JP4767863B2 - 比色基質、比色センサー、および使用方法 - Google Patents
比色基質、比色センサー、および使用方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、試料中のタンパク質、酵素、または微生物の存在または非存在の検出に有用な組成物および方法を包含する。本発明は、基質が改変を受けた時点を示す検出可能なシグナルを生成する比色成分を含んでなる、基質、典型的にはタンパク質またはペプチドを含む。改変は、タンパク質、例えば酵素に接触し、そして基質の改変、例えば酵素切断をもたらす基質の結果であることができる。
ペプチドの例は、本明細書中に記載の基質、ならびにタンパク質との相互作用により改変を受ける当該技術分野で公知のペプチドを含む。サンダーズ(Mitchell C.Sanders)による2001年5月3日付けの米国特許出願番号第09/848,781号、名称「細菌汚染検出装置および使用方法」およびサンダーズら(Mitchell C.Sanders,et al.)による2002年5月28日付けの米国仮出願番号第60/383,847号、名称「微生物の検出方法」は、かかるペプチドを記載しそしてそれらの教示はその全体を本明細書に編入する。
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES(本明細書中では「配列番号1」と称し、ここで配列番号1の「X」記号はいかなるアミノ酸であってもよい)、
KAAHKSALKSAE(本明細書中では「配列番号2」、または「Papal」と称する)、
KKASEAAHKSALKSAE(本明細書中では「配列番号3」、または「Papa2」と称する)、
CHHHASEAAHKSALKSAE(本明細書中では「配列番号4」、または「Papa3」と称する)、
KHLGGGALGGGAKE(本明細書中では「配列番号5」、または「Palal」と称する)、
KHLGGGGGAKE(本明細書中では「配列番号6」、または「Papgl」と称する)、
ACCDEYLQTKE(本明細書中では「配列番号7」、または「Pl」と称する)、
ADTVEPTGAKE(本明細書中では「配列番号8」、または「P2」と称する)、
KLPHKLSWSADNP(本明細書中では「配列番号9」、または「P3」と称する)、
PVPSTPPTPSPSTP(本明細書中では「配列番号10」、または「A1」と称する)、
NMLSEVERE(本明細書中では「配列番号11」、または「M1」と称する)、
KQNMLSEVERADTE(本明細書中では「配列番号12」、または「M2」と称する)、
NEAIQEDQVQYE(本明細書中では「配列番号13」、または「Ssp1」または「SAP2」と称する)、
ETKVEENEAIQK(本明細書中では「配列番号14」、または「Ssp2」と称する)、
DSRPVRRRRRPRVSK(本明細書中では「配列番号15」、または「T1」と称する)、
KVSRRRRRGGD(本明細書中では「配列番号16」、または「T2」と称する)、
KKASEVSRRRRRGGK(本明細書中では「配列番号17」、または「T3」と称する)、
CHHHASEVSRRRRRGGK(本明細書中では「配列番号18」、または「T4」と称する)、
KEKIGKEFKRIVQE(本明細書中では「配列番号19」、または「LL1」と称する)、
KVQRIKDFLRNLVE(本明細書中では「配列番号20」、または「LL2」と称する)、
EAAGAMFLEAIPK(本明細書中では「配列番号21」、または「CPI1」と称する)、
EGAMFLEAIPMSIPK(本明細書中では「配列番号22」、または「CPI2」と称する)、
CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH(本明細書中では「配列番号23」、または「CPI3」と称する)、
KARRRRRGGGAMFLEAIPMSIPCGC(本明細書中では「配列番号24」、または「CPI4」と称する)、
VSRRRRRGGDGDGC(本明細書中では「配列番号25」、または「JMH001」と称する)、
GGDGDGC(本明細書中では「配列番号26」、または「JMH002」と称する)、
VSRRRRRGGDGKGDAC(本明細書中では「配列番号27」、または「JMH003」と称する)、
NEAIQEDQVQARRAKARRAC(本明細書中では「配列番号28」、または「JMH004」と称する)、
QVQARRAKARRAC(本明細書中では「配列番号29」、または「JMH005」と称する)、
