CN1902494B - 用于检测广谱细菌的方法、肽和生物传感器 - Google Patents

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Abstract

此处公开了通过使样品与衍生自α1-蛋白酶抑制剂的反应位点环(RSL)结构域的修饰的肽底物接触，检测伤口感染和检测样品中细菌，例如伤口细菌的存在或不存在的方法。在本发明中，我们证明了没有α1-蛋白的这些肽底物可以有效用作肽底物。由细菌产生和/或分泌的酶对该肽底物的修饰或修饰的不存在，可以作为样品中存在或不存在细菌的指标。本发明也描述了检测样品中细菌的存在或不存在的方法。

Description

用于检测广谱细菌的方法、肽和生物传感器
相关申请
本申请要求2004年6月9日提交的美国临时申请No.60/578,811和2003年11月3日提交的美国临时申请No.60/516,692的优先权。在此引入上述申请的完整教导作为参考。
技术领域
本发明涉及用于检测广谱细菌的方法、肽和生物传感器。
伤口感染是美国健康花费的主要原因。所有手术伤口的大约5％被微生物感染，该数字对于进行腹部手术的患者来说明显更高(10-20％)。细菌物种，如葡萄球菌是最常从感染的伤口分离的。这可能是因为人类是环境中的葡萄球菌的天然储存处，任何特定时间都有最高达50％的群体在此集群。集群速度在医院设置中显著更高，在健康护理工作者和患者中都是如此。而且，医院环境中集群的生物容易抗很多形式的抗微生物治疗，这是由于在经常使用抗生素的医院环境中存在的强选择压力。葡萄球菌通常是作为共生体携带的，但是，有了表皮的破口，它们可以导致严重的，甚至威胁生命的感染。
葡萄球菌是手术伤口感染中最常见的致病剂；其它包括，但不限于，酿脓链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形菌、阴沟肠杆菌、无硝不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌。由于任何上述生物导致的手术后感染都是医院的重要关注。预防所述感染的最常见途径是施用预防性抗生素药物。尽管通常是有效的，但该策略具有不希望的培育细菌的抗性株的作用。由于有利于抗性株的生长，不应该鼓励常规使用预防性抗生素。
代替常规的预防，更好的方法是实施良好的伤口控制，即，在手术前、手术过程中和手术后保持手术区没有细菌，并且在愈合过程中仔细监测该部位是否有感染。正常监测方法包括密切观察伤口部位是否愈合缓慢、炎症和脓的体征，以及测量患者的体温以发现是否有发热的体征。不幸的是，很多症状仅仅在感染已经存在后才能发现。此外，患者出院后，他们负责监测自己的健康，对于不熟练的患者来说，感染症状可能是不明显的。
能够检测广谱细菌，特别是在感染早期发生症状前检测广谱细菌的系统或生物传感器对于患者和健康工作者都是有益的。如果患者能够在出院/离开诊所后准确监测伤口的状况，那么可以足够早地开始合适的抗微生物治疗，以预防更严重的感染。
发明内容
已经发现合成的酶底物，即，人α-1蛋白酶抑制剂，可以用于测试系统，以鉴定多种微生物物种，如通常感染伤口的细菌。
人α-1蛋白酶抑制剂(α1-PI)是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员。丝氨酸蛋白酶抑制剂是作为导致蛋白酶抑制的不可逆自杀底物起作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。蛋白酶是在致病细菌中的常见毒力因子，有时用于破坏宿主防御。在丝氨酸蛋白酶抑制剂家族(抑制剂已经在名称丝氨酸蛋白酶抑制剂中固有)中，α-1蛋白酶抑制剂(α1-PI)是主要的和最充分研究的成员之一。α-1参与从激活的中性粒细胞分泌弹性蛋白酶的调节，其又控制宿主结缔组织的降解(Salvesen，GS etal.，″Human plasma proteinase inhibitors″，Ann.Rev.Biochem.，52：655-709(1983)，在此引入作为参考)。这一类独特的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有特征性的暴露的反应位点环(RSL)结构域。重要的是，已经证明α1-PI的RSL容易受到宿主和细菌来源的许多蛋白酶的切割，导致α1-PI的灭活。
可以设计测试系统，以便同时鉴定多种(例如，至少2种、至少5种或至少10种)不同的微生物物种，如通常感染伤口的那些。例如，它可以鉴定某些类型的致病细菌共有，但不存在于非致病细菌中的酶。例如，可以用细菌基因组数据库的基于计算机的信息学鉴定所述酶。通过将酶用作检测系统的基础，可以设计非常敏感的测试，因为甚至非常小量的酶也可以催化显著量底物的转换。
因此，本发明描述了一种通过检测样品中细菌的分子标志的存在或不存在，检测样品中一种或多种微生物，例如细菌的存在或不存在的方法。
“分子标志”是可以用于检测样品，如伤口或体液中微生物(如细菌、真菌或病毒)的存在或不存在的任何分子。具体地，待检测的分子标志包括蛋白，如微生物分泌的蛋白，其在微生物的细胞表面上表达，或在病毒或朊病毒感染的细胞的表面上表达。在一种实施方案中，该酶是细菌蛋白酶。
一方面，本发明描述了检测样品中一种或多种细菌的存在或不存在的方法，包括以下步骤：在导致由细菌产生和/或分泌的酶对底物进行修饰的条件下，使样品与可检测性标记的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂反应位点环(RSL)结构域肽底物接触；并且检测底物的修饰或底物修饰的不存在。底物的修饰表明样品中细菌的存在，底物修饰的不存在表明样品中不存在细菌。
底物可以是合成的。例如，它可以来源于天然或非天然存在的RSL结构域，并且可以与野生型丝氨酸蛋白酶抑制剂的RSL具有相同或等同的活性。它也可以包含丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域的变体、类似物或片段或由丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域的变体、类似物或片段组成。在一种实施方案中，底物包含SEQ ID NO：1、2或3。在一种实施方案中，底物是下文描述的CPI1、CPI2或CPI3。
细菌可以是，例如，伤口特异性细菌，如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形菌、阴沟肠杆菌、无硝不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌。
另一方面，本发明描述了检测受试者中伤口感染的存在或不存在的方法，包括以下步骤：a)在导致由细菌产生和/或分泌的酶对底物进行修饰的条件下，使从受试者中的伤口获得的样品与可检测性标记的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域肽底物接触；和b)检测底物的修饰或底物修饰的不存在。底物的修饰表明受试者中存在伤口感染，底物修饰的不存在表明受试者中不存在感染。
