JPH02177899A - スオレプトコッカス・ミュータンスに特異的に反応するＩｇＤモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）（血清型ｃ　／
　ｅ　／　ｆ　）に特異的に反応するＩｇＤモノクロ−
ナル抗体、および該モノクロ−ナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマに関する。

発明の背景 免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）は、抗原刺激によるＢ細胞
の分化過程の初期にｒｇＭとともにＢ細胞上に出現し、
その後、遺伝子のプロセシングにより消失してゆくこと
が知られており、また、その機能についての報告も多数
為されている。しかし、このＩｇＤは膜結合型ＩｇＤで
あり、血中に微量存在する分泌型１ｇＤについてはその
存在意義はいまだ不明なことが多く、現在、体液性免疫
の分野では大きな研究課題の１つになっている。

この分泌型ＩｇＤの研究が遅れている原因として、（ｉ
）血中の分泌型ＩｇＤが微量である；（ｉｉ）ＩｇＤを
持つ適当な実験動物がない（サル、マウス、ラットくら
いてしかＩｇＤが確認されておらず、これらから大量の
血液を採取するのは困難である）：　（ｉｉ）動物モデ
ル系でモノクロ−ナルＩｇ　Ｄ分？ｔ　型ガン細胞があ
まり得られていない［ラットで６株Ｉ１．　Ｂａｚｉｎ
　ｅｔ　ａｌ、　（１９７８）　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、　、　１２１．２０７７−２０８２　；　？ウスで２
株：　Ｆ、　Ｄ、　Ｆｉｎｋｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、
　（１９８１）Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　１２６．
６８０−６８７］　；　（ｉｎ）またそれらのモノクロ
−ナルＩｇＤの抗原特異性が明らかでない：などが挙げ
られる。今のところ、（ｉｎ）にも示すように、何に反
応するのかわかっていないＩｇＤを用いて、非特異的な
ＩｇＤの作用を解析することが主となっている。その結
果、ＩｇＤがＴ細胞に結合して抗体産生のモジュレータ
−として作用していること、また、Ｔ細胞からＩｇＤに
対するレセプターが分泌されていることなどがわがって
きた［Ｒ，Ｆ、　Ｃｏ１ｃｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
５）　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６．７４４−７４６；Ｒ，
Ｆ、Ｃｏ１ｃｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｊ、ＥＸ
ｌ）、Ｍｅｄ、、１６２．１８５２−１８６１１Ｍ、Ａ
ｄａｃｈｉ　ａｎｄ　Ｋ、　ｌ５ｈｉｚａｋａ　（１９
８８）　Ｐｒ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３．
７００３−７００７］。しかし、ｒｇＤが認識する特異
抗原がＩｇＤと結合した場合に起きる生理的変化につい
てはほとんど知られていナイ。従って、いくつかの研究
室で、ある特定の抗原に特異的なＩｇＤを大量に調製し
ようとする努力が為されているが［Ｍ、　Ｇ、　５ｔｅ
ｅｌｅ　ａｎｄ　Ｇ、ΔＬｅｓ　１ｉｅ　（１９８８）
　１ｍｍｕｎｏ１．．６４，３９］−３９５］、いまた
満足なものは得られていない。

ストレプトコッカス・ミュータンスは、う蝕（虫歯）の
主たる原因菌であり、その血清型によりａ〜ｈに至る８
つの型に分類されている。また、ＤＮＡの相同性に基つ
きストレカ・コツカス・クリ発明の口約 本発明者は、ストレプトコッカス・ミュータンス（ｃ／
ｅ／ｆ型）に特異的に反応するモノクロ−ナル抗体を得
るべく鋭意検討を進めていたが、その結果、ストレプト
コッカス・ミュータンス（Ｃ／　ｅ　／　ｆ型）とは強
く反応するか、他の口腔内ストレプトコッカス属とは反
応しないか、または弱くしか反応しない特異性の高いモ
ノクロ−ナル抗体であり、かつその免疫グロブリンクラ
スかＩｇＤであるモノクロ−ナル抗体を得た。即ち、本
発明は、血清型ｃ／ｅ／ｆのストレプトコッカス・ミュ
ータンスとは強（反応するが、他の口腔内ストレプトコ
ツカス属とは反応しないか、または弱くしか反応しない
、抗原特異性か明確であるＩｇＤモノクロ−ナル抗体、
および該モノクロ−ナル抗体を産生ずるハイブリトーマ
を提供するものである。

