ES2271078T3 - Metodo para detectar listeria monocytogenes. - Google Patents
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Abstract
Un método para detectar la presencia o ausen- cia de Listeria monocytogenes en una muestra a ensayar, método que comprende las etapas de: a) poner en contacto una muestra a ensayar con un sustrato peptídico específico para una metaloproteasa que es exclusiva de Listeria monocytogenes; y b) detectar la escisión del sustrato peptídico o la ausencia de escisión del sustrato peptídico, en el que la escisión del sustrato peptídico es indicativa de la presencia de Listeria monocytogenes en la muestra, y la ausencia de escisión del sustrato es indica- tiva de la ausencia de Listeria monocytogenes en la muestra a ensayar.
Description
Método para detectar Listeria
monocytogenes.
La presente invención se refiere a la detección
de microorganismos procariotas. En particular, la presente
invención se refiere a un método y un dispositivo para detectar la
presencia o ausencia de un microorganismo o patógeno procariota que
contamina alimentos y áreas de trabajo relacionadas con
alimentos.
En la actualidad, el Departamento de Seguridad
Alimentaria y Servicios de Inspección (FSIS) (del inglés,
" Food Safety and Inspection
Services") de los Estados Unidos emplea más de medio
billón de dólares anuales en la realización de inspecciones de
carnes, aves y pescados con respecto a la presencia de contaminantes
bacterianos. En sentido amplio, las inspecciones se hacen para
determinar la higiene del área de trabajo y para detectar microbios
patógenos en productos alimenticios. La ingestión de microbios
patógenos puede producir intoxicaciones alimentarias cuando los
microbios son embalados de manera inadvertida dentro de las
mercancías de venta en supermercados. Un ejemplo de microbio
patógeno es Salmonella. Salmonella es un género de
bacteria Gram negativa que constituye una fuente importante de
enfermedades humanas de origen alimentario en todo el mundo. Cada
año se informa de hasta 4 millones de casos de salmonelosis
solamente en los Estados Unidos. Se conocen varios serotipos
diferentes de especies de Salmonella patógenas, de los cuales
los más conocidos son S. typhimurium y S.
enteriditis. Habitualmente, la salmonelosis se trata con
antibióticos. Sin embargo, están emergiendo cepas de
Salmonella resistentes a antibióticos. Listeria y
E. coli son también contaminantes microbianos de aparición
frecuente. Listeria monocytogenes es una bacteria Gram
positiva que es una de las causas comunes de gastroenteritis. Los
ensayos de E. coli se realizan como indicación de una
contaminación fecal de alimentos y áreas de trabajo.
La industria alimentaria ha tendido a realizar
ensayos de detección de la contaminación de alimentos sólo a nivel
de producción y de comercio al por mayor. Sin embargo, en el tiempo
transcurrido entre que un producto alimenticio es embalado y su
consumo tiene lugar, un patógeno bacteriano que había sido
indetectable en la inspección a nivel de comercio al por mayor,
puede multiplicarse y convertirse así en un riesgo para la salud.
La contaminación de alimentos tiene una importancia cada vez mayor
para el productor. La publicidad negativa y las retiradas de
productos del mercado cuestan a la industria alimentaria millones
de dólares al año.
En la actualidad, los sistemas de análisis
utilizados a nivel de producción y de comercio al por mayor
requieren un adiestramiento y equipamiento especializados, un
tiempo considerable, y no son muy sensibles a la presencia de
cantidades pequeñas de bacterias patógenas. Para realizar análisis
con respecto a una contaminación bacteriana cuya existencia se
sospechosa, se obtiene un cultivo usando una muestra del alimento o
una muestra procedente del lugar de trabajo del que se tiene
sospecha que está contaminado, con el fin de aumentar la cantidad de
sustancia detectable (del contaminante bacteriano cuya existencia
se sospecha). La realización del cultivo puede requerir hasta 48
horas. A continuación, las células que han crecido en el cultivo se
lisan para obtener un lisado. Históricamente, la realización de
análisis de bacterias patógenas se ha realizado usando anticuerpos
en un inmunoanálisis para detectar proteínas bacterianas en el
lisado. En los últimos años, algunas compañías han utilizado
métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para
copiar el material genético bacteriano que se va a usar en los
análisis de detección. El material genético aislado se multiplica y
se identifica en etapas distintas. El sistema de detección por PCR
requiere también de horas en lugar de minutos para realizarlo. La
realización del ensayo se hace en el momento del envío de un
producto al supermercado o antes del envío. Se precisa un método
fácil, sensible y rápido para detectar una contaminación en
alimentos, tanto para realizar los ensayos a nivel de comercio al
por mayor como para realizarlos a nivel de comercio al por
menor.
También se necesitan dispositivos de detección a
nivel del comercio al por menor para protección del consumidor. Los
aparatos usados para realizar los ensayos que son útiles a nivel del
comercio al por mayor generalmente no son útiles a nivel del
comercio al por menor por diversas razones. En primer lugar, la
mayoría de los ensayos a nivel del comercio al por mayor requieren
una capacitación técnica no frecuentemente practicada por el
consumidor típico. En segundo lugar, cuando un producto permanece
en el estante antes de su compra, los niveles de contaminantes
pueden aumentar, especialmente si la temperatura del producto no
está debidamente controlada. Durante el tiempo en el que el
alimento está en tránsito, se puede producir el crecimiento
bacteriano. Se han publicado métodos y dispositivos para detectar
microorganismos en alimentos a nivel del comercio al por menor.
Aunque se han desarrollado ensayos para el mercado al por menor,
estos ensayos no han tenido éxito para su adopción. Se han usado
detectores colorimétricos de cambios en el contenido iónico, por
ejemplo en el pH, del líquido o del material que rodea el producto
alimentario, o se han incorporado en embalajes destinados al
comercio al por menor según se ilustra en las Patentes de EE. UU.
Núms. 4.746.616 y 5.053.339. También se han acoplado anticuerpos a
marcadores colorimétricos para la detección de contaminantes tal
como se ilustra en las Patentes de Patente de EE. UU. Núms.
5.306.466 y 5.869.341. Nada de lo anteriormente mencionado es
suficientemente específico y sensible para satisfacer las
necesidades del mercado actual.
