ES2886852T3 - Método para detectar microbios que deterioran los alimentos - Google Patents

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Abstract

Método para detectar un microbio que deteriora los alimentos en una muestra de alimentos que comprende: a) añadir un primer agente de ajuste de pH a una muestra de alimentos para proporcionar una muestra de alimentos que tiene un pH en el rango de pH 1 a 5, separar cualquier precipitado sólido presente en la muestra de alimentos con pH ajustado para proporcionar una muestra de alimentos con pH ajustado, añadir un segundo agente de ajuste de pH a la muestra de alimentos con pH ajustado para proporcionar una muestra de alimentos que tenga un pH en el rango de pH 6,5-9 para su uso en el paso b), b) hacer contacto con una muestra de alimentos con un sustrato peptídico, donde el sustrato peptídico comprende un péptido que comprende un agente fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm, un agente no fluorescente que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, para extinguir dicha emisión de dicho agente fluorescente, y un sitio de escisión situado entre dicho agente fluorescente y el primer agente no fluorescente, donde el sitio de escisión es escindible por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos de un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho primer grupo de microbios que deteriora los alimentos, c) monitorizar la fluorescencia de la muestra que contiene el sustrato peptídico en el paso b), donde un aumento de la fluorescencia es indicativo para la presencia de un microbio que deteriora los alimentos de dicho primer grupo, donde la muestra de alimentos es un producto lácteo.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para detectar microbios que deterioran los alimentos
Campo de la invención
[0001] La presente invención se refiere a un método para detectar microbios que deterioran los alimentos. La invención también se refiere a un kit para llevar a cabo el método de la invención.
Estado de la técnica
[0002] A pesar de mejores esfuerzos dentro de la industria alimenticia, los productos alimenticios, tales como los productos lácteos y las bebidas, como la cerveza y los zumos de frutas, pueden contaminarse con microorganismos que deterioran los alimentos, lo que da como resultado una vida útil más corta, productos menos sabrosos y, en algunos casos, riesgos para la salud.
[0003] En la industria láctea, la leche cruda se somete a diferentes tratamientos térmicos y de otro tipo para eliminar los microorganismos patógenos y para aumentar la vida útil de los productos lácteos. La pasteurización se aplica principalmente a determinados productos alimenticios, como la leche, para reducir el riesgo microbiológico y aumentar su capacidad de conservación. La pasteurización no está destinada a matar todos los microorganismos patógenos en alimentos o líquidos. El UHT (tratamiento ultra térmico) también se utiliza para el tratamiento de la leche. El procesamiento u Ht mantiene la leche a una temperatura de 138 °C durante una fracción de segundo. En países, como la India, donde la leche se produce de forma no estandarizada, la pasteurización y/o el procesamiento UHT no siempre son eficaces para inactivar los microorganismos de deterioro, lo que da como resultado una leche con una vida útil más corta. Actualmente, no existe una prueba rápida para determinar si la pasteurización y/o el procesamiento UHT han sido eficaces. Las muestras deben cultivarse para permitir que se realice un recuento bacteriano a fin de determinar si una muestra está contaminada o no.
[0004] La WO2016/018798 se refiere a métodos in vitro para detectar un biomarcador de inflamación, infección y/o actividad bacteriana en una muestra de leche a partir de una vaca, que indican problemas con la propia leche (es decir, deterioro) o problemas relacionados con la salud de la vaca (es decir, mastitis).
[0005] En la industria cervecera, existe la necesidad de determinar si un lote se ha contaminado con bacterias que deterioran la cerveza, tales como Lactobacillus lindneri, Lactobacillus brevis y Pediococcus damnosus. La PCR se ha usado para detectar microorganismos que deterioran la cerveza (S. Borg, 2016, 229, Proceedings of World Brewing Congress), sin embargo, la PCR todavía requiere 24-48 horas para determinar la presencia de bacterias que deterioran. Aun se necesita una prueba rápida para que se produzcan retrasos mínimos en el proceso de producción.
