DE602004011105T2

DE602004011105T2 - Verfahren, peptide und biosensoren mit eignung zum nachweis eines breiten spektrums von bakterien

Info

Publication number: DE602004011105T2
Application number: DE602004011105T
Authority: DE
Inventors: Shite Malden SEBASTIAN; Gerard J. Holden COLPAS; Diane L. Lancaster ELLIS-BUSBY; Jennifer M. Framingham HAVARD; Mitchell C. West Bolyston SANDERS
Original assignee: Ethicon Inc
Current assignee: Ethicon Inc
Priority date: 2003-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2008-12-18
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: CN1902494B; WO2005042770A2; US20150184220A1; ATE382862T1; CA2557612C; US8609358B2; AU2004286342B2; CA2557612A1; US20070275423A1; US9315851B2; WO2005042770A3; US20140322790A1; AU2004286342A1; EP1692510B1; CN1902494A; DE602004011105D1; EP1692510A2; JP4864715B2; JP2007514409A

Description

Hintergrund der Erfindung
Wundinfektionen stellen eine der Hauptursachen der Gesundheitsausgaben in den Vereinigten Staaten dar. Ungefähr 5% aller chirurgischen Wunden werden mit Mikroorganismen infiziert und diese Zahl ist für Patienten, bei denen abdominale chirurgische Eingriffe durchgeführt werden, signifikant höher (10–20%). Bakterienarten wie Staphylokokken gehören zu den am meisten aus infizierten Wunden isolierten Organismen. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass Menschen das natürliche Reservoir für Staphylokokken in der Natur darstellen, wobei bis zu 50% der Population zu jedem Zeitpunkt innerhalb von Kolonien leben. Die Kolonisierungsraten sind innerhalb von Krankenhäusern signifikant höher, und zwar sowohl bei Gesundheitspersonal, als auch bei Patienten. Darüber hinaus sind die im Krankenhaus anzutreffenden kolonisierenden Organismen mit einiger Wahrscheinlichkeit gegenüber vielen Formen der antimikrobiellen Therapie resistent, was auf den starken Selektionsdruck zurückzuführen ist, der in der nosokomialen Umwelt existiert, in der Antibiotika häufig verwendet werden. Staphylokokken werden normalerweise als harmlose Kommensalen mitgeführt. Wenn jedoch eine Öffnung in der Epidermis auftritt, können sie schwere, sogar lebensbedrohliche Infektionen verursachen.
Staphylokokken stellen die häufigsten etiologischen Agenzien in chirurgischen Wundinfektionen dar. Andere derartige Agenzien schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Streptococus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae und Escherichia coli. Post-chirurgische Infektionen, die von einem der oben genannten Organismen verursacht werden, stellen signifikante Probleme für Krankenhäuser dar. Die am häufigsten angewandte Strategie, derartige Infektionen zu vermeiden, besteht in der Gabe prophylaktischer antibiotischer Arzneimittel. Während diese Strategie grundsätzlich effektiv ist, bringt sie auch den ungewollten Effekt mit sich, dass resistente Bakterienstämme gezüchtet werden. Die routinemäßige Verwendung von prophylaktischen Antibiotika sollte daher zur Vermeidung der Züchtung resistenter Stämme vermieden werden.
Ein im Vergleich zur routinemäßigen Prophylaxe besserer Ansatz besteht in der Durchführung eines guten Wundermanagements. D. h., dass die Wunde vor, während und nach der Operation frei von Bakterien gehalten werden muss und die Wunde während der Heilungsphase sorgsam auf mögliche Infektionen überwacht werden muss. Normale Überwachungsmethoden schließen die genaue Beobachtung der Wunde bezüglich langsamer Heilung, Anzeichen von Entzündungen und Eiter, sowie die Messung der Temperatur des Patienten zur Erkennung von Fieber ein. Unglücklicherweise sind viele Symptome erst dann erkennbar, wenn die Infektion bereits etabliert ist. Weiterhin wird der Patient nach seiner Entlassung aus dem Krankenhaus für die Überwachung seiner eigenen Gesundheit selbst verantwortlich und die Symptome einer Infektion können für einen Laien nicht unbedingt erkennbar sein.
Ein System oder ein Biosensor, der ein breites Spektrum von Bakterien, insbesondere während der frühen Phase der Infektion vor der Manifestation von Symptomen nachweisen kann, wäre sowohl für Patienten als auch Gesundheitspersonal vorteilhaft. Wenn ein Patient den Zustand einer Wunde auch nach der Entlassung aus dem Krankenhaus oder der Klinik überwachen kann, dann kann eine angemessene antimikrobielle Therapie früh genug eingeleitet werden, um eine ernsthaftere Infektion vermeiden zu können.
WO 03/063693 beschreibt Verfahren zum Nachweis einer Wundinfektion und zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines einzelnen Mikroorganismentyps, beispielsweise von Wundpathogenen in einer Probe, durch Inkontaktbringen einer Probe mit einem Enzym, das von dem Bakterium produziert oder sezerniert wird, und dem Nachweis einer Modifikation oder der Abwesenheit der Modifikation des Substrates als Indikator für die Anwesenheit oder Abwesenheit des Enzyms in der Probe.
Suter, S. et al. ((1991) European Respiratory Journal, 4:21; 6284–6292) beschreibt die protolytische Inaktivierung des α1-Proteinaseinhibitors in infizierten Bronchialsekreten aus Patienten mit zystischer Fibrose.
Nelson et al. (1998) Anal Biochem. vol. 260(2): 230–236 beschreibt die Inaktivierung von α1 Proteinaseinhibitor als breiten Screen zum Nachweis proteolytischer Aktivitäten in unbekannten Proben.
Zusammenfassung der Erfindung
Es wurde festgestellt, dass ein synthetisches Enzymsubstrat, humaner α1 Protease Inhibitor, in einem Testsystem zur Identifizierung verschiedener Mikroorganismenarten, wie Bakterien, die häufig Wunden infizieren, verwendet werden kann.
Humaner alpha-1 Proteinaseinhibitor (α1-PI) ist ein Mitglied der Serpinfamilie. Serpine sind eine Familie von Serinproteinaseinhibitoren, die als irreversible Suizidsubstrate zur Inhibierung von Proteinasen führen. Proteasen sind häufig vorkommende Virulenzfaktoren pathogener Bakterien und werden bisweilen verwendet, um die Abwehrmechanismen des Wirtes zu inaktivieren. Aus der Familie der Serpine (Inhibitor ist dem Begriff Serpin inherent) ist der alpha-1-Proteinaseinhibitor (α1-PI) einer der bedeutendsten und am besten charakterisierten Mitglieder. α1-PI spielt in der Regulation von Elastasen eine Rolle, die von aktivierten Neutrophilen sezerniert werden, welche ihrerseits den Abbau des Bindegewebes des Wirtes kontrollieren (Salvesen, GS et al., „Human plasma proteinase inhibitorrs", Ann. Rev. Biochem., 52: 655–709 (1983), durch Verweis in diese Beschreibung aufgenommen). Diese einzigartige Kategorie von Serinproteinase Inhibitoren besitzt eine charakteristische exponierte Reaktionszentrum-Loop (RSL) Domäne. Bedeutsamer Weise ist gezeigt worden, dass die RSL von α1-PI gegenüber einer Spaltung durch eine Anzahl von Proteinasen sowohl des Wirtes als auch bakterieller Herkunft empfindlich ist, was zur Inaktivierung von α1-PI führt.
Das Testsystem kann derart ausgestaltet sein, dass simultan mehrere (z. B. mindestens 2, mindestens 5 oder mindestens 10) verschiedene Mikroorganismenarten, wie die, die häufig in infizierten Wunden gefunden werden, identifiziert werden können. Es kann beispielsweise die Enzyme identifizieren, die in bestimmten Klassen pathogener Bakterien häufig vorkommen, die aber in nicht-pathogenen Bakterien nicht vorkommen. Derartige Enzyme können beispielsweise mit einem Computer-basierten bioinformatischen Screen von bakterielle genomische Daten enthaltenden Datenbanken identifiziert werden. Dadurch, dass Enzyme als Basis für das Detektionssystem verwendet werden, können sehr sensitive Tests bereitgestellt werden, da selbst sehr kleine Mengen von Enzymen den Umsatz einer substantiellen Substratmenge katalysieren können.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Bakteriums bereit, das die folgenden Schritte aufweist: (a) In Kontakt bringen einer Probe mit einem detektierbar markierten synthetischen α1-Proteinaseinhibitor-Peptidsubstrat mit einer Reaktionszentrum-Loop-Domäne unter Bedingungen, die zur Spaltung des genannten Substrats durch ein von einem Bakterium produzierten Enzym führen; und (b) detektieren einer Spaltung oder einer Abwesenheit der Spaltung des Substrats, wobei die Spaltung des Substrats die Anwesenheit des Bakteriums in der Probe anzeigt und die Abwesenheit von Spaltung der Modifikation des Substrats die Abwesenheit des Bakteriums in der Probe anzeigt.
Eine „Molekülmarkierung" ist jedes Molekül, das für den Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Mikroorganismus (z. B. eines Bakteriums, Pilzes oder Virus) in einer Probe, wie einer Wunde oder Körperflüssigkeit verwendet werden kann. Insbesondere schließen die zu detektierenden molekularen Markerproteine, wie die von Mikroorganismen sezernierten Proteine und auf der Zelloberfläche von Mikroorganismen exprimierten Proteine oder auf der Oberfläche einer mit einem Virus oder einem Prion infizierten Zelle ein. In einer Ausführungsform ist das Enzym eine bakterielle Protease.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines oder mehrerer Bakterien in einer Probe, umfassend die Schritte des Inkontaktbringens der Probe mit einem detektierbar markierten α1-Proteinaseinhibitor-Peptidsubstrat mit einer Reaktionzentrum-Loop-(RSL)Domäne unter Bedingungen, die zur Modifikation des Substrates durch ein von einem Bakterium produzierten und/oder sezernierten Enzym führen; und detektieren der Modifikation oder der Abwesenheit der Modifikation des Substrates. Die Modifikation des α1-Proteinaseinhibitors zeigt die Anwesenheit des Bakteriums in der Probe an und die Abwesenheit der Modifikation des α1-Proteinaseinhibitors zeigt die Abwesenheit Bakteriums in der Probe an.