Los autores de la invención conocen la memoria
descriptiva de la Patente de los Estados Unidos, documento US
5330889 (Monget Daniel), que describe un procedimiento de análisis
bacteriológico para diferenciar la especie patógena
monocytogenes en una muestra que puede contener bacterias del
género Listeria, un medio para su implementación y un
dispositivo para identificar Listeria monocytogenes. El
procedimiento consiste en poner la muestra que ha de ser analizada
en contacto con un medio de identificación que comprende un sustrato
cromogénico o fluorogénico capaz de ser hidrolizado por la
glicina-aminopeptidasa.
Los autores de la invención también conocen un
artículo titulado "Development of An Internally Quenched
Fluorescent Substrate for Escherichia coli Leader Peptidase"
de Wenyan Zhong y col., en Analytical Biochemistry 255,
63-73 (1998), que describe que la peptidasa líder
de Escherichia coli, una proteína integral de membrana, es
responsable de la escisión de la secuencia señal de muchas
proteínas que se exportan.
Domann y col. (Infection and Immunity,
enero de 1.991, págs. 65-72) describen la detección
de L. monocytogenes con placas de agar-leche
(cónfer. desde la pág. 67, col. 2, párrafo 3 hasta la pág. 68,
párrafo 1).
Se precisa un medio para detectar de manera
específica y sensible la presencia o ausencia de al menos un
microorganismo patógeno en productos alimenticios potencialmente
contaminados, a nivel del comercio al por menor.
La presente invención proporciona un método para
detectar la presencia o ausencia de Listeria monocytogenes
según se expone en las reivindicaciones principales que se adjuntan.
Más concretamente, el método comprende identificar al menos una
proteína de la membrana externa o una proteína secretada que es
exclusiva de un patógeno microbiano particular, Listeria
monocytogenes, y que es específica de sustrato.
Utilizando un tratamiento bioinformático, se
realizaron comparaciones con la búsqueda BLAST, de los conjuntos de
proteasas de una pluralidad de especies comunes de bacterias
patógenas. Se identificaron una o más proteasas que eran exclusivas
de una especie. A continuación se identificó el sustrato específico
para cada proteasa, usando la Transferencia de Energía de
Fluorescencia por Resonancia (FRET). El sustrato exclusivo
identificado se marcó luego y se usó para detectar la presencia de
un patógeno microbiano particular en las muestras que requerían ser
sometidas a examen. Los sustratos de proteasas identificados se
ensayaron con alimentos comunes y con levaduras con el fin de
identificar los sustratos que eran específicos para las
bacterias.
La presente solicitud describe también un
dispositivo para detectar la proteína marcadora y para advertir al
consumidor de la presencia de la proteína marcadora. Se proporciona
un biosensor de uso en establecimientos de comercio al por menor o
de uso doméstico, para detectar alimentos contaminados, que
comprende un sustrato específico que está acoplado al material de
embalaje más próximo al producto alimenticio que ha de ser sometido
a control con respecto a la existencia de una contaminación
bacteriana. Preferiblemente, el sustrato está unido covalentemente
a un marcador y por consiguiente contiene una señal de detección que
al producirse la proteolisis del enlace
sustrato-marcador indica la presencia de una
bacteria contaminante. El biosensor se prepara determinando en
primer lugar el sustrato específico de una proteasa específica,
característica de la bacteria que ha de ser detectada. El sustrato
específico determinado se marca con una pluralidad de grupos
lábiles cromatogénicos o fluorescentes. Más preferiblemente, el
grupo marcador proporciona una señal latente que se activa
solamente cuando la señal es desprendida proteolíticamente del
embalaje. Son grupos cromatogénicos lábiles, por ejemplo, los
grupos para-nitroanilida. Preferiblemente, las
moléculas sustrato marcadas van acopladas a la superficie interior
del material de embalaje más próximo al producto alimenticio. Si el
producto alimenticio se llega a contaminar, el patógeno microbiano
produce la proteasa que actúa sobre el sustrato marcado que está
adherido al embalaje, liberando el grupo lábil. Cuando una señal
colorimétrica visualmente detectable queda libre, se produce un
cambio de color visible en el sitio de interés.
Las proteasas que son comunes entre especies
microbianas patógenas, pero que son específicas de sustrato y que
comparten un sustrato común, se pueden identificar para usarlas en
un método y en un dispositivo para detectar la presencia de
bacterias. Por ejemplo, las bacterias se pueden recoger de las
superficies de trabajo de plantas cárnicas y de restaurantes. Un
sustrato que puede ser escindido por una pluralidad de bacterias se
marca y se une covalentemente a una superficie recolectora, tal como
las fibras de algodón de la punta de un hisopo. La punta del hisopo
se usa para pasarla por la superficie que se sospecha que está
contaminada por bacterias. La punta del hisopo se pone en un medio
y se incuba utilizando condiciones que permiten la proteolisis del
sustrato marcado si la proteasa(s) específica para el
sustrato unido y marcado está presente. La proteolisis da como
resultado la producción de una señal detectable, por ejemplo, un
cambio de color, que puede ser visible si la señal es un grupo
cromatogénico lábil.
En esta memoria descriptiva se describe una
banda sensora. Preferiblemente, la banda sensora comprende un
material inerte al que se ha adherido covalentemente un sustrato que
contiene una señal de detección latente. Se puede utilizar un único
sustrato de proteasas o una pluralidad de sustratos de proteasas.
Cuando se utiliza una pluralidad de sustratos de proteasas, cada
uno de ellos puede estar marcado para distinguirlo de los otros,
y/o cada uno de ellos puede estar colocado en una región particular
del material de soporte de la banda. Dependiendo del producto
alimenticio, se puede predecir la frecuencia de la aparición
esperada de un microbio patógeno particular. Por ejemplo,
Listeria monocytogenes es un contaminante común de productos
avícolas, y por lo tanto, un sustrato marcado con un grupo
cromogénico lábil, específico para una proteasa de Listeria
monocytogenes, puede ir incorporado sobre la superficie del
embalaje más próxima al producto avícola. Sin embargo, cuando puede
haber presentes muchos posibles patógenos microbianos, se puede
utilizar un sustrato que pueda ser sometido a proteolisis por todos
los microbios siempre y cuando sea específico de los microbios
patógenos.