[0006] MicroSnap™ Listeria spp. (Hygenia) es una prueba para la detección y enumeración de bacterias Listeria. La prueba usa una reacción de prueba bioluminogénica que genera luz cuando las enzimas que son características de las bacterias E. Coli reaccionan con sustratos especializados. Luego, la señal generadora de luz se cuantifica en el luminómetro EnSURE™. Los resultados están disponibles en 24 horas. Sin embargo, este método se basa en un enriquecimiento de las bacterias Listeria. Se requiere una prueba rápida e in situ para proporcionar un método rápido de producción para que los procesos de fabricación alimenticia no se retrasen innecesariamente.
[0007] Un objeto de la presente invención es proporcionar un método rápido para la determinación de microbios que deterioran los alimentos.
Resumen de la invención
[0008] La presente invención busca proporcionar un método para detectar microbios que deterioran los alimentos en una muestra de alimentos que comprende:
a) añadir un primer agente de ajuste de pH a una muestra de alimentos para proporcionar una muestra de alimentos que tiene un pH en el rango de pH 1 a 5, separar cualquier precipitado sólido presente en la muestra de alimentos con pH ajustado para proporcionar una muestra de alimentos con pH ajustado y añadir un segundo agente de ajuste de pH a la muestra de alimentos con pH ajustado para proporcionar una muestra de alimentos que tiene un pH en el rango de pH 6,5-9, que se usará en el paso b),
b) poner en contacto una muestra de alimentos con un sustrato peptídico, donde el sustrato peptídico comprende un péptido que comprende un agente fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm, un agente no fluorescente que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, para extinguir dicha emisión de dicho agente fluorescente, y un sitio de escisión situado entre dicho agente fluorescente y dicho agente no fluorescente, donde el sitio de escisión es escindible por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos que pertenece a un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos de microbios que deterioran los alimentos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho primer grupo de microbios que deterioran los alimentos,
c) monitorizar la fluorescencia de la muestra que contiene el sustrato peptídico en el paso b), donde un aumento de la fluorescencia es indicativo de la presencia de un microbio que deteriora los alimentos que pertenece a dicho primer grupo de microbios que deterioran los alimentos,
donde la muestra de alimentos es un producto lácteo.
[0009] Según la presente invención, se proporciona un método, como se ha definido anteriormente, que permite la detección rápida y específica de microorganismos que provocan el deterioro de los alimentos. En presencia de una proteasa que reconoce y escinde el sitio de escisión, la escisión del péptido en el sitio de escisión da como resultado la liberación del primer agente no fluorescente del sustrato peptídico y, como resultado, una señal fluorescente es detectable por un detector adecuado. Una ventaja del presente método es que se puede llevar a cabo en las muestras de alimentos crudos sin la necesidad de enriquecer la población de microbios, por ejemplo, cultivando los microbios. Como resultado, el presente método es capaz de detectar la contaminación bacteriana dentro de, por ejemplo, 10 minutos después de poner en contacto el sustrato peptídico con la muestra de alimentos.
[0010] Sin pretender imponer ninguna teoría, los inventores postulan que la longitud de onda de emisión del agente fluorescente permite que se detecte la fluorescencia en una región de fluorescencia de fondo mínima. Los métodos del estado de la técnica se basan en la monitorización por debajo de la región de 600 mediante, por ejemplo, detección bioluminérgica o colorimétrica simple. La monitorización por debajo de la región de 600 nm, sin embargo, proporciona una sensibilidad insuficiente debido a la emisión de fondo provocada por la autoluminiscencia y/o autofluorescencia de aminoácidos, tales como triptófano, tirosina y fenilalanina. El método según la presente invención es capaz de detectar la presencia de microbios que deterioran los alimentos en una muestra de alimentos sin la necesidad de enriquecer la población microbiana.
[0011] La invención también proporciona un kit para la detección de microbios que deterioran los alimentos que comprende:
a) un tubo que contiene un sustrato peptídico que comprende un agente fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm, un agente no fluorescente que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, para extinguir dicha emisión de dicho agente fluorescente, y un sitio de escisión situado entre dicho agente fluorescente y dicho agente no fluorescente, donde el sitio de escisión es escindible por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos que pertenece a un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos de microbios que deterioran los alimentos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho primer grupo de microbios que deterioran los alimentos,
b) un tubo que comprende un primer agente de ajuste de pH seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido tricloroacético y ácido cítrico, y
c) un tubo que contiene un segundo agente de ajuste de pH seleccionado preferiblemente del grupo que consiste en hidróxido de sodio, tampón tris de acetato de sodio y tampón de fosfato de sodio.
