ES2325923T3 - Sustratos colorimetricos, sensores colorimetricos y procedimientos de uso. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de detección de la presencia o ausencia de un microorganismo que comprende detectar la modificación de un sustrato peptídico que comprende las etapas de: a) exponer un sustrato peptídico sin modificar a una muestra que va a probarse para la presencia de un microorganismo en condiciones que darán como resultado una modificación del sustrato peptídico, en donde el sustrato peptídico sin modificar comprende un primer componente colorimétrico de colorante reactivo acoplado a una parte del péptido; y b) detectar una modificación del sustrato peptídico o una ausencia de la modificación del sustrato peptídico, en donde la modificación comprende escindir la parte del péptido que comprende el primer componente colorimétrico de colorante reactivo, en el que la escisión da como resultado un cambio de color visible; en el que el sustrato peptídico incluye al menos un miembro del grupo que está constituido por: y la secuencia de péptidos LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES en la que X puede ser cualquier aminoácido; la secuencia de péptidos KAAHKSALKSAE; la secuencia de péptidos KKASEAAHKSALKSAE; la secuencia de péptidos CHHHASEAAHKSALKSAE; la secuencia de péptidos KHLGGGALGGGAKE; la secuencia de péptidos KHLGGGGGAKE; y la secuencia de péptidos PGTKLYTVPW, en el que además el primer componente colorimétrico de colorante reactivo es uno de los miembros del grupo que está constituido por: un colorante de monohalotriazina; un colorante de dihalotriazina; un colorante de 2,4,5-trihalopirimidina; un colorante de 2,3-dihaloquinoxalina; un colorante funcionalizado con éster N-hidroxisulfosuccinimidílico (sulfo-NHS); un colorante funcionalizado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS); un colorante de vinilsulfona; un colorante de cloruro de sulfonilo; un colorante funcionalizado con éster tetrafluorofenílico; un colorante funcionalizado con isotiocianato; y un colorante funcionalizado con yodoacetilo.
Description
Sustratos colorimétricos, sensores
colorimétricos y procedimientos de uso.
La infección de heridas es una fuente principal
de gasto en asistencia sanitaria en los Estados Unidos.
Aproximadamente el 5% de todas las heridas quirúrgicas llegan a
infectarse con microorganismos y esa cifra es considerablemente
mayor (\sim 10-20%) para pacientes que se someten
a cirugía abdominal. Las especies bacterianas, tales como
Staphylococci, son los organismos más frecuentemente
aislados de las heridas infectadas. Esto es probablemente debido a
que los seres humanos son la cavidad natural para los
Staphylococci en el entorno, colonizando hasta el 50% de la
población en cualquier momento dado. Las velocidades de colonización
son significativamente superiores en el ámbito hospitalario, tanto
entre el personal sanitario como entre los pacientes. Además, es
probable que los organismos colonizadores en el entorno
hospitalario sean resistentes a muchas formas de terapia
antimicrobiana debido a la fuerte presión selectiva que existe en
el entorno nosocomial en el que frecuentemente se usan
antibióticos. Los Staphylococci se llevan normalmente como
comensales inocuos. Sin embargo, dada una brecha en la epidermis,
pueden producir una infección grave, incluso potencialmente
mortal.
Los Staphylococci son los agentes
etiológicos más comunes en infecciones de heridas quirúrgicas; otros
incluyen, pero no se limitan a, Streptococcus pyogenes,
Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis,
Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus,
Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli.
La infección posquirúrgica debida a
microorganismos es una preocupación importante de los hospitales. La
forma más común de prevenir tal infección es administrar fármacos
antibióticos profilácticos. Aunque generalmente es eficaz, esta
estrategia tiene el efecto no deliberado de reproducir cepas
resistentes de bacterias. Debe rechazarse el uso rutinario de
antibióticos profilácticos porque promueve el crecimiento de cepas
resistentes.
En vez de usar profilaxis rutinaria, una mejor
solución es poner en práctica un buen tratamiento de las heridas,
es decir, mantener el área libre de bacterias antes, durante y
después de la cirugía y supervisar cuidadosamente el sitio de
infección durante la curación. Los procedimientos de supervisión
normales incluyen una observación estrecha del sitio de la herida
durante la lenta curación, indicios de inflamación y pus, además de
medir la temperatura del paciente para detectar indicios de fiebre.
Desafortunadamente, muchos síntomas sólo son evidentes después de
que la infección ya se haya establecido. Además, después de que un
paciente recibe el alta del hospital, es responsable de supervisar
su propia asistencia sanitaria y los síntomas de infección pueden
no ser evidentes para el paciente no
cualificado.
cualificado.
Sería ventajoso para tanto los pacientes como
para el personal sanitario un procedimiento, sistema o biosensor
que pudiera detectar las fases tempranas de la infección antes de
que los síntomas se desarrollaran. Un procedimiento tal, o
biosensor, sería sensible a bajos niveles de microorganismos
presentes en una herida para facilitar la detección precoz. Si un
paciente puede supervisar con exactitud la condición de una herida
después del alta, entonces una terapia antimicrobiana apropiada
puede iniciarse lo suficientemente pronto como para prevenir una
infección más
grave.
grave.
Se ha encontrado que pueden marcarse sustratos
con el fin de producir un cambio de color visible cuando se
modifican por una proteína. También se ha encontrado que moléculas
(por ejemplo, proteínas segregadas por microorganismos, expresadas
sobre la superficie celular de microorganismos o expresadas sobre la
superficie de una célula infectada con un virus o prión) pueden
servir de marcadores para la detección de la presencia o ausencia
de un microorganismo en una muestra, por ejemplo una herida o fluido
corporal. Por consiguiente, la presente invención proporciona un
procedimiento para detectar la presencia o ausencia de un
microorganismo como se define en la reivindicación 1. Las
realizaciones preferidas del procedimiento se definen en las
reivindicaciones 2 a 13.
La presente invención también proporciona un
biosensor para detectar la presencia o ausencia de un microorganismo
como se define en la reivindicación 14. Las realizaciones
preferidas del biosensor se definen en las reivindicaciones 15 a
21.
El sustrato puede estar unido a un soporte
sólido.
En algunas realizaciones, esta invención incluye
un sustrato que comprende al menos dos componentes colorimétricos
unidos a un péptido, incluyendo los componentes colorimétricos al
menos dos colores diferentes. En algunas realizaciones, el sustrato
que comprende al menos un componente colorimétrico está unido a un
soporte sólido que está coloreado.
Englobados por esta invención están
procedimientos de detección de la modificación de un sustrato
descrito en este documento. El procedimiento comprende las etapas
de a) exponer una muestra al sustrato en condiciones que darán como
resultado una modificación del sustrato y b) detectar la
modificación o una ausencia de la modificación.
El sustrato comprende un péptido con al menos un
componente colorimétrico de colorante reactivo. Preferentemente, el
sustrato está unido a un soporte sólido. La modificación comprende
escindir al menos una parte del sustrato, incluyendo la parte uno
de los componentes colorimétricos y dando como resultado la escisión
una señal detectable (por ejemplo, un cambio de color visible). Por
ejemplo, el componente colorimétrico de un sustrato con un
componente colorimétrico puede escindirse del sustrato y el
componente colorimétrico puede difundir fuera del sustrato. Por
tanto, la modificación del sustrato se señalizaría por la pérdida de
color.
En otro ejemplo, el componente colorimétrico de
un sustrato con un componente colorimétrico puede escindirse del
sustrato y el componente colorimétrico puede recogerse en un
colector. En algunas realizaciones, el colector es una membrana o
soporte de captura que cambiaría de color como resultado de que el
sustrato escindido es recogido por el colector. Por tanto, la
modificación del sustrato se señalizaría por un cambio de color en
la membrana de captura que está en la proximidad del sustrato.
En otro ejemplo, el sustrato comprende dos
componentes colorimétricos, uno de los componentes colorimétricos
puede ser un primer color, por ejemplo, azul, y un segundo
componente colorimétrico puede ser un segundo color, por ejemplo,
amarillo. Cuando están presentes en el mismo sustrato, el sustrato
sin modificar puede aparecer verde. Si ese mismo sustrato se
modifica (por ejemplo, tal como escisión enzimática del componente
colorimétrico amarillo del sustrato), el sustrato puede aparecer
azul. Por tanto, la modificación del sustrato se señalizaría por un
cambio en el color de verde a azul.
Como se describe adicionalmente en este
documento, un sustrato con un componente colorimétrico puede unirse
a un soporte sólido que está coloreado. El componente colorimétrico
de péptido puede ser un primer color, tal como amarillo, y el
soporte sólido puede ser un segundo color, tal como azul. La
combinación del soporte sólido con el sustrato sin modificar puede
aparecer verde. Si el sustrato se modifica (por ejemplo, tal como
escisión enzimática del componente colorimétrico amarillo del
sustrato), la combinación del soporte sólido y el sustrato
modificado aparecerá azul. Por tanto, la modificación del sustrato
se señalizaría por un cambio en el color de verde a azul.
En otras realizaciones, la invención incluye un
procedimiento de detección de la presencia o ausencia de una enzima
en una muestra usando procedimientos descritos en este documento.
Como se describe en este documento, la enzima puede producirse
específicamente o ser segregada por un microorganismo. Por tanto, la
detección de la enzima guarda una correlación con la presencia, o
ausencia, del microorganismo.
En una realización adicional, esta invención
incluye biosensores para detectar la presencia o ausencia de una
proteína, una enzima o un microorganismo usando los procedimientos
descritos en este documento.
Como se describe en este documento, la presente
invención permite la detección de proteínas, enzimas y
microorganismos, incluyendo aquellos que producen infecciones. Esta
invención puede usarse ventajosamente en un variado intervalo de
papeles que incluyen proporcionar utilidad en un ámbito de
asistencia sanitaria. Por ejemplo, en un ámbito de asistencia
sanitaria, esta invención permitirá que un usuario identifique la
presencia de microorganismos en una herida de manera que puedan
tomarse medidas profilácticas antes de que se establezca la
infección. Esto permite las administraciones selectivas de fármacos
profilácticos que pueden reducir algunos efectos secundarios
negativos de su uso, tales como la reproducción de cepas resistentes
de microorganismos. Otro ejemplo de la utilidad proporcionada por
esta invención es que permite que un paciente supervise la condición
de una herida después de que haya sido dado de alta de un hospital
de manera que pueda buscar asistencia médica o tomar medidas
profilácticas si se detecta un microorganismo patógeno.
La invención proporciona una detección rápida y
de bajo coste de proteínas, enzimas o microorganismos en una
muestra basada en la modificación de un sustrato que da como
resultado un cambio de color detectable, eliminándose la necesidad
de equipos caros para detectar una modificación del sustrato. Los
materiales de partida necesarios para poner en práctica esta
invención son baratos. Adicionalmente, los procedimientos y los
artículos de esta invención permiten un medio portátil para
detectar la presencia de microorganismos, eliminar la necesidad de
realizar la detección o partes de detección en un ámbito de
laboratorio u hospitalario.
La patente o el archivo de solicitud contiene al
menos un dibujo realizado en color. Las copias de esta patente o
publicación de solicitud de patente con dibujos en color serán
proporcionadas por la oficina bajo petición y pago de la tasa
necesaria.
La figura 1 ilustra el espectro de Reactive Blue
4 en agua.
La figura 2 ilustra el espectro de Reactive
Yellow 86 en agua.
La figura 3 ilustra el espectro de REMAZOL®
Brilliant Blue R en agua.
La figura 4 ilustra el espectro de Reactive
Black 5 en agua.
\newpage
La figura 5 ilustra una fotografía de recipiente
de recogida de especímenes de laboratorio que incluye un sensor de
la presente invención.
La figura 6 ilustra una fotografía de dos
hisopos que incluyen sensores de la presente invención.
La figuras 7 ilustra una fotografía de una regla
que incluye sensores de la presente invención.
La figura 8 ilustra la regla mostrada en la
figura 22A después de exponerse al fluido de la herida que contenía
proteínas de un microorganismo específico para los sensores.
La figura 9 ilustra una sonda capilar rígida que
incluye sensores de la presente invención.
La figura 10 ilustra una realización en la que
un sustrato incluye dos componentes colorimétricos distintos.
La figura 11 ilustra un esquema de una
realización de la invención en la que una resina de níquel está
unida a un péptido que incluye un componente colorimétrico.
La figura 12 ilustra un esquema de una
realización de la invención en la que una membrana cargada está
unida a un péptido que incluye un componente colorimétrico.
La figura 13 incluye fotografías de sensores y
colectores con péptidos marcados escindidos sobre la superficie.
La figura 14 incluye fotografías de sensores y
colectores con péptidos marcados escindidos sobre la superficie.
La figura 15 muestra una gráfica del espectro
UV/visible en agua de un péptido con doble marcado.
La figura 16 ilustra una gráfica de la
fluorescencia relativa de diversos sensores en la que los sensores
se han esterilizado con óxido de etileno (OET) y/o se han expuesto a
Pseudomonas.
La figura 17 ilustra una gráfica de la
fluorescencia relativa de diversos sensores en la que los sensores
se han esterilizado con óxido de etileno (OET) y/o se han expuesto a
Enterococcus.
La presente invención engloba procedimientos y
biosensores útiles para la detección de la presencia o ausencia de
una proteína, una enzima o un microorganismo en una muestra. Esta
invención incluye un sustrato peptídico que comprende un componente
colorimétrico que produce una señal detectable que indica cuando el
sustrato ha experimentado una modificación. La modificación puede
ser el resultado de poner el contacto el sustrato con una proteína,
tal como una enzima, y dando como resultado la modificación del
sustrato por, por ejemplo, escisión enzimática.
La señal detectable incluye una señal visual o
un cambio de color visible. Como se usa en este documento, una
"señal visible" incluye un cambio de color que es perceptible
sin ningún tipo de equipo de detección o equipos de intensificación
tales como un fluorímetro. En otras realizaciones, la señal
detectable es un cambio en el color de un color o tono no
fluorescente a otro.
