JP4864715B2 - 細菌の広域スペクトルの検出に有用な方法、ペプチドおよびバイオセンサー - Google Patents
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Description
<発明の詳細な説明>
正常な生育の過程の一部として、多くの微生物は酵素をそれらの生育環境内に分泌する。それらの酵素は、栄養素の放出、宿主防御に対する保護、細胞エンベロープ合成(細菌内)および/または維持、およびまだ決定されていないその他を含み、それらに限定されない多数の機能を有する。細菌のような多数の微生物は、細胞外環境へ暴露(そしてそれと相互作用)する細胞表面上で酵素産生もする。
実施例
下記の細菌種それぞれの培養物を、当該技術分野では標準の方法を用いて、ブレインハートインフュージョン(Brain Heart Infusion、BHI)浴中、37℃で激しく攪拌(約200rpm)して一晩(O/N)培養した;黄色ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、霊菌、大腸菌、緑膿菌(PA14)、緑膿菌(GSU3)、および糞便連鎖球菌。一晩培養の後、それぞれの培養物の試料1mlを採取し、そして12.000rpm、5分間の遠心分離によりカルチャー上清から細胞を取り除いた。残ったカルチャー上清は必要になるまで氷上で保存した(1時間以内)。細菌は、以下に記載のように酵素の存在または非存在に関してアッセイされた。
35個の新しく冷凍した創傷用包帯をThomas Serena博士(St.Vincent Wound Clinic,Erie,PAの医学指導者かつPenn North Centers for Advanced Wound Careの創始者)から入手した。包帯を本研究のための医療廃棄物として分類しそして創傷または患者についてのいかなる情報も得られなかった。包帯は無作為に創傷に由来しそして同じ日の内に集めて発送された。包帯をドライアイス上で輸送しそして到着すると直ちに−80℃で保管した。
抽出
分析する日に、包帯をフリーザーから取り出しそして切断のために包帯を引き出すために十分な程度に解凍した。すべての作業は、滅菌条件下で、血液中病原体ガイドライン(Blood−Borne Pathogen Guidline)に従って行われた。各種の包帯大きさおよび浸出物が存在した。大部分の包帯はガーゼタイプであり、いくつかは吸収中心部を有していた(すなわち、親水コロイドまたは先進的創傷管理ドレッシングは含まれていなかったように見受けられる)。それぞれの包帯から2x3.5cmの長方形を切り取った(面積7cm2)。大型包帯の場合には包帯の最も代表的な部分を選択した。
2種のペプチド基質、CPI1およびCPI2はRSL配列のすべての切断部位を包含するように設計され、それを図1Aおよび1Bに示す。ペプチド基質を蛍光プローブedans(5−((2−アミノエチル)アミノ)ナフタレン−1−スルホン酸)および消光色素分子dabcyl((4−(4−(ジメチルアミノ)フェニル)アゾ)安息香酸)を用いて標識した。
(CPI1)Edans−EAAGAMFLEAIPK−dabcyl(配列番号1)
(CPI2)Edans−EGAMFLEAIPMSIPK−dabcyl(配列番号2)
細菌をインキュベーター内で一晩、37℃で5mL PHI(ブレインハートインフュージョン)培地中で培養した。得られた培養物それぞれを2個の試料に分割した。1個は培養物として使用し、他方は遠心分離で分離して上清を集めた。アッセイは、150mM NaClを添加した20mM tris緩衝液(pH7.2)中で行った(PBS)。切断反応は、37℃で全体積100μL中の培地または上清7μLおよびペプチド基質(水/DMSO中5mg/mL)3μLを用いて行った。反応は、励起波長355nmおよび発光波長485nmを用いて蛍光プレートリーダーで追跡した。
表面への分子の付着は、数種の異なる形式の相互作用を用いて行うことができる。典型的には、タンパク質は、疎水性、静電気、または共有結合相互作用を用いて表面に付着できる。各種の表面性質を有する多数の市場で入手できる膜および樹脂がある。表面は、所要の表面性質を備えるために化学的に改変されることもできる。
CPI2は、広域スペクトルセンサーの良い候補として決定された。表面センサーは下記のように構築された。
使用したペプチド: CPI2
使用した量: 8μg
センサーを空気乾燥しそして−20℃で一晩保管した。感度研究のために、センサーを滅菌した96ウエルプレート内に装入した。
CPI3ペプチドは、多種の病原体の検出のために使用される広域スペクトルペプチドCPI2の5−ヒスチジンタグ付バージョンである。システイン基がN−末端に付加されて色素を用いる標識を可能とする:
CPI3 〔Ac〕−CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH〕〔OH〕
CPI3ペプチドは、システイン基上にテトラメチルローダミン ヨードアセトアミド(TMRIA)色素(Molecular Probe,Eugene,Oregonから入手可能)を用いて標識された。標識反応は、過剰のTMRIA色素を用いてPBS中、pH値7.4で行った。色素対ペプチドの比率は約1.0と算出された。
検出可能に標識された基質の長期の安定性または使用可能性を評価するために、CPI2基質をHRPを用いて検出可能に標識しそしてアフィゲル(AffiGel)ビーズへ付着させた。40℃で合計して35日間、ビーズを熟成した。35日間の熟成過程の間に種々の間隔でビーズの試料を採取しそして緑膿菌の106CFU/mLを含む溶液またはPBSの対照緩衝液に暴露した。細胞に暴露されたビーズは、暗青色シグナルを発光し、一方対照に暴露されたものは発光しなかった。図11は、安定性研究の間に採取された種々の試料の色測定のグラフを示す。データは、ビーズが非常に安定でありそして時間経過と共に検出可能なシグナルの劣化に伴ういかなる問題もなかったことを示し、ビーズが非常に耐久性であることを示した。
CPI2蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ペプチドを糞便連鎖球菌の5種の異なる臨床株(University of Coloradoから入手)に暴露した。ペプチドはすべての5種の株と強く反応した。図12は、種々の株に暴露した後に測定された相対蛍光のグラフを示す。データは、検出可能に標識されたペプチドが、創傷病原体の異なる株の存在を検出することを示す。
CPI2ペプチドを西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と共役させ、次いで液相および固相アッセイのために種々のビーズ(例えばアフィゲルおよびアガロースビーズ)に結合させた。一部のビーズは、緑膿菌の106CFU/mLを含む溶液に暴露させた。暗青色がABTSおよび過酸化水素の存在で形成され、それは細菌の存在を示した。検出可能な色シグナルは、4分間以下作動し、検出可能に標識されたビーズは、有害病原体を検出するために有用な注意試験(care test)の迅速な広域スペクトル点として使用できることを示唆した。