Der α1-Proteinaseinhibitor kann synthetisch sein. Beispielsweise kann er von einer nativen oder nicht natürlich vorkommenden RSL-Domäne abgeleitet sein und kann die gleiche oder äquivalente Aktivität wie die RSL eines Wildtyp α1-Proteinaseinhibitors haben. Er kann auch eine Variante, ein Analoges oder Fragment einer α1-Proteinaseinhibitor RSL Domäne aufweisen oder daraus bestehen. In einer Ausführungsform umfasst das Substrat SEQ ID Nr. 1, 2 oder 3. In einer Ausführungsform ist das Substrat CPI1, CPI2 oder CPI3 wie unten beschrieben.
Das Bakterium kann beispielsweise ein wundenspezifisches Bakterium sein, so wie Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Pseduomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumonia und Escherichia coli.
In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Wundinfektion in einem Subjekt umfassend die Schritte (a) In Kontakt bringen einer Probe erhalten aus der Wunde eines Subjekts mit einem detektierbar markierten synthetischen α1-Proteinaseinhibitor-Pepstidsubstrat mit einer RSL-Domäne unter Bedingungen, die durch ein von einem Bakterium produzierten und/oder sezernierten Enzyms zu der Modifikation des Substrats führen; und (b) Detektieren einer Modifikation oder der Abwesenheit einer Modifikation des Substrats. Die Modifikation des Substrats zeigt das Vorhandensein einer Wundinfektion im Subjekt an und die Abwesenheit der Modifikation des Substrats zeigt die Abwesenheit einer Infektion in dem Subjekt an.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Wundinfektion in einem Subjekt, aufweisend die Schritte (a) In Kontakt bringen einer Wunde eines Subjekts mit einem detektierbar markierten synthetischen α1-Proteinaseinhibitor-Peptidsubstrat mit einer RSL-Domäne für ein von einem Bakterium produziertes und/oder sezerniertes Enzym unter Bedingungen, die zur Modifikation des Substrats durch ein von dem Bakterium produzierten und/oder sezernierten Enzym führen; und (b) Detektieren einer Modifikation oder der Abwesenheit einer Modifikation des Substrats. Die Modifikation des Substrats zeigt die Anwesenheit einer Wundinfektion in dem Subjekt an und die Abwesenheit einer Modifikation des Substrats zeigt die Abwesenheit einer Infektion in dem Subjekt an.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Biosensor zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Bakteriums, beispielsweise eines wundspezifischen Bakteriums in einer Probe, umfassend eine feste Unterlage und ein detektierbar markiertes synthetisches α1-Proteinaseinhibitor-Peptidsubstrat mit einer RSL-Domäne, wobei das Substrat mit der festen Unterlage verbunden ist. Das Peptid kann mit einem fluoreszenten oder colorimetrischen Farbstoff zur Detektion der Peptidspaltung durch eine bakterielle Protease markiert sein.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zum Nachweis einer Wundinfektion, umfassend einen Biosensor zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Bakteriums in einer Probe und ein oder mehrerer Reagenzien zum Nachweis der Anwesenheit des Bakteriums, welches das für die Wundinfektion ursächliche Agens ist. Das Reagenz kann beispielsweise zum Nachweis eines von einem Bakterium sezernierten Enzyms verwendet werden. Insbesondere kann das Reagenz zum Nachweis der Modifikation des Substrates des Biosensors verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B: 1A zeigt die relative Position der Spaltungsstellen in der α1-Proteinaseinhibitor (α1-P1) RSL Sequenz (SEQ ID Nr. 4). 1B zeigt die Sequenz des CPI1 Peptids (SEQ ID Nr. 1), des CPI2 Peptids (SEQ ID Nr. 2) und des α1-Proteinaseinhibitors (human) (SEQ ID Nr. 3).
2A bis 2D: Die 2A und 2B sind Graphen der relativen Fluoreszenz von Proben enthaltend über Nacht gewachsene bakterielle Kulturen, Assaysubstrat (2A, CPI1 Peptid; 2B, CPI2 Peptid) und Reaktionspuffer (pH 7,2) mit 150 mmol/l NaCl über die Zeit (in Sekunden). Die 2C und 2D sind Graphen der relativen Fluoreszenz von Proben enthaltend über Nacht erhaltener bakterieller Überstände, Assaysubtrate (2C, CPI1 Peptid; 2D, CPI2 Peptid) und Reaktionspuffer (pH 7,2) mit 150 mmol/l NaCl über die Zeit (in Sekunden).
3A bis 3D: 3A und 3B sind Graphen der relativen Fluoreszenz von Proben enthaltend 48 Stunden gewachsene bakterielle Kulturen, Assaysubstrat (3A CPI1; 3B, CPI2) und Reaktionspuffer über die Zeit (in Sekunden). Die 3C und 3D sind Graphen der relativen Fluoreszenz von Proben enthaltend 48 Stunden kultivierte bakterielle Überstände, Assaysubstrate (3C, CPI1; 3D, CPI2) und Reaktionspuffer über die Zeit (in Sekunden).
Die 4A und 4B illustrieren Sensordaten für E. faecalis (mit einer Konzentrationsserie von: 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml) mit CPI2 Peptid. 4A zeigt Bilder von Sensoren, die mit Bakterien unter einer UV Lichtquelle mit 365 nm inkubiert wurden. 4B zeigt Intensitätsdaten von jeder Konzentration, die mit digitalisierten Fotos erhalten wurden.
Die 5A und 5B illustrieren Sensordaten für P. aeroginosa (mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml) mit CPI2 Peptid. 5A zeigt Bilder von Sensoren, die mit Bakterien unter einer 365 nm UV Lichtquelle inkubiert wurden. 5B zeigt Intensitätsdaten von jeder Konzentration, die von digitalisierten Fotos erhalten wurden.
Die 6A und 6B illustrieren Sensordaten für S. aureus (mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml) mit CPI2 Peptid. Die 6A zeigt Bilder von Sensoren, die mit Bakterien unter einer 365 nm UV Lichtquelle inkubiert wurden. 6B zeigt Intensitätsdaten von jeder Konzentration, die von digitalisierten Fotos erhalten wurden.
Die 7A und 7B illustrieren Sensordaten für S. pyogenes (mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml) mit CPI2 Peptid. Die 7A zeigt Bilder von Sensoren, die mit Bakterien unter einer 365 nm UV Lichtquelle inkubiert wurden. 7B zeigt Intensitätsdaten von jeder Konzentration, die von digitalisierten Fotos erhalten wurden.
Die 8A und 8B illustrieren Sensordaten für S. marcescens (mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml) mit CPI2 Peptid. Die 8A zeigt Bilder von Sensoren, die mit Bakterien unter eine 365 nm UV Lichtquelle inkubiert wurden. 8B zeigt Intensitätsdaten von jeder Konzentration, die von digitalisierten Fotos erhalten wurden.
Die 9A bis 9C sind Balkendiagramme, die die relative Inkubation für 40 Stunden mit verschiedenen Bakterienkonzentrationen illustrieren (A = 10⁶ CFU; B = 10⁵ CFU; und C = 10⁴ CFU) (Stahp = Staphylococcus aureus, Serratia = Serratia marcescens; Strep = Streptococcus salivarius; PA14 = Pseudomonas aeruginosa; Entern = Enterococcus faecalis).
Die 10A bis 10B sind Graphen, die die relative Fluoreszenz von Bakterien illustrieren, die von Wundverbänden extrahiert wurden (Peptidsubstrat: CPI2) (Reaktionspuffer: 1XPBS). (A: Wunde Proben Nr. 1–10; B: Wunde, Proben Nr. 11–20; C: Wunde, Proben Nr. 20–30; D: Wunde Proben Nr. 31–35).
11 zeigt einen Graphen von Fluoreszenzmessungen von verschiedenen Proben, die während einer Stabilitätsstudie entnommen wurden.
12 zeigt einen Graphen relativer Fluoreszenz, die nach Exposition von detektierbar markierten Substraten mit verschiedenen Stämmen eines Wundpathogens gemessen wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Als Teil ihres normalen Wachstumsprozesses sezernieren viele Mikroorganismen eine Anzahl von Enzymen in ihre Umwelt. Diese Enzyme haben verschiedene Funktion einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Abgabe von Nahrungsstoffen, Schutz vor der Verteidigung des Wirtes, Zellwandsynthese (in Bakterien) und/oder -erhalt und andere zum Teil noch nicht bekannte Funktionen. Viele Mikroorganismen, wie Bakterien, produzieren auf ihrer Zelloberfläche auch Enzyme, die gegenüber der extrazellulären Umwelt exponiert sind (und damit interagieren).
Ein System, das die Anwesenheit dieser produzierten und/oder sezernierten Enzyme nachweisen kann, kann ebenso zum Anzeigen der Anwesenheit der produzierenden/sezernierenden Bakterien dienen. In alternativer Weise kann ein System, das die Abwesenheit dieser produzierten und/oder sezernierten Enzyme nachweisen kann, ebenso zum Nachweis der Abwesenheit der produzierenden/sezernierenden Bakterien dienen. Solch ein Detektionssystem ist zum Nachweis oder zur Diagnose einer Infektion, beispielsweise einer Wundinfektion nützlich.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Substraten, wie von synthetischen α1-Proteinaseinhibitor-Peptidsubstraten mit einer RSL-Domäne, zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von durch ein breites Spektrum von Bakterien produzierten oder sezernierten Enzymen. Der hierin verwendete Begriff „synthetisch" bezieht sich auf nicht-natürlich vorkommende Peptide. Die synthetischen Peptide können abgeleitet sein von (beispielsweise einer Variante, einem Analog oder einem Fragment) eines Reaktionszentrum-Loops (RSL) in voller Länge oder als Wildtyp, als Mitglied der α1-Proteinaseinhibitoren. In einer Ausführungsform wird das synthetische Peptidsubstrat gemäß den hier beschriebenen Verfahren hergestellt. Diese synthetische Substrate können dann mit einer detektierbaren Markierung markiert werden, so dass unter bestimmten Bedingungen, unter denen die jeweiligen Enzyme spezifisch mit ihnen reagieren, sie einer Modifikation unterzogen werden und beispielsweise eine sichtbare Farbveränderung beobachtet werden kann. Substrate, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen jegliche Moleküle ein, die eine Spaltstelle der α1-Proteinaseinhibitor RSL-Sequenz ausweisen, die mit dem Enzym der vorliegenden Erfindung interagieren kann. Die relative Position der Spaltungsstelle innerhalb der RSL Sequenz des α1-Proteinaseinhibitors (α1-P1) ist bereits veröffentlicht worden (Nelson, D. et al., „Inactivation of alpha1-proteinase inhibitor as a broad screen for detecting proteolytic activities in unknown samples", Anal. Biochem., 260(2): 230–36 (1998)) und ist in 1A dargestellt. Beispiele für Substrate schließen die hier beschriebenen Substrate ein, als auch Substrate für diese Enzyme, die bisher nicht bekannt sind. In einer Ausführungsform umfasst das Substrat die Sequenz EAAGAMFLEAIPK (SEQ ID Nr. 1). In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Substrat die Sequenz EGAMFLEAIPMSIPK (SEQ ID Nr. 2). Weitere Beispiele schließen α1-PI derivatisierte fluoreszierende Peptide, beispielsweise Edans-EAAGAMFLEAIPK-Dabcyl (CPI1) und Edans-EGAMFLEAIPMSIPK-Dabcyl (1B) ein.