La invención incluye un sustrato que comprende
al menos un componente colorimétrico unido a un péptido.
Preferentemente, el sustrato se une a un soporte sólido. En algunas
realizaciones, el péptido es uno que experimentará una modificación
cuando interactúe con una proteína. Por ejemplo, la proteína puede
ser una enzima y la modificación puede incluir que la enzima
escinda el péptido. En algunas realizaciones, el péptido es
sintético, mientras que en otras se produce naturalmente.
Los péptidos que se usan en la presente
invención son:
LLGDFFRKSKBKIGKBFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES
(denominado en este documento "SEQ ID NO: 1"), en el que el
miembro "X" de SEQ ID NO:1 puede ser cualquier aminoácido;
KAAHKSALKSAE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 2" o "Papa1");
KKASEAAHKSALKSAE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 3" o "Tapa2");
CHHHASEAAHKSALKSAE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 4" o "Papa3");
KHLGGGALGGGAKE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 5" o "Palal");
KHLGGGGGAKE (denominado en este documento "SEQ
ID NO: 6" o "Papgl"); y
PGTKLYTVPW (que puede unirse a la superficie de
bacterias Staphylococci; la secuencia PGTKLYTVPW se denomina
en este documento "SEQ ID NO: 41").
\vskip1.000000\baselineskip
Otros péptidos que se aluden en la siguiente
descripción son:
ACCDEYLQTKE (denominado en este documento "SEQ
ID NO: 7" o "P1");
ADTVEPTGAKE (denominado en este documento "SEQ
ID NO: 8" o "P2");
KLPHKLSWSADNP (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 9" o "P3");
PVPSTPPTPSPSTP (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 10" o "A1");
NMLSEVERE (denominado en este documento "SEQ
ID NO: 11" o "M1");
KQNMLSEVERADTE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 12" o "M2");
NEAIQEDQVQYE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 13" o "Ssp1");
ETKVEENEAIQK (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 14" o "Ssp2" o "SAP2");
DSRPVRRRRRPRVSK (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 15" o "T1");
KVSRRRRRGGD (denominado en este documento "SEQ
ID NO: 16" o "T2");
KKASEVSRRRRRGGK (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 17" o "T3");
CHHHASEVSRRRRRGGK (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 18" o "T4");
KEKIGKEFKRIVQE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 19" o "LL31");
KVQRIKDFLRNLVE (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 20" o "LL2");
EAAGAMFLEAIPK (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 21" o "CPI1");
EGAMFLEAIPMSIPK (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 22" o "CPI2");
CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH (denominado en este
documento "SEQ ID NO: 23" o "CPI3");
KARRRRRGGGAMFLEAIPMSIPCGC (denominado en este
documento "SEQ ID NO: 24" o "CPI4");
VSRRRRRGGDGDGC (denominado más adelante "SEQ
ID NO: 25" o "JMH001");
GGDGDGC (denominado en este documento "SEQ ID
NO: 26" o "JMH002");
VSRRRRRGGDGKGDAC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 27" o "JMH003");
NEAIQEDQVQARRAKARRAC (denominado en este
documento "SEQ ID NO: 28" o "JMH004");
QVQARRAKARRAC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 29" o "JMH005");
GGDGKGDAC (denominado en este documento "SEQ
ID NO: 30" o "JMH006");
QVQARRRAKARRRAC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 31" o "JMH007");
VSRRRRRGGKGC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 32" o "JMH008");
SVTRRRRRGGRASGGC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 33" o "DEB001");
SEAIQEDQVQYCAAAHHHHH (denominado en este
documento "SEQ ID NO: 34" o "SSP3");
KARRRRRGGDGDGCGC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 35" o "T5");
HHHHHSRRRRRGGCGC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 36" o "T6");
HHHHHSVQRIKDFLRNLVCGC (denominado en este
documento "SEQ ID NO: 37" o "LL3");
RRRRRSVQRIKDFLRNLVCGC (denominado en este
documento "SEQ ID NO: 38" o "LL4");
HHHHHAAHKSALKSACGC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 39" o "Papa4"); y
RRRRRAAHKSALKSACGC (denominado en este documento
"SEQ ID NO: 40" o "Papa5").
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones de la invención, el
miembro "X" de SEQ ID NO:1 es ornitina.
Tales sustratos descritos en este documento
puede obtenerse a partir de fuentes comerciales tales como
Sigma-Aldrich, Corp. (St. Louis, MO), o pueden
producirse (por ejemplo, aislarse, purificarse o sintetizarse)
usando procedimientos conocidos para aquellos expertos en la
materia. La interacción con una proteína comprende una secuencia de
aminoácidos, tal como una de las secuencias enumeradas en este
documento o una secuencia que tiene al menos el 50%, 60%, 70%, 80%,
85%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencias a una de las
secuencias enumeradas en este documento, como se determina usando
un programa de comparación de secuencias y parámetros descritos en
este documento.
En algunas realizaciones, los grupos laterales
adicionales están unidos a uno de los aminoácidos de la cadena
peptídica. Por ejemplo, DEB001 puede incluir un grupo protector éter
bencílico unido a uno o más de los ácidos de serina en la cadena
peptídica. Los grupos protectores son grupos químicos que se usan
para proteger un aminoácido de la reacción con un componente
colorimétrico. El uso de grupos protectores permite marcar el mismo
tipo de aminoácido en un péptido con dos componentes colorimétricos.
Por ejemplo, un grupo de serina en DEB001 puede protegerse con un
grupo éter bencílico y la serina sin proteger puede hacerse
reaccionar con un componente colorimétrico. El grupo protector
puede eliminarse y la segunda serina puede hacerse reaccionar con
un componente de color diferente, creándose así un sustrato con dos
componentes de color diferentes.
El péptido del sustrato puede producirse usando
técnicas convencionales de proteínas recombinantes (véase, por
ejemplo, AUSUBEL Y COL. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY
(1998). Además, las proteínas de la presente invención también
pueden generarse usando técnicas recombinantes. El sitio exacto de
la modificación puede determinarse probando con un amplio surtido
de la proteína que va a detectarse y el sustrato y puede definirse
un sustrato más específico para esa proteína, si así se desea. Este
sustrato también puede usarse para ensayar la presencia de
microorganismos de interés.
Los sustratos se marcan con al menos un
componente colorimétrico de colorante reactivo. En algunas
realizaciones, los sustratos se marcan con al menos dos componentes
colorimétricos (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 o más
componentes colorimétricos). Los componentes colorimétricos producen
una señal (un cambio visible en el color) si el sustrato se
modifica (escisión del péptido). De esta forma, los componentes
colorimétricos actúan de marca o etiqueta para indicar la presencia
o ausencia de la modificación. La señal es un cambio visible en el
color, es decir, un cambio en el color que es detectable dentro de
la banda visible del espectro de luz (por ejemplo, de \sim 700 nm
a \sim 400 nm). Uniendo un mayor número de componentes
colorimétricos al sustrato puede producirse un color o cambio de
color más visible. En realizaciones adicionales, los sustratos se
marcan con al menos dos componentes colorimétricos distintos. Tales
realizaciones permiten la posibilidad de producir dos o más cambios
diferentes de tono.
Muchos tipos de colorantes reactivos están
disponibles comercialmente (de fabricantes de colorantes tales como
DyStar Textilfarben GmbH & Co. Deutschland KG, Fráncfort,
Alemania, y empresas químicas tales como Sigma Aldrich, Acros,
Molecular Probes y ICN) y son adecuados para uso como componentes
colorimétricos. El tipo o las especies específicas de
colorante(s) seleccionado(s) para un procedimiento de
detección, aplicación o artículo de fabricación dependerán de las
propiedades del colorante (por ejemplo, un coeficiente de extinción
molar) y el entorno en el que va a usarse.
Los colorantes reactivos son compuestos
coloreados que contienen uno o dos grupos reactivos que pueden
formar enlaces covalentes entre el colorante y un péptido,
sustrato, componentes colorimétricos, un soporte sólido o un
colector. Aproximadamente el 80% de todos los colorantes reactivos
se basan en el cromóforo azo. Los colorantes reactivos usados en la
presente invención son colorantes de mono y dihalotriazina (por
ejemplo, colorantes de mono y difluorotriazina; colorantes de mono
y diclorotriazina;
mono-(m'-carboxipiridinio)triazinas;
Reactive Blue 4; Reactive Yellow 86; colorantes en la línea de
PROCION® de colorantes, tintes y materias colorantes que están
disponibles de BASF; y la línea de CIBACRON^{TM} de colores de
alquitrán de hulla que están disponibles de
Ciba-Geigy);
2,4,5-trihalopirimidinas;
2,3-dihaloquinoxalinas; colorantes funcionalizados
con éster N-hidroxisulfosuccinimidílico
(sulfo-NHS); colorantes funcionalizados con
N-hidroxisuccinimidilo (NHS); colorantes de
vinilsulfona (por ejemplo, la línea de REMAZOL® de tintes de
alquitrán de hulla tales como REMAZOL® Blue, producido por DyStar
Textilfarben GmbH & Co. Deutschland KG; y Reactive Black 5);
colorantes de cloruro de sulfonilo (por ejemplo,
lisamina-rodamina y cloruro de dabsilo); colorantes
funcionalizados con éster tetrafluorofenílico; colorantes
funcionalizados con isotiocianato; y colorantes funcionalizados con
yodoacetilo.
\newpage
La estructura de erioglaucina (también conocida
como FD&C Blue 1, Acid Blue 9, Brilliant Blue FCF o
N-etil-N-[4-[[4-[etil[(3-sulfofenil)metil]amino]fenil](2-sulfofenil)metilen]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]-3-sulfo-,
sal interna, sal disódica, número CAS
[3844-45-9]) es:
Una forma de cloruro de sulfonilo de este
colorante puede prepararse mediante procedimientos conocidos para
aquellos expertos en la materia. Las estructuras químicas de dos
posibles isómeros del cloruro de sulfonilo de erioglaucina son:
Los nombres de estos colorantes son
N-etil-N-[4-[[4-[etil[(3-(clorosulfonil)fenil)metil]amino]fenil](2-sulfofenil)metilen]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]-3-sulfo-,
sal interna, sal sódica, y
N-etil-N-[4-[[4-[etil[(3-sulfofenil)metil]amino]fenil](2-(clorosulfonil)fenil)metilen]-2,5-ciclohexadien-1-iliden]-3-sulfo-,
sal interna, sal sódica.
Se sabe que los cloruros de sulfonilo reaccionan
preferentemente con grupos de amina primaria tales como aquellos
encontrados en grupos de lisina o en el extremo N de péptidos y
proteínas. Por tanto, los colorantes mostrados anteriormente pueden
usarse directamente para marcar péptidos. Alternativamente, mediante
procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia, la
forma de cloruro de sulfonilo de erioglaucina puede modificarse
adicionalmente químicamente para presentar otros grupos funcionales
tales como ésteres de NHS, yodosuccinimidas u otros grupos
reactivos. Ejemplos de tales modificaciones químicas de otros
colorantes se proporcionan en la patente de EE.UU. 5.393.514, la
patente de EE.UU. 5.846.737 y la patente de EE.UU. 5.798.276.
Los colorantes reactivos se basan en químicas de
grupos salientes de cloro o flúor y se conocen como colorantes de
cloro- o fluoro-triazinilo. Los colorantes reactivos
oscilan de muy baja reactividad a altamente reactivos (tales como
CIBRACRON^{TM} F y PROCION® MX) a una variedad de intervalos de
temperatura. El grupo reactivo es un anillo de triazinilo (un
anillo de seis lados con tres nitrógenos). La reacción se considera
un mecanismo de sustitución bimolecular nucleófila. Es una adición
específica catalizada por base del grupo funcional nucleófilo del
sustrato al centro electrófilo del grupo reactivo del colorante.
Reactive Blue 4 y Reactive Yellow 86 tienen la siguiente
estructura:
El espectro UV/visible en agua del colorante de
triazina Reactive Blue 4 se ilustra en la figura 1, mientras que el
espectro del colorante de triazina Reactive Yellow 86 se ilustra en
la figura 2.
Los colorantes de vinilsulfona reaccionan
mediante un mecanismo de adición nucleófila en el que frecuentemente
hay una etapa de eliminación antes de la etapa de adición dando
como resultado la formación de un producto intermedio vinílico.
Normalmente, hay una eliminación catalizada por base de un grupo
saliente nucleófugo seguida por una adición catalizada por base de
un grupo funcional nucleófilo del sustrato. Los colorantes REMAZOL®
son ejemplos de colorantes de vinilsulfona que utilizan el grupo
reactivo:
-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}-OSO_{3}Na.
Reactive Blue 19 y Reactive Black 5 tienen las siguientes
estructuras:
El espectro UV/visible en agua de REMAZOL®
Brilliant Blue R se ilustra en la figura 3, mientras que el espectro
de la vinilsulfona REMAZOL® Black B se ilustra en la figura 4.