La presente solicitud también describe un
kit que se proporciona para detectar contaminantes
microbianos en alimentos. El kit comprende un soporte sólido
plano, que preferiblemente contiene una pluralidad de pocillos, al
que está unido un sustrato proteico marcado con grupos lábiles. Se
proporcionan un medio para disponer de una disolución tamponada con
fosfato, un control negativo y un control positivo. Una muestra del
alimento en sospecha (SF) (del inglés, " Suspect
Food") se prepara en el tampón de fosfato. Una parte
alícuota de cada SF, el control negativo y el control positivo se
colocan cada uno de ellos en su propio pocillo y se dejan
reaccionar. Los pocillos en los que se observa un cambio de color
contienen contaminantes microbianos a menos que el pocillo del
control negativo también cambie de color. Si el pocillo del control
negativo cambia de color, se puede repetir el análisis.
La Figura 1 es una imagen de la espuma
Styrofoam que contiene encapsuladas proteínas (PES) (del
inglés, " Protein Encapsulated
Styrofoam") para capturar bacterias tales como L.
monocytogenes;
La Figura 2 es una gráfica que muestra el tiempo
que tardan en disolverse las pastillas de PES, determinado por la
cantidad de anticuerpo liberado a lo largo del tiempo; y
La Figura 3 es una imagen que muestra la
activación de la fluorescencia de un sustrato en presencia de L.
monocytogenes.
Una de las consideraciones más importantes para
desarrollar un kit analítico de aplicación a nivel del
comercio al por mayor es la capacidad que tenga para capturar
patógenos microbianos en alimentos. Es necesario contar con un
procedimiento para capturar bacterias de manera fiable en matrices
de alimentos de manera que todas las bacterias viables son
capturadas y se someten a enriquecimiento en un medio de
recuperación adecuado. Muchas compañías usan hisopos de algodón o
filtros para capturar las bacterias, pero varios estudios
independientes han mostrado que el atrapamiento de bacterias en
estos materiales porosos reduce la exactitud de la detección cuando
se detectan niveles de contaminación bajos. Los métodos estándar de
captura en filtros también atrapan bacterias pero son menos fiables
que el simple cultivo en placa, y los métodos de cultivo tardan
hasta una semana para obtener resultados. Los dispositivos de
captura de bacterias, tales como las bolitas magnéticas, son más
costosos y requieren una etapa adicional para recoger las bacterias
a lo largo de la pared del tubo con un imán.
En los ensayos para el control de la seguridad
alimentaria, la muestra de alimento se tritura en un triturador
especial denominado Stomacher Blender, que está equipado con
una bolsa ésteril Stomacher Bag. El principio básico del
método de captura de la invención consiste en añadir una pastilla de
PES a la muestra triturada durante unos cuantos minutos, con
agitación suave, para capturar las bacterias. El revestimiento
permanece intacto durante este corto tiempo de exposición a
temperatura ambiente. Una vez capturadas las bacterias, el PES se
deja flotar sobre la superficie de la bolsa Stomacher de la
que es extraído con unas pinzas esterilizadas. La pastilla se
deposita en un medio de cultivo de enriquecimiento y se incuba a
37ºC hasta que una cantidad suficiente de bacterias puede ser
detectada de manera fiable. Una vez transcurrido el tiempo
suficiente a 37ºC, el revestimiento de gelatina se disuelve y las
bacterias se liberan de manera efectiva en el medio de cultivo de
crecimiento.
Para fabricar la pastilla de PES, se calentó
gelatina a 65ºC y se dejó enfriar hasta aproximadamente 55ºC. A
continuación se añadió una concentración de anticuerpo de 50
\mug/ml, justo antes de que la cápsula de gelatina se formara
alrededor del glóbulo. La tecnología que utiliza PES se puede usar
para capturar y liberar bacterias desde una muestra a ensayar a un
medio de enriquecimiento. La rigidez de la gelatina impide que los
anticuerpos se liberen hasta varias horas después de la incubación
(véase la figura 2).
Dos pastillas de PES se incubaron en PBS con
agitación vigorosa, a temperatura ambiente [RT (del inglés,
" Room Temperature"); series 1 y 2)]. A
cada uno de los tiempos (0, 5, 10, 20, 60, 120 y 720 minutos), se
extrajo una parte alícuota de la muestra y la cantidad de
anticuerpo conjugado con HRP se detectó con un sustrato
TMB-peroxidasa (KPL, Gaithersburg, MD). La lectura
de las muestras se realizó con un lector para microplacas de
Benchmark a 655 nm. Pasados 20 minutos, menos del 1% del anticuerpo
total presente sobre la pastilla de PES se había disuelto en la
disolución de PBS. De este modo es posible capturar bacterias con
las cápsulas revestidas de anticuerpo y liberarlas en el medio de
enriquecimiento con este método. La rigidez (número Bloom alto) de
la gelatina de piel de cerdo (300 Bloom) hace que sea posible este
procedimiento de captura y liberación. El uso de una gelatina de un
número Bloom más bajo permitiría que la bacteria fuera liberada mas
deprisa en el medio de enriquecimiento.
La presente memoria descriptiva describe un
método para capturar y liberar cuantitativamente bacterias
contaminantes presentes en una muestra de alimento, que utiliza las
pastillas de Stirofoam que contienen encapsuladas proteínas
(PES), anteriormente descritas. Una o más pastillas recubiertas con
anticuerpos comercialmente disponibles, atrapados en gelatina, se
pueden depositar en una muestra del alimento homogeneizado a ensayar
contenido en una bolsa Stomacher y se pueden incubar con
agitación suave a temperatura ambiente. La pastilla se puede luego
extraer con unas pinzas esterilizadas y depositarse en un medio de
crecimiento a 37ºC durante un corto período de tiempo, hasta que el
revestimiento de gelatina se haya disuelto y las bacterias se hayan
liberado en el
medio.
medio.
La presencia de contaminación por L.
monocytogenes se detecta midiendo la metaloproteasa (mpl), que
se encuentra solamente en la especie patógena de L.
monocytogenes (Domann y col., Infection and Immunity,
enero de 1.991; 59(1): 65-72; Mengaud y col.,
(1991). Se diseñó una serie de péptidos, M1 (lote
038-13/15) y P1 (lote 038-10/12),
para usar como sustratos sintéticos de la mpl (Tabla 1) y las
secuencias fueron fabricadas por New England Peptide (195
Kimball St. Fitchburg, MA). Los péptidos se sintetizaron con grupos
fluorescentes (DABCYL y EDANS) de manera tal que los sitios activos
no estuvieran bloqueados. El péptido M1 es específico para L.
monocytogenes a pH 5,5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La evidencia preliminar indica que a pH 5,5, el
péptido M1 es específico para L. monocytogenes y no detecta
de manera significativa la presencia de E. coli (véase la
Figura 3). Se espera que este péptido y los derivados de este
péptido (con una o dos sustituciones de aminoácidos) se puedan usar
en un formato estándar de análisis en microplacas para la detección
de L. monocytogenes en alimentos.
Se descubrió que Listeria monocytogenes
secreta al menos dos proteasas características, una de las cuales
es una metaloproteasa y la otra es una
serina-proteasa. Las proteasas microbianas se pueden
dividir en cuatro clases principales basándose en el sitio
catalítico (metalo-proteasa,
serina-proteasa, cisteína-proteasa y
aspartato-proteasa). El tipo concreto de sitio
catalítico se puede determinar utilizando bloqueadores de sitios
catalíticos. Por ejemplo, la presencia de una metaloproteasa que
contiene un sitio catalítico metalo se puede demostrar bloqueando
de manera específica la reacción que cataliza con TAPI
[N-{D,L-[2-(hidroxiaminocarbonil)metil]-4-metilpentanoil}L-3-(2-naftil)alanil-L-alanina,2-aminoetil-amida].
El sitio catalítico de cada proteasas contiene una signatura de
aminoácidos, un motivo o secuencia de aminoácidos característicos,
que se pueden usar para identificar esa proteasa y nuevas proteasas
similares pertenecientes a una de sus clases. Además, muchas de las
proteasas presentan dos formas: una forma inactiva de mayor tamaño
que requiere una proteolisis parcial (proteolisis limitada) para
obtener una forma activa de la enzima, de menor tamaño. Se sabe que
las proteasas rompen los enlaces peptídicos de un sustrato proteico.
Se sabe que algunas proteasas son muy específicas con respecto al
tipo de enlace peptídico que son capaces de hidrolizar o romper.
Cuando una proteasa tiene una limitación con respecto al
enlace(s) que puede romper, se dice que la proteasa es
específica de sustrato.
La secuencia de aminoácidos característica de
una enzima particular o de su sitio catalítico está reproducida en
el código genético. Conociendo la secuencia de aminoácidos de una
enzima o de su sitio catalítico, se puede deducir la secuencia de
nucleótidos del DNA o RNA que codifica esa secuencia. Esa secuencia
de nucleótidos se puede luego localizar en el código genético de
una bacteria o se puede sintetizar. La clonación de la secuencia
genética que codifica esa secuencia de aminoácidos se puede usar
para obtener múltiples moldes para generar copias de la enzima o de
su sitio catalítico. Usando estas copias de la enzima o de su sitio
catalítico, se puede determinar el sitio exacto de la escisión o el
tipo de enlace hidrolizado. Usando esta información, se puede
definir un sustrato especifico de la enzima. Este sustrato se puede
usar para realizar análisis con respecto a la presencia de las
bacterias patógenas. El sustrato se proporciona con un marcador que
sirve para indicar la presencia de las bacterias patógenas. El
marcador preferido es un marcador cromogénico y produce una señal
visual cuando es escindido. Por ejemplo, cuando se determina la
escisión específica de un sustrato, el sustrato se puede
proporcionar con dos colorantes diferentes, sirviendo uno de los
colorantes para extinguir al otro colorante cuando los colorantes
se encuentran muy próximos, y se puede medir mediante FRET.
La transferencia de energía de fluorescencia por
resonancia (FRET) es el procedimiento que consiste en una
interacción entre estados excitados dependiente de la distancia, en
el que la emisión de una de las moléculas fluorescentes se acopla a
la excitación de la otra molécula fluorescente. Un par típico de
aceptor y dador de una transferencia de energía por resonancia
consiste en el ácido
4-[[4-(dimetilamino)fenil]azo]benzoico
(DABCYL) y el ácido
5-[(2-aminoetilamino]naftalenosulfónico
(EDANS). EDANS se excita mediante iluminación con luz de 336 nm y
emite un fotón con una longitud de onda de 490 nm. Si un resto de
DABCYL se encuentra situado dentro de una distancia de 20 ángstrom
del resto de EDANS, este fotón será absorbido eficientemente.
DABCYL y EDANS estarán unidos a los extremos opuestos de un sustrato
peptídico. Si el péptido está intacto, la FRET será muy eficiente.
Si el péptido ha sido escindido por la metaloproteasa, los dos
colorantes ya no estarán muy próximos y la FRET será ineficiente.
El seguimiento de la reacción de escisión se puede realizar
observando una disminución en la fluorescencia del DABCYL o un
aumento en la fluorescencia del EDANS (pérdida de extinción).
Métodos alternativos para proporcionar una señal
visual incluyen marcar el sustrato de la proteasa con un colorante
apto para uso alimentario (FD&C) tal como el rojo Texas o con
negro amido o con un colorante fluorométrico tal como
4-nitroanilina o
7-amino-4-metil-cumarina.
Para las aplicaciones en comercio al por menor, el sustrato marcado
puede ir unido al embalaje de los alimentos. Cuando la proteasa que
caracteriza al microorganismo patógeno está presente, el marcador o
el sustrato marcado es escindido del embalaje, difundiéndose desde
el sitio en el que está adherido. Esto da como resultado un cambio
de color en ese sitio. Por ejemplo, el embalaje puede llevar un
"NO INGERIR" impreso en rojo sobre él. Cuando el sustrato
marcado está presente, la escritura está oculta. Cuando el marcador
es separado, el aviso se hace visible.
En una de las realizaciones, se proporciona un
sistema analítico que detecta e indica la presencia del
microorganismo procariota predeterminado Listeria
monocytogenes. La presencia de la Listeria monocytogenes
predeterminada viene indicada por la escisión proteolítica de un
sustrato por acción de una proteasa que da como resultado la
producción de una señal. Preferiblemente, la señal es cromogénica.
La L. monocytogenes (DP-L1955) fue
gentilmente proporcionada por la Dra. Julie Theriot de la Stanford
School of Medicine. La L. monocytogenes se hizo avirulenta
mediante una deleción del gen requerido para la motilidad
intracelular (ActA, Smith y col., J. Cell Biol., noviembre
de 1.996; 135(3): 647-660).
A continuación se expone un método para
desarrollar un análisis para detectar una bacteria patógena que
produce al menos una proteasa extracelular y un método para usar
este análisis para detectar bacterias patógenas que producen al
menos una proteasa extracelular:
Etapa
1)
Se selecciona una secuencia de aminoácidos,
también denominada secuencia marcadora, que caracteriza o que marca
de manera exclusiva la presencia del microorganismo de interés, tal
como, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos exclusiva para una
proteasa extracelular producida por un microorganismo procariota
patógeno de interés. La selección se realiza utilizando un
tratamiento bioinformático. Se realizan comparaciones con la
búsqueda BLAST entre especies comunes de bacterias patógenas con
respecto a secuencias de aminoácidos conocidas. Se determinan una o
más secuencias de aminoácidos que son exclusivas para un
microorganismo procariota específico.
Etapa
2)
Se aísla la proteasa del medio extracelular en
el que crece la bacteria patógena que se ha de ensayar. Como
alternativa, si se desconoce la secuencia genética de la proteasa o
la posición de la secuencia genética de la proteasa, se aísla y se
clona la secuencia genética que produce la expresión de la secuencia
de aminoácidos marcadora de la Etapa 1, o bien, primero se
determina la secuencia genética, y después se procede de la misma
manera anteriormente mencionada.
Etapa
3)
Se determina el medio requerido para el
crecimiento del microorganismo procariota específico de interés y
para la expresión de su proteasa activa exclusiva en el medio.
Se determina si se requiere una segunda proteasa
para convertir la proteasa específica de una forma precursora
inactiva a una forma activa.
Para determinar si la proteasa ha sido secretada
en una forma activa, una muestra del cultivo bacteriano se
proporciona junto con sustratos potenciales elegidos, y se determina
la escisión de estos sustratos. Por ejemplo, un glóbulo de
bacterias procedente de la Etapa 3) se resuspende con cuidado en 500
\mul de DMEM en presencia de sustratos comunes de gran extensión
(miosina II, albúmina de suero bovino, colágeno, fibronectina y
hemoglobina). La miosina II, pero no las proteínas procedentes de
la leche, tales como la caseína, se ha visto que es un sustrato
adecuado para medir la actividad proteolítica de una bacteria Gram
positiva aislada de jamón seco curado (Rodriguez y col., J.
Appl. Microbiol., noviembre de 1.998; 85(5):
905-912). La suspensión de bacterias y sustratos se
incuba a 37ºC con agitación suave. A tiempos
pre-establecidos (0,1 h, 0,3 h, 1,0 h, 3,0 h, 5,0
h, 24 h y 48 horas) las muestras se centrifugan para sedimentar las
bacterias, y una parte alícuota pequeña se retira para que sirva de
muestra sobre un gel de SDS-PAGE. Una vez terminado
el paso de los tiempos, las muestras se procesan sobre un minigel
de SDS-PAGE en gradiente del 10% - 15%. A
continuación, las proteínas se transfieren a Immobilon Pseq
(Tampón de transferencia, CAPS al 10%, metanol al 10% pH 11,0, 15 V
durante 30 minutos) usando un aparato de transferencia semiseca, de
Bio-Rad. Después de la transferencia de las
proteínas, la transferencia se tiñe con azul de Coomassie
R-250 (Azul brillante de Coomassie
R-250 al 0,25%, metanol al 50%, ácido acético al
10%) y se decolora (decoloración alta durante 5 minutos, metanol al
50%, ácido acético al 10%; decoloración baja hasta haberla
completado, metanol al 10%, ácido acético al 10%), seguido de
secuenciación desde el extremo N-terminal. Como
alternativa, las muestras se procesarán en un espectrómetro de masas
con el fin de mapear los sitios de escisión proteolítica utilizando
un espectrómetro de masas Voyager Elite (Perceptive
Biosystems).
Por ejemplo, L. monocytogenes produce una
metaloproteasa extracelular, denominada mpl. El gen de esta
proteasa está situado justo en dirección aguas abajo de otro factor
de virulencia, el gen de la listerolisina (Domann y col.,
Infection and Immunity, enero de 1.991; 59(1):
65-72). La mpl tiene dos formas, una forma activa y
una forma inactiva. Los tres posibles mecanismos de activación de la
mpl o de cualquier proteasa inactiva mediante proteolisis limitada
son: autodigestión (procedimiento autocatalítico), digestión por
acción de una proteasa bacteriana diferente de la metaloproteasa, y
digestión por acción de una proteasa extracelular de la célula
hospedadora. Se ha encontrado que la actividad de metaloproreasa se
puede medir indirectamente en los sobrenadantes de L.
monocytogenes. El seguimiento de la actividad de mpl se puede
realizar midiendo el derramamiento del receptor de
IL-6 por la superficie de monocitos humanos. El
procesamiento de la metaloproteasa precursora de L.
monocytogenes hacia la forma madura se determinó que requería la
presencia de los monocitos.
El siguiente método se puede utilizar para
determinar la activación de una proteasa inactiva de otras bacterias
patógenas. Se preincuban las bacterias de interés o bien con
células enteras fijadas en metanol, o bien con preparaciones de
membranas de monocitos arrancadas con NaOH. La fijación de los
monocitos impedirá la internalización de las bacterias. De manera
breve, 10.000 CFU de L. monocytogenes se añaden a placas de
monocitos que casi han alcanzado la confluencia y que han sido
fijados con metanol al 100%, a -20ºC, durante 10 minutos, o con
paraformaldehído al 5,0% en un tampón que preserva el citoesqueleto.
Después de 2 - 4 horas de incubación, el sobrenadante que contiene
las bacterias se extrae y se centrifuga para separar el sobrenadante
del sedimento celular. El sobrenadante se incuba con los sustratos
proteicos escogidos durante tiempos
pre-establecidos, para determinar su actividad.
Se encontró que la expresión de la
metaloproteasa activa en L. monocytogenes aumentaba al hacer
crecer las bacterias procariotas en un medio libre de proteínas tal
como el medio D 10, un medio elaborado por Trivett y Meyer (1971).
Las bacterias se cultivaron toda la noche (24 h); se centrifugaron a
5k x g durante 10 minutos y luego se resuspendieron en el medio de
cultivo de tejidos (Medio de Eagle Modificado por Dulbecco,
"DMEM", Life Technologies (Gaithersburg, MD)).
Etapa
4)
Etapa
5)
Se identifica el sitio(s) diana también
denominado "sitio(s) activo" de la escisión por acción
de la proteasa.
Se determina la secuencia peptídica del sitio
activo de la proteasa usando una transferencia de energía de
fluorescencia por resonancia (FRET). La transferencia de energía de
fluorescencia por resonancia (FRET) es el procedimiento que
consiste en una interacción entre estados excitados, dependiente de
la distancia, en el que la emisión de una de las moléculas
fluorescentes se acopla a la excitación de la otra molécula
fluorescente. La FRET es una de las mejores maneras de identificar
la especificidad de un sustrato con respecto a una proteasa
particular (Liu y col., Anal. Biochem., 15 de febrero de
1.999; 267(2): 331-335). Un par típico de
aceptor y dador de una transferencia de energía por resonancia
consiste en el ácido
4-[[4-(dimetilamino)fenil]azo]benzoico
(DABCYL) y el ácido
5-[(2-aminoetilamino]naftalenosulfónico
(EDANS). EDANS se excita mediante iluminación con luz de 336 nm y
emite un fotón con una longitud de onda de 490 nm. Si un resto de
DABCYL se encuentra situado dentro de una distancia de 20 ángstrom
del resto de EDANS, este fotón será absorbido eficientemente.
DABCYL y EDANS estarán unidos a los extremos opuestos de un sustrato
peptídico. Si el péptido está intacto, la FRET será muy eficiente.
Si el péptido ha sido escindido por la metaloproteasa, los dos
colorantes ya no estarán muy próximos y la FRET será ineficiente.
El seguimiento de la reacción de escisión se puede realizar
observando o una disminución en la fluorescencia del DABCYL o un
aumento en la fluorescencia del EDANS (pérdida de extinción).
Cuando la enzima es una metaloproteasa (mpl), la
forma activa de la mpl se puede amplificar mediante reacción en
cadena de la polimerasa usando cebadores directos e inversos que
contienen sitios de restricción útiles para la clonación en un
vector de expresión con un promotor fuerte inducible (tal como el
sistema T7 de pET-28a), Novagen). Los cebadores
útiles para la amplificación son: catgccatgggtagaacgggctgataccca
(SEQ ID NO: 4) y gcgccggaattctcagttaaccccaactgctt (SEQ ID NO: 5).
Cada uno de los cebadores tiene al menos una protuberancia de 6
pares de bases. Se amplifica el DNA procedente o de colonias lisadas
de L. monocytogenes o de preparaciones purificadas de DNA
genómico de L. monocytogenes. El cebador directo se
suministra con un sitio Nco I que incluye la metionina de inicio
(CATATG). El cebador inverso incluye un codón de terminación (TGA) y
un sitio de restricción Eco RI (GAATTC). Un protocolo de
amplificación típico comprende amplificar la secuencia genética con
la Taq polimerasa en las siguientes condiciones: 4 minutos de
desnaturalización inicial a 92ºC, (25 ciclos, 30 segundos de
hibridación a 50ºC, 1,5 minutos de extensión a 72ºC, 30 segundos de
desnaturalización a 92ºC), 10 minutos de extensión final a 72ºC y
conservación a 4ºC. La temperatura de hibridación se puede aumentar
o disminuir un poco para constituir la temperatura de
desnaturalización (Tm) (del inglés, "melting
temperature") prevista de los
cebadores.
cebadores.
Después de clonar la secuencia genética de la
metaloproteasa activa en pET28a, el gen se secuencia mediante
secuenciación por paseo con cebador bicatenario en un analizador
génico ABI310. La forma activa recombinante de la secuencia
genética de la metaloproteasa se purifica mediante cromatografía en
ácido nitrilotriacético-níquel aprovechando la
secuencia identificadora de polihistidina contenida en el vector
pET-28a.
Etapa
6)
Se proporciona un dispositivo con un sustrato
peptídico que lleva una terminación carboxi terminal marcada y cuya
escisión se ha determinado que es específica, mediante el ensayo de
FRET de la Etapa 5, para la proteasa de las bacterias patógenas de
interés. Por ejemplo, un péptido marcado con un cromógeno podría ir
unido a una membrana de PVDF que tiene una zona hidrófoba. Cuando el
péptido fuera cortado, el colorante se concentraría en la zona
hidrófoba, haciéndose visible. Como alternativa, el péptido podría
estar marcado con fluorescencia, y visualizarse con una lámpara de
UV. Otra posibilidad la constituye un péptido con un grupo
cromogénico lábil que al separarse cambia de color. El péptido puede
ir marcado con un colorante azul y acoplado a una superficie de
color rojo. Para el observador, la superficie se vería negra salvo
que la bacteria específica estuviera presente para proporcionar la
proteasa que escindiría el péptido, volviéndose la superficie de
color rojo a medida que el péptido fuera escindido por proteolisis y
se difundiera hacia afuera. Aunque los grupos lábiles
convencionales tales como 4-nitroanilina o
7-amino-4-metil-cumarina
se pueden cuantificar mediante espectrofotometría y fluorometría,
puede ser mejor usar un grupo lábil tal como el Rojo Texas que
tiene un intenso color azul. Situando dos o tres grupos de Rojo
Texas cerca del extremo del péptido, sería posible detectar
visualmente la desaparición del sustrato por acción de la actividad
de proteasa de L. monocytogenes.
Las cisteínas de la terminación carboxilo de los
péptidos se marcaron con Rojo Texas y bromoacetamida usando un
procedimiento estándar descrito para marcar actina. Véase Wang y
Sanders, 1990. Un ejemplo es un péptido hidrófobo marcado con las
moléculas 2-3 de Rojo Texas. Otra posibilidad sería
marcar el péptido con Negro amido. A medida que el sustrato es
escindido por proteolisis por acción de la mlp, el péptido de color
negro se difunde hacia afuera, y aparecería una zona nítida que
indicaría la presencia de L. monocytogenes.
El péptido se puede acoplar a una superficie,
tal como una placa de microtitulación de vidrio o un material de
embalaje alimentario de polipropileno, en la orientación adecuada.