Substrate, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen auch colorimetrische und/oder fluorimetrische Komponenten ein und ein Peptid, das mit wenigstens einem von einem Mikroorganismus produzierten oder sezernierten Protein interagiert. In einigen Ausführungsformen interagiert der Peptidteil des Substrats mit dem Protein des Mikroorganismus. In anderen Ausführungsformen interagiert wenigstens eine colorimetrische Komponente des Substrates mit dem Protein des Mikroorganismus.
Beispiele für Substrate werden in der PCT Anmeldung PCT/US03/03172 mit dem Titel „Method For Detecting Microorganisms" von Mitchell C. Sanders, et al., angemeldet am 31. Januar 2003 und veröffentlicht als WO 03/063693 am 7. August 2003; und US Anmeldung Nr. 60/578,502 mit dem Titel „Colorimetric Substrates, Colorimetric Sensors, and Methods of Use" von Mitchell C. Sanders, et al., angemeldet am 9. Juni 2004, beschrieben. Die gesamte Lehre dieser Anmeldungen wird hiermit in die Beschreibung aufgenommen.
Das synthetische α1-Proteinaseinhibitor-Peptidsubstrat mit RSL-Domäne kann zum Nachweis mehrerer (das heißt, mehr als einer, z. B. mindestens 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 oder mehr) Wundpathogene, wie Bakterien, verwendet werden. Die Enzyme, die in der Bakteriennachweismethode gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind bevorzugter Weise wundspezifische Enzyme. Ein wundspezifisches Enzym, wie hier verwendet, ist ein Enzym, das von einem pathogenem Bakterium produziert und/oder sezerniert wird, das aber gleichzeitig nicht von nicht-pathogenen Bakterien produziert und/oder sezerniert wird. Beispiele von pathogenen Bakterien schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Staphylokokken (z. B. Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis oder Staphycoccus saprophyticus), Streptokokken (z. B. Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae oder Streptococcus agalactiae), Enterokokken (z. B. Enterococcus faecalis oder Enterococcus faecium), Korynebakterienarten (z. B. Corynebacterium diptheriae), Bazillen (z. B. Bacillus anthracis), Listerien (z. B. Listeria monocytogenes), Clostridiumarten (z. B. Clostridium perfringens, Clostridium tetanus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile), Neisserienarten (z. B. Neisseria meningitidis oder Neisseria gonorrhoeae) E. coli, Shigella-Arten, Samonella-Arten, Yersinienarten (z. B. Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis oder Yersinia enterocolitica), Vibrio cholerae, Campylobacter-Arten (z. B. Campylobacter jejuni oder Campylobacter fetus), Heliobacter pylori, Pseudomonien (z. B. Pseudomonas aeruginosa oder Pseudomonas mallei), Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, Legionella pneumophila, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Borrelia burgdoferi, Mycobakterien (z. B. Mycobacterium tuberculosis), Mycobacterium leprae, Actinomyces-Arten, Nocardia-Arten, Chlamydien (z. B. Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis oder Chlamydia pneumoniae), Rickettsien (z. B. Rickettsia ricketsii, Rickettsia prowazekii oder Rickettsia akari), Bruzellen (z. B. Brucella abortus, Brucella melitensis oder Brucella suis), Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae und Francisella tularensis. Bevorzugter Weise ist das wundspezifische Bakterium staphylococcus, streptococcus, enterococcus, bacillus, Clostridiumarten, E. coli, Yersinia, pseudomonas, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae oder Mycobacterium leprae. Das wundspezifische Enzym kann beispielsweise von Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetionbacter anitratus, Klebsiella pneumoniae und/oder Escherichia coli produziert und/oder sezerniert werden.
Der hier verwendete Begriff „Modifikation" bezieht sich auf Veränderungen des Substrates, etwa durch Spaltung oder andere direkt oder indirekt detektierbare Mittel. Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können Substrate, beispielsweise Proteine oder Polypeptide, durch Spaltung modifizieren, und derartige Modifikationen können detektiert werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Pathogens in einer Probe zu bestimmen. Ein Verfahren zur Detektion einer Modifikation eines Substrates durch ein Enzym besteht in der Markierung des Substrates mit zwei verschiedenen Farbstoffen, wobei einer dazu dient, den Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FREI) zu dem anderen Farbstoff zu hemmen, wenn die Moleküle, beispielsweise Farbstoffe oder colorimetrische Substanzen, sich in großer Nähe befinden, und durch Fluoreszenz gemessen werden.
FREI ist der Prozess abstandabhängiger Wechselwirkung angeregter Zustände, in dem die Emission eines fluoreszenten Moleküls mit der Anregung eines anderen Moleküls gekoppelt ist. Ein typisches Akzeptor und Donorpaar für Resonanzenergietransfer besteht aus 4-[[(Dimethylamino)phenyl]azo]benzoesäure (DABCYL) und 5-[(2-Aminoethylamoni]naphthalensulfonsäure (EDANS). EDANS wird durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 336 nm angeregt und imitiert ein Photon mit einer Wellenlänge von 490 nm. Wenn sich ein DABCYL-Rest innerhalb von 20 Å von EDANS befindet, wird dieses Photon effizient absorbiert. DABCYL und EDANS werden zu entgegengesetzten Enden eines Peptidsubstrats konjugiert. Wenn das Substrat intakt ist, ist der FREI sehr effizient. Wenn das Peptid von einem Enzym gespalten wurde, werden sich die beiden Farbstoffe nicht mehr in enger Nachbarschaft befinden und FREI wird ineffizient. Die Spaltungsreaktion kann durch Beobachtung entweder eine Abnahme in DABCYL-Fluoreszenz oder einer Zunahme in EDANS-Fluoreszenz (Verlust der Löschung) verfolgt werden.
Das α1-Proteinaseinhibitor-Substrat kann unter Verwendung standardmäßiger rekombinanter Proteintechniken hergestellt werden (siehe beispielsweise Ausubel et al., Current Protocolos in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998), dessen gesamte Lehre hierdurch in die Beschriebung einbezogen wird). Außerdem könne die Enzyme der vorliegenden Erfindung unter Verwendung rekombinanter Techniken hergestellt werden. Mittels einer ausreichenden Menge von Enzymen und deren Substraten kann die genaue Stelle der Modifikation bestimmt werden.
Die Substrate werden mit einer detektierbaren Markierung markiert, die zur Beobachtung der Interaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat verwendet wird und jegliche Substratmodifikation detektiert, beispielsweise die Spaltung des Substrates oder der Markierung, die aus derartigen Interaktionen resultieren. Beispiele für detektierbare Markierungen schließen verschiedene Farbstoffe ein, die in Substrate inkorporiert werden können, beispielsweise die hier beschriebenen, Spin-Markierungen, Antigen-Markierungen, Epitop-Markierungen, Haptene, Enzym-Markierungen, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, pH-empfindliche Materialien, chemolumineszente Materialien, colorimetrische Komponenten, biolumineszente Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzym-Markierungen schließen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase und Acetylcholinesterase ein; Beispiele für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe schließen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin ein; Beispiele für geeignete Fluoreszenz-Materialien schließen Umbelliferone, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlorotriazinylaminfluoresc ein, Dansylchlorid und Phycoerythrin ein; ein Beispiel eines chemolumineszenten Materials schließt Luminol ein; Beispiele für biolumineszierende Materialien schließen Luziferase, Luziferin und Aequorin ein, und Beispiele für geeignete radioaktive Materialien schließen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S und ³H ein. Andere Beispiele für detektierbare Markierungen schließen Bodipy, Pyren, Texas Red, IAEDANS, Dansylaziridin, IATR und Fluoreszein ein. Succinimidylester, Isothiocyanate und Iodoacetamide dieser Markierungen sind ebenfalls kommerziell erhältlich. In einer Ausführungsform ist das Substrat mit einer fluoreszierenden Probe und einem löschenden Farbstoffmolekül markiert.
Das Substrat kann mit wenigstens einer colorimetrischen Komponente markiert sein, die zur Überwachung der Interaktion zwischen dem Protein und dem Substrat sowie der Detektion jeglicher Substratmodifikation, beispielsweise der Spaltung des Peptids oder der Markierung, die aus derartigen Interaktionen sich ergibt, verwendet wird. Demzufolge dinet die colorimetrische Komponente als Markierung, die die Anwesenheit oder Abwesenheit der Modifikation, und folglich die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Mikroorganismus in einer Probe anzeigt. In einigen Ausführungsformen ist die colorimetrische Komponente kovalent am Peptid gebunden.
In einigen Ausführungsformen spaltet das Protein mindestens einen Teil des Substrates, der eine (mindestens eine) colorimetrische Komponente einschließt. Wenn das Substrat beispielsweise eine blaue colorimetrische Komponente und eine gelbe colorimetrische Komponente einschließt, kann das ungespaltene Substrat grün erscheinen. Nachdem das Protein einen Teil des Substrates gespalten hat, der die gelbe colorimetrische Komponente umfasst, kann das Substrat blau erscheinen.
