PL215172B1 - Sposób wykrywania Escherichia coli, biosensor do wykrywania Escherichia coli i zestaw do wykrywania Escherichia coli - Google Patents
Sposób wykrywania Escherichia coli, biosensor do wykrywania Escherichia coli i zestaw do wykrywania Escherichia coliInfo
- Publication number
- PL215172B1 PL215172B1 PL378054A PL37805404A PL215172B1 PL 215172 B1 PL215172 B1 PL 215172B1 PL 378054 A PL378054 A PL 378054A PL 37805404 A PL37805404 A PL 37805404A PL 215172 B1 PL215172 B1 PL 215172B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- substrate
- sample
- enzyme
- escherichia coli
- edans
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 61
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 149
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 80
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 80
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 33
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 88
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 29
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 29
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 29
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 23
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 20
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 15
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 13
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 claims description 10
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 8
- -1 suture Substances 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 5
- 239000005003 food packaging material Substances 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 36
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 31
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 74
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 39
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 39
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 39
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 25
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 16
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 5
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 4
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 4
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 4
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000607715 Serratia marcescens Species 0.000 description 4
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 4
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 4
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 4
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 3
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N Arg-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XPSGESXVBSQZPL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 2
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 description 2
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 description 2
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 241000194024 Streptococcus salivarius Species 0.000 description 2
- AJNUKMZFHXUBMK-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N AJNUKMZFHXUBMK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 102000007362 alpha-Crystallins Human genes 0.000 description 2
- 108010007908 alpha-Crystallins Proteins 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 108010003052 omptin outer membrane protease Proteins 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGSNRSQFCPZFAA-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-(2-aminoethyl)naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(O)(=O)=O)=C(N)C(CCN)=CC2=C1 SGSNRSQFCPZFAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical group OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LSKWDEYBJACPBB-UHFFFAOYSA-N 5-(aziridin-1-ylsulfonyl)-n,n-dimethylnaphthalen-1-amine Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(=O)(=O)N1CC1 LSKWDEYBJACPBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 7-hydroxycoumarin Natural products O1C(=O)C=CC2=CC(O)=CC=C21 CJIJXIFQYOPWTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012440 Acetylcholinesterase Human genes 0.000 description 1
- 108010022752 Acetylcholinesterase Proteins 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N Arg-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(O)=O IASNWHAGGYTEKX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N Arg-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- ZBYLEBZCVKLPCY-FXQIFTODSA-N Asp-Ser-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ZBYLEBZCVKLPCY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034309 Bacterial disease carrier Diseases 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000722910 Burkholderia mallei Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241000589874 Campylobacter fetus Species 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 235000013175 Crataegus laevigata Nutrition 0.000 description 1
- OWAFTBLVZNSIFO-SRVKXCTJSA-N Cys-His-His Chemical compound N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O OWAFTBLVZNSIFO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 206010061126 Escherichia infection Diseases 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- DZMVESFTHXSSPZ-XVYDVKMFSA-N His-Ala-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DZMVESFTHXSSPZ-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 1
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N Lys-Lys-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XOQMURBBIXRRCR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WWXNZNWZNZPDIF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 241000606723 Rickettsia akari Species 0.000 description 1
- 241000606697 Rickettsia prowazekii Species 0.000 description 1
- NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NLQUOHDCLSFABG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO SBMNPABNWKXNBJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- 238000012084 abdominal surgery Methods 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 229940022698 acetylcholinesterase Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010060035 arginylproline Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940065181 bacillus anthracis Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000020612 escherichia coli infection Diseases 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005661 hydrophobic surface Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical class NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003014 ion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N n,n-dichlorotriazin-4-amine Chemical compound ClN(Cl)C1=CC=NN=N1 ZTLGJPIZUOVDMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N naphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C1=CC=C2C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=C1 PSZYNBSKGUBXEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920005597 polymer membrane Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046939 rickettsia prowazekii Drugs 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N umbelliferone Chemical compound C1=CC(=O)OC2=CC(O)=CC=C21 ORHBXUUXSCNDEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/10—Enterobacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
- G01N33/56916—Enterobacteria, e.g. shigella, salmonella, klebsiella, serratia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/24—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- G01N2333/245—Escherichia (G)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności lub braku obecności Escherichia coli w próbce, biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności Escherichia coli w próbce i zestaw do wykrywania zakażenia Escherichia coli.
Tło wynalazku
Zakażenia są głównym źródłem wydatków na opiekę zdrowotną. Około 5% wszystkich ran chirurgicznych zostaje zakażonych drobnoustrojami, a liczba ta jest znacząco większa (10-20%) w przypadku pacjentów, u których przeprowadzono zabiegi chirurgiczne brzucha. Gatunki bakterii takie jak Escherichia coli (E. coli) są organizmami najczęściej izolowanymi z zakażonych ran. Częstość kolonizacji bakteryjnej jest znacząco większa w środowisku szpitalnym, zarówno wśród pracowników, jak i pacjentów. Co więcej, organizmy kolonizujące w środowisku szpitalnym są prawdopodobnie oporne na wiele rodzajów terapii przeciwbakteryjnej, co wiąże się z silną presją selekcyjną środowiska szpitalnego, gdzie antybiotyki są często stosowane. Większość szczepów Escherichia coli może w nieszkodliwy sposób współistnieć z ludźmi, na przykład w ich jelitach i nie jest prawdopodobne, żeby w normalnych warunkach wywoływały one chorobę. Jednak pewne szczepy produkują toksyny, które mogą powodować poważne, nawet zagrażające życiu zaburzenia, w tym zaburzenia jelitowe, zaburzenia nerek i zakażenia dróg moczowych.
Escherichia coli jest jednym z typów organizmów patogennych, który można znaleźć w ludzkim organizmie podczas zakażenia, inne typy obejmują, ale bez ograniczenia, gatunki Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae i Staphylococcus.
Zakażenie, w tym zakażenie ran spowodowane którymkolwiek z powyższych organizmów, jest istotnym problemem dla szpitali. Najczęstszą drogą zapobiegania takiemu zakażeniu jest profilaktyczne podawanie antybiotyków. Podczas gdy ta strategia jest zasadniczo efektywna, wywołuje ona niezamierzony efekt w postaci hodowania opornych szczepów bakterii. Należy unikać rutynowego stosowania antybiotyków w celach profilaktycznych z tego właśnie powodu, że pobudzają one wzrost opornych szczepów.
Zamiast rutynowego stosowania profilaktyki, lepiej jest raczej stosować zasady dobrej praktyki postępowania przeciwbakteryjnego, tj. chronić przed bakteriami przed, w czasie i po zabiegach chirurgicznych obszary, które mogą zostać zakażone i uważnie monitorować pod kątem zakażenia miejsce rany i płyny ustrojowe pacjenta. Zwykłe sposoby monitorowania obejmują ścisłą obserwację miejsca rany pod kątem powolnego gojenia się, objawów stanu zapalnego i ropy, jak równie mierzenie temperatury pacjenta pod kątem objawów gorączki oraz badanie płynów ustrojowych pacjenta, na przykład moczu, pod kątem objawów zakażenia. Niestety, wiele objawów staje się oczywistych dopiero wtedy, gdy zakażenie jest już rozwinięte. Co więcej, po wypisaniu pacjenta ze szpitala, staje się on odpowiedzialny za monitorowanie swojej opieki zdrowotnej a objawy zakażenia mogą być niewidoczne dla niewykwalifikowanego pacjenta.
System lub biosensor, który może wykrywać wczesne stadia zakażenia, zanim rozwiną się objawy, byłby korzystny zarówno dla pacjenta jak i dla pracowników opieki zdrowotnej. Jeżeli pacjent może po wypisie ściśle kontrolować stan rany, wtedy można rozpocząć odpowiednią terapię przeciwbakteryjną wystarczająco wcześnie, żeby zapobiec poważniejszemu zakażeniu.
Streszczenie wynalazku
Stwierdzono, że wydzielane przez drobnoustroje, takie jak bakterie lub grzyby, cząsteczki, na przykład białka, których ekspresja zachodzi na powierzchni komórek drobnoustrojów albo których ekspresja zachodzi na powierzchni komórki zakażonej wirusem lub prionem, mogą służyć jako wskaźnik do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce, na przykład w ranie lub w płynie ustrojowym. Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju - E. coli - w próbce poprzez wykrywanie w próbce obecności lub braku obecności molekularnego wskaźnika drobnoustroju. W szczególności, wskaźniki molekularne, które mają być wykryte obejmują białka takie jak enzymy, które są specyficzne dla gatunków drobnoustroju.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności lub braku obecności Escherichia coli w próbce, polegający na tym, że sposób ten obejmuje etapy w których:
PL 215 172 B1
a) kontaktuje się próbkę ze znakowanym w wykrywalny sposób substratem dla związanego z błoną enzymu protezowego swoistego dla patogennych bakterii Escherichia coli, w warunkach, które skutkują cięciem tego substratu przez ten enzym; i
b) wykrywa się cięcie lub brak cięcia tego substratu, przy czym cięcie tego substratu wskazuje na obecność patogennych bakterii Escherichia coli w tej próbce i przy czym brak cięcia tego substratu wskazuje na brak obecności Escherichia coli w tej próbce;
przy czym związanym z błoną enzymem proteazowym jest ompT; i przy czym znakowany w wykrywalny sposób substrat obejmuje peptyd wybrany spośród: (dabcylo-K)VSRRRRRGG(D-edans) (NR ID. SEKW.: 2);
KKAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 3 i 4);
CHHHAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 5 i 6).
Korzystnie w sposobie według wynalazku próbkę wybiera się z grupy składającej się z próbki uzyskanej z rany podmiotu i płynu ustrojowego.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się substrat na podłożu stałym.
Korzystniej w sposobie według wynalazku stosuje się podłoże stałe zawierające materiał, który ma być wolny od zanieczyszczeń drobnoustrojami.
Korzystniej w sposobie według wynalazku stosuje się podłoże stałe wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do przechowywania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu, materiału do pakowania żywności i tamponu.