Los cloruros de sulfonilo son derivados
reactivos de ácido sulfónico. La reacción de compuestos de cloruro
de sulfonilo con una molécula que contiene amina primaria avanza con
la pérdida de cloro y la formación de un enlace sulfonamida. La
estructura del colorante de cloruro de sulfonilo, cloruro de
sulfonilo de lisamina-rodamina B (es decir,
xantilio,
9-[4-(clorosulfonil)-2-sulfofenil]-3,6-bis(dietilamino)-,
sal interna, disponible de Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon,
número CAS/nombre: 62796-29-6),
es:
Los colorantes funcionalizados con éster
N-hidroxisulfosuccinimidílico
(sulfo-NHS) son solubles en agua y reaccionan con
moléculas que contienen aminas primarias para formar un enlace amida
con la pérdida del grupo sulfo-NHS. Los colorantes
funcionalizados con N-hidroxisuccinimidilo (NHS)
también son reactivos con grupos de amina. La estructura del
colorante funcionalizado con éster de NHS, BODIPY® FL, SSE (es
decir, ácido
4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propiónico,
éster sulfosuccinimidílico, sal sódica; disponible de Molecular
Probes, Eugene, Oregon), es:
El (Los) componente(s)
colorimétrico(s) se une(n) al sustrato mediante
procedimientos conocidos en la técnica tales como aquellos
descritos por Greg Hermanson en BIOCONJUGATE TECHNIQUE (1996),
disponible de Academic Press, San Diego, CA. En algunas
realizaciones, los componentes colorimétricos están covalentemente
unidos al péptido. Por ejemplo, puede usarse un grupo protector
para bloquear uno de los sitios de unión en una cadena peptídica
mientras que se une un primer componente colorimétrico (por ejemplo,
un colorante de triazina unido a un grupo de serina o un colorante
de vinilsulfona unido a un grupo de cisteína). Después de unirse el
primer componente colorimétrico, el grupo protector se elimina con
el fin de unir un segundo componente colorimétrico. Pueden usarse
tensioactivos tales como Triton-X para promover la
unión de los componentes colorimétricos a las cadenas peptídicas
y/o mejorar la solubilidad.
El grado al que el sustrato se marca con
componentes colorimétricos variará y puede depender de muchos
factores tales como, por ejemplo, las necesidades de la aplicación
en la que va a usarse el sustrato, los requisitos de fabricación y
los deseos del profesional de esta invención. Un procedimiento de
caracterización del nivel, o la cantidad, de marcado de un sustrato
incluido se refiere a su "relación de colorante respecto a
sustrato". Como se usa en este documento, el término relación
"de colorante respecto a sustrato" es la relación molar de la
concentración molar de colorante respecto a la concentración molar
de sustrato y es un medio de caracterización del nivel de marcado
del sustrato, así como de la eficiencia de la reacción de marcado.
Por ejemplo, una relación de colorante respecto a sustrato de 1,0
significaría que, en promedio, cada sustrato está marcado con un
componente colorimétrico. Una relación de colorante respecto a
sustrato baja puede significar un marcado incompleto del sustrato
(es decir, muchos péptidos no tienen colorante unido a ellos). En
algunas realizaciones, el intervalo de la relación de colorante
respecto a sustrato depende del número de aminoácidos en el péptido
que van a marcarse con el componente de color. Por ejemplo, si van
a marcarse dos sitios, entonces una reacción de marcado completa
daría una relación de colorante respecto a sustrato de
aproximadamente 2. Las relaciones de colorante respecto a sustrato
adecuadas dependen de la aplicación exacta. Por ejemplo, la relación
de colorante respecto a sustrato puede afectar la claridad de la
señal, la unión del sustrato a un soporte sólido y otros aspectos
del biosensor que pueden variarse dependiendo de las necesidades del
profesional de la invención.
Una relación de colorante respecto a sustrato
adecuada puede determinarse mediante experimentación. Por ejemplo,
el péptido del sustrato puede sintetizarse para añadir o extraer
grupos aminoácido adicionales que son dianas adecuadas para unir
los componentes colorimétricos. De este modo, la relación de
colorante respecto a sustrato puede variarse y los sustratos
resultantes pueden probarse para determinar qué relación produce
resultados aceptables para una aplicación dada. Por ejemplo, CPI4
contiene dos grupos de cisteína en un extremo que son buenas dianas
para los colorantes de vinilsulfona. Esto permite la unión de dos
componentes colorimétricos en cada péptido. Añadiendo un segundo
componente colorimétrico, la señal resultante producida por el
sustrato será más brillante (es decir, que tiene una mayor
intensidad de color y/o contraste más marcado) que si solo se
uniera un componente colorimétrico al sustrato. Este color más
brillante puede ser más favorable para una aplicación dada. Por
ejemplo, un colorante azul oscuro puede verse fácilmente sobre un
soporte sólido, pero un colorante amarillo puede requerir más
colorantes por péptido para crear el nivel de color deseado. Sin
embargo, demasiados colorantes sobre un extremo del péptido pueden
crear un impedimento estérico si, o cuando, el péptido está unido a
un soporte sólido, por lo que hay una relación o intervalo de
relaciones de colorante respecto a sustrato óptima para cada
sustrato y/o aplicación.
En algunas realizaciones, el sustrato peptídico
se une a un soporte sólido. Ejemplos de soportes sólidos adecuados
incluyen un vendaje para heridas (por ejemplo, una venda o gasa),
cualquier material que necesite ser estéril o estar libre de
contaminación microbiana, un artículo que contenga o recoja la
muestra (por ejemplo, una bolsa de recogida de orina, una bolsa de
recogida de sangre, una bolsa de recogida de plasma, un tubo de
ensayo, un tubo de recogida de fluido corporal, un tubo de ensayo,
un catéter, un hisopo, un soporte de hisopo, una tira reactiva o un
pocillo de una microplaca), un polímero, una membrana, una resina,
vidrio, una esponja, una sonda rígida o capilar, un punto de la
regla de cuidado, un disco, un microscopio, un filtro, una lente,
espuma, tela, papel, una toallita, una sutura y una bolsa. En
algunas realizaciones de la invención, el soporte sólido está hecho
de materiales adecuados para la esterilización. Ejemplos de
procedimientos adecuados de esterilización del soporte sólido
incluyen tratamientos con radiación gamma y tratamientos con óxido
de etileno. En algunas realizaciones, el soporte sólido incluye un
componente colorimétrico y/o el soporte sólido está hecho de un
material coloreado.
En realizaciones preferidas, el soporte sólido
es un producto médico que se pone en contacto con un paciente o
tejido corporal o muestras de fluido de un paciente médico. Por
ejemplo, en algunas realizaciones, el soporte sólido es un
dispositivo o producto médico que tiene un puerto de muestra que
permite el acceso a una muestra de fluido (por ejemplo, fluido
corporal o de la herida), un agente de mecha para sacar el fluido al
dispositivo o producto, una cámara de ensayo en la que tiene lugar
la detección y un puerto de visualización que permite que un
profesional vea la señal que indica la presencia de un
microorganismo. En ejemplos adicionales, el soporte sólido es un
material usado para limpiar la superficie de una herida, medir la
distancia hasta el cierre de una herida, obtener muestras de una
herida y/o transferir especímenes a un laboratorio de microbiología
clínica. Tales soportes sólidos proporcionan un dispositivo de
diagnóstico o de análisis de diagnóstico inmediato (POC) que podría
ser usado por profesionales sanitarios para cuantificar y cualificar
la presencia de cualquier microorganismo infeccioso o patógeno
dentro de una herida. Por ejemplo, tales realizaciones podrían
usarse para determinar si una herida tenía 10^{5} UFC por ml de
patógenos de herida (o más). 10^{5} UFC por ml de patógenos de
herida se considera que es la colonización crítica que indica que
una herida crónica está infectada.
La figura 5 ilustra una fotografía de un
recipiente de recogida de especímenes de laboratorio. El color azul
del sensor 500 indica la presencia de uno o más tipos específicos de
microorganismos en el recipiente de especímenes de laboratorio.
Similarmente, un sensor podría colocarse en un recipiente de
muestras de hisopo para indicar la presencia de microorganismos en
una muestra que se ha colocado en el recipiente.
En algunas realizaciones, los sensores que
contienen marcadores específicos de patógenos de heridas están
unidos a un collar que se coloca en la parte trasera de un alginato
o un hisopo (por ejemplo, un hisopo de algodón o poliuretano). El
hisopo saca el fluido de la herida hacia arriba a lo largo del
exterior del vástago. Entonces, el fluido pasa de la parte superior
del hisopo al sensor de collar y, si las proteínas microbianas de
interés están presentes en el fluido, el sensor produce una señal
(por ejemplo, un cambio de color). En el caso de un péptido marcado
con un colorante de un color simple, el color que difunde libremente
se recoge en una membrana que une preferencialmente el grupo
saliente del colorante con una fuerte afinidad.
La figura 6 ilustra una fotografía de dos
hisopos. El hisopo de la izquierda no se ha expuesto a una muestra
de fluido, mientras que el de la derecha se ha expuesto. El sensor
unido al hisopo de la derecha ha cambiado de color, indicando la
presencia de Staphylococcus aureus en la muestra.
En otra realización, los sensores se incorporan
sobre o en una regla de plástico fina, flexible y transparente que
tiene el fin doble de medir la distancia del lecho de la herida y
detectar la presencia de tipos específicos de microorganismos para
determinar si un paciente tendrá una infección incipiente. En
algunas realizaciones, la regla incluye canales situados en el
medio junto con una o más escalas colorimétricas que pueden
proporcionar un color positivo y/o negativo del color, un sensor o
sensores de infección que producen una señal visible en presencia
de microorganismos perjudiciales y/o un área con líneas para
escribir la información del paciente (por ejemplo, el número de
identificación del paciente, fecha y/u hora de visita).
Opcionalmente, la regla puede comprender sensores específicos para
una o más especies de patógenos de la herida y/o un sensor de amplio
espectro que detecta una pluralidad de patógenos. En uso, la
combinación de regla/sensor podría fotografiarse para proporcionar
al asistente del paciente un registro permanente de la historia
clínica del paciente. La figura 7 ilustra una fotografía de una
regla tal. La figura 8 ilustra la regla después de exponerla a
fluido de la herida que contenía proteínas de un microorganismo
específico para los sensores y de que los sensores hayan
experimentado un cambio en el color, indicándose así la presencia de
microorganismos.
En otra realización, los sensores están
incluidos en una toallita o esponja de limpieza de la herida que
podría usarse, por ejemplo, para limpiar una herida y detectar la
presencia de microorganismos. La esponja o toallita comprende un
material absorbente tal como tela, papel, algodón, esponja o
material fibroso no tejido. Un sensor se uniría o se incorporaría
sobre la toallita o esponja en un patrón que proporcionaría una
cobertura uniforme para detectar las proteínas de una herida
infectada. En algunas realizaciones, los sensores están impresos
sobre el material en un patrón tal como ondas, malla, rejilla o
manchas. Preferentemente, la señal producida por el sustrato puede
identificarse fácilmente a partir de los colores típicos del fluido
de la herida. En algunas realizaciones, la toallita o esponja
también se usa para extender una sustancia terapéutica o
antibiótica.
En otra realización más, los sensores se colocan
en la punta de una sonda rígida cilíndrica o capilar usado para
muestrear el fluido de la herida. La sonda es suficientemente rígida
para hacer presión sobre la herida para extraer mediante presión y
sacar tejido en una cámara hueca que contiene los sensores. En
algunas realizaciones, la sonda incluye un amplio espectro de
sensores, una serie de sensores específicos, o ambos. En algunas
realizaciones, las cámaras están hechas de materiales de limpieza
blandos o duros (tales como vidrio, silicona u otros materiales con
propiedades similares). La cámara interna de la sonda saca hacia
arriba el líquido por acción capilar y también contiene filtros de
membrana que incluyen sensores colorimétricos que son específicos
para cada microorganismo o patógeno de interés y/o forman un sensor
que puede detectar un amplio espectro de microorganismos.
Opcionalmente, la sonda o capilar incluye una mecha absorbente que
comprende poliuretano u otro material adecuado que se usa para
sacar el fluido de muestra a las regiones del sensor de membrana. La
figura 9 ilustra una sonda 900 capilar rígida que incluye los
sensores 902.
En otra realización, los sensores se incorporan
en una tira fina, película delgada, malla o material de sutura que
está colocado sobre una herida para recoger fluido. En algunas
realizaciones, los sensores producen una señal en el plazo de
minutos desde la detección de la presencia de un
microorganismo(s) de interés. En algunas realizaciones, las
tiras, película, malla o suturas están hechas de un material no
absorbente (por ejemplo, fibras de nailon o polietileno). En otras
realizaciones, las tiras, película, malla o suturas están hechas de
un material absorbente (por ejemplo, poliuretano). En uso, las
películas delgadas, malla o suturas pueden colocarse en un soporte
de tubos de ensayo de plástico o vidrio comúnmente usado para
transportar muestras de hisopo a un laboratorio, proporcionándose
así un sistema de sensores para el asistente y un recipiente para
una lectura de confirmación dentro de un laboratorio de
hospital.
En algunas realizaciones, el dispositivo de
sensores de análisis de diagnóstico inmediato (POC) puede
incorporarse en una bolsa o frasco de especímenes que puede usarse
para transferir una muestra (por ejemplo, una muestra de tejido o
biopsia) a un laboratorio. En realizaciones adicionales, los
péptidos se implantan sobre una película delgada y/o se impregnan
directamente sobre el frasco o la bolsa de muestra. Opcionalmente,
detergentes no iónicos (por ejemplo, HECAMEG, TRINTON X100 o TWEEN)
y/u otro(s) reactivo(s) (por ejemplo, tampones, tales
como PIPES (pKa = 6,76), ADNsa I y/o vidrio no poroso o perlas
metálicas) están incluidos en el sensor de POC y/o bolsa o frasco
de especímenes con el fin de controlar la actividad óptima de los
sensores, para hidrolizar el ADN de la muestra de tejido y prevenir
que se vuelva demasiado viscoso, para macerar el tejido mediante
agitación suave, para permeabilizar la muestra de tejido para
promover la detección de cualquier microorganismo de interés y/o
mejorar la homogeneidad de la muestra de biopsia/tejido.
En algunas realizaciones, el dispositivo de POC
es un artículo desechable que se usaría una vez y luego se
depositaría en los residuos con riesgo biológico. Con la
esterilización en autoclave, el dispositivo se destruiría y la
información del paciente se guardaría de forma confidencial.