発明の構成および効果 本発明に係るＩｇＤモノクロ−ナル抗体、および該抗体
を産生ずるハイブリトーマは、以下のよセタス（ａ型）
、ストレプトコッカス・クラス（ｂ型）、ストレフトフ
ソノＪス・ミュータンス（ｃ／ｅ／ｆ型）、ストレプト
コッカス・ソブリヌス（ｄ／ｇ型）、ストレプトコッカ
ス に再分類することが提唱され、承認されている。

このような分類に基つくと、ｃ／ｅ／ｆ型のストレプト
コッカス 分離されることから、この型のストレプ１へコツカス・
ミュータンスかヒトの主たるう触発生菌であると考えら
れる［例えば、教養歯利基礎医学ンリズ「臨床家のため
の口腔微生物学」、鷹森健志部、株式会社書林（１．９
８６年）、および「歯の健康と食生活」、浜田茂幸編、
第一出版株式会社（１．９８６年）コ。

このようなヒトの主たるう触発生菌であるストレプトコ
ッカス・ミュータンス（　ｃ　／　ｅ　／　ｆ型）に特
異的に反応するモノクロ−ナル抗体か得られれば、ヒト
におけるう蝕の診断、予防、および治療に極めて有用な
ものとなる。

うにして製造することができる．即ぢ、）ストレプトコ
ッカス・ミュータンスの菌体を抗原としてマウスを免疫
し、 ）該マウスの抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞と
を融合させ、血清型ｃ／ｅ／ｆのストレプトコッカス・
ミュータンスとは強（反応するが、他のロ腔内ストレプ
Ｉ・コツカス属とは反応しないか、または弱くしか反応
しないＩｇＤモノクロ−ナル抗体を産生じているハイブ
リトーマを選択し、 ＩＩ）該ハイブリドーマを適当な条件下で培養し、該モ
ノクロ−ナル抗体を回収する。

工程１）のマウスの免疫は、血清型ｃ，ｅ，またはｆの
ストレプトコッカス・ミュータンスの菌体を抗原として
マウスに投与し、一定期間経過後さらに同一の抗原でマ
ウスを処理することによって行うことかできる。血清型
ｆのストレプトコッカス・ミュータンス、例えばＳＥ１
７株を用いるのが好ましい。通常、この菌体はＦｒｅｕ
ｎｄの完全アンユハントと混合してマウスに投与する。

また、リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁させて投与しても
よい 免疫するマウスとしては、例えばＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　
ｃマウスを用いるのか好ましい。

工程１１）の細胞融合は、工程Ｉ）で免疫されたマウス
の抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞とを用い、常
法によって行うことができる。

抗体産生細胞としては、上記Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマ
ウスの肺細胞か最も好ましいが、これ以外に、例えば、
マウスのリンパ節細胞や末梢リンパ球なとも使用するこ
とかできる。

ミエローマ細胞としては、マウスのミエローマ細胞株Ｓ
Ｐ２１０−Ａｇｌ　４が好ましいが、Ｐ３Ｎ５１．−１
−Ａｇ４−］や］Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕなどの細胞
株も用いることができる。

細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、ＨＶ
Ｊ法、電気融合法なとを挙げることができる。

また、得られたハイブリドーマの選択は、例えば、以下
のようにして行うことができる。即ち、後記実施例に示
したように、本発明のＩｇＤモノクロ−ナル抗体は、血
清型ｃ、、ｅ、およびｆのストレプトコッカス・ミュー
タンスとは強く反応するが、その他の口腔内ストレプト
コツカス属の菌、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃ。

ｃｃｕｓ　ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・
タンスストレプトコッカス°フィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・ミテ
ィス（Ｓｔｒｅｐｔ。

ｃｏｃｃｕｓ　ｍ１ｔｉｓ）、ストレプトコッカス・サ
リバリｉｓ）とは反応しないか、または弱くしか反応し
ない。また、その標的抗原はストレプトコッカス・ミュ
ータンスの細胞壁多糖抗原で、エピトープとしてＮ−ア
セチルグルコサミンを含んでいた。このように特異的に
反応する抗原が明らかなＩｇＤモノクロ−ナル抗体およ
び該モノクロ−ナル抗体ハイブリトーマを適当な培地で
培養し、その培養液とストレプトコッカス・ミュータン
ス（血清型ｃ、ｅ、およびｆ）およびその他のストレプ
トコッカス属の菌と反応させ、例えば酵素抗体法（ＥＩ
Ａ）により、ストレプトコッカス・ミュータンス（血清
型ｃ、ｅ、およびｆ）とは強く反応するが、その他のス
トレプトコツカス属の菌とは反応しないか、または弱く
しか反応しないＩｇＤ抗体を産生じているハイブリドー
マを選択すればよい。次いて、選択したハイブリトーマ
を限界希釈法によってクローニングする。