Jeszcze korzystniej w sposobie według wynalazku stosuje się pojemnik do przechowywania płynów ustrojowych wybrany z grupy składającej się z torebki do zbierania moczu, torebki do zbierania krwi, torebki do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności Escherichia coli w próbce, charakteryzujący się tym, że zawiera podłoże stałe i znakowany w wykrywalny sposób substrat dla związanego z błoną enzymu protezowego swoistego dla patogennych bakterii Escherichia coli;
przy czym ten substrat przyłączony jest do tego podłoża stałego; przy czym związanym z błoną enzymem proteazowym jest ompT; i przy czym znakowany w wykrywalny sposób substrat obejmuje peptyd wybrany spośród: (dabcylo-K)VSRRRRRGG(D-edans) (NR ID. SEKW.: 2);
KKAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 3 i 4);
CHHHAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 5 i 6).
Korzystnie w biosensorze według wynalazku podłoże stałe zawiera materiał, który ma być wolny od zanieczyszczeń drobnoustrojami.
Korzystnie w biosensorze według wynalazku to podłoże stałe jest wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do trzymania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu, materiału do pakowania żywności i tamponu.
Korzystniej w biosensorze według wynalazku ten pojemnik do przechowywania płynów ustrojowych jest wybrany z grupy składającej się z pojemnika do zbierania moczu, pojemnika do zbierania krwi, pojemnika do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do wykrywania zakażenia, charakteryzujący się tym, że zawiera biosensor jak określono powyżej oraz jeden lub więcej odczynników skutecznych do wykrywania związanego z błoną enzymu protezowego swoistego dla patogennych bakterii Escherichia coli, przy czym związanym z błoną enzymem proteazowym jest ompT.
W jednym z aspektów opisano tu sposób wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju, na przykład E. coli, w próbce, obejmujący etapy kontaktowania próbki z wykrywalnym, znakowanym substratem dla enzymu wytwarzanego i/lub wydzielanego przez drobnoustrój w warunkach, które powodują przekształcanie substratu przez enzym; i wykrywanie przekształcenia lub braku przekształcenia substratu. Przekształcenie substratu wskazuje na obecność drobnoustroju w próbce a nieobecność przekształcenia substratu wskazuje na brak drobnoustroju w próbce. W szczególności substrat może składać się ze znakowanego peptydu, który jest cięty przez enzym proteazę, żeby otrzymać sygnał, który może być wykryty. Co więcej, ten peptyd można zaprojektować tak, aby zawierał określoną sekwencję reszt aminokwasów rozciągającą się na jednym końcu oryginalnego peptydu substratu jako znacznik „tag, w celu kowalencyjnego sprzęgania substratu do powierzchni.
W innym aspekcie opisano tu sposób diagnozowania obecności lub braku obecności zakażenia u podmiotu, obejmujący etapy a) kontaktowania otrzymanej z rany podmiotu próbki ze znakowanym
PL 215 172 B1 w wykrywalny sposób substratem dla enzymu wytwarzanego i/lub wydzielanego przez drobnoustrój, na przykład E. coli, w warunkach, które powodują przekształcanie substratu przez enzym; i b) wykrywania przekształcenia lub braku przekształcenia substratu. Przekształcenie substratu wskazuje na obecność zakażenia u podmiotu, a nieobecność przekształcenia substratu wskazuje na brak zakażenia u podmiotu.
W jeszcze innym aspekcie opisano tu sposób diagnozowania obecności zakażenia lub braku zakażenia rany u podmiotu, obejmujący etapy a) kontaktowania podmiotu ze znakowanym w wykrywalny sposób substratem dla enzymu wytwarzanego i/lub wydzielanego przez drobnoustrój, na przykład E. coli w warunkach, które powodują przekształcanie substratu przez enzym; i b) wykrywania przekształcenia lub braku przekształcenia substratu. Przekształcenie substratu wskazuje na obecność zakażenia rany u podmiotu, a nieobecność przekształcenia substratu wskazuje na brak zakażenia rany u podmiotu.
W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek przedstawia biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustrój - E. coli, zawierający stałe podłoże i znakowany w wykrywalny sposób substrat dla enzymu wytwarzanego i/lub wydzielanego przez drobnoustrój, w którym to biosensorze substrat jest przyłączony do stałego podłoża.
W jeszcze innym aspekcie, niniejszy wynalazek przedstawia zestaw do wykrywania zakażenia, zawierający biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności drobnoustroju w próbce i jeden lub więcej odczynników do wykrywania w próbce obecności drobnoustroju, który jest czynnikiem powodującym zakażenie. Na przykład, odczynnik może być użyty do wykrycia enzymu wydzielanego przez drobnoustrój. W szczególności odczynnik może być użyty do wykrycia przekształcenia substratu biosensora.
Krótki opis figur
Fig. 1 jest wykresem cięcia docelowego substratu ecot1 (T1) (fluorescencja względna) w próbkach zawierających różne bakterie, tak jak wskazano. Wszystkie próbki bakterii pochodzą bezpośrednio z hodowli i zawierają komórki i pożywki. (Legenda skrótów: bufor = 20 mM bufor TRIS (pH 7,4) ze 150 mM NaCl, peptyd T1 = znakowany substrat peptydowy)
Fig. 2 jest wykresem cięcia docelowego substratu ecot2 (T2) (fluorescencja względna) w próbkach zawierających różne bakterie, tak jak wskazano. Wszystkie próbki bakterii pochodzą bezpośrednio z hodowli i zawierają komórki i pożywki. (Legenda skrótów: bufor = 20 mM bufor TRIS (pH 7,4) ze 150 mM NaCl, peptyd T2 = znakowany substrat peptydowy)
Fig. 3 jest wykresem cięcia docelowego substratu ecot2 (T2) (fluorescencja względna) w próbkach zawierających różne bakterie, tak jak wskazano, plus płodową surowicę wołową (FBS). Wszystkie próbki bakterii pochodzą bezpośrednio z hodowli i zawierają komórki i pożywki. (Legenda skrótów: bufor = 20 mM bufor TRIS (pH 7,4) ze 150 mM NaCl, peptyd T2 = znakowany substrat peptydowy, FBS = płodowa surowica wołowa)
Fig. 4 jest wykresem cięcia docelowego substratu ecot2 (T2) (względna fluorescencja) w próbkach pozorowanego płynu z ran, zawierających różne bakterie, plus albuminę surowicy wołowej (BSA). Wszystkie próbki bakterii pochodzą bezpośrednio z hodowli i zawierają komórki i pożywki. (Legenda skrótów: bufor = 20 mM bufor TRIS (pH 7,4) z 150 mM NaCl, peptyd T2 = znakowany substrat peptydowy)
Fig. 5 jest wykresem cięcia substratu proteazy T3 (względna fluorescencja) w czasie, w próbkach zawierających bufor, bufor plus T3, bufor plus T3C (nieoczyszczony peptyd) lub hodowlę zawierającą komórki i pożywki z Pseudomonas, E. coli, S. aureus (Staph. aureus), S. epidermidis (Staph. epidermidis), S. salivarius (Strep. salivarius), S. pyogenes (Strep. pyogenes), Enterococcus Iub Serratia.
Szczegółowy opis wynalazku
Wiele drobnoustrojów wydziela pewną liczbę enzymów do swojego środowiska wzrostu, co jest częścią ich normalnego procesu wzrostu. Te enzymy mają pewne funkcje obejmujące, ale bez ograniczenia, uwalnianie składników odżywczych, ochronę przed obroną gospodarza, syntezę i/lub utrzymanie otoczki komórki (u bakterii) i inne jeszcze nieokreślone. Wiele drobnoustrojów wytwarza enzymy również na powierzchni swoich komórek, która jest wystawiona na środowisko zewnątrzkomórkowe (i oddziałuje z nim). Wiele z tych enzymów jest specyficznych dla drobnoustroju, który je wydziela i jako takie mogą one służyć jako specyficzne wskaźniki obecności tych drobnoustrojów. System, który może wykrywać obecność tych enzymów, które są wytwarzane i/lub wydzielane może również służyć do wskazywania obecności wytwarzającego/wydzielającego je drobnoustroju. Alternatywnie, system, który może wykrywać brak obecności tych enzymów, które są wytwarzane i/lub wydzielane również
PL 215 172 B1 może służyć do wskazywania braku obecności wytwarzającego/wydzielającego je drobnoustroju. Taki system detekcji jest użyteczny do wykrywania lub diagnozowania zakażenia. Tak jak użyto tutaj, „zakażenie oznacza zaburzenie spowodowane przez wystawienie na działanie patogennego drobnoustroju. W jednym z przykładów drobnoustrojem jest E. coli. W innym przykładzie zaburzenie jest zakażeniem rany, zaburzeniem jelitowym, zatruciem pokarmowym, zaburzeniem nerek lub zakażeniem dróg moczowych.
System testowy do detekcji drobnoustroju, jak opisano tutaj, może być przystosowany do detekcji jednego specyficznego organizmu, na przykład E. coli, przez identyfikowanie białka takiego jak wydzielany enzym specyficzny dla drobnoustroju, który ma być wykryty. Alternatywnie, system testowy można zaprojektować do jednoczesnej identyfikacji więcej niż jednego gatunku drobnoustroju (na przykład przynajmniej 2, przynajmniej 5 lub przynajmniej 10 różnych gatunków drobnoustrojów), takich jak te, które zazwyczaj powodują zakażenia. Identyfikowanie tych enzymów, które są wspólne dla pewnych klas drobnoustrojów patogennych, ale które nie są obecne w drobnoustrojach innych niż patogenne, jest pewną drogą do osiągnięcia tego celu. Takie enzymy mogą być na przykład identyfikowane komputerowo w oparciu o przeszukiwanie bioinformatyczne baz danych genomów bakteryjnych. Używając enzymów jako podstawy systemu detekcji, można zaprojektować czułe testy, ponieważ nawet bardzo mała ilość enzymu może katalizować przekształcanie znaczącej ilości substratu.
Niniejszy wynalazek dotyczy identyfikacji białek bakteryjnych, które są specyficzne dla drobnoustrojów, które są czynnikami powodującymi zakażenia. Obecność patogennej bakterii można wykryć przez zaprojektowanie syntetycznego substratu, który będzie specyficznie reagował z enzymem, który jest obecny na powierzchni komórki lub który jest wydzielany. Te syntetyczne substraty mogą być znakowane wykrywalnym znacznikiem tak, że w warunkach, w których odpowiadające im enzymy specyficznie z nimi reagują, podlegają one przekształceniom, na przykład obserwowana jest widoczna zmiana koloru.