GGDGKGDAC(本明細書中では「配列番号30」、または「JMH006」と称する)、
QVQARRRAKARRRAC(本明細書中では「配列番号31」、または「JMH007」と称する)、
VSRRRRRGGKGC(本明細書中では「配列番号32」、または「JMH008」と称する)、
SVTRRRRRGGRASGGC(本明細書中では「配列番号33」、または「DEB001」と称する)、
SEAIQEDQVQYCAAAHHHHH(本明細書中では「配列番号34」、または「SSP3」と称する)、
KARRRRRGGDGDGCGC(本明細書中では「配列番号35」、または「T5」と称する)、
HHHHHSRRRRRGGCGC(本明細書中では「配列番号36」、または「T6」と称する)、
HHHHHSVQRIKDFLRNLVCGC(本明細書中では「配列番号37」、または「LL3」と称する)、
RRRRRSVQRIKDFLRNLVCGC(本明細書中では「配列番号38」、または「LL4」と称する)、
HHHHHAAHKSALKSACGC(本明細書中では「配列番号39」、または「Papa4」と称する)、
RRRRRAAHKSALKSACGC(本明細書中では「配列番号40」、または「Papa5」と称する);
Alt誘導ペプチド、例えばPGTKLYTVPW−ピレン(これはブドウ球菌(Staphylococci)細菌の表面に結合でき、配列PGTKLYTVPWは本明細書中では「配列番号41」と称する);
ペプチドグリカン、例えばN−アセチルグルコサミン〔b−1,4−N アセチルムラミン酸、N−アセチルムラミル−L−アラニン、またはリポテイコ酸;および
溶血素の検出のための色素を含む脂質小胞(多数の溶血素は孔形成性トキシンである規則性タンパク質複合体を形成し、そして脂質小胞から色素を放出し次いで疎水性固体支持体上への色素の拡散により検出できる)。本発明のいくつかの態様では、配列番号1の「X」メンバーはオルニチンである。
基質は、少なくとも1種の比色成分を用いて標識される。典型的には、比色成分は基質、タンパク質、またはペプチドに付着できる反応性色素である。いくつかの態様では、基質は少なくとも2種の比色成分(例えば少なくとも2、3、4、5、7、10、15種、またはそれ以上の比色成分)を用いて標識できる。比色成分は、基質が改変されると(例えばペプチドおよび/または1個もしくはそれ以上の基質からの比色成分の切断)シグナル(例えば目視できる色変化)を生成する。この方法では、比色成分は改変の存在または非存在を示すラベルまたはタグとして作用する。いくつかの態様では、シグナルは目視できる色の変化である。他の態様では、シグナルは、光スペクトルの可視バンド(例えば約700nm〜約400nm)内で検出される色の変化である。基質に多数の比色成分を付着させて、さらに目視可能な色または色変化を発生できる。さらなる態様では、基質は少なくとも2種の異なる比色成分を用いて標識される。かかる態様は色調の2種もしくはそれ以上の異なる変化を生成する可能性を生む。
Co.Deutschland KG,Frankfurt、ドイツ、および化学会社、例えばSigma Aldrich、Acros、Molecular Probe、およびICNから)、そして比色成分としての使用に適する。検出方法、応用、または製造物品に対して選択される色素のタイプまたは特定の種類は、色素の性質(例えばモル吸光係数)およびそれが使用される環境に依存する。
Blue)21、リアクティブ・オレンジ(Reactive Orange)78、リアクティブ・イエロー(Reactive Yellow)15、リアクティブ・ブルー(Reactive Blue)19、リアクティブ・ブルー(Reactive Blue)4、リアクティブ・レッド(Reactive Red)11、リアクティブ・イエロー(Reactive Yellow)86、リアクティブ・ブルー(Reactive Blue)163、リアクティブ・レッド(Reactive Red)180);モノおよびジハロゲントリアジン色素(例えばモノ−およびジ−フルオロトリアジン色素;モノ−およびジ−クロロトリアジン色素;モノ−(m’−カルボキシピリジニウム)トリアジン;リアクティブ・ブルー(Reactive Blue)4、リアクティブ・イエロー(Reactive Yellow)86;BASFから入手できる色素、染料、および着色料のPROCION(R)系列の色素;およびCiba−Geygyから入手できる石炭タール色素のCIBACRON(R)系列);2,4,5−トリハロゲノピリミニジン;2,3−ジハロキノキサリン;N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル(スルホ−NHS)エステル機能化色素;N−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)機能化色素;ビニルスルホン色素(例えばDyStar