工程ｉｉｉ　）のＩｇＤモノクロ−ナル抗体の回収は、
例えば、工程１１）で得られたクローンをマウスの腹腔
内に移植した後、その腹水液から常法によって行うこと
ができるし、大量培養装置を用いてハイブリドーマクロ
ーンを培養した培養液からも常法どうり回収することが
できる。また、回収したＩｇＤ抗体を、硫安塩析、分子
ふるい、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等によって精製してもよい。

を産生するハイブリドーマは分泌型ＩｇＤの機能解析や
免疫グロブリン・クラススイッチングの解析なとの各種
免疫学研究に有用である。また、本ＩｇＤモノクロ−ナ
ル抗体は、ヒトにおけるう蝕の診断、予防、および治療
にも有用である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例 （１）抗原のＢ製 ストレプトコッカス・ミュータンス血清型ｆである５Ｅ
１７株をプレイン・ハート・インフユーソヨン（以下、
ＢＨＩと略称する）液体培地に接種し、３７°Ｃて１８
時間培養した。培養した菌体を回収し、リン酸緩衝化生
理食塩水（以下、ＰＢＳと略称する）により３回遠心洗
浄してから、菌体をその２倍容量のＰＢＳに懸濁した。

この菌液を沸騰水中で２０分間処理した後、ＰＢＳで２
度洗浄した。得られた死菌体をＰＢＳに懸濁して、６６
０ｎｍの濁度が１０になるように菌液を調製し、これを
抗原液として用いた。

（２）マウスの免疫 」１記抗原液とＰｒｅｕｎｄ完全アジュバントの各々等
量を混和して乳状液（ｗａｔｅｒ　−１ｎ−ｏｉｌ状）
とした。

この乳状液をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（８週齢；
♀）に］　ｍＱ／匹で腹腔的投与して免疫し、その４週
後から１週毎に、０．５１ＲＱの抗原液７匹で１２回反
復して免疫を行った。免疫したマウスから血清を少量採
取し、後述の酵素抗体法（以下、ＥＩＡと略称する）に
より血清中の抗体価を測定した。抗体価かエンドポイン
ト測定法で２０万倍以上を示したマウスにつき、前述の
最終層腔内免疫が終了して１週間後に再び前述の抗原液
０．５ｍｇを尾静脈中に投与し、その４日後に肺臓を摘
出して細胞融合に供した。

（３）ハイブリドーマの調製 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス由来のミエローマ細胞Ｓ
Ｐ２１０−Ａｇ１４株を１０％仔牛血清（以下、Ｆｅ２
と略称する）を含むタルヘソコ変法イーグル培地（以下
、ＤＭＥＭ培地と略称する）中で培養し、浮遊液を混和
し、全細胞を遠心して回収した。上清を除き、細胞を室
温に戻してから、１ｍｆｆの５０％ボリュチレングリコ
ール（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地中）（以下、ＰＥＧと略称す
る）を１〜２分かけて徐々に添加して細胞と混和した。

次に１．ＯｍＱのＤＭＥＭ培地を５分間に渡って徐々に
加え、ＰＥＧを希釈した後、遠心して細胞を回収した。

得られた融合細胞に、１．０ｍ１２の２０％ＦＣ８、］
−００μＭヒ００μンチン、１６μＭチミンンを含むＤ
ＭＥＭ培地　（以下、ＨＴ培地と略称する）を加えて遠
心し、洗浄した。この細胞を新たなＨＴ培培地−２５×
１０Ｑ牌細胞／ｍ（２となるよう懸濁して、Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ社製９６穴カルチャープレートに１００μＱ／穴と
なるように分注した。３７°Ｃ１５％ＣＯ３の存在下で
６時間培養した後、各人に１００μρの８００ｎＭアミ
ノプテリンを含むＨＴ培地を加え、培養液を４００ｎＭ
アミノプテリンを含むＨＴ培地（以下、ＨＡＴ選択培地
と略称する）とした。その後、このＨＡ　Ｔ選択培地中
で１０〜１４日間、５％ＣＱ、存在下に３７°Ｃで培養
し、バイブリド生存率か９０％以」二の状態で回収し、
その細胞をＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、再ひＤＭＥ
Ｍ培地に懸濁してミエローマ細胞浮遊液とした。この液
中の生細胞密度を血球計算盤を用いるトリパンプル−排
除試験にて測定した。