In einigen Ausführungsformen schließt die Modifikation des Substrates die Hydrolyse mindestens einer Peptidbindung im Peptid ein und führt dazu, dass mindestens ein Teil des Pep tids vom Substrat gespalten wird. Der abgespaltene Teil schließt mindestens eine colorimetrische Komponente ein, was zu einer sichtbaren Farbveränderung führt. In anderen Ausgestaltungen schließt die Modifikation des Substrates die Spaltung wenigstens einer colorimetrischen Verbindung des Peptides ein, was in einer sichtbaren Farbveränderung resultiert.
Die colorimetrische Komponente dinet als Markierung. In einer Ausgestaltung hat mindestens eine colorimetrische Komponente eine andere Farbe als die andere colorimetrische Komponente oder die anderen colorimetrischen Komponenten. Beispiele für colorimetrische Komponenten schließt Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galaktosidase und Acetylcholinesterase ein; Beispiele für geeignete prosthetische Gruppenkomplexe schließen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin ein. In einer Ausgestaltung der Erfindung umfasst das Substrat ein Peptid mit wenigstens zwei colorimetrischen Komponenten, wobei jede colorimetrische Komponente eine verschiedene Farbe umfasst und wobei das Substrat an eine feste Unterlage gebunden ist. Die Modifikation des Substrates kann die Spaltung mindestens eines Teils des Substrates umfassen, wobei der Teil eine der colorimetrischen Komponenten einschließt und die Spaltung zu einer erkennbaren Farbveränderung führt.
Die Probe in der die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bakterien nachzuweisen ist, oder mittels derer eine Wundinfektion diagnostiziert werden soll, kann beispielsweise eine Wunde (zum Beispiel eine Wundoberfläche auf einem Subjekt), eine Körperflüssigkeit wie Blut, Urin, Sputum oder Wundflüssigkeit (zum Beispiel an der Wunde produzierter Eiter) sein. Die Probe oder feste Unterlage kann jeglicher Artikel sein, auf dem Bakterien aufbewahrt werden können, beispielsweise ein Katheter, ein Tasche (beispielsweise ein Urinsammelbeutel, ein Blutsammelbeutel oder ein Plasmasammelbeutel), eine Platte, ein Polymer, eine Membran, ein Harz, ein Glas, ein Schwamm, ein Artikel, der die Probe sammelt, ein Artikel, der die Probe enthält, ein Spekulum, ein Filter, eine Linse, ein Schaum, ein Gewebe, ein Papier, eine Naht, ein Messstab, ein Tupfer, ein Probenröhrchen, eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte, eine Kontaktlinsenlösung, ein Abstrich von der Oberfläche einer Raumes oder eines Gebäudes, beispielsweise eines Untersuchungszimmers oder Operationsraumes, einer Gesundheitseinrichtung, eines Badezimmers, einer Küche, oder einer Herstellungs- oder Prozessierungseinrichtung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Biosensor zur Detektion eines (oder mehrerer, beispielsweise, mindestens 2, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 50, mindestens 75 oder mindestens 100) Wundpathogens bzw. Wundpathogene, beispielsweise von Bakterien wie hier beschrieben, und zur Benachrichtigung eines Benutzers über die Anwesenheit der Infektion. Der Biosensor kann im Gesundheitsbereich oder zu Hause zum Nachweis infizierter Wunden verwendet werden. Er kann ein (oder mehrere) Breitspektrumsubstrat bzw. Breitspektrumsubstrate umfassen, die auf eine feste Unterlage gebunden sind, die sich proximal zu einer Wunde oder einer anderen Körperflüssigkeit befindet, die für bakterielle Kontamination untersucht werden soll. Bevorzugter Weise ist das Substrat eine synthetisches Serpin-Peptid-Substrat mit einer RSL-Domäne, das kovalent mit einer Markierung verbunden ist und daher ein Detektionssignal aufweist, das nach Proteolyse der Substrat-Markierungs-Bindung die Anwesenheit der Bakterien anzeigt.
Der Biosensor wird hergestellt, indem zuerst ein erfindungsgemäßes Substrat, so wie das synthetische α1-Proteinaseinhibitor-Substrat mit RSL-Domäne, markiert wird, und zwar mit einer oder mehreren und bevorzugt mit einer Vielzahl von detektierbaren Markierungen, beispielsweise chromatogenen oder fluoreszenten Abgangsgruppen. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die markierende Gruppe ein latentes Signal bereitstellt, dass nur dann aktiviert wird, wenn das Signal vom Substrat proteolytisch entfernt wird. Chromatogene Abgangsgruppen schließen beispielsweise para-nitroanalide Gruppen ein. Sollte das Substrat mit einem von einem Bakterium in eine Wunde oder eine andere Körperflüssigkeit sezernierten Enzym oder mit einem auf der Oberfläche einer Bakterienzelle präsentierten Enzym in Kontakt kommen, so modifiziert das Enzym das Substrat in einer Weise, das dies zur Detektion dieser Modifikation führt, beispielsweise durch eine Veränderung in der Absorption, die visuell oder als Farbänderung (beispielsweise auf einer festen Unterlage wie einem Wundverband) detektiert werden kann oder unter Verwendung spektophotometrischer Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind.
Der Biosensor ist eine feste Unterlage, beispielsweise ein Wundverband (wie eine Bandage oder Gaze) bzw. jegliches Material, dass steril oder frei von mikrobiellen Kontaminationen sein soll, beispielsweise ein Polymer, eine Membran, ein Harz, ein Glas, ein Schwamm, eine Platte, ein Spekulum, ein Filter, eine Linse, ein Schaum, ein Gewebe, ein Papier, ein Messstab oder eine Naht oder ein Artikel, der die Probe enthält oder sammelt (so wie ein Behältnis zur Aufbewahrung von Körperflüssigkeiten, beispielsweise ein Urinsammelbehälter, ein Blut- oder Plasmasammelbehälter, ein Probenröhrchen, ein Katheter, ein Tupfer oder eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte).
Typischerweise ist die feste Unterlage aus Materialien hergestellt, die zur Sterilisierung geeignet sind, sofern die Unterlage die Wunde oder die Probe direkt kontaktiert. In einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann der Biosensor direkt mit der Wunde in Kontakt gebracht werden. In einigen Beispielen wird eine sterile Abdeckung oder Schicht verwendet, um Kontaminationen der Wunde oder Körperflüssigkeiten durch derartigen direkten Kontakt zu vermeiden. Sofern sterile Abdeckungen verwendet werden, weisen diese Eigenschaften auf, die sie für die Sterilisierung geeignet machen und gleichzeitig nicht mit der Enzym-/Substratinteraktion störend interagieren. Der Teil des Biosensors, der mit der Wunde in Kontakt kommt, ist bevorzugter Weise nicht adhärent, um eine leichte Entfernung des Biosensors von der Probenoberfläche zu gewährleisten. Wenn der Biosensor beispielsweise einen Wundverband aufweist, so kontaktiert der Verband die Wunde für eine für die Reaktion des Enzymsubstrats ausreichende Zeit, und der Verband wird dann von der Wunde entfernt ohne eine weitere Verletzung der Wunde oder des umgebenden Gewebes zu verursachen.
Ein Breitspektrum-Substrat (beispielsweise ein Substrat, das zur Detektion von mehr als einem Pathogen oder Bakterium geeignet ist), das in geeigneter Weise mit einem detektierbaren Marker, beispielsweise einem chromogenen Farbstoff, markiert ist und in einem Sensorapparat befestigt oder inkorporiert ist, kann als Indikator für die Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen pathogenen Bakterien dienen, die die oben genannten Enzyme sezernieren.
Der Biosensor der vorliegenden Erfindung kann optional ein oder mehrere weitere Substrate (beispielsweise mindestens 2, mindestens 5, mindestens 10, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 50, mindestens 75 oder mindestens 100 Substraten) für produzierte und/oder sezernierte Enzyme pathogener Bakterien aufweisen. Wenn mehr als ein Substrat verwendet wird, kann jedes markiert werden, so dass die Substrate voneinander unterscheidbar sind (beispielsweise durch Verwendung verschiedener detektierbarer Markierungen) und/oder die Substrate können in bestimmten Regionen der festen Unterlage lokalisiert sein.
Substrate mit hydrophoben Abgangsgruppen können nicht-kovalent an hydrophobe Oberflächen gebunden sein. Alternativ können hydrophile oder hydrophobe Substrate an Oberflächen mittels Disulfiden oder primären Aminen, Carboxyl- oder Hydroxylgruppen gebunden werden.
Verfahren zur Kopplung von Substraten an eine feste Unterlage sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise können fluoreszierende und chromatogene Substrate unter Verwendung von nicht-essenziellen reaktiven Termini wie freie Amine, Carboxylsäuren oder SH-Gruppen an feste Unterlagen gebunden werden, die die Reaktion mit den Wundpathogenen nicht beeinflussen. Freie Amine können an Carboxylgruppen auf dem Substrat gebunden werden, beispielsweise unter Verwendung eines 10fachen molaren Überschusses von entweder N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) oder N-Cyclohexyl-N'-2-(4'-methyl-morpholinium)ethylcarbodiimid-p-toluolsulphonat (CMC) für 2 Stunden bei 4°C in destilliertem Wasser, eingestellt auf pH 4,5, um die Kondensationsreaktion zur Bildung einer Peptidverbindung zu stimulieren. SH-Gruppen können mit DTT oder TCEP reduziert werden und dann zu einer freien Aminogruppe auf der Oberfläche mit N-e-Maleimidocaproinsäure (EMCA) gekoppelt werden (Griffith et al., FEBS Lett., 134: 261–263 (1981), welches durch Verweis in diese Beschreibung aufgenommen wird).