Textilfarben GmbH & Co.Deutschland KGにより製造される石炭タール染料のREMAZOL(R)系列、例えばREMAZOL(R)ブルー;およびリアクティブ・ブラック5);およびスルホニルクロリド色素(例えばリサミン・ローダミン(lissamine rhodamine)、およびダブシル(dabsyl)クロリド);テトラフルオロフェニルエステル機能化色素;イソチオシアナート機能化色素;およびヨードアセチル機能化色素を含む。本発明は、本明細書中に表示した色素に構造的に等価な色素も包含する。
いくつかの態様では、基質は固体支持体に付着される。適切な固体支持体の例は、創傷用包帯(例えば包帯またはガーゼ)、滅菌状態または微生物汚染を含まないことが要求されるいずれかの物質、試料を収容または集積するための物品(例えば蓄尿バッグ、血液集積バッグ、血漿集積バッグ、試験管、体液集積管、試験管、カテーテル、スワブ、スワブキャリヤ、ディップティック、またはマイクロプレートのウエル)、ポリマー、膜、樹脂、ガラス、スポンジ、剛性プローブもしくは毛管、介護定規(care ruler)の先端、ディスク、スコープ(scope)、フィルター、レンズ、発泡体、布、紙、ワイプ(wipe)、縫合糸、およびバッグを含む。本発明のいくつかの態様では、固体支持体は滅菌に適する物質から作製される。固体支持体を滅菌するために適合する方法には、ガンマ線照射処理および酸化エチレン処理が含まれる。いくつかの態様では、固体支持体が比色成分を含むかおよび/または固体支持体が比色成分から作製される。
いくつかの態様では、コレクターが、シグナルが検出可能となるように切断部分を除去するために使用される。本明細書中で使用される場合に、「コレクター」とは、基質の切断部分を誘引する性質を含んでなる固体または表面である。それらの態様では、1個もしくはそれ以上の切断部分は、基質の他の部分および/または固体支持体に対するよりもコレクターに対してより高い誘引性または親和性を有することができ、切断部分は、基質から離れそしてコレクターまたは基質の非切断部分もしくは改変された基質から離れたある場所に向かって移動、収着、および/または拡散する。いくつかの態様では、切断部分が移動する距離は、検出可能なシグナルがもたらされほど十分である。いくつかの態様では、切断部分の移動は検出可能なシグナルをもたらす。
工程1)関係する微生物を特有して同定するアミノ酸配列を定義する。あるいは病原体、例えば創傷特異性病原体の特定の群に特有である(1個もしくはそれ以上の)アミノ酸配列を決定できる。
工程2)酵素による基質の最適な改変を容易にする条件を決定するために十分なタンパク質を入手する。
工程3)微生物の生育のためおよび細胞の表面に現れるかまたは細胞により分泌されるタンパク質の産生のための条件を決定する。
工程4)活性タンパク質のいずれかの特異性基質を同定する。可能性がある基質の例は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、脂質、およびペプチドグリカンサブユニットを含む。検出可能なラベル、例えば本明細書中に記載の検出可能なラベル、またはその他の当該技術分野で公知の検出可能なラベルを用いて各基質を標識する。
工程5)(場合により)(例えば上記の比色成分を用いて)タンパク質の活性または結合部位を決定してタンパク質−基質相互作用の特異性を増加し、次いで活性または結合部位の生成に有用な遺伝子配列を決定し、そして特異性がさらに高い基質を生成するために決定された遺伝子配列をクローニングする。
工程6)関係する病原性細菌のプロテアーゼの検出のために上記に同定された検出可能に標識された1種もしくはそれ以上の基質を含んでなるバイオセンサーを準備する。
実施例
本発明は下記の実施例により説明され、それらはいかなる様式でも限定を意図しない。
本実施例では、ヒスチジンタグを有するペプチドが、共有結合した付着NTAにより不動体化されたニッケルイオンを含む樹脂(例えばSEPHAROSE(R))に結合した連続ヒスチジン残基の能力に基づいて精製される。
本実施例では、負に荷電した膜(膜ICE−450、Pall Corporation,East Hills,New Yorkから入手可能)が、ペプチドの末端(すなわちペプチドのアルギニン)に位置する正に荷電した領域を含むペプチドを結合するために使用された。ペプチドの切断された部分上に含まれる場合に、負に荷電した膜には低い親和性を有するが、しかし正に荷電したコレクター膜(膜SB−6407、Pall Corporation,East Hills,New Yorkから入手可能)には高い親和性を有する負に荷電した色素を用いてペプチドを標識した。この概念は、図12に示される。