Enzymy, które są stosowane w sposobie wykrywania bakterii tu opisanym, są dogodnie enzymami swoistymi dla zakażenia. W stosowanym tu znaczeniu, enzym swoisty dla zakażenia jest enzymem wytwarzanym i/lub wydzielanym przez bakterie patogenne, ale nie jest wytwarzany przez bakterie inne niż patogenne. Przykłady bakterii patogennych obejmują, ale bez ograniczenia, staphylococcus (na przykład Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis lub Staphylococcus saprophyticus), streptococcus (na przykład Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae Iub Streptococcus agalactiae), enterococcus (na przykład Enterococcus faecalis lub Enterococcus faecium) gatunki corynebacteria (na przykład Corynebacterium diptheriae), bacillus (na przykład Bacillus anthracis), listeria (na przykład Listeria monocytogenes), gatunki Clostridium (na przykład Clostridium perfringens, Clostridium tetanus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile), gatunki Neisseria (na przykład Neisseria meningitidis lub Neisseria gonorrhoeae), E. coli, gatunki Shigella, gatunki Salomonella, gatunki Yersinia (na przykład Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis lub Yersinia enterocolitica), gatunki Vibrio cholerae, Campylobacter (na przykład, Calmpylobacter jejuni lub Campylobacter fetus), Helicobacter pylori, pseudomonas (na przykład, Pseudomonas aeruginosa Iub Pseudomonas mallei), Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, Legionella pneumophila, TreponemapalIidum, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, mycobacteria (na przykład, Mycobacterium tuberculosis), Mycobacterium leprae, gatunki Actinoomyces, gatunki Nocardia, chlamydia (na przykład, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis Iub Chlamydia pneumoniae), Rickettsia (na przykład, Rickettsiaricketsii, Rickettsia prowazekii Iub Rickettsia akari), brucella (na przykład, Brucella abortus, Brucella melitemis, Iub Brucella suis), Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae i Francisella tularensis. Bakterią specyficzną dla zakażenia jest dogodnie staphylococcus, streptococcus, enterococcus, bacillus, gatunki Clostridium, E. coli, yersinia, pseudomonas, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae lub Mycobacterium leprae. Na przykład, enzym swoisty dla zakażenia może być wytwarzany i/lub wydzielany przez Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae i/lub Escherichia coli.
Enzym może być jednym lub więcej spośród następujących: białko fosfolipazy A, białko błony zewnętrznej T (ompT) lub inne białka omp. Sekwencje tych białek mogą być otrzymane poprzez przeszukiwanie baz danych sekwencji białek, na przykład GenBank, a takie poszukiwanie może przepro6
PL 215 172 B1 wadzić specjalista w tej dziedzinie. Geny kodujące takie białka mogą być także klonowane, przy użyciu technik klonowania znanych osobom wykwalifikowanym w tej dziedzinie.
Substraty, które można zastosować zgodnie z wynalazkiem obejmują każdą cząsteczkę, albo syntetyczną albo występującą naturalnie, która może oddziaływać z enzymem tu opisanym. Przykłady substratów obejmują opisane tutaj substraty, jak również substraty dla tych enzymów znane w tej dziedzinie. Inne przykłady substratów obejmują fluorescencyjne peptydy pochodne ecot1 (T1), na przykład Edans-DSRPVRRRRRPRVSK-Dabcyl (NR ID. SEKW.:1) lub fluorescencyjne peptydy pochodne ecot2 (T2), na przykład Edans-KVSRRRRRGGD-Dabcyl (NR ID. SEKW.:2), które mogą być cięte przez białko ompT patogennej E. coli. Takie opisane tutaj substraty można otrzymać ze źródeł komercyjnych np. Sigma (St. Louis, MO) lub można je wytworzyć, np. izolować lub oczyszczać lub syntetyzować przy użyciu sposobów znanych specjalistom w tej dziedzinie.
Enzymy opisane zgodnie z wynalazkiem mogą przekształcać substraty, na przykład białka lub polipeptydy, poprzez cięcie i takie przekształcenia mogą być wykrywane w celu oznaczenia obecności lub braku obecności patogenu w próbce. Jednym ze sposobów wykrywania przekształcenia substratu przez enzym jest znakowanie substratu dwoma różnymi barwnikami, z których jeden służy do wygaszania fluorescencji drugiego barwnika przez fluorescencyjny rezonans energetyczny (FRET), gdy cząsteczki, na przykład barwniki lub substancje kolorymetryczne, są w bliskim sąsiedztwie i pomiar przez wykrywanie zmian we fluorescencji.
FRET jest procesem interakcji stanu pobudzenia zależnym od odległości, w którym emisja jednej cząsteczki fluorescencyjnej jest sprzężona z pobudzeniem innej. Typowa para akceptor i donor dla rezonansu energetycznego składa się z kwasu 4-[[(dimetyloamino)fenyl]azo]benzoesowego (Dabcyl) i kwasu 5-[(2-aminoetyloamino]naftalenosulfonowego (Edans). Edans jest pobudzany światłem o długości 336 nm i emituje foton przy długości fali 490 nm. Jeżeli cząsteczka Dabcyl jest umiejscowiona w obszarze 20 angstremów od cząsteczki Edans, ten foton będzie wydajnie absorbowany. Dabcyl i Edans będą przyłączane do przeciwnych końców substratu peptydowego. Jeżeli substrat jest nietknięty, FRET będzie bardzo wydajny. Jeżeli peptyd zostanie rozcięty przez enzym, dwa barwniki nie będą dłużej w bliskim sąsiedztwie i FRET będzie niewydajny. Reakcję cięcia można monitorować przez obserwację albo zmniejszania fluorescencji Dabcylu albo wzrost fluorescencji Edans (utrata wygaszania).
Jeżeli substrat, który ma być przekształcony jest białkiem, peptydem lub polipeptydem, substrat może być wytworzony przy użyciu standardowych technik rekombinacji białek (patrz na przykład Ausubel i wsp. „Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, (1998)). Dodatkowo, enzymy opisane zgodnie z wynalazkiem mogą być także wytworzone przy użyciu technik rekombinacji. Dzięki obfitej dostępności enzymu lub jego substratu, jeżeli jest to pożądane, można oznaczyć dokładne miejsce przekształcenia i określić bardziej specyficzny substrat enzymu. Ten substrat można także zastosować do badania obecności bakterii patogennej.
Substraty są znakowane wykrywalnym znacznikiem, który jest stosowany do monitorowania interakcji między enzymem a substratem i wykrywania jakichkolwiek przekształceń substratu, na przykład cięcia substratu lub znakowania wynikającego z takich interakcji. Przykłady wykrywalnych znaczników obejmują różne barwniki, które mogą być włączane do substratów, na przykład te opisane tutaj, znaczniki spinu, znaczniki antygenowe lub epitopowe, haptenowe, znaczniki enzymatyczne, grupy prostetyczne, materiały fluorescencyjne, materiały chemiluminescencyjne, materiały bioluminescencyjne i materiały radioaktywne. Przykłady odpowiednich znaczników enzymatycznych obejmują peroksydazę chrzanową, fosfatazę alkaliczną, β-galaktozydazę i acetylocholinoesterazę; przykłady odpowiednich kompleksów grup prostetycznych obejmują streptawidynę/biotynę i awidynę/biotynę; przykłady odpowiednich materiałów fluorescencyjnych obejmują umbelliferon, fluoresceinę, izotiocyjonian fluoresceiny, rodaminę, dichlorotriazinylamino fluoresceinę, chlorek dansylu i fikoerytrynę; przykład chemiluminescencyjnego materiału obejmuje luminol; przykłady bioluminescencyjnych materiałów obejmują lucyferazę, lucyferynę i ekworynę, a przykłady odpowiedniego radioaktywnego materiału
ΛΛΓ ή O ή CO O obejmują: 125I, 131I, 33S i 3H. Inne przykłady wykrywalnych znaczników obejmują: Bodipy, Pyrene, Texas Red, Edans, Dansyl Aziridine, IATR i fluoresceinę. Sukcyimidylowe estry, izocyjaniany i jodoacetamidy tych znaczników są także dostępne komercyjnie. Jeżeli nie są stosowane wykrywalne znaczniki, aktywność enzymatyczna może być oznaczana innymi odpowiednimi sposobami, na przykład wykrywaniem cięcia substratu przy użyciu analizy elektroforetycznej lub innymi sposobami znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Przykładem odpowiedniego wykrywalnego znacznika jest barwnik chromogenny, który pozwala monitorować hydrolizę substratu przez drobnoustrój. Przykładem takiego
PL 215 172 B1 barwnika jest paranitrofenol. Barwnik sprzężony do cząsteczki substratu będzie bezbarwny aż do przekształcenia substratu przez wydzielany enzym, w którym to punkcie zmieni się na żółty. Postęp oddziaływań enzym-substrat może być monitorowany przez pomiar absorbancji na spektrofotometrze przy 415 nm. Specjalistom w tej dziedzinie znane są inne barwniki, które wytwarzają wykrywalne przekształcenia, np. widoczną zmianę koloru.
Próbką, w której jest wykrywana obecność lub brak obecności bakterii, takiej jak E. coli, lub diagnozowane jest zakażenie, może być na przykład rana, płyn ustrojowy taki jak krew, mocz, plwocina lub płyn z rany (na przykład ropa wytwarzana w miejscu rany). Próbką może być także cokolwiek, co może zawierać bakterię na powierzchni i/lub wewnątrz, na przykład, opatrunek rany, cewnik, torebka do zbierania moczu, torebka do zbierania krwi, torebka do zbierania osocza, dysk, scope, sączek, soczewka, gąbka, materiał, papier, szew, tampon, probówka, studzienka mikropłytki, płyn do soczewek kontaktowych, materiał, w który była zapakowana żywność lub wymaz z powierzchni pokoju lub budynku, na przykład badanego pokoju lub sali operacyjnej w zespole opieki zdrowotnej, łazienki, kuchni lub zakładu przetwarzającego lub wytwarzającego.
Zgodnie z wynalazkiem opisano także biosensor do wykrywania (jednego lub więcej, na przykład przynajmniej 2, przynajmniej 5, przynajmniej 10, przynajmniej 20, przynajmniej 30, przynajmniej 50, przynajmniej 75 lub przynajmniej 100) opisanego tutaj wskaźnikowego białka enzymu(enzymów) i do powiadomienia odbiorcy o obecności białka wskaźnikowego. Dostarczony jest biosensor do zastosowania w zespole opieki zdrowotnej, lub do użytku domowego do wykrywania zakażenia, zawierający (jeden lub więcej) specyficzny substrat(substraty), który jest sprzężony z podłożem stałym, które jest w sąsiedztwie rany lub innego płynu ustrojowego, który ma być monitorowany ze względu na skażenie bakterią. Dogodnie substrat jest związany kowalencyjnie ze znacznikiem i w ten sposób ma sygnał detekcyjny, który po proteolizie związanego znakowanego substratu wskazuje na obecność bakterii. Taki biosensor można także zastosować w miejscach przygotowywania żywności w celu wykrywania produktów skażonych bakteriami.