免疫マウスから肺臓を摘出して、ＤＭＥＭで３回洗浄後
、これを細切して、新たな］ＯｍＱのＤＭＥＭ培地中で
ピンセットを用いて圧縮することにより分散させ単個細
胞浮遊液とした。結合組織や細胞凝集塊を静置して除き
、この単個肺細胞を遠心して回収した。次いで、この細
胞を５ｍｇの０８３％塩化アンモニウム溶液中に懸濁し
て水冷下に１０分間放置し、混入する赤血球を破壊した
。

これに５ｍｇのＤＭＥＭ培地を加えて遠心し、得られた
沈降細胞を８ｍ０．のＤＭＥＭ培地に懸濁して肺細胞浮
遊液とした。牌細胞浮遊液中の生存細胞数を前記のトリ
パンブルー排除試験法で測定すると２．５〜３．ＯＸ］
、ＯＬ１個／匹であった。各々のマウスから得られた肺
細胞Ｒ−遊液に、その生細胞数のｌ／１０数のミエロー
マを含むミエローマ細胞一マ・コロニーを形成させた。

（４）酵素抗体ｉ（Ｅ　Ｉ　Ａ）による抗体価の測定ス
トレプトコッカス・ミュータンス　Ｓ　Ｅ　］、　７株
をＢＨＩ液体培地に接種し、３７°Ｃて１８時間培養し
た後、ＰＢＳで３回遠心洗浄して菌体を得た。これをＰ
ＢＳに再び懸濁して６６０ｎｍの濁度か０．６となるよ
う調整し、この菌液をＮｕｎｃ社製９６穴イム／プレー
１−　Ｈに５０μり／穴となるよう分注し、３７°Ｃに
て一夜乾固させて抗原固定化プレートとした。このプレ
ートに１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ（以下、ＢＳ
Ａ−ＰＢＳと略称する）を３００μρ／穴で分注し、３
７°Ｃて３０分間放置することにより非特異的吸着効果
を低減させた。ＢＳＡ−ＰＢＳをＰＢＳで洗浄後、ハイ
ブリドーマ培養上清、希釈した腹水上清、あるいは希釈
した抗Ｓ　Ｅ　１．７株−マウス抗血清を５０μρ／穴
で分注し、３７°Ｃで１時間反応させた。これをＰＢＳ
で洗浄後、西洋ワサビペルオキシターゼで標識化した抗
マウス（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）−ヤギＴｇＧ（ＩｇＧとＩｇ
ＭのＨ鎖およびＬ鎖の両方に反応性を示す）のＢＳＡ−
ＰＢＳ希釈液を５０μρ／穴て分注し、３７°Ｃて３０
分間反応させた。これをＰＢＳで洗浄した後、２，２”
−アジノージ−［３エチル−ベンゾチアプリン−（６）
−スルポン酸］と過酸化水素を含む基質液（Ｋｉｒｋｅ
ｇａａｄ　ａｎｄ　ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ社製）を５０μＱ／穴で分注して、生しる発色の強度
を４］４ｎｍにおいて分光光度計で測定した。抗体結合
量と吸光度か比例関係を持つ時間域において得られた結
果を比較して抗体価の指標とした。