CPI2ペプチドを西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)と共役させ、次いで液相および固相アッセイのために種々のビーズ(例えばアフィゲルおよびアガロースビーズ)に結合させた。患者の創傷に暴露させたスワブ試料は、University of Massachusetts Medical Schoolから入手した。スワブ試料を下記のプロトコールを用いて細菌の存在に関して試験した。
Claims (22)
- 細菌の存在または非存在の検出方法であって、
a)試料を、検出可能に標識されたα1プロテナーゼ阻害剤の反応性部位ループ(RSL)ドメインペプチド基質と、細菌により産生された酵素により該基質の切断がもたらされる条件下で、接触させる工程、及び
b)基質の切断または切断の非存在を検出する工程であって、基質の切断が試料内の細菌の存在を示しそして基質の切断の非存在が試料内の細菌の非存在を示す、工程
を含むことを特徴とする方法。 - 細菌が黄色ブドウ球菌、表在ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、緑膿菌、糞便連鎖球菌、霊菌、奇怪変形菌、エンテロバクター・クロカエ、アセチノバクター・アニトラタス、肺炎桿菌、および大腸菌から成る群から選択される創傷特異性細菌である、請求項1に記載の方法。
- 酵素がプロテアーゼである、請求項1または2に記載の方法。
- 基質が蛍光プローブおよび消光色素分子を用いて標識されている、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 基質が、スピンラベル、抗原タグ、エピトープタグ、ハプテン、酵素ラベル、補欠分子族、蛍光物質、pH感受性物質、化学発光物質、比色化合物、生物発光物質、および放射性物質から成る群から選択されるラベルにより標識されている、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 基質が
EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE,およびCGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHHから成る群から選択されるペプチドの少なくとも1種を含んでなる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 試料が被験者上の創傷表面および体液から成る群から選択される、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 基質が固体支持体上にある、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が、創傷用包帯、体液を保持するための容器、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、発泡体、布、紙、縫合糸、ディップスティック、スワブ、蓄尿バッグ、血液蓄積バッグ、血漿蓄積バッグ、試験管、カテーテル、およびマイクロプレートのウエルから成る群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 固体支持体が、微生物の汚染物を含まないことを要求される材料を含んでなる、請求項8および9のいずれかに記載の方法。
- 基質が少なくとも2種の異なる比色成分を含んでなり、そして基質が固体支持体上に付着され、ここで、基質の改変が比色成分の一種を含む基質の少なくとも一部分を切断することを含んでなる、該切断が目視可能な色変化をもたらす、請求項8〜10のいずれかに記載の方法。
- 比色成分がペプチドに共有結合される、請求項11に記載の方法。
- 試料内の細菌の存在または非存在を検出するためのバイオセンサーであって、
a)固体支持体、および
b)検出可能に標識されたα1プロテナーゼ阻害剤の反応性部位ループ(RSL)ドメインペプチド基質であって、該固体支持体に付着されている基質、
を含むことを特徴とする、バイオセンサー。 - 基質が、黄色ブドウ球菌、表在ブドウ球菌、化膿連鎖球菌、緑膿菌、糞便連鎖球菌、霊菌、奇怪変形菌、エンテロバクター・クロカエ、アセチノバクター・アントラタス、肺炎桿菌、および大腸菌から成る群から選択される創傷特異性細菌により産生されるタンパク質に特異性である、請求項13に記載のバイオセンサー。
- タンパク質がプロテアーゼ酵素である、請求項14に記載のバイオセンサー。
- 基質が蛍光プローブおよび消光色素分子を用いて標識される、請求項13〜15のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 基質が、スピンラベル、抗原タグ、エピトープタグ、ハプテン、酵素ラベル、補欠分子族、蛍光物質、pH感受性物質、化学発光物質、比色化合物、生物発光物質、および放射性物質から成る群から選択されるラベルにより標識される、請求項13〜16のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 基質が
EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE,およびCGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHHから成る群から選択されるペプチドの少なくとも1種を含んでなる、請求項13〜17のいずれかに記載のバイオセンサー。 - 固体支持体が、創傷用包帯、体液を保持するための容器、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、発泡体、布、紙、縫合糸、ディップスティック、スワブ、蓄尿バッグ、血液蓄積バッグ、血漿蓄積バッグ、試験管、カテーテル、およびマイクロプレートのウエルから成る群から選択される、請求項13〜18のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 固体支持体が、微生物の汚染物を含まないことを要求される材料を含んでなる、請求項13〜19のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 基質が、ペプチドに共有結合している少なくとも2種の異なる比色成分を含んでなる、
請求項13〜20のいずれかに記載のバイオセンサー。 - EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE,およびCGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHHから成る群から選択されるアミノ酸配列からなる、群より選択されたアミノ酸配列からなる、検出可能に標識された単離ペプチド。
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