Biosensor jest wykonywany najpierw przez określenie specyficznego substratu dla specyficznego enzymu charakterystycznego dla bakterii, które mają być wykrywane. Określony specyficzny substrat jest znakowany jednym lub więcej, dogodnie wieloma, wykrywalnymi znacznikami, na przykład chromatogennymi lub fluorescencyjnymi grupami opuszczającymi. Najlepiej, jeżeli grupa znakująca dostarcza utajonego sygnału, który jest aktywowany tylko wtedy, gdy sygnał jest proteolitycznie odłączany od substratu. Chromatogenne grupy opuszczające obejmują na przykład grupy paranitroanilidowe. Substrat powinien wchodzić w kontakt z enzymem wydzielanym przez bakterię do rany lub innego płynu ustrojowego lub prezentowanym na powierzchni komórki bakteryjnej, enzym przekształca substraty w sposób, który daje w wyniku detekcję takiego przekształcenia, na przykład zmianę absorbancji, która może być wykryta wizualnie jako zmiana koloru (na przykład na stałym podłożu takim jak opatrunek rany) albo przy użyciu technik spektrofotometrycznych, standardowych w tej dziedzinie.
Biosensor będący przedmiotem niniejszego wynalazku może zawierać także jeden lub więcej substratów (na przykład przynajmniej 2, przynajmniej 5, przynajmniej 10, przynajmniej 20, przynajmniej 30, przynajmniej 50, przynajmniej 75 lub przynajmniej 100 substratów) dla enzymów wytwarzanych i/lub wydzielanych przez bakterie patogenne. Biosensor jest podłożem stałym, na przykład opatrunkiem rany (takim jak bandaż lub gaza), jakimkolwiek materiałem, który powinien być jałowy lub wolny od skażeń bakteryjnych, polimerem, dyskiem, scope, sączkiem, soczewką, gąbką, materiałem, papierem lub szwem lub artykułami, które zawierają lub służą do zbierania próbek (takie jak pojemnik do zbierania moczu, pojemnik do zbierania osocza, probówka, cewnik, gazik (tampon) lub studzienka mikropłytki).
Typowo, w przypadku gdy podłoże stałe bezpośrednio kontaktuje się z raną lub zakażonym obszarem lub próbką, to podłoże stałe wykonane jest z materiałów nadających się do sterylizacji. W pewnej postaci niniejszego wynalazku biosensor może być bezpośrednio kontaktowany z raną lub zakażonym obszarem. W pewnych przypadkach stosowane jest sterylne pokrycie lub warstwa, żeby zapobiec skażeniu rany lub płynu ustrojowego przez taki bezpośredni kontakt. Jeżeli stosowane są takie sterylne pokrycia, będą one miały takie własności, które pozwolą na ich sterylizację, jednak nie przeszkodzą w interakcji enzym/substrat. Dogodnie część biosensora, która wchodzi w kontakt z raną jest także nieprzylegająca po to, by pozwolić na łatwe usunięcie biosensora z powierzchni próbki. Na przykład, jeżeli biosensor zawiera opatrunek rany, opatrunek rany pozostaje w kontakcie z raną przez
PL 215 172 B1 czas wystarczający do reakcji substratu enzymu i potem opatrunek jest usuwany z rany bez powodowania dalszego uszkodzenia rany lub otaczających tkanek.
Substraty odpowiednio znakowane wykrywalnymi znacznikami, na przykład barwnikami chromogennymi, są przyłączane lub włączane do aparatu sensorowego i mogą działać jako wskaźniki obecności lub braku obecności bakterii patogennych, które wydzielają wcześniej wspomniane enzymy. Gdy używany jest więcej niż jeden substrat, każdy może być znakowany tak, żeby rozróżnić jeden od drugiego (na przykład używając różnych wykrywalnych znaczników) i/lub każdy może być zlokalizowany w konkretnym regionie podłoża stałego. Substraty z hydrofobowymi grupami opuszczającymi mogą być niekowalencyjnie związane z podłożami hydrofobowymi. Alternatywnie, hydrofilowe lub hydrofobowe substraty mogą być sprzęgane do powierzchni przez disiarczek lub aminę pierwszorzędową, grupy karboksylowe lub hydroksylowe. Sposoby sprzęgania substratów do stałego podłoża są znane w tej dziedzinie. Na przykład fluorescencyjne lub chromogenne substraty mogą być sprzęgane do podłoża stałego przy użyciu nieistotnych reaktywnych zakończeń, takich jak wolne aminy, kwasy karboksylowe lub grupy SH, które nie wpływają na reakcję z patogenem. Wolne aminy mogą być sprzęgane do grup karboksylowych substratu na przykład przy użyciu 10-cio krotnego nadmiaru albo chlorowodorku N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC) lub sulfonianu N-cykloheksyloN'-2-(4'-metylomorfolino)etylo karbodiimidu-p-toluenu (CMC) przez 2 godziny w 4°C w wodzie destylowanej doprowadzonej do pH 4,5, żeby pobudzić reakcję kondensacji w celu utworzenia połączenia peptydowego. Grupy SH mogą być redukowane DDT lub TCEP i następnie sprzęgane do wolnych grup aminowych na powierzchni przy użyciu kwasu N-e-maleimido heksanowego (EMCA, Griffith i wsp., FEBS Lett. 134: 261-263, 1981). Przykłady substratów są tutaj dostarczone.
Polipeptydy opisane zgodnie z wynalazkiem obejmują także fragmenty i sekwencje wariantów opisanych tutaj substratów polipeptydowych. Warianty obejmują istotnie homologiczne peptydy, kodowane przez to samo genetyczne lokus w organizmie, np. wariant allelowy, równie dobrze jak inne warianty. Warianty obejmują także polipeptydy pochodzące z innych genetycznych Ioci w organizmie, ale mające istotną homologię do opisanego tutaj substratu polipeptydowego. Warianty obejmują także polipeptydy istotnie homologiczne lub identyczne z tymi polipeptydami, ale pochodzące z innego organizmu, tj. ortologi. Warianty obejmują także polipeptydy, które są istotnie homologiczne lub identyczne z tymi polipeptydami, które są wytwarzane drogą syntezy chemicznej. Warianty obejmują także polipeptydy, które są istotnie homologiczne lub identyczne z tymi polipeptydami otrzymywanymi sposobami rekombinacji.
Procent identyczności dwóch sekwencji aminokwasowych można oznaczać przez dopasowanie sekwencji w celu optymalnego porównania (np. można wprowadzić przerwy w sekwencji pierwszej sekwencji). Następnie porównywane są aminokwasy w odpowiadających pozycjach a procent identyczności między dwiema sekwencjami jest funkcją liczby identycznych pozycji w tych sekwencjach (tj. %identyczności = # identycznych pozycji/całkowitą # pozycji x 100). W pewnych postaciach, długość przyrównanej w celu porównywania sekwencji stanowi przynamniej 30%, dogodniej przynamniej 40%, jeszcze dogodniej przynamniej 60% a nawet jeszcze dogodniej przynamniej 70%, 80%, 90% lub 100% długości sekwencji odniesienia. Rzeczywiste porównanie dwóch sekwencji można zrealizować dobrze znanymi sposobami, na przykład przy użyciu algorytmu matematycznego. Zalecany nieograniczający przykład takiego algorytmu matematycznego jest opisany w Karlin i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993). Taki algorytm jest włączony do programów BLAST (wersja 2.2) jak opisano w Schaffer i wsp., (Nucleic Acids Res., 29:2994-3005, 2001). Podczas używania programów BLAST i Gapped BLAST można stosować parametry domyślne poszczególnych programów. W pewnej realizacji przeszukiwana baza danych jest bazą danych bez redundancji (NR), a parametry do porównania sekwencji można ustawić następująco: bez filtrów; wartość oczekiwana 10; wielkość słowa 3; macierz BLOSUM62 i kara za przerwę 11 i kara za wydłużenie 1.
W innej postaci procent identyczności między dwiema sekwencjami aminokwasowymi można oznaczać przy użyciu programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (Accelrys Inc., San Diego California) stosując albo macierze Blossom 63 albo macierze PAM250 i wagi przerw 12, 10, 8, 6 lub 4 i wagi długości 2, 3 lub 4. W jeszcze innej postaci procent identyczności między dwiema sekwencjami kwasu nukleinowego można określić przy użyciu programu GAP w pakiecie oprogramowania GCG (dostępne na http://www.cgc.com), stosując wagi przerw 50 i wagi długości 3.
Opisane są tutaj inne zalecane sposoby porównywania sekwencji.
Opisano tu także peptydy mające mały stopień identyczności, ale mające wystarczające podobieństwo, żeby spełniać jedną lub więcej tych samych funkcji spełnianych przez polipeptyd, np. zdolPL 215 172 B1 ność do działania jako substrat dla specyficznej proteazy E. coli. Podobieństwo jest determinowane przez konserwatywne podstawienia aminokwasów. Takie podstawienia są tymi, które podstawiają dany aminokwas w polipeptydzie innym aminokwasem o podobnej charakterystyce. Podstawienia konserwatywne prawdopodobnie są fenotypowo milczące. Typowo jako podstawienia konserwatywne traktowane są zastąpienia, jeden za drugi, między aminokwasami alifatycznymi Ala, Val, Leu i Ile; wzajemna zamiana reszt hydroksylowych aminokwasów Ser i Thr; wymiana reszt kwasowych aminokwsów Asp i Glu; podstawienie między resztami aminokwasów amidowych Asn i Gln; wymiana reszt aminokwasów zasadowych Lys i Arg i zamiana między resztami aminokwasów aromatycznych Phe i Tyr. Wskazówki dotyczące kwestii, które zmiany aminokwasów są prawdopodobnie fenotypowo milczące podane są w Bowie i wsp., Science 247: 1306-1310, 1990).