En algunas realizaciones, el sustrato se
adhiere, se une, se acopla o se liga al soporte sólido. Los
procedimientos para hacer esto son conocidos en la técnica. Por
ejemplo, el sustrato puede unirse al soporte sólido mediante
interacciones no covalentes (por ejemplo, interacciones hidrófobas,
interacción hidrófila, interacciones electrostáticas o mediante un
procedimiento de sorción) o mediante enlace covalente. En
realizaciones adicionales, el sustrato incluye grupos salientes
hidrófobos y está unido no covalentemente a una superficie hidrófoba
de un soporte sólido. En otras realizaciones, los sustratos
hidrófilos o hidrófobos se acoplan a superficies mediante disulfuro
o aminas primarias, grupos tiol, grupos carboxilo, grupos hidroxilo,
o con el uso de reticulantes (por ejemplo, sulfo EMCS (éster de
N-maleimidocaproiloxisulfosuccinimida), disponible
de Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, Illinois). En todavía otra
realización, el sustrato se acopla a un soporte sólido usando
extremos reactivos no esenciales tales como aminas libres, ácidos
carboxílicos o grupos tiol que no afectan la interacción del
sustrato con una proteína producida por un microorganismo. Las
aminas libres pueden acoplarse a grupos carboxilo sobre el sustrato
usando, por ejemplo, un exceso molar de 10 veces de o bien
clorhidrato de
N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
o p-toluenosulfonato de
N-ciclohexil-N'-2-(4'-metil-morfolinio)etilcarbodiimida
durante \sim 2 h a \sim 4ºC en agua destilada, ajustado a un pH
\sim 4,5, para estimular la reacción de condensación para formar
un enlace peptídico. Los grupos tiol pueden reducirse con
ditiotreitol o
tris(2-carboxietil)fosfina y luego
acoplarse a un grupo amino libre sobre una superficie con ácido
N-e-maleimidocaproico (véase D.G.
Griffith y col. N-Polymethylenecarboxymaleimides: A
new class of probes for membrane sulfhydryl groups, 134 FEBS LETT.
261-63 (1981)). En otra realización, el sustrato se
une al soporte sólido mediante interacciones atractivas entre los
aminoácidos del péptido y el soporte sólido. Por ejemplo, un
péptido con residuos de histidina consecutivos puede unirse a una
resina (por ejemplo, SEPHAROSE®) que contiene iones níquel
inmovilizados por NTA covalentemente unido. En todavía otro
ejemplo, el soporte sólido tiene una carga polar (por ejemplo, una
membrana cargada negativamente) y al menos alguna parte del
sustrato (por ejemplo, uno o más péptidos de la cadena peptídica del
sustrato) tiene una carga polar opuesta a la que está sobre el
soporte sólido. Estas cargas opuestas proporcionan la unión del
sustrato al soporte sólido.
La modificación del sustrato comprende escindir
al menos una parte del sustrato incluyendo la parte uno de los
componentes colorimétricos y dando la escisión como resultado un
cambio de color visible. Por ejemplo, si el sustrato incluye
componentes colorimétricos tanto azules como amarillos, el sustrato
sin escindir puede aparecer verde. Después de que una proteína
escinda una parte del sustrato que incluye el componente
colorimétrico amarillo, la parte escindida se elimina de la
presencia inmediata de la parte sin escindir dejando que la parte
sin escindir aparezca azul. El cambio de color visible indica la
presencia del microorganismo en la muestra, mientras que la
ausencia de un cambio de color indica la ausencia del
microorganismo.
La figura 5 ilustra un esquema de una
realización de la invención. El sustrato sin modificar comprende un
péptido, un componente colorimétrico amarillo y un componente
colorimétrico azul. El sustrato sin modificar tiene un tono verde.
Después de la modificación por una proteasa, una parte del péptido
que incluye el componente colorimétrico amarillo se escinde,
dejando el sustrato con sólo un componente colorimétrico azul. Por
tanto, la modificación del sustrato produce una señal en forma de
un cambio de color de verde a azul.
En algunas realizaciones, la modificación del
sustrato incluye escindir un enlace peptídico del péptido. En otra
realización, la modificación del sustrato incluye hidrolizar al
menos un enlace peptídico en el péptido y da como resultado que al
menos una parte del péptido se escinde del sustrato. La parte
escindida incluye al menos uno de los componentes colorimétricos,
dando como resultado un cambio de color visible.
Pueden variar los mecanismos exactos empleados
para eliminar la parte escindida del sustrato de la presencia
inmediata de la parte sin escindir. Por ejemplo, la parte escindida
puede difundir, sorberse y/o migrar al entorno circundante (por
ejemplo, tal como un vendaje para heridas) o puede lavarse con un
líquido.
En algunas realizaciones se usa un colector para
eliminar las partes escindidas de manera que la señal sea
detectable. Tal como se usa en este documento, un "colector" es
un sólido o superficie que comprende una propiedad que atrae la
parte escindida de un sustrato. En estas realizaciones, una o más de
las partes escindidas puede tener una mayor atracción o afinidad
por el colector que por la otra parte del sustrato y/o el soporte
sólido de manera que las partes escindidas migren, se sorban y/o
difundan del sustrato y hacia el colector o algún punto remoto de
la parte sin escindir del sustrato o el sustrato modificado. En
algunas realizaciones, la distancia que migra la parte escindida es
suficiente de manera que resulte una señal detectable. En algunas
realizaciones, la migración de la(s) parte(s)
escindida(s) da como resultado una señal detectable.
En algunas realizaciones, la parte escindida del
sustrato puede ser capturada sobre un colector. En realizaciones
adicionales, la parte escindida es capturada sobre un colector
coloreado. En otras realizaciones adicionales, la modificación del
sustrato da como resultado que una parte escindida sea capturada
sobre la superficie de un colector coloreado, produciéndose o
indicándose así un cambio en el color del soporte sólido. Es decir,
una vez se libere la parte escindida del sustrato, se une al
colector por una o más fuerzas (por ejemplo, una fuerza producida
por una carga electrostática o magnética, o un enlace químico). En
otra realización, el colector produce que la parte escindida migre
una distancia suficiente del sustrato de manera que el color del
soporte sólido sea detectable.
Como ejemplo no limitante, un sustrato puede
incluir un primer componente colorimétrico (por ejemplo, un
componente colorimétrico amarillo unido a un péptido). La
modificación puede incluir escindir el sustrato de forma que una
primera parte de péptidos escindida incluya el primer componente
colorimétrico y una segunda parte de péptidos escindida no incluya
un componente colorimétrico. La primera parte de péptidos escindida
puede ser atraída hacia el colector, dando como resultado un cambio
de color visible del colector (por ejemplo, el colector puede
aparecer más amarillo). Si el sustrato se unió originalmente a un
soporte sólido, la combinación del soporte sólido y la parte sin
escindir del sustrato puede presentar un cambio en el color (por
ejemplo, que aparezca menos amarillo o se vuelva incoloro).
En otro ejemplo no limitante, la primera y
segunda parte escindida puede presentarse en un líquido y la
migración de la primera parte que incluye el componente
colorimétrico (por ejemplo, amarillo) hacia un colector puede dar
como resultado que el líquido presente un cambio en el color (por
ejemplo, que aparezca menos amarillo o se vuelva incoloro).
En todavía otro ejemplo no limitante, el
sustrato sin modificar puede incluir al menos dos componentes
colorimétricos (por ejemplo, un componente colorimétrico amarillo y
uno azul) y la modificación puede dar como resultado la primera
parte escindida que incluye el componente colorimétrico amarillo y
la segunda parte que incluye el componente colorimétrico azul.
Antes de la migración sustancial del primer componente
colorimétrico, la estrecha proximidad del primer y el segundo
componente colorimétrico puede proporcionar un aspecto verde. Como
la primera parte migra hacia un colector, los colores individuales
se mueven más evidentes. Por ejemplo, si la segunda parte está
unida a un soporte sólido, la combinación del soporte sólido y la
segunda parte puede cambiar de color (por ejemplo, volverse de un
tono más azul) ya que la primera parte migra hacia un colector y
lejos del soporte sólido y la segunda parte. Si, por ejemplo, el
sustrato original se incluyó en un líquido, el líquido continuará
apareciendo verde inmediatamente después de la modificación. Sin
embargo, como la primera parte escindida migra hacia el colector,
la combinación restante de fluido y la segunda parte escindida puede
cambiar de color (por ejemplo, volverse de un tono más azul).
Opcionalmente o adicionalmente, la modificación del sustrato puede
dar como resultado que el colector produzca un cambio de color (por
ejemplo, que el colector presente un color más amarillo que la
primera parte escindida amarilla recogida sobre la superficie del
colector).
En algunas realizaciones, la modificación da
como resultado un cambio de color visible en un patrón
predeterminado. Por ejemplo, la modificación puede dar como
resultado la aparición, la desaparición y/o el cambio de color de
una forma (por ejemplo, un símbolo, una letra o una palabra). Esto
puede llevarse a cabo con, por ejemplo, uniendo sustratos sobre un
soporte sólido en un patrón (por ejemplo, una estrella, una cruz o
un signo más). Por ejemplo, el material de soporte sólido puede ser
azul y los sustratos con componentes colorimétricos amarillos
pueden disponerse sobre el soporte sólido en la forma de una
estrella. Antes de la modificación, el soporte sólido parece tener
un fondo azul con una estrella verde (surgiendo el tono verde de la
estrella de la mezcla del tono amarillo del sustrato y el tono azul
del soporte sólido). La modificación da como resultado la escisión
de los componentes colorimétricos amarillos del sustrato y se indica
por la pérdida de intensidad de la estrella verde, dejando que el
soporte sólido aparezca azul. En otra realización se emplea un
colector y el colector se forma de tal forma que las partes
escindidas serán atraídas a un área predeterminada del colector. Por
ejemplo, los sustratos pueden incluir un componente colorimétrico
amarillo y el colector puede comprender un material azul. La
modificación del sustrato da como resultado que los componentes
colorimétricos amarillos se recojan sobre el colector en una forma
predeterminada, tal como la forma de una cruz. De este modo, la
modificación de los sustratos se indica por la aparición de una cruz
con un aspecto verde (debido al tono azul combinado del colector y
el amarillo de los componentes colorimétricos). En todavía otra
realización, la modificación del sustrato da como resultado la
aparición, la desaparición y/o el cambio de color visible en una o
más formas predeterminadas sobre tanto un soporte sólido como un
colector. Opcionalmente se usan muchos tipos diferentes de
sustratos, superficies de colector y superficies de soporte sólidas
de manera que puede detectarse una pluralidad de modificaciones y/o
microorganismos. Esta invención engloba el uso de más de una forma,
combinación de formas y desplazamientos de color sobre uno o más
colectores y/o soportes sólidos que serán evidentes para un experto
en la materia.
Los ejemplos descritos en este documento no
pretenden ser limitantes en ningún modo y otras combinaciones de
soporte(s) sólido(s), tipo y número de componentes
colorimétricos y colectores atractivos y/o repulsivos inductores de
la migración también están englobados por esta invención.
En una realización, la invención incluye un
procedimiento de detección de la modificación de un sustrato en el
que un sustrato sin modificar comprende un péptido con al menos un
componente colorimétrico comprendiendo el procedimiento las etapas
de a) exponer el sustrato a una muestra en condiciones que darán
como resultado la modificación del sustrato comprendiendo la
modificación del sustrato escindir al menos una parte del péptido
que incluye al menos un componente colorimétrico y la parte
escindida migra hacia un colector dando la migración como resultado
un cambio de color visible; y b) detectar la presencia o ausencia
del cambio de color visible indicando un cambio de color visible la
modificación del sustrato e indicando la ausencia de un cambio de
color visible una ausencia de la modificación del sustrato.
La figura 11 ilustra un esquema de una
realización que quelación metálica de la invención. Un componente
colorimétrico, en este caso un colorante, se incluye sobre un
péptido que está unido a un soporte sólido de resina de níquel. Una
proteasa escinde una parte del péptido, y la parte escindida tiene
una mayor afinidad por un colector de membrana que por la
superficie original. Cuando el colorante migra hacia el colector, el
péptido restante y el soporte sólido producen un cambio de color
visible. Opcionalmente, el colector produce una señal cuando el
colorante migra hacia o sobre el colector.
La figura 12 ilustra una realización de la
invención en la que una membrana cargada se acopla al sustrato que
incluye un componente colorimétrico. Una proteasa escinde una parte
del péptido, y la parte escindida tiene una mayor afinidad por el
colector de membrana que por la superficie original. Cuando el
colorante migra hacia el colector, el sustrato restante y el
soporte sólido producen un cambio de color visible. Opcionalmente,
el colector produce una señal cuando el colorante migra hacia
él.
Los colectores pueden estar hechos de cualquier
material adecuado que facilite la migración de partes escindidas
del sustrato. Por ejemplo, el colector puede incluir una membrana,
una resina, un polímero, una película, vidrio o un material
quelante. En algunas realizaciones, el colector está unido a una
superficie sólida, tal como un vendaje para heridas (por ejemplo,
una venda o gasa), cualquier material que necesite ser estéril o
estar libre de contaminación microbiana, un artículo que contenga o
recoja la muestra (por ejemplo, una bolsa de recogida de orina, una
bolsa de recogida de sangre, una bolsa de recogida de plasma, un
tubo de ensayo, un tubo de recogida de fluido corporal, un tubo de
ensayo, un catéter, un hisopo, una tira reactiva o un pocillo de
una microplaca), un polímero, una membrana, una resina, vidrio, una
esponja, un disco, un microscopio, un filtro, una lente, espuma,
tela, papel, una sutura y una bolsa. En algunas realizaciones de la
invención, el soporte sólido está hecho de materiales adecuados
para la esterilización. Ejemplos de procedimientos adecuados de
esterilización del colector incluyen tratamientos con radiación
gamma. En algunas realizaciones, el colector incluye un componente
colorimétrico o está hecho de un material coloreado.
Como parte de sus procedimientos de crecimiento
normales, muchos microorganismos segregan o hacen que se segreguen
varias proteínas en su entorno de crecimiento tales como enzimas.
Estas proteínas tienen numerosas funciones que incluyen, pero no se
limitan a, la liberación de nutrientes, protección contra defensas
del huésped, síntesis de envolturas celulares (en bacterias) y/o
mantenimiento, y otras todavía sin determinar. Muchos
microorganismos también producen proteínas sobre su superficie
celular que están expuestas a (e interactúan con) el entorno
extracelular. Muchas de estas proteínas son específicas para el
microorganismo que las segrega y, como tales, pueden servir de
marcadores específicos de la presencia de aquellos microorganismos.
Esta invención incluye un procedimiento y/o sistema que puede
detectar la presencia de estas proteínas producidas y/o segregadas
y puede servir igualmente para indicar la presencia del
microorganismo productor/secretor. Alternativamente, esta invención
proporciona un procedimiento y/o sistema que puede detectar la
ausencia de estas proteínas producidas y/o segregadas de manera que
indican la ausencia del microorganismo productor/secretor. Un
procedimiento y/o sistema de detección tal es útil para detectar o
diagnosticar la presencia de un microorganismo y/o una infección
(por ejemplo, una infección de la herida).
En algunas realizaciones, un microorganismo
produce la proteína que modifica el sustrato. Esta invención incluye
procedimientos para detectar la presencia o ausencia de un
microorganismo en una muestra. Por ejemplo, el procedimiento puede
comprender las etapas de a) poner en contacto la muestra con un
sustrato en condiciones que darán como resultado una modificación
del sustrato por el microorganismo y b) detectar la modificación o
una ausencia de la modificación. Una proteína producida, segregada o
expresada por el microorganismo modifica el sustrato. La
modificación comprende escindir al menos una parte del sustrato,
incluyendo la parte uno de los componentes colorimétricos y dando
la escisión como resultado un cambio de color visible, indicándose
así la presencia del microorganismo en la muestra, e indicando la
ausencia de la modificación la ausencia del microorganismo.
Un sistema de detección de microorganismos, como
se describe en este documento, puede adaptarse para detectar un
microorganismo específico mediante la identificación de una
proteína, tal como una enzima segregada, específica para el
microorganismo que va a detectarse. Alternativamente puede diseñarse
un sistema para identificar simultáneamente más de una especie de
microorganismos (por ejemplo, al menos 2, al menos 5, o al menos 10
especies de microorganismos diferentes), tales como aquellos que
comúnmente infectan heridas. Preferentemente, este objetivo se logra
identificando aquellas proteínas que son comunes a ciertas clases
de microorganismos patógenos, pero que no son comunes a
microorganismos no patógenos. Tales proteínas pueden identificarse,
por ejemplo, con una selección bioinformática por ordenador de las
bases de datos del genoma microbiano.
La presencia de un microorganismo puede
detectarse diseñando un sustrato sintético que reaccionará
específicamente con una proteína que está presente sobre la
superficie de la célula o se segrega al entorno de crecimiento del
microorganismo. Estos sustratos sintéticos pueden marcarse con un
marcador detectable tal que, en condiciones en las que sus
proteínas respectivas reaccionan específicamente con ellos, los
sustratos experimenten una modificación que esté indicada por la
marca detectable. Por ejemplo, la marca detectable puede producir un
cambio de color visible.
Ejemplos de microorganismos que pueden
detectarse por las diversas realizaciones de esta invención incluyen
bacterias, virus y hongos. Preferentemente, el microorganismo es
una bacteria. Ejemplos de bacterias incluyen, pero no se limitan a,
estafilococos (por ejemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis o Staphylococcus saprophyticus),
estreptococos (por ejemplo, Streptococcus pyogenes, Streptococcus
pneumoniae o Streptococcus agalactiae), enterococos (por
ejemplo, Enterococcus faecalis o Enterococcus
faecium), especies de corinebacterias (por ejemplo,
Corynebacterium diptheriae), bacilos (por ejemplo,
Bacillus anthracis), listeria (por ejemplo, Listeria
monocytogenes), especies de Clostridium (por ejemplo,
Clostridium perfringens, Clostridium tetanus, Clostridium
botulinum, Clostridium difficile), especies de Neisseria
(por ejemplo, Neisseria meningitidis o Neisseria
gonorrhoeae), E. coli, especies de Shigella,
especies de Salmonella, especies de Yersinia (por
ejemplo, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, o
Yersinia enterocolitica), Vibrio cholerae, especies de
Campylobacter (por ejemplo, Campylobacter jejuni o
Campylobacter fetus), Helicobacter pylori, pseudomonas
(por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa o Pseudomonas
mallei), Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis,
Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum, Legionella
pneumophila, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Borrelia
burgdorferi, micobacterias (por ejemplo, Mycobacterium
tuberculosis o Mycobacterium leprae), especies de
Actinomyces, especies de Nocardia, Chlamydia
(por ejemplo, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis o
Chlamydia pneumoniae), Rickettsia (por ejemplo,
Rickettsia ricketsii, Rickettsia prowazekii o Rickettsia
akari), Brucella (por ejemplo, Brucella abortus,
Brucella melitensis o Brucella suis), Proteus
mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter
anitratus, Klebsiella pneumoniae y Francisella
tularensis. Preferentemente, la bacteria es una o más del grupo
que está constituido por un estafilococo, un estreptococo, un
enterococo, un bacilo, un clostridium, E. coli, yersinia,
pseudomonas, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Enterobacter
clocae, Acetinobacter anitratus, Klebsiella pneumoniae o
Mycobacterium leprae. Más preferentemente, la bacteria es una
o más del grupo que está constituido por Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas
aeruginosa, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Serratia
marcescens, Enterobacter clocae, Acetinobacter anitratus,
Klebsiella pneumoniae y/o Escherichia coli.
Las realizaciones de esta invención también
pueden usarse para detectar uno o más tipos de hongos.
Preferentemente, los hongos son aquellos que son los más capaces de
producir daño a propiedades y/o aquellos que producen enfermedad en
mamíferos. Ejemplos de hongos incluyen Absidia, Acremonium,
Alternaria, Apophysomyces, Arthroderma, Aspergillus, Aureobasidium,
Basidiobolus, Beauveria, Bipolaris, Blastomyces, Botryosphaeria,
Candida, Capronia, Conidiobolus, Cladophialophora, Cladosporium,
Clavispora, Coccidioides, Cochliobolus, Cokeromyces, Coniothyrium,
Cryptococcus, Cunninghamella, Curvularia, Emericella, Epicoccum,
Epidermophyton, Exophiala, Exserohilum, Fennellia, Fonsecaea,
Fusarium, Gibberella, Helminthosporium, Histoplasma, Hortaea,
Hyphopichia, Issatchenkia, Kluyveromyces, Lacazia, Lasiodiplodia,
Leptosphaeria, Lewia, Madurella, Microsporum, Mortierella, Mucor,
Mycosphaerella, Nectria, Neosartorya, Neotestudina, Ochroconis,
Paracoccidioides, Penicillium, Phialophora, Pichia,
Plectosphaerella, Pseudallesheria, Pyrenochaeta, Rhizopus,
Saccharomyces, Saksenaea, Scedosporium, Setosphaeria, Sporothrix,
Stephanoascus, Stachybotrys (por ejemplo, Stachybotrys
chartarum o Stachybotrys echinata), Syncephalastrum,
Trichophyton, Wangliella y Yarrowia.
Estas listas de bacterias y hongos sólo
comprenden ejemplos de microorganismos a los que puede aplicarse
esta invención, y no pretenden ser exhaustivas. Esta invención
puede aplicarse a cualquier bacteria y hongo actualmente conocidos,
además de a cualquier especie que se descubra en el futuro.
En algunas realizaciones, la proteína que
interactúa con el sustrato para producir la modificación es una
enzima. Debido a que una pequeña cantidad de enzima puede catalizar
la renovación de una cantidad sustancial de sustrato, el basar un
sistema de detección en enzimas proporciona pruebas sensibles. En
otras realizaciones, las proteínas son enzimas específicas para
patógenos. Como se usa en este documento, una "enzima específica
para patógeno" es una enzima producida y/o segregada por un
microorganismo patógeno, pero no se produce y/o segrega por un
microorganismo no patógeno.
Esta invención incluye un procedimiento para
detectar la presencia o ausencia de una enzima en una muestra. En
un ejemplo, el procedimiento comprende las etapas de a) poner en
contacto la muestra con un sustrato en condiciones que darán como
resultado una modificación del sustrato por la enzima y b) detectar
la modificación o una ausencia de la modificación. La modificación
comprende hidrolizar al menos un enlace peptídico en el péptido y
dar como resultado que al menos una parte del péptido se escinde del
sustrato, incluyendo la parte del péptido escindida del sustrato
uno de los componentes colorimétricos y dando la escisión como
resultado un cambio de color visible, indicándose así la presencia
de la enzima en la muestra e indicando la ausencia de la
modificación la ausencia de la enzima en la muestra.
Las enzimas pueden agruparse en clases en tanto
que representen dianas para agentes de revelado para detectar los
microorganismos que las producen y las presenten sobre la superficie
celular o las segreguen a su entorno de crecimiento. Como se
describe en este documento, las enzimas se agrupan en nueve clases:
una lisina (es decir, una enzima que actúa para lisar células
huésped), una autolisina, una exotoxina, una enzima de unión a
matriz, una lipasa; una enzima de la pared celular (es decir, una
enzima que participa en la síntesis y la renovación de componentes
de la pared celular bacteriana, incluyendo peptidoglicano), una
proteasa (es decir, una enzima que escinde específicamente o no
específicamente un péptido, polipéptido o proteína), una hidrolasa
(es decir, una enzima que degrada moléculas poliméricas en sus
subunidades), una enzima metabólica (es decir, una enzima diseñada
para realizar diversas funciones de mantenimiento de la célula tales
como degradar nutrientes en componentes que son útiles para la
célula) o una enzima del factor de virulencia (es decir, una enzima
que es requerida por la célula bacteriana para producir una
infección).
Ejemplos de posibles muestras sobre/en las que
se detecta la presencia o ausencia de microorganismos incluyen una
herida; un fluido corporal (por ejemplo, tal como sangre, orina,
esputo o fluido de la herida tal como pus); un trozo de pelo; un
trozo de uña; un trozo de concha; un trozo de escama; un trozo de
pluma; un trozo de tejido (por ejemplo, una muestra de tejido
médico o un trozo de carne, pescado o carne de ave); cualquier
artículo sobre/en el cual puedan estar contenidos microorganismos
(por ejemplo, un artículo implantado en un cuerpo animal, catéter,
una bolsa de recogida de orina, una bolsa de recogida de sangre, una
bolsa de recogida de plasma, un disco, un microscopio, un filtro,
una lente, espuma, tela, papel, una sutura, un hisopo, un soporte
de hisopo, una tira reactiva, una esponja, un artículo polimérico,
un artículo hecho de una resina, un artículo de vidrio, un tubo de
ensayo o un pocillo de una microplaca); disoluciones para lentillas;
una esponja; un material polimérico; una membrana; un artículo
hecho de resina o vidrio; o una muestra obtenida con hisopo de un
área de una habitación o edificio (por ejemplo, una sala de
reconocimiento o quirófano de un centro sanitario, un baño, una
cocina o un centro de procesamiento o fabricación).
En otras realizaciones, la invención incluye un
biosensor para detectar la presencia o ausencia de microorganismos.
Estos biosensores pueden incorporar procedimientos de la invención
como se describen en este documento. En un ejemplo, el biosensor
comprende un soporte sólido y al menos un sustrato detectablemente
marcado unido al soporte sólido. En una realización, el sustrato
está covalentemente unido al soporte sólido. En otra realización,
el sustrato se adhiere o une al soporte sólido mediante
interacciones hidrófobas, hidrófilas y/o electrostáticas entre el
soporte sólido y el sustrato. En todavía otras realizaciones, el
sustrato se adhiere o une al soporte sólido mediante adsorción o
absorción. En otras realizaciones, el sustrato incluye un péptido y
al menos dos componentes colorimétricos unidos al péptido. El
péptido interactúa o reacciona específicamente con la proteína de
interés. En algunas realizaciones, los componentes colorimétricos
están covalentemente unidos al péptido.
En algunas realizaciones, el biosensor incluye
al menos un sustrato que interactúa o reacciona específicamente con
la proteína, enzima o microorganismo y al menos dos componentes
colorimétricos covalentemente unidos al péptido. La interacción o
reacción da como resultado que el sustrato produzca una señal
detectable para indicar la presencia de la proteína. En
realizaciones adicionales, el biosensor detecta una o más (por
ejemplo al menos \sim 2, al menos \sim 5, al menos \sim 10,
al menos \sim 20, al menos \sim 30, al menos \sim 50, al menos
\sim 75, o al menos \sim 100) proteínas descritas en este
documento y produce una señal (por ejemplo, un cambio de color
visible) para indicar la presencia de las proteínas.
En algunas realizaciones, esta invención incluye
un biosensor para detectar la presencia de al menos dos proteínas
incluyendo una primera proteína y una segunda proteína. Por ejemplo,
el biosensor de la presente invención puede incluir uno o más
sustratos (por ejemplo, al menos \sim 2, al menos \sim 5, al
menos \sim 10, al menos \sim 20, al menos \sim 30, al menos
\sim 50, al menos \sim 75, o al menos \sim 100 sustratos) que
pueden interactuar con una o más proteínas producidas y/o
segregadas. En un ejemplo, el biosensor comprende un soporte sólido,
al menos un primer sustrato detectablemente marcado y al menos un
segundo sustrato detectablemente marcado. Los sustratos
detectablemente marcados están unidos al soporte sólido. El primer
sustrato incluye un primer péptido y al menos dos componentes
colorimétricos unidos al primer péptido. El primer sustrato
reacciona específicamente con la primera proteína. Similarmente, el
segundo sustrato incluye un segundo péptido y al menos dos
componentes colorimétricos, y el segundo sustrato reacciona
específicamente con la segunda proteína.
En algunas realizaciones, al menos tres de los
cuatro componentes colorimétricos unidos al primer y segundo
sustrato son distintos. En estas realizaciones multicoloreadas, el
biosensor puede experimentar dos o más cambios de color visibles
distintos para indicar la presencia de una o más proteínas y/o
microorganismos distintos. Por ejemplo, si un tipo de sustrato se
diseña para reaccionar con un tipo de proteína mientras que un
segundo tipo de sustrato se diseña para reaccionar con una proteína
diferente, y ambos tipos de sustrato están incluidos sobre el
soporte sólido, puede diseñarse una pluralidad de cambios de colores
para indicar la presencia de una pluralidad de proteínas y/o
especies de microorganismos diferentes.
En una realización, el biosensor es para uso en
un ámbito hospitalario o de uso doméstico y es adecuado para
detectar microorganismos en una herida. En otras realizaciones
adicionales, el biosensor es para uso en un ámbito agrícola. Un
ejemplo de un biosensor en un ámbito agrícola es un sensor usado
para detectar la presencia de microorganismos en productos
alimenticios (por ejemplo, productos de carne, pescado o aves).
En algunas realizaciones, el biosensor se pone
en contacto directamente con un cuerpo animal (por ejemplo, un
cuerpo humano). En otras realizaciones, el biosensor se pone en
contacto directamente con una herida sobre un cuerpo animal. En
aquellas realizaciones en las que la muestra es una herida o fluido
corporal puede usarse una cubierta estéril o capa estéril para
prevenir contaminación de la herida o fluido corporal con el
contacto directo con el biosensor. En realizaciones adicionales, la
cubierta estéril tiene propiedades que la hacen adecuada para la
esterilización, sin embargo la cubierta estéril no interfiere con la
interacción proteína/sustrato. Ejemplos de procedimientos adecuados
para esterilizar el biosensor incluyen tratamiento con radiación
gamma. En otra realización, el biosensor se ve a través del vendaje
(por ejemplo, a través de una ventana transparente en el
vendaje).
Un procedimiento para hacer el biosensor de la
presente invención es determinar primero un sustrato específico que
pueda interactuar con una proteína característica específica del
microorganismo que va a detectarse. El sustrato específico
determinado se marca con uno o más componentes colorimétricos y se
une a un soporte sólido. Si el sustrato debe ponerse en contacto
con la proteína específica segregada o expresada por el
microorganismo de interés, la proteína modifica el sustrato de un
modo que da como resultado la detección de una modificación tal.
Por ejemplo, como se describe en este documento, la modificación
puede producir un cambio visible en el color.
Preferentemente, la parte del biosensor que se
pone en contacto con la muestra no se adherirá excesivamente a la
muestra, de manera que permite el fácil desprendimiento del
biosensor de la muestra. Por ejemplo, si el biosensor comprende un
vendaje para heridas, el vendaje se pone en contacto con la herida
durante un tiempo suficiente para que la proteína reaccione con el
sustrato, y luego se quita el vendaje de la herida sin producir una
lesión adicional a la herida o al tejido circundante.
A continuación sigue un ejemplo de un
procedimiento para desarrollar un ensayo para detectar un
microorganismo que produce al menos una proteína que es segregada o
se presenta sobre la superficie del microorganismo y un
procedimiento para usar el ensayo para detectar bacterias patógenas
que producen la(s) enzima(s). Este procedimiento no
pretende ser limitante en ningún modo ya que se conocen otros
procedimientos en la técnica.
- Etapa 1)
- Definir una secuencia de aminoácidos que únicamente identifique el microorganismo de interés. Alternativamente pueden determinarse (una o más) secuencias de aminoácidos que son únicas para un grupo específico de patógenos, por ejemplo, patógenos específicos para heridas.
Seleccionar una secuencia de aminoácidos, por
ejemplo, una proteína, péptido, o polipéptido (secuencia marcadora)
que únicamente caracteriza o marca la presencia del microorganismo o
grupo de microorganismos (por ejemplo, patógenos específicos para
heridas) de interés. La selección puede realizarse utilizando una
aproximación bioinformática, por ejemplo, como se describe más
adelante en detalle. Se determinan una o más secuencias de
aminoácidos que son únicas para un microorganismo específico.
- Etapa 2)
- Obtener suficiente proteína para determinar las condiciones que facilitan la modificación óptima de un sustrato por la enzima.
Aislar la proteína del medio extracelular en el
que crece el microorganismo que va a ensayarse, o de la membrana
celular del microorganismo, usando técnicas de purificación de
proteínas convencionales descritas, por ejemplo, en Ausubel
(anteriormente).
Alternativamente, si la secuencia genética que
codifica la proteína o la localización de la secuencia genética que
codifica la proteína son desconocidas, aislar y clonar la secuencia
genética que codifica el aminoácido marcador de la etapa 1, o
determinar primero la secuencia genética y luego proceder como
antes.
- Etapa 3)
- Determinar las condiciones para el crecimiento del microorganismo y para la producción de una proteína presentada sobre la superficie de la célula o segregada por la célula.
Determinar el medio requerido para el
crecimiento del microorganismo específico de interés y para la
expresión de su única proteína activa en el medio. También
determinar si se requiere una segunda molécula, por ejemplo una
enzima, para convertir la proteína específica de una forma de
precursor inactiva en una forma activa. Para determinar si la
proteína ha sido segregada en una forma activa se proporciona una
muestra del cultivo de microorganismos de posibles sustratos
elegidos y se determina la escisión de estos sustratos. Esto puede
hacerse, por ejemplo, combinando el microorganismo que produce la
proteína con el sustrato en los medios apropiados e incubando a
\sim 37ºC con agitación suave. A tiempos prefijados (por ejemplo
\sim 0,1, \sim 0,3, \sim 1,0, \sim 3,0, \sim 5,0, \sim
24 y \sim 48 horas), las muestras se centrifugan para desactivar
el microorganismo y se saca una pequeña alícuota para una muestra
en gel de SDS-PAGE. Después de completarse el
periodo de tiempo, las muestras se ejecutan en aproximadamente un
gradiente del 10-15% de minigel de
SDS-PAGE. Entonces, las proteínas se transfieren a
Immobilon Pseq (tampón de transferencia, \sim 10% CAPS, \sim 10%
de metanol pH \sim 11,0, \sim 15 V durante \sim 30 minutos)
usando un aparato de transferencia semi-seca
Bio-Rad. Tras la transferencia de las proteínas, la
transferencia se tiñe con azul de Coomassie R-250
(\sim 0,25% de Coomassie Brilliant Blue R-250,
\sim 50% de metanol, \sim 10% de ácido acético) y se destiñe
(alta decoloración durante -5 minutos, \sim 50% de metanol, \sim
10% de ácido acético; baja decoloración hasta que se completa,
\sim 10% de metanol, \sim 10% de ácido acético) seguido por
secuenciación del extremo N. Alternativamente, las muestras pueden
ejecutarse en un espectrómetro de masas con el fin de mapear los
sitios de escisión.
Opcionalmente, la(s) proteína(s)
producida(s) por los microorganismo(s) en el medio de
crecimiento se comparan con muestras tomadas de muestras clínicas
para garantizar que los microorganismos producen la proteína en el
(los) entorno(s) en el (los) que va(n) a detectarse.
Por ejemplo, las proteínas encontradas en una muestra tomada de un
sitio de la herida de un paciente en el hospital pueden analizarse y
compararse con las proteínas producidas por el microorganismo que
crece en la muestra. De este modo puede confirmarse que el
microorganismo produce la proteína en una muestra o entorno de
prueba real y que la proteína puede formar la base para el
procedimiento de detección.
- Etapa 4)
- Identificar cualquier sustrato peptídico específico de la proteína activa. Marcar cada sustrato con una marca detectable descrita en este documento
- Etapa 5)
- Aumentar la especificidad de la interacción proteína-sustrato (opcional) determinando el sitio activo o de unión de la proteína (por ejemplo, usando los componentes colorimétricos como se describen anteriormente), luego determinar la secuencia genética útil para producir el sitio activo o de unión y clonar la secuencia genética determinada para generar un sustrato más específico.
- Etapa 6)
- Proporcionar un biosensor que comprenda uno o más de los sustratos detectablemente marcados identificados anteriormente para la detección de la proteasa de las bacterias patógenas de interés.
\newpage
El sustrato puede unirse al soporte sólido, por
ejemplo, un vendaje para heridas, o un artículo que soporta la
proteína y el sustrato, por ejemplo, un tubo o bolsa de recogida de
fluido corporal, un pocillo de microplaca o un tubo de ensayo. El
soporte sólido, si se desea, puede proporcionar una pluralidad de
sitios de unión derivatizados para el acoplamiento al sustrato, por
ejemplo, sitios de amina primaria marcada con éster succimidílico
sobre placas derivatizadas (placas de unión XENOBIND^{TM}
disponibles de Xenopore Corp. Hawthorne, Nueva Jersey).
Opcionalmente, acoplar, por ejemplo, albúmina de suero bovino, al
mismo bloquea los sitios reactivos sin ocupar sobre el soporte
sólido.
Permitir que la(s) proteína(s) se
ponga(n) en contacto con el (los) sustrato(s) y
supervisar la reacción para una modificación en el sustrato
detectablemente marcado, como se describe en este documento. La
modificación del sustrato indica que la proteína producida y/o
segregada por el microorganismo está presente en la reacción.
Además, la ausencia de la modificación del sustrato indica que la
proteína no está presente en la muestra. Si el microorganismo o la
proteína son de una herida, la modificación del sustrato indica que
el microorganismo está presente en la herida, mientras que la
ausencia de la modificación del sustrato indica que la bacteria
particular no está presente en la herida.
La presente invención se ilustrará ahora por los
siguientes ejemplos que no pretenden ser limitantes en ningún
modo.
En este ejemplo, los péptidos con colas de
histidina se purificaron basándose en la capacidad de los residuos
de histidina consecutivos de unirse a una resina (por ejemplo,
SEPHAROSE®) que contiene iones níquel inmovilizados mediante NTA
covalentemente unido.
Los péptidos CPI3, Papa4 y LL3 se marcaron sobre
el sitio de la cisteína con Reactive Black 5. El péptido SSP3 se
marcó sobre el sitio de serina con Reactive Blue 4. Después de la
purificación y la caracterización, los cuatro péptidos se unieron a
resina de NTA en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH
\sim 7,4 durante \sim 2 horas a aproximadamente temperatura
ambiente. Entonces, la resina se aclaró exhaustivamente con PBS. La
resina de NTA dio un alto nivel de unión a péptido (azul muy oscuro)
sin unión no específica como se demostró por la unión muy pequeña
con péptidos con colas de histidina o colorantes reactivos
libres.
Los péptidos CPI3 y Papa4 sobre la resina de NTA
es escindieron con Pseudomonas aeruginosa (PA14), el péptido
SSP3 se escindió con Serratia marcescens y el péptido LL3 se
escindió con Streptococcus pyogenes a \sim 37ºC. La parte
del péptido escindida de la superficie del sensor se diseñó
específicamente para contener el componente de colorante y se
recogió sobre una membrana cargada positivamente separada (membrana
SB-6407, disponible de Pall Corporation, East
Hills, Nueva York). El Reactive Black 5 contiene cargas negativas
que fueron atraídas a la membrana del colector. Esta interacción
produjo un cambio de color de blanco a azul sobre la membrana del
colector. Las muestras de control constituidas por las membranas del
colector se añadieron a la resina sin bacterias. Se obtuvo una
fuerte diferencia de color sobre las membranas del colector con
bacterias cuando se compararon con los controles. El concepto de
este experimento se muestra en la figura 11. Después de la
exposición a las bacterias, las membranas de control permanecieron
sin colorear o claramente tenían menos colorido que las membranas
del colector que se expusieron a las bacterias.
El péptido CPI3 marcado con Reactive Black 5 se
unió a una resina de NTA y se aclaró exhaustivamente. Entonces, la
resina se secó en un tubo de centrífuga con filtro y se extendió
sobre una lámina de plástico adhesiva. La resina se empapó de PBS y
se aclaró exhaustivamente para eliminar el material libremente
unido. Entonces se hicieron un sensor de control y uno de ensayo
colocando una membrana del colector (membrana
SB-6407, disponible de Pall Corporation, East
Hills, Nueva York) sobre la superficie. De este modo se obtuvo un
sensor usando resina de NTA para unir el péptido sobre una
superficie. Uno de los sensores se expuso a Pseudomonas
aeruginosa (PA14) a \sim 37ºC y el péptido escindido con
colorante se recogió sobre la membrana del colector. El control
sólo se expuso a PBS. El sensor que se expuso a las bacterias
expresó un color transparente, mientras que el control mostró poco
o ningún cambio en el color.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ejemplo, una membrana cargada
negativamente (membrana ICE-450, disponible de Pall
Corporation, East Hills, Nueva York) se usó para unir péptidos que
contenían una región cargada positivamente en el extremo del
péptido (es decir, las argininas de los péptidos). Los péptidos se
marcaron con colorantes cargados negativamente que cuando estaban
contenidos sobre la parte escindida del péptido tenían baja afinidad
por la membrana cargada negativamente, pero una alta afinidad por
una membrana del colector cargada positivamente (membrana
SB-6407, disponible de Pall Corporation, East
Hills, Nueva York). Este concepto se muestra en la figura 12.