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch Fragmenten und Varianten der Breitspektrumpeptidsubstrate aufweisen oder daraus bestehen, beispielsweise α1-Proteinaseinhibitor-Peptidsubstrat mit einer RSL-Domäne, wie hier beschrieben. Varianten schließen ein substantiell homologes Polypeptid ein, das vom gleichen genetischen Lokus wie diese Peptidsubstrate kodiert wird, beispielsweise die α1-RSL-Domäne in einem Organismus, das heißt eine Allelvariante, sowie andere Varianten. Varianten umfassen auch Polypeptide, die von anderen genetischen Loci in einem Organismus abgeleitet werden, aber substanzielle Homologie zu einem hierin beschriebenen Peptidsubstrat aufweisen. Varianten schließen auch Polypeptide ein, die substanziell homolog oder identisch zu diesen Peptidsubstraten sind, aber von anderen Organismen abgeleitet sind, d. h. Orthologe sind. Varianten schließen auch Polypeptide ein, die substanziell homolog oder identisch zu diesen Peptidsubstraten sind und durch chemische Synthese hergestellt werden. Varianten schließen auch Polypeptide ein, die substanziell homolog oder identisch zu diesen Peptidsubstraten sind, die durch rekombinante Verfahren hergestellt werden.
Die prozentuale Identität von zwei Aminosäuresequenzen kann durch Gegenüberstellung der Sequenzen unter optimierten Vergleichsparametern bestimmt werden (z. B. können Lücken in die Sequenz einer ersten Sequenz eingeführt werden). Die Aminosäuren an korrespondierenden Positionen werden dann verglichen und die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen Positionen, die die Sequenzen gemein sam haben (d. h. prozentuale Identität = Anzahl von identischen Positionen/Gesamtanzahl von Positionen × 100). In bestimmten Ausführungsformen ist die Länge der Aminosäuresequenzen, die zum Vergleich gegenübergestellt werden, mindestens 30%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 60% und am meisten bevorzugt mindestens 70%, 80%, 90% oder 100% der Länge der Peptidsubstratsequenz, beispielsweise der α1-RSL-Domänensequenz. Der eigentliche Vergleich der zwei Sequenzen kann mittels bekannter Verfahren, beispielsweise unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel eines derartigen mathematischen Algorithmus ist in Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873–5877 (1993) beschrieben, welches durch Verweis in diese Beschreibung aufgenommen wird. Ein derartiger Algorithmus ist auch im BLAST Programm (Version 2.2) inkorporiert, wie beschrieben von Schaffer et al. (Nucleic Acids Res., 29:2994–3005 (2001), durch Verweis Teil dieser Beschreibung). Wenn BLAST und Gapped BLAST Programme verwendet werden, können die voreingestellten Parameter der entsprechenden Programme verwendet werden. In einem Ausführungsbeispiel ist die durchsuchte Datenbank eine nicht-redundante (NR) Datenbank und die Parameter zum Vergleich der Sequenzen können wie folgt eingestellt werden: keine Filter; „Expect" Wert von 10; Wortlänge von 3; die Matrix ist BLOSUM62; und die Lückenkosten („Gap Costs") haben eine Existenz von 11 und eine Extension von 1.
In einer weiteren Ausführungsform kann die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des GAP Programms im GCG Softwarepaket (Accelrys Inc., San Diego, Kalifornien, USA) unter Verwendung entweder einer Blossom 63 Matrix oder einer PAM250 Matrix und einem Lückengewicht („Gap Weight") von 12, 10, 8, 6 oder 4 und einer Längengewichtung von 2, 3 oder 4 durchgeführt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung des GAP Programms im GCG Softwarepaket (Accelrys Inc.) unter Verwendung eines Lückengewichts von 50 und einer Längengewichtung von 3 durchgeführt werden.
Weitere bevorzugte Sequenzvergleichsverfahren werden hierin beschrieben.
Ebenfalls beschrieben werden Polypeptidsubstrate mit einer geringeren Identität aber mit einer ausreichenden Ähnlichkeit, so dass eine oder mehrere der gleichen Funktionen der Peptidsubstrate ausgeführt werden können, beispielsweise die Fähigkeit als Substrat für von Bakterien produzierten oder sezernierten Enzymen zu fungieren, beispielsweise für wundspezifi sche Bakterien. Ähnlichkeit wird durch konservierte Aminosäuresubstitution bestimmt. Derartige Substitutionen sind solche, die eine gegebene Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Charakteristik ersetzen. Konservative Substitutionen sind mit großer Wahrscheinlichkeit phänotypisch ohne Ausprägung (stumm). Typischerweise als konservative Substitutionen angesehen wird der jeweilige gegenseitige Austausch zwischen den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile; der Austausch von Hydroxylresten Ser und Thr; der Austausch der sauren Reste Asp und Glu; der Austausch zwischen den Amidresten Asn und Gln; der Austausch der basischen Reste Lys und Arg und der Ersatz zwischen den aromatischen Resten Phe und Tyr. Anhaltspunkte dafür, welche Aminosäureveränderungen wahrscheinlich phänotypisch stumm sind, können in Bowie et al., Science, 247:1306–1310 (1990) gefunden werden, dessen Lehre durch Verweis in diese Beschreibung aufgenommen wird.
Funktionelle Varianten können auch Aminosäuresubstitutionen enthalten, die ähnlich zu denen in der α1-RSL-Domäne sind, und die zu keiner oder nur einer insignifikanten Veränderungen in ihrer Funktion führen. Alternativ können derartige Substitutionen die Funktion entweder positiv oder negativ beeinflussen. Nicht funktionale Varianten enthalten typischerweise eine oder mehrere nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, Deletionen, Insertionen, Inversionen oder Verkürzungen, oder eine Substitution, Insertion, Inversion oder Deletion in einen kritischen Rest oder kritischen Region, wobei kritische Regionen die protolytische Spaltstelle für eine Infektions-spezifische Protease einschließt.
Aminosäuren in einem Peptidsubstrat gemäß der vorliegenden Erfindung, die für die Spaltung mittels eines Enzyms, z. B. einer Protease, essentiell sind, können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden, wie die Positions-bestimmte Mutagenese oder die Alanin-Scanning-Mutagenese (Cunningham et al., Science, 244: 1081–1085 (1989)). Das zuletzt genannte Verfahren führt eine einzelne Alaninmutation an einer der Reste des Moleküls ein (eine Mutation pro Molekül).
Die Erfindung umfasst weiterhin Polypeptidfragmente der Peptidsubstrate oder funktionale Varianten davon, einschließlich biologisch aktiver Fragmente mit 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% Sequenzhomologie zu einem synthetischen oder natürlich vorkommenden Peptidsubstrat wie hierin beschrieben, z. B. der α1-RSL-Domänsequenz. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Fragmente der Varianten der hier beschriebenen Polypeptide. Biologisch aktive Fragmente schließen Fragmente ein, die die Fähigkeit, als Substrat, für die von Bakterien, wie beispielsweise wundspezifischen Bakterien produzierten oder sezernierten Enzymen dienen zu können, erhalten haben.
Fragmente können diskret (d. h. nicht zu anderen Aminosäuren oder Polypeptiden fusioniert) sein oder können Teil eines größeren Polypeptids sein. Weiterhin können verschiedene Fragmente innerhalb eines einzelnen größeren Polypeptides enthalten sein. In einer Ausführungsform kann ein zur Expression in einem Wirt bereitgestelltes Fragment heterologe Prä- und Pro-Polipeptidregionen aufweisen, die mit dem Aminoterminus des Polipeptidfragments fusioniert sind und eine weitere Region, die mit dem Carboxylterminus des Fragments fusioniert ist.
Die Biosensoren und Peptide der vorliegenden Erfindung können in jeglicher Situation eingesetzt werden, in der es wünschenswert ist, die Anwesenheit oder Abwesenheit von Bakterien nachzuweisen, insbesondere pathogene Bakterien. Beispielsweise können Bakterien, die auf Arbeitsflächen in Gesundheitseinrichtungen haften und insbesondere in Operationssälen aufgefunden werden, mit einem hier beschrieben Biosensor nachgewiesen werden. Ein Substrat (oder mehr als ein Substrat), das mittels eines von einem Bakterium sezernierten oder auf der Oberfläche eines Bakteriums präsentierten Enzyms modifiziert werden kann, ist markiert und kovalent zu einem Kollektorsubstrat, wie Baumwollfasern am Ende eines Tupfers, gebunden. Sofern mehr als ein Substrat verwendet wird, kann jedes derart markiert werden, dass es von den anderen Substraten unterscheidbar ist (beispielsweise unter Verwendung verschiedener detektierbarer Markierungen) und/oder jedes kann in einer bestimmten Region der festen Unterlage lokalisiert sein. Die Spitze des Tupfers wird zum Wischen der Oberfläche verwendet, die möglicherweise mit Bakterien kontaminiert ist. Das Ende des Tupfers wird in ein Medium platziert und unter Bedingungen inkubiert, die die Modifikation des markierten Substrates erlauben, sofern ein Enzym vorhanden ist, dass spezifisch für das gebundene, markierte Substrat ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zum Nachweis wundspezifischer, hier beschribener Bakterien. Der Kit kann eine feste Unterlage aufweisen, beispielsweise mit einer Mehrzahl von Vertiefungen (z. B. eine Mikrotiterplatte), an die ein detektierbar markiertes Substrat (ein α1-Preteinaseihibitor-Peptidsubstrat mit einer RSL-Domäne) gebunden, verlinkt oder befestigt ist. Ein Mittel zur Bereitstellung einer oder mehrer Pufferlösungen wird bereit gestellt. Eine negative Kontrolle und/oder eine positive Kontrolle können ebenfalls bereitgestellt werden. Geeignete Kontrollen können leicht von einem Fachmann vorgeschlagen werden. Eine Probe, die möglicherweise von einem Pathogen (z. B. einem hier beschrieben Bakterium) kontaminiert ist, wird unter Verwendung der Pufferlösung(en) vorbereitet. Ein Aliquot der Probe, eine negative Kontrolle und eine positive Kontrolle wird in seine jeweils eigene Vertiefung platziert und die Reaktion wird ermöglicht. Die Vertiefungen, in denen die Modifikation des Substrats, beispielsweise eine Farbveränderung beobachtet wird, werden als mikrobielles Pathogen enthaltend benannt. Ein derartiger Kit ist besonders für den Nachweis einer Wundinfektion in einem Subjekt nützlich.
Ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst ist ein Kit, der einen Biosensor aufweist, so wie ein verpackter sterilisierter Wundverband und weitere Reagenzien, die zur Durchführung des Detektionsassays nötig sind.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele illustriert, ohne dass die Erfindung damit eingeschränkt werden soll.