モノクロ−ナル抗体の菌種あるいは血清型特異性を判定
するため、上記の５Ｅ１７株以外に下記の菌株も抗原と
して用いた。即ち、ミュータンス群連鎖球菌として、 ストレプトコッカス・クリセタス：Ｈ３ＩＫ、Ｅ　４．
９株、Ｊ−Ｉ　Ｓ　６株 ストレフトコツカス・クラス：　ＦＡ　１．Ｌ　ＢＨＴ
株、ＫＡＹ１株 ストレゾ１−コツカス・ミュータンス　ｌｎｇｂｒｉｔ
ｔ株、ＭＴＧＲ株、Ｌ　Ｍ　７株、２４株、ＭＴ７０３
するハイブリトーマのクローニング コロニーを形成した培養穴から５０μρずつ上清を分取
し、５Ｅ１７株を抗原として上記（４）に示したＥＩＡ
にて抗５ＥＬ７株抗体の有無を検討した。ＥｌΔ陽性の
培養大中のコロニーを２４穴カルチヤープレー）（Ｎｕ
ｎｃ社製）に移して培養を続けた後、各々についてＨＴ
培地中に１０細胞／ｍＱとなるよう希釈分散し、９６穴
カルチヤーフレー　１−に１．００μａ／穴となるよう
に分注した。５％ＣＯ２の存在下、３７°Ｃで１０〜１
４日間インキユヘートした後、コロニー形成穴の培養上
清を５０μρ分取して、再びＳ　Ｅ　１．７株を抗原と
して上記（４）のＥＩＡを行ない抗５Ｅ１７株抗体の有
無を調へた。ＥＩＡ陽性て単一コロニーを生した培養穴
から、そのコロニーを２４穴カルチヤープレートに移し
て培養し、上記と同様の限界希釈法によって再度２回ク
ローニングを行った。上記（４）に示したすべての菌株
を抗原に用いて、最終クロニングの培養上清中に含まれ
ているモノクロナル抗体の抗原特異性を調へた。ミュー
タンス群Ｒ株、０Ｍ２１７５株、ＭＴ５５７株 ストレプトコッカス・ソブリヌス　０Ｍ２１７６株、Ｍ
Ｔ６１．５Ｒ株、Ｂ　１．３株、０Ｍ２６５株、６７１
５株、ＫＩＲ株 ストレゾ１−コツカス・タウネアイ・ＭＦ２５株、ＢＦ
ｅｌ、２株、Ｍ　４．−４９株 ストレプトコッカス・フィラス°８Ｓ１株、ＨＤ３株 ならひに、他の口腔内連鎖球菌として、ストレプトコッ
カス・ミティス：ＡＴＣＣ９８１１株、ＡＴＣＣ１５９
０９株、ＡＴＣＣ１，５９１０株、ＡＴＣＣ１５９１，
３株 ストレプトコッカス・サリバリウス・ｌ（ｌ−Ｉ　Ｔ株
、ＨＴ　９　Ｒ株 ストレプトコッカス・サンダイス二ＭＴ株、ＳＴＧ株、
ＡＴＣＣ１，０５５６株、ＡＴＣＣ１０５５７株である
。

（５）ミュータンス群連鎖球閑のうちストレゾ１〜コツ
カス・ミュータンス血清型ｃ、ｅ、およびｆに特異的に
反応するモノクロ−ナル抗体を産生連鎖球菌において、
ストレプトコッカス・ミュータンスＩｎｇｂｒｉｔｔ株
、Ｍ”Ｐ６Ｒ株（以上、血清型Ｃ）ＬＭ７株、２４株、
ＭＴ７０３Ｒ株（以上、血清型ｅ）；５Ｅ１７株、０Ｍ
２１７５株、ＭＴ５５７株（以」−１血清型ｆ）にのみ
反応する抗体を産生ずるハイブリ１ヘーマクローンを選
別した。

（６）抗マウス免疫グロブリン抗体によるＩｇＤ産生ハ
イブリドーマの選別 上記（５）において選別したいくつかのノーイブリドー
マの培養」１清を分取し、ｌｎｇｂｒｉｔｔ株を抗原、
抗マウス免疫グロブリン−ウサキ抗体［抗ＩｇＧ１、抗
１ｇＧ２ａ、抗ＩｇＧ、＋１、抗１ｇＧ３、抗１ｇＡ、
抗ＩｇＭ（以上、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｑｕａｌｅｘ社製
）；抗ＩｇＤ。

抗ＩｇＥ（以上、Ｎｏｒｄｉｃ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）：これらはす
べてＨ鎖特異的である］を２次抗体、抗つサギＴｇＧ−
ヤギＩｇＧ（西洋ワサビペルオキシダーセ標識）を３次
抗体として、」１記（４）記載のＥＩＡにより、培養上
清中のモノクロ−ナル抗体の免疫グロブリンクラスを同
定した。

その結果、マウスハイブリトーマｆ９３と命名しタフロ
ーンが産生ずるモノクロ−ｔ　ル抗体（Ｍ　Ａ　ｂｆ９
３と命名）のみかＩｇＤクラスであることかわかった（
第１図）。また、マウスモノクロ−ナル抗体アイソタイ
ピングキノｈ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いてＭＡ
ｂ　ｆ９３を解析したところ、そのＬ鎖はに型であった
。