Warianty funkcjonalne mogą także zawierać podstawienia podobnych aminokwasów, w wyniku których nie powstają zmiany lub powstają tylko nieistotne zmiany funkcji. Alternatywnie, takie podstawienia mogą do pewnego stopnia, pozytywnie lub negatywnie, zmieniać funkcje. Warianty inne niż funkcjonalne typowo zawierają jedno lub więcej niekonserwatywnych podstawień aminokwasów, delecji, insercji, inwersji lub cięć lub podstawień, insercji, inwersji lub delecji w krytycznych resztach lub krytycznych regionach, takie krytyczne regiony obejmują miejsce proteolitycznego cięcia dla proteazy specyficznej dla zakażenia.
Aminokwasy w polipeptydzie tu opisanym, które są istotne dla cięcia przez proteazę specyficzną dla E. coli mogą być identyfikowane sposobami znanymi w tej dziedzinie, takimi jak miejscowo ukierunkowana mutageneza lub skaningowa mutageneza alaninowa (Cunningham i wsp., Science, 244: 1081-1085, 1989). Ta ostatnia procedura wprowadza pojedynczą mutację alaniny w każdej reszcie w cząsteczce (jedna mutacja na cząsteczkę).
Opisano tu także fragmenty polipeptydowe substratów peptydowych lub ich funkcjonalnych wariantów. Opisano tu także fragmenty wariantów opisanych tutaj polipeptydów. Użyteczne fragmenty obejmują te, które zachowały zdolność do działania jako substraty dla proteazy specyficznej dla zakażenia.
Fragmenty mogą być oddzielne (nieprzyłączone do innych aminokwasów lub polipeptydów) lub mogą być wewnątrz większego polipeptydu. Ponadto, kilka fragmentów może być zawartych wewnątrz pojedynczego większego polipeptydu. W pewnej postaci, fragment zaprojektowany do ekspresji w gospodarzu może mieć heterologiczne pre i pro polipeptydowe regiony przyłączone do końca aminowego fragmentu polipeptydowego i dodatkowo region przyłączony do końca karboksylowego fragmentu polipeptydu.
Biosensory będące przedmiotem niniejszego wynalazku mogą być zastosowane w jakiejkolwiek sytuacji, gdy pożądane jest wykrycie obecności lub braku obecności bakterii, w szczególności bakterii patogennej. Na przykład bakteria, która zbiera się na powierzchni roboczej w zakładzie wytwarzania lub przetwarzania żywności albo w zakładzie opieki zdrowotnej, a w szczególności w salach operacyjnych, może być wykryta przy użyciu biosensora tak jak to tutaj opisano. Substrat lub więcej niż jeden substrat, który może być przekształcany przez enzym wydzielany lub obecny na powierzchni bakterii, jest znakowany i kowalencyjnie przyłączony do kolektora substratu takiego jak włókna bawełniane na końcu gazika (tamponu). Gdy używany jest więcej niż jeden substrat, każdy może być znakowany tak, żeby odróżnić jeden od drugiego (na przykład różnymi wykrywalnymi znacznikami) i/lub każdy może być zlokalizowany w konkretnym regionie na podłożu stałym. Koniec gazika jest używany do wycierania powierzchni podejrzanej o skażenie bakteriami. Koniec gazika jest umieszczany w pożywce i hodowany w warunkach pozwalających na przekształcanie znakowanego substratu, jeżeli obecny jest enzym specyficzny dla znakowanego, związanego substratu(substratów).
Niniejszy wynalazek dotyczy także zestawu do wykrywania opisanych tutaj bakterii specyficznych dla zakażenia. Zestaw może zawierać podłoże stałe, na przykład mające wiele studzienek (np. płytka do mikromiareczkowania), do którego jest przyłączony, sprzężony lub przymocowany wykrywalny, znakowany substrat. Dostarczane są środki do dostarczania jednego lub więcej roztworów buforów. Dostarczane są także kontrola ujemna i/lub kontrola dodatnia. Odpowiednie kontrole mogą być łatwo wywiedzione przez specjalistę w tej dziedzinie. Opisana tutaj próbka, podejrzana o skażenie patogenem, jest przygotowywana przy użyciu roztworu(roztworów) buforu. Porcje próbki, kontroli ujemnej i dodatniej są umieszczane w oddzielnych studzienkach, żeby reagowały. Te studzienki, w których obserwuje się przekształcenie substratu, na przykład zmianę koloru, są oznaczane, że zawierają patogen bakteryjny. Taki zestaw jest szczególnie użyteczny do wykrywania zakażenia u podmiotu.
PL 215 172 B1
Niniejszy wynalazek dotyczy także zestawu, który zawiera biosensor, taki jak zapakowany sterylny opatrunek rany lub sensor do materiału do pakowania żywności, i wszystkie dodatkowe odczynniki niezbędne do wykonania oznaczenia detekcji.
Sposób przeprowadzania oznaczania wykrywania bakterii patogennych, które wytwarzają przynajmniej jeden enzym, który jest wydzielany przez komórkę lub obecny na powierzchni komórki i sposób stosowania oznaczania w celu wykrycia bakterii patogennej wytwarzającej enzym(enzymy) jest następujący:
Etap 1) oznaczanie sekwencji aminokwasowej, która unikalnie identyfikuje drobnoustrój prokariotyczny będący przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, można oznaczać (jedną lub więcej) sekwencję aminokwasową, która jest unikalna dla specyficznej grupy patogenów swoistych dla zakażenia.
Selekcja sekwencji aminokwasowej, na przykład białka, peptydu lub polipeptydu (sekwencja znacznikowa), która unikalnie charakteryzuje lub znakuje obecność będącego przedmiotem zainteresowania drobnoustroju lub grupy drobnoustrojów (na przykład patogenów specyficznych dla zakażenia). Selekcja może być przeprowadzona przy użyciu podejścia bioinformatycznego, na przykład jak opisano szczegółowo poniżej. Oznaczane są jedna lub więcej sekwencji aminokwasowych, które są specyficzne dla drobnoustroju prokariotycznego.
Etap 2) Otrzymanie wystarczającej ilości enzymu do oznaczenia warunków ułatwiających optymalne przekształcanie substratu przez enzym.
Izolowanie enzymu ze środowiska pozakomórkowego, w którym rosną bakterie patogenne, które mają być analizowane lub z błony komórkowej bakterii stosując standardowe techniki oczyszczania białka opisane na przykład w Ausubel (powyżej).
Alternatywnie, w przypadku gdy sekwencja genetyczna kodująca enzym lub umiejscowienie sekwencji genetycznej kodującej enzym są nieznane, izolowanie i klonowanie sekwencji genetycznej kodującej znacznikowy aminokwas według etapu 1, lub najpierw oznaczenie sekwencji genetycznej a następnie postępowanie jak poprzednio.
Etap 3) oznaczanie warunków wzrostu organizmu prokariotycznego i wytwarzania enzymu obecnego na powierzchni komórki lub wydzielanego przez komórkę.
Oznaczanie pożywki wymaganej do wzrostu będącego przedmiotem zainteresowania specyficznego drobnoustroju prokariotycznego i do ekspresji jego enzymu o unikalnej aktywności do środowiska. Także oznaczanie czy druga cząsteczka, na przykład enzym, jest wymagana do przekształcenia specyficznego enzymu z formy nieaktywnego prekursora, w formę aktywną. Do oznaczenia czy enzym został wydzielony w formie aktywnej, dostarczana jest próbka hodowli bakteryjnej z wybranymi potencjalnymi substratami i oznaczane jest cięcie tych substratów. Można to przeprowadzić, na przykład, przez łączenie bakterii, która wytwarza enzym z substratem w odpowiedniej pożywce i inkubowanie w 37°C z łagodnym wytrząsaniem. Po upływie ustalonego wcześniej czasu (0,1; 0,3; 1,0; 3,0; 5,0; 24 i 48 godzin) próbki są wirowane w celu osadzenia bakterii na dnie i mała porcja jest przenoszona na próbkę żelu SDS-PAGE. Po upłynięciu czasu, próbki są puszczane w 10-15% gradiencie na miniżelu SDS-PAGE. Następnie białka są przenoszone do Immobilon Pseq (bufor do przenoszenia; 10% CAPS; 10% metanol; pH 11,0; 0,15 V przez 30 minut) używając aparatu Bio-Rad do półsuchego transblottingu. Po przeniesieniu białek, plama jest znakowana Comassie blue R-250 (0,25% Comassie Brillant Blue R250; 50% metanol; 10% kwas octowy) i odbarwiana (silne odbarwianie przez 5 min, 50% metanol; 10% kwas octowy; słabe odbarwianie dopóki nie będzie kompletne, 10% metanol; 10% kwas octowy), po czym następuje sekwencjonowanie od N-końca. Alternatywnie próbki mogą być puszczone na spektrometr masowy w celu mapowania miejsc cięcia proteolitycznego przy użyciu spektrometru Voyager Elite Mass (Perceptive Biosystems, Albertville, Minesota).
Etap 4) Identyfikacja każdego specyficznego substratu(substratów) aktywnej enzymatycznie proteazy. Przykłady potencjalnych substratów obejmują białka, peptydy, polipeptydy, lipidy i podjednostki peptydoglikanu. Znakowanie każdego substratu wykrywalnym znacznikiem opisanym tutaj lub innym znacznikiem znanym w tej dziedzinie.
Etap 5) Zwiększanie specyficzności interakcji enzym-substrat (opcjonalnie) przez oznaczanie miejsca aktywnego lub miejsca wiążącego enzymu (na przykład stosując FRET, jak to opisano powyżej), następnie oznaczanie sekwencji genetycznej użytecznej do wytwarzania miejsca aktywnego lub wiążącego i klonowanie określonej sekwencji genetycznej w celu wytworzenia bardziej specyficznego substratu.
PL 215 172 B1
Etap 6) Dostarczanie biosensora zawierającego jeden lub więcej zidentyfikowanych powyżej, znakowanych w wykrywalny sposób substratów w celu detekcji proteazy bakterii patogennych, które są przedmiotem zainteresowania.
Substrat może być przymocowany do stałego podłoża, na przykład opatrunku rany lub artykułu, który zawiera enzym i substrat, na przykład torebki lub probówki do zbierania płynów ustrojowych, studzienki mikropłytki lub probówki. Stałe podłoże, jeżeli jest to pożądane, może dostarczać na derywatyzowanych płytkach wielu derywatyzowanych miejsc wiążących do sprzęgania substratu, na przykład miejsca pierwszorzędowej aminy znakowane estrem sukcymidylowym (Xenobind plates, Xenopore, Hawthorne, New Jersey).