Descripción de formas de realización
[0012] La presente invención se refiere a un método para detectar microbios que deterioran los alimentos que comprende:
a) añadir un primer agente de ajuste de pH a una muestra de alimentos para proporcionar una muestra de alimentos que tiene un pH en el rango de pH 1 a 5, separar cualquier precipitado sólido presente en la muestra de alimentos con pH ajustado, y añadir un segundo agente de ajuste de pH a la muestra de alimentos con pH ajustado para proporcionar una muestra de alimentos que tenga un pH en el rango de pH 6,5-9 que se va a usar en el paso b),
b) poner en contacto una muestra de alimentos con un sustrato peptídico, donde el sustrato peptídico comprende un péptido que comprende un agente fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm, un agente no fluorescente que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, para extinguir dicha emisión de dicho agente fluorescente, y un sitio de escisión situado entre dicho agente fluorescente y dicho agente no fluorescente, donde el sitio de escisión es escindible por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos que pertenece a un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos de microbios que deterioran los alimentos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho primer grupo de microbios que deterioran los alimentos,
c) monitorizar la fluorescencia de la muestra que contiene el sustrato peptídico en el paso b), donde un aumento de la fluorescencia es indicativo de la presencia de un microbio que deteriora los alimentos que pertenece a dicho primer grupo de microbios que deterioran los alimentos,
donde la muestra de alimentos es un producto lácteo.
[0013] El término "deterioro de los alimentos", como se utiliza en este caso, significa un cambio insatisfactorio en las características sensoriales de un producto alimenticio como resultado de la contaminación mediante mohos, levadura y bacterias.
[0014] El término "microbios que deterioran los alimentos", como se utiliza en este caso, significa mohos, levadura o bacterias que provocan el deterioro de los alimentos.
[0015] El término "muestra de alimentos", como se utiliza en este caso, significa un alimento o una bebida. El alimento puede ser un sólido o un fluido. Preferiblemente, el alimento es un fluido, más preferiblemente un líquido.
[0016] El término "péptido", como se utiliza en este caso, significa un oligómero que comprende al menos 3 aminoácidos. Preferiblemente, el peptídico comprende no más de 20 aminoácidos. Preferiblemente, el peptídico comprende entre 4 y 20 aminoácidos, más preferiblemente entre 6 y 15 aminoácidos. Los aminoácidos usados pueden ser cualquier aminoácido, preferiblemente elegido del grupo de aminoácidos de origen natural o del grupo de aminoácidos sintéticos, en particular, derivados de aminoácidos naturales.
[0017] El término "sitio de escisión", como se utiliza en este caso, significa un motivo de aminoácido que es escindido por un compuesto específico, por lo que el sitio de escisión comprende uno o más enlaces amida. El sitio de escisión puede tener la estructura XYZ, donde X es al menos un aminoácido, Y es una porción de estructura molecular compuesta por al menos dos aminoácidos y Z es al menos un aminoácido. Los aminoácidos son preferiblemente aquellos que permiten la unión del compuesto que efectúa la escisión del primer sitio de escisión.
[0018] El término "proteasa", como se utiliza en este caso, significa una proteína secretada por o presente en la membrana de un microbio capaz de escindir un motivo de aminoácido, por ejemplo, una enzima, en otras palabras, una proteasa o transpeptidasa
[0019] El término "un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos de microbios que deterioran los alimentos", como se utiliza en este caso, significa una clase de microbios que comparten la capacidad de escindir el sitio de escisión presente en el sustrato peptídico.
[0020] El término "limitado" significa que dicho grupo no comprenderá todos los microbios, o todas las bacterias, es decir, un número limitado, de modo que la liberación del agente no fluorescente es de hecho indicativa de uno o más microbios que deterioran los alimentos, pero no de todos ni de ninguno de los microbios o las bacterias, etc.