La placa de microtitulación debe proporcionar una pluralidad de
sitios de unión derivatizados para el acoplamiento con el sustrato
peptídico, tales como sitios con aminas primarias marcadas con
éster de succimidilo, dispuestos sobre placas derivatizadas (placas
Xenobind,
Xenopore).
Xenopore).
Manteniendo un pH neutro, la terminación amino
del péptido puede ir marcada preferentemente. Brevemente expuesto,
el péptido (en una concentración de 1-3 mg/ml) se
incubará con placas Xenobind durante 2 horas en tampón de fosfato
sódico 50 mM (pH 7,0). Después de lavarlas con el tampón de lavado,
las placas se bloquearán con albúmina de suero bovino al 3% durante
2 horas a 37ºC. Por último las placas se lavarán tres veces en
tampón de lavado y se conservarán a 4ºC hasta su utilización.
Los sitios reactivos opcionalmente no ocupados,
presentes en la placa de microtitulación o sobre el embalaje
alimentario, se bloquean acoplando a ellos albúmina de suero bovino,
o el dominio activo de p26. p26 es una proteína de tipo de la
proteína alfa-cristalina, que se usa en este caso
para disminuir la agregación de proteínas inespecíficas. La
capacidad de la proteína p26 para volver a plegar la
citrato-sintetasa desnaturalizada por calor, antes
y después del acoplamiento a la superficie del embalaje alimentario,
se usa como control para determinar la actividad de p26. Proteínas
del tipo de la proteína alfa-cristalina se
produjeron mediante técnicas recombinantes usando tecnologías
estándar del DNA recombinante (Maniatis y col., Molecular
Cloning: a laboratory manual. 1.982). Brevemente expuesto, el
plásmido que contiene el dominio central cargado en configuración
lámina BETA de p26, se somete a electroporación en células
B121(DE3) electrocompetentes (electroporador Pulser
de Bio-Rad, para E. coli). Las células se
hacen crecer hasta alcanzar una OD de 0,8, y luego se someten a
inducción con IPTG 1 mM durante 4 horas. Las células se centrifugan,
se sonican en un tampón de concentración baja (Tris 10 mM pH 8,0,
NaCl 500 mM, Imidazol 50 mM) para su lisis (Virsonic, Virtis,
Gardiner, NY). El lisado se centrifuga a 13.000 x g durante 10
minutos, y el sobrenadante se filtra en filtros de 0,45 \mum y 0,2
\mum. El filtrado se carga sobre una columna de
Ni-NTA-Superose (Quiagen, Valencia, CA, Núm.
de catálogo 30410). Un tampón de alta concentración (Tris 10 mM pH
8,0, NaCl 500 mM, Imidazol 250 mM) se usa para eluir la
proteína.
\newpage
Ejemplo
1
Los productos alimenticios se sometieron a
ensayos por pentaplicado para determinar el campo de aplicabilidad
a productos alimenticios listos para su consumo. Cada una de las
muestras de alimento sólido se procesó en una campana de flujo
laminar. Veinticinco gramos de cada producto alimenticio se
extrajeron de su embalaje y se pesaron. La muestra pesada del
alimento sólido se puso en una bolsa estéril Stomacher con
125 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato
potásico 10 mM, pH 7,4, cloruro sódico 120 mM, cloruro potásico 2,7
mM). El alimento sólido se homogeneizó en un triturador
Stomacher (Fisher Scientific; Pittsburgh, PA) y los
sobrenadantes filtrados se usaron para los ensayos. La L.
monocytogenes se capturó y se liberó eficientemente añadiendo
una pluralidad de Pastillas de Styrofoam con Proteínas
Encapsuladas. Las pastillas de PES (descritas en lo que antecede)
se incubaron con el extracto del alimento durante un período de
incubación de al menos 30 minutos. Las pastillas de PES se
extrajeron de la superficie y se depositaron en un medio de
enriquecimiento para liberar de manera efectiva las bacterias.
Después de incubar a 37ºC durante al menos 4 horas, el medio se
centrifugó a 5.000 x g durante 10 minutos, y el sedimento se
resuspendió en 50 \mul de PBS. Los alimentos líquidos se
prepararon mezclando una parte alícuota del alimento líquido con
una de las pastillas de PES sin someter el líquido al
Stomacher. Transcurridos los 30 minutos de la etapa de
captura, la pastilla de PES se recuperó y el glóbulo se depositó en
un medio de enriquecimiento.
Un análisis basado en la actividad de proteasa
se realizó en cada una de las muestras. Se hizo lectura de cada uno
de los pocillos de la placa de microtitulación antes de comenzar el
análisis con el fin de obtener una medida exacta del fondo para
controlar la variabilidad existente de un pocillo a otro. El
análisis de actividad de proteasa se realizó usando placas de
microtitulación que contenían un péptido marcado para la
determinación por FRET, tal como el péptido M1 que se ha descrito en
lo que antecede. Típicamente, 0,5 \mug del péptido se incubaron
con 50 \mul de extracto del cultivo bacteriano durante al menos 20
min a 37ºC. En presencia de las bacterias, el péptido que participa
en la FRET fluorescerá a 493 nm. Como controles positivos, se puede
añadir L. monocytogenes o la forma recombinante activa de la
proteasa específica del patógeno, a algunas de las muestras de
alimento antes de la incubación, en el análisis de las placas de
microtitulación. Los controles negativos consisten en muestras de
alimento en las que se ha determinado que carecen por completo de
patógenos bacterianos de acuerdo con métodos existentes ya
publicados (Curtis y col., 1.995).
Ejemplo
2
El PVDF constituye una membrana de transferencia
que es hidrófoba hasta que se empapa en metanol, con lo que se
convierte en hidrófila. Un anillo de metanol se estampó sobre PVDF y
se dejó secar al aire. Un sustrato peptídico, marcado con un
colorante aprobado por la FD&C, se incubó con la membrana. El
péptido se unió sólo al anillo hidrófilo. Esta membrana se adhirió
al material de embalaje, por ejemplo, en el lado interior de los
embalajes alimentarios que está en contacto directo con el alimento.