另一方面，本发明描述了检测受试者中伤口感染的存在或不存在的方法，包括以下步骤：a)在导致由细菌产生和/或分泌的酶对底物进行修饰的条件下，使从受试者的伤口与由细菌产生和/或分泌的酶的可检测性标记的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域肽底物接触；和b)检测底物的修饰或底物修饰的不存在。底物的修饰表明受试者中存在伤口感染，底物修饰的不存在表明受试者中不存在感染。
另一方面，本发明描述了用于检测样品中细菌，例如伤口特异性细菌的存在或不存在的生物传感器，包含固体支持物和可检测性标记的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域肽底物，其中所述底物附着于固体支持物。可以用荧光或比色染料标记肽，用于检测细菌蛋白酶对肽的切割。
另一方面，本发明描述了用于检测伤口感染的试剂盒，包含用于检测样品中细菌的存在或不存在的生物传感器和用于检测作为伤口感染的致病剂的细菌的存在的一种或多种试剂。例如，该试剂可以用于检测由细菌分泌的酶。具体地，该试剂可以用于检测生物传感器的底物的修饰。
附图说明
图1A和1B。图1A描述了α-1蛋白酶抑制剂(α1-PI)RSL序列(SEQ ID NO：4)上的切割位点的相对位置。图1B描述了CPI1肽(SEQ ID NO：1)、CPI2肽(SEQ ID NO：2)和α-1蛋白酶抑制剂(人)(SEQ ID NO：3)的序列。
图2A-2D。图2A和2B是含有过夜细菌培养物、测定底物(图2A，CPI1肽；图2B，CPI2肽)和含有150mM NaCl的反应缓冲液(pH7.2)的样品随时间(以秒为单位)的相对荧光图。图2C和2D是含有过夜细菌上清液、测定底物(图2C，CPI1肽；图2D，CPI2肽)和含有150mM NaCl的反应缓冲液(pH7.2)的样品随时间(以秒为单位)的相对荧光图。
图3A-3D。图3A和3B是含有48小时细菌培养物、测定底物(图3A，CPI1肽；图3B，CPI2肽)和反应缓冲液的样品随时间(以秒为单位)的相对荧光图。图3C和3D是含有48小时细菌上清液、测定底物(图3C，CPI1肽；图3D，CPI2肽)和反应缓冲液(pH7.2)的样品随时间(以秒为单位)的相对荧光图。
图4A和4B说明用CPI2肽获得的粪肠球菌(采用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列)的传感器数据。图4A显示在365nm UV光源下与细菌一起温育的传感器的图像。图4B显示获自数字化照片的每个浓度的强度数据。
图5A和5B说明用CPI2肽获得的铜绿假单胞菌(采用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列)的传感器数据。图5A显示在365nmUV光源下与细菌一起温育的传感器的图像。图5B显示获自数字化照片的每个浓度的强度数据。
图6A和6B说明用CPI2肽获得的金黄色葡萄球菌(采用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列)的传感器数据。图6A显示在365nmUV光源下与细菌一起温育的传感器的图像。图6B显示获自数字化照片的每个浓度的强度数据。
图7A和7B说明用CPI2肽获得的酿脓链球菌(采用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列)的传感器数据。图7A显示在365nm UV光源下与细菌一起温育的传感器的图像。图7B显示获自数字化照片的每个浓度的强度数据。
图8A和8B说明用CPI2肽获得的粘质沙雷氏菌(采用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列)的传感器数据。图8A显示在365nmUV光源下与细菌一起温育的传感器的图像。图8B显示获自数字化照片的每个浓度的强度数据。
图9A-9C是说明与不同浓度的细菌相对温育40小时的柱状图。(A＝106CFU；B＝105CFU；C＝104CFU)(Staph＝金黄色葡萄球菌；Serratia＝粘质沙雷氏菌；Strep＝唾液链球菌；PA14＝铜绿假单胞菌；Entero＝粪肠球菌)。
图10A-10D是说明从伤口敷料提取的细菌的相对荧光的图片(肽底物：CPI2)(反应缓冲液：1×PBS)。(A：伤口样品1-8号；伤口样品11-20号；C：伤口样品20-30号；伤口样品31-35号)。
图11显示了从稳定性研究过程中采集的多个样品测量的荧光的图片。
图12显示了从暴露于伤口病原体的多个株后可检测性标记的底物测量的相对荧光的图片。
具体实施方式
作为正常生长过程的一部分，很多微生物分泌许多酶到它们的生长环境中。这些酶具有许多功能，包括，但不限于，营养物质的释放、抗宿主防御的保护、细胞包膜合成(细菌中)和/或维持、以及其它未确定的功能。许多微生物，如细菌，也在细胞表面产生暴露于细胞外环境(并且与其相互作用)的酶。
能够检测产生和/或分泌的这些酶的存在的系统能够等同地表明产生/分泌细菌的存在。或者，能够检测产生和/或分泌的这些酶的不存在的系统能够等同地表明产生/分泌细菌的不存在。所述检测系统可用于检测或诊断感染，例如，伤口感染。
本发明涉及将底物，如合成丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域肽底物用于检测由广谱细菌产生或分泌的酶的存在或不存在.此处用到的“合成”是指非天然存在的肽.合成肽可以衍生自丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员(如α1-PI)的全长或野生型反应位点环(RSL)(例如，是其变体、类似物或片段).在一种实施方案中，根据此处举例说明的方法制备合成肽底物.然后可以用可检测的标记对合成底物进行标记，以便在它们各自的酶特异性与其反应的条件下，它们进行修饰，例如，观察到的可见颜色改变.用于本发明的底物包括合成或天然存在的任何分子，如包含可以与本发明的酶相互作用的RSL序列的切割位点的分子.以前已经报道过α-1蛋白酶抑制剂(α1-P1)的RSL序列上的切割位点的相对位置(Nelson，D.et al.，＂Inactivation ofalphal-proteinase inhibitor as a broad screen for detecting proteolyticactivities in unknown samples，＂Anal.Biochem.，260(2)：230-36(1998))并且示于图1A.底物的例子包括此处描述的底物，以及本领域公知的这些酶的底物.在一种实施方案中，底物包含序列EAAGAMFLEAIPK(SEQ ID NO:1).在另一种实施方案中，底物包含EGAMFLEAIPMSIPK(SEQ ID NO:2).其它实例包括衍生自α1-P1的荧光肽，例如Edans-EAAGAMFLEAIPK-Dabcyl(CPI1)和Edans-EGAMFLEAIPMSIPK-Dabcyl(图1B).