[0021] Se ha descubierto que al reducir el pH de una muestra de alimentos fluidos a un pH de entre 1 a 5, el material proteínico que tiene un punto isoeléctrico en el rango de pH 1 a 5 puede eliminarse fácilmente cuando se precipita, de modo que la proteína que puede provocar ruido de fondo en las mediciones de muestras de alimentos se puede eliminar fácilmente sin afectar a la actividad de las proteasas que permanecen en la solución a un pH de 1 a 5. A continuación, se ajusta el pH de la solución resultante para llevar el pH a un pH en el intervalo de pH de 6,5 a 9. Preferiblemente, dicha eliminación de material proteínico se realiza cuando la muestra de alimentos es un producto lácteo, por ejemplo, yogur, nata o leche.
[0022] Se añade un primer agente de ajuste de pH a una muestra de alimentos fluidos para proporcionar una muestra de alimentos que tiene un pH en el rango de pH 2 a 5, más preferiblemente pH 3 a 5, aun más preferiblemente pH 4 a 5. Se añade un segundo agente de ajuste de pH a la muestra de fluidos resultante para proporcionar una muestra de alimentos fluidos que tiene un pH en el rango de pH 7,5-9, más preferiblemente pH 8 a 9.
[0023] Separar el precipitado sólido del resto de la muestra se puede realizar mediante, por ejemplo, centrifugación, filtración o decantación. Preferiblemente, el precipitado sólido se separa mediante centrifugación.
[0024] En una forma de realización preferida, el primer agente de ajuste de pH se selecciona del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido tricloroacético y ácido cítrico.
[0025] En una forma de realización, el segundo agente de ajuste de pH se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de sodio, acetato de sodio, tampón tris y tampón fosfato.
[0026] En la invención, la muestra de alimentos es un producto lácteo.
[0027] En una forma de realización preferida, el producto lácteo es yogur, queso, mantequilla, cuajada, nata o leche, preferiblemente leche.
[0028] La muestra de alimentos se puede someter a un proceso de pasteurización o UHT. El muestreo de una muestra de alimentos después de la pasteurización o el tratamiento del proceso UHT proporciona una indicación de si el paso del tratamiento ha tenido éxito en la eliminación de los microorganismos que deterioran los alimentos de la muestra.
[0029] Preferiblemente, el sitio de escisión es escindido por una proteasa proporcionada por bacterias de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Arthrobacter, Alicylcobacillus, Lactobacillus, Listeria, Microbacterium, Micrococcus y Streptococcus. Preferiblemente, las bacterias se seleccionan del grupo de Alicyclobacillus, Bacillus y Listeria. Preferiblemente, las bacterias se seleccionan del grupo de A. acidoterrestris, A acidiphilus, A pomorum, A fastidiosus.
[0030] En algunas formas de realización preferidas, el sitio de escisión es un sustrato para una serina proteasa o serina transpeptidasa. Preferiblemente, la proteasa serinica pertenece al grupo EC.3.4.21.62, por ejemplo, subtilisina, o el grupo EC.3.4.24.2, por ejemplo, pseudolisina.
[0031] Preferiblemente, el sitio de escisión tiene la estructura XYZ, donde X es al menos un aminoácido, Y es una porción de estructura molecular compuesta por al menos dos aminoácidos y Z es al menos un aminoácido. X y Z pueden ser cualquier aminoácido. Preferiblemente, Y comprende un dipéptido que consiste en un aminoácido alifático, hidrofóbico y un ácido aromático o cíclico de amino o un aminoácido básico y un aminoácido hidrófilo. El aminoácido hidrofóbico alifático se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en glicina, alanina, leucina, valina y derivados de las mismas. El aminoácido aromático o cíclico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en fenilalanina, tirosina, triptófano, prolina y derivados de las mismas. El aminoácido básico es preferiblemente lisina y el aminoácido hidrófilo es preferiblemente treonina o serina.
[0032] Preferiblemente, Y comprende un dipéptido que es una combinación de alanina-fenilalanina, alaninatriptófano, alanina-prolina o lisina-treonina, más preferiblemente, Y es una combinación de alanina-fenilalanina, alanina-triptófano, alanina-prolina.
[0033] Preferiblemente, el péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AAAFALAC (SEQ ID NO: 1), AAFAALAC (SEQ ID NO: 2), AAAAFLAC (SEQ ID NO: 3), FAAAALAC (SEQ ID NO: 4), FAAFALAC (SEQ ID NO: 5).