多数のペプチド基質を反応性色素を用いて標識した。ビニルスルホン色素をペプチド上のシステイン基を標的にするために使用した。モノ−およびジ−クロロトリアジン色素をペプチド上のセリン基を標的にするために使用した。スルホニルクロリドおよびN−ヒドロキシスルホスクシンイミジル(スルホ−NHS)エステル色素をペプチド上のアミン基を標的にするために使用した。
本実施例は、基質が少なくとも2種の比色成分を含む本発明の態様を目的とする。ペプチドは2種の有色色素を用いる標識のための2個の標的アミノ酸を含む。色素が2種の異なるアミノ酸、例えばセリンおよびシステインを標的とする場合に、保護基は不要である。一種の有色色素をペプチドと反応させ、それを精製、濃縮し、次いでそれを第二の有色色素と反応させて標識付与を実行できる。標識付与は、異なるアミノ酸を標的とする2種の有色色素の双方と同時に反応させ、次いでそれを精製しそして濃縮しても実行できる。
ペプチドCPI3をリアクティブ・ブラック5およびCIBACRONTMブリリアント・イェロー3G−Pの双方を用いて標識してP4紙上で淡青色に着色したペプチドを創成した。リアクティブ・ブラック5およびCIBACRONTMブリリアント・イェロー3G−Pの標識レベルを変化すると、さらに緑色が強いペプチドを作製できた。二重標識CPI3ペプチドをP4紙上に吸着させそして十分リンスした。正に荷電した膜(膜SB−6407、Pall Corporation,East Hills,New Yorkから入手可能)をP4膜の両側に配置してゆるく結合している物質を引き取った。膜を完全にリンスした後、P4上の二重標識CPI3を約100μlPBS中に入れ、これは対照として色素コレクター膜(膜SB−6407、Pall Corporation,East Hills,New Yorkから入手可能)を伴っていた。P4上の二重標識CPI3を約25μlの一晩培養緑膿菌(PA14)と一緒に約75μlのPBS中、色素コレクター膜(膜SB−6407、Pall Corporation,East Hills,New Yorkから入手可能)と一緒に配置した。試料を約18時間、約37で放置した。細菌にさらされた二重標識CPI3/PA膜の色素コレクター膜は色変化を示したが、一方対照コレクター膜は白色のままであった。細菌にさらした試料のコレクター膜は、青色および黄色色素の双方を示すように見え、従ってCPI3ペプチドの双方の切断された部分が膜に移動したか、またはペプチドの黄色部分がP4紙上に残ったが、然し色が非常に淡かった可能性がある。同一の二重標識CPI3基質をそのヒスチジンタグによりMTA樹脂に付着させそしてPA14を用いて切断すると、コレクター膜は青色を示し、一方NTA樹脂も黄色の気味を有する青色の色調を示した。
いくつかの態様では、基質および固体支持体の双方が比色成分を含む。さらなる態様では、ペプチドの切断の際に比色成分を含むペプチドの切断部分が取り除かれそして残った色素の色を支持体上に見ることができる。この様式で、基質の改変は、混合色素のものから固体支持体のものへの色変化を含む目視可能なシグナルを生成する。場合により、シグナルはコレクター上のペプチドの切断部分を捕捉することを含む。この様式で、2個のシグナルが改変により生成され、一方は固体支持体上に発現されそして他方はコレクター上に発現される。
ペプチドは、2−クロロトリチル(chlorotrityl)クロリド樹脂(”super−acid−sensitive”樹脂、Bachem,Bubendorf,スイスから入手可能)上の標準Fmoc/Bocカッリング化学を介して調製された。この方法では、ペプチドはα−N9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)保護アミノ酸を用いて調製された。側鎖官能基は、ブトキシオキシカルボニル(Boc)およびt−ブチル(t−Bu)基を主として用いて保護されたが、しかし他の酸感応性保護基も使用できる。ペプチドは、表面へのアミノ酸の段階的添加を介してビーズから成長される。アミノカルボン酸部分は、最初にビーズ表面上の遊離反応性基(典型的にはアミン)にカップルさせて、アミノ結合を生成する。塩基感応性のFmoc基はジメチルホルムアミド(DMF)中のピペリジンの30%溶液中、20分間で取り除かれ、ビーズは十分に洗浄され、そして次のアミノ酸が導入される。このプロセスの連続は、C−末端からN−末端までのビーズから成長する所望のポリアミド構造の構築をもたらす。
