CN86108380A - 对铜绿假单胞菌血清型具有交叉反应性和交叉保护作用的单克隆抗体 - Google Patents

对铜绿假单胞菌血清型具有交叉反应性和交叉保护作用的单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

产生出能分泌人单克隆抗体的细胞株，该抗体能结合所选择的铜绿假单胞菌IATS血清型的脂多糖分子。含有这些抗体的药用组合物，还可结合有其它的单克隆抗体，血浆组分或抗菌素。还包括这种组合物在控制感染方面的预防和治疗应用。

Description

本申请是1985年12月10日提交的U.S.S.N    807394号的部分继续申请，在此声明将该申请的内容合并与此。
本发明涉及应用免疫学技术提供一种用于诊断和治疗细菌感染的新型物质，具体地讲，是关于能识别铜绿假单细胞菌（Pseudomonas    aeruginosa）多重血清型的人单克隆抗体的生产和应用。
革兰氏阴性疾病及其多数严重的并发症，如菌血症和内毒血症是造成患者高发病率和死亡率的原因。这在革兰氏阴性铜绿假单胞菌中更是如此。在最近的五十年中，这一点日益与细菌感染，特别是医院感染相联系着。
在过去几十年中，抗生素被选来治疗革兰氏阴性疾病。然而，连续的高发病率和高死亡率表明抗菌素的作用是有限的，对铜绿假单胞菌更是如此（参见Andriole，V.G.，“Pseudomonas.Bacteremia：Can    A    ntibiotie    Therapy    Iherapy    Improve    Survival？”，J.Lab.Clin.Med.（1978）94：196-199）。因此，就促使去寻找另外的防治方法。
已被考虑过的方法之一是以主动或被动免疫来增强宿主的免疫系统。例如，已经观察到用全细胞细菌疫苗或经纯化的铜绿假单胞菌的细菌内毒素对人或实验动物进行主动免疫，这就导致产生一种特异调理性抗体，该抗体主要作用于铜绿假单胞菌外层细胞膜上的脂多糖（LPS）分子中重复的寡糖单位的决定因子（参见Pollack，M，Immunoglobulins：Characteristics    and    Uses    of    Intraoenous    Preparations，Alving，B.M.and    Finlayson，J.S.，eds;pp.73-79，U.S.Department    orHealth    and    Human    Seruices，1979）。
这种抗体，不论是主动产生的还是被动转入的，在各种动物中（Pollack，supra）以及某些在人体上的初步研究中（参见Young，L.S.and    Pollack，M.，Pseudomonas    aeruginosa，Sabath，l.，ed.，pp.119-132，Hans    Huber，1980）均显示出了对铜绿假单胞菌感染的致死效应有抵抗作用。此外，这些抗体对患铜绿假单胞菌菌血症的患者具有非常重要的一种作用是在于发现了对感染菌LPS分子的抗体在存活和高急性血清效价之间的关系。（参见Pollack，M.，and    Yong，L.S.，J.Clin    Invest.，63：276-286，（1979）]。
以上的报告指出免疫治疗方法可以用来防止和治疗归因于铜绿假单胞菌的细菌性疾病，如施用收集的含有抗感染菌抗体的人免疫球蛋白。在此处定义的人免疫球蛋白是指人血浆经分部后富含抗体的部分，其中存在着对铜绿假单胞菌菌株为特异性的抗体。由于在使用人免疫球蛋白成分时所固有的某些限制，使得治疗归因于铜绿假单胞菌的疾病的方法仍处于研究阶段[见Collins，M.S.and    Roby，R.E.，J.Med，76（3A）：168-174），（1984）]，而且迄今还没有利用这些成分的市售产品。
免疫球蛋白组合物所具有的这种限制之一是它们要收集数千或更多的供者的样品，这种样品是经预先确定含抗假单胞菌一抗体的样品。这种收集方式导致单个抗体效价的平均化，其结果最多只能使所需抗体的最终效价略有提高。
另外的限制是预选的过程需要花费巨大的连续地筛选供者以保证产品的一致性。除此以外，每批的免疫球蛋白产品仍含有相当大的差异，而且各地理区域的产品之间也会不同。
免疫球蛋白组合物所固有的另一限制是，在使用时要同时辅以大量的体外的蛋白质（它们可能含有病毒，如最进表明的结合有爱滋病的蛋白），这些蛋白含有造成生物学副作用的潜在性。低效价的所需抗体与大量的体外蛋白质的结合会限制适用水平，特异性物质的含量以及供给患者的有效免疫球蛋白量。
在文献中已有很多用于分析铜绿假单胞菌感染的血清定型图谱。这些图谱主要基于这种微生物的热稳定性的主要体细胞抗原[见Zierdt    C.H.，in    Clucose    Nonfermenting    Gram-Negative    Bacteria    in    Clinical    Microbiology，Gilardi，G.L.，ed.，CRC    Press，pp    213-238（1978）]。
血清组图谱的增多使得铜绿假单胞菌的血清学研究更加难以比较，因此，为了筛选上清液似乎可任意选择给定的系统。各定型系统之间的混乱由于国际抗原定型图谱（IATS）系统的提出而得以澄清，该系统是由系统细菌学国际委员会的假单胞菌分委会作为对铜绿假单胞菌的进一步血清研究的支柱而提出的。该系统提供了十七种不同的血清型，称作为IATS1型，IATS2型等，包括了前述各系统中所确定的全部热稳定性主要体细胞抗原。参见Liu，P.v.，Int.J.Syst.Bacteriol.，33：256-264，（1983），在此声明其内容合并于本文。
在发展可于铜绿假单胞菌各菌株中为交叉反应性的保护性单克隆抗体方面，引入基于铜绿假单胞菌保护性抗原的定型图谱也是有益的。这种图谱的设计是要发展一种医用疫苗，而且在Fisher，M.W.et    al.，J.Bacteriol.，98：835-836，（1969）中已详细叙述了。这种系统通常被称作为Fisher定型系统，它将主要的已知的铜绿假单胞菌分为七种类型，称作Fisher免疫1型，Fisher免疫2型等等。IATS与Fisher定型系统之间的关系已被澄清（见Liu，P.V.，etal.，supra）并列于表1。如表1所示，没有任何一种Fisher免疫型与IATS的某一血清型正好相对等，尽管每一个Fisher免疫型确实与IATS的某一血清型相对应。对IATS和Fisher定型系统而言，与两种血清定型图谱相关的抗原决定簇被认为是处于铜绿假单胞菌的LPS分子的表面上（Liu，P.V.et    al.，supra;Hanessien，F.，et    al.，Nature，229：209-210（1979）]。
表1
关于铜绿假单胞菌的IATS和Fisher定型图谱的比较与相互关系
IATS    Fisher
1    4
2    3
3    -
4    -
5    7
6    1
7    -
8    6
9    -
10    5
11    2
12    -
13    -
14    -
15    -
16    -
17    -
1975年Kohler和Milstein报道了它们的开创性发现，即某些鼠细胞系可与鼠脾细胞相融会产生出杂种瘤，每种杂种瘤会分泌出具某一特异性的抗体，也就是单克隆抗体[Kohler，G.，and    Milstein，C.，Nature，256：495-497（1975）]。随着这项技术的出现，在某种情况下就有可能大量生产对某一决定簇或抗原决定簇为特异性的鼠类抗体。然而，这种鼠单克隆抗体或该抗体的组合物在用于人类时具有某些缺陷，特别是发现在将鼠单克隆抗体用于治疗某些人类疾病的实验研究时，经常会观察到引发使其失效的免疫反应[Levy，R.L.and    Miller，R.A.，Ann.Rer.Med.，34：107-116，（1983）]。
使用杂交瘤技术，Sadoff等报导了生产Ig    G类的鼠单克隆抗体，其直接作用于铜绿假单胞菌的某一血清型的LPS分子上的O-侧链决定簇（Abstracts    of    the    1982    Interscience    Conference    on    Antim    icrobial    Agents    and    Chemotherapy，No.253）。它们进一步报道了这种鼠抗体使小鼠抵抗了由具有与该抗体所作用类型即，同源血清型相同的血清型的铜绿假单胞菌造成的致死性侵害。随后的几篇文章详细地叙述了具有各种特异性的鼠和人的抗一铜绿假单胞菌LPS单克隆抗体的发展;例如：Sanada，S.，et    al.，J.Inf，Dis.，150：570-576，（1984）;Sadoff，J.，et    al.，Antibiot.Chemother.，36：134-146，（1985）;Hancock，R.，et    al.，Infect.Immun.37：166-171（1982）.，Siadak，A.W.and    Costrom，M.E.，in    Human    Hybridomas    and    Monoclonal    Antibodies，Engleman，E.G.，et    al.，pp.167-185，Plenum    Publishing    Corp.（1985）and    Saw    ada，S.et    al.，J.Inf.Dis.，152：965-970（1985）。抗铜绿假单胞菌LPS血清型-特异性人单克隆抗体的生产和免疫治疗应用揭示于未决的美国专利第734624号和828005号中，在此声明其内容合并于此。
尽管使用对于某一IATS血清型铜绿假单胞菌为特异性的单克隆抗体在某些情况下是有着一定的优越性，如当感染被确定为某一单一血清型时，但在许多其它情况下则并不是优选的。例如预防人体的某种潜在疾病时，则优选的是给以一种或多种抗多数IATS血清型的人类抗体。同样，在不知感染菌的血清型的治疗过程中，则优选给以对虽然不是全部但也是大多数的在治疗上为重要的铜绿假单胞菌IATS血清型为有效的人抗体。而对人单克隆抗体的结合而言，理论上讲是可以将各种针对某一IATS血清型铜绿假单胞菌的特异性抗体混合起来以抵抗不同的血清型，但从生产的观点来看这种组合物是难以生产的，而且也不经济。
因此，急需的是能够识别并抵抗多重IATS血清型铜绿假单胞菌的人抗一铜绿假单胞菌单克隆抗体。进而言之，这些抗体应能用于预防和治疗铜绿假单胞菌感染。本发明满足了这些需要。
提供了一种新的细胞系，它可以产生能对多数但不是全部IATS血清型铜绿假单胞菌的LPS分子特异性起作用的人单克隆抗体。这些抗体有不同的对Fisher免疫型起作用的反应能力，结合0个，1个或多个免疫型。此外，提供了一种治疗易受或已受铜绿假单胞菌感染的人的方法，即施用预防量或治疗量的一种组合物，该组合物含有至少一种能与铜绿假单胞菌IATS血清型起交叉反应的人单克隆抗体或其结合片段，该组合物以含有生理可接受的载体为更好。该组合物还可以含有任何一种或多种下述物质：能与铜绿假单胞菌鞭毛，外毒素A或与铜绿假单胞菌的LPS上的其它血清型或免疫型决定簇相作用的另外的人单克隆抗体;人血浆的γ球蛋白部分;从显示出对铜绿假单胞菌有升高了的免疫球蛋白反应水平的人获得的血浆中得到的γ球蛋白;以及一种或多种抗菌素。
本发明提供了能生产人单克隆抗体的新细胞以及这种抗体的组合物，该组合物能够选择性地识别至少多数的（在某些情况下为全部的）铜绿假单胞菌，而单个的抗体识别多重的IATS血清型和0个，1个或多个Fisher免疫型铜绿假单胞菌。这类细胞含有可识别的染色体，其中该细胞本身的或来自细胞前体的菌株DNA已被重排以编码具有在某些铜绿假单胞菌血清型中共有的抗原决定部位的结合位点的抗体。这些人单克隆抗体有很多的应用领域，包括诊断和治疗（如活体的保护）。
本发明的细胞可以是被转化的人淋巴细胞，其产生保护性的人单克隆抗体，该抗体作用于铜绿假单胞菌的可接触的LPS分子。“可接触的”一词在此是指LPS分子在生理环境中可用来直接与单克隆抗体相作用。这样得到的单克隆抗体可以用在归因于铜绿假单胞菌的严重疾病的预防和治疗中。铜绿假单胞菌细胞外膜上的LPS分子可被抗体分子直接作用，由此促进补体调节的溶胞作用和（或）微生物的吞噬作用。再者，从细胞外膜释放到周围环境中的那些LPS分子可以自由地与抗体分子直接作用，而且可以通过网状内皮系统而清除掉。
单克隆抗体的制备可由核酸序列的连续表达而完成，该序列编码对在多重血清型铜绿假单胞菌的LPS分子上的抗原决定部位为特异性的抗体。这种单克隆抗体是由从已接触过适当血清型铜绿假单胞菌的供体人员身上所获的B淋巴细胞通过细胞控制的EB病毒转化而产生。这样产生的分泌抗体的细胞系的特征是连续产生具有二倍体染色体组型的淋巴母细胞，EB核抗原阳性，分泌Ig G，Ig M Ig A，或Ig D同型的单克隆抗体，包括各种亚型如Ig G1，Ig G2，Ig G3和Ig G4。细胞控制的转化的方法详见美国专利第4464465号，其内容合并于此。可以使用完整的单克隆抗体或使用其片段，如Fv，Fab及F（ab′）2等，但通常均使用完整的，由已知方法制造的。
另外，产生抗体的细胞株可以通过细胞融合技术，以适宜的药物标记过的人骨髓瘤细胞，鼠骨隋瘤细胞，人-鼠异源骨髓瘤细胞或人淋巴母细胞与人B-淋巴细胞融合而得到人杂交细胞株。
本发明的细胞株除了直接生产人单克隆抗体以外还有其它的用途。该细胞株可与其它的细胞（如适宜的药物标记的人骨髓瘤细胞，鼠骨髓瘤细胞，人-鼠异源骨髓瘤细胞或人淋巴母细胞）相融合，以产生杂交瘤，从而转移编码单克隆抗体的基因。另外，该细胞株可作为编码免疫球蛋白的染色体的来源，它可以通过融合以外的技术来被分离和转移到细胞中。此外，编码单克隆抗体的基因可分离并用重组DNA技术在各种宿主中生产特异性的免疫球蛋白。特别是，通过从信使RNA中建立cDNA库，可以分离出编码不含基因内区的免疫球蛋白的多个cDNA克隆，并且放到适宜的原核或真核的表达载体中，转化到宿主中，最终用于大量生产。
淋巴母细胞或杂交细胞株可用常规技术进行克隆和筛选，使用能够结合在细胞上清液中检测到的各种不同铜绿假单胞菌IATS血清型和Fisher免疫型的抗原决定部位的抗体。在筛选中以本发明的抗体作为封闭抗体，使用本专业领域技术人员熟知的技术，可以容易地分离出另外的识别相同抗原决定簇或抗原决定部位的单克隆抗体。
在本发明的一个方面，提供了人单克隆抗体，该抗体能够特异性地结合在多数（但不是全部）IATS血清型铜绿假单胞菌中存在的LPS决定簇上。例如这些决定簇可以存在于2或3个IATS血清型和在0，1或至少2个Fisher免疫型中。这种抗体可在活体中抵抗一些或全部的被识别的血清型和免疫型，典型的为2个或更多个血清型。
本发明的单克隆抗体在体外也具有广泛的用途。例如，该单克隆抗体可以用来定型，分离特殊的铜绿假单胞菌菌株，从非均质的细胞混合物中选择性地去除铜绿假单胞菌等等。
用于诊断时，该单克隆抗体可经标记，也可不标记。诊断性分析需要测定单克隆抗体与铜绿假单胞菌LPS结合所形成的复合物。未标记的抗体可用于凝集反应分析。此外，未标记的抗体还可与其它标记过的抗体（第二抗体）相结合来使用，即与单克隆抗体相反应的抗体，如对免疫球蛋白有特异性的抗体。再者，单克隆抗体可被直接标记。可使用的标记物种类很多，如放射性核素，荧光剂，酶，酶底物，酶辅助因子，酶抑制子，配位体（特别是半抗原）等等。很多免疫检测方法都是可取的，例如在美国专利3817827，3850752，3901654，3935074，3984533，3996345，4034074和4098876号中所述的那些方法，在此声明其内容合并于此。
本发明的单克隆体通常应用于酶免疫测定，即将本抗体或来自不同种的其它抗体与一种酶结合。当含有某一血清型的铜绿假单胞菌的样品（如人血或其溶解产物）与本抗体结合时，结合是发生在抗体和那些显示所需抗原决定簇的分子间。然后就可从未结合的反应物中分离出这些细胞，加进第二抗体（被一种酶标记）。之后，测定特异地结合到细胞上的抗体一酶结合物的存在。也可以使用本技术领域熟知的其它常规技术。
在测定铜绿假单胞菌感染或铜绿单胞菌抗原的存在时，和本抗体一起使用的还有试验药盒。因此，本发明的单克隆抗体组合物通常是以冻干的形式提供（它可以是单独的或是与针对于其它的革兰氏阴性细菌的补加抗体连接的）。可以连接到标记物上的或未连接的抗体也包括于装有缓冲液（如Tris，磷酸盐，碳酸盐等）、稳定剂、生物杀伤剂、无活性蛋白（如牛血清蛋白，或其类似物）的药盒中。一般地，这些材料的量是以低于活性抗体的量的5%wt，且通常以基于抗体浓度的至少0.001%wt.的总量存在。为了稀释活性成分，还经常使用惰性膨胀剂或赋形剂，在此，赋形剂是以组合物总重量的1-99%的量存在。当使用到能够结合到该单克隆抗体上去的第二抗体时，它通常是装在一个单独的瓶中。第二抗体典型地连接到一种标记物上且是以类似于上面所述的抗体形成方式形成。
药用配方及其使用
本发明的单克隆抗体也可以作为药用组合物的成分与一种药用上有效的载体相结合，该药用组合物含有治疗量或预防量的本发明的至少一种单克隆抗体。药用载体应该是适合于给病人传送单克隆抗体的任何相溶性无毒物质。无菌水、乙醇、脂肪、蜡以及惰性固体都可作为载体。也可将药用佐剂（缓冲剂，分散剂）结合进药用组合物中。这些组合物可以含有单一的单克隆抗体以特异地针对于两种或多种但不是所有的铜绿假单胞菌IATS血清型。或者，药用组合物可以含有两种或多种单克隆抗体以形成一种“鸡尾酒”。例如，含有抗各种铜绿假单胞菌血清型和免疫型的人单克隆抗体的鸡尾酒将是一种通用产品，它具有抗许多的该特定菌株的临床分离物的活性。
令人感兴趣的是能够与至少三种IATS血清型（通常是至少四种，更经常的是至少五种IATS血清型）反应的预防和/或治疗单克隆抗体组合物。更令人感兴趣的是与至少大约七中血清型（最好至少十至十四种直至包括所有十七种IATS血清型）反应的单克隆抗体组合物。与IATS血型相连同。该组合物最好与至少一种免疫型（通常至少两种，更通常的是至少三或四种直至Fisher免疫型系统的所有七种免疫型）相反应。
该组合物中的每一种将包括至少一种抗体（通常至少两种，更通常是至少三种或更多），其中每一抗体与至少2，3，4或更多但不是所有的IATS血清型反应。以存在至少一种能结合至少两种IATS血清型和一种或多种Fisher免疫型（最好至少两种免疫型）的单克隆抗体为好。
组合物中不同单克隆抗体的总数最好是至少一种或等于或少于该组合物与其反应的IATS血清型总数的约二分之一（经常是该总数的三分之一）。
各种单克隆抗体成分的摩尔比通常不大于1∶10，经常是不大于1∶5，且对于每一其它抗体成分，其摩尔比是约1∶1-2。
本发明的人单克隆抗体也可以与其它的单克隆抗体组合物结合使用或者与现存的血浆产品（如用于预防或治疗人体铜绿假单胞菌疾病的商业上可得到的γ球蛋白或免疫球蛋白产品）结合使用。为了免疫球蛋白，血浆最好取自与铜绿假单胞菌反应的免疫球蛋白的水平提高了的献血者。祥见概要“Intravenous    Immune    Globulin    and    the    Compromised    Host”Amer.J.Med.，76（3a），March    30，1984，1-231页，在此声明其内容合并于此。
本发明的单克隆抗体也可以作为与抗生素或抗微生物试剂结合的单独服用的组合物使用。一般地，抗微生物剂可以包括与一种氨基糖基苷（例如：庆大霉素，tobramycin等）相结合的一种抗假单胞菌青酶素（例如，羧苄青霉素），但现有技术中非常熟悉的众多添加剂（如头孢菌素）也可以使用。
本发明的单克隆抗体及其药用组合物特别适用于口服或非肠道给药。尤其是，该药用组合物可以经非肠道（即皮下，肌肉或静脉）进药。因此，本发明提供用于非肠道服用的组合物，它包括一种人单克隆抗体的溶液，或者是一种溶解在一种可接受的载体最好是一种水溶性载体中的鸡尾酒。各种水溶性载体都可以使用，如水，缓冲过的水，0.4%的盐水，0.3%的甘氨酸和其类似物。这些溶液经过灭菌且通常除去了颗粒物质。这些组合物可以用非常熟悉的常规灭菌法灭菌。为了接近生理条件的需要，组合物可以含有象PH调节及缓冲剂一类的可以药用的辅助物质，例如，乙酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，乳酸钠等等。在这些配方中，抗体浓度的变化范围是很宽的，即，它可以少至小于约0.5%（通常为或至少约1%），也可以多至15或20%（重量），这主要是根据液体体积、粘度等进行选择，尤其是所选择的特定服用方式。
因此，可以制备一种用于肌肉注射的典型药用组合物，它含有1毫升的已缓冲过的无菌水和50毫克的单克隆抗体。而用于静脉注入的典型组合物，其构成是含有250毫升无菌的Ringer′s溶液和150毫克单克隆抗体。制备非肠道服用的组合物的实际方法对于本领域的技术人员来说，是已知的或显而易见的。例如，在Remingten′s    Pharmaceutical    Science，第15版，Mack    Publishirg    Compeng，Easton，Pennsglvania（1980）中有更详细叙述，在此声明其内容合并于此。
本发明的单克隆抗体可以冻干保存，使用前在一种合适载体中复原。这一技术对于常规的免疫球蛋白已显示是有效的，现有的冻干和复原技术均可以使用。本领域的技术人员都知道，冻干和复原都可以导致抗体活性的不同程度的丧失（例如，对于常规的免疫球蛋白，Ig    M抗体比Ig    G抗体具有更大的活性丧失趋势），因此，为了补偿损失，必须调整用量。
含有本发明的人单克隆抗体的组合物或其鸡尾酒可以被服用而用于预防和（或）治疗铜绿假单胞菌感染。当用于治疗时，给已被一种或多种铜绿假单胞菌血清型感染的病人服用足量的组合物，以治疗或至少阻止其感染和其并发症。能够达到这一目的的量称作“治疗有效剂量”。其有效用量依赖于感染的严重程度以及病人自身免疫系统的总状态，但是其范围一般是每千克体重约1至200毫克抗体，更常用的是每千克体重5至25毫克。应当注意的是，本发明的物质一般是在严重疾病状态的情况下使用，即在由于铜绿假单胞菌的感染而带来细菌和内毒素血危及生命或潜在的危急生命的情况下使用。在这种情况下，考虑到不存在体外物质以及由本发明的人单克隆抗体带来的不存在“外源物质”排斥反应，治疗医师可能会觉得必要而且有可能给病人服用实际过量的这种抗体。
在用于预防方面，可以给还未被铜绿假单胞菌感染的病人服用含有本发明的抗体的组合物或其鸡尾酒，以增强病人对于这种潜在感染的抵抗力。该剂量被称作“预防有效剂量”。在这种情况下，精确的用量再次依赖于病人的健康状况和总的免疫水平，但是一般范围为每千克体重0.1至25毫克，尤其是每千克体重0.5至2.5毫克。
在单个或多样的服用本发明的组合物时，所用的剂量水平和方式由治疗医师选定。在任何情况下，该药用配方都应该提供对有效地治疗病人为足量的本发明的抗体。
实施例
实施例1
实施例1说明可与IATS血清型2，5和16及Fisher免疫型3和7反应的人的单克隆抗体（Ig    M同型）的生产方法。
得自已知受到铜绿假单胞菌慢性感染的囊性纤维变形患者的外周血样用作人B细胞的来源。通过在Ficoll-Paque上的标准离心技术（Boyum，A.，Scand.J.Clin.Lab.Invest.（1968）21：Suppl.97，77-89）从血液中分离出单核细胞并在无钙/镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤两次。
用改良的E-玫瑰花结程序从T-细胞中除去单核细胞。简言之，先在4℃下将细胞重新悬浮在含有20%牛胎儿血清（FCS）的PBS中使浓度达1×107个细胞/ml。然后将1ml该悬浮液放在一支17×100mm聚苯乙烯圆底试管中，加入1×1092-氨基-异硫脲鎓溴（AET）-处理来自10%（v/v）Iscove改良Dulbecco培养基（Iscove培养基）溶液的羊红血细胞（Madsen，M.and Jehnson，H.E.，J.Immun.Methods（1979）27：61-74）。在4℃下轻轻混合悬浮液5-10分钟，然后在4℃下以2500×g在Ficoll-Paque上离心8分钟除去E-玫瑰花结细胞。收集连结在界面处的E-玫瑰花结阴性外周血单核细胞（E-PBMC）并在Iscove培养基中洗涤一次，然后再悬浮在含有15%（v/v）FCS，L-谷氨酰胺（2mmol/l），青霉素（100 IU/ml），链霉素（100μg/ml），次黄嘌呤（1×10-4M），氨基蝶呤（4×10-7M），和胸苷（1.6×10-5M）的同样培养基中。以下称此培养基为HAT培养基。
E-PBMC的细胞从动转化伴随着将这些细胞与一个转化细胞株一起共同培养。转化细胞株是Epstein-Barr核抗原（EBNA）阳性人淋巴母细胞细胞株，该细胞株通过GM1500淋巴母细胞细胞株的甲磺酸乙酯（EMS）诱变，继之以在30μg/m16-硫代鸟嘌呤存在时选择而得到，这些细胞表现次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶（HGPRT）缺失，从而对HAT敏感。该细胞株被命名为1 A2细胞株并在1982年3月29日贮藏在美国典型培养物保藏中心（A.T.C.C.），A.T.C.C.贮藏号为CRL8119。将对数生长期的1AZ细胞株悬浮在HAT培养基中，然后以每个E-PBMC有8-IAZ的比例与E-PBMC合并。将细胞混合物放入8个圆底的96孔微滴板（Costar 3799）中，每个孔有200μl体积，浓度为72，000个细胞/孔并在37℃下在含有6%CO2的湿润空气中温育。通过用新鲜HAT培养基取代-半上清液将培养物平板培养5-8天。每隔一天用倒置显微镜观察一次孔中的细胞增殖迹象，二次平板培养十二天，观察到100%的孔含有增殖的细胞，并且在多数孔中细胞具有足够除去并测试抗铜绿假单胞菌抗体上清液的密度。
用酶联免疫吸附测定（ELISA）技术（Engvall，E.，（1977）55：193-200）筛选有抗铜绿假单胞菌抗体的上清液。抗原平板由平底的96孔微滴板（Immulon    II，Dynatech）组成，其中的孔含有各种吸附到孔的底部的活细菌。为了促进细菌吸附到塑料上，将50μl/孔的多聚-L-赖氨酸（PLL）（在PH7.2的PBS中1μg/ml）在室温下温育30分钟。然后轻拂去未吸附的PLL，用PBS洗一次平板，将50μl在PBS中洗过的细菌悬浮物加入到每个孔中，平板在37℃培育1小时。用盐水-吐温[0.9%Na    Cl，0.05%（v/v）Tween-20]洗平板三次除去未吸附的细菌。用于筛选的各种抗原平板包括：（1）铜绿假单胞菌Fisher免疫型1，2和4（A.T.C.C.Nos.27312，27313，27315）的混合物;（2）铜绿假单胞菌Fisher免疫型3，5，6和7（分别为A.T.C.C.Nos.27314，27316，27317，27318）的混合物;和（3）没有细菌的微滴板。
先用200μl/孔的封闭缓冲液[PBS，PH7.2，含有5%（w/v）无脂肪干乳，0.01%（v/v）防沫剂A（Sigma），和0.01%（w/v）乙基汞硫代水杨酸钠]封闭平板开始ELISA，封闭后，用盐水-Tween洗平板三次。然后将50μl    PH7.2的含有0.1%    Tween-20的PBS和0.2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）放在所有孔中。从培养平板的孔中取出上清液，放入相应的抗原平板的孔中（50μl/孔）并在室温下将平板培育30分钟。然后除去上清液，用盐水-Tween洗涤孔三次，并将50μl适当稀释的辣根过氧化酶（HRP）共轭山羊抗人Ig    G+Ig    M（American    Qualex    International    ＃    A114+＃A1124）加入到孔中。在这个实施例中，在PH7.2的含有0.05% Tween-20的0.1% BSA的PBS中使用最终稀释度分别为1∶5000和1∶3000的HRP-山羊抗-Ig G和HRP-山羊抗-Ig M。在室温下温育30分钟之后，除去过量的酶共轭山羊抗体并用盐水-Tween洗涤孔三次。然后将100μl底物（含0.8mg/ml含二盐酸对-苯二胺100mM的柠檬酸缓冲液，PH0.5，加上含0.03%H2O2的去离子H2O，在平板培养前等体积混合）加入到每个孔中。在暗处培育30分钟后，将50μl 3N H2SO4加到所有孔中终止反应，含有可与平板培养的抗原反应的抗体的培养物上清液通过在相应孔中的阳性颜色显色被检测并通过在Bio-Tek EL-310微量ELISA读数器上测定490nm处的吸光度定量测定反应强度。
用上述方法分析培养物上清液使得有可能鉴定两个含有抗铜绿假单胞菌抗体的孔（1    C1和ZH12），抗-铜绿假单胞菌抗体可与Fisher免疫型3，5，6和7平板而不是Fisher免疫型1，2和4平板或无细菌平板反应。为了鉴定所识别的特异性Fisher免疫型，如上所述为每种免疫型制备只含有一种Fisher免疫型的PLL固定细菌的抗原平板。如上所述用来自各个免疫型平板的1    C1和ZH12孔的培养物上清液进行的ELISA分析表明这两个孔含有对Fisher免疫型3和7有特异性的抗体。在铜绿假单胞菌分型菌株（得自A.T.C.C.并包括33348-33364号）的IATS板上进行的相似的ELISA说明在1    C1和ZH12孔中的抗体可特异地与IATS菌株2，5和16反应。
除了HRP-山羊抗人Ig    G和HRP-山羊抗人Ig    M单独用作第二步试剂，而不合并以外，用类似于上述特异性试验的ELISA测定法测定了在1    G1和ZH12中的同型活性抗体。用抗-Ig    M试剂只观察到在1C1和ZH12中的抗体与Fisher免疫型3和7的阳性反应，说明在每个孔中的相应抗体的Ig    M同型。
为了测定抗-Fisher免疫型3和7反应类型是否是由于在1    C1和ZH12孔中有一种或多种抗体（即，一种抗体与Fisher免疫型3和7两者都起反应或两种抗体，一种与Fisher免疫型3反应，另一种与Fisher免疫型7反应），以低密度传代培养来自两个孔的细胞并在单独的Fisher免疫型3和Fisher免疫型7细胞抗原平板上测定含有增殖细胞孔的抗体活性。在96孔的圆底平板中以5个细胞/孔的密度在总体积为100μl的缺乏氨基蝶呤成分的HAT培养基（HT-培养基）中进行传代培养。
在所有孔中都含有密度为500个细胞/孔的非转化，HAT敏感淋巴母细胞作为饲养细胞。平板培养四关，将100μl    HAT培养基加到所有孔中选择性地杀死饲养细胞。再用HAT培养基取代一半上清液在培养的第9天加到孔中。此后，每4-5天以相似的方法把HT培养基加到孔中直到孔中的淋巴母细胞密度足够用ELISA进行上清液分析为止。当在单独的Fisher免疫型3和Fisher免疫型7抗原平板上测定时，所有可与Fisher免疫型3反应的上清液也可与Fisher免疫型7反应，表明一种抗体担负对两种Fisher免疫型的活性。在IATS菌株2，5和16上测定时发现任意选择的上清液可与所有三种菌株而不是个别菌株反应，进一步支持一种抗体可与Fisher免疫型3和7及IATS菌株2，5和16交叉反应的结论。
来自1    C1和2    H12孔的特异性抗体产生细胞的克隆伴随着来自每个孔的细胞单独经受几个回合的限制稀释克隆直到用上述ELISA方案所测定的所有克隆上清液导致对Fisher免疫型3和7及IATS菌株2，5和16的阳性反应。利用上述饲养细胞传代培养克隆。用这种方法，获得了两个克隆的转化人细胞株（1    C1和2    H12），这些细胞株是连续的（永久的）并且各自都分泌可与Fisher免疫型3和7及IATS菌株2，5和16反应的人的单克隆抗体。在这个实施例中，细胞株及其产生的抗体具有同样的名称。
实施例Ⅱ
实施例Ⅱ说明可与IATS血清型2，5和16及Fisher免疫型3和7反应的人的单克隆抗体（Ig G同型）的生产方法生产方案与实施例Ⅰ基本相同。简言之，得自已知受到铜绿假单胞菌慢性感染的囊性纤维变形患者的外周血样用作人B细胞的来源。除了将1.6ml的PBS悬浮液与1.6×109AET-处理羊红血细胞悬浮液一起使用外，如实施例Ⅰ所述分离单核细胞。细胞从动转化也是相同的，例外之处为：每个E-PBMC与1 A2细胞的比例为7.5;使用15个17，000个细胞/孔的平板;将培养物平板培养6-10天;在平板培养的第16天，几乎所有孔都含有增殖细胞。
如上所述进行培养物上清液的特异性抗体筛选，并导致找出一个含有一种可与Fisher免疫型3，5，6和7平板，而不是Fisher免疫型1，2和4平板或无细菌平板反应的抗体的孔（9D1）。在单独的免疫型或血清型细菌抗原平板上用9    D1培养物上清液进行的所述的ELISA测定表明一种对Fisher免疫型3和7，以及IATS菌株2，5和16都有特异性的抗体。按照实施例Ⅰ所进行的随后研究说明在9    D1孔中的抗体特异性归因于分泌Ig    G同型抗体的单一克隆。
实施例Ⅲ
实施例Ⅲ说明本发明的某些抗体的抗原特异性。