Opcjonalnie, niezajęte reaktywne miejsca na stałym podłożu są blokowane przez sprzęganie z albuminą surowicy wołowej lub aktywną domeną p26. p26 jest białkiem typu alfa-krystaliny, które w tym przypadku jest stosowane do zmniejszania niespecyficznej agregacji białka. Zdolność białka p26 do ponownego zwijania denaturowanej termicznie syntetazy cytrynianowej przed i po sprzęganiu do powierzchni opakowań do żywności jest stosowane jako kontrola do oznaczania aktywności p26. Białka typu alfa-krystaliny były wytwarzane techniką rekombinacji, przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA (patrz Ausubel, powyżej). W skrócie, plazmid zawierający domenę rdzeniową naładowanej beta kartki p26 jest elektroporowany do komórek elektrokompetentnych BL21(DE3) (Bio-Rad E. coli pulser). Komórki są hodowane do OD600 0,8, następnie indukowane 1 mM IPTG przez 4 godziny. Komórki są wirowane i sonifikowane w słabym buforze (10 mM Tris, pH 8,0; 500 mM NaCl; 50 mM Imidazol) w celu zlizowania (Virsonic, Virtis, Gardiner, New York). Lizat jest wirowany przy 13 000 x g przez 10 minut i supernatant jest sączony przez 0,45 i 0,2 μm. Przesącz jest ładowany na kolumnę superose NI-NTA (Qiagen, Valencia, California, cat # 30410). Do eluowania białka używany jest silny bufor (10 mM Tris pH 8,0; 500 mM NaCl, 250 mM imidazol).
Tak jak tu opisano, należy pozwolić enzymowi, by wszedł w kontakt z substratem i obserwować reakcję przekształcenia w substracie, który jest znakowany w wykrywalny sposób. Przekształcanie substratu wskazuje, że enzym wytwarzany/wydzielany przez bakterie jest obecny w reakcji. Dodatkowo, brak przekształcenia substratu wskazuje na brak enzymu w próbce. Jeżeli bakterie lub enzym pochodzą z rany lub innego zakażonego obszaru, przekształcanie substratu wskazuje, że bakteria jest obecna w ranie lub zakażonym obszarze i że rana lub obszar są zakażone, podczas gdy brak przekształcenia substratu wskazuje, że konkretna bakteria nie jest obecna w ranie lub obszarze i że rana lub obszar nie są zakażone konkretną bakterią.
P r z y k ł a d y
Niniejszy wynalazek będzie teraz zilustrowany następującymi przykładami, których zamiarem nie jest, by były ograniczające w jakikolwiek sposób.
P r z y k ł a d 1: Wykrywanie obecności E. coli w próbce
Opracowanie oznaczenia E. coli
Gram-ujemna bakteria Escherichia coli jest najlepiej scharakteryzowanym ludzkim patogenem i wiadomo, że wydziela bardzo niewiele cząsteczek, jeżeli nie są one specyficznie wymagane dla wirulencji. Wirulentne szczepy obejmują te, które prawdopodobnie powodują zatrucia pokarmowe (O157:H7), zaburzenia jelitowe (EHEC) lub zakażenia dróg moczowych (UTI). Jednak większość szczepów E. coli może nieszkodliwie współistnieć z ludźmi i nie jest prawdopodobne, by powodowały choroby w normalnych warunkach.
Chociaż wiele genów jest wspólnych z innymi bakteriami, E. coli ma rozwinięte pewne unikalne sposoby współistnienia. Badania genomu K-12 E. coli przez odejmowanie kilku innych bakterii patogennych i niepatogennych dostarcza listy genów, które są unikalne dla tego organizmu. Otrzymana lista obejmuje fosfolipazę A białek błony zewnętrznej, białko błony zewnętrznej T (ompT) i kilka innych genów omp.
Gen ompT koduje enzym, który znajduje się na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej i jest stosowany do ochrony komórki przed silnie kationowymi peptydami przeciwbakteryjnymi (defensynami) wytwarzanymi u ludzi. Jak wykazano, białko OmpT jest związaną z błoną proteazą, która efektywnie tnie protaminy (sperma łososia). Enzym wiąże dodatnio naładowane białka i peptydy, a cięcie najchętniej pojawia się między dwiema dodatnio naładowanymi resztami. Używane tutaj substraty peptydowe znakowano sondą fluorescencyjną edvans (5-(kwas (2-aminoetylo)aminonaftaleno-1-sulfonowy) i cząsteczką barwnika wygaszającego dabcyl (kwas (4-(4-(dimetyloamino)fenylo)azo)benzoesowy). Sekwencje używanych znakowanych peptydów ecot1 (T1) i ecot2 (T2) są następujące:
PL 215 172 B1 (T1) Edans-DSRPVRRRRRPRVSK-Dabcyl (NR ID. SEKW.: 1) (T2) Dabcyl-KVSRRRRRGGD-Edans (NR ID. SEKW.: 2)
Bakterie hodowano przez noc w inkubatorze w 37°C w 5 ml pożywek BHI (Brain Heart Infusion). Każdą z otrzymanych hodowli dzielono na dwie próbki. Jedną stosowano jako hodowlę, drugą osadzano przez wirowanie i zbierano supernatant. Oznaczenia przeprowadzano w 20 mM buforze Tris (pH 7,4) z dodatkiem 150 mM NaCl. Reakcję przeprowadzano z 5 μΐ hodowli lub supernatantu 1 i 5 μΐ substratu peptydowego (10 mg/ml w wodzie) w całkowitej objętości 100 μl w 37°C. Po reakcji wykonywano odczyt we fluorymetrycznym czytniku płytek, stosując falę wzbudzenia o długości 355 nm i falę emisji o długości 485 nm.
Pierwszy zestaw doświadczeń przeprowadzono przez dodanie hodowli bakteryjnej bezpośrednio do roztworu do oznaczania. Proteaza OmpT jest białkiem związanym z błoną i nie należałoby się spodziewać znalezienia jej w postaci wydzielonej do pożywek. Pierwsze oznaczenie przeprowadzono używając jako substratu peptydu ecot1 (T1). Wyniki przedstawiono na Fig. 1.
Jak pokazano na Fig. 1, przy użyciu substratu peptydowego T1, aktywność proteazy obserwowano zarówno dla E. coli, jak i Pseudomonas. To samo oznaczenie proteazy powtórzono w identycznych warunkach dla substratu ecot2 (T2). Wyniki przedstawiono na Fig. 2.
Jak pokazano na Fig. 2, z tym substratem reagowała próbka zawierająca E. coli. Wydaje się, że ten peptyd jest zarówno efektywny, jak i selektywny w stosunku do E. coli.
W celu sprawdzenia, czy proteaza jest związana z błoną, jak oczekuje się tego dla OmpT E. coli, oznaczenie proteazy powtórzono dla supernatantów otrzymanych z każdej hodowli bakteryjnej. Gdy z supernatantami z hodowli bakteryjnych zastosowano substrat peptydowy T1, nadal obserwowano aktywność proteazy dla Pseudomonas, ale nie stwierdzono w supernatancie aktywności związanej z komórkami E. coli. To wskazuje, że proteaza z Pseudomonas jest wydzielana do roztworu, ale obserwowana tutaj proteaza E. coli jest związana z błoną i może należeć do OmpT. Gdy substrat peptydowy T2 zastosowano w reakcji z supernatantami z hodowli bakteryjnych, nie wykazywał on żadnej reaktywności z proteazą wydzielaną przez E. coli albo inną badaną bakterię. To wskazuje, że peptyd T2 wydaje się być selektywny względem proteazy OmpT błony zewnętrznej E. coli.
Następnie badano reaktywność krzyżową substratu peptydowego T2 z rodzajami warunków i cząsteczek, które mogą być obecne w środowisku rany. Płynem, który może być obecny w środowisku rany jest, przynajmniej początkowo, surowica. Żeby sprawdzić reaktywność z surowicą, bufor reakcyjny zmieniono przez dodanie 5% płodowej surowicy wołowej i powtórzono oznaczenie proteazy stosując substrat peptydowy T2. Wyniki przedstawiono na Fig. 3. Jak pokazano na Fig. 3, wykrycie obecności E. coli w próbce E. coli nastąpiło w obecności FBS.
Oznaczenie proteazy testowano także w buforze pozorującym płyn z rany. Bufor stanowił fizjologiczny roztwór soli buforowany Tris, tak jak opisano powyżej, do którego dodano 5% (wagowo) albuminy surowicy wołowej. Oznaczenie proteazy powtórzono stosując znowu substrat peptydowy T2. Wyniki tego oznaczania przedstawiono na Fig. 4. Jak pokazano na Fig. 4, reaktywność proteazy w próbce E. coli nie była zmieniona przez bufor pozorujący płyn z rany. W tych warunkach, peptyd T2 wydaje się być szybką i selektywną sondą do wykrywania komórek E. coli.
P r z y k ł a d 2: Opracowanie powierzchni biosensora
Przyłączanie cząsteczek do powierzchni można przeprowadzić przy zastosowaniu kilku różnych typów oddziaływań. Typowo, białka mogą być przyłączane do powierzchni przy użyciu oddziaływań hydrofobowych, elektrostatycznych lub kowalencyjnych. Komercyjnie dostępnych jest wiele różnych błon i żywic o różnych właściwościach powierzchni. Powierzchnie mogą być także modyfikowane chemicznie w celu otrzymania wymaganych właściwości powierzchni.
Istnieją dostępne komercyjnie błony do przenoszenia, do wiązania białek i peptydów. Składają się one z dodatnio i ujemnie naładowanych polimerów takich jak jonowymienne błonowe filtry dyskowe i żywice. Błony nitrocelulozowe oferują oddziaływania hydrofobowe i elektrostatyczne. Błony z włókien szklanych oferują powierzchnię hydrofobową, która może być łatwo zmieniona chemicznie w celu dodania grup funkcyjnych. Są także zmienione błony polimerowe, które oferują reaktywne grupy funkcyjne, które kowalencyjnie wiążą się z białkami i peptydami.
Możliwe jest także zastosowanie różnych grup funkcyjnych na błonach lub żywicach i odczynnika sieciującego w celu kowalencyjnego połączenia białek. Odczynniki sieciujące zawierają dwie grupy reaktywne i dlatego dostarczają środków do kowalencyjnego łączenia dwóch docelowych grup funkcyjnych. Najpowszechniejszymi grupami funkcyjnymi dostępnymi na białkach są grupy aminowa, tiolowa, kwas karboksylowy i grupa alkoholowa, które są stosowane do tworzenia poprzecznych wiązań
PL 215 172 B1 międzycząsteczkowych. Odczynniki sieciujące mogą być homobifunkcyjne lub heterobifunkcyjne a komercyjnie dostępny jest szereg odczynników sieciujących o różnej długości.