[0034] En una forma de realización preferida, el péptido tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AAAFALAC (SEQ ID NO: 1), AAFAALAC (SEQ ID NO: 2), AAAAFLAC (SEQ ID NO: 3), FAAAALAC (SEQ ID NO: 4), FAAFALAC (SEQ ID NO: 5), donde el sustrato peptídico es escindido por proteasa de Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Arthrobacter, Microbacterium, Micrococcus y Streptococcus. En esta forma de realización, el método según la invención permite monitorizar la contaminación por los organismos que deterioran los alimentos más predominantes. Dicha monitorización es importante, por ejemplo, en la industria láctea, cuando la presencia de cualquiera de las bacterias que deterioran los alimentos en un producto lácteo puede reducir la vida útil, dar lugar a un producto desagradable o suponer un riesgo de salud si se consume.
[0035] En otra forma de realización preferida, el sitio de escisión es escindido por una proteasa proporcionada por bacterias de los géneros Bacillus y donde el péptido comprende un sitio de escisión AAAFALAC (SEQ ID NO:
1 ).
[0036] Preferiblemente, el péptido es un sustrato para una proteasa proporcionada por bacterias de los géneros Listeria, por ejemplo, Listeria monocytogenes y el péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en AANAKTNC (SEQ ID NO: 6 ), AANKVTNC (SEQ ID NO: 7), ALNKVTNC (SEQ ID NO: 8 ), ALNAKTNC (SEQ ID NO: 9). Cuando el péptido tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 6 -SeC ID NO: 9, el péptido contiene un sitio de escisión específico para Listeria monocytogenes, de modo que es el sustrato peptídico escindido por una proteasa proporcionada específicamente por Listeria monocytogenes, pero no por un microbio que deteriora los alimentos que pertenece a dicha especie de microbios que deterioran los alimentos.
[0037] En otra forma de realización preferida, el sustrato comprende un segundo sitio de escisión que es escindido por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los microbios de un segundo grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho segundo y/o primer grupo.
[0038] En otra forma de realización, el segundo sitio de escisión no es el mismo que el primer sitio de escisión.
[0039] Preferiblemente, el agente fluorescente es un tinte de cianina que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm y el agente no fluorescente es un tinte de cianina que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm.
Figure imgf000006_0001
Fórmula I
[0040] En una forma de realización, el primer agente fluorescente es un tinte de cianina que tiene la fórmula general como se muestra en la fórmula I, donde R 1 se selecciona del grupo que consiste en H, halo, y
Figure imgf000006_0002
donde R 17 se selecciona del grupo que consiste en carboxilo, amino y sulfanato; X se selecciona del grupo que consiste en O, S, NH y N-hidrocarbilo; R2, R3, R9, R 10 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H e hidrocarbilo; R4, R5, R11, R 12 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H, hidrocarbilo y sulfanato o junto con los átomos a lo que están unidos forman un anillo aromático; R6, R7, R13, R 14 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en H e hidrocarbilo; R 8 y R 15 se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en hidrocarbilo, (CH2)qFG o (CH 2 )PLN, donde al menos uno de R 8 y R 15 es (CH 2 )qFG, donde q es un número entero de 1 a 20 y FG es un grupo funcional que no reacciona directamente con grupos carboxilo, hidroxilo, amino o tiol, donde p es un número entero de 1 a 20 y LN es un grupo conector que reacciona con grupos carboxilo, hidroxilo, amino o tiol; R 16 es H o hidrocarbilo.
[0041] Preferiblemente, el agente fluorescente es un agente donde R 1 es
Figure imgf000006_0003
donde X es O y R 17 es SO 3 Na; R2, R3, R9, R 10 son hidrocarbilo, preferiblemente metilo; R 4 y R 11 son H y R 5 y R 12 son H o sulfanato; R6, R7, R13, R 14 son H; R 8 es (CH 2 )qFG, donde q es 4 y FG es sulfanato; R 15 es (CH 2 )PLN, donde p es 5 y LN es carboxilo; R 16 es H.
[0042] Aun más preferiblemente, el agente fluorescente es un agente donde R 1 es
Figure imgf000006_0004
donde X es O y R17 es SO 3 Na; R2, R3, R9, R 10 son metilo; R 4 y R 11 son H y R 5 y R 12 son sulfanato; R6, R7, R13, R 14 son H; R 8 es (CH 2 )qFG, donde q es 4 y FG es sulfanato; R 15 es (CH 2 )PLN, donde p es 5 y LN es carboxilo; R 16 es H. Preferiblemente, el agente fluorescente es un agente correspondiente a la fórmula II.