Los péptidos CPI4, Papa5 y T5 se marcaron sobre
el sitio de la cisteína con Reactive Black 5. Después de la
purificación y la caracterización, los tres péptidos se unieron a la
membrana ICE-450 cargada negativamente en solución
salina tamponada con fosfato (PBS) pH \sim 7,4 durante la noche.
Entonces, las membranas se aclararon con PBS. A continuación se
colocaron membranas positivamente cargadas (membrana
Sub-6407, disponible de Pall Corporation, East
Hills, Nueva York) sobre cualquiera de los dos lados del péptido
unido a la membrana en PBS para quitar cualquier material
libremente unido. El material no específicamente unido se eliminó
recogiéndolo sobre la membrana cargada positivamente. Las membranas
unidas a péptido se limpiaron de este modo hasta que se ve que no
se desprende color de las membranas.
Los péptidos CPI4 y Papa5 sobre la membrana del
sensor cargada negativamente es escindieron con Pseudomonas
aeruginosa (PA14) y el péptido T5 se escindió con Escherichia
coli a \sim 37ºC. El péptido CPI4 sobre la membrana del
sensor cargada negativamente también se escindió con
Streptococcus pyogenes. El péptido escindido de la
superficie de los sensores se diseñó específicamente para contener
el componente de colorante y se recogió con una membrana cargada
positivamente separada (membrana SB-6407, disponible
de Pall Corporation, East Hills, Nueva York). Esta interacción
produjo un cambio de color de blanco a azul sobre la membrana del
colector. Las muestras de control constituidas por las membranas
del colector se añadieron al sensor con sólo PBS. Los resultados
experimentales se muestran en la figura 13. Se obtuvo un cambio de
color sobre las membranas del colector con bacterias cuando se
comparó con los controles para todos los péptidos descritos
anteriormente.
En otra realización, los péptidos marcados con
Reactive Black 5 se adsorbieron sobre membranas de papel P4
(disponibles de Fisher Scientific International Inc. Hampton, New
Hampshire) siguiendo el mismo protocolo que se describe
anteriormente. Los péptidos que se usaron fueron Papa4 y LL3 que
contenían ambos colas de histidina. Los sensores de membrana P4 de
Papa4 y LL3 se escindieron ambos con Pseudomonas aeruginosa
(PA14) a \sim 37ºC y la parte escindida del péptido se recogió
sobre una membrana SB-6407. El control consistió en
la adición de PBS sólo a las membranas de los sensores. Los
resultados se muestran en la figura 14. Se obtuvo un cambio de
color sobre las membranas del colector con bacterias cuando se
comparó con los controles para todos los péptidos descritos
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Muchos de los sustratos peptídicos se marcaron
con colorantes reactivos. Los colorantes de vinilsulfona se usaron
para elegir como diana grupos de cisteína sobre los péptidos. Los
colorantes de mono y diclorotriazina se usaron para elegir como
diana grupos de serina sobre los péptidos. Los colorantes de cloruro
de sulfonilo y éster N-hidroxisulfosuccinimidílico
(sulfo-NHS) se usaron para elegir como diana grupos
de amina sobre los péptidos.
Un ejemplo de un procedimiento de marcado para
el marcado del péptido CPI4 con Reactive Black 5 se muestra en la
tabla 1. CPI4 contiene dos grupos de cisteína que son elegidos como
diana por Reactive Black 5 (un colorante de REMAZOL®) en
condiciones básicas. La siguiente tabla demuestra que los diferentes
niveles de marcado (como es evidente por la relación de colorante
respecto a péptido) pueden obtenerse variando las condiciones de
marcado. El péptido estaba a \sim 5 mg/ml en agua, Reactive Black
5 estaba a \sim 5 mg/ml en agua y el Na_{2}CO_{3} estaba a
\sim 10 mg/ml en agua. El marcado fue \sim 18 horas a \sim
37ºC.
El marcado de péptidos con colorantes de
triazina también se realizó en condiciones básicas. Los colorantes
de triazina eligieron preferencialmente como diana grupos de serina.
Los resultados en la tabla 2 se obtuvieron bajo un conjunto de
condiciones de reacción para cada colorante. El péptido estaba a
\sim 5 mg/ml en agua, los colorantes estaban a \sim 10 mg/ml en
agua y el Na_{2}CO_{3} estaba a \sim 10 mg/ml en agua. El
marcado fue 18 horas a \sim 37ºC.
La tabla 2 demuestra que es posible marcar los
péptidos con muchos colorantes de triazina diferentes para obtener
diferentes colores. Las condiciones de marcado pueden mejorarse como
se muestra en la tabla 1 para cada uno de estos colorantes
dependiendo del uso específico y la relación de colorante respecto a
péptido deseada.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo se refiere a una realización de la
invención en la que el sustrato incluye al menos dos componentes
colorimétricos. El péptido incluye dos aminoácidos diana para marcar
con dos colorantes coloreados. No se requieren grupos protectores
si los colorantes eligen como diana dos aminoácidos diferentes, por
ejemplo serina y cisteína. El hacer reaccionar el péptido con uno
de los colorantes coloreados, purificarlo, concentrarlo y luego
hacerlo reaccionar con el segundo colorante coloreado puede realizar
el marcado. El marcado también puede realizarse mediante la
reacción con ambos colorantes coloreados eligiendo como diana
diferentes aminoácidos al mismo tiempo y luego purificándolos y
concentrándolos.
Se usó el péptido JMH001. Se usó un colorante
coloreado de azul (por ejemplo, Reactive Black 5, que es un
colorante de REMAZOL®) para elegir como diana el grupo de cisteína
en un extremo del péptido y un colorante coloreado de amarillo (por
ejemplo, Reactive Yellow 86, que es un colorante de triazina) se usó
para elegir como diana el grupo de serina en el otro extremo del
péptido. Este reactivo particular se hizo en dos etapas. El
Reactive Black 5 se hizo reaccionar con JMH001 en tampón carbonato
de pH \sim 10 con aproximadamente un exceso molar de
2-5 de colorante respecto a péptido. Después de la
purificación, el péptido marcado se hizo reaccionar con Reactive
Yellow 86 con aproximadamente un exceso molar de 5 del colorante y
Na_{2}CO_{3}. El JMH001 marcado con Reactive Black 5 (centro
del tubo) mostró un color azul antes de marcar con Reactive Yellow
86. El péptido con doble marcado purificado (JMH001 con Reactive
Black 5 y Reactive Yellow 86) mostró un color verde.
La figura 15 muestra el espectro UV/visible de
JMH001 con doble marcado. El máximo de absorbancia de Reactive
Black 5 se observa a \sim 595 nm y el máximo de absorbancia de
Reactive Yellow 86 se observa a aproximadamente \sim 400 nm. Los
cálculos de colorante respecto a péptido para este marcado
particular fueron \sim 0,4 para Reactive Black 5 y \sim 1,4
para Reactive Yellow 86. La relación de colorante respecto a
proteína anterior superior a \sim 1,0 para Reactive Yellow 86
puede ser debida a una diferencia del coeficiente de extinción ya
que se usó en una forma sin purificar. Por ejemplo, un alto nivel
de marcado de Reactive Black 5 puede no producir un color verde con
Reactive Yellow 86 altamente marcado ya que el reactivo Black 5
tiene un coeficiente de extinción superior al de Reactive Yellow
86. Para los péptidos con doble marcado, la elección de los dos
colorantes y las condiciones de marcado pueden optimizarse para
obtener el color mezclado deseado de los dos.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
El péptido CPI3 se marcó tanto con Reactive
Black 5 como con CIBACRON^{TM} Brilliant Yellow 3
G-P creando un péptido coloreado de azul claro
sobre papel P4. Variando los niveles de marcado de Reactive Black 5
y CIBACRON^{TM} Brilliant Yellow 3 G-P pudo
producirse un péptido de color más verde. El péptido CPI3 con doble
marcado se adsorbió sobre papel P4 y se aclaró exhaustivamente. Las
membranas cargadas positivamente (membrana SB6407, disponible de
Pall Corporation, East Hills, Nueva York) se colocaron sobre
cualquiera de los dos lados de la membrana P4 para extraer
cualquier material libremente adsorbido. Después de aclararse
completamente la membrana, el CPI3 con doble marcado sobre P4 se
colocó en \sim 100 \mul de PBS con una membrana del colector
del colorante (membrana SB6407, disponible de Pall Corporation, East
Hills, Nueva York) como control. El CPI3 con doble marcado sobre P4
se colocó en \sim 75 \mul de PBS con -25 \mul de
Pseudomonas aeruginosa (PA14) que crece durante la noche con
una membrana del colector del colorante (membrana SB6407, disponible
de Pall Corporation, East Hills, Nueva York). Las muestras se
dejaron durante \sim 18 horas a \sim 37ºC. La membrana del
colector del colorante de la membrana de CPI3/P4 con doble marcado
expuesta a las bacterias mostró un cambio de color mientras que la
membrana del colector de control permaneció blanca. La membrana del
colector de la muestra expuesta a bacterias pareció mostrar
colorante tanto azul como amarillo por lo que era probable que
ambas partes escindidas del péptido CPI3 migraran a la membrana o
que la parte amarilla del péptido permaneciera detrás sobre el
papel P4, pero era de un color muy claro. Cuando el mismo sustrato
de CPI3 con doble marcado se unió por su cola de histidina a la
resina de NTA y se escindió con PA14, la membrana del colector
mostró un color azul, mientras que la resina de NTA también mostró
algo de color azul residual con un matiz de amarillo.
\vskip1.000000\baselineskip
En algunas realizaciones, tanto el sustrato como
el soporte sólido incluyen componentes colorimétricos. En
realizaciones adicionales, con la escisión del péptido, la parte
escindida del péptido que incluía un componente colorimétrico se
elimina y el color del colorante restante puede observarse sobre el
soporte. De este modo, modificación del sustrato producirá una
señal visible que incluye un cambio de color desde el del colorante
mezclado hasta el del soporte sólido. Opcionalmente, la señal
incluye capturar la parte escindida del péptido sobre un colector.
De este modo, por la modificación se producen dos señales; una se
expresa sobre el soporte sólido y una se expresa sobre el
colector.
Para ilustrar esta realización de dos
colorantes, el papel P4 marcado con amina se coloró con cloruro de
sulfonilo de lisamina-rodamina B y con cloruro de
dabsilo para crear membranas rosas y amarillas, respectivamente.
Brevemente, \sim 10 \mul de una solución de colorante de \sim
5 mg/ml en dimetilformamida (DMF) se añadió a \sim 190 \mul de
DMF y se hizo reaccionar con el papel P4 marcado con amina durante
la noche a temperatura ambiente. Después de un aclarado exhaustivo
y la eliminación del colorante con membranas de
SB-6407 cargadas positivamente, el CPI4 marcado con
Reactive Black 5 (relación de colorante/péptido de 2,0) se adsorbió
sobre la membrana de \sim 5 \mul en \sim 95 \mul de
solución de PBS durante la noche a temperatura ambiente. Después de
un aclarado exhaustivo y la eliminación del colorante con membranas
de SB-6407 cargadas positivamente, las membranas
resultantes mostraron el color mezclado de púrpura (creado por una
mezcla de azul y rosa) y verde oscuro (creado por una mezcla de
azul y amarillo).
\vskip1.000000\baselineskip
Los péptidos se prepararon mediante química de
acoplamiento convencional de Fmoc/Boc sobre resina de cloruro de
2-clorotritilo (una resina "supersensible a
ácidos" disponible de Bachem, Bubendorf, Suiza). En esta
metodología, los péptidos se preparan usando aminoácidos protegidos
con \alpha-N
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); los grupos
funcionales de las cadenas laterales se protegen principalmente con
grupos butoxioxicarbonilo (Boc) o terc-butilo
(t-Bu), aunque también pueden usarse otros grupos sensibles a
ácidos. Los péptidos crecen a partir de una perla mediante adición
escalonada de aminoácidos a la superficie. El resto de ácido
aminocarboxílico se acopla primero a un grupo reactivo libre
(normalmente una amina) sobre la superficie de la perla dando un
enlace amida. Los grupos Fmoc sensibles a bases se eliminan en una
solución al 30% de piperidina en dimetilformamida (DMF) durante 20
minutos, las perlas se lavan exhaustivamente y se introduce el
siguiente aminoácido. La continuación de este procedimiento da como
resultado la construcción de la estructura de poliamida deseada que
crece a partir de las perlas del extremo C hasta el extremo N.
Con la desprotección de Fmoc del aminoácido
final, la resina se hizo reaccionar luego con
lisamina-rodamina B que contenía un grupo cloruro
de sulfonilo. Los cloruros de sulfonilo reaccionan rápidamente con
los grupos de amina primaria dando una sulfonamida. El colorante
sin reaccionar libre se eliminó mediante lavados exhaustivos con
DMF, acetona e isopropanol. Una vez las aguas de lavado estuvieron
libres de colorante, el péptido protegido de las cadenas laterales
se desacopló de la perla en una solución al 1% de ácido
trifluoroacético (TFA) en diclorometano (DCM). La resina de cloruro
de 2-clorotritilo liberará los péptidos en
concentraciones muy bajas de ácido. Normalmente, los péptidos
crecen a partir de resinas de tipo Wang en condiciones muy ácidas
(\sim 80-100% de TFA); estas condiciones no sólo
desacoplarán el péptido de la perla, sino que también desprotegerán
los grupos laterales del péptido. En este caso, el uso de 1% de TFA
en DCM fue suficiente para desacoplar el péptido marcado con
colorante de la perla sin ninguna pérdida perceptible de grupos
protectores de las cadenas laterales. Esto proporciona una gran
molécula con sólo un grupo funcional de ácido carboxílico reactivo
en el extremo C. Este péptido marcado protegido se hizo reaccionar
luego sobre papel marcado con amina usando el mismo procedimiento
de acoplamiento que el usado para preparar el esqueleto del péptido.