CPI3ペプチドは、多種の病原体の検出のために使用される広域スペクトルペプチドCPI2の5−ヒスチジンタグ付バージョンである。システイン基がN−末端に付加されて色素を用いる標識を可能とする:
CPI3 〔Ac〕−CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH〕−〔OH〕
CPI3ペプチドは、システイン基上にテトラメチルローダミン ヨードアセトアミド(TMRIA)色素(Molecular Probes,Eugene,Oregonから入手可能)を用いて標識された。標識反応は、過剰のTMRIA色素を用いてPBS中、pH7.4で行った。色素対ペプチドの比率は約1.0と算出された。
SAP2を含むセンサーを黄色ブドウ球菌、緑膿菌、化膿連鎖球菌、大腸菌、および糞便連鎖球菌の存在下、37℃で60分間インキュベーションした。340nmの励起および490nmの発光を用いる蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を得られたシグナル強度を測定するために使用した。黄色ブドウ球菌試料のみがペプチドを加水分解でき、これによりEDANS分子の蛍光消光を活性化した。これはSAP2が黄色ブドウ球菌の存在を特異的に検出できるセンサー内の使用に適することを示す。
等価性
本発明を特定して示しそしてその好ましい態様を参照して記載してあるが、形状および詳細における種々の変化が、同伴する請求範囲により包含される本発明の範囲から外れることなく実施できることは当該技術分野の専門家には理解されるであろう。
Claims (24)
- a)基質の改変をもたらす条件下で非改変基質を試料にさらす工程であって、ここで、該非改変基質がペプチドおよび第一反応性色素比色成分を含有し、該第一反応性色素比色成分がペプチドとカップルしている、工程、および
b)基質の改変または基質の改変の非存在を検出する工程であって、ここで改変が第一反応性色素比色成分を含有するぺプチドの切断を含み、そして該切断が目視できる色変化をもたらす、工程、
を含んでなり、かつ、
該第一反応性基色素比色成分が、モノハロゲントリアジン色素、ジハロゲントリアジン色素、2,4,5トリハロゲノピリミニジン色素、2,3−ジハロキノキサリン色素、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル(スルホ−NHS)エステル機能化色素、N−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)機能化色素、ビニルスルホン色素、スルホニルクロリド色素、テトラフルオロフェニルエステル機能化色素、イソチオシアナート機能化色素およびヨードアセチル機能化色素からなる群の一員である、ことを特徴とする、基質の改変を検出する方法。 - 第一反応性色素比色成分がペプチドに共有結合している、請求項1に記載の方法。
- 改変がペプチド結合の加水分解を含みそして基質から反応性色素がカップルした部分の分離をもたらす、請求項1または2に記載の方法。
- 基質が、
ペプチド配列LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES、
ペプチド配列KAAHKSALKSAE、
ペプチド配列KKASEAAHKSALKSAE、
ペプチド配列CHHHASEAAHKSALKSAE、
ペプチド配列KHLGGGALGGGAKE、
ペプチド配列KHLGGGGGAKE、
ペプチド配列ACCDEYLQTKE、
ペプチド配列ADTVEPTGAKE、
ペプチド配列KLPHKLSWSADNP、
ペプチド配列PVPSTPPTPSPSTP、
ペプチド配列NMLSEVERE、
ペプチド配列KQNMLSEVERADTE、
ペプチド配列NEAIQEDQVQYE、
ペプチド配列ETKVEENEAIQK、
ペプチド配列DSRPVRRRRRPRVSK、
ペプチド配列KVSRRRRRGGD、
ペプチド配列KKASEVSRRRRRGGK、
ペプチド配列CHHHASEVSRRRRRGGK、
ペプチド配列KEKIGKEFKRIVQE、
ペプチド配列KVQRIKDFLRNLVE、
ペプチド配列EAAGAMFLEAIPK、
ペプチド配列EGAMFLEAIPMSIPK、
ペプチド配列CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH、
ペプチド配列KARRRRRGGGAMFLEAIPMSIPCGC、