Beispiel 1: Bereitstellung von Bakterien zum Nachweis der Abwesenheit oder Anwesenheit von Bakterien in einer Probe
Eine Kultur jeder der folgenden Bakterienspezies wurde über Nacht (O/N) in Gehirn-Herz-Infusionsbrühe („Brain Hart Infusion Broth", BHI) bei 37°C unter starker Schütteln (ca. 200 Upm) kultiviert, und zwar unter Verwendung von Verfahren die im Stand der Technik als Standardverfahren gelten: Staphylococcus aureus; Streptococcus pyogenes; Serratia marcescens; Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa (PA14), Pseudomonas aeruginosa (GSU3); und Enterococcus faecalis. Nach der Inkubation über Nacht wurde eine 1 ml Probe jeder Kultur entnommen und die Zellen wurden aus dem Kulturüberstand durch Zentrifugation bei 12.000 × g für 5 Minuten entfernt. Die zurückbleibenden Zellkulturüberstände wurden auf Eis gelagert, bis sie benötigt wurden (für weniger als 1 Stunde). Die Bakterien wurden nachfolgend, wie unten beschrieben, auf die Anwesenheit oder Abwesenheit von Enzymen getestet.
Alternativ wurden die Zellen nicht vom Zellkulturüberstand getrennt, sondern der Test wurde mit einer Probe durchgeführt, die die Zellen in Suspension in der Kulturbrühe enthielten. Nach 48 Stunden (2 Tagen) des Wachstum wurde die Prozedur wiederholt.
Beispiel 2: Extraktion von Bakterien aus Wundverbänden zum Nachweis der Abwesenheit oder Anwesenheit von Bakterien in einer Wundprobe
35 frische, gefrorene Wundverbände wurden von Dr. Thomas Serena, medizinischer Direktor der St. Vincent Wound Clinic, Erie, PA, USA und Gründer des Penn North Centers for Advanced Wound Care erhalten. Die Verbände wurden als medizinischer Abfall klassifiziert, wobei keine Informationen über die Wunden der Patienten erhalten wurden. Die Verbände stammten von nicht-ausgewählten Wunden, und wurden nach dem Sammeln am gleichen Tag verschifft. Die Verbände wurden auf Trockeneis verschifft und sofort nach Ankunft bei –80°C aufbewahrt.
Extraktion
Am Tag der Analyse wurden die Verbände aus dem Froster entfernt und soweit aufgetaut, dass die Verbände zum Zerschneiden gedehnt werden konnten. Alle Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt, gemäß den „Blond-Borne Pathogen Guidelines". Eine große Vielfalt verschiedener Verbandgrößen und Exsudate war repräsentiert. Die meisten der Verbände waren gazeartig, wobei einige ein absorbierendes Zentrum enthielten (d. h. es schien so, als seien keine Hydrokoloidverbände enthalten). Ein 2 cm × 3,5 cm Rechteck wurde aus jedem Verband herausgeschnitten (7 cm² Fläche). Im Fall von größeren Verbänden wurde die am repräsentativsten erscheinende Fläche gewählt. Eine große Vielfalt von Verbandfarben und Exsudaten wurde erhalten. Die Verbände wurden in 15 ml sterile konische Reagenzgläser mit 3 ml sterilem PBS gegeben und die Extraktion wurde bei 4°C über Nacht durchgeführt. In verschiedenen Proben wurde das PBS sofort nach Immersion des Verbandes flockig (proben 2, 3, 9, 14, 22, 26 und 27). Wir vermuten, dass diese Verbandproben Silber von der Wundbehandlung enthielten. Nach der Extraktion der Verbände wurde die Farbe der jeweiligen Lösung festgehalten. Drei 0,5 ml Aliquots jedes Extrakts wurden zur Aufbewahrung und Testung gesammelt.
Die Spaltungsreaktion wurde mit 10 μl des Wundenprobenextraktes durchgeführt, 3 μl CPI2-Peptidsubstrat (5 mg/ml in Wasser/DMSO) in 100 μl Gesamtvolumen bei 37°C. Die Reaktion wurde auf einem fluorimetrischen Plattenlesegerät unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 355 nm und einer Emmissionswellenlänge von 485 nm verfolgt (10A bis 10D).
Beispiel 3: Breitspektrumassay unter Verwendung von Varianten der α1-PI RSL Sequenz
Zwei Peptidsubstrate, CPI1 und CPI2, wurden so gestaltet, dass sie alle Spaltstellen der RSL-Sequenz umfassen, wie in den 1A und 1B gezeigt. Die Peptidsubstrate wurden mit dem fluoreszenten Farbstoff Edans ((5-((2-Aminoethyl)amino)naphthalen-1-sulfonsäure) und mit dem Löschfarbstoffmolektül („Quencher") Dabcyl ((4-(4-(Dimethylamino)phenyl)azo)benzoesäure) markiert.
(CPI1) Edans – EAAGAMFLEAIPK-Dabcyl (SEQ ID Nr. 1)
(CPI2) Edans – EGAMFLEAIPMSIPK-Dabcyl (SEQ ID Nr. 2)
Die Bakterien wurden über Nacht in einem Inkubator bei 37°C in 5 ml BHI Medium kultiviert. Jede der entstehenden Kulturen wurde in zwei Proben aufgeteilt. Eine Probe wurde als Kultur verwendet und die andere wurde zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Die Assays wurden in 20 mmol/l Trispuffer (pH 7,2) mit 150 mmol/l NaCl (PBS) durchgeführt. Die Spaltungsreaktion wurde mit 7 μl der Kultur oder des Überstandes und 3 μl Peptidsubstrat (5 mg/ml in Wasser/DMSO) in 100 μl Gesamtvolumen bei 37°C durchgeführt. Die Reaktion wurde mit einem fluorimetrischen Plattenleser unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 355 nm und einer Emissionswellenlänge von 485 nm verfolgt.
Der erste Satz von Experimenten wurde durch Zugabe der Bakterienkultur (Medien und Zellen) direkt in die Assaylösung durchgeführt. Der erste Assay verwendete einen Tag lang kultivierten Zellen und Überstände, sowie die Peptide CPI1 und CPI2 als Substrate. Wie in den 2A und 2B gezeigt, wurde mit dem Peptidsubstrat eine Proteaseaktivität für eine Anzahl von Bakterien beobachtet.
Um zu bestimmen, welche der Bakterien Proteasen sezernieren, wurde ein ähnliches Experiment unter Verwendung bakterieller Überstände durchgeführt, die von den über Nacht gezüchteten Bakterienkulturen mit den Peptiden CPI1 und CPI2 stammen. Wie in den 2C und 2D gezeigt, waren die Ergebnisse zu denen mit den Bakterienkulturen durchgeführten Versuchen ähnlich, was dafür spricht, dass Proteasen sezerniert wurden.
In einem zweiten Satz von Experimenten wurde ein ähnlicher Assay mit 48 Stunden kultivierten Zellen und Überständen durchgeführt. Der Assay verwendete CPI1 und CPI2 als Substrate. Der Assay wurde wie oben für den ersten Satz der Experimente beschrieben durchgeführt, wobei 5 μl der bakteriellen Überstände verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in den 3A–D gezeigt.
Beispiel 4: Entwicklung von Biosensoroberflächen
Das Anhaften von Molekülen an Oberflächen kann durch verschiedene Interaktionstypen vermittelt werden. Typischerweise können Proteine unter Verwendung hydrophober, elektrostatischer oder kovalenter Interaktionen auf Oberflächen aufgebracht werden. Es gibt viele verschiedene kommerziell erhältliche Membranen und Harze mit einer Vielzahl von Oberflächeneigenschaften. Die Oberflächen können auch chemisch modifiziert werden, um die nötigen Oberflächeneigenschaften zu erreichen.
Für Protein- und Peptidbindungen existieren kommerziell erhältliche Transfermembranen. Sie bestehen aus positiv und negativ geladenen Polymeren wie Ionenaustauschmembranen, Scheibenfiltern und Harzen. Mikrozellulosemembranen ermöglichen hydrophobe und elektrostatische Interaktionen. Glasfasermembranen ermöglichen eine hydrophobe Oberfläche, die leicht chemisch modifiziert werden kann, um funktionelle Gruppen hinzuzufügen. Es gibt auch modifizierte Polymermembranen mit reaktiven funktionellen Gruppen, die Proteine und Peptide kovalent binden.
Es ist auch möglich, verschiedene funktionelle Gruppen auf Membranen oder Harzen zu verwenden und ein Quervernetzungsagens, um Proteine kovalent zu verbinden. Quervernetzungsreagenzien enthalten zwei reaktive Gruppen und stellen dadurch ein Mittel zur kovalenten Verbindung von zwei funktionellen Zielgruppen bereit. Die am verbreitetsten funktionel len Gruppen für Proteine sind Amine, Thiole, Carboxylsäuren und alkoholische Gruppen, die zur Bereitstellung intramolekularer Quervernetzungen verwendet werden. Quervernetzungsagenzien können homobifunktional oder heterobifunktional sein und eine Auswahl von Quervernetzungsagenzien verschiedener Längen sind kommerziell erhältlich.
Metallchelat-(Affinitätsbindungs-)Interaktionen können eine festere Bindung an biologische Moleküle bereitstellen. Eine His-Markierung, die in ein Peptidsubstrat eingebaut ist, kann eine Verbindung zu einem Nickel-Bindungsharz vermitteln. Histidin-markierte Peptide können basierend auf der Fähigkeit von konsekutiven Histidinresten zur Bindung an ein Harz (Sepharose) enthaltend Nickelionen, die durch kovalent gebundene Nitrilotriessigsäure (NTA) immobilisiert sind, gereinigt werden. Ein CPI3 Peptid enthaltend CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH (SEQ ID Nr. 5) wurde auf der Grundlage von CPI2 mit der Addition eines Histidintags hergestellt. CPI3 wurde an der Cysteingruppe mit einem colorimetrischen Farbstoff markiert. In diesem Beispiel wurde ein Remazolfarbstoff, Reactive Black 5 (RB5) verwendet. Dieser Farbstoff erzeugt eine dunkelblaue Farbe mit einem Absorptionsmaximum bei 595 nm.