Entonces, estos paneles de péptidos se desprotegieron completamente
usando 85% de TFA, 5% de agua, 5% de tioanisol y 5% de fenol
proporcionando un sensor de péptidos activos marcado con un
colorante rosa.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Las muestras se esterilizaron con óxido de
etileno (OET) en condiciones comúnmente usadas para la
esterilización de catéteres. Aunque la señal se redujo
aproximadamente el 21% después de la esterilización con OET, el
conjugado de colorante tenia la misma cinética de reacción en
presencia de Pseudomonas o Enterococcus, como se
muestra en las figuras 16 y 17, respectivamente. Esto muestra que
los sensores pueden esterilizarse usando OET sin una reducción
significativa en la sensibilidad o reactividad con extractos
bacterianos. Una observación muy interesante es que las muestras
tratadas con óxido de etileno tenían menores señales de fondo. Esto
indica que el procedimiento de esterilización redujo la filtración
de colorante sin incorporar.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido CPI3 es una versión con una cola de
5-histidina del péptido CPI2 de amplio espectro
usado para la detección de múltiples patógenos. Se añadió un grupo
de cisteína sobre el extremo N para permitir el marcado con
colorante:
- CPI3
- [Ac]-CGAMFLEAIPMSIPAAAHHHHH-[OH].
El péptido CPI3 se marcó con colorante de
yodoacetamida de tetrametilrodamina (TMRIA) (disponible de Molecular
Probes, Eugene, Oregon) sobre el grupo de cisteína. La reacción de
marcado se realizó en PBS pH 7,4 con un exceso de colorante de
TMRIA. La relación de colorante respecto a péptido se calculó que
era aproximadamente 1,0.
Aproximadamente 1 mg de CPI3 marcado con
colorante de TMRIA se unió a 1 ml de perlas de agarosa (obtenidas
de Qiagen, Valencia, California) con níquel-ácido nitrilotriacético
(Ni-NTA) por la cola de 5-histidina
sobre el péptido. Esencialmente se unió todo el CPI3 a las perlas
de Ni-NTA, como se demuestra por la pérdida de
color de la solución.
Un volumen de perlas de 50 \mul de
CPI3-TMRIA se colocó en tubos y se añadieron 200
\mul de 1x10^{4} o 1x10^{5} ufc por ml de Enterococcus
faecalis y se dejaron incubar durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Las proteasas bacterianas escindieron el CPI3 de forma que
se liberó un fragmento de colorante-péptido de las
perlas de Ni-NTA. Las perlas se separaron de la
solución mediante una corta centrifugación con una microcentrífuga.
Los volúmenes y las concentraciones bacterianas correspondientes
(por ejemplo, 100 \mul de 1x10^{5} ufc/\mul) para obtener
10^{5}, 10^{6}, 10^{7} equivalentes de ufc se eliminaron de
los tubos y se colocaron en la punta de un jeringa de 1 ml. Como
control se usó solución salina tamponada con fosfato sin bacterias
añadidas. Entonces, la jeringa se colocó en la parte superior de una
junta tórica de tamaño compatible sobre una membrana de
poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) forrada con papel de
filtro y el émbolo se bajó para forzar al líquido a través de la
membrana. Los fragmentos de colorante-péptido se
retuvieron en la superficie de la membrana de PVDF y a través del
papel de filtro sólo pasó el líquido sin colorar. Después de 5
minutos, la membrana de PVDF expuesta a 10^{7} ufc/ml de líquido
presentó la respuesta de color más brillante, mientras que la
membrana de PVDF expuesta a 10^{6} ufc/ml de líquido presentó
menos de una respuesta de color que la membrana expuesta a 10^{7}
ufc/ml de líquido. Después de 5 minutos, la membrana de PVDF
expuesta a 10^{5} ufc/ml de líquido presentó menos de una
respuesta de color que la membrana expuesta a 10^{6} ufc/ml de
líquido, mientras que la membrana expuesta a 0 ufc/ml de líquido no
presentó respuesta de color apreciable.
\vskip1.000000\baselineskip
Los sensores que incluían SAP2 se incubaron en
presencia de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Streptococcus pyogenes, Escherichia coli y Enterococcus
faecalis a 37ºC durante 60 minutos. Se usó la transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia (FRET) con una excitación de
340 y una emisión 490 nm para medir la intensidad de la señal
resultante. Sólo la muestra de Staphylococcus aureus pudo
hidrolizar el péptido, activándose así la fluorescencia extinguida
de la molécula de EDANS. Esto indica que SAP2 es adecuado para uso
en sensores que puedan detectar específicamente la presencia de
Staphylococcus aureus.
Aunque esta invención se ha mostrado y descrito
particularmente con referencia a las realizaciones preferidas de la
misma, aquellos expertos en la materia entenderán que en ella pueden
hacerse diversos cambios en la forma y detalles sin apartarse del
alcance de la invención englobado por las reivindicaciones
adjuntas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Ethicon, Inc.
\hskip1cmExpressive Constructs, Inc.
\hskip1cmSanders, Mitchell C.
\hskip1cmColpas, Gerard J.
\hskip1cmEllis-Busby, Diane L.
\hskip1cmHavard, Jennifer M.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Sustratos colorimétricos, sensores
colorimétricos y procedimientos de uso
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P043712EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 04817523.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
11-03-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/516.688
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-03-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/578.502
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-09-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANT
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 17
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
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\hskip1cm
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<210> 18
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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<400> 18
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\hskip1cm
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<210> 19
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\hskip1cm
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<210> 20
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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<400> 20
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\hskip1cm
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<210> 21
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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<400> 21
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\hskip1cm
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<210> 22
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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\hskip1cm
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<210> 23
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<211> 22
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia de péptidos sintética
\newpage
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<400> 23
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\hskip1cm
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<210> 24
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<211> 25
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<212> PRT
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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<400> 24
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\hskip1cm
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<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de péptidos sintética
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<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
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<211> 13
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de péptidos sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (21)
1. Un procedimiento de detección de la presencia
o ausencia de un microorganismo que comprende detectar la
modificación de un sustrato peptídico que comprende las etapas
de:
- a)
- exponer un sustrato peptídico sin modificar a una muestra que va a probarse para la presencia de un microorganismo en condiciones que darán como resultado una modificación del sustrato peptídico, en donde el sustrato peptídico sin modificar comprende un primer componente colorimétrico de colorante reactivo acoplado a una parte del péptido; y
- b)
- detectar una modificación del sustrato peptídico o una ausencia de la modificación del sustrato peptídico, en donde la modificación comprende escindir la parte del péptido que comprende el primer componente colorimétrico de colorante reactivo,
en el que la escisión da como resultado un
cambio de color visible;
en el que el sustrato peptídico incluye al menos
un miembro del grupo que está constituido por:
- la secuencia de péptidos LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES en la que X puede ser cualquier aminoácido;
- la secuencia de péptidos KAAHKSALKSAE;
- la secuencia de péptidos KKASEAAHKSALKSAE;
- la secuencia de péptidos CHHHASEAAHKSALKSAE;
- la secuencia de péptidos KHLGGGALGGGAKE;
- la secuencia de péptidos KHLGGGGGAKE; y
- la secuencia de péptidos PGTKLYTVPW,
y
en el que además el primer componente
colorimétrico de colorante reactivo es uno de los miembros del grupo
que está constituido por:
- un colorante de monohalotriazina; un colorante de dihalotriazina; un colorante de 2,4,5-trihalopirimidina; un colorante de 2,3-dihaloquinoxalina; un colorante funcionalizado con éster N-hidroxisulfosuccinimidílico (sulfo-NHS); un colorante funcionalizado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS); un colorante de vinilsulfona; un colorante de cloruro de sulfonilo; un colorante funcionalizado con éster tetrafluorofenílico; un colorante funcionalizado con isotiocianato; y un colorante funcionalizado con yodoacetilo.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en
el que el primer componente colorimétrico de colorante reactivo
está covalentemente unido al sustrato peptídico.
3. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la modificación incluye la
hidrólisis de un enlace peptídico del sustrato sin modificar y da
como resultado que la parte acoplada al colorante reactivo del
péptido se desprenda del sustrato y migre hacia un colector.
4. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que el cambio de color
visible es una pérdida de color.
5. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que el sustrato
peptídico sin modificar incluye adicionalmente un segundo
componente colorimétrico acoplado al sustrato peptídico que es
distinto del primer componente colorimétrico de colorante
reactivo.
6. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, en el que el sustrato
peptídico está acoplado a un soporte sólido.
7. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en el que la modificación del sustrato da como resultado un tono
del soporte sólido que se vuelve más visible.
8. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 ó 7, en el que el péptido está covalentemente
unido al soporte sólido.
9. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 7 u 8, en el que el soporte sólido se selecciona
del grupo que está constituido por un vendaje para heridas, un
material esterilizado, un artículo que contiene la muestra, un
artículo que recoge la muestra, un polímero, una membrana, una
resina, vidrio, una esponja, un disco, un microscopio, un filtro,
una lente, una espuma, una tela, un papel, una sutura y una
bolsa.
10. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-9, en el que la muestra es al
menos una del grupo constituido por una superficie de herida sobre
un sujeto, un fluido corporal, un trozo de pelo, un trozo de uña,
un trozo de concha, un trozo de escama, un trozo de pluma, un trozo
de tejido, un artículo implantado en el cuerpo de un animal, un
catéter, una bolsa de recogida de orina, una bolsa de recogida de
sangre, una bolsa de recogida de plasma, un disco, un microscopio,
un filtro, una lente, espuma, tela, papel, una sutura, un hisopo,
una tira reactiva, una esponja, un artículo polimérico, un artículo
hecho de una resina, un artículo de vidrio, un tubo de ensayo, un
pocillo de una microplaca, una parte de solución para lentillas, una
esponja, un material polimérico, una membrana, un artículo hecho de
resina, un artículo hecho de vidrio y un hisopo.
11. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, en el que la modificación del
sustrato incluye escindir una parte del péptido para producir una
parte escindida, incluyendo la parte escindida el primer componente
colorimétrico, dando la modificación como resultado la migración de
la parte escindida hacia un colector y dando la migración como
resultado un cambio de color visible.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que el colector incluye al menos un material seleccionado del
grupo que está constituido por una membrana, una resina, un
polímero, una película, vidrio o un material quelante.
13. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la modificación del
sustrato se usa para indicar la presencia de una enzima bacteriana
seleccionada del grupo que está constituido por una lisina, una
autolisina, una lipasa, una exotoxina, una enzima de la pared
celular, una enzima de unión a matriz, una proteasa, una hidrolasa,
una enzima del factor de virulencia y una enzima metabólica.
14. Un biosensor para detectar la presencia o
ausencia de un microorganismo detectando la presencia o ausencia de
una enzima producida por el microorganismo comprendiendo el
biosensor un sustrato peptídico que reacciona específicamente con
la enzima y un primer componente colorimétrico de colorante reactivo
acoplado a una parte del sustrato peptídico;
en el que el sustrato peptídico incluye al menos
un miembro del grupo que está constituido por:
- la secuencia de péptidos LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVXRIKDFLRNLVPRTES en la que X puede ser cualquier aminoácido;
- la secuencia de péptidos KAAHKSALKSAE;
- la secuencia de péptidos KKASEAAHKSALKSAE;
- la secuencia de péptidos CHHHASEAAHKSALKSAE;
- la secuencia de péptidos KHLGGGALGGGAKE;
- la secuencia de péptidos KHLGGGGGAKE; y
- la secuencia de péptidos PGTKLYTVPW,
y
en el que además el primer componente
colorimétrico de colorante reactivo es uno de los miembros del grupo
que está constituido por:
- un colorante de monohalotriazina; un colorante de dihalotriazina; un colorante de 2,4,5-trihalopirimidina; un colorante de 2,3-dihaloquinoxalina; un colorante funcionalizado con éster N-hidroxisulfosuccinimidílico (sulfo-NHS); un colorante funcionalizado con N-hidroxisuccinimidilo (NHS); un colorante de vinilsulfona; un colorante de cloruro de sulfonilo; un colorante funcionalizado con éster tetrafluorofenílico; un colorante funcionalizado con isotiocianato; y un colorante funcionalizado con yodoacetilo.
15. Un biosensor según la reivindicación 14, en
el que el primer componente colorimétrico de colorante reactivo
está covalentemente unido al sustrato peptídico.
16. Un biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones 14 ó 15 que incluye adicionalmente un segundo
componente colorimétrico acoplado al sustrato peptídico, siendo el
segundo componente colorimétrico distinto del primer componente
colorimétrico de colorante reactivo.
\newpage
17. Un biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones 14-16 que incluye adicionalmente un
soporte sólido, estando el sustrato peptídico acoplado al soporte
sólido.
18. Un biosensor según la reivindicación 17, en
el que el sustrato peptídico está covalentemente unido al soporte
sólido.
19. Un biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones 17 ó 18, en el que el soporte sólido se selecciona
del grupo que está constituido por un vendaje para heridas, un
material esterilizado, un artículo que contiene una muestra, un
artículo que recoge una muestra, un polímero, una membrana, una
resina, vidrio, una esponja, un disco, un microscopio, un filtro,
una lente, una espuma, una tela, un papel, una sutura y una
bolsa.
20. Un biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones 14-19 que incluye adicionalmente un
colector que incluye al menos un material seleccionado del grupo
que está constituido por una membrana, una resina, un polímero, una
película, vidrio o un material quelante.
21. Un biosensor según cualquiera de las
reivindicaciones 14-20, en el que el sustrato
peptídico incluye una secuencia de péptidos que reacciona
específicamente con una enzima seleccionada del grupo que está
constituido por una lisina, una autolisina, una lipasa, una
exotoxina, una enzima de la pared celular, una enzima de unión a
matriz, una proteasa, una hidrolasa, una enzima del factor de
virulencia y una enzima metabólica.
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