ペプチド配列VSRRRRRGGDGDGC、
ペプチド配列GGDGDGC、
ペプチド配列VSRRRRRGGDGKGDAC、
ペプチド配列NEAIQEDQVQARRAKARRAC、
ペプチド配列QVQARRAKARRAC、
ペプチド配列GGDGKGDAC、
ペプチド配列QVQARRRAKARRRAC、
ペプチド配列VSRRRRRGGKGC、
ペプチド配列SVTRRRRRGGRASGGC、
ペプチド配列SEAIQEDQVQYCAAAHHHHH、
ペプチド配列KARRRRRGGDGDGCGC、
ペプチド配列HHHHHSRRRRRGGCGC、
ペプチド配列HHHHHSVQRIKDFLRNLVCGC、
ペプチド配列RRRRRSVQRIKDFLRNLVCGC、
ペプチド配列HHHHHAAHKSALKSACGC、
ペプチド配列RRRRRAAHKSALKSACGC、
ペプチド配列PGTKLYTVPW、
Alt誘導ペプチド、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、および脂質小胞からなる群の少なくとも一員を含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 目視できる色変化が色の消失である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 非改変基質が、第一反応性色素比色成分とは異なる第二比色成分をさらに含む、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- ペプチドが固体支持体にカップルしている、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 基質の改変が、さらに見えやすくなる固体支持体の色調をもたらす、請求項7に記載の方法。
- ペプチドが固体支持体に共有結合している、請求項7または8のいずれかに記載の方法。
- 固体支持体が、創傷用包帯、滅菌材料、試料を収容する物品、試料を集積する物品、ポリマー、膜、樹脂、ガラス、スポンジ、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、発泡体、布、紙、縫合糸、およびバッグから成る群から選択される、請求項7〜9のいずれかに記載の方法。
- 試料が、対象者上の創傷表面、体液、毛髪の一片、爪の一片、殻の一片、垢の一片、羽毛の一片、組織の一片、動物の身体内に埋め込まれた物品、カテーテル、蓄尿バッグ、血液集積バッグ、血漿集積バッグ、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、発泡体、布、紙、縫合糸、スワブ、リップスティック、スポンジ、ポリマー性物品、樹脂から作製された物品、ガラス物品、試験管、マイクロプレートのウエル、コンタクトレンズ液の一部分、スポンジ、ポリマー性物品、膜、樹脂から作製された物品、ガラスから作製された物品、およびスワブからなる群の少なくとも一種である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 基質の改変が、切断部分を生成するためのペプチドの一部分の切断を含み、該切断部分は第一反応性色素比色成分を含み、該改変はコレクターに向かう切断部分の移動をもたらし、そして該移動が目視できる色変化をもたらす、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- コレクターが膜、樹脂、ポリマー、フィルム、ガラス、またはキレート性物質からなる群から選択される少なくとも1種の物質を含む、請求項12に記載の方法。
- 基質の改変が、溶解素、自己溶解素、リパーゼ、エキソトキシン、細胞壁酵素、マトリックス結合酵素、プロテアーゼ、加水分解酵素、毒性因子酵素、および代謝酵素からなる群から選択される細菌酵素の存在を示すために使用される、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 微生物により生産される酵素の存在または非存在を検出することにより微生物の存在または非存在を検出するためのバイオセンサーであって、バイオセンサーが、該酵素と特異的に反応するペプチド基質および該ペプチド基質の一部にカップルした第一反応性色素比色成分を含み、かつ、第一反応性色素比色成分がモノハロゲントリアジン色素、ジハロゲントリアジン色素、2,4,5トリハロゲノピリミニジン色素、2,3−ジハロキノキサリン色素、N−ヒドロキシスルホスクシンイミジル(スルホ−NHS)エステル機能化色素、N−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)機能化色素、ビニルスルホン色素、スルホニルクロリド色素、テトラフルオロフェニルエステル機能化色素、イソチオシアナート機能化色素およびヨードアセチル機能化色素からなる群の一員である、ことを特徴とする、バイオセンサー。
- 第一反応性色素比色成分がペプチド基質に共有結合している、請求項15に記載のバイオセンサー。
- 基質が、
ペプチド配列LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES、
ペプチド配列KAAHKSALKSAE、
ペプチド配列KKASEAAHKSALKSAE、
ペプチド配列CHHHASEAAHKSALKSAE、
ペプチド配列KHLGGGALGGGAKE、
ペプチド配列KHLGGGGGAKE、
ペプチド配列ACCDEYLQTKE、
ペプチド配列ADTVEPTGAKE、
ペプチド配列KLPHKLSWSADNP、
ペプチド配列PVPSTPPTPSPSTP、
ペプチド配列NMLSEVERE、
ペプチド配列KQNMLSEVERADTE、
ペプチド配列NEAIQEDQVQYE、
ペプチド配列ETKVEENEAIQK、
ペプチド配列DSRPVRRRRRPRVSK、
ペプチド配列KVSRRRRRGGD、
ペプチド配列KKASEVSRRRRRGGK、
ペプチド配列CHHHASEVSRRRRRGGK、
ペプチド配列KEKIGKEFKRIVQE、
ペプチド配列KVQRIKDFLRNLVE、
ペプチド配列EAAGAMFLEAIPK、
ペプチド配列EGAMFLEAIPMSIPK、
ペプチド配列CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH、
ペプチド配列KARRRRRGGGAMFLEAIPMSIPCGC、
ペプチド配列VSRRRRRGGDGDGC、
ペプチド配列GGDGDGC、
ペプチド配列VSRRRRRGGDGKGDAC、
ペプチド配列NEAIQEDQVQARRAKARRAC、
ペプチド配列QVQARRAKARRAC、
ペプチド配列GGDGKGDAC、
ペプチド配列QVQARRRAKARRRAC、
ペプチド配列VSRRRRRGGKGC、
ペプチド配列SVTRRRRRGGRASGGC、
ペプチド配列SEAIQEDQVQYCAAAHHHHH、
ペプチド配列KARRRRRGGDGDGCGC、
ペプチド配列HHHHHSRRRRRGGCGC、
ペプチド配列HHHHHSVQRIKDFLRNLVCGC、
ペプチド配列RRRRRSVQRIKDFLRNLVCGC、
ペプチド配列HHHHHAAHKSALKSACGC、
ペプチド配列RRRRRAAHKSALKSACGC、
ペプチド配列PGTKLYTVPW、
Alt誘導ペプチド、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、および脂質小胞からなる群の少なくとも一員を含む、請求項15または16に記載のバイオセンサー。 - ペプチド基質にカップルした第二比色成分をさらに含み、第二比色成分が第一反応性色素比色成分とは異なる、請求項15〜17のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 固体支持体をさらに含み、ペプチド基質が該固体支持体にカップルしている、請求項15〜18のいずれかに記載のバイオセンサー。
- ペプチド基質が固体支持体に共有結合している、請求項19に記載のバイオセンサー。
- 固体支持体が、創傷用包帯、滅菌材料、試料を収容する物品、試料を集積する物品、ポリマー、膜、樹脂、ガラス、スポンジ、ディスク、スコープ、フィルター、レンズ、発泡体、布、紙、縫合糸、およびバッグから成る群から選択される、請求項19または20のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 膜、樹脂、ポリマー、フィルム、ガラス、またはキレート性物質からなる群から選択される少なくとも1種の物質を含むコレクターをさらに含む、請求項15〜21のいずれかに記載のバイオセンサー。
- ペプチド基質が、溶解素、自己溶解素、リパーゼ、エキソトキシン、細胞壁酵素、マトリックス結合酵素、プロテアーゼ、加水分解酵素、毒性因子酵素、および代謝酵素からなる群から選択される酵素と特異的に反応する配列を含む、請求項15〜22のいずれかに記載のバイオセンサー。
- 請求項15〜23のいずれかに記載のバイオセンサーおよび少なくとも1種の試薬を含んでなる、タンパク質を検出するためのキット。
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