Figure imgf000007_0001
Formula II
[0043] El agente no fluorescente, que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, es un compuesto que tiene poca o ninguna fluorescencia intrínseca y que puede extinguir eficazmente la fluorescencia de un fluoróforo próximo con poco fondo. En una forma de realización, el agente no fluorescente es una molécula de cianina. Las moléculas de cianina, también denominadas tintes de cianina, incluyen compuestos que tienen dos anillos heterocíclicos que contienen nitrógeno, sustituidos o no sustituidos, unidos por una cadena de polimetina.
[0044] En una forma de realización preferida, el agente no fluorescente es un agente donde R 1 es cloro, R2, R3, R9, R 10 son metilo; R 4 es H y R 5 es N-hidrocarbilo, preferiblemente N[(CH 2 ) 3 SO 3 Na] 2 ; R 11 y R 12 forman un anillo aromático monosustituido con grupo sulfanato; R6, R7, R13, R 14 son H; R 8 es (CH 2 )qFG, donde q es 3 y FG es sulfanato; R 15 es (CH 2 )PLN, donde p es 5 y LN es carboxilo; R 16 es H.
[0045] En otra forma de realización, el agente fluorescente y el no fluorescente son el mismo agente, preferiblemente donde R 1 es
Figure imgf000007_0002
en X es O y R 17 es SO 3 Na; R2, R3, R9, R 10 son hidrocarbilo, preferiblemente metilo; R4, R5, R11, R 12 son H; R6, R7, R13, R 14 son H; R 8 es (CH 2 )qFG, donde q es 4 y FG es sulfanato; R 15 es (CH 2 )PLN, donde p es 5 y LN es carboxilo; R 16 es H.
[0046] El agente no fluorescente también puede ser una fracción de extinción rápida, por ejemplo BHQ3, (Biosearch) QC-1 (Li-COR.com), o partículas que comprenden dichos compuestos, por ejemplo, nanopartículas de oro y nanopartículas de hierro. En una forma de realización, el sustrato peptídico es una nanopartícula que comprende un péptido tal y como se define aquí.
[0047] Los ejemplos de agentes fluorescentes que se puede usar en la presente invención incluyen, pero de forma no limitativa, Alexa Fluor@ 660, Alexa Fluor@ 680, Alexa Fluor@ 700, Alexa Fluor@ 750 At To 680, ATTO 700, DY-647, DY-650, DY-673, DY-675, DY-676, DY-680, DY-681 , DY- 682, DY-690, DY-700, DY-701 , DY-730, DY-731 , DY-732, DY-734, DY-750, DY-751 , DY-752, DY-776, DY-781 , DY-782, DY-831, La Jolla Blue, Cy5, Cy5.5, Cy7, IRDye® 800CW, IRDye® 38, IRDye® 800RS, IRDye® 700DX, IRDye® 680, entre otros. Los tintes "Alexa Fluor" están disponibles en Molecular Peptides Inc., Eugene, OR, EE. UU. (www.peptides.com). Los tintes "ATTO" están disponibles en ATTO-tec GmbH, Siegen, Alemania (www.atto-tec.com). Los tintes "DY" están disponibles en Dyomics GmbH, Jena, Alemania (www.dyomics.com). La Jolla Blue está disponible en Hyperion Inc. Los tintes "Cy" están disponibles en Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EE. UU. (www.amersham.com). "IRDye® infrared dyes" están disponibles en LI-COR® Bioscience, Inc. Lincoln, N E, EE. UU. (www.licor.com).
[0048] Preferiblemente, el método no comprende un paso de enriquecimiento de la población de microbios. Ventajosamente, la presente invención puede detectar la presencia de microorganismos que deterioran los alimentos sin necesidad de enriquecer primero el número de microorganismos presentes cultivando la muestra durante varias horas.
[0049] En una forma de realización, el método comprende poner en contacto la muestra con un sustrato peptídico que comprende un segundo péptido que comprende un segundo sitio de escisión que es escindido por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos de un segundo grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que pertenezca a dicho segundo o primer grupo.