Początkowo badane peptydy zaprojektowano jako substraty do opracowania oznaczenia do detekcji bakterii przy użyciu fluorescencyjnego rezonansu energetycznego (Edans i Dabcyl). T2, który jest selektywny w stosunku do E. coli, jest przykładem takiego substratu i jest tutaj opisany.
W celu opracowania substratów specyficznych dla immobilizacji powierzchniowej, zrobiono kilka wersji peptydu T2. Peptydy zaprojektowano tak, żeby w przypadku T2 zawierały grupy lizyny (funkcyjne grupy aminowe) na jednym końcu peptydu. Dodatek dwóch grup lizyny (KK) na jednym końcu peptydu służy jako znacznik i dostarcza idealnych grup do przyłączenia do powierzchni technikami takimi jak oddziaływania elektrostatyczne albo poprzez przyłączenie kowalencyjne. Peptyd T4 zaprojektowano tak, żeby zawierał na jednym końcu grupę cysteiny (C) i trzy grupy histydyny (HHH). Dodatek cysteiny dostarcza innej idealnej grupy lub znacznika do przeprowadzenia kowalencyjnego przyłączania poprzez grupę tiolową. Zawartość trzech grup histydyny dostarcza także możliwości przyłączenia do żywicy z niklem.
Sekwencję peptydu T2 zmodyfikowano jak pokazano:
T2 (dabcylo-K)VSRRRRRGG(D-edans) (NR ID. SEKW.: 2)
T3 KKAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 3 i 4)
T4 CHHHAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 5 i 6)
Przed peptydami do oryginalnej sekwencji dodano znacznik, żeby umożliwić przyłączenie do powierzchni.
Oznaczenie proteazy, opisane tutaj do wykrywania E. coli, przeprowadzano ze zmodyfikowaną wersją T2, T3. Bakterie (Pseudomonas, E. coli, S. aureus, S. epidermidis, S. salivarius, S. pyogenes, Enterococcus i Serratia) hodowano w inkubatorze przez noc, w temperaturze 37°C, w 5 ml pożywki (BHI) (Brain Heart Infusion). Oznaczenie przeprowadzano w 20 mM buforze Tris (pH 7,4) z dodatkiem
150 mM NaCl. Reakcję przeprowadzano z 7 μΐ hodowli zawierającej komórki i pożywkę i 3 μΐ substratu peptydowego (5 mg/ml) w całkowitej objętości wynoszącej 100 pi, w temperaturze 37°C. Reakcję monitorowano we fluorymetrycznym czytniku płytek stosując długość fali wzbudzenia 355 nm i długość faii emisji 485 nm. Wyniki przedstawiono na Fig. 5. Jak pokazano na Fig. 5, to oznaczenie wydaje się być specyficzne dla E. coli.
Oddziaływania chelat metal (powinowactwo wiązania) mogą dostarczyć cząsteczkom biologicznym silniejszych wiązań. Znacznik His wbudowany do substratu peptydowego, na przykład T4, może być stosowany, w celu umożliwienia przyłączenia do żywicy wiążącej się z niklem. Żywica jest inkubowana z odpowiednią hodowlą, na przykład E. coli przez 30 minut w 37°C. Po odwirowaniu, bufor jest usuwany a osadzona żywica jest obrazowana. Następnie wykrywana jest wytwarzana przez peptyd fluorescencja. W przykładzie takiego oznaczenia E. coli wykrywano przy użyciu biosensora, w którym peptyd ze znacznikiem His T4 był przyłączony do żywicy wiążącej się z niklem a następnie wystawiony na działanie hodowli E. coli lub pożywek BHI bez bakterii. Znaczniki peptydowe z lizyną, na przykład T3, mogą być stosowane do przyłączania do powierzchni, takiej jak UitraBindTM (Pali Geiman Laboratory, Ann Arbor, MI). UltraBind jest błoną polieterosulfonową, która jest zmodyfikowana grupami aldehydowymi w celu kowalencyjnego wiązania białek. Białka są poddawane bezpośredniej reakcji z powierzchnią UltraBind. Możliwe jest także przyłączenie białek lub peptydów do powierzchni przy użyciu łańcuchów łączników sieciujących. Na przykład, karboimid, EDC (chlorowodorek (1-etyl-3-(3-dimetylaminopropylo)karbodiimidu) jest powszechnie stosowany do łączenia grup kwasów karboksylowych z aminami. Łączenie peptydu z czynnikiem sieciującym pozwala na wybór łańcucha łącznika w celu wydłużenia peptydu poza powierzchnię błony ciągle wiążącej go kowalencyjnie. Łączenie peptydu przez łącznik sieciujący można optymalizować po to, żeby peptyd był dostępny dla enzymów bakteryjnych. To pozwala na optymalizację czasu reakcji sensora, ponieważ dostępność peptydu jest bezpośrednio związana z tym parametrem.
Chociaż wynalazek został szczegółowo pokazany i opisany w odniesieniu do jego zalecanych postaci, będzie zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, że różne zmiany w formie i szczegółach mogą być w nim dokonane bez odbiegania od zakresu wynalazku objętego przez załączone zastrzeżenia.
PL 215 172 B1
Lista sekwencji <110> £xpr@ssivs Constructs, Inc.
Colpas, Gerard J.
Ellis-Busby, Dianę L.
Sebastian, Shite Sanders, Mitchell C.
<120> Sposób wykrywania Escherichia coli, bionsn.ior do wykrywania En che r i chi a ccii i zestaw dc wykrywania Escherichia coli <130> 3265.1003002 <150> 60/444,523 <151> 2003-01-31 <160> 6 <170 FastSEQ wersja dla Windows 4.0 <210 1 <211> 15 <212> PRT <213> Bi.eznaTta <220>
<223> Sztuczna <400 1
Asp Ser Arg Pro Val Arg Arg Arg Arg Arg Pro Arg Yal Ser Lys 15 10 15 <210 2 <211> 11 <212> PRT <213> Nieznana <220>
<223> Sztuczna <400> 2
Lys Yal Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Asp 15 10 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Nieznana <220>
<223> Sztuczna <400> 3
Lys Lys Ala Ser Glu 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT
PL 215 172 B1 <213> Nieznana <220>
<223> Sztuczna <400 4
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Lys 15 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Nieznana <220 <223> Sztuczna <400 5
Cys His His His Ala Ser Glu 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Nieznana <220>
<223> Sztuczna <400 6
Val Ser Arg Arg Arg Arg Arg Gly Gly Lys 15 10
PL 215 172 B1
Claims (11)
1. Sposób wykrywania obecności lub braku obecności Escherichia coli w próbce, znamienny tym, że obejmuje etapy w których:
a) kontaktuje się próbkę ze znakowanym w wykrywalny sposób substratem dla związanego z błoną enzymu protezowego swoistego dla patogennych bakterii Escherichia coli, w warunkach, które skutkują cięciem tego substratu przez ten enzym; i
b) wykrywa się cięcie lub brak cięcia tego substratu, przy czym cięcie tego substratu wskazuje na obecność patogennych bakterii Escherichia coli w tej próbce i przy czym brak cięcia tego substratu wskazuje na brak obecności Escherichia coli w tej próbce;
przy czym związanym z błoną enzymem proteazowym jest ompT; i przy czym znakowany w wykrywalny sposób substrat obejmuje peptyd wybrany spośród: (dabcylo-K)VSRRRRRGG(D-edans) (NR ID. SEKW.: 2);
KKAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 3 i 4); CHHHAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 5 i 6).
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę wybiera się z grupy składającej się z próbki uzyskanej z rany podmiotu i płynu ustrojowego.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się substrat na podłożu stałym.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się podłoże stałe zawierające materiał, który ma być wolny od zanieczyszczeń drobnoustrojami.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się podłoże stałe wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do przechowywania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu, materiału do pakowania żywności i tamponu.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się pojemnik do przechowywania płynów ustrojowych wybrany z grupy składającej się z torebki do zbierania moczu, torebki do zbierania krwi, torebki do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
7. Biosensor do wykrywania obecności lub braku obecności Escherichia coli w próbce, znamienny tym, że zawiera podłoże stałe i znakowany w wykrywalny sposób substrat dla związanego z błoną enzymu protezowego swoistego dla patogennych bakterii Escherichia coli;
przy czym ten substrat przyłączony jest do tego podłoża stałego; przy czym związanym z błoną enzymem proteazowym jest ompT; i przy czym znakowany w wykrywalny sposób substrat obejmuje peptyd wybrany spośród: (dabcylo-K)VSRRRRRGG(D-edans) (NR ID. SEKW.: 2); KKAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 3 i 4); CHHHAS(E-edans)VSRRRRRGG(K-dabcyl) (NR ID. SEKW.: 5 i 6).
8. Biosensor według zastrz. 7, znamienny tym, że podłoże stałe zawiera materiał, który ma być wolny od zanieczyszczeń drobnoustrojami.
9. Biosensor według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że to podłoże stałe jest wybrane z grupy składającej się z opatrunku rany, pojemnika do trzymania płynów ustrojowych, dysku, scope, sączka, soczewki, gąbki, materiału, papieru, szwu, materiału do pakowania żywności i tamponu.
10. Biosensor według zastrz. 9, znamienny tym, że ten pojemnik do przechowywania płynów ustrojowych jest wybrany z grupy składającej się z torebki do zbierania moczu, torebki do zbierania krwi, torebki do zbierania osocza, probówki, cewnika i studzienki mikropłytki.