Das CPI3 Reaktive Black 5-markierte Peptid wurde mittels einer Histidinmarkierung an ein NTA Harz gebunden. Das NTA Harz zeigte eine gute Peptidbindung ohne unspezifische Bindung.
Markiertes CPI3 auf NTA Harz wurde über Nacht bei 37°C mit Pseudomonas aeruginosa (PA14) gespalten. Die gespaltenen Peptide wurden mit einer positiv geladenen Membran (Pall SB6407) gesammelt und in das Gefäß mit dem Harz und den Bakterien platziert. Eine Kontrollprobe bestand aus CPI3 auf NTA Harz mit einer positiv geladenen Membran in Phosphatpuffer Saline (PBS). Eine starke Farbänderung wurde im Vergleich mit der Kontrolle auf der positiv geladenen Membran in der Probe mit den Bakterien erhalten. Die Farbveränderung auf der Membran zeigte, dass das CPI3 gespalten worden war und dass der gespaltene Teil mit dem Farbstoff auf die Membran diffundiert war, was eine blaue Farbe hervorrief.
Lysinpeptidmarkierungen können zur Vernetzung an eine Oberfläche wie UltraBind^® (Pall Gelmann Laboratory, Ann Arbor, MI, USA) verwendet werden. UltraBind ist eine Polyethersulfonmembran, die mit Aldehydgruppen zur kovalenten Bindung von Proteinen modifiziert ist. Proteine werden mit der UltraBind-Oberfläche direkt verbunden. Es ist auch möglich, Proteine oder Peptide an die Oberfläche mittels Quervernetzungsketten zu binden. Beispielsweise wird das Carbodiimid EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid) häufig zur Vernetzung von Caroxylsäuregruppen an Amine verwendet. Die Vernetzung von Peptiden mit einem quervernetzten Agens ermöglicht die Auswahl einer Vernetzungskette zur Verlängerung des Peptides von der Oberfläche der Membran, während es gleichzeitig kovalent gebunden ist. Die Vernetzung des Peptids mittels eines Quervernetzungsmittels kann optimiert werden, um die Peptide für die bakteriellen Enzyme zugänglich zu machen. Dies ermöglicht die Optimierung der Reaktionszeit des Sensors, da die Peptidverfügbarkeit zu diesem Parameter in einer direkten Beziehung steht.
Beispiel 5: Oberflächensensorsensitivität
Es wurde bestimmt, dass CPI2 ein guter Kandidat für einen Breitspektrumsensor darstellt. Oberflächensensoren wurden wie folgt konstruiert:
verwendetet Membran: Pall SB6407
verwendetes Peptid: CPI2
verwendete Menge: 8 μg
Die Sensoren wurden luftgetrocknet und über Nacht bei –20°C aufbewahrt. Die Sensoren wurden für die Sensitivitätsstudien in sterile 96-er Platten eingebracht.
Die Bakterien E. faecalis, P. aeruginosa, S. aureus, S. pyogenes und S. marcescens wurden über Nacht bei 37°C in 5 ml BHI (Hirn-Herz-Infusion) Medium kultiviert und in der für jedes Experiment angegebenen Konzentration verdünnt. Jeder Bakterienstamm wurde mit PBS (pH 7,4) verdünnt, um eine optische Dichte (OD) von ungefähr 0,52 bei 550 nm zu erhalten. Diese OD sollte ungefähr 10⁸ Zellen/ml Bakterien entsprechen. Dieser 10⁸ Zellen/ml Stamm für jede Bakterienart wurde mit PBS verdünnt, um eine Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml zu erhalten. Für den Sensitivitätstest wurden 100 μl aus jeder der Konzentrati onsserien von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml (Zellen) auf eine Reihe von Sensoren aufgetragen. Kontrollen für jeden Sensitivitätstest bestanden in Sensoren, die 100 μl PBS aufwiesen.
Daten wurden nach 4, 24 und 48 Stunden für jede Platte aufgenommen. Die Daten bestanden aus Farb-(fluoreszierenden)Bildern jeder Platte, die unter relativ gleichen Bedingungen (Licht, Belichtungszeit, etc.) unter Verwendung einer Kodak DC290 Digitalkamera aufgenommen wurden. Die Bilder wurden unter Verwendung von NIH ImageJ, einer öffentlich zugänglichen Bildverarbeitungs- und -analysesoftware des National Institute of Health (NIH), analysiert. Die Analyse bestand in der Messung der Intensitätswerte innerhalb jeder Vertiefung (d. h. der Summe der Intensitätswerte aller Pixel in der gewählten Fläche geteilt durch die Anzahl der Pixel). Die Pixel haben Werte zwischen 0 und 1. ImageJ repräsentiert 0 als weiß und solche mit einem Wert von 1 als schwarz. Die Sensorsensitivitätsdaten werden als Indexwerte von 0 bis 1 über die Zeit aufgetragen und spiegeln das wider, was den Bildern entspricht.
Die Ergebnisse des E. faecalis Sensors, der mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml getestet wurde, werden in den 4A und 4B gezeigt.
Die Ergebnisse des P. aeruginosa Sensors, der mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml getestet wurde, ist in den 5A und 5B gezeigt.
Die Ergebnisse des S. aureus Sensors, der mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml getestet wurde, ist in den 6A und 6B gezeigt.
Die Ergebnisse des S. pyogenes Sensors, der mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml getestet wurde, ist in den 7A und 7B gezeigt.
Die Ergebnisse des S. marcescens Sensors, der mit einer Konzentrationsserie von 10⁷, 10⁶, 10⁵ und 10⁴ Zellen/ml getestet wurde, ist in den 8A und 8B gezeigt.
Das CPI2 Peptidsubstrat wurde von den Proteasen von Enterococcus, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus und Serratia effizient gespalten. CPI2 Peptidsubstrat wurde nicht gespalten, wenn es mit E. coli Zellen oder Überstand inkubiert wurde. CPI2 Peptid wurde nicht in Gegenwart uninfizierter Wundflüssigkeit gespalten. Bei den höchsten Bakterienkonzentra tionen zeigen viele der Fluoreszenzassays eine Signallöschung, die sich in einem erniedrigten Fluoreszenzsignal für einige der 10⁷ und 10⁸ Proben niederschlägt. Der Assay kann mit weniger Substrat auf der Membran wiederholt werden, um die Löschung des Fluoreszenzsignals zu reduzieren.
Die Reaktivität jedes Sensors wurde am Ende jeder Sensorstudie (40 Stunden) verglichen, um das relativn Signals jedes Sensors zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in den 9A bis 9C gezeigt. Das CPI2 Peptid war beim Nachweis der meisten Pathogene bei 10⁵ CFU effizient. Alle fünf Bakterienarten (aber nicht E. coli) gaben ein starkes Signal bei einer Konzentration von 10⁵ Bakterien/ml. Bei einer Konzentration von 10⁴ Bakterien/ml, scheint Serratia kein Signal zu erzeugen, welches signifikant oberhalb des Hintergrundes gemessen werden kann.
Die Kreuzreaktivität des CPI2 Peptid mit harmlosen Bakterien und mit Wundflüssigkeit kann sorgfältiger unter Verwendung geeigneter Kontrollen analysiert werden. Die Anwendbarkeit des CPI2 Peptidsubstrats auf einem Wundverband und in einer in vivo Schweinestudie kann ebenfalls bestimmt werden.
Während diese Erfindung insbesondere in Bezug auf bevorzugte Ausgestaltungen gezeigt und beschrieben wurde, wird ein Fachmann erkennen, dass verschiedene Veränderungen in Form und Details durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Erfindung, wie sie durch die abhängigen Ansprüche beschrieben ist, abzuweichen.
Beispiel 6: Durchdrück-Assay
Ein CPI3 Peptid stellt eine 5-Histidin-markierten Version des Breitspektrumpeptids CPI2 dar, und wird für den Nachweis verschiedener Pathogene verwendet. Eine Cysteingruppe wurde am N-terminalen Ende addiert, um die Markierung mit einem Farbstoff zu ermöglichen:
CPI3 [Ac]-CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH-[OH].
Das CPI3 Peptid wurde mit Tetramethylrhodamin Iodoacetamid-(TMRIA)Farbstoff (erhältlich von Molecular Probes, Eugens, Oregon, USA) an der Cysteingruppe markiert. Die Mar kierungsreaktion wurde in PBS pH 7,4 mit einem Überschuss von TMRIA-Farbstoff durchgeführt. Das Verhältnis Farbstoff zu Peptid wurde als ungefähr 1,0 berechnet.
Ungefähr 1 mg mit TMRIA-Farbstoff markiertes CPI3 wurde über die 5-Histidin Markierung des Peptids an 1 ml Nickel-Nitrilotriessigsäure(N-NTA)-Agarosekügelchen (von Qiagen, Valencia, Kalifornien, USA) gebunden. Praktisch das gesamte CPI3 wurde an die Ni-NTA Kügelchen gebunden, was sich aus dem Farbverlust der Lösung ergab.
Ein 50 μl Kügelchenvolumen CPI3-TMRIA wurde in Reaktionsgefäße gegeben und 200 μl 1 × 10⁴ oder 1 × 10⁵ CFU pro ml Enterococcus faecalis wurden hinzugegeben und für 5 Minuten inkubiert. Die bakteriellen Proteasen spalteten das CPI3 derart, dass ein Farbstoff-Peptidfragment von den Ni-NTA Kügelchen abgegeben wurde. Die Kügelchen wurden mittels einer kurzen Zentrifugation mit einer Mikrofuge aus der Lösung abgeschieden.