[0050] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit para la detección de microbios que deterioran los alimentos que comprende:
a) un tubo que contiene un sustrato peptídico que comprende un agente fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión de 650900 nm, un agente no fluorescente que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, para extinguir dicha emisión de dicho agente fluorescente, y un sitio de escisión situado entre dicho agente fluorescente y dicho agente no fluorescente, donde el sitio de escisión es escindible por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos que pertenece a un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos de microbios que deterioran los alimentos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho primer grupo de microbios que deterioran los alimentos,
b) un tubo que comprende un primer agente de ajuste de pH preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido tricloroacético y ácido cítrico,
c) un tubo que comprende un segundo agente de ajuste de pH preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de sodio, acetato de sodio, tampón tris y tampón fosfato.
[0051] En una forma de realización preferida, el kit comprende un dispositivo para monitorizar la fluorescencia, donde dicho dispositivo está adaptado para recibir un tubo que contiene una muestra de alimentos y el sustrato peptídico.
[0052] Las formas de realización descritas para el método se aplican mutatis mutandis al kit según la presente invención.
[0053] Ventajosamente, el kit permite detectar de forma sencilla microbios que deterioran los alimentos sin la necesidad de cultivar primero la muestra. El kit se puede usar en un entorno de producción y no requiere equipo de laboratorio especializado.
[0054] La presente invención se ha descrito anteriormente con referencia a varias formas de realización ejemplares, como se muestra en los dibujos. Son posibles modificaciones e implementaciones alternativas de algunas partes o algunos elementos. El alcance de la protección se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0055] La figura 1 muestra un gráfico de URF frente al tiempo para muestras de leche contaminadas con Pseudomonas aeruginosa (círculo), Bacillus cereus (cruz) y Ochrobactrum anthropi (triángulo).
Ejemplos
Ejemplo 1
[0056] El péptido 1 QC-1-AAAFALAC-IRDie800CW se obtuvo mediante métodos estándar de síntesis de péptidos en fase sólida. El agente fluorescente IRDye800CW y el agente no fluorescente QC-1 (extintor) se obtuvieron a partir de LI-COR (Nebraska, EE. UU.).
[0057] Alcalase, Sigma Aldrich P4860: la solución contiene 150 mg/mL de alcalasa.
[0058] La fluorescencia se monitorizó a lo largo del tiempo usando un instrumento Cary Eclipse, ajustes: Ex. Longitud de onda: 720 nm; Em. Longitud de onda: 785 nm; Ex. Ranura 10 nm; Em. Ranura 10 nm; Ave. Tiempo 0,1 s; Ex. Filtro y Em. Filtro: Auto
Método general
[0059] Se diluyeron 100 pL de leche o vacío (tampón de fosfato de sodio, pH 8 ) en 1,5 mL de agua milliQ. Se añadieron 100 pL de la muestra diluida a 1 mL, tampón de fosfato de sodio 0,1 M pH 8 , 1,9 mL de agua MQ, 30 pl de péptido 1,10, 2,5 o 0,5 ng/pl de una solución de 123,8 ng/pl de alcalasa, una proteasa secretada por Bacillus licheniformis, un microorganismo que se encuentra en la leche cruda.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Método para detectar un microbio que deteriora los alimentos en una muestra de alimentos que comprende: a) añadir un primer agente de ajuste de pH a una muestra de alimentos para proporcionar una muestra de alimentos que tiene un pH en el rango de pH 1 a 5, separar cualquier precipitado sólido presente en la muestra de alimentos con pH ajustado para proporcionar una muestra de alimentos con pH ajustado, añadir un segundo agente de ajuste de pH a la muestra de alimentos con pH ajustado para proporcionar una muestra de alimentos que tenga un pH en el rango de pH 6,5-9 para su uso en el paso b),
b) hacer contacto con una muestra de alimentos con un sustrato peptídico, donde el sustrato peptídico comprende un péptido que comprende un agente fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm, un agente no fluorescente que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, para extinguir dicha emisión de dicho agente fluorescente, y un sitio de escisión situado entre dicho agente fluorescente y el primer agente no fluorescente, donde el sitio de escisión es escindible por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos de un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho primer grupo de microbios que deteriora los alimentos,
c) monitorizar la fluorescencia de la muestra que contiene el sustrato peptídico en el paso b), donde un aumento de la fluorescencia es indicativo para la presencia de un microbio que deteriora los alimentos de dicho primer grupo,
donde la muestra de alimentos es un producto lácteo.