为了确定单克隆抗体1 C1，2H12，和9 D1是否可与同样的抗原性靶反应，因而具有相同的特异性，进行了另外的测定。首先，在参考菌株和临床分离的铜绿假单胞菌的板上在ELISA试验中比较这些抗体。ELISA程序除做了以下修改外如上所述：1）代替吸附到PLL涂层的平板上的细菌，平板的孔含有各种完整的细菌，这些细菌都被用乙醇固定到孔的底部。将50μl用PBS洗过的细菌悬浮液（OD660＝0.2）加入到孔中，平板在500×g下离心20分钟，吸出PBS，加入75μl乙醇再离心10分钟，除去乙醇，然后空气干燥制备平板。抗原平板上含有IATS菌株2，5，11，和16（A.T.C.C.号分别为33349，33352，33358，和33363）和16株预先通过按产品说明书用Difco[Detroit，Michigan]细菌用铜绿假单胞菌抗血清进行凝聚反应和通过ELISA（如本文所述）分为血清型2，5，16，或这种血清型的结合型的临床分离菌;2）除抗-IATS16以1∶250稀释外，兔分型抗血清以1∶500的稀释度用在PBS稀释。用含有1    C1，2H12和9    D1抗体的培养物上清液;3）作为第二步试剂，将以1∶500稀释的生物素化（biotinylated）蛋白A（B-2001，Vector    Laboratories，Inc.，Burlingame，CA）和以1∶500稀释的生物素化山羊抗人Ig（4703，Tago，Inc.，Burlingame，CA）分别用于兔和人抗体的检测。将15μl试剂加入到适当的孔中并在室温下培育30分钟后，除去未结合的试剂，洗孔三次。然后将50μl预先形成的抗生物素蛋白：生物素化辣根过氧化酶复合物（Vectastain    ABC    Kit，Vector    Laboratories，Inc.，Burlingame，CA）加入到每个孔中。在室温下温育30分钟后，除去过量的Vectastain    ABC试剂，并在加入底物之前再洗孔三次。
如表Ⅱ所示，测定结果表明抗体1    C1和9    D1与分为IATS2，5或16血清型的每个临床分离菌株反应。而抗体2H12不与这三个分离菌株反应。这表明抗体2H12可识别的抗原决定簇与1    C1或9    D1所识别的不同，并且显然两种抗原决定簇可同等地在大多数而非所有相应于IATS血清型2，5或16的临床分离菌株上表达。
表Ⅱ
Difco细菌用铜绿假单胞菌抗血清
和人的单克隆抗体2    H12，1    C1，
和9    D1对分型菌株和铜绿假单胞
菌临床分离菌株的反应作用类型
兔    人
分型菌株或
IATS    IATS    IATS    IATS    MAb    MAb    MAb
临床分离菌株    α2    α5    α16    α11    2H12    1C1    9D1
IATS    2    +    -    -    -    +    +    +
IATS 5 （+）a+ - - + + +
IATS 16 （+）a（+）a+ - + + +
IATS    11    -    -    -    +    -    -    -
A523    +    +    -    -    +    +    +
B406 + + （+）a- + + +
C27    +    +    -    -    +    +    +
D26    +    +    -    -    +    +    +
F155    +    +    +    -    +    +    +
F225 + （+）a+ - + + +
F250    +    +    -    -    +    +    +
F253    -    +    -    -    +    +    +
F255    +    +    -    -    -    +    +
F256    +    -    -    -    -    +    +
F396    +    +    +    -    +    +    +
H217    +    +    +    -    +    +    +
H218    +    +    -    -    +    +    +
H219    -    +    -    -    +    +    +
H220    +    +    -    -    +    +    +
H221    +    +    -    -    -    +    +
a（+）＝ELISA反应很弱的阳性
这些资料进一步表明被抗体1    C1和9    D1所识别的分子靶很可能存在于所有临床分离的铜绿假单胞菌上，这些临床分离菌株可分为属于IATS血清型2，5或16的类型，而被抗体2    H12所识别的靶在这种分离菌株的亚型上表达。
为了确定1    C1，2H12和9    D1抗体是与不同的抗原反应还是选择性地与具有在大多数而非所有IATS2，5和16血清型上表达的这种抗原决定额的同一抗原上的不同的抗原决定簇反应，进行了免疫吸附分析。因为在IATS2，5和16之间共同具有的抗原性明显地是由于热稳定性抗原（Liu，P.V.等人，supra）和与以前就注意到的热稳定性是脂多糖分子的特性相一致，所以选择来自IATS菌株2，5，16和11的LPS制剂。在60℃下在盐水中提取从分型菌株中制备粗制品LPS（Orskov，F.等人，Acta.Path.Microbiol.Scand.（1971）Section    B79：12-152）。从每种血清型中取10μg    LPS，LPS的量通过2-酮-3-脱氧辛酯（KDO）含量确定（Karkhanis，Y.D.等人，Anal.Biochem.（1978）85：595-601），在10-20%梯度凝胶上进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（Hancock，R.E.W和Carey，A.M.，J.Bacteriol.（1977）140：901-910）。使分离的各种分子从凝胶转移到在别处所述的硝化纤维素膜（NCM）上（Towbin，H.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1979）76：4350-4354）并将NCM吸附膜在PBS-Tween中放1小时（Batteiger，B.，等人，J.Immunol.Meth.（1982）55：297-307）。然后在室温下在20ml来自1 C1，2 H12，或9 D1细胞株用过的培养物上清液中将吸附膜培育1小时。在PBS-Tween中漂洗5分钟后，将每张NCM吸附膜在25℃下在1∶1000或1∶1500稀释度（用PBS-Tween）的碱性磷酸酯酶共轭的山羊抗人Ig G+Ig A+Ig M（Zymed）中温育1小时。然后在PBS-Tween中洗涤吸附膜5分钟，洗涤后通过在25℃下在30ml氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（NBT-BCIP）底物中按照Leary等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983）80：4045-4049中所述的方法温育吸附膜15-20分钟可目测抗原-抗体相互作用时间。在去离子水中漂洗吸附膜数次停止显色。
用三种抗体所得到的吸附轮廓是显著不同的。抗体2    H12主要识别在血清型2，5和16抗原制剂中-系列短的有规则间隔的（即，梯状的）低分子量分子。某些有规则间隔的较高分子量分子也可被微弱地识别。在来自血清型11的LPS制剂上观察不到反应。为了破坏蛋白抗原使用预先用蛋白酶K在60℃处理的LPS制剂重复进行免疫吸附分析未引起外形的改变。低分子量的带恰恰相应于在类似方法进行的SDS-PAGE凝胶中所看到的较小的LPS分子，在SDS-PAGE凝胶中不将抗原转移到NCM上而是特异地使抗原着色显示LPS（Tsai，C.M.和Frasch，C.E.，Anal.Biochem.（1982）119：115-119）除了在银染色凝胶上的最低条带（代表核心区加上LPS的类脂A）不被识别。抗体1    C1识别血清型2，5和16而非11的抗原制剂中的相同系列的有规则间隔的低分子量分子，尽管反应强度不象用2H12所进行的反应强度那么强，此外，这种抗体也主要识别血清型2，5和16上的一系列有规则间隔的较高分子量分子，它们与识别的较低分子量条带共同产生独特的，完全梯状轮廓。通过用蛋白酶K预处理抗原制剂不改变这些轮廓，其次，除了未识别出代表核心加类脂A的条带以外这些轮廓相应于在LPS特异染色凝胶中观察到的梯状谱带（即，它们是逐带对应的）。抗体9    D1具有与在IATS2，5和16，而非11上的菌株上的抗体1    C1相同的反应轮廓。而且，未识别出不同LPS制剂的银染色凝胶泳道的最下面的条带并且通过用蛋白酶A预处理LPS制剂不改变整个轮廓。这些观察结果都表明血清型2，5和16的LPS是被2    H12，1    C1，和9    D1抗体识别的分子靶。