このマウスハイブリト−マｆ９３株は、微工研閑寄第］
、　０４．６５号（ＦＥＲＭ　Ｐ−］　０４．６５）と
して寄託されている。

（７）　ＭＡｂ　ｆ９３の認識抗原 ミュータンス群連鎖球菌のス）・レプトコノカス・クリ
セタス（８８１株）、ストレプトコッカスラス（ＦＡ１
株）、ストレプトコッカス・ミュータンス（ｌｎｇｂｒ
ｉｔｔ株、ＬＭ７株、Ｓ　Ｅ　１．　７株）、ストレプ
トコッカス・ソブリヌス（ＭＴ６１５Ｒ株、０Ｍ７６５
株）、ストレフトコツカス・タウ不アイ（ＭＰ２５株）
のそれぞれから、ＤＥＡ．Ｅ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−
２　５、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２００，　ＣＭ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ａ−２　５　（いずれもＰｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）カラムにより細胞壁多糖抗原を精製した。こ
の抗原をＣｏｒｎｉｎｇ社製ＥＩＡプレートに３０μｇ
／穴となるように分注した後、３７°Ｃに保温すること
により乾固してＥＩＡに供した。

」−記（４）のＥＴＡにより、各血清型株の細胞壁多糖
抗原に対するＭＡｂｆ９３の反応性を調べた結果を第１
表に示した。全菌体を抗原に用いるＥＩＡによる結果（
第２図）とよく一致して、血清型ｃ，ｅ，ｆ株の精製し
た細胞壁多糖抗原に対して陽性反応か見られた。また、
細胞壁多糖抗原を抗原に用いたＥＩＡにおいて、ハプテ
ン糖の共存によるＭＡｂ　ｆ９　３の反応性の変化を調
べた結果、Ｎ−アセチルグルコサミンが強力に細胞壁多
糖抗原とＭＡｂｆ９３の結合反応を抑制した。この結果
からＭＡｂｆ’９３はＮ−アセチルグルコサミン構造を
抗原決定基として含む細胞壁多糖抗原を認識することか
わかった。また、本抗原はミュータンス群連鎖球菌にお
いてはストレプトコッカスミュータンス（血〆ｉｌＩ型
ｃ，ｅ，ｆ）に特異的であることも示された。

第１表ミュータンス群連鎖球菌の各血清型からの精製８
３１株　　　　ａ型 ＦＡＩ株　　　　ｂ型 Ｉｎｇｂｒｉｔｔ株　　　　Ｃ型 ＭＴ６１５Ｒ株　　ｄ型 ＬＭ７株　　　　ｅ型 Ｓ　Ｅ　１．　７株　　　ｆ型 ０Ｍ２６５株　　ｇ型 ± 十干 ＋＋ ＋ （８）マウス腹水中での抗体産生 Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（８〜１０週齢）に０．
５ｍＲのプリスタン（２，６，　ｌ　０，　１４−テト
ラメチルペンタデカン）７匹を腹腔内投与した。その１
０日後に、あらかじめ１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地
で培養しておいたハイブリドーマｆ９３を２０ＸＩＯ７
／匹として同マウスの腹腔内に接種した。

接種して１０〜２０日後、マウスが死亡する直前に、腹
水を採取し、遠心して腹水上清を得た。Ｉｎｇｂｒｉｔ
ｔ株を抗原とし、上記（４）に示したＥＩＡにより、得
られた腹水上清の抗体価を調べた。第３図に示すように
、この腹水上清は半飽和結合濃度が２０４８倍希釈と高
い抗体価を示し、ＭＡｂ　ｆ９３の大量精製材料として
適することか判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、種々の抗血清を用いてモノクロ−ナル抗体Ｍ
Ａｂ　ｆ９　３の免疫グロブリンクラスを調べた結果を
示すグラフであり、第２図は、モノクロ−ナル抗体ＭＡ
ｂ　ｆ９　３と種々の菌株どの反応性を調べた結果を示
すグラフであり、第３図は、ハイブリドーマｆ９３をマ
ウス腹腔内に投与して得た腹水上清について、抗体価を
測定した結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ストレプトコッカス・ミュータンス（血清型ｃ／ｅ
   ／ｆ）に特異的に反応するＩｇＤモノクロ−ナル抗体。 ２、請求項１記載のモノクロ−ナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマ。