JP2001161394A - 細菌の鑑別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細菌、例えばヘモフィルス属を迅速、簡便に
鑑別できる方法を提供する。 【解決手段】 ５−アミノレブリン酸を含ませた吸水性
を有する担体と被検試料を培養して培地上に発育した孤
立集落を直接接触させ、細菌が有する酵素活性により５
−アミノレブリン酸から生成した物質を、紫外線照射に
よる発蛍光または呈色液添加による発色として検出す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生化学的性状によ
る細菌の鑑別方法において、当該細菌が有する酵素活性
を利用して鑑別する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査における細菌の鑑別は、通常、
培地上の孤立集落を純培養した後、その生化学的性状を
鑑別表に照合して行われる。例えば、分離培地上にヘモ
フィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属の細菌を疑われ
る集落が生じたら、生化学的同定を行い、その菌種（例
えばヘモフィルス インフルエンザあるいはヘモフィル
ス パラインフルエンザなど）であることを確かめなく
てはならない。その決定は、一般的にＸ因子（ヘミン）
とＶ因子（ニコチンアミドアデニンジヌクレイチド）の
要求性に基づいて行われているが、培地への両因子の添
加と菌の発育との関係を培養法で調べるため、どうして
も結果を得るまでに１８〜２４時間かかる。また、安定
した結果を得るためには両因子の持ち込みを避けるため
の操作と細心の注意が必要である。

【０００３】上記の問題点を解決するために、キリアン
はＸ因子要求性テストの代わりに５−アミノレブリン酸
からのポルフィリン合成能テストで確かめられるべきこ
とを強調したが［Ｋｉｌｉａｎ，Ｍ．（１９７４）．Ａ
ｃｔａ Ｐａｔｈ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｓｃａｎｄ．
Ｂ８２，８３５］、この方法でも、ヘモフィルス属の細
菌を鑑別するには充分な菌量と４〜１６時間の培養時間
を必要とする。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前期のように、感染症
の診断における従来の技術は、迅速性はまだ充分とはい
えず、また厳密に操作しなかった場合鑑別結果の誤認の
危険性もある。こういった事実が細菌検査による感染症
の診断に大きな障害となっているのが現状である。従っ
て、感染症の治療や予防対策手段の早期決定にその検査
成績が必ずしも反映されているとは言い難い。本発明は
こうした細菌検査を迅速、簡便に行える手段を提供し、
細菌検査が抱える根本的な課題を解決することを目的と
するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、生化学的性状による細菌の鑑別において、５−アミ
ノレブリン酸を含ませた吸水性を有する担体と被検試料
を培養して培地上に発育した孤立集落を直接接触させ、
細菌が有する酵素活性により５−アミノレブリン酸から
生成した物質を、紫外線照射による発蛍光または呈色液
添加による発色として検出することを特徴とする細菌の
鑑別方法、により解決することができる。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明は、培地上に孤立集落を形
成する被検試料中に存在する細菌が有する酵素活性の有
無を調べることで、分離した菌を判別することを基本と
し、この特異酵素の活性を発蛍光または呈色試薬による
発色等を用いて確認するものである。例えば、前記のシ
グナルを発現するための特定の化合物を吸水性を有する
担体に含ませておき、培地上の孤立集落と直接接触させ
て、適当な条件下で細菌の酵素活性により生成した物質
を、紫外線照射による発蛍光または呈色液添加による発
色として検出する。

【０００７】本発明に用いる発蛍光または呈色試薬によ
る発色を発現するための物質としては、５−アミノレブ
リン酸が挙げられる。好適にはその塩酸塩が用いられ
る。この化合物は生化学的性状による細菌の鑑別におい
て、特定の細菌（例えば、ヘモフィルス インフルエン
ザ）は欠失しているがそれ以外の多くの細菌が有する酵
素群が作用し、その酵素活性によって生成した物質（例
えばポルフィリンやポルホビリノーゲン）は紫外線の照
射によって蛍光を発する。また、呈色液の添加によって
発色する性質も有する。従って、この化合物を含ませた
吸水性を有する担体と、予め被検試料を適当な平板培地
（例えばチョコレート寒天培地）に塗沫し適温（例えば
３７℃）で培養して培地上に発育させた孤立集落を直接
接触させた後、当該担体に含まれる物質由来のシグナル
である発色または発蛍光を目視的あるいは機器を用いて
観察・検出することができる。

【０００８】本発明における吸水性の担体としては、そ
の機能（吸水性）を有していれば特に材質、形状は限定
されない。具体的には、例えば、紙、濾紙、セルロー
ス、不織布、綿、スポンジ等を挙げることができる。こ
の担体をそのまま使用しても良いし、あるいはガラス、
プラスチック、木材、金属、等の適当な部材に具備さ
せ、取り扱い易くして用いることもできる。その形状、
及び長さ、太さは特に限定されない。好適には、いわゆ
る綿棒をそのまま用いることができる。

【０００９】前記担体の調製法も周知の方法によれば良
く、特に限定されない。具体的には、５−アミノレブリ
ン酸塩酸塩の０．０１〜２０％の水溶液を１０〜１００
０μｌを吸水性担体あるいは綿棒等の吸水性担体を具備
したものに染み込ませ、自然乾燥、送風乾燥、凍結乾燥
等で乾燥させて用いる。

【００１０】上記のように作製した担体は、その材質、
形状を問わず、冷蔵保存（２〜１０゜Ｃ）であれば少な
くとも６ヶ月間は試薬性能（発蛍光性、発色性）の劣化
はみられず安定的に使用できる。更に、驚くべきこと
に、吸水性を有する担体に綿棒を使用した場合に保存試
験を行った結果、１２ヶ月に渡りその性能が変わること
はなく、それ以上の期間が経過しても使用できることが
知見された。このことは、本発明の使用範囲・試験条件
を広げるという効果を発揮するものである。

【００１１】本発明における被検試料としては、ヒト、
家畜等の動物の血液、尿、糞便、髄液、咽頭液、痰、気
管支分泌液、鼻咽頭液、眼液などすべての臨床材料から
分離した菌を用いることができる。

【００１２】臨床材料の病原性細菌の一般的な検査手順
は、被検試料から培養により菌分離を行った後、生化学
的性状試験培地で１〜７日培養後判定した成績を生化学
的性状鑑別表に照合して菌種を確認する、という長い工
程を経る。対して本発明は被検試料を適当な平板培地
（例えばチョコレート寒天培地）に塗沫し適温（例えば
３７℃）で培養し、培地上の孤立集落に前記のようにし
て調製した５−アミノレブリン酸塩酸塩含有担体を直接
接触させ、２０〜４０℃、例えば３７℃で、１〜４時間
後、例えば、３時間後に吸水性を有する担体に含まれる
５−アミノレブリン酸（塩酸塩）から生成した物質由来
のシグナルを発生させ、（例えばポルフィリンを検出す
る場合は紫外線照射下の蛍光、ポルホビリノーゲンの場
合は呈色液による発色）そのシグナルの有無を肉眼で判
定する事により菌の鑑別を行うことができる。あるい
は、機械的に蛍光または発色を検出しても良い。

【００１３】例えば、分離された菌がヘモフィルス イ
ンフルエンザかヘモフィルス パラインフルエンザかを
鑑別するとき、培地上に発育した集落を精製水に５−ア
ミノレブリン酸塩酸塩を１〜１０％に溶解した液を、例
えば工業用綿棒（株式会社日本綿棒）に３０〜５０μｌ
染み込ませ、凍結乾燥させた担体（試薬を含む部分）と
接触させ、綿棒を例えば０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６
〜９）５０μｌを分注した小試験管に担体部分が当該緩
衝液で湿潤する状態で入れ、例えば３７℃、３時間反応
させ、長波長の紫外線（例えば３６０ｎｍ付近）を照射
し、吸湿性を有する担体部分に含まれるポルフィリンか
ら発する赤色蛍光の有無を肉眼で判定する。あるいは、
その試験管に精製水０．５ｍｌと呈色液（例えばコバッ
ク試薬：５ｇのパラジメチルアミノベンズアルデヒドに
対し７５ｍｌのアミルアルコールと２５ｍｌの濃度が１
２Ｎの濃塩酸を加えた混合液）０．５ｍｌを加えよく振
った後静置し、ポルホビリノーゲンの有無を下層部の発
色で判定する。紫外線を当てたとき赤色蛍光がある場
合、あるいは精製水とコバック試薬を添加したときの下
層部が赤く発色する場合は、ポルフィリン産生能を有す
ることが確認でき、ポルフィリン産生能の無い菌（例え
ばヘモフィルス インフルエンザ）との鑑別が簡便にで
きる。

【００１４】本発明によれば、ヘモフィルス インフル
エンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｅ）、（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ
ｕｓ）とこれら以外のヘモフィルス属の細菌との鑑別が
できる。即ち、公知手段によってヘモフィルスが疑われ
た検査対象物に本発明を適用し、その結果発蛍光、発色
が認められなければヘモフィルス インフルエンザ、ヘ
モフィルス エジプチウス及びヘモフィルス ヘモリテ
ィクスと鑑別でき、発蛍光、発色が認められたらそれ以
外のヘモフィルス、例えばヘモフィルス パラインフル
エンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス パラヘモリティクス（Ｈ
ａｅｍｏｐｈｉｌｕ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕ
ｓ）等であることが鑑別できる。

【００１５】本発明はヘモフィルス属の鑑別に限らず、
公知手段によってある細菌感染が疑われその鑑別が必要
になった場合に適用できる。例えば、アクチノバチルス
（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パスツレラ（Ｐ
ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、エイケネラ コロデンス
（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）等の生化
学的性状の鑑別方法を迅速、簡便に行うことが可能であ
る。

【００１６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。

【実施例１】（担体の調製）５−アミノレブリン酸塩酸
塩（和光純薬工業社）０．５５８ｇを精製水１００ｍｌ
に溶解し（０．５５８％水溶液）、その３０μｌを工業
用綿棒（日本綿棒）の吸水部に染み込ませ、凍結乾燥し
たもの（本発明１）と、同様に調製し４℃で１２ヶ月保
存したもの（本発明２）を用いた。

【００１７】（試験菌および試験菌の培養）被検試料と
して用いた試験菌は、ＩＤテスト・ＮＨ−２０ラピッド
（日水製薬）を用いて同定した臨床分離株１２株を用い
た。その内訳は、ヘモフィルス インフルエンザが８
株、ヘモフィルス パラヘモリティクスが２株、そして
ヘモフィルス パラインフルエンザが２株であった。こ
の１２株の試験菌をチョコレ−ト寒天培地（日水製薬）
で３７℃、１８時間培養後、培地上の孤立集落に前記の
ようにして調製した５−アミノレブリン酸塩酸塩含有担
体を直接接触させ、綿棒をｐＨ８の０．１Ｍリン酸緩衝
液５０μｌ分注した小試験管に担体部分が当該緩衝液で
湿潤する状態で入れ、３７℃で、２時間後に吸水性を有
する担体部分に３６０ｎｍの紫外線を照射し、そこから
発する蛍光の有無を肉眼で判定した。

【００１８】（従来法）従来法として「ポルフィリン合
成能テスト」を同時に行った。操作法は、５−アミノレ
ブリン酸塩酸塩（和光純薬工業）０．０３３５ｇと硫酸
マグネシウム７水和物（和光純薬工業）０．００１９７
ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１００ｍｌに
溶解し、この基質液０．５ｍｌへチョコレート寒天培地
（日水製薬）で３７℃、１８時間培養した各試験菌を濃
厚（マックファーランド Ｎｏ．３）に浮遊させ、３７
℃で４時間培養し、波長３６０ｎｍの紫外線を照射して
赤色蛍光の有無を肉眼で判定した。結果を

【表１】以下に示す。

【００１９】

【表１】

【００２０】以上のように、従来法と本発明による各菌
種の持つ生化学的性状は一致した。また、４℃、１２ヶ
月の保存後も性能の劣化はみられなかった。

【００２１】

【実施例２】 反応条件の確認 （担体の調製）５−アミノレブリン酸塩酸塩（和光純薬
工業）０．５５８ｇを精製水１００ｍｌに溶解し（０．
５５８％水溶液）、その３０μｌを工業用綿棒（日本綿
棒）の吸水部に染み込ませ、凍結乾燥したものを用い
た。

【００２２】（試験菌および試験菌の培養）被検試料と
して用いた試験菌は、ＩＤテスト・ＮＨ−２０ラピッド
（日水製薬）によって同定した臨床分離株ヘモフィルス
パラインフルエンザを用いた。

【００２３】（操作）０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）
を作製し、同緩衝液に６Ｎの濃塩酸を加えｐＨ６の０．
１Ｍリン酸緩衝液を、２Ｍトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン水溶液を加えてｐＨ８、９及び１０の０．
１Ｍリン酸−トリス緩衝液を作製した。試験菌をチョコ
レ−ト寒天培地（日水製薬）で３７℃、１８時間培養
後、培地上の孤立集落に前記のようにして調製した５−
アミノレブリン酸塩酸塩含有担体を直接接触させ、綿棒
を各ｐＨの０．１Ｍリン酸緩衝液５０μｌ分注したそれ
ぞれの小試験管に担体部分が当該緩衝液で湿潤する状態
で入れ、３７℃で、４時間反応させた。１時間経過ごと
に吸水性を有する担体部分に３６０ｎｍの紫外線を照射
し、そこから発する蛍光の有無を肉眼で判定した。

【００２４】（従来法）比較例として従来法である「ポ
ルフィリン合成能テスト」を行った。操作法は、５−ア
ミノレブリン酸塩酸塩（和光純薬工業）０．０３３５ｇ
と硫酸マグネシウム７水和物（和光純薬工業）０．００
１９７ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）１００
ｍｌに溶解し、この基質液０．５ｍｌへチョコレート寒
天培地（日水製薬）で３７℃、１８時間培養した各試験
菌を濃厚（マックファーランドＮｏ．３）に浮遊させ、
３７℃で４時間培養した。１時間経過ごとに、３６０ｎ
ｍの紫外線を照射して赤色蛍光の有無を肉眼で判定し
た。結果を

【表２】以下に示す。表の「−」は陰性、「＋」は弱陽
性、「＋＋」は陽性、「＋＋＋」は強陽性を意味する。

【００２５】

【表２】

【００２６】以上のように、従来法では４時間経過しな
ければ判定できる状態にならない。対して、本発明によ
れば、ｐＨが６〜１０の間であれば、各ｐＨともに少な
くとも３時間以内、ｐＨ８、９であれば１時間以内で判
定結果が得られる。

【００２７】

【発明の効果】以上のように本発明方法によれば、臨床
材料において、培地上に発育した集落の鑑別をする場
合、従来法は結果の判定までに４〜２４時間必要であっ
たのに対し、本発明は少なくとも、培地上に細菌の発育
が認められてから１〜３時間で鑑別が可能である。検出
法も、５−アミノレブリン酸塩酸塩を含ませた吸水性を
有する担体と被検試料を培養して培地上に発育した孤立
集落を直接接触させ、当該担体へ紫外線を照射あるいは
呈色試薬を添加しての蛍光または発色を検出するという
簡便な操作である。この迅速性と簡便性は細菌検査が治
療、予防等に今まで以上に寄与するものとなる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生化学的性状による細菌の鑑別におい
   て、５−アミノレブリン酸を含ませた吸水性を有する担
   体と被検試料を培養して培地上に発育した孤立集落を直
   接接触させ、細菌が有する酵素活性により５−アミノレ
   ブリン酸から生成した物質を、紫外線照射による発蛍光
   または呈色液添加による発色として検出することを特徴
   とする細菌の鑑別方法。
2. 【請求項２】 細菌がヘモフィルス属である、請求項１
   の鑑別方法。
3. 【請求項３】 吸水性を有する担体が綿棒である、請求
   項１、２に記載の細菌の鑑別方法。