用于本发明的底物也包括比色和/或荧光成分和肽，并且与微生物产生和/或分泌的至少一种蛋白相互作用.在一些方案中，底物的肽部分与微生物的蛋白相互作用.在其它实施方案中，底物的至少一个比色成分部分与微生物的蛋白相互作用.
底物的实例描述于2003年1月31日提交的Mitchell C.Sanders等的PCT申请PCT/US03/03172中，该申请的名称是“检测微生物的方法”，在2003年8月7日公开为WO03/063693；也描述于2004年6月9日提交的Mitchell C.Sanders等的美国申请No.60/578,502，该申请的名称是“比色底物、比色传感器和使用方法”.在此引入这些申请的完整教导作为参考.
可以用合成丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域肽底物检测多种(即，超过1种，例如，至少2、3、4、5、10、15、20、25或更多种)伤口病原体，如细菌.用于本发明的细菌检测方法中的酶优选是伤口特异性酶.如此处使用的，伤口特异性酶是由致病细菌产生和/或分泌，但不由非致病细菌产生和/或分泌的酶.致病细菌的实例包括，但不限于，葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌或腐生葡萄球菌)、链球菌(例如，酿脓链球菌、肺炎链球菌或无乳链球菌)、肠球菌(例如，粪肠球菌或屎链球菌)、棒杆菌物种(如白喉棒杆菌)、芽孢杆菌(例如，炭疽芽孢杆菌)、利斯特氏菌(单核细胞增生利斯特氏菌)、梭菌物种(例如，产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌、艰难梭菌)、奈瑟氏球菌物种(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌)、大肠杆菌、志贺氏菌物种、沙门氏菌物种、耶尔森氏菌物种(例如，鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌或小肠结肠炎耶尔森氏菌)、霍乱弧菌、弯曲杆菌物种(例如，空肠弯曲杆菌或胚胎弯曲杆菌)、幽门螺杆菌、假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌或鼻疽假单胞菌)、流感嗜血杆菌、百日咳博德特氏菌、肺炎支原体、解脲尿支原体、嗜肺军团菌、苍白密螺旋体、问号钩端螺旋体、布氏疏螺旋体、分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌)、麻风分枝杆菌、放线菌物种、诺卡氏菌物种、衣原体(例如，鹦鹉热衣原体、砂眼衣原体或肺炎衣原体)、立克次氏体(例如，立氏立克次氏体、普氏立克次氏体或红恙虫立克次氏体)、布鲁氏菌(例如，流产布鲁氏菌、马耳他布鲁氏菌或猪布鲁氏菌)、奇异变形菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、无硝不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和土拉热弗朗西丝氏菌.优选地，伤口特异性细菌是葡萄球菌、链球菌、肠球菌、芽孢杆菌、梭菌物种、大肠杆菌、耶尔森氏菌、假单胞菌、奇异变形菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、无硝不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌或麻风分枝杆菌.例如，伤口特异性酶可以由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、奇异变形菌、粘质沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、无硝不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和/或大肠杆菌产生和/或分泌.
此处用到的“修饰”是指底物的改变，例如通过切割或其它直接或间接可检测的方法.本发明的酶可以通过切割修饰底物，例如，蛋白或多肽，并且可以检测所述修饰，以确定样品中病原体的存在或不存在.一种通过检测由酶进行的底物修饰的方法是用两种不同的染料标记底物，其中当分子，例如，染料或比色物质紧密相邻时，其中一种染料用于淬灭向另一种染料的荧光共振能量转移(FRET)，并且可以通过荧光测量.
FRET是一种距离依赖性激发状态相互作用的过程，其中一种荧光分子的发射与另一种荧光分子的激发相偶联.用于共振能量转移的典型受体和供体对由4-[[-(二甲基氨基)苯基]偶氮]苯甲酸(DABCYL)和5-[(2-氨基乙基氨基]萘磺酸(EDANS)组成.EDANS由336nm光的照射激发，并且发射波长为490nm的光子.如果DABCYL部分位于EDANS的20埃内，该光子将被有效吸收.DABCYL和EDANS将连接于肽底物的相对末端.如果底物是完整的，FRET将是非常有效的.如果肽被酶切割，两种染料将不再紧密相邻，并且FRET将是无效的。切割反应之后可以观察DABCYL荧光的减弱或EDANS荧光的增强(失去淬灭).
如果要修饰的底物是蛋白、肽或多肽，可以用标准重组蛋白技术产生底物(例如，参见Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，(1998)，在此引入其完整教导作为参考).此外，也可以用重组技术制备本发明的酶.通过充分供应酶或它们的底物，可以确定修饰的精确位点.
用监测酶和底物之间的相互作用的可检测标记对底物进行标记，并且检测任何底物修饰，例如，由所述相互作用导致的底物或标记的切割.可检测标记的实例包括可以掺入底物的多种染料，例如，此处描述的那些，自旋标记、抗原标志、表位标志、半抗原、酶标记、辅基、荧光材料、pH敏感材料、化学发光材料、生色染料、比色成分、生物发光材料和放射性材料.合适的酶标记的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酶；合适的辅基的实例包括，链亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯和藻红素；化学发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母发光蛋白，合适的放射性材料的实例包括125I、131I、35S和3H.可检测标记的其它实例包括Bodipy、Pyrene、Texas Red、IAEDANS、丹酰氮丙啶、IATR和荧光素.这些标记的琥珀酰酯、异硫氰酸酯和碘乙酰胺也是可商购的.在一种实施方案中，用荧光探针和淬灭染料分子标记底物.
可以用监测蛋白和底物之间的相互作用的至少一种比色成分对底物进行标记，并且检测任何底物修饰，例如，由所述相互作用导致的肽或标记的切割.以此方式，比色成分作为标记或标志，以表明修饰的存在或不存在，以便发现样品中微生物的存在或不存在。在一些实施方案中，比色成分与肽共价连接.
在一些实施方案中，该蛋白切割包括(至少一种)比色成分的底物的至少一部分.例如，如果底物包括蓝色比色成分和黄色比色成分，未切割的底物可以表现为绿色.在蛋白切割包括黄色比色成分的底物的一部分后，底物可以表现为蓝色.
在一些实施方案中，底物的修饰包括水解肽中的至少一个肽键，并且导致肽的至少一部分从底物切除.切除的部分包括至少一种比色成分，导致可见的颜色改变.在其它实施方案中，底物的修饰包括从肽切割至少一种比色化合物，导致可见的颜色改变.
比色成分作为标记或标志.在一种实施方案中，至少一种比色成分是与其它比色成分不同的颜色.比色成分的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和乙酰胆碱酶；合适的辅基的实例包括，链亲和素/生物素和亲和素/生物素.在本发明的一种实施方案中，底物包括具有至少两种比色成分的肽，其中每种比色成分包含不同的颜色，并且其中底物附着于固体支持物.底物的修饰可以包括切割底物的至少一部分，其中该部分包括比色成分之一，并且该切割导致可见的颜色改变.
检测是否存在细菌，或诊断有伤口感染的样品可以是，例如，伤口(如受试者的伤口表面)、体液，如血液、尿或伤口液(例如，在伤口部位产生的脓).样品或固体支持物也可以是细菌可以包含在其上/其中的任何物品，例如，导管、袋(如尿收集袋、血液收集袋或血浆收集袋)、盘、聚合物、膜、树脂、玻璃、海绵、收集样品的物品、容纳样品的物品、观察器、过滤器、透镜、泡沫、织物、纸、缝线、探测尺、抹布、试管、微量滴定板的孔、隐形眼镜洗液或来自屋子或建筑物，例如健康设施的检查室或手术室、浴室、厨房或加工或生产设施的区域的抹布.
本发明也描述用于检测(一种或多种，例如，至少2种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少50种、至少75种、或至少100种)伤口病原体，如此处描述的细菌，并且用于给用户指出感染的存在的生物传感器.该生物传感器可以用于健康设施或家用，以检测受感染的伤口.它可以包含(一种或多种)广谱底物，所述底物与邻近伤口或正在监测是否有细菌污染的其它体液的固体支持物偶联.优选地，该底物是与标记共价结合的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域肽底物，因此具有检测信号，在底物-标记键蛋白水解时该检测信号表明细菌的存在.
生物传感器的制备是通过首先用一种或多种，并且优选大量可检测的标记，例如，生色或荧光离去基团标记本发明的底物.最优选地，标记基团提供了仅仅在信号经蛋白水解而脱离底物时才激活的潜伏信号.生色离去基团包括，例如，对-硝基analide基团.如果底物与由细菌分泌到伤口或其它体液或存在于细菌细胞表面上的酶接触，则酶修饰底物，其修饰方式导致所述修饰的检测，所述修饰例如是吸光度的改变，所述改变可以作为颜色改变(例如，固体支持物，如伤口敷料上的颜色改变)而肉眼检测，或采用本领域的标准分光光度技术检测.
生物传感器是固体支持物，例如，伤口敷料(如绷带或纱布)、要求无菌或无微生物污染(污染物)的任何材料，例如，聚合物、膜、树脂、玻璃、海绵、盘、观察器、过滤器、透镜、泡沫、织物、纸、蘸棒或缝线，或任何容纳或收集样品的物品(如，容纳体液的容器，如，尿收集袋、血液或血浆收集袋、试管、导管、抹布或微量滴定板的孔).
典型地，如果固体支持物与伤口或样品直接接触，则固体支持物由适于消毒的材料制成.在本发明的一种实施方案中，生物传感器可以直接与伤口接触.在某些情况下，用无菌覆盖物或层防止在所述直接接触后的伤口或体液污染.如果使用所述无菌覆盖物，它们将具有使其适于消毒的特性，但是不干扰酶/底物相互作用.优选地，生物传感器与伤口接触的部分也是非粘附性的，以便容易将生物传感器从样品表面取出.例如，如果生物传感器包含伤口敷料，该敷料与伤口接触足够酶底物反应的时间，然后从伤口取出敷料，以便不对伤口或周围组织导致进一步损伤.
用可检测标记，例如，生色染料进行合适标记，并且附着或掺入传感器装置的广谱底物(如，适于检测一种以上病原体或细菌的底物)可以用作分泌上述酶的多种致病细菌的存在或不存在的指标.
本发明的生物传感器也可以任选包含致病细菌产生和/或分泌的酶的一种或多种额外底物(例如，至少2种、至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少50种、至少75种或至少100种底物).当使用一种以上底物时，可以对每一种进行标记，以便将其与另一种底物进行区分(例如，采用不同的可检测标记)，并且/或者，每一种底物可以位于固体支持物上的特定区域.
具有疏水离去基团的底物可以与疏水表面非共价结合.或者，亲水或疏水底物可以通过二硫化物或伯胺、羧基或羟基与表面偶联.将底物偶联于固体支持物的方法是本领域公知的.例如，采用非必须的反应末端，如不影响与伤口病原体反应的游离胺、羧酸或SH基团，可以将荧光和生色底物与固体底物偶联.例如，可以采用10倍摩尔过量的N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)或N-环己基-N’-2-(4-甲基-吗啉)乙基碳二亚胺-对-甲苯磺酸盐(CMC)在4℃下，在调整到pH4.5的蒸馏水中使游离胺与底物上的羧基偶联2小时，以便刺激缩合反应，从而形成肽键.可以用DTT或TCEP还原SH基团，然后通过N-e-马来酰亚胺基己酸(EMCA)与表面上的游离氨基偶联(Griffith et al.，Febs Lett.，134：261-263(1981)，在此引入作为参考).
本发明的多肽也可以包含广谱肽底物，如此处描述的丝氨酸蛋白酶抑制剂RSL结构域肽底物的片段和变体，或由所述片段和变体组成.变体包括由与微生物中的这些肽底物，如α1RSL结构域相同的基因座编码的显著同源的多肽，即等位基因变体，还包括其它变体.变体也包括来源于生物中的其它基因座，但与此处描述的肽底物具有显著同源性的多肽.变体也包括与这些肽底物具有显著同源性或同一性，但来源于另一生物的多肽，即，直向同源物.变体也包括与这些肽底物具有显著同源性或同一性，但通过合成产生的多肽.体也包括与这些肽底物具有显著同源性或同一性，但通过重组方法产生的多肽.
可以通过将序列进行最优比较目的的比对，确定两个氨基酸序列的同一性百分比(例如，可以将空位引入第一个序列的序列中).然后比较相应位置的氨基酸，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置数的函数(即％同一性＝相同位置数/位置总数×100).在某些实施方案中，为比较目的而进行比对的氨基酸序列的长度是肽底物序列，例如，α1RSL结构域序列长度的至少30％，优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％、80％、90％或100％.可以通过公知方法，例如，采用数学算法完成这两个序列的实际比较.所述数学算法的优选的非限定性实例描述于Karlin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877(1993)，在此引入作为参考。所述算法整合到BALST程序(2.2版)中，如Schaffer等的描述(Nucleic AcidsRes.，29：2994-3005(2001)，在此引入作为参考).当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的缺省参数.在一种实施方案中，检索的数据库是非冗余(NR)数据库，并且序列比较的参数可以设定为：无过滤；预期值为10；字长为3；矩阵是BLOSUM62；空位耗费的存在值为11，延伸值为1.
在另一种实施方案中，可以用GCG软件包(Accelrys Inc.，SanDiego，California)中的GAP程序确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，该程序使用Blossom63矩阵或PAM250矩阵，空位权重是12、10、8、6或4，长度权重为2、3或4.在另一实施方案中，可以用GCG软件包(Accelrys Inc.)中的GAP程序确定两个核酸序列之间的同一性百分比，该程序使用的空位权重是50，长度权重是3.
此处描述了其它优选的序列比较方法.
本发明也包括这样的多肽底物，其具有较低的同一性程度，但具有足够的相似性，以便行使一种或多种与肽底物行使的功能相同的功能，如作为细菌如伤口特异性细菌产生或分泌的酶的底物.相似性是通过保守氨基酸取代确定的.所述取代是这样的取代，即，多肽中的特定氨基酸被具有相似特征的另一种氨基酸取代.保守取代很可能是表型沉默的.一般认为的保守取代是脂族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的彼此替代；羟基残基Sre和Thr之间的彼此交换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn和Gln之间的取代；碱性残基Lys和Arg之间的交换；和芳族残基Phe和Tyr之间的替代.关于哪些氨基酸改变可能是表型沉默的指导可以参见Bowie et al.，Science，247：1306-1310(1990)，在此引入作为参考.
功能性变体也可以包含与α1RSL结构域中的氨基酸相似的氨基酸的取代，该取代不导致功能改变或导致不显著的改变.或者，所述取代可以一定程度上正或负影响功能.非功能性变体通常含有一个或多个非保守氨基酸取代、缺失、插入、反向或截短，或含有关键残基或关键区域中的取代、插入、反向或缺失，所述关键区域包括感染特异性蛋白酶的蛋白水解切割位点.
可以通过本领域公知的方法，例如，定点诱变或丙氨酸扫描诱变，鉴定本发明的肽底物中对酶，如蛋白酶的切割必须的氨基酸(Cunningham et al，Science，244：1081-1085(1989)，在此引入作为参考).后一种程序在分子的每个残基导入了单个丙氨酸突变(每个分子一个突变).
本发明也包括肽底物或其功能性变体的多肽片段，包括与此处描述的合成或天然存在的肽底物，如α1RSL结构域序列具有60％、70％、80％、90％或95％序列同源性的生物活性片段.本发明也包括此处描述的多肽的变体的片段.生物活性片段包括保留了作为由细菌，例如伤口特异性细菌产生或分泌的酶的底物的能力的片段.
片段可以是离散的(不与其它氨基酸或多肽融合)，或者可以在更大的多肽内.此外，一些片段可以包含在单个更大的多肽内.在一种实施方案中，设计用于在宿主中表达的片段可以具有与多肽片段的氨基末端融合的异源前多肽和多肽原区域以及与片段的羧基末端融合的额外的区域.
本发明的生物传感器和多肽可以用于任何需要检测细菌，特别是致病细菌的存在与否的场合.例如，可以用此处描述的生物传感器检测在健康设施，特别是手术室中的工作表面收集的细菌.可以由细菌分泌或存在于细菌表面上的酶修饰的底物，或一种以上的底物被标记并且共价结合于收集底物，如抹布尖上的棉纤维.当使用一种以上底物时，可以对每一种都进行标记，以便将其与另一种底物区分(例如，用不同的可检测标记)，并且/或者，每一种底物都可以位于固体支持物上的特定区域.抹布尖被用于擦拭怀疑被细菌污染的表面.将抹布尖置于培养基中，并且温育，温育条件是这样的，即，如果存在结合的、标记的底物的特异性酶，则该条件允许标记的底物被修饰.
本发明也描述了用于检测此处描述的伤口特异性细菌的试剂盒.该试剂盒可以包含固体支持物，例如，具有多个孔的固体支持物(例如，微量滴定板)，该支持物上连接、偶联或附着了可检测性标记的底物(如丝氨酸蛋白酶反应位点环(RSL)结构域肽底物).提供了用于提供一种或多种缓冲液的装置.也可以提供阴性对照和/或阳性对照.本领域技术人员可以很容易推断合适的对照.采用缓冲液制备怀疑被病原体(如此处描述的细菌)污染的样品.将样品、阴性对照和阳性对照的等分样品置于其自身的孔中，使其反应.确定观察到底物修饰，例如颜色改变的孔为含有微生物病原体.所述试剂盒对于检测受试者中的伤口感染特别有用.
本发明也包括这样的试剂盒，其中包含生物传感器，如包装的无菌伤口敷料，并且包含进行所述检测测定必须的任何额外试剂.
实施例
现在将通过以下实施例详细举例说明本发明，这些实施例不打算以任何方式进行限制.
实施例1：用于检测样品中细菌不存在或存在的细菌的制备
采用本领域的标准方法，37℃下在剧烈振荡的条件下(约200rpm)，在Brain Heart Infusion(BHI)培养液中使每一种以下细菌物种的培养物生长过夜：金黄色葡萄球菌；酿脓链球菌；粘质沙雷氏菌；大肠杆菌；铜绿假单胞菌(PA14)；铜绿假单胞菌(GSU3)；和粪肠球菌.过夜生长后，获得每种培养物的1ml样品，通过12,000x g离心5分钟，从培养物上清液除去细胞.将剩余的培养物上清液储存在冰上直到需要(小于1小时).按照下文的描述测定细菌中酶的存在或不存在.
或者，不从培养物上清液分离细菌细胞，而是在含有仍然处于培养液中的悬浮液中的细胞的样品上进行测定.生长48小时(两天)后，重复该程序.
实施例2：从伤口敷料提取细菌，用于确定伤口样品中细菌的不存在或存在
从St.Vincent Wound Clinc，Erie，PA的医学主任和Penn NorthCenters for Advanced Wound Care的创始人Thomas Serena博士处获得了35块新鲜的冷冻伤口敷料.敷料被分类为本研究的医学废品，没有获得伤口或患者的信息.敷料来自于随机伤口并且在同一天收集和运输.在干冰上运送敷料，到达后立即在-80℃下储存.
提取
在分析的当天，从冰箱取出敷料，解冻到足以铺开的程度，以便切割.所有的工作都是在无菌条件下进行，并且依照血携带的病原体指南.代表了宽范围的敷料大小和渗出物.大多数敷料是纱布型的，一些包括了吸收中心(即，看起来没有包括水胶体或完全伤口控制敷料).从每个敷料切下2×3.5cm的长方形(面积是7cm2).在大敷料的情况下选择敷料的最有代表性的部分.
获得了宽范围的敷料颜色和渗出物.将敷料放置于装有3ml无菌PBS的15ml无菌锥形试管中，在4℃下进行提取过夜.在浸渍敷料后立即有一些样品使PBS成为白色絮状(样品2、3、9、14、22、26和27).我们怀疑这些敷料样品含有来自于伤口处理的银.提取敷料后，记录每种溶液的颜色.收集每个提取物的3份0.5ml等分样品，用于储存和检测.
切割反应是在100μl总体积中，在37℃下用10μl伤口样品提取物、3μl CPI2肽底物(5mg/mL，溶于水/DMSO中)进行的.在荧光板读数器上接着进行反应，该读数器采用335nm的激发波长和485nm的发射波长(图10A-10D).
实施例3：采用αl-PI RSL序列的变体进行的广谱测定
设计两种肽底物，CPI1和CPI2，以包括RSL序列的所有切割位点，如图1A和1B所示.用荧光探针edans(5-((2-氨基乙基)氨基)萘-1-磺酸)和淬灭染料分子dabcyl((4-(4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)标记肽底物.
(CPI1)Edans-EAAGAMFLEAIPK-Dabcyl(SEQ ID NO:1)
(CPI2)Edans-EGAMFLEAIPMSIPK-Dabcyl(SEQ ID NO:2)
使细菌在培养箱中在5mL BHI(Brain Heart Infusion)培养基中生长过夜.将得到的每种培养物分成两个样品.一个用作培养物，另一个通过离心旋转，并且收集上清液.测定是在添加了150mM NaCl(PBS)的20mM tris缓冲液(pH7.2)中进行的.切割反应是在100μL的总体积中，在37℃下用7μL培养物或上清液和3μL肽底物(5mg/mL，溶于水/DMSO中)进行的.在荧光板读数器上接着进行反应，该读数器采用335nm的激发波长和485nm的发射波长.
第一组实验是通过将细菌培养物(培养基和细胞)直接添加到测定溶液中而进行的.第一个测定使用过夜(1天)生长细胞和上清液和作为底物的肽CPI1和CPI2.如图2A和2B所示，用肽底物观察到了很多细菌的蛋白酶活性.
为了确定哪些细菌分泌了蛋白酶，采用获自过夜生长细菌培养物的细菌上清液，用肽CPI1和CPI2进行相似实验.如图2C和2D所示，结果与细菌培养物的结果相似，表面分泌了蛋白酶.
在第二组实验中，用48小时(两天)生长细胞和上清液进行了相似测定.该测定用CPI1和CPI2作为底物.按照前面对第一组实验的描述进行本测定，区别是此处采用5μL细菌上清液.结果示于图3A-D.
实施例4：生物传感器表面的显色
可以通过使用一些不同类型的相互作用使分子与表面附着.典型地，可以用疏水、静电或共价相互作用使蛋白与表面附着.可以购买到许多具有多种表面特性的膜和树脂.可以对表面进行化学修饰，以提供需要的表面特性.
可以购买到用于蛋白和肽结合的转移膜.它们由带正电和带负电的聚合物，如离子交换膜盘滤器和树脂组成.硝酸纤维素膜提供了疏水和静电相互作用.玻璃纤维膜提供了能够容易被化学修饰以添加官能团的疏水表面.也存在提供与蛋白和肽共价结合的反应性官能团的修饰的聚合物膜.
也可以利用膜或树脂上的多种官能团和交联剂来共价连接蛋白。交联剂含有两个反应基团，从而提供将两个靶官能团共价连接的途径.靶定蛋白的最常见的官能团是胺、硫醇、羧酸和醇基团，它们用于形成分子内交联.交联剂可以是同双官能的或异双官能的，各种长度的交联剂的选择是可以商购的.
金属螯合(亲和结合)相互作用可以给生物分子提供更强的键.构建到肽底物内的组氨酸标志可以用于与镍结合树脂连接.基于连续的组氨酸残基与树脂(Sepharose)结合的能力纯化带有组氨酸标志的肽，所述树脂含有由共价连接的氨三乙酸(NTA)固定化的镍离子.基于添加了组氨酸标志的CPI2制备包含CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH(SEQ ID NO：5)的CPI3肽。用比色染料在半胱氨酸基团标记CPI3.在本实施例中，使用了一种remazol染料，即，Reactive Black5(RB5)。该染料产生了暗蓝色，在595nm处有峰值吸收.
Figure S04839725620060712D000171
CPI3-Reactive Black5标记的肽通过组氨酸标志与NTA树脂结合.NTA树脂产生没有非特异性结合的高水平肽结合.
37℃下用铜绿假单胞菌(PA14)切割NTA树脂上的标记的CPI3过夜.用放置在装有树脂和细菌的试管中的带正电的膜(Pall SB6407)收集切割的肽.对照样品由NTA树脂上的CPI3和磷酸缓冲液(PBS)中的带正电的膜组成.与示出的对照相比，在具有细菌的样品中带正电的膜上获得了强的颜色改变.膜上的颜色改变表明，切割了CPI3，带有染料的被切割的部分弥散到膜上，产生蓝色.
赖氨酸肽标志可以用于连接于表面，如UltraBindTM(Pall GelmanLaboratory，Ann Arbor，MI).UltraBind是用醛基团修饰的聚醚砜膜，所述醛基团用于与蛋白共价结合.蛋白直接与UltraBind表面反应.也可以用交联链将蛋白或肽连接于表面.例如，通常用碳二亚胺，即EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，盐酸盐)将羧酸基团连接于胺.用交联剂连接肽，使得能够选择接头链，以便将肽延伸离开膜表面，而仍然与其共价结合.通过交联剂进行的肽连接可以最优化，使得细菌酶能够获得肽.这使得传感器的反应时间最优化，因为肽的可获得性与该参数直接相关.
实施例5：表面传感器敏感性
确定CPI2是广谱传感器的良好候选物.
表面传感器的构建如下：
使用的膜：Pall SB6407
使用的肽：CPI2
使用的量：8μg
空气干燥传感器，在-20℃下储存过夜.将传感器加样到无菌96孔板，以进行敏感性研究.
37℃下在5ml BHI(Brain Heart Infusion)培养基中使粪链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌和粘质沙雷氏菌在培养箱中生长过夜，并且稀释到每个实验特定的浓度.用PBS(pH7.4)稀释每株细菌，以便在550nm处获得大约0.52的光密度(OD).设定该OD代表大约108个细胞/ml细菌.用PBS稀释108个细胞/ml每种细菌的储液，以获得107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列.敏感性测试是将107、106、105和104个细胞/ml(细胞)的浓度系列的每一个的100μL置于一行传感器上.每个敏感性测试由暴露于100μL PBS的传感器组成.
在4、24和48小时采集每个板的数据.数据由在相对统一的条件下(光、暴露时间等)用Kodak DC290数码相机采集的每个板的颜色(荧光)图像组成.用国家卫生部(NIH)开发的一种公共的结构域图像加工和分析程序NIH ImageJ分析图像.分析由测量每个孔内的强度值组成(即，选择中所有象素的强度值的和除以象素数).象素的值是0-1。ImageJ将0显示为白色，值为1的象素为黑色.所有传感器敏感性数据对时间作图是从0-1的指数进位，其趋势准确反映了图像中所见.
用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列测试的粪链球菌传感器的结果示于图4A和4B.
用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列测试的铜绿假单胞菌传感器的结果示于图5A和5B.
用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列测试的金黄色葡萄球菌传感器的结果示于图6A和6B.
用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列测试的酿脓链球菌传感器的结果示于图7A和7B.
用107、106、105和104个细胞/ml的浓度系列测试的粘质沙雷氏菌传感器的结果示于图8A和8B.
CPI2肽底物由肠球菌、假单胞菌、葡萄球菌、链球菌和沙雷氏菌的蛋白酶有效切割.当与大肠杆菌细胞或上清液一起温育时，CPI2肽底物没有被切割.在未感染的伤口液体存在下，CPI2肽没有被切割.在细菌的最高浓度，很多上述荧光测定表现出淬灭，这是通过一些107和106样品的荧光水平下降而证实的.用膜上更少的底物重复该测定，以减少荧光淬灭.
在传感器研究结束时(40小时)比较每个传感器的反应性，以确定从每个传感器获得的相对信号.结果示于图9A-9C.CPI2肽在105CFU可以有效检测大多数病原体.所有五种细菌(大肠杆菌除外)在105个细菌/ml的浓度产生强信号.但是，在104个细菌/ml的浓度，没有观察到沙雷氏菌产生可以测量到显著高于背景的信号.
可以采用合适的对照更透彻地分析CPI2肽与无害细菌以及与伤口液体的交叉反应性.也可以确定CPI2肽底物对伤口敷料和在体内猪研究中的适用性.
尽管具体示出了本发明，并且参考其优选实施方案进行了描述，本领域技术人员应该理解，可以对其进行多种形式和细节的改变而不背离所附权利要求所包含的本发明的范围。
实施例6：压过(PUSH-THROUGH)测定
CPI3肽是用于检测多种病原体的广谱肽CPI2的带有5-组氨酸标志的形式.在N末端添加了半胱氨酸以便用以下染料进行标记：
CPI3[Ac]-CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH-[OH].
用四甲基罗丹明碘乙酰胺(TMRIA)染料(可购自Molecular Probes，Eugene，Oregon)在半胱氨酸基团上标记CPI3肽.在含有过量TMRIA染料的PBS pH7.4中进行标记反应.计算出染料与肽的比例为大约1.0.
大约1mg TMRIA染料标记的CPI3通过肽上的5-组氨酸标志与1ml镍-氨三乙酸(Ni-NTA)琼脂珠(获自Qiagen，Valencia，California)结合.基本所有的CPI3都与Ni-NTA珠结合，这是由溶液失去颜色而证明的.
将50μl珠体积的CPI3-TMRIA置于试管中，加入200μl1×104或1×105cfu/ml粪肠球菌，在室温下温育5分钟.细菌蛋白酶切割CPI3，使得染料-肽片段从Ni-NTA珠释放.通过用微量离心机短暂离心，从溶液分离珠.从试管取出相当于获得105、106、107cfu等同物的体积和细菌浓度(如100μl的1×105cfu/μl)并且置于1ml注射器尖端.将未添加细菌的磷酸缓冲液用作对照.然后将注射器置于背后衬有滤纸的聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上的大小匹配的O-环的顶端，推动注射器的活塞以强迫液体通过膜.染料-肽片段保留在PVDF膜表面，仅仅是未连接染料的液体通过滤纸.5分钟后，暴露于107cfu/mL液体的PVDF膜表现出最亮的颜色反应，而暴露于106cfu/mL液体的PVDF膜表现出低于暴露于107cfu/mL液体的膜的颜色反应.5分钟后，暴露于105cfu/mL液体的PVDF膜表现出低于暴露于106cfu/mL液体的膜的颜色反应，而暴露于0cfu/mL液体的膜没有表现出可分辨的颜色反应.
实施例7：可检测性标记的底物的稳定性
为了评估可检测性标记的底物的长期稳定性或活力，用HRP可检测性标记CPI2底物，并且附着于AffiGel珠.将珠子在40℃总共老化35天.在35天老化过程中的多个间隔取出珠子样品，暴露于含有106CFU/ml铜绿假单胞菌的溶液或对照缓冲液PBS.暴露于细菌的珠子产生了暗蓝色信号，而暴露于对照的珠子则没有产生.图11说明了测量的在稳定性研究中采集的多个样品的颜色图.数据表明珠子非常稳定，不具有任何随时间破坏可检测信号的问题，表明珠子非常耐用.
实施例8：株间可操作性
将CIP2荧光共振能力转移(FRET)肽暴露于粪链球菌的5种不同的临床株(获自科罗拉多大学).肽与所有5个菌株强反应.图12举出了暴露于各个菌株后测量的相对荧光的图像.数据表明，可检测性标记的肽将检测伤口病原体的不同菌株的存在.
实施例9：与HRP缀合的CPI2肽的反应性
CPI2肽与辣根过氧化物酶(HRP)缀合，然后与多种珠(如affigel和琼脂糖珠)偶联，用于液相和固相测定.将一些珠子暴露于含有106CFU/ml铜绿假单胞菌的溶液.在ABTS和过氧化氢存在下形成了暗蓝色，表明细菌的存在.可检测的颜色信号在少于4分钟内就开始工作，表明可检测性标记的珠子可以用作用于检测有害病原体的精确测试的快速广谱点.
实施例10：临床抹布样品测试
CPI2肽与辣根过氧化物酶(HRP)缀合，然后与多种珠(如affigel和琼脂糖珠)偶联，用于液相和固相测定.从马塞诸塞大学医学院获得已经暴露于患者伤口的抹布样品.用以下方案测试抹布样品中细菌的存在：
1)用PBS对HRP-珠进行1：10稀释，以形成珠浆.将10微升浆加入过滤板的每个孔.
2)将10微升每个冷冻的伤口样品加入80微升PBS中.然后将得到的溶液加入过滤板中的孔.
3)将板温育4分钟，然后将滤板旋转到含有US生物稳定液底物(1.46mM ABTS和H2O2)的另一块板中.
4)显色1分钟后，在405nm用微量滴定板读数器进行读数.
在ABTS和过氧化氢存在下，含有伤口病原体的样品变成暗蓝色.

Claims (22)

1.检测细菌存在或不存在的方法，包括以下步骤：
a)在导致由细菌产生的酶对底物进行修饰的条件下，使样品与可检测性标记的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂反应位点环结构域肽底物接触；和
b)检测底物的修饰或底物修饰的不存在，底物的修饰表明样品中存在细菌，底物修饰的不存在表明样品中不存在细菌。
2.权利要求1的方法，其中所述细菌是伤口特异性细菌，选自金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形菌、阴沟肠杆菌、无硝不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌。
3.权利要求1或2的方法，其中所述酶是蛋白酶。
4.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述底物是用荧光探针和淬灭染料分子标记的。
5.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述底物是用选自下组的标记进行标记的：自旋标记、抗原标志、表位标志、半抗原、酶标记、辅基、荧光材料、pH敏感材料、化学发光材料、比色成分、生物发光材料和放射性材料。
6.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述底物包括选自下组的至少一种肽：
EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、
KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE和
CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH。
7.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述样品选自受试者的伤口表面和体液。
8.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述底物是在固体支持物上。
9.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述固体支持物选自伤口敷料、容纳体液的容器、盘、观察器、过滤器、透镜、泡沫、织物、纸、缝线、蘸棒、抹布、尿收集袋、血液收集袋、血浆收集袋、试管、导管、抹布和微量滴定板的孔。
10.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述固体支持物包含需要无微生物污染物的材料。
11.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述支持物包含至少两种不相似的比色成分，并且底物附着于固体支持物，其中底物的修饰包括切割底物的至少一部分，该部分包含比色成分之一，该切割导致可见的颜色改变。
12.权利要求1-3的任意一项的方法，其中所述比色成分与肽共价连接。
13.用于检测样品中细菌的存在或不存在的生物传感器，该生物传感器包含：
a)固体支持物，和
b)可检测性标记的合成丝氨酸蛋白酶抑制剂反应位点环(RSL)结构域肽底物，所述底物附着于所述固体支持物。
14.权利要求13的生物传感器，其中所述底物是由选自下组的伤口特异性细菌产生的蛋白的特异性底物：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、酿脓链球菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形菌、阴沟肠杆菌、元硝不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌。
15.权利要求14的生物传感器，其中所述蛋白是蛋白酶。
16.权利要求13-15的任意一项的生物传感器，其中所述底物是用荧光探针和淬灭染料分子标记的。
17.权利要求13-15的任意一项的生物传感器，其中所述底物是用选自下组的标记进行标记的：自旋标记、抗原标志、表位标志、半抗原、酶标记、辅基、荧光材料、pH敏感材料、化学发光材料、比色成分、生物发光材料和放射性材料。
18.权利要求13-15的任意一项的生物传感器，其中所述底物包括选自下组的至少一种肽：
EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、
KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE和
CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH。
19.权利要求13-15的任意一项的生物传感器，其中所述固体支持物选自伤口敷料、容纳体液的容器、盘、观察器、过滤器、透镜、泡沫、织物、纸、缝线、蘸棒、抹布、尿收集袋、血液收集袋、血浆收集袋、试管、导管、抹布和微量滴定板的孔。
20.权利要求13-15的任意一项的生物传感器，其中所述固体支持物包含需要无微生物污染物的材料。
21.权利要求13-15的任意一项的生物传感器，其中所述支持物包含至少两种与肽共价连接的不相似的比色成分。
22.一种分离的肽，包含可检测标记和选自下组的氨基酸序列：
EAAGAMFLEAIPK、EGAMFLEAIPMSIPK、
KGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVK、GAMFLEAIPMSIPPE和
CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH。
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