实施例Ⅳ
实施例Ⅳ上面本发明的一种抗体的保护性活性。
为了评价抗体1    C1在活体内保护能力，在小鼠中进行了动物保护研究。首先通过用饱和硫酸铵（50%终浓度）沉淀从用过的培养物上清液中使1    C1
浓缩（Good，A.H.，等人，Selected    Methods    in    Cellular    Immunology，Mishell，B.B.和Shiigi，5S.M.，eds.，W.J.Freeman    &    Co.，旧金山，CA，279-286（1980））。在最小体积的无菌水中重新悬浮沉淀物，在PBS中广泛地透析，并无菌过滤。作为阴性对照，用类似的方法处理来自另一种产生对IATS菌株11的LPS特异的人的单克隆抗体的转化的人细胞株（6F11-A.T.C.C.CRL8562号）的培养物上清液。
将体重在20-22g之间的雌性BALB/C小鼠分为两组，每组30只。通过用0.5ml浓缩的ICI或6 F11抗体分别腹腔（ip）进入接种每组的所有小鼠。6小时后，把两组的每一组都再分为三组，每组10只。每组的10只小鼠都分别用0.3ml含有5LD50的IATS菌株2，5或11的活细菌悬浮液单独进行腹腔攻击。由在对数生长期的肉汤培养制备细菌悬浮液，从肉汤培养中将细菌离心，在PBS中洗涤两次并在PBS中重新悬浮到适当的密度。每组由4或5只小鼠组成的对照组用0.5ml PBS进行腹腔内注射并在6小时后用5LD50的同样血清型进行腹腔内攻击。细菌攻击之后，观察动物5天。
如表Ⅲ所示，抗体ICI对于IATS2和IATS5两种血清型，而不是IATS11血清型提供特异而有效的保护。在未经保护的动物中进行细菌攻击后的典型过程包含内毒休克的不同时期并通常伴随着死亡，只给PBS的对照动物经历急性内毒休克并且所有动物都迅速死亡。供给非同种抗体（6F11）的阴性对照动物有一段更长的休克期，其特征为在表Ⅲ脚注“a”中所列的症状。后来这些动物中有些痊愈了，可能是由于在抗体制剂中共同浓缩的非抗体成分的作用。然而得到保护性同种抗体的动物仅表现出较轻的内毒血症的症状。这些症状在接种24小时之内消失，然后动物在整个剩下的5天观察期中着起来是健康的。
表Ⅲ
人的单克隆抗体ICI对IATS血清型
和5的保护作用的体内证明
存活动物数/受攻击动物数
用下列物质攻击5天后
人的单克隆抗体    IATS2    IATS5    IATS11
ICI    8/10    10/10    3/10
6F11    0/10    1/10    10/10
PBS    0/4    0/4    0/4
a在注意到非特异性保护的情况下，感染后的恢复与在同种抗体和总染菌株，即，具有IATS2或5的IC    I和具有IATS11的6    F11中所看到的恢复明显不同。在后一种情况下，对于细菌攻击后24小时表现正常的动物来说恢复是基本完全的。然而，在非特异情况下，小鼠在恢复到正常状态之前有几天表现急性感染症状（即，腹泻，硬皮睑，波缘毛皮“隆起的”外形，和缓慢运动）。显然这种非特异性保护是由于共同浓缩并注射到动物体内的非抗体成分的作用，因为只给PBS的所有动物都死亡了。
利用同样的方法，进行了第二次试验，在第二次试验中用Fisher菌株2，3或7攻击各组小鼠并观察动物5天。如表Ⅳ所示，抗体ICI又对具有Fisher免疫型3和7的其它方面的致死感染提供特异而有效的保护，但对Fisher免疫型2是无效的。
表4
活体中人单克隆抗体1C1抗Fisher免疫型3和7的保护作用
存活数/试验数
（用下列物质攻击后5天）
人单克隆抗体    Fisher3    Fisher7    Fisher2
1C1    10/10    10/10    1/10a
6F11    0/10    7/10a    10/10
PBS    0/5    0/5    0/5
a.表Ⅳ角标，表示极可能是由于非特异性保护而存活的。
实施例Ⅴ：
实施例Ⅴ说明生产与铜绿假单胞菌的IATS血清型4和11及Fisher免疫型2反应的人单克隆抗体的方法。重复实施例Ⅰ-Ⅳ所述方法，对分离二、定性、和测定抗体几步需加修饰。下面叙述该方法的修饰及用这里所述单克隆抗体得到的结果。
人的B细胞来源于予先用从Fisher免疫型3分离的一种高分子量的多糖免疫的个体（Pier，G.B.等人文章，刊在Infec.Immun.（1984）45：309～313，其内容合并于此）。
用转化细胞株1A2与这些细胞共同培养，从而完成EPBMC的细胞控制的转化。将对数生长期的1A2细胞悬浮在HAT培养基中，再以每个EPBMC比15个1A2的比例加入EPBMC细胞。将细胞混液放入14个微滴定板中，每孔滴200μl，含细胞62，000个。培养的第7天和第10天补喂培养物，第15天观察到100%的孔都含增殖的细胞。
为筛选抗铜绿假单胞菌的抗体，用两种抗原平皿，包括（1）铜绿假单胞菌Fisher免疫型1到7的混合物（ATCC号分别为No27312，27313，27314，27315，27316，27317和27318）和（2）PLL处理的不含细菌的微滴定板。
用上面例子中的方法分析培养物上清液鉴定出约有100个孔含有与Fisher免疫型1～7板反应的抗铜绿假单胞菌抗体，但没有与不含细菌的PLL处理的微滴定板反应。为鉴定可识别的特定Fisher免疫型，如上述设计抗原板，其中每行孔内只含一种Fisher免疫型PLL固定的细菌。如上述进行EIISA试验，将抗铜绿假单胞菌阳性孔中取出的培养物上清液放在新抗原板的纵行各孔中，鉴定出含有Fisher免疫型2特异性抗体的几个孔。为进一步分析抗Fisher免疫型2抗体的血清特异性，将上清液置于设计好的各孔中分别含有铜绿假单胞菌17种IATS血清型的抗原板进行相似的ELISA试验。结果表明大部分上清液是对IATS血清型11特异的，只有一个即6D6孔对IATS血清型4，11，13和14显示交叉反应特异性。
为确定抗IATS血清型4，11，13和14交叉反应型是由于孔6D6的单抗体还是多重抗体引起的，将孔6D6中上清液分别被IATS血清型4，7（阴性对照），11，13和14吸收，再将吸收过的上清液置于含这五种血清型之一的PLL固定的细菌中进行上述ELISA试验。在冰上用等体积的上清液重悬聚集的细菌细胞沉淀半小时，再离心将细菌与上清液分开。这个试验结果表明吸收的IAT血清型4和11彼此具有抗体活性，但对IATS血清型7，13或14不具活性。这说明在6D6孔中至少有两种不同的抗铜绿假单胞菌的抗体，至少有一种与血清型4或11起交叉反应的抗体。
通过三步可以从6D6孔培养物分离和克隆适合产生抗体的细胞。第一步涉及20个细胞/孔的细胞低密度亚培养，然后将从第一轮低密度亚培养中产生的抗IATS血清型4+11阳性孔中得到的细胞再进行另一轮低密度亚培养（5个细胞/孔）。每轮亚培养均在96孔的园型底平板中，以上述密度在无氨基蝶呤的100μl    HAT培养基（HT培养基中）中进行。将未转化的HAT敏感的淋巴样干细胞以500细胞/孔的密度保温培养，作为喂养者细胞。培养4天后，每孔中加入100μl    HAT培养基以杀死喂养细胞。在滴入孔后9天，用HAT培养基换掉一半上清液来喂养孔内细胞。然后，每隔4～5天用HT-培养基以相似方式喂入一次，直至孔内有足够用于上述ELISA试验的淋巴样干细胞密度为止。
在每个试验中，那些与IATS血清型4反应的上清液也都与IATS血清型11和Fisher免疫型2反应。此外，抗IATS血清13和14的抗体活体失去了，这证实了前述的特异性转移。
通过将低密度细胞（1个细胞/孔）移至72孔的Terasaki板（Nunc＃-36538）（10μl/孔）来有效地克隆产生特定抗体的细胞。将平板置于温育器中3小时使细胞沉至板底，然后在显微镜下划出含单个细胞的孔。将每个单个细胞分别置于含喂养者细胞的96孔园底板，如上述进行低密度亚培养。根据上述方法进行ELISA试验时，所有出现克隆的上清液都是抗IATS血清型4和11阳性的。
通过这些方法得到一个克隆的转化的人细胞株，它可连续生长（长生不死），并分泌与Fisher免疫型2反应并与IATS血清型4和11交叉反应的人单克隆抗体。在这个例子中，产生的细胞株和抗体采用同样的代号（即6D6）。
6D6孔中抗体的同型是通过与上述特异性试验相似的ELISA试验测定的，只是HRP-山羊抗人Ig    G和HRP-山羊抗人Ig    M分别被用作第二步试剂，而不是结合使用。6D6孔中抗体与Fisher免疫型2和IATS血清型4和11的阳性反应仅在有抗-Ig    M试剂时才可观察到，这说明Ig    M为该抗体的同型。
通过例3所述的免疫吸附分析，用6D6抗体识别各种分子的生化特性，只是从Fisher免疫型2及IATS血清型4和11中选用LPS制备液作为分析用抗原制备液。Fisher免疫型1的LPS制备液作为阴性对照。
分析前，用离解缓冲液（含0.125M    Tris，4%（w/v）SDS，20%（v/v）甘油，10%（v/v）β-巯基乙醇，0.4%（w/v）溴酚兰，pH6.8）将每种LPS粗液以1∶1比例稀释，超声处理5分钟。为分解样品中的蛋白，以40%（w/w）酶对LPS的比率在各样品中加入蛋白酶K（1mg/ml），在60℃温育2小时，1小时后超声处理5分钟。再将样品加热到100℃，持续5分钟，在微离心机中离心2分钟。
将代表10μg各种菌株的LPS样品澄清液按上述进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。将分离的各种分子转移到NCM，将各个NCM在6D6细胞株得来的10ml培养物上清液中，于室温下温育2小时。方法如上述。
仅在含Fisher免疫型2，IATS血清型4或IATS血清型11的LPS的泳道中发现了阳性的结果。在Fisher免疫型2和IATS血清型11泳道中，抗体6D6识别出一系列有规则间隙的低分子量的（即类似梯子）短带，可肉眼观察到它们准确地对应在NCM上没转移抗原的SDS-PAGE凝胶上较小的LPS分子，因而不用特异地染色，只是在银染色凝胶上最低分子量的带（代表LPS核心区加上类脂A）没有被识别。相反，在含IATS血清型4LPS，抗体6D6的泳道，抗体6D6识别出几乎跨越凝胶全长的有规则间隔的一系列带，在高分子量带中发生了剧裂的反应。进而，这个图谱对应于在LPS特异染色凝胶中观察到的类似梯子的带状图（即好象是带带对应的），只是代表核心部分加上类脂A的带未被识别。这些资料清楚地说明，LPS的O-侧链是抗体6D6在Fisher免疫型2和IATS血清型4及11上识别的靶子。
为估价活体中抗体6D6的保护能力，用小鼠进行动物保护试验。首先用饱和硫酸铵沉淀培养物上清液未浓缩抗体6D6（终浓度为50%）。用最低限体积的无菌水重悬沉淀的材料，在PBS中透析，再无菌过滤。作为阴性对照，将产生人对Fisher免疫型1的LPS特异性的单克隆抗体的另外转化的人细胞株培养物上清液（C5    B7-ATCC    NoCRL8753）以同样方式处理。同样，作为阳性对照，将产生人对Fisher免疫型2和IATS血清型11的LPS特异性的单克隆抗体的转化细胞株6F11（ATCCNoCRL8562）的培养物上清液浓缩。
将体重为20到22克的雌瑞士Webster子鼠分为三组，每组20只。将每组小鼠腹腔内注射0.5ml浓缩的6D6，C5    B7或6F11抗体。6小时后，将每组中20只鼠再分为四组，每亚组的5个鼠分别用含8LD50的Fisher免疫型1，2，IATS血清型4或11的活细菌悬液攻击。如例Ⅳ中所述方法制备细菌悬液。细菌攻击后，观察动物5天，结果如下：
表Ⅴ
活体中人单克隆抗体6D6抗Fisher免疫型2和IATS血清型4和11的保护作用
存活数/试验数
（用下列物质攻击后5天）
人单克隆抗体    Fisher1    Fisher2    IATS4    IATS116D6    0/5    5/5    4/5    5/5
6F11    0/5    5/5    0/5    5/5
C5B7    5/5    1/5    0/5    0/5
如表Ⅴ所示，抗体6D6对Fisher免疫型2，IATS血清型4和IATS血清型11的致死攻击提供特异而有效的保护，但对Fisher免疫型1没有这种作用。
实施例Ⅵ：
实施例Ⅵ叙述生产与铜绿假单胞菌的IATS血清型6和13及Fisher免疫型1反应的人单克隆抗体的方法。重复实施例Ⅰ到Ⅴ的方法，但在分离、定性和测定抗体等步骤需作修饰。下面叙述了步骤上的修饰及用这里叙述的单克隆抗体所得的结果。
人B细胞来源于用从Fisher免疫型2（见Pier等人，Infec.Immun.，34;461（1981））分离的高分子量多糖免疫的个体。如上所述地收集EPBMC后，将细胞冷冻在一个液氮蒸气罐里，内装含10%（v/v）DMSO的FCS。然后在37℃快速解冻，在Iscov氏溶液中洗一次，再重悬在HAT溶液中。以每个E-PBMC比15个1A2的比例转化细胞。将细胞混液以78，500细胞/孔的浓度置于20个微滴定盘中，每培养3～5天加培养基，第11天时观察到100%的孔都含增殖细胞。
用ELISA技术筛选有抗铜绿假单胞菌抗体的上清液，抗原平板由铜绿假单胞菌的Fisher免疫型1～7的混液组成（分别是临床分离物PSAI277（来自Genetic    Systems    Corporation    Organism    Bank    C“Gscon”）），ATCC27313，PSAG98（GSCOB），ATCC27315，PSAF625（GSCOB），ATCC27317和ATCC27318）。也用不含细菌的PLL处理过的微滴定板来筛选。
通过上述方法分析培养物上清液鉴定出有约200个孔含有与Fisher免疫型1～7板反应的抗铜绿假单胞菌的抗体，但在没有细菌的PLL处理的平板上没有该抗体。为鉴定含与两个或更多的IATS血清型反应的抗体的孔，要如上述建立抗原平板，其中一行孔内含仅一种IATS血清型的PLL固定的细菌。如上述用每个抗铜绿假单胞菌阳性孔的扩大培养物的上清液进行ELISA试验。将各种上清液置于新抗原板的各排孔中，结果鉴定出一系列孔含有与多重IATS血清型反应的抗体。一个命名为8HT孔含有对IATS血清型6和13特异的抗体。当用该孔上清液置于7个Fisher免疫型上如上述进行ELISA试验时，表明抗体8H7对Fisher免疫型1是特异的。
为鉴定抗IATS血清型6和13的反应模式是否是由于孔8H7中多重抗体之一所致，用IATS血清型6，13和17（阴性对照）分别吸收另一上清液等分试样，再用吸收的上清液在三种IATS血清型之一的PLL固定的细菌上如上述进行ELISA试验结果表明IATS血清型6和13吸附了彼此的抗体活性。IATS血清型17既不抗IATS6也不抗IATS13。这个资料说明抗IATS血清型6和13的反应模式是孔8H7中单个抗体所致。基本上如例Ⅴ所述，用三步完成从孔8H7上清液中分离和克隆产生抗体的细胞。用这些方法克隆的人转化细胞株能连续生长（即长生不死），并分泌与Fisher免疫型1反应又与IATS血清型6和13交叉反应的人单克隆抗体。本例中生产的细胞株和抗体都用8H7命名。使用相似于例Ⅴ中所述的方法，测定出8H7孔中抗体的同型物是Ig    M。8H7抗体识别的分子的生化特性是通过如上实施例Ⅲ和Ⅴ所述的免疫吸附法分析的，只是选用了Fisher免疫型1和IATS血清型6和13的LPS制备液作为分析用抗原制备液。选自IATS血清型10的LPS制备液作为阴性对照。
免疫吸附表明，仅仅含Fisher免疫型1，IATS血清型6或IATS血清型13LPS的NCM泳道的结果是阳性的。在Fisher免疫型1和IATS血清型6泳道中，抗体8H7识别有规则间隔的几条带，带长几乎与凝胶等长。这些带精确地与LPS分子的各个分子量相对应，正如用未将抗原转移到NCM上，但对LPS特别染色的SDS-PAGE凝胶电泳中所见的一样。在含IATS血清型13LPS的泳道中，抗体8H7识别更简单的一系列有规则间隔的并局限于凝胶的中上分子量部分的几条带。被识别的带对与在LPS特异染色凝胶中观察到的位置相对应，只是在染色凝胶中最高和最低分子量的带好象没有在Western吸附中被识别。这些资料清楚地说明LPS是被在Fisher免疫型1和IATS血清型6和13上的抗体8H7识别的分子靶子。
为估计抗体8H7在活体中的保护能力，如例Ⅳ和Ⅴ所述用小鼠进行动物保护研究。作为阴性对照，产生对Fisher免疫型2LPS特异的人单克隆抗体的转化后人细胞株（6F11-ATCCNoCRL8652）的培养物上清液以同样方式处理。作为阳性对照，使用产生对Fisher免疫型1和IATS血清型6的LPS特异的人单克隆抗体的转化人细胞株C5    B7（ATCC，NoCRL8753）上清液。
将体重为20到22克的雌瑞士Webster小鼠分成三组，每组30只。每组的所有小鼠都分别腹腔注射0.5ml浓缩的8H7，6F11或C5 B7抗体。四小时后，将这三组再分成10只三个亚组，每亚最小鼠分别用0.3ml含代表IATS6血清型（Fisher免疫型1的等同物）的临床分离物（A522）9.4LD50，0.3ml含IATS13参考血清型的5LD50或0.3ml IATS11（Fisher免疫型2等同物）参考血清型的10LD50腹膜攻击。如上例Ⅳ所述方法制备细菌悬液。细菌攻击后，观察试验动物5天，结果如下。
表Ⅵ
活体中人单克隆抗体8H7抗IATS血清型6和13的保护作用
人单克隆抗体    存活数/试验数
用下列物质攻击后5天
IATS6    IATS13    IATS11
8H7    9/10    6/10    1/10
C5    B7    9/10    0/10    0/10
6F11    0/10    2/10    10/10
如表Ⅵ所示，抗体8H7对IATS血清型6的致死攻击提供特异而有效的保护，而对IATS血清型11不提供这种保护，抗IATS血清型13的保护是低度的，可能是由于与血清型6分离物相比，它要求相对多的菌体达到LD50（前者每个单位形成3×10菌落，后者为2.6×10个）。在分别的实验中，抗体8H7全部保护了用3.5LD50的IATS血清型13分离攻击的5只鼠，也全部保护了用IATS6分离物攻击的5只鼠。
如前所述，令人欣赏的是本发明的细胞株提供了人单克隆抗体和它们的片段，它们对不同铜绿假单胞菌IATS血清型有交叉保护和交叉反应的作用。这将允许预防和治疗的组合物更易于进一步发展，使其能有效地抗由于如果不是全部也是大部分铜绿假单胞菌的感染。此外，该细胞株提供的抗体可用于免疫试验及其它已知方法。
虽然上面详述并举例说明本发明，但显然一些变化及修饰仍可在附件权项的范围内实施。

Claims (40)

1、一种组合物，它含有能特异性结合大多数但不是全部IATS血清型铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的人单克隆抗体或其结合片段。
2、根据权项1的组合物，其中所述的抗体在活体内抵抗至少两种IATS血清型。
3、根据权项1的组合物，其中所述的抗体在活体内抵抗三种IATS血清型。
4、根据权项1的组合物，其中所述的抗体能够结合2或3种IATS血清型。
5、根据权项4的组合物，其中所述的抗体在体内抵抗至少2种IATS血清型。
6、根据权项1的组合物，其中所述的抗体是与任何Fisher免疫型铜绿假单胞菌都不起反应的抗体。
7、根据权项1的组合物，其中所述的抗体是与一种Fisher免疫型铜绿假单胞菌反应的坑体。
8、根据权项1的组合物，其中所述的抗体是能够与两种或更多种Fisher免疫型铜绿假单胞菌起反应的抗体。
9、根据权项8的组合物，其中所述的抗体是能与三种IATS血清型相反应的抗体。
10、根据权项7的组合物，其中所述的抗体在活体内能抵抗至少两种IATS血清型和一种Fisher免疫型。
11、根据权项8的组合物，其中所述的抗体在活体内抵抗至少两种IATS血清型和至少两种Fisher免疫型。
12、一种组合物，它含有至少两种人单克隆抗体，所述抗体中至少有一种能够与在不是全体但至少两种IATS血清型铜绿假单胞菌上存在的可接触的脂多糖决定簇起特异性反应。
13、根据权项12的组合物，其中至少一种抗体是在活体内抵抗两种或更多种IATS血清型。
14、根据权项12的组合物，其中所述抗体在活体内抵抗三种IATS血清型。
15、根据权项12的组合物，其中所述的抗体能够结合三种IATS血清型。
16、根据权项12的组合物，其中所述的抗体是不与任何Fisher免疫型起反应的抗体。
17、根据权项12的组合物，其中所述的抗体是能与一种Fisher免疫型铜绿假单胞菌反应的抗体。
18、根据权项12的组合物，其中所述的抗体是能与两种或更多种Fisher免疫型起反应的抗体。
19、根据权项16，17或18的组合物，其中所述的抗体是在活体内抵抗IATS血清型和Fisher免疫型的抗体。
20、一种组合物，它含有抗体或其结合片段，该抗体或其片段能与多数但不是全部的IATS血清型和少数但大于1的Fisher免疫型铜绿假单胞菌起特异性反应。
21、根据权项20的组合物，其中所述的抗体或其片段与至少三种IATS血清型铜绿假单胞菌反应。
22、根据权项20的组合物，其中所述的抗体或其片段能与两种Fisher免疫型铜绿假单胞菌反应。
23、根据权项20的组合物，其中所述的抗体能在活体内抵抗至少两种IATS血清型和至少两种Fisher免疫型。
24、根据权项20的组合物，其中所述的抗体与IATS血清型2，5和16以及Fisher免疫型3和7相反应。
25、一种组合物，它含有抗体或其结合片段，该抗体和其片段能与多数但不是全部IATS血清型以及一种Fisher免疫型铜绿假单胞菌特异地结合。
26、根据权项25的组合物，其中所述的抗体或其片段能结合两种IATS血清型。
27、根据权项25的组合物，其中所述的抗体能在活体内抵抗至少两种IATS血清型和一种Fisher免疫型。
28、根据权项25的组合物，其中所述的抗体与IATS血清型4和11以及Fisher免疫型2起反应。
29、根据权项25的组合物，其中所述的抗体与IATS血清型6和13以及Fisher免疫型1相反应。
30、一种药用组合物，它含有任何根据权项1，12，20或25的组合物以及生理上可接受的载体。
31、一种治疗对菌血症或由铜绿假单胞菌造成的其它疾病敏感的患者的方法，该方法包括给患者施用治疗有效量或预防有效量的如权项1，12，20或25所述的组合物。
32、一种永存的转化的细胞株，它分泌与不是全部但至少两种IATS血清型铜绿假单胞菌起特异性反应的人单克隆抗体。
33、根据权项32的细胞株，它的ATCC号为CRL8941，9171或9258。
34、一种人单克隆抗体，它与抗原决定部位相反应，该抗原决定部位与权项33的细胞株所产生的单克隆抗体相反应。
35、一种测定铜绿假单胞菌的检验药盒，它包括含有至少一种人单克隆抗体的单克隆抗体组合物，其中所述的抗体与不是全部但至少两种IATS血清型铜绿假单胞菌反应，提供可检测信号的标记物与所述抗体共价结合或与同所述单克隆抗体相反应的第二抗体相键合。
36、一种用于治疗或预防铜绿假单胞菌感染的药用组合物，它包括至少抵抗两种IATS血清型铜绿假单胞菌的人单克隆抗体并与抗菌素，从人血浆免疫球蛋白来的γ球蛋白组分和（或）生理可接受的载体相结合。
37、根据权项36的药用组合物，其中从人血浆免疫球蛋白来的ν球蛋白组分是由对铜绿假单胞菌和（或）其抗原成分具有升高了的免疫球蛋白反应水平的人身上获得的。
38、根据权项36的组合物，它还包括与铜绿假单胞菌鞭毛或外毒素A起反应的单克隆抗体。
39、一种治疗对铜绿假单胞菌感染敏感患者的方法，该方法包括：
给所述患者施以预防量或治疗量的能与至少两种IATS血清型铜绿假单胞菌的脂多糖决定簇相结合的单克隆抗体，并结合一种或多种的下述物质：预防量或治疗量的能与铜绿假单胞菌鞭毛或外毒素A相反应的单克隆抗体;能与至少另外一种铜绿假单胞菌脂多糖分子血清型决定簇相反应的单克隆抗体;从人血浆来的γ球蛋白组分;从对铜绿假单胞菌和（或）其产物具有升高了的免疫球蛋白反应水平的人血浆中来的ν球蛋白组分;和抗菌素。
40、测定样品中铜绿假单胞菌的方法，它包括将所述的样品与能同至少两种IATS血清型铜绿假单胞菌相反应的单克隆抗体相结合;测定复合物的形成。
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