11. Zestaw do wykrywania zakażenia, znamienny tym, że zawiera biosensor jak określono w jednym z zastrz. 7 do 10 oraz jeden lub więcej odczynników skutecznych do wykrywania związanego z błoną enzymu protezowego swoistego dla patogennych bakterii Escherichia coli, przy czym związanym z błoną enzymem proteazowym jest ompT.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US44452303P | 2003-01-31 | 2003-01-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL378054A1 PL378054A1 (pl) | 2006-02-20 |
| PL215172B1 true PL215172B1 (pl) | 2013-10-31 |
Family
ID=33131532
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL378054A PL215172B1 (pl) | 2003-01-31 | 2004-01-30 | Sposób wykrywania Escherichia coli, biosensor do wykrywania Escherichia coli i zestaw do wykrywania Escherichia coli |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20060257955A1 (pl) |
| EP (1) | EP1587948A2 (pl) |
| AU (1) | AU2004225575B2 (pl) |
| CA (1) | CA2514938A1 (pl) |
| PL (1) | PL215172B1 (pl) |
| WO (1) | WO2004087942A2 (pl) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005528887A (ja) | 2002-01-31 | 2005-09-29 | エクスプレッシブ コンストラクツ，インコーポレイテッド | 微生物の検出方法 |
| AU2004260926B2 (en) | 2003-01-31 | 2007-08-16 | Systagenix Wound Management Ip Co. B.V. | Cationic anti-microbial peptides and methods of use thereof |
| CA2564426C (en) * | 2003-09-02 | 2013-01-08 | Expressive Constructs, Inc. | A device for the detection of microorganisms using signal amplification |
| WO2005042770A2 (en) | 2003-11-03 | 2005-05-12 | Ethicon, Inc. | Methods, peptides and biosensors useful for detecting a broad spectrum of bacteria |
| ATE432358T1 (de) * | 2003-11-03 | 2009-06-15 | Ethicon Inc | Kolorimetrische substrate, kolorimetrische sensoren und verwendungsverfahren |
| US7909773B2 (en) | 2005-06-03 | 2011-03-22 | Tyco Healthcare Group Lp | Post-operative bacteria test strip spool and method |
| DE602006016978D1 (de) | 2005-11-02 | 2010-10-28 | Bioproduce Sthlm Ab | Endotoxinanalyse |
| WO2009054913A1 (en) * | 2007-10-19 | 2009-04-30 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Rapid detection of volatile organic compounds for identification of bacteria in a sample |
| US9145574B2 (en) * | 2009-04-24 | 2015-09-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for assessing and mapping microbes and microbial biofilms on wounds |
| WO2010126856A1 (en) * | 2009-04-27 | 2010-11-04 | The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. | Rapid detection of volatile organic compounds for identification of mycobacterium tuberculosis in a sample |
| EP2467493A1 (en) * | 2009-08-20 | 2012-06-27 | Frederic Nason | Bioluminescent bacterial detection |
| CN103429610B (zh) | 2011-03-18 | 2017-03-01 | 杜克大学 | 用于抑制炎症的肽 |
| US9303063B2 (en) | 2011-03-18 | 2016-04-05 | Duke University | Peptide compounds for suppressing inflammation |
| CN102707054B (zh) * | 2012-06-18 | 2014-11-05 | 黑龙江八一农垦大学 | 大肠埃希氏菌OmpT抗体间接ELISA检测方法 |
| EP3022313B1 (en) | 2013-07-18 | 2017-03-15 | Nestec S.A. | Escherichia coli as a marker for hypertriglyceridemia |
| WO2018075953A1 (en) * | 2016-10-20 | 2018-04-26 | Isi Life Sciences, Inc. | Detection of urinary tract infections |
| US11339420B2 (en) | 2017-01-01 | 2022-05-24 | The Regents Of The University Of California | Fluorescence-based reporters for mutagenesis detection in E. coli |
| US12359240B2 (en) | 2019-04-25 | 2025-07-15 | Nanyang Technological University | Membrane protease-based methods for detection of bacteria |
Family Cites Families (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2003A (en) * | 1841-03-12 | Improvement in horizontal windivhlls | ||
| FR2405301A1 (fr) * | 1977-10-04 | 1979-05-04 | Api Labor | Substrats et procede permettant l'identification rapide de bacteries du genre streptococcus |
| US4242447A (en) * | 1978-11-29 | 1980-12-30 | Bioresearch | Rapid detection of bacteria |
| EP0122028A1 (en) * | 1983-03-07 | 1984-10-17 | E-Y Laboratories, Inc. | Colorimetric assay for enzymes, diagnostic article therefor and a method for forming such article |
| US4897444A (en) * | 1985-05-31 | 1990-01-30 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Immobilized fluorogenic substrates for enzymes; and processes for their preparation |
| NZ218499A (en) * | 1985-12-10 | 1990-04-26 | Genetic Systems Corp | Monoclonal antibodies against pseudomonas aeruginosa, pharmaceutical compositions and detection methods |
| US5994059A (en) * | 1986-11-24 | 1999-11-30 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and methods for detecting Streptomyces enterococci |
| US5518894A (en) * | 1987-11-05 | 1996-05-21 | Berg; James D. | Rapid coliform detection system |
| US5236827A (en) * | 1988-06-20 | 1993-08-17 | Becton, Dickinson And Company | Device for enhancing fluorescence and kinetics and methods of using the device |
| US5523205A (en) * | 1988-08-02 | 1996-06-04 | Institut Pasteur | DNA probes specific for hemolytic listeria |
| EP0428000A1 (en) * | 1989-11-03 | 1991-05-22 | Abbott Laboratories | Fluorogenic substrates for the detection of proteolytic enzyme activity |
| CA2029172C (en) * | 1989-11-28 | 2002-04-02 | Eric Flam | Dressing including an indicator |
| US5210022A (en) * | 1990-04-20 | 1993-05-11 | Rcr Scientific, Inc. | Method test media and chromogenic compounds for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria |
| FR2671561B1 (fr) * | 1991-01-16 | 1993-03-26 | Bio Merieux | Procede et milieu d'identification de bacteries du genre listeria. |
| EP0576842B1 (de) * | 1992-06-11 | 2002-10-16 | MERCK PATENT GmbH | Verfahren und Mittel zum Nachweis von Listerien |
| EP0704538A4 (en) * | 1993-06-14 | 1999-12-08 | Lin He | BACTERIA IDENTIFICATION METHOD AND APPARATUS |
| FR2708285B1 (fr) * | 1993-07-28 | 1995-10-20 | Rambach Alain | Procédé d'identification de microorganismes avec un milieu supplémenté en hydrate de carbone. |
| US5514551A (en) * | 1994-10-14 | 1996-05-07 | Gen-Probe Incorporated | Compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| DE19517940A1 (de) * | 1995-05-18 | 1996-11-21 | Merck Patent Gmbh | Nachweis von Listerien mittels rekombinanter Bakteriophagen |
| US6387650B1 (en) * | 1995-06-07 | 2002-05-14 | Biocontrol Systems, Inc. | Method and composition for detecting bacterial contamination in food products |
| US6008029A (en) * | 1995-08-25 | 1999-12-28 | Novo Nordisk Biotech Inc. | Purified coprinus laccases and nucleic acids encoding the same |
| US5804395A (en) * | 1995-12-01 | 1998-09-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Fluorescence polarization assays of enzymes and substrates therefore |
| US6048688A (en) * | 1996-11-12 | 2000-04-11 | Kimberly-Clark Corporation | Method for detection of Pseudomonas aeruginosa using polymerase chain reaction |
| US5719031A (en) * | 1996-08-14 | 1998-02-17 | Molecular Probes, Inc. | Dye labeled polymers as reagents for measuring polymer degradation |
| US6068988A (en) * | 1997-02-28 | 2000-05-30 | Biosynth Ag | Detection of microbial metabolites with a 3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphate compound |
| WO1999002546A1 (en) * | 1997-07-08 | 1999-01-21 | Human Genome Sciences, Inc. | 123 human secreted proteins |
| US5882885A (en) * | 1997-07-17 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | Glycogen phosphorylase |
| US6380370B1 (en) * | 1997-08-14 | 2002-04-30 | Genome Therapeutics Corporation | Nucleic acid and amino acid sequences relating to Staphylococcus epidermidis for diagnostics and therapeutics |
| US5976827A (en) * | 1997-12-12 | 1999-11-02 | Akzo Nobel, N.V. | Sensor device for detecting microorganisms and method therefor |
| US6284517B1 (en) * | 1999-05-28 | 2001-09-04 | Lawrence Restaino | Plating media for the presumptive identification of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis |
| ATE337410T1 (de) * | 2000-05-03 | 2006-09-15 | Expressive Constructs Inc | Verfahren zum nachweis von listeria monocytogenes |
| US20030096315A1 (en) * | 2000-05-03 | 2003-05-22 | Sanders Mitchell C. | Device for detecting bacterial contamination and method of use |
| JP2005528887A (ja) * | 2002-01-31 | 2005-09-29 | エクスプレッシブ コンストラクツ，インコーポレイテッド | 微生物の検出方法 |
-
2004
- 2004-01-30 PL PL378054A patent/PL215172B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2004-01-30 AU AU2004225575A patent/AU2004225575B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-01-30 WO PCT/US2004/002594 patent/WO2004087942A2/en not_active Ceased
- 2004-01-30 EP EP04749308A patent/EP1587948A2/en not_active Withdrawn
- 2004-01-30 CA CA002514938A patent/CA2514938A1/en not_active Abandoned
- 2004-01-30 US US10/543,554 patent/US20060257955A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-09-30 US US12/894,212 patent/US8377651B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-01-31 US US13/756,053 patent/US20130316369A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8377651B2 (en) | 2013-02-19 |
| PL378054A1 (pl) | 2006-02-20 |
| EP1587948A2 (en) | 2005-10-26 |
| US20060257955A1 (en) | 2006-11-16 |
| US20110070594A1 (en) | 2011-03-24 |
| AU2004225575A1 (en) | 2004-10-14 |
| WO2004087942A2 (en) | 2004-10-14 |
| AU2004225575B2 (en) | 2008-02-21 |
| CA2514938A1 (en) | 2004-10-14 |
| WO2004087942A3 (en) | 2005-01-27 |
| US20130316369A1 (en) | 2013-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8377651B2 (en) | Method for detecting Escherichia coli | |
| CN1902494B (zh) | 用于检测广谱细菌的方法、肽和生物传感器 | |
| AU2003212897B2 (en) | Method for detecting microorganisms | |
| JP4767863B2 (ja) | 比色基質、比色センサー、および使用方法 | |
| AU2003212897A1 (en) | Method for detecting microorganisms | |
| EP2619316B1 (en) | Ultrasensitive detection of beta hemolytic streptococcus | |
| PL215163B1 (pl) | Sposób wykrywania drobnoustroju w próbce, biosensor do wykrywania drobnoustroju w próbce i zestaw do wykrywania zakazenia rany | |
| AU2007203457A1 (en) | Method for detecting microorganisms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140130 |