2. Método según la reivindicación 1, donde el primer agente de ajuste de pH se selecciona del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido tricloroacético y ácido cítrico.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, donde el segundo agente de ajuste de pH se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de sodio, acetato de sodio, tampón tris y tampón fosfato.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el producto lácteo es yogur, queso, mantequilla, cuajada, nata o leche, preferiblemente leche.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el sitio de escisión es escindido por una proteasa proporcionada por bacterias de los géneros Pseudomonas, Alicydobacillus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Arthrobacter, Lactobacillus, Listeria, Microbacterium, Micrococcus y Streptococcus.
6 . Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el péptido comprende un sitio de escisión seleccionado del grupo que consiste en AAAFALAC (SEQ ID NO: 1 ), AAFAALAC (SEQ ID NO: 2), AAAAFLAC (SEQ ID NO: 3), FAAAALAC (SEQ ID NO: 4), FAAFALAC (SEQ ID NO: 5).
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el sitio de escisión es escindido por una proteasa proporcionada por bacterias de los géneros Bacillus y donde el péptido comprende un sitio de escisión AAAFALAC (SEQ ID NO: 1).
8 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el primer sitio de escisión es escindido por una proteasa proporcionada por Listeria monocytogenes y el péptido comprende un sitio de escisión seleccionado del grupo que consiste en AANAKTNC (SEQ ID NO: 6 ), AANKVTNC (SEQ ID NO: 7), ALNKVTNC (SEQ ID NO: 8 ), ALNAKTNC (SEQ ID NO: 9).
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde dicho agente fluorescente es un tinte de cianina que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm y donde el agente no fluorescente es un tinte de cianina que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el método no comprende un paso de enriquecer la población de microbios.
11. Kit para la detección de microorganismos que alteran los alimentos que comprende:
a) un tubo que contiene un sustrato peptídico que comprende un péptido que comprende un agente fluorescente que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm, un agente no fluorescente que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm, para extinguir dicha emisión de dicho agente fluorescente, y un sitio de escisión situado entre dicho agente fluorescente y dicho agente no fluorescente, donde el sitio de escisión es escindible por una proteasa proporcionada específicamente por un microbio que deteriora los alimentos de un primer grupo que consiste en un número limitado de cepas, especies o géneros microbianos de microbios que deterioran los alimentos, y no es escindido por ningún compuesto proporcionado por ningún microbio que no pertenezca a dicho primer grupo de microbios que alteran los alimentos, preferiblemente donde el sitio de escisión es escindido por una proteasa proporcionada por bacterias de los géneros Pseudomonas, Alicydobacillus, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Arthrobacter, Lactobacillus, Listeria, Microbacterium, Micrococcus y Streptococcus,
b) un tubo que comprende un agente de ajuste de pH seleccionado del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido acético, ácido tricloroacético y ácido cítrico,
c) un tubo que comprende un segundo agente de ajuste de pH seleccionado del grupo que consiste en hidróxido de sodio, acetato de sodio, tampón tris y tampón fosfato.
12. Kit según la reivindicación 11, que comprende un dispositivo para monitorizar la fluorescencia, donde dicho dispositivo está adaptado para recibir un tubo que contiene una muestra de alimentos y el sustrato peptídico.
13. Kit según la reivindicación 11 o 12, donde el péptido comprende un sitio de escisión seleccionado del grupo que consiste en AAAFALAC (SEQ ID NO: 1), AAFAALAC (SEQ ID NO: 2), AAAAFLAC (SEQ ID NO: 3), FAAAALAC (SEQ ID NO: 4), FAAFALAC (SEQ ID NO: 5), AANAKTNC (SEQ ID NO: 6 ), AANKVTNC (SEQ ID NO: 7), ALNKVTNC (SEQ ID NO: 8 ), ALNAKTNC (SEQ ID NO: 9).
14. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 11-13, donde dicho agente fluorescente es un tinte de cianina que tiene una longitud de onda de emisión de 650-900 nm y donde el agente no fluorescente es un tinte de cianina que tiene una longitud de onda de absorción de 650-900 nm.
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