Si el péptido es escindido por las proteasas bacterianas presentes
en el alimento, la molécula de colorante será atraída hacia la
región hidrófoba de la membrana, y se concentrará allí, indicando
que la bacteria está presente por medio de la formación de color o
de fluorescencia dentro del centro del anillo. Se pueden detectar
bacterias diferentes de Listeria monocytogenes usando el
método y el dispositivo descritos, una vez que una interacción
específica sustrato-proteasa se haya determinado y
optimizado para la bacteria de interés.
En el caso de algunas especies bacterianas,
puede ser necesario proporcionar un método para optimizar la
interacción sustrato-proteasa. Por ejemplo, se
pueden requerir cationes divalentes para optimizar la escisión del
sustrato acoplado por acción de la proteasa. En este caso, la
superficie del embalaje alimentario estará bloqueada con proteínas
y/o péptidos que pueden precargarse con iones metálicos, tales como
por ejemplo polihistidina o motivos dedos de zinc.
<110> EXPRESSIVE CONSTRUCTS, INC.
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<120> DISPOSITIVO PARA DETECTAR UNA
CONTAMINACIÓN BACTERIANA Y MÉTODO DE UTILIZACIÓN
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<130> 102951-11
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<140> Presentada con este documento
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<141>
03-05-2.001
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<150> 60/201.405
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<151>
03-05-2.000
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Version 3.0
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<210> 1
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Listeria monocytogenes
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<400> 1
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\sa{Asn Met Leu Ser Glu Val Glu Arg Glu}
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<210> 2
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Listeria monocytogenes
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<400> 2
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\sa{Ala Cys Cys Asp Glu Tyr Leu Gln Thr Lys
Glu}
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<210> 3
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<212> PRT
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<213> Listeria monocytogenes
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\sa{Ala Asp Thr Val Glu Pro Thr Gly Ala Lys
Glu}
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<210> 4
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> Listeria monocytogenes
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\hskip-.1em\dddseqskipcatgccatgg gtagaacggg ctgataccca
\hfill30
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<210> 5
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<211> 32
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<212> DNA
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<213> Listeria monocytogenes
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipgcgccggaat tctcagttaa ccccaactgc tt
\hfill32
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Claims (26)
1. Un método para detectar la presencia o
ausencia de Listeria monocytogenes en una muestra a ensayar,
método que comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra a ensayar con
un sustrato peptídico específico para una metaloproteasa que es
exclusiva de Listeria monocytogenes; y
b) detectar la escisión del sustrato peptídico o
la ausencia de escisión del sustrato peptídico,
en el que la escisión del sustrato
peptídico es indicativa de la presencia de Listeria
monocytogenes en la muestra, y la ausencia de escisión del
sustrato es indicativa de la ausencia de Listeria
monocytogenes en la muestra a
ensayar.
2. El método de la reivindicación 1, en el que
el sustrato peptídico está marcado.
3. El método de la reivindicación 1, en el que
dicho sustrato peptídico está marcado con un marcador de
extinción.
4. El método de la reivindicación 2, en el que
el marcador es fluorescente o cromogénico.
5. El método de la reivindicación 1, en el que
la escisión se detecta usando una lámpara de UV, un colorímetro o
un fluorímetro.
6. El método de la reivindicación 4, en el que
el marcador fluorescente comprende un grupo fluorescente lábil y un
agente extintor de fluorescencia.
7. El método de la reivindicación 6, en el que
si el sustrato peptídico marcado con una marcador fluorescente es
escindido, se produce una señal fluorescente.
8. El método de la reivindicación 7, en el que
la señal fluorescente se detecta con un fluorímetro o con una
lámpara de UV.
9. El método de la reivindicación 4, en el que
si el sustrato peptídico marcado con un marcador cromogénico es
escindido, se produce una señal colorimétrica visible.
10. El método de la reivindicación 9, en el que
si el sustrato peptídico marcado con un marcador cromogénico es
escindido, se detecta una señal con un colorímetro.
11. El método de la reivindicación 1, en el que
el sustrato peptídico comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
12. El método de la reivindicación 1, en el que
la muestra a ensayar comprende un extracto bacteriano.
13. El método de la reivindicación 1, en el que
el sustrato peptídico está adherido a una superficie.
14. El método de la reivindicación 13, en el que
la superficie es vidrio o polipropileno.
15. El método de la reivindicación 3, en el que
el marcador de extinción se selecciona entre el grupo que consiste
en marcadores fluorescentes y marcadores cromogénicos.
16. Un método para detectar la presencia o
ausencia de Listeria monocytogenes en una muestra a ensayar,
método que comprende las etapas de:
a) poner en contacto la muestra a ensayar con un
sustrato peptídico específico para una proteasa que es exclusiva de
Listeria monocytogenes, en el que el sustrato peptídico
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo
que consiste en:
- i)
- SEQ ID NO: 1; o
- ii)
- SEQ ID NO: 2; y
b) detectar la escisión del sustrato peptídico o
la ausencia de escisión del sustrato peptídico,
en el que la escisión del sustrato
peptídico es indicativa de la presencia de Listeria
monocytogenes en la muestra a ensayar, y la ausencia de
escisión del sustrato peptídico es indicativa de la ausencia de
Listeria monocytogenes en la muestra a
ensayar.
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el sustrato peptídico está marcado.
18. El método de la reivindicación 17, en el que
el marcador es fluorescente o cromogénico.
19. El método de la reivindicación 18, en el que
el marcador fluorescente comprende un grupo fluorescente lábil y un
agente extintor de fluorescencia.
20. El método de la reivindicación 18, en el que
si el sustrato peptídico marcado con una marcador fluorescente es
escindido, se produce una señal fluorescente.
21. El método de la reivindicación 20, en el que
la señal fluorescente se detecta con un fluorímetro o con una
lámpara de UV.
22. El método de la reivindicación 18, en el que
si el sustrato peptídico marcado con un marcador cromogénico es
escindido, se produce una señal colorimétrica visual.
23. El método de la reivindicación 22, en el que
si el sustrato peptídico marcado con un marcador cromogénico es
escindido, se detecta una señal colorimétrica con un
colorímetro.
24. El método de la reivindicación 16, en el que
la muestra a ensayar comprende un extracto bacteriano.
25. El método de la reivindicación 16, en el que
el sustrato peptídico está adherido a una superficie.
26. El método de la reivindicación 25, en el que
la superficie es vidrio o polipropileno.
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