Es wurden korrespondierende Volumina und Bakterienkonzentrationen (z. B. 100 μl von 1 × 10⁵ CFU/μl) aus den Reaktionsgefäßen entnommen, um 10⁵, 10⁶, 10⁷ CFU-Äquivalente zu erhalten und in die Spitze einer 1 ml Spritze gegeben. Phosphat-gepufferte Saline ohne Bakterien wurde als Kontrolle verwendet. Die Spritze wurde dann auf eine von der Größe her passenden O-Ring aufgesetzt, der sich auf einer Polyvinylidenfluorid(PVDF)-Membran befand, die durch Filterpapier gestützt war und der Kolben wurde heruntergedrückt, um die Flüssigkeit durch die Membran zu pressen. Farbstoff-Peptidfragmente wurden an der Oberfläche der PVDF-Membran zurückgehalten und nur ungefärbte Flüssigkeit passierte das Filterpapier. Nach 5 Minuten zeigte die PVDF-Membran, die mit der 10⁷ CFU/ml Flüssigkeit in Kontakt gebracht wurde, die hellste Farbreaktion, während die PVDF Membran, die mit der 10⁶ CFU/ml Flüssigkeit in Kontakt gebracht wurde, nur eine geringere Farbreaktion als die mit der 10⁷ CFU/ml Flüssigkeit in Kontakt gebrachte Membran zeigte. Nach 5 Minuten zeigte die PVDF Membran, die mit der 10⁵ CFU/ml Flüssigkeit in Kontakt gebracht wurde, eine geringere Farbreaktion als die Membran, die mit der 10⁶ CFU/ml Flüssigkeit in Kontakt gebracht wurde, während die Membran, die zur 0 CFU/ml Flüssigkeit in Kontakt gebracht wurde, keine erkennbare Farbreaktion zeigte.
Beispiel 7: Stabilität der detektierbar markierten Substrate
Um die langfristige Stabilität oder Lebensfähigkeit der detektierbar markierten Substrate zu untersuchen, wurden CPI2 Substrate detektierbar mit HRP markiert und an AffiGel Kügelchen gebunden. Die Kügelchen wurden bei 40°C für insgesamt 35 Tage gealtert. Zu verschiedenen Zeitpunkten während des 35 Tage dauernden Alterungsprozesses wurden Proben der Kügelchen entnommen und mit einer Lösung enthaltend 10⁶ CFU/ml P. aeruginosa oder PBS als Kontrollpuffer in Kontakt gebracht. Die Kügelchen, die die mit den Bakterien in Kontakt gebracht wurden, zeigten ein dunkelblaues Signal, während die mit der Kontrolle in Kontakt gebrachten kein derartiges Signal zeigten. 11 zeigt einen Graphen der gemessenen Farben von verschiedenen Proben während des Stabilitätstestes. Die Daten zeigen, dass die Kügelchen sehr stabil sind und sie keine Probleme mit dem Abfall des detektierbaren Signals über die Zeit haben. Dies spricht dafür, dass die Kügelchen sehr haltbar sind.
Beispiel 8: Durchführbarkeit mit verschiedenen Stämmen
Ein CIP2 Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Peptid wurde gegenüber fünf verschiedenen klinischen Stämmen von E. faecalis (erhalten von der University of Colorado) exponiert (in Kontakt gebracht). Das Peptid reagierte mit allen fünf Stämmen stark. 12 zeigt einen Graphen der relativen Fluoreszenz, die nach der Exposition mit den verschiedenen Stämmen gemessen wurden. Die Daten zeigen, dass das detektierbar markierte Peptid die Anwesenheit verschiedener Stämme eines Wundpathogens detektiert.
Beispiel 9: Reaktivität eines mit HRP konjugierten CPI2 Peptids
Das CPI2 Peptid wurde mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert und dann an verschiedene Kügelchen (z. B. AffiGel- und Agarose-ügelchen) gebunden, so dass es in Flüssigphasen- und Festphasenassays verwendet werden kann. Einige der Kügelchen wurden mit einer Lösung enthaltend 10⁶ CFU/ml Pseudomonas aeruginosa exponiert. Eine dunkelblaue Farbe bildete sich in Anwesenheit von ABTS und Wasserstoffperoxid, was für die Anwesenheit von Bakterien spricht. Das detektierbare Farbsignal funktionierte in weniger als 4 Minuten, was dafür spricht, dass die detektierbar markierten Kügelchen als schneller breitbanddiagnostischer Test verwendet werden können, der nützlich zum Nachweis schädlicher Pathogene ist.
Beispiel 10: Klinischer Abstrichtest
Das CPI2 Peptid wurde mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert und dann an verschiedene Kügelchen (z. B. AffiGel- und Agarosekügelchen) gebunden, so dass es in Flüssigphasen- und Festphasenassays verwendet werden kann. Mit Tupfern durchgeführte Abstriche, die an Patientenwunden durchgeführt wurden, wurden von der University of Massachusetts Medical School erhalten. Die Abstriche wurden für die Anwesenheit von Bakterien mit dem nachfolgenden Protokoll getestet:

1) Die HRP-Kügelchen wurden mit PBS 1:10 verdünnt, um eine Kügelchen-Aufschlemmung zu bilden. 10 μl der Aufschlemmung wurden in eine Vertiefung einer Filterplatte gegeben.
2) 10 μl jeder gefrorenen Wundprobe wurden zu 80 μl PBS gegeben. Die resultierende Lösung wurde dann in eine Vertiefung der Filterplatte gegeben.
3) Die Platte wurde für 4 Minuten inkubiert und dann wurde der Filter in eine andere Platte enthaltend US Biological „stable liquid substrate" (1,46 mmol/l ABTS und H₂O₂).
4) Nach einer Minute Entwicklungszeit wurde die Platte mittels des Mikroplattenleser bei 405 nm ausgelesen.

Die Proben, die Wundpathogene enthielten, wurden im Beisein von ABTS und Wasserstoffperoxid dunkelblau. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Bakteriums, aufweisend die Schritte: a) In Kontakt bringen einer Probe mit einem detektierbar markierten synthetischen α1-Proteinaseihibitor-Peptidsubstrat mit einer Reaktionszentrum-Loop-Domäne unter Bedingungen, die zur Spaltung des genannten Substrats durch ein von einem Bakterium produzierten Enzym führen; und b) detektieren einer Spaltung oder einer Abwesenheit der Spaltung des Substrats, wobei die Spaltung des Substrats die Anwesenheit des Bakteriums in der Probe anzeigt und die Abwesenheit von Spaltung der Modifikation des Substrats die Abwesenheit des Bakteriums in der Probe anzeigt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Bakterium ein wundenspezifisches Bakterium ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumonia und Escherichia coli.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Enzym eine Protease ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Substrat mit einer fluoreszierenden Sonde und einem Quencher-Farbstoffmolekül markiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Substrat mit einer Markierung markiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Spin-Markierungen, Antigen-Markierungen, Eptiop-Markierungen, Haptenen, Enzym-Markierungen, prosthetischen Gruppen, fluoreszierenden Materialien, pH-empfindlichen Materialien, chemolumineszenten Materialien, colorimetrischen Komponenten, biolumineszenten Materialien und radioaktiven Materialien.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Substrat mindestens eines der Peptide aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus EAAGAMFLEAIPK, EGAMFLEAIPMSIPK, KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK, GAMFLEAIPMSIPPE und CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Wundoberfläche auf einer Person und einer Körperflüssigkeit.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Substrat auf einer festen Unterlage angeordnet ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die feste Unterlage ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wundverbandmaterial, einem Gefäß zur Aufbewahrung von Körperflüssigkeiten, einer Platte, einem Spekulum, einem Filter, einer Linse, einem Schaum, einem Gewebe, einem Papier, einer Naht, einem Messstab, einem Tupfer, einem Urinsammelbehälter, einem Blutsammelbehälter, einem Plasmasammelbehälter, einem Probenröhrchen, einem Katheter und einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die feste Unterlage ein Material aufweist, das frei von mikrobiellen Verunreinigungen ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Substrat mindestens zwei verschiedene colorimetrische Komponenten aufweist und das Substrat an einer festen Unterlage befestigt ist, wobei die Modifikation des Substrates die Spaltung mindestens eines Teiles des Substrates umfasst, das eine der colorimetrischen Komponenten umfasst, wobei die Spaltung zu einer Farbänderung im sichtbaren Bereich führt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die colorimetrischen Komponenten mit dem Peptid kovalent verbunden sind.
Biosensor zur Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Bakteriums in einer Probe, wobei der Biosensor aufweist: a) eine feste Unterlage und b) ein detektierbar markiertes synthetisches α1-Proteinaseihibitor-Peptidsubstrat mit einer Reaktionszentrum-Loop(RSL)-Domäne, wobei das Substrat mit der festen Unterlage verbunden ist.
Biosensor gemäß Anspruch 13, wobei das Substrat für ein Protein spezifisch ist, das von einem wundspezifischen Bakterium produziert wurde und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Serratia marcescens, Proteus mirabilis, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumonia und Escherichia coli.
Biosensor gemäß Anspruch 14, wobei das Protein ein Prothease-Enzym ist.
Biosensor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das Substrat mit einer fluoreszierenden Sonde und einem Quencher-Farbstoffmolekül markiert ist.
Biosensor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das Substrat mittels einer Markierung markiert ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Spin-Markierungen, Antigen-Markierungen, Eptiop-Markierungen, Haptenen, Enzym-Markierungen, prosthetischen Gruppen, fluoreszierenden Materialien, pH-empfindliche Materialien, chemolumineszenten Materialien, colorimetrischen Komponenten, biolumineszenten Materialien und radioaktiven Materialien.
Biosensor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei das Substrat mindestens eines der Peptide aufweist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus EAAGAMFLEAIPK, EGAMFLEAIPMSIPK, KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK, GAMFLEAIPMSIPPE und CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH.
Biosensor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei die feste Unterlage ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Wundverbandmaterial, einem Gefäß zur Aufbewahrung von Körperflüssigkeiten, einer Platte, einem Spekulum, einem Filter, einer Linse, einem Schaum, einem Gewebe, einem Papier, einer Naht, einem Messstab, einem Tupfer, einem Urinsammelbehälter, einem Blutsammelbehälter, einem Plasmasammelbehälter, einem Probenröhrchen, einem Katheter und einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
Biosensor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 19, wobei die feste Unterlage ein Material aufweist, das frei von mikrobiellen Verunreinigungen ist.
Biosensor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei das Substrat mindestens zwei unterschiedliche colorimetrische Komponenten aufweist, die kovalent mit dem Peptid verbunden sind.
Isoliertes, detektierbar markiertes Peptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EAAGAMFLEAIPK, EGAMFLEAIPMSIPK, KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK, GAMFLEAIPMSIPPE und CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH.