BRPI0922952B1

BRPI0922952B1 - métodos de detectar e identificar um microorganismos em meios sólidos ou semi-sólidos

Info

Publication number: BRPI0922952B1
Application number: BRPI0922952-3A
Authority: BR
Inventors: John Walsh; Jones Hyman; Thurman Thorpe
Original assignee: Biomerieux, Inc.
Priority date: 2008-12-16
Filing date: 2009-12-15
Publication date: 2021-02-17
Also published as: US20130323718A1; EP2376914A2; JP6186414B2; CA2745872A1; WO2010077304A3; US8795983B2; JP2016073288A; RU2011123155A; KR101650017B1; CN104502317B; CA2745872C; AU2009333848A1; CN104502317A; BRPI0922952B8; US20140335558A1; MX2011005988A; BRPI0922952A2; KR20110106373A; JP5837420B2; JP2012511905A

Abstract

MÉTODOS PARA SEPARAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E/OU IDENTIFICAÇÃO DE MICROORGANISMOS EM MEIOS SÓLIDOS OU SEMI-SÓLIDOS A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para varrer, detectar, e monitorar microorganismos em meios sólidos ou semi-sólidos utilizando medições de fluorescência intrínseca (IF). Os métodos são adicionalmente dirigidos à detecção, caracterização e/ou identificação de microorganismos em um meio sólido ou semi-sólido utilizando medições de fluorescência intrínseca (IF) que são características de microorganismos.

Description

MÉTODOS DE DETECTAR E IDENTIFICAR UM MICROORGANISMOS EM MEIOS SÓLIDOS OU SEMI-SÓLIDOS

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDO RELACIONADO

[001] O presente pedido reivindica o benefício do pedido de patente provisional US número 61/122.925, intitulado “Methods for characterization of microorganisms on solid or semi-solid media”, depositado em 16 de dezembro de 2008, que é incorporado aqui.

Campo da invenção

[002] A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para detectar, monitorar, caracterizar e/ou identificar microorganismos em meios sólidos ou semi-sólidos.

Antecedentes da invenção

[003] Microorganismos isolados para fins de diagnóstico clínico, bem como aqueles isolados para monitorar contaminação de gêneros alimentícios, tecidos médicos ou meio ambiente, freqüentemente necessitam ser caracterizados para determinar a resposta apropriada à presença dos organismos encontrados. Ensaios de identificação fenotípica automatizada, tradicionais, como os sistemas Vitek®, Phoenix™ e Microscan®, ou testes fenotípicos manuais como API, exigem que microorganismos estejam em uma fase de crescimento apropriada e livres de meios interferentes e produtos de sangue para fornecer resultados robustos. Esses sistemas utilizam colônias cultivadas por 16-24 horas em meios revestidos, após o que suspensões padronizadas são feitas das colônias, e então os testes de caracterização efetivos exigem um período adicional de 4-24 horas de incubação para conclusão.

[004] Métodos de espectroscopia óptica, como fluorescência intrínseca (IF), espectroscopia infravermelha (FTIR), ou espectroscopia Raman, têm o potencial de permitir identificação de microorganismos muito rapidamente, porém foram somente demonstrados trabalhar com suspensões de microorganismo “limpas”. Publicações descreveram métodos IF para caracterização microbiana somente com conjuntos de organismos muito limitados, ou que exigiram medidas adicionais, como eventos de ligação específica, para permitir caracterização funcional. O exame direto de microorganismos em meio de crescimento foi considerado problemático devido à contribuição grande assumida do próprio meio ao padrão espectroscópico.

[005] A presente invenção supera os problemas na técnica por fornecer métodos que podem discriminar entre microorganismos espectroscopicamente interrogados diretamente em meio de crescimento sólido e/ou semi-sólido fluorescente, incluindo meio altamente fluorescente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção provê métodos para detectar, monitorar, caracterizar e/ou identificar microorganismos em meio sólido e/ou semi-sólido. A caracterização abrange a categorização ampla ou classificação de microorganismos bem como a identificação efetiva de uma espécie única. Como utilizado aqui “identificação” significa determinar à qual família, gênero, espécie, e/ou cepa um microorganismo anteriormente desconhecido pertence. Por exemplo, a identificação de um microorganismo anteriormente desconhecido em nível de família, gênero, espécie e/ou cepa. Os métodos revelados aqui permitem a detecção, caracterização e/ou identificação de microorganismos mais rapidamente do que técnicas anteriores, resultando em diagnósticos mais rápidos (por exemplo, em um sujeito tendo ou com suspeita de ter uma infecção) e identificação de materiais contaminados (por exemplo, gêneros alimentícios e produtos farmacêuticos). As etapas envolvidas nos métodos da invenção podem ser realizadas em um quadro de tempo curto para produzir informações contestáveis clinicamente relevantes. Em certas modalidades, organismos de crescimento rápido podem ser detectados e identificados em apenas algumas horas. Organismos de crescimento mais lento podem ser detectados e identificados mais rapidamente do que com técnicas anteriores, fornecendo resultados em um quadro de tempo útil. A etapa de identificação/caracterização individualmente pode ser realizada em alguns minutos ou menos. Os métodos também permitem detectar, monitorar, caracterizar e/ou identificar múltiplos tipos de microorganismos (por exemplo, classes e/ou espécies diferentes) simultaneamente (por exemplo, em culturas mistas). Vantajosamente, em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser realizados in situ sem destruição da colônia, desse modo preservando a colônia para testes ou usos adicionais. Adicionalmente, os métodos da invenção podem ser parcial ou totalmente automatizados, desse modo reduzindo o risco de manipular materiais infecciosos e/ou contaminar as amostras.

[007] Um primeiro aspecto da invenção refere-se a métodos de caracterizar e/ou identificar um microorganismo em um meio sólido ou semi-sólido, compreendendo:

[008] Interrogar uma ou mais colônias em um meio sólido ou semi-sólido para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF) características de um microorganismo na colônia; e

[009] Caracterizar e/ou identificar o microorganismo na colônia com base em medições de fluorescência intrínseca (IF).

[0010] Outro aspecto da invenção refere-se a métodos de detectar e caracterizar um microorganismo em um meio sólido ou semi-sólido, compreendendo:

[0011] Varrer um meio, conhecido por conter, ou que pode conter uma ou mais colônias de microorganismo para localizar as colônias presentes no meio;

[0012] Interrogar uma ou mais colônias localizadas durante a etapa (a) para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF) características de um microorganismo na colônia; e

[0013] Detectar, caracterizar e/ou identificar o microorganismo na colônia baseado nas medições de fluorescência intrínseca (IF).

[0014] Um aspecto adicional da invenção refere-se a métodos de caracterizar e/ou identificar um microorganismo em uma amostra, compreendendo:

[0015] Cultivar um microorganismo presente na amostra em um meio sólido ou semi-sólido para produzir pelo menos uma colônia;

[0016] Interrogar uma ou mais colônias no meio para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF) características do microorganismo; e

[0017] Caracterizar e/ou identificar o microorganismo na colônia com base nas medições produzidas.

[0018] Um aspecto adicional da invenção refere-se a métodos de detectar a presença de um microorganismo em uma amostra, compreendendo:

[0019] Obter uma amostra conhecida por conter ou que pode conter um microorganismo;

[0020] Cultivar um microorganismo presente na amostra em um meio sólido ou semi-sólido; e

[0021] Localizar quaisquer colônias presentes no meio por conduzir uma varredura de ponto por ponto do meio sólido ou semi-sólido para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF);

[0022] Em que a presença de uma ou mais colônias como localizada pelas medições produzidas indica que um microorganismo está presente na amostra.

[0023] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um sistema para detectar, caracterizar e/ou identificar um microorganismo em um meio sólido ou semi-sólido, o sistema compreendendo um espectrofotômetro e óptica de focalizar, como um sistema de lente ou um microscópio. Em outras modalidades, o sistema compreende ainda um mecanismo para varrer a superfície do meio e/ou um mecanismo para controlar o ambiente de (por exemplo, incubar) o meio.

[0024] Em outra modalidade, um colônia pode ser interrogada para produzir medições que podem ser utilizadas para detectar, caracterizar e/ou identificar os microorganismos da colônia (por exemplo, a colônia pode ser interrogada utilizando espectroscopia). Os microorganismos podem ser caracterizados e/ou identificados por comparar as medições (por exemplo, o espectro) da colônia com medições similares (por exemplo, espectro ou espectros) feitas de microorganismos conhecidos. Em outra modalidade, a colônia pode ser interrogada não invasivamente (por exemplo, em uma placa vedada). A capacidade de caracterizar e/ou identificar os microorganismos contidos em uma colônia diretamente (por exemplo, em uma placa vedada) sem manipulação adicional aumenta a segurança de identificação microbiana.

[0025] Ainda em outra modalidade, a interrogação espectroscopia se baseia em características intrínsecas dos microorganismos (por exemplo, fluorescência intrínseca). Em outras modalidades, a interrogação espectroscópica se baseia em parte em sinais obtidos de agentes adicionais que são adicionados durante os métodos da invenção e interagem com microorganismos específicos ou grupos de microorganismos.

[0026] Em outra modalidade, os métodos compreendem ainda uma etapa de recuperar a colônia, suspender novamente a colônia e executar testes de identificação e/ou caracterização adicionais (por exemplo, resistência à droga, fatores de virulência, antibiograma).

[0027] A presente invenção é explicada em maior detalhe nas figuras da presente invenção e descrição exposta abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0028] As figuras 1A-1D mostram espectros de placas Agar de sangue não inoculado (BAP), sem membrana (A) ou BAP com membrana de polieterssulfona com grade Pall Metricel Black (Pall) (B), membrana de éster misturado Whatman Black (WME) (C), ou membrana preta de policarbonato com trilha cauterizada Whatman (WPC) (D) disposta através da superfície do meio.

[0029] As figuras 2A-2C mostram espectros de colônias em membrana WME sobre BAP obtida de EC3 (A) e SA1 (B), e os resultados de subtrair o espectro EC3 do espectro SA1 (C).

[0030] As figuras 3A-3D mostram espectros de colônias em BAP sem uma membrana obtida de EC1 (A) SA1 (B), EF1 (C) e PA1 (D).

[0031] As figuras 4A-4F mostram gráficos tridimensionais das varreduras de busca IF de ponto por ponto do curso F, onde altura é igual à intensidade de fluorescência. Os gráficos mostram medições feitas em 6 h (A), 8 h (B), 10 h (C), 12 h (D), 16 h (E) e 24 h (F).

[0032] As figuras 5A-5B mostram uma imagem de close-up do BAP do curso F após 24 h (A), e um gráfico de contorno de intensidade de fluorescência da varredura de busca em 12 h mostrando locais de colônia correspondentes (B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0033] A presente invenção pode ser incorporada em formas diferentes e não deve ser interpretada como limitada às modalidades expostas aqui. Em vez disso, essas modalidades são fornecidas de modo que essa revelação seja completa, e transmitirá totalmente o escopo da invenção para aqueles versados na técnica. Por exemplo, características ilustradas com relação a uma modalidade podem ser incorporadas em outras modalidades, e características ilustradas com relação a uma modalidade específica podem ser eliminadas daquela modalidade. Além disso, inúmeras variações e adições às modalidades sugeridas aqui serão evidentes para aqueles versados na técnica à luz da presente revelação, que não se afastam da presente invenção.

[0034] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica à qual essa invenção pertence. A terminologia utilizada na descrição da invenção aqui é para fins de descrever modalidades específicas somente e não pretende ser limitadora da invenção.

[0035] Definições

[0036] Como utilizado aqui, "um”, "uma” ou "o, a” podem significar um ou mais de um. Por exemplo, "uma” célula pode significar uma única célula ou uma multiplicidade de células.

[0037] Também como utilizado aqui, "e/ou” se refere a e abrange todas e quaisquer combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretadas na alternativa ("ou”).

[0038] Além disso, o termo "aproximadamente” como utilizado aqui ao se referir a um valor mensurável como uma quantidade de um composto ou agente, dose, tempo, temperatura, e similar, pretende abranger variações de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0,5% ou mesmo ± 0,1% da quantidade especificada.

[0039] Como utilizado aqui, o termo "microorganismo” pretende abranger organismos que são genericamente unicelulares, que podem ser multiplicados e manipulados no laboratório, incluindo, porém não limitados a, bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, leveduras, fungos, parasitas e mollicutes. Exemplos não limitadores de bactérias Gram-negativas da presente invenção incluem bactérias dos seguintes gêneros: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klevsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevundimonas, Ralstonia, Achromobacter, Fusobacterium, Prevotella, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Brucella, Pasteurella, Providencia e Legionella. Exemplos não limitadores de bactérias Gram-positivas da presente invenção incluem bactérias dos seguintes gêneros: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Paenibacilus, Lactobacillus, Listeria, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria e Corynebacteria. Exemplos não limitadores de leveduras e fungos da presente invenção incluem aqueles dos seguintes gêneros: Candida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaria, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces e Trichosporon. Exemplos não limitadores de parasitas da presente invenção incluem aqueles dos seguintes gêneros: Trypanosoma, Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca e Naegleria. Exemplos não limitadores de mollicutes da presente invenção incluem aqueles dos seguintes gêneros: Mycoplasma e Ureaplasma.

[0040] Como utilizado aqui, os termos "colônia” e "microcolônia” se referem a uma multiplicidade ou população de microorganismos que se situam em proximidade estreita entre si, que se situam em uma superfície, e que são os descendentes clonais, por replicação in situ, de um único microorganismo ancestral. Em geral, uma "colônia” é visível ao olho humano e é tipicamente maior do que aproximadamente 50 μm, 60 μm, 80 μm ou 100 μm em diâmetro. Entretanto, como utilizado aqui, a menos que de outro modo mencionado, o termo "colônia” pretende incluir ambas as colônias tendo um diâmetro de 50 μm ou mais, e "microcolônias” tendo um diâmetro de 50 μm ou menos. Em outras modalidades, a presente invenção é dirigida à varredura, detecção, caracterização e/ou identificação de microorganismos em uma “microcolônia.” Como utilizado aqui, uma “microcolônia” pode variar de aproximadamente 2 μm a aproximadamente 50 μm ou de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 50 μm. Uma “microcolônia” é genericamente demasiadamente pequena para ser visível a olho nu (por exemplo, menor do que aproximadamente 50 μm em diâmetro).

[0041] Como utilizado aqui, os termos “varrer” ou “varredura” se referem à busca de uma área predefinida em um padrão sistemático ou predeterminado, ou aleatoriamente, para localizar algo de interesse (por exemplo, uma colônia de microorganismo). Por exemplo, um meio sólido ou semi-sólido pode ser “varrido” por mover um feixe de luz focalizado em um padrão sistemático ou predeterminado, ou aleatoriamente, sobre uma superfície para detectar, localizar ou de outro modo sentir uma colônia de microorganismo. Em uma modalidade alternativa, o meio sólido ou semi-sólido pode ser movido em um padrão sistemático ou predeterminado, ou aleatoriamente, em relação ao feixe de luz para detectar, localizar ou de outro modo sentir uma colônia de microorganismo. De acordo com essa modalidade, a fonte de luz tem tipicamente um diâmetro de feixe menor do que aproximadamente 0,5 mm, menor do que aproximadamente 0,2 mm, ou menor do que 0,1 mm. Em outra modalidade, o diâmetro de feixe é de aproximadamente 5 μm a aproximadamente 500 μm, de aproximadamente 10 μm a aproximadamente 100 μm, ou de aproximadamente 20 μm a aproximadamente 80 μm.

[0042] Em uma modalidade, a “varredura” pode compreender uma “varredura” de ponto por ponto do meio sólido ou semi-sólido. De acordo com essa modalidade uma fonte de luz (por exemplo, um feixe laser) pode ser movido para um primeiro ponto no meio sólido ou semi-sólido e uma etapa de varredura ou interrogação realizada para a detecção e/ou caracterização de quaisquer colônias de microorganismos que podem estar presentes. Alternativamente, o meio sólido ou semi-sólido pode ser movido em relação à fonte de luz de tal modo que uma varredura de ponto por ponto seja conduzida do meio sólido ou semi-sólido. Subseqüentemente, a fonte de luz (por exemplo, um feixe laser), ou o meio sólido ou semi-sólido, pode ser movido de tal modo que um segundo ponto no meio possa ser varrido e/ou interrogado. Esse processo de varredura de ponto por ponto pode ser continuado até que uma busca de ponto por ponto de uma dada área de busca seja concluída. A área de busca pode ser a superfície inteira do meio sólido ou semi-sólido (por exemplo, uma placa de meio) ou um subconjunto do mesmo.

[0043] Em outra modalidade, a busca de ponto por ponto pode ser realizada do ponto a ponto ao longo de uma trajetória linear (por exemplo, alongo de uma linha reta através do meio). Subseqüentemente, a fonte de luz, ou meio, pode ser deslocado para uma segunda linha linear, e uma busca de ponto por ponto conduzida ao longo da trajetória linear da segunda linha linear. Esse padrão de busca de ponto por ponto e linha por linha (ou varredura do tipo grade) pode ser continuado até que uma área de busca dada seja concluída. A área de busca pode ser a superfície inteira do meio sólido ou semi-sólido (por exemplo, uma placa de meio) ou um subconjunto da mesma. Em outra modalidade, a varredura pode ser uma varredura contínua (isto é, uma varredura de ponto por ponto contínua).

[0044] A presente invenção provê métodos para detectar, monitorar, caracterizar e/ou identificar microorganismos em um meio sólido ou semi-sólido. Os métodos rápidos permitem a detecção, caracterização e/ou identificação de microorganismos mais rapidamente do que técnicas anteriores, resultando em diagnósticos mais rápidos (por exemplo, em um sujeito tendo ou com suspeita de ter uma infecção), caracterização e/ou identificação de materiais contaminados (por exemplo, gêneros alimentícios, suprimentos de água e produtos farmacêuticos). As etapas envolvidas nos métodos da invenção, de obter uma amostra para caracterização/identificação de microorganismos, podem ser realizadas em um curto quadro de tempo para obter informações contestáveis clinicamente relevantes. Em certas modalidades, os métodos da invenção podem ser realizados em menos do que aproximadamente 72 horas, por exemplo, em menos do que aproximadamente 18, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 hora. Em certas modalidades, as etapas de identificação podem ser realizadas em menos do que 60 minutos, por exemplo, menos do que aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 minuto. Os métodos podem ser utilizados para caracterizar e/ou identificar qualquer microorganismo como descrito aqui. Em uma modalidade, o microorganismo é uma bactéria. Em outra modalidade, o microorganismo é uma levedura. Em outra modalidade, o microorganismo é um fungo. Os métodos podem ser utilizados para detectar, monitorar, caracterizar e/ou identificar múltiplos tipos de microorganismos, por exemplo, microorganismos de espécies, gêneros, famílias, ordens, classes, fila, e/ou reinos diferentes. Em uma modalidade, os métodos da invenção permitem a caracterização e/ou identificação de alguns ou todos os tipos diferentes de microorganismos presentes em uma amostra, por exemplo, em uma cultura mista. Em outras modalidades, os métodos podem ser utilizados para caracterizar e/ou identificar dois ou mais tipos diferentes de bactérias, dois ou mais tipos diferentes de levedura, dois ou mais tipos diferentes de fungo, ou dois ou mais tipos diferentes de uma mistura de bactérias, levedura e ou fungo. A detecção de cada dos múltiplos tipos de microorganismos pode ocorrer simultaneamente ou quase simultaneamente. Adicionalmente, os métodos da invenção podem ser parcial ou totalmente automatizados, desse modo reduzindo o risco de manipular materiais infecciosos e/ou contaminar as amostras.

[0045] Um primeiro aspecto da invenção se refere a métodos de caracterizar e/ou identificar um microorganismo em um meio sólido ou semi-sólido, compreendendo:

[0046] Interrogar uma ou mais colônias em um meio sólido ou semi-sólido para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF) características de um microorganismo na colônia; e

[0047] Caracterizar e/ou identificar o microorganismo na colônia com base nas medições produzidas.

[0048] Outro aspecto da invenção refere-se a métodos de detectar, caracterizar e/ou identificar um microorganismo em um meio sólido ou semi-sólido, compreendendo:

[0049] Varrer um meio, conhecido por conter, ou que pode conter uma ou mais colônias de microorganismo para localizar as colônias presentes no meio;

[0050] Interrogar uma ou mais colônias localizadas durante a etapa (a) para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF) características de um microorganismo na colônia; e

[0051] Detectar, caracterizar e/ou identificar o microorganismo na colônia baseado nas medições produzidas.

[0052] Um aspecto adicional da invenção refere-se a métodos de caracterizar e/ou identificar um microorganismo em uma amostra, compreendendo:

[0053] Cultivar um microorganismo presente na amostra em um meio sólido ou semi-sólido para produzir pelo menos uma colônia;

[0054] Interrogar uma ou mais colônias no meio para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF) características do microorganismo; e

[0055] Caracterizar e/ou identificar o microorganismo na colônia com base nas medições produzidas.

[0056] Um aspecto adicional da invenção refere-se a métodos de detectar a presença de um microorganismo em uma amostra, compreendendo:

[0057] Obter uma amostra conhecida por conter ou que pode conter um microorganismo;

[0058] Cultivar um microorganismo presente na amostra em um meio sólido ou semi-sólido; e

[0059] Localizar quaisquer colônias presentes no meio por varrer o meio para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF);

[0060] Em que a presença de uma ou mais colônias como localizada pelas medições produzidas indica que um microorganismo está presente na amostra.

[0061] Amostras que podem ser testadas pelos métodos da invenção incluem amostras tanto clínicas como não clínicas nas quais a presença e/ou crescimento de microorganismo é conhecido ou suspeito, bem como amostras de materiais que são rotineiramente ou ocasionalmente testadas em relação à presença de microorganismos. A quantidade de amostra utilizada pode variar grandemente devido à versatilidade e/ou sensibilidade do método. A preparação de amostra pode ser realizada por qualquer número de técnicas conhecidas por aqueles versados na arte.

[0062] Amostras clínicas que podem ser testadas incluem qualquer tipo de amostra tipicamente testado em laboratórios clínicos e/ou de pesquisa, incluindo, porém não limitados a, sangue, soro, plasma, frações de sangue, fluido de articulação, urina, sêmen, saliva, fezes, fluidos cérebro-espinhal, conteúdo gástrico, secreções vaginais, homogeneizados de tecido, aspirados de medula óssea, homogeneizados de osso, esputo, aspirados, esfregões e águas de enxágue de esfregão, outros fluidos corpóreos e similares.

[0063] A presente invenção encontra uso em aplicações de pesquisa bem como veterinárias e médicas. Sujeitos apropriados dos quais amostras clínicas podem ser obtidas são genericamente sujeitos mamíferos, porém podem ser qualquer animal. O termo "mamífero” como utilizado aqui inclui, porém não é limitado a, seres humanos, primatas não humanos, gado, ovelhas, cabras, porcos, cavalos, gatos, cães, coelhos, roedores (por exemplo, ratos ou camundongos), etc. sujeitos humanos incluem neonatos, crianças, jovens, adultos e sujeitos geriátricos. Sujeitos dos quais amostras podem ser obtidas incluem, sem limitação, mamíferos, pássaros, répteis, anfíbios e peixes.

[0064] Amostras não clínicas que podem ser testadas incluem substâncias que abrangem, porém não são limitadas a gêneros alimentícios, bebidas, produtos farmacêuticos, cosméticos, água (por exemplo, água potável, água não potável, e água residual), lastros de água domar, ar, terra, esgoto, material de planta (por exemplo, sementes, folhas, troncos, raízes, flores, frutas), produtos de sangue (por exemplo, plaquetas, soro, plasma, frações de hemácias, etc.), amostras de tecido ou órgão de doador, amostras de guerra biológica, e similares. O método também é particularmente bem adequado para teste em tempo real para monitorar níveis de contaminação, controle de processo, controle de qualidade e similar em cenários industriais.

[0065] O volume da amostra deve ser suficientemente grande para produzir uma ou mais colônias quando revestida em meio. Volumes apropriados dependerão da fonte da amostra e do nível previsto de microorganismos na amostra. Por exemplo, um esfregão clínico de um ferimento infectado conterá um nível mais elevado de microorganismos por volume do que uma amostra de água potável a ser testada em relação à contaminação, de modo que um volume menor de material de esfregão será necessário em comparação com a amostra de água potável. Em geral, o tamanho de amostra pode ser pelo menos aproximadamente 50 ml, por exemplo, 100 ml, 500 ml, 1000 ml ou mais. Em outras modalidades, a amostra pode ser menor do que aproximadamente 50 ml, por exemplo, menor do que aproximadamente 40 ml, 30 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml ou 2 ml. Em certas modalidades, o tamanho de amostra pode ser aproximadamente 1 ml ou menos, por exemplo, aproximadamente 750 μl, 500 μl, 250 μl, 100 μl, 50 μl, 25 μl, 10 μl, 5 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0,1 μl, ou menos. Para modalidades nas quais o tamanho de amostra é grande, a amostra pode ser filtrada (por exemplo, através de uma membrana de filtro) e/ou concentrada através de métodos bem conhecidos na arte (por exemplo, centrifugação, evaporação, etc.) para reduzir o volume e/ou coletar quaisquer microorganismos na amostra. Microorganismos coletados em uma membrana de filtro podem ser suspensos novamente e colocados em meios sólidos ou semi-sólidos ou a membrana de filtro pode ser colocada diretamente em meios semi-sólidos.

[0066] Amostras a serem testadas são colocadas em um meio apropriado e incubadas sob condições que são úteis para crescimento de microorganismos. O meio pode ser selecionado com base no(s) tipo(s) de microorganismos conhecidos como estando ou suspeitos de estarem na amostra. Meios de crescimento apropriados para microrganismos diferentes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Os meios de crescimento podem ser qualquer meio que forneça nutrientes apropriados e limite movimento dos microorganismos (isto é, forneça crescimento localizado). Em algumas modalidades, o meio pode ser um meio semi-sólido, como Agar, gelatina, alginato, carragenana ou pectina. Meios apropriados incluem meios tendo funções diferentes que são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo sem limitação meios de finalidade geral, meios seletivos, meios diferenciais e/ou meios cromogênicos. Meios podem ser selecionados e/ou ajustados de tal modo que medições significativas (por exemplo, medições IF) possam ser obtidas. Os exemplos de meios semi-sólidos apropriados incluem, sem limitação, um Agar C, Agar Acetobacter, Agar Acriflavina-ceftazidima, Agar Actinomyces, Agar de isolamento Actinomicete, Agar de isolamento de Aeromonas, Agar Anaeróbico, Agar de sangue anaeróbico, Agar TVLS anaeróbico, Agar APT, Agar de manitol de Ashby, Agar de diferenciação de Aspergillus, Agar ASS, Agar Aureus, Agar de sangue de azida, Agar de lactose B.T.B., Agar de Bacillus, Agar de Baird Parker, Agar de BiGGY, Agar de esculin de bile, Agar de azida de esculin de Bile, Agar de amido verde brilhante de sais de bile, Agar de sulfito de bismuto, Agar de sangue, Agar de sangue SLMB, Agar BPL, Agar de infusão de coração cérebro, Agar de Brewer, Agar verde brilhante, Agar de bile verde brilhante, Agar de sacarose lactose vermelho fenol verde brilhante, Agar BROLACIN, Agar BROLACIN MUG, Agar de Burcella, Agar BSM, Agar de extrato de levedura de carvão tamponado, Agar de caseinato de cálcio, Agar seletivo de Campylobacter, Agar de Candida ident, Agar de magnésio de levedura de caseína, Agar CASO, Agar CATC, Agar seletivo de Cereus, Agar Cetrimida, Agar Chapman Stone, Agar de lactose azul China, Agar Chlamydospore, Agar de citrato Christensen, Agar de uréia de Christensen, Agar de citrato, Agar CLED, Agar de Clostridium, Agar Clostridium difficile, Agar de Coliforme, Agar de Columbia, Agar de sangue de Columbia, Agar de farelo de milho, Agar de levedura de peptona de farelo de milho, Agar CPC, Agar Cramp, Agar Xzapek dox, Agar D.T.M., Agar Davis Minimal, Agar DCLS, Agar de citrato desoxicolato, Agar de teste de desoxirribonuclease, Agar DEV ENDO, Agar de gelatina DEV, Agar de nutriente DEV, Agar de caseinpeptona Dextrose, Agar de amido de dextrose, Agar DHL, Agar Dicloran rose bengal, Agar de virulência de difteria, Agar de teste DNase com toluidina, Agar de E. coli, Agar E. coli 0157:H7 MUG, Agar ECC, Agar seletiva ECC, Agar ECD, Agar ECD MUG, Agar BEM, Agar ENDO, AGAR Enterobacter sakazakii, Agar Enterococcus faecium, Agar seletivo de Enterococcus, Agar de ferro Esculin, Agar Eugonic, Agar fúngico, Agar fungobiótico, Agar Gassner, Agar de lactose Gassner, meio de ferro de gelatina, Agar de sal de gelatina, Agar de contagem de germe, Agar roxo bromcresol de glicose, Agar GSP, Agar entérico Hektoen, Agar de azida esculin canamicina, Agar campylobacter Karmali, Agar KF-estreptococo, Agar King, Agar seletiva de Klebsiella, Agar Kligler, Agar KRANEP, Agar Kundrat, Agar Lactobacillus bulgaricus, Agar TTC Lactose, Agar LB, Agar Leifson, Agar EMB Levine, agar de LIsteria, Agar mono confirmatório de Lsterina, Agar mono diferencial de Listeria, Agar seletivo de Listeria, Agar lactose Litmus, Agar LL, Agar LPM, Agar diferencial LS, Agar L-topo, Agar Luria, Agar de ferro arginina de Lisina, Agar de ferro de lisina, Agar enterococo M, Agar M-17, Agar MacConkey, Agar MacConkey com violeta cristal, cloreto de sódio e 0,15% de sais de bile, Agar MUG MacConkey, Agar sorbitol-MacConkey, Agar de Malte, Agar de extrato de malte, Agar vermelho fenol de sal manitol, Agar McBride, Agar McClung Toabe, Agar M-CP, Agar de fígado de carne, Agar seletivo de enterococo de filtro de membrana, Agar de glucuronide de lactose de membrana, Agar M-endo, Agar M-Endo LES, Agar MeReSa, Agar M-FC, Agar Middlebrook 7H10, Agar Middlebrook 7H11, Agar de leite, Agar Mitis salivarius, Agar MM, Agar de carvão tamponado modificado, Agar MOX, Agar MRS, Agar MS.0157, Agar M-TEC, Agar Mueller Hinton, Agar de soja triptona MUG, Agar de Micoplasma, Agar Nobre, Agar de nutriente, gelatina de nutriente, Agar de nutriente de teste OF, Agar OGY, Agar OGYE, Agar de soro de laranja, Agar Oxford, Agar sletivo de listeria PALCAM, Agar de extrato de levedura de Pentacloro rose bengal, Agar de extrato de levedura Peptona, Agar de leite peptonizado, Agar Perfringens, Agar de dextrose vermelho fenol, Agar de lactose vermelho fenol, Agar de maltose vermelho fenol, Agar de sacarose vermelho fenol, Agar de tartrato vermelho fenol, Agar de fosfato de fenolftaleína, Agar de fenil alanina, Agar de contagem de placa, Agar MUG de contagem de placa, Agar PLET, Agar indicador PM, Agar de dextrose de batata, Agar de rose bengal de glicose de batata, Agar de sacarose de glicose de batata, Agar de manitol Pril®, Agar de Pseudomonas, Agar R-2A, Agar Raka-Ray, Agar de enterococci rápido, Agar cloristridial reforçado, Agar de extrato de arroz, Agar Rogosa, Agar Rogosa SL, Agar Rose bengal, Agar de cloranfenicol Rose Bengal, Agar S.F.P., Agar de glicose a 2% Sabouraud, Agar de glicose a 4% Sabouraud, Agar de dextrose Sabouraud, Agar de glicose Sabouraud com cloranfenicol, Agar de Salmonella, Agar de Salmonella de acordo com Oenoz, Agar de cromogen de Salmonella, Agar SD, Agar Select, Agar seletivo para fungos patogênicos, Agar SFP, Agar S-Gal®/LB, Agar Shapton, Agar de citrato de Simmons, Agar de leite desnatado, Agar de ácido sórbico, Agar de spirit blue, Agar SPS, Agar SS, Agar nutriente padrão no. 1, Agar Estafilococo, Agar seletivo de Streptococcus, Agar de isolamenot de Streptococcus thermophilus, Agar API de sulfato, Agar de ferro de sulfito, Agar TBX, Agar TCBS, Agar TCMG, Agar Tergitol®-7, Agar Thayer Martin, Agar Thermoacidurans, Agar Tinsdale, Agar de suco de tomate, Agar Tributirina, Agar de ferro de açúcar triplo, Agar de soja triptica, Agar de triptona, Agar de extrato de glicose de triptona, Agar de extrato de levedura de glicose de triptona, Agar de extrato de levedura de soja de triptona, Agar de extrato de levedura de triptona, Agar de triptose, Agar TSC, Agar TSN, Agar de cerveja universal, Agar UTI, Agar Vibrio, Agar de sacarose parahemolítico Vibrio, Agar de bile vermelho violeta, Agar de glicose de bile vermelho violeta, Agar de lactose de bile vermelho violeta, Agar de dextrose de lactose de bile vermelho violeta, Agar de cultura de vitamina B12, Agar Vogel-Johnson, Agar VRB MUG, Agar anaeróbico Wilkins Chalgren, Agar Wilson Blair, Agar diferencial WL, Agar de nutriente WL, Agar Wort, Agar XLD, Agar XLT4, Agar de levedura, Agar de extrato de levedura, Agar de malte de levedura, Agar de manitol de levedura, Agar de isolamenot de Yersinia, Agar seletivo de Yersinia, Agar YGC, Agar YPAD, Agar YPDG, Agar YPG, e Agar YT. Em uma modalidade, o meio sólido ou semi-sólido pode compreender ainda um ou mais aditivos adicionais que intensificam ou de outro modo aumentam as medições de fluorescência intrínseca (IF) de uma colônia de microorganismo no meio sólido ou semi-sólido. Aditivos apropriados para aumentar a fluorescência intrínseca podem incluir um ou mais hidrolisados de proteína, aminoácidos, extratos de carne e vegetal, fontes de carboidrato, agentes de tamponamento, agentes de ressuscitar, fatores de crescimento, co-fatores de enzima, sais minerais, suplementos de metal, compostos de redução, agentes de quelação, agentes sensíveis à luz, agentes de resfriamento brusco, agentes de redução, agentes de oxidação, detergentes, tensoativos, desinfetantes, agentes seletivos, inibidores metabólicos ou combinações dos mesmos.

[0067] Em outras modalidades, o meio pode ser um filtro (por exemplo, uma membrana de filtro ou um filtro de fibra de vidro), por exemplo, que é disposto no topo de um meio semi-sólido. Em outras modalidades, o filtro é disposto sobre um material (por exemplo, um absorvente) que foi exposto a (por exemplo, embebido em) meio líquido. Em algumas modalidades, uma amostra (por exemplo, uma amostra de volume grande) pode ser passada através de um filtro para coletar quaisquer microorganismos presentes na amostra. O filtro pode ser então colocado no topo de meios de crescimento e incubado sob condições apropriadas para crescimento de microorganismo. Membranas de filtro apropriadas são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem qualquer membrana apropriada para coletar microorganismos e/ou capaz de suportar crescimento de microorganismo. Os exemplos de materiais de membrana incluem, sem limitação, celulose, éster de celulose misturado, nitrocelulose, cloreto de polivinil, náilon, politetrafluoroetileno, polissulfona, polieterssulfona, negro policarbonato, e éster misturado com negro incluindo qualquer combinação dos mesmos. Os filtros podem ter um tamanho de poro apropriado para filtrar líquidos e/ou coletar microorganismos, por exemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 25 μm para levedura e aproximadamente 0,05 μm a aproximadamente 2 μm, por exemplo, aproximadamente 0,2 μm a aproximadamente 1 μm para bactérias.

[0068] Em certas modalidades, o meio pode estar presente em uma placa, por exemplo, uma placa de Agar microbiológica padrão. Em algumas modalidades, a placa pode ser uma placa de multicavidades, tendo, por exemplo, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 64, 96, 128 ou mais cavidades por placa, para teste de múltiplas amostras. A placa pode ser feita de qualquer material apropriado para cultivar microorganismos, por exemplo, poliestireno ou vidro. A placa tem opcionalmente uma tampa. Se a interrogação de colônias ocorrer enquanto a tampa está no lugar, a tampa e/ou a placa pode conter pelo menos uma área que é transparente a pelo menos uma porção da luz visível ultravioleta, e/ou espectro próximo ao infravermelho para permitir interrogação através da tampa e/ou placa.

[0069] Nos métodos da invenção, as frases "microorganismos em crescimento presentes na amostra em um meio sólido ou semi-sólido” e "uma amostra é colocada em um meio” incluem qualquer modo de contatar a amostra com o meio de tal modo que microorganismos presentes na amostra possam crescer e produzir colônias. Em certas modalidades, a amostra é colocada na superfície do meio sólido ou semi-sólido. Em outras modalidades, a amostra pode ser misturada com o meio em um estado líquido e então permitida solidificar (por exemplo, placas de escoamento) de tal modo que quaisquer colônias que crescem sejam incorporadas no meio. Em outra modalidade, uma amostra pode ser misturada com meio desidratado de tal modo que o meio seja reidratado e então deixado solidificar.

[0070] Em uma modalidade, o meio sólido ou semi-sólido está no fundo de um recipiente contendo microorganismos suspenso em um líquido acima do meio. O recipiente pode ser então manipulado (por exemplo, centrifugado) para colocar os microorganismos no meio. O líquido pode ser então removido e o meio incubado para crescimento de colônia. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser introduzida em um tubo de cultura de sangue contendo um meio de crescimento de líquido e um meio sólido ou semi-sólido no fundo. O tubo de cultura é então centrifugado para colocar os microorganismos no meio sólido ou semi-sólido (opcionalmente após lisar as hemácias), o líquido removido, e os microorganismos crescidos, detectados e/ou identificados de acordo com os métodos da invenção.

[0071] Após uma amostra ser colocada em um meio (por exemplo, por espalhar uma amostra de líquido no meio utilizando técnicas microbiológicas padrão e/ou por colocar uma membrana de filtro em um meio semi-sólido), o meio é incubado sob condições apropriadas para crescimento de microorganismos presentes na amostra. Condições apropriadas são bem conhecidas daqueles versados na arte e dependerão dos microorganismos e do meio. O meio pode ser incubado em uma temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 50°C, por exemplo, aproximadamente 25°C a aproximadamente 45°C, por exemplo, aproximadamente 37°C. O tempo de incubação é suficiente para colônias detectáveis aparecerem (visualmente ou espectroscopicamente) e dependerá do(s) microorganismo(s), temperatura, meio, nível de nutrientes, e outras condições que determinam a taxa de crescimento. Em algumas modalidades, o tempo de incubação pode ser aproximadamente 12 horas ou menos, por exemplo, aproximadamente 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 hora ou menos. Em certas modalidades, como sob condições de crescimento lento ou com microorganismos de crescimento lento (por exemplo, micobactérias), o tempo de incubação pode ser aproximadamente 12 horas ou mais, por exemplo, aproximadamente 18, 24, 36, 48 ou 72 ou mais horas. Em algumas modalidades, o meio é incubado em um incubador e o meio é removido do incubador uma ou mais vezes e colocado em um aparelho para detectar e/ou identificar quaisquer colônias que crescem no meio. Em outras modalidades, o meio pode ser incubado diretamente no aparelho utilizado para detectar e/ou identificar colônias, por exemplo, em um suporte de placa com temperatura controlada.

[0072] Em um aspecto, a invenção refere-se à interrogação de uma colônia de microorganismos em um meio sólido ou semi-sólido para produzir medições IF que identificam o microorganismo que compõem a colônia. Em uma modalidade, a interrogação é por espectroscopia de fluorescência. A interrogação pode ocorrer em um modo não invasivo, isto é, a colônia pode ser interrogada enquanto permanece intacta no meio. Em outra modalidade, a placa contendo o meio e a colônia permanece vedada (por exemplo, a tampa não é removida) durante toda a interrogação. De acordo com essa modalidade, a placa, ou uma porção da mesma, pode ser composta de um material que seja transparente à luz (por exemplo, pelo menos uma porção do espectro de luz próximo ao infravermelho (NIR; 700 nm-1400 nm), ultravioleta (UV; 190 nm - 400 nm) e/ou visível (VIS: 400 nm-700 nm). Os exemplos de materiais apropriados incluem, sem limitação, acrílico, metacrilato, quartzo, sílica fundida, safira, um copolímero de olefina cíclica (COC) e/ou um polímero de ciclo olefina (COP (por exemplo, Zeonex® (Zeonex®, San Diego, CA)). A capacidade de detectar e/ou identificar os microorganismos em um modo não invasivo, opcionalmente unida à manter a placa vedada durante todo o processo de identificação, bem como automatizar parte ou todo o procedimento, diminui o risco de manipular microorganismos que são ou podem ser infecciosos e/ou perigosos, bem como o risco de contaminar a amostra. Além disso, a capacidade de identificar microorganismos por interrogação direta sem processamento adicional da pelota (por exemplo, suspensão e revestimento e/ou outros ensaios de identificação), aumenta grandemente a velocidade com a qual a identificação pode ser feita. Em outras modalidades, a colônia é suspensa em uma solução e opcionalmente removida do meio antes da interrogação. Em outra modalidade, a colônia é suspensa em uma solução após interrogação in situ e interrogação adicional é então realizada. Por exemplo, técnicas como testes de aglutinação de látex ou testes de identificação fenotípica automatizados que podem ser aplicados a microorganismos isolados, porém não uma colônia de microorganismos em um meio podem ser realizados nos microorganismos suspensos.

[0073] Em algumas modalidades, a espectroscopia pode ser utilizada para analisar as propriedades de fluorescência intrínseca dos microorganismos, por exemplo, uma propriedade presente no microorganismo na ausência de agentes adicionais, como colorações, corantes, agentes de ligação, etc. Em outras modalidades, além de analisar IF, a espectroscopia pode ser também utilizada para analisar uma ou mais propriedades extrínsecas do(s) microorganismo(s), por exemplo, uma propriedade que possa ser somente detectada com o auxílio de agentes adicionais. A interrogação de espectroscopia pode ser realizada por qualquer técnica conhecida por aqueles versados na arte como sendo eficaz para detectar e/ou identificar uma ou mais propriedades intrínseca ou extrínseca de microorganismos. Por exemplo, fluorescência de face frontal (onde a luz de excitação e emitida entra e sai da mesma superfície óptica, e se a amostra for genericamente opticamente espessa, a luz de excitação penetra uma distância muito curta na amostra (vide, por exemplo, Eisinger, J., e J. Flores, "Front-face fluorometry of liquid samples,” Anal. Biochem. 94:15 (1983)) pode ser utilizada para identificação de microorganismos em pelotas. Outras formas de medição, como medições de epifluorescência, refletância, absorvência e/ou dispersão, também podem ser empregadas na presente invenção.

[0074] Em um aspecto da invenção, a espectroscopia é realizada utilizando óptica de focalização, como um sistema de lente ou um microscópio montado para permitir observações na faixa ultravioleta, visível e infravermelha ligada funcionalmente a um espectrofotômetro (por exemplo, utilizando fibra óptica). Em uma modalidade, o meio (por exemplo, em uma placa), é colocado em um estágio de microscópio onde pode ser interrogado por uma fonte de excitação bem como observado visualmente (por exemplo, através do microscópio). Em uma modalidade, a placa pode ser manualmente manipulada para posicionar colônias para interrogação, por mover a própria placa ou mover o estágio de microscópio ao qual a placa é afixada. Em outra modalidade, o estágio de microscópio é automaticamente controlado (por exemplo, um estágio motorizado) de tal modo que uma placa afixada ao estágio possa ser varrida (por exemplo, em um padrão estabelecido projetado para cobrir a seção inteira a ser varrida). Em outra modalidade, o meio mantido estacionário enquanto um feixe de luz focalizada, como um laser, é varrido através do meio e a luz emitida é detectada por um detector de imageamento ou não imageamento. Em uma modalidade adicional, o microscópio pode compreender um incubador de placa com um controle de temperatura (por exemplo, um banho de água) de modo que a placa possa permanecer sob o microscópio e ser interrogada durante incubação do meio.

[0075] Em um aspecto da invenção, uma fonte de excitação é dirigida em uma colônia única para produzir medições IF. A colônia pode ser qualquer tamanho no momento de interrogação desde que seja suficientemente grande para que uma medição precisa seja feita. Em uma modalidade, uma colônia pode ser interrogada quando não é detectável pelo olho humano. Por exemplo, uma colônia pode ser interrogada quando a colônia compreende menos do que aproximadamente 10.000 microorganismos, por exemplo, menos do que aproximadamente 5000, 1000, 500, 400, 300, 200 ou 100 microorganismos. Em outras modalidades, uma colônia pode ser interrogada quando a colônia tem menos do que aproximadamente 1000 μm em diâmetro ou menos do que aproximadamente 1000 μm em comprimento em sua dimensão mais longa (se a colônia não for redonda). Por exemplo, uma colônia pode ser interrogada quando a colônia tem aproximadamente 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50 ou 25 μm ou menos. Em uma modalidade, o feixe de excitação é de diâmetro menor do que a colônia a ser interrogada, de tal modo que o feixe inteiro possa ser orientado em uma colônia e o meio não interfira substancialmente na medição IF. Em certas modalidades, o feixe de excitação tem um diâmetro menor do que aproximadamente 1000 μη, por exemplo, menor do que aproximadamente 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50 ou 25 μm. o tamanho do feixe de excitação, bem como o tamanho do feixe de emissão, pode ser controlado, por exemplo, com o uso de pontinhos. Em algumas modalidades,o feixe de excitação é dirigido ao centro da colônia. Em outras modalidades, o feixe de excitação é dirigido em outras partes da colônia (por exemplo, em e/ou próximo à borda) onde os microorganismos podem estar em um estado de crescimento e/ou metabólico diferente do que aqueles no centro da colônia. Em uma modalidade adicional, o feixe de excitação pode ser dirigido em certa profundidade na colônia, por exemplo, utilizando microscopia confocal.

[0076] A fonte de iluminação de colônia, ou fonte de excitação, pode ser selecionada de qualquer número de fontes de luz apropriadas como sabido por aqueles versados na técnica. Qualquer porção do espectro eletromagnético que produza dados utilizáveis pode ser utilizada. Fontes de luz capazes de emissão nos espectros ultravioleta, visível e/ou próximo ao infravermelho, bem como outras porções do espectro eletromagnético, podem ser utilizadas e são conhecidas por aqueles versados na técnica. Por exemplo, fontes de luz podem ser lâmpadas continuum como uma lâmpada de arco de deutério ou xenônio para geração de luz ultravioleta e uma lâmpada de halogênio tungstênio para geração de excitação visível/near-infrared. Essas fontes de luz fornecem uma faixa de emissão ampla e a largura de banda espectral para comprimentos de onda de excitação específicos podem ser reduzidos utilizando filtros de interferência óptica, prismas e/ou grades ópticas, como bem conhecidos na técnica.

[0077] Alternativamente, uma pluralidade de fontes de luz de banda estreita, como diodos de emissão de luz e/ou lasers, pode ser espacialmente multiplexada para fornecer uma fonte de excitação de múltiplos comprimentos de onda. Por exemplo, diodos de emissão de luz são disponíveis de 190 nm a em excesso de 900 nm e as fontes têm uma largura de banda espectral de 20 - 40 nm (largura completa em meio máximo). Lasers são disponíveis em comprimentos de onda discretos de ultravioleta a próximo ao infravermelho e podem ser empregados em métodos de multiplexação bem conhecidos por aqueles versados na técnica.

[0078] A seletividade espectral de qualquer das fontes de luz pode ser aperfeiçoada utilizando meio de discriminação espectral como um monocromador de varredura. Outros métodos de discriminação podem ser utilizados, como sabido por aqueles versados na técnica, como um filtro sintonizável acústico-óoptico, filtro sintonizável de cristal líquido, um conjunto de filtros de interferência óptica, espectrografia de prisma, etc., e em qualquer combinação. Uma consideração na seleção dos discriminador espectral leva em conta a faixa de sintonização bem como o nível de seletividade. Como ilustração, por exemplo, um discriminador poderia utilizar a faixa de comprimento de onda de 300 - 800 nm com uma seletividade de 10 nm. Esses parâmetros determinam genericamente a tecnologia ótima necessária para obter a faixa de sintonização bem como a seletividade.

[0079] Tipicamente, a fonte de luz resulta na excitação da amostra, seguida por medição da emissão de fluorescência a partir da amostra em pontos de tempo predeterminados ou continuamente. Similarmente, a luz refletida da interação da fonte de excitação com a amostra pode ser medida para fornecer dados pertinentes para detecção e/ou caracterização.

[0080] A emissão da amostra pode ser medida por qualquer meio apropriado de discriminação espectral, e em algumas modalidades emprega um espectrômetro. O espectrômetro pode ser um monocromador de varredura que detecta comprimentos de onda de emissão específica pelo que a saída do monocromador é detectada por um tubo fotomultiplicador e/ou o espectrômetro pode ser configurado como uma espectrografia de imageamento pelo que a saída é detectada por um conjunto detector de imageamento como um conjunto detector de dispositivo de carga acoplada (CCD). Em uma modalidade, um discriminador permite a observação do sinal de fluorescência e/ou dispersão por um meio de fotodetecção (como um tubo fotomultiplicador, fotodiodo de avalanche, conjunto detector CCD, e/ou conjunto detector de dispositivo de carga acoplada de multiplicação por elétron (EMCCD)).

[0081] A técnica espectroscópica é utilizada para obter medições que são preferivelmente fornecidas como medições de Matriz de emissão - excitação (EEM). Como utilizado aqui, EEM é definido como a intensidade de emissão espectral luminescente de substâncias fluorescentes como uma função de comprimento de onda tanto de excitação como emissão, e inclui um espectro total ou um subconjunto do mesmo, onde um subconjunto pode conter um único ou múltiplos pares de excitação/emissão. Adicionalmente, uma seção transversal do EEM com um comprimento de onda de excitação fixo pode ser utilizada para mostrar os espectros de emissão para um comprimento de onda de excitação específico, e uma seção transversal do EEM com um comprimento de onda de emissão fixa pode ser utilizado para mostrar os espectros de excitação para uma amostra. Em uma modalidade, múltiplos EEMs são medidos em mais de um par de comprimentos de onda de excitação-emissão específica, por exemplo, pelo menos em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50 ou mais pares de comprimento de onda de excitação-emissão específico. Em certas modalidades, o número de pares de comprimento de onda de excitação-emissão medido é suficiente para determinar a espécie exata do microorganismo, por exemplo, aproximadamente 5 a aproximadamente 30 pares, por exemplo, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 pares de comprimento de onda. Em outras modalidades, o número de pares de comprimento de onda de excitação-emissão medido é suficiente para pelo menos parcialmente identificar o microorganismo, por exemplo, obter informações úteis suficientes para ação, por exemplo, informações suficientes para identificar um grupo de classificação como descrito abaixo. Por exemplo, um número apropriado de pares de comprimento de onda de excitação-emissão para fornecer informações úteis para ação, como um grupo de classificação, pode ser aproximadamente 2 a aproximadamente 8 pares, por exemplo, aproximadamente 3 a aproximadamente 5 pares.

[0082] De acordo com a invenção, medições de controle são feitas para colônias de microorganismos conhecidos, desse modo permitindo correlação de dados de teste medidos com caracterização dos microorganismos de interesse utilizando vários métodos matemáticos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, os dados de amostras podem ser comparados com as medições de controle ou linha de base utilizando sistemas de software conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Mais particularmente, os dados podem ser analisados por um número de métodos de análise multivariada, como, por exemplo, Análise discriminante geral (GDA), Análise discriminante de quadrados mínimos parciais (PLSDA), regressão de quadrados mínimos parciais, análise de componente principal (PCA), análise de fator paralelo (PARAFAC), análise de rede neural (NNA) e/ou máquina de vetor de suporte (SVM). Esses métodos podem ser utilizados para classificar microorganismos desconhecidos de interesse em grupos relevantes com base em nomenclatura existente, e/ou em grupos de ocorrência natural com base no metabolismo de organismo, patogenicidade e/ou virulência em projetar o sistema para monitorar, detectar e/ou caracterizar o organismo como descrito anteriormente.

[0083] Ainda em outra modalidade, medições não espectroscópicas do sistema de detecção, como tempos de detecção e taxas de crescimento podem ser utilizadas para auxiliar na caracterização e/ou identificação de microorganismos da colônia. Adicionalmente, medições feitas de uma imagem fotográfica dos meios sólidos ou semi-sólidos fornecem informações valiosas sobre a caracterização e/ou identidade dos microorganismos na colônia, como tamanho de colônia, formato, cor e densidade.

[0084] Em algumas modalidades da invenção, caracterização e/ou identificação dos microorganismos na colônia não necessitam envolver identificação de uma espécie exata. A caracterização abrange a categorização ou classificação ampla de partículas biológicas bem como a identificação efetiva de uma espécie única. A classificação de microorganismo a partir de uma colônia pode compreender determinação de características fenotípicas e/ou morfológicas para o microorganismo. Por exemplo, a caracterização das partículas biológicas pode ser realizada com base em diferenças observáveis, como, composição, formato, tamanho, clustering e/ou metabolismo. Em algumas modalidades, a classificação das partículas biológicas de interesse pode não exigir conhecimento prévio das características de uma dada partícula biológica porém somente exige correlações consistentes com medições empíricas desse modo tornando esse método mais geral e facilmente adaptável do que métodos com base em eventos de ligação específicos ou reações metabólicas. Como utilizado aqui “identificação” significa determinar a qual família, gênero, espécie e/ou cepa um microorganismo anteriormente desconhecido pertence. Por exemplo, a identificação de um microorganismo previamente desconhecido em nível de família, gênero, espécie, e/ou cepa.

[0085] Em alguns casos, a caracterização abrange modelos de classificação que fornecem informações úteis suficientes para que ação seja tomada. Como utilizado aqui, os modelos de classificação preferidos compreendem agrupar em um ou mais dos seguintes: (1) grupos Gram; (2) grupos Gram clínicos; (3) grupos terapêuticos; (4) grupos funcionais; e (5) grupos de fluorescência intrínseca natural.

[0086] Grupos Gram: na classificação de Grupos Gram, microorganismos podem ser colocados em uma das três categorias de classificação ampla com base em sua reação de coloração Gram e tamanho geral, os grupos selecionados de um ou mais dos seguintes: (a) microorganismos Gram positivos que colorem de azul escuro com coloração Gram; (b) microorganismos Gram negativos que colorem de vermelho com coloração Gram; e (c) células de levedura que colorem de azul escuro com coloração Gram, porém são células redondas muito grandes que são distinguidas de bactérias por suas características morfológicas e tamanho.

[0087] Grupos Gram clínicos: os Grupos Gram podem ser divididos em várias subcategorias que representam características morfológicas distintas. Essas subcategorias compreendem todas as informações clínicas relevantes relatadas por um tecnologista de laboratório experiente, e desse modo fornecem um nível de identificação mais elevado do que uma reação Gram positiva ou negativa. Essa classificação específica é muito útil porque elimina preocupações sobre confiar na qualidade de uma coloração Gram e/ou o nível de habilidade do técnico em ler o esfregaço por fornecer as informações clinicamente relevantes equivalentes com um sistema automatizado. Mais especificamente, subcategorias de microorganismos com base nesse modelo de classificação podem ser selecionadas de uma ou mais dos seguintes: (a) cocci, que são células redondas pequenas; (b) diplococos, que são duas células redondas pequenas unidas; (c) bastões, que são no formato retangular; e (d), bacilos, que são no formato de bastões. Os exemplos dessas subcategorias que podem ser avaliados por informações morfológicas adicionais incluem: (i) cocci Gram positivos; (ii) cocci Gram positivos em cadeias; (iii) cocci Gram positivos em clusters (isto é, clusters "semelhantes à uva”); (iv) diplococo Gram positivos; (v) bastões Gram positivos; (vi) bastões Gram positivos com endósporos; (vii) bastões Gram negativos; (viii) coccobacilli Gram negativos; (ix) diplococo Gram negativos; (x) levedura; e (xi) fungos filamentosos.

[0088] Grupos terapêuticos: os grupos terapêuticos compreendem múltiplas espécies microbianas que, quando isoladas dos tipos de espécime específicos, são tratados com a mesma classe de antibióticos ou mistura de antibióticos (referência: "Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008”). Em muitos casos, não é exigido pelo clínico que a identidade para o nível de espécie permita alteração de terapia empírica inicial para uma terapia mais direcionada porque mais de uma espécie pode ser tratada com a mesma escolha de antibiótico(s). esse nível de classificação coloca corretamente esses microorganismos do "mesmo tratamento” em categorias terapêuticas únicas. Os exemplos desse nível de caracterização incluem a capacidade de distinguir espécie Enterobacteriacae (EB) altamente resistente de espécie EB sensível (Enterobacter spp. De E. coli), ou espécie de Candida resistente a fluconazol (C. glabrata e C. kruzei) de espécie de Candida sensível (C. albicans e C. parapsilosis) e assim por diante.

[0089] Grupos funcionais: de acordo com a invenção, microorganismos também podem ser colocados em vários grupos com base em uma mistura de características metabólicas, de virulência e/ou fenotípica. Organismos não fermentativos podem ser claramente distinguidos dos fermentativos. Além disso, a espécie de microorganismo que produz hemolisinas pode ser agrupada separadamente de espécie não hemolítica. Em alguns casos, esses grupos representam categorias mais amplas do que o nível de gênero (por exemplo, coliformes, bastões não fermentativos Gram-negativos) alguns no nível de gênero (por exemplo, Enterococus, Candida) e alguns com discriminação mais próxima ao nível de espécie (por exemplo, estafilococos negativos-coagulase, estreptococos alfa-hemolíticos, estreptococos beta-hemolíticos, estafilococos positivos-coagulase, isto é, S. aureus).

[0090] Grupos de fluorescência intrínseca natural ("IF”): microorganismos também podem ser colocados em categorias com base em sua tendência natural a agrupar juntos por suas características de fluorescência inatas e/ou intrínsecas. Alguns desses grupos podem ser comuns a categorias de Grupo funcional e terapêutico. Esses agrupamentos podem compreender espécie individual, como E. faecalis, S. pyogenes ou P. aeruginosa que têm assinaturas IF características e/ou podem conter pequenos grupos de organismos com assinaturas IF relativamente conservadas como os grupos E.coli-K. oxytoca ou E.aerogenes e C. freundii.

[0091] Além de medir propriedades intrínsecas de microorganismos (como fluorescência intrínseca) para fins de identificação, os métodos da presente invenção podem compreender ainda o uso de agentes identificadores adicionais para auxiliar no processo de identificação. Agentes que se ligam a microorganismos específicos, como ligandos por afinidade, podem ser utilizados para separar microorganismos, identificar uma classe ou espécie de microorganismo (por exemplo, através de ligação a um receptor ou proteína de superfície exclusiva) e/ou identificar uma característica do microorganismo (por exemplo, resistência a antibiótico). Agentes identificadores úteis incluem, sem limitação, anticorpos monoclonais e policlonais e fragmentos dos mesmos (por exemplo, anti-Eap para identificação de S. aureus), sondas de ácido nucléico, antibióticos (por exemplo, penicilina, vancomicina, polimixina B), aptâmeros, mimética de peptídeo, proteínas de ligação derivadas de fago, lectinas, biomarcadores de imunidade inata hospedeiros (proteínas de fase aguda, proteína de ligação LPS, CD14, lectina de ligação de manose, receptores semelhante à Toll), peptídeos de defesa hospedeiros (por exemplo, defensinas, catelicidinas, proteogrinas, magaininas), bacterocinas (por exemplo, lantibióticos, como nisina, mersacidina, epidermina, galidermina e plantaricina C, e peptídeos classe II), bacteriófagos e corantes fluorescentes seletivos para ácidos nucléicos, lipídeos, carboidratos, polissacarídeos, cápsulas/substância viscosa ou proteínas, incluindo qualquer combinação. Se o agente não desprender ele próprio um sinal detectável, o agente pode ser rotulado para fornecer um sinal detectável, como por conjugar o agente com um marcador (por exemplo, visível ou fluorescente). Marcadores incluem, sem limitação, compostos fluorescentes, luminescentes, fosforescentes, radioativos e/ou colorimétricos. O agente pode ser adicionado aos microorganismos em qualquer etapa nos métodos da invenção, por exemplo quando a amostra é colocada no meio e/ou após as colônias terem sido detectadas. Em algumas modalidades, a presença e/ou quantidade do agente na colônia pode ser determinada durante interrogação da colônia. Outros agentes identificadores úteis incluem substratos para enzimas microbianas, agentes de quelação, detergentes, tensoativos, desinfetantes (por exemplo, alcoóis, alvejante, peróxido de hidrogênio) e compostos tóxicos (por exemplo, azida de sódio, cianeto de potássio) e inibidores metabólicos como cicloexamida, etc. similarmente, muitos compostos fluorescentes para medir viabilidade de célula microbiana, metabolismo e/ou potencial de membrana podem ser utilizados como um agente identificador na presente invenção.

[0092] Em um aspecto da invenção, o método pode compreender ainda uma etapa de recuperar o(s) microorganismo(s) da colônia e executar testes adicionais. O(s) microorganismo(s) recuperado(s) pode(m) ser suspenso(s) em um meio apropriado, por exemplo, solução salina. Após suspenso, o(s) microorganismo(s) pode(m) ser submetido(s) a quaisquer testes adicionais que são desejáveis, como seria sabido por aqueles versados na técnica e como descrito acima. Em particular, qualquer teste que exija amostras limpas de microorganismos pode ser realizado com o(s) microorganismo(s) suspenso(s). em algumas modalidades, testes de identificação/caracterização adicionais podem ser realizados. Os exemplos de testes de identificação incluem Vitek 2, testes de ácido nucléico amplificado e não amplificado (NAT), ensaios de aglutinação de látex e cromogênica, imunoensaios, (por exemplo, empregar anticorpos primários ou secundários rotulados e/ou outros ligandos), espectrometria de massa (por exemplo, espectrometria de massa MALDI-TOF) e/ou outras técnicas ópticas como espectroscopia infravermelha (FTIR) ou espectroscopia Raman. Testes de caracterização adicionais podem ser também realizados, como resistência a droga, antibiogramas e/ou fatores de virulência. A caracterização adicional pode ser parte de um teste que foi iniciado durante as etapas de identificação iniciais do método. Por exemplo, a detecção de S. aureus resistente a meticilina pode começar por adição de penicilina rotulada de forma fluorescente à amostra antes do crescimento de colônias. A presença e/ou quantidade de penicilina ligada pode ser então determinada, por exemplo, na colônia ou em microorganismos recuperados da colônia. Em certas modalidades, um ou mais testes adicionais podem ser realizados no mesmo sistema no qual as etapas de identificação são realizadas, por exemplo, no mesmo aparelho. Em uma modalidade, testes adicionais específicos podem ser selecionados de diversos testes disponíveis com base na identificação feita.

[0093] Em um aspecto da invenção, algumas ou todas as etapas do método podem ser automatizadas. Como utilizado aqui, o termo "automatizado” significa controlado por computador. Em uma modalidade, as várias etapas de detecção e correlação de emissão de fluorescência são automatizadas, e as informações resultantes obtidas dos métodos são automaticamente utilizadas para povoar um banco de dados. Em modalidades adicionais, outras etapas no método, como detecção e/ou interrogação de colônias, também podem ser automatizadas. A automação das etapas dos métodos não somente permite que mais amostras sejam testadas mais rapidamente, como também reduz os riscos de erros humanos em manipular amostras que podem conter microorganismos prejudiciais e/ou infecciosos e reduz as chances de contaminar as amostras e/ou expor o manipulador às amostras. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um sistema para detectar e/ou identificar um microorganismo em um meio sólido ou semi-sólido, o sistema compreendendo um espectrofotômetro e óptica de focalização, como um sistema de lente ou um microscópio. Em outras modalidades, o sistema compreende ainda um mecanismo para varrer a superfície do meio e/ou um mecanismo para controlar o ambiente do (por exemplo, incubação) meio.

[0094] Um aspecto da invenção refere-se à detecção de uma colônia em um meio sólido ou semi-sólido. A detecção é opcionalmente seguida por identificação/caracterização dos microorganismos na colônia. Em

[0095] Em certas modalidades da invenção, os métodos de detecção podem ser também utilizados para detectar a presença de um (uns) microorganismo(s) em uma amostra, com ou sem identificação do microorganismo detectado. Em algumas modalidades, os métodos de detecção podem ser utilizados para monitorar amostras em relação à contaminação por um microorganismo, por exemplo, gêneros alimentícios, produtos farmacêuticos, água potável, etc. em uma modalidade, os métodos podem ser realizados em um modo repetitivo para monitoração constante em relação à contaminação, por exemplo, uma vez por mês, uma vez por semana, uma vez por dia, uma vez por hora, ou qualquer outro padrão de tempo. Em outra modalidade, amostras podem ser testadas conforme necessário, por exemplo, quando se suspeita de contaminação ou ausência de contaminação necessita ser confirmada. Em modalidades adicionais, os métodos de detecção podem ser utilizados para procurar a presença de um microorganismo em uma amostra clínica, por exemplo, de uma cultura de sangue ou ferimento. Por exemplo, uma amostra pode ser removida de uma cultura de sangue em certos pontos de tempo e o método de detecção realizado na amostra para determinar se a cultura de sangue é positiva. Em uma modalidade, uma amostra pode ser tirada em um ponto de tempo definido após inoculação da cultura, por exemplo, 24 horas após inoculação, para determinar se a cultura de sangue é positiva. Em outra modalidade, amostras podem ser tiradas da cultura de sangue regularmente, por exemplo, a cada 12, 6, 4, 2, 1 ou 0,5 hora, para identificar culturas de sangue positivas em um período de tempo curto sendo detectavelmente positivas. Em certas modalidades dos métodos de detecção, a etapa de detecção pode ser opcionalmente seguida por métodos de identificação/caracterização como descrito aqui. Em outras modalidades, os métodos de detecção são parcial ou totalmente automatizados, particularmente para as modalidades que envolvem monitoração repetitiva de amostras.

[0096] Em certas modalidades, os métodos da invenção podem ser realizados com células de animais ou plantas em vez de microorganismos. Em particular, células de animais (por exemplo, células de mamíferos, aves, insetos) ou células de plantas que podem crescer em colônias, torrões ou outras estruturas tridimensionais ou que são cultivadas em substratos tridimensionais podem ser detectadas, monitoradas, caracterizadas e/ou identificadas utilizando as técnicas reveladas aqui. Os exemplos de células apropriadas que crescem em colônias tridimensionais incluem, sem limitação, células tronco, fibroblastos e células neoplásicas.

[0097] A presente invenção é adicionalmente detalhada nos seguintes exemplos, que são oferecidos como ilustração e não pretendem limitar a invenção de modo algum. Técnicas padrão bem conhecidas na arte ou as técnicas especificamente descritas abaixo são utilizadas.

Exemplos Exemplo 1. Obtenção de espectros a partir de colônias em placas e membranas

[0098] Os testes foram realizados para determinar se espectros úteis poderiam ser obtidos de colônias diretamente em placas de Agar de sangue (BAP; Agar de soja tríptica com 5% de sangue de ovelha) com e sem membranas pretas (tabela 1). Colônias de E.coli (EC), S.aureus (AS) , E. faecalis (EF) e P. aeruginosa (PA) foram cultivadas como indicado na tabela 2 e espectros foram tirados através do microscópio UV (Objetiva 10X) acoplado a um adaptador de fibra óptica a um espectrômetro Fluorolog3 (Horiba Jobin Yvon, Edison NJ) e um detector PMT. O EEM foi adquirido através de uma faixa de comprimento de ondas de Excitação (Ex) = 260-550 nm, e Emissão (Em) = 280-600 nm, a cada 5 nm com uma largura de fenda = 5 nm. Onde indicado, a área de interrogação foi estreitada por colocar um pontinho de 1 mm na trajetória de emissão que resultou em uma área observada de aproximadamente 0,1 mm. Sem o pontinho, os círculos de excitação e emissão como projetado nas colônias foram iguais em aproximadamente 1 mm de diâmetro. As amostras que foram incluídas em cada curso de teste são indicadas na tabela 2.

[0099] Membranas:

[00100] Nenhuma = Agar de sangue de ovelha (SBA)

[00101] Pall = membrana de polieterssulfona com grade de Pall Metricel Black em SBA

[00102] WPC = membrana preta de policarbonato com trilha cauterizada Whatman em SBA

[00103] WME = membrana de éster misto Whatman Black em SBA

[00104] Espectros de curso de teste A2 de placas não inoculadas são mostrados nas figuras 1A-1D. O eixo geométrico vertical em cada figura indica a faixa Ex, e o eixo geométrico horizontal mostra a faixa Em. espectros foram obtidos de BAP (figura 1A), membrana Pall (figura 1B), membrana WME (figura 1C) e membrana WPC (figura 1D) sem microorganismos. A primeira observação foi a diferença em fluorescência de segundo plano entre as membranas Pall e Whatman e a BAP. Surpreendentemente, a membrana Pall preta floresceu intensamente nas áreas do espectro anteriormente consideradas como sendo importantes para classificação de suspensões microbianas, muito mais do que BAP não mascarado. Entretanto, a membrana WME forneceu a fluorescência de segundo plano mínima de todas.

[00105] Espectros do curso de teste A3 de colônias em membrana WME em relação à BAP são mostrados nas figuras 2A-2C. espectros foram obtidos de EC3 (figura 2A) e SA1 (figura 2B), e o resultado de subtrair o espectro EC3 do espectro SA1 é mostrado na figura 2C. os espectros das colônias mostram diferenças claras entre S. aureus e E. coli. O fato de que algumas partes do espectro são mais elevadas para E. coli e outras são mais elevadas para S. aureus mostra que as diferenças estão presentes no padrão geral, e não simplesmente diferenças na escala de intensidade.

[00106] Espectros do curso de teste B1 de colônias em BAP sem uma membrana são mostrados nas figuras 3A-3D. os espectros foram obtidos de EC1 (figura 3A), SA1 (figura 3B), EF1 (figura 3C), e PA1 (figura 3D). embora os parâmetros de medição diferentes produzam intensidades muito mais elevadas do que os espectros A3, e apesar de serem medidos diretamente em um BAP sem uma membrana preta, os padrões relativos são ainda similares para a espécie respectiva de bactérias.

[00107] Esses experimentos mostraram que espectros de fluorescência intrínseca poderiam ser obtidos de colônias através do microscópio diretamente em um BAP, com ou sem o auxílio de uma membrana preta para reduzir fluorescência de segundo plano, e os padrões observados foram característicos para tipos diferentes de microorganismos.

Exemplo 2. Varredura para microcolônias através do microscópio

[00108] Os testes foram realizados para determinar se as colônias que crescem sob o microscópio em um estágio motorizado poderiam ser localizadas utilizando medições IF de ponto por ponto, e têm espectros IF coletados automaticamente de cada colônia detectada. Um microscópio UV foi acoplado a um espectrômetro Fluorolog 3 (Horiba Jobin Yvon, Edison NJ), que serviu como a fonte de excitação de fluorescência e o dispositivo de medição de emissão, através de cabos de fibra óptica. O estágio motorizado do microscópio foi adaptado com um incubador de placa compacto construído com bobinas de tubagem alimentadas por um banho de água em circulação ajustada em 36°C. o incubador foi também equipado com uma janela transparente UV feita de uma lâmina de microscópio de quartzo. Vários meios de Agar foram inoculados pelo método de dispersão com E. coli ATCC 25922 (EC) e/ou S. aureus ATCC 25923 (AS) como indicado na tabela 3. Alguns cursos utilizaram um material de bloqueio de luz, uma membrana de éster misto Whatman preta (WME) ou carvão, para reduzir a fluorescência vindo do próprio meio.

[00109] Após inoculação, o estágio motorizado do microscópio foi programado para mover periodicamente através da placa de Agar em uma grade de busca e medir a fluorescência em cada ponto com um ou mais pares de comprimento de onda de emissão/excitação. O Fluorolog3 foi programado com larguras de fenda ajustadas em 10 nm e tempos de integração ajustados em 500 ms (cursos de teste A-E) ou 1000 ms (cursos de teste F-H). o feixe d excitação projetado na superfície do Agar foi restrito a diâmetro de aproximadamente 0,1 mm por colocar um pontinho no feixe de excitação no microscópio. Correspondendo a esse tamanho de feixe, o estágio de microscópio foi escalonado em incrementos de 0,1 mm de modo que 10 etapas cobriram 1 mm de distância. O feixe de emissão não foi limitado a um pontinho, porém o microscópio foi coberto durante medições para evitar que qualquer luz de dispersão que não foi gerada pelo feixe de excitação seja detectada.

[00110] Para cursos de teste G e H, um algoritmo foi desenvolvido para calcular automaticamente a localização de colônias em crescimento. Para o curso H o programa foi adicionalmente aperfeiçoado de modo que todas as colônias que foram detectadas acionaram o estágio de microscópio para mover para seus locais em seqüência e coletar seus espectros IF. Os espectros coletados eram um subconjunto de uma varredura de matriz total que compreendia 300 pontos EEM selecionados para reduzir o tempo de aquisição exigido. Também para fins de tempo, o instrumento foi programado para tirar espectros de não mais do que 10 colônias.

[00111] O curso A teve um problema de instrumento que parou o programa após 6 h., e nenhuma colônia foi detectada durante esse tempo.

[00112] O curso B mostrou uma colônia raramente acima de fluorescência de segundo plano em 8 h, 2 claramente visíveis em 10 h., e 3 em 12 h e posteriormente. A diferença entre os sinais de colônia e o segundo plano era maior em 440 - 525 nm (aproximadamente 4x o segundo plano) do que em 305-365 nm (aproximadamente 2x o segundo plano).

[00113] O curso C não teve colônias na área de varredura devido a um inóculo baixo.

[00114] O curso D mostrou 1 colônia em 8 h e 3 em 10 h e posteriormente.

[00115] O curso E não teve colônias no campo de visão inicialmente. Uma colônia cresceu nas bordas do campo por 12 h, 3 em 14 h e posteriormente.

[00116] O curso F com um inoculo misturado mostrou 10 colônias determinadas como sendo EC por 8 h., adicionalmente 3 SA por 10 h., e mais 2 SA em tempos maiores do que 12 h. gráficos tridimensionais das varreduras de busca IF de ponto por ponto de curso F são mostrados nas figuras 5A-5F, onde a altura é igual à intensidade de fluorescência. Os gráficos mostram medições feitas em 6 h onde a primeira colônia detectada foi observada (figura 4A), 8 h (figura 4B), 10 h (figura 4C), 12 h (figura 4D) 16 h (figura 4E) e 24 h (figura 4F). observe que todas as colônias visíveis em 8 h eram E.coli, ao passo que as colônias adicionais vistas em 10 h e posteriormente eram S. aureus. Uma imagem de close-up do BAP do curso F após 24 h é mostrada na figura 5A com a área de varredura de busca delineada, um gráfico de contorno de intensidade de fluorescência a partir da varredura de busca em 12 h mostrando locais correspondentes de colônia é mostrado na figura 5B.

[00117] O curso G mostrou 1 colônia EC em 8 h e 2 colônias EC em 9 h. um erro de instrumento parou a aquisição em 10 h e 12 h, porém quando reiniciado em 12 h havia 5 colônias detectadas; 2 EC e 3 SA. O algoritmo de detecção de colônia identificou com sucesso a localização de todas as 5 colônias.

[00118] O curso H teve condensação na janela de observação que interferiu em todas as varreduras antes de 9 h., em cujo tempo 3 colônias EC foram detectadas e espectros tirados. As mesmas 3 EC foram detectadas em varreduras subseqüentes, e começando em 13 h, 4 colônias SA foram também detectadas e os espectros tirados.

[00119] Os resultados experimentais mostram que fluorescência intrínseca pode ser utilizada para detectar a presença e número de microcolônias de microorganismos enquanto estão crescendo diretamente em placas de Agar, quer uma membrana de bloqueio de segundo plano ou carvão seja utilizada ou não. Além disso, após a localização, é relativamente simples tirar espectros completos das microcolônias in situ para classificação.

Exemplo 3. Classificação de colônias de microorganismo em placas de Agar

[00120] Os testes foram realizados para determinar se colônias microbianas poderiam ser classificadas dos espectros IF tirados diretamente na placa de Agar onde foram cultivadas.

[00121] A aquisição espectral foi feita através de uma matriz de excitação (Ex) e emissão (Em) de comprimentos de onda 260-580 nm e 260-680 nm, respectivamente, em um subconjunto de 300 pontos EEM selecionado para reduzir o tempo de aquisição exigido. Adicionalmente, todos os comprimentos de onda de refletância (onde Ex = Em) foram também lidos. Para fluorescência, as larguras de fenda foram ajustadas em 5 nm de passagem de faixa e o tempo de integração foi de 1000 ms. Cada aquisição de 300 pontos demorou aproximadamente 8,1 min. para completar.

[00122] A tabela 4 lista os microorganismos testados, que compreendia 6 isolados cada de 20 espécies para um total de 120 testes. Onde utilizado para indicar agrupamentos diferentes do que por espécie, o termo Gram clínico (ClinGram) se refere ao nível de classificação possível por um observador altamente versado lendo uma coloração Gram, não apenas positiva, negativa ou levedura (Tabela 5). Por exemplo, Estafilococos são cocos Gram positivos em clusters, enquanto muitos Estreptococos são cocos Gram positivos em cadeias.

[00123] A tabela 5 mos tra os resultados de modelagem de classificação por Análise discriminante Linear escalonada avançada com validação cruzada "deixe um de fora”. A validação cruzada "deixe um de fora” foi escolhida porque faz uso eficientemente de conjuntos de dados pequenos, estimando os resultados como se um número de "desconhecidos” fosse testado igual ao conjunto de "treinamento”, sem necessitar passar duas vezes a quantidade de testes. Nas tabelas, o "Número de etapas DA” se refere ao número de etapas de Análise discriminante concluídas, que pode ser ou não o número efetivo de pontos EEM utilizados para produzir os resultados indicados. Tipicamente o número de etapas é igual ao número de pontos ExEm no modelo, porém às vezes o número de pontos de modelo é menor se pontos forem removidos, em vez de adicionados, durante algumas etapas.

[00124] Uma vez que a Análise discriminante pode "encontrar” falsas correlações nas flutuações aleatórias nos dados, dado um número suficiente de pontos de dados suficientemente "barulhentos”, a validação cruzada é essencial para estimar o sucesso verdadeiro de um modelo de classificação dado. Genericamente, os resultados não validados cruzados tenderão a 100% corretos com contagem de etapas crescente, enquanto os resultados validados cruzados elevarão até um pico, e então diminuirão. O modelo com o número de etapas próximo ao pico de validação cruzada pode ser considerado otimizado para um conjunto de dados dado. A tabela 5 mostra os resultados de cada curso de modelo de classificação, ambos com e sem validação cruzada, no ponto onde os resultados validados cruzados são otimizados.

[00125] A classificação para cada microorganismo por análise discriminante foi considerada como correta se a primeira escolha do modelo para classificação fosse a identidade efetiva do microorganismo, independente de quão próximo as outras escolhas podem ter sido. Também é mostrado o número e percentagem de microorganismos para os quais a identidade efetiva está compreendida nas 3 escolhas superiores da classificação do modelo, indicando um bom modelo preditivo, se ainda assim imperfeito, para classificação.

[00126] Os espectros de colônias mostram claramente o potencial para classificar microorganismos. Há provavelmente algum ruído nos dados, como indicado pelo fato de que os resultados são melhorados por armazenar 2 pontos ExEm adjacentes. Dois fatores conhecidos que contribuem para os dados barulhentos vêm de posicionamento inconsistente do feixe de medição sobre as colônias, e os níveis de luz baixos que atingem o detector através do aparelho. Para esse estudo, o posicionamento do feixe de excitação no centro das colônias com a câmera de microscópio foi difícil porque a iluminação disponível para visualização não era ótima. Na realidade, o posicionamento foi observado como estando fora em algumas ocasiões, o que foi corrigido, porém é provável que outros posicionamentos errados passassem despercebidos. O ruído no próprio sinal de fluorescência era também grande porque a quantidade de energia fluorescente que atinge os detectores era mais do que 1000 vezes mais baixa do que para suspensões de microorganismos. Isso era devido à configuração de microscópio e fibra óptica, que é uma ferramenta de pesquisa flexível porém não é otimizada para esse tipo de medição. Um sistema óptico projetado para essa tarefa poderia facilmente superar esse problema.

[00127] Exemplo 4 : os testes foram realizados para determinar se melhor posicionamento e produtividade aumentada de luz poderiam melhorar a classificação de colônias microbianas com fluorescência intrínseca. O experimento do exemplo 3 foi repetido com o mesmo equipamento e as mesmas cepas de microorganismo, porém com um método modificado. A aquisição espectral foi feita através da mesma faixa de comprimento de onda de Excitação (Ex) e Emissão (Em) (Ex = 260-580 nm, Em = 260-680 nm) porém com um subconjunto diferente de 312 comprimentos de onda que cobrem as mesmas áreas chave do espectro, porém é mais útil para armazenagem de valores do que o subconjunto anterior. A principal razão para utilizar subconjuntos é reduzir o tempo necessário para coletar espectros com o equipamento atual. As larguras de fenda de monocromador foram aumentadas para passagem de faixa de 7 nm em relação a 5 nm anterior, que aumentou a fluorescência medida por aproximadamente 2 vezes. O tempo de integração foi mantido em 1000 ms, e cada aquisição demorou aproximadamente 9,8 min. para concluir.

[00128] A tabela 6 mostra os resultados de modelagem de classificação por Análise discriminante linear escalonada avançada com validação cruzada "Deixe um de fora”. Como anteriormente, a classificação foi considerada correta se a primeira escolha do modelo para classificação era a identidade efetiva do microorganismo, independente de quão próximo as outras escolhas podem ter sido. O desempenho de classificação ao nível de espécie é mostrado com base em pontos de dados individuais (sem armazenagem), armazenando 3 leituras de fluorescência adjacentes em um padrão "L” na matriz ExEm, e armazenando 5 pontos EEM adjacentes em um quadrado. Além disso, a classificação ao nível de Gram clínico é mostrada como armazenagem "3L”.

[00129] As mudanças do método para melhorar a consistência das leituras de fluorescência combinadas com a produtividade de luz aumentada substancialmente melhoram o sucesso de classificação. Dos aperfeiçoamentos principais, melhor posicionamento contribuiu provavelmente mais para o ganho de desempenho do que a produtividade de luz aumentada, e é provável que as leituras de fluorescência de mais de um local em cada colônia possam ser usadas para aumentar adicionalmente a precisão de classificação. As limitações no equipamento atual permitiram somente um aumento modesto de 2 vezes em sinal sem reduzir a resolução espectral ou aumentar substancialmente o tempo de varredura, e é evidente que há ainda ruído de leitura significativo nos espectros de fluorescência.

[00130] O ruído de leitura é parcialmente superado por armazenar pontos adjacente, o que não teve efeito positivo sobre outros fatores que afetam o sucesso da classificação, porém reduz de acordo a resolução espectral. Essa armazenagem ajuda também a indicar que alguma resolução espectral poderia ser sacrificada para melhorar o ruído de leitura em um sistema otimizado. O aperfeiçoamento com armazenagem, entretanto, não foi tão grande quanto à diferença entre esses dados e os resultados do método anterior, o que mostra provavelmente que o posicionamento da medição desempenhou um papel maior. Aperfeiçoamentos adicionais em sucesso de classificação poderiam ser feitos com óptica otimizada e posicionamento automatizado como estaria bem compreendido nos conhecimentos do técnico comum.

[00131] O acima é ilustrativo da presente invenção, e não deve ser interpretado como limitação da mesma. A invenção é definida pelas reivindicações a seguir, com equivalentes das reivindicações sendo incluídas na mesma. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, publicações de patente, e quaisquer outras referências mencionadas aqui são incorporadas a título de referência na íntegra para os ensinamentos relevantes à sentença e/ou parágrafo no qual a referência é apresentada.

Claims

Método de detectar e identificar uma bactéria em um meio sólido ou semi-sólido, caracterizado pelo fato de que compreende:
- a) Varrer o referido meio sólido ou semi-sólido, conhecido por conter, ou que pode conter uma ou mais colônias de bactérias para localizar quaisquer colônias presentes no meio;
- b) Interrogar uma ou mais colônias de bactérias no referido meio sólido ou semi-sólido, localizadas durante a etapa (a), para produzir medições de fluorescência intrínseca (IF) características de uma bactéria na referida colônia, em que referidas medições (IF) são produzidas por espectroscopia que compreende determinar uma matriz de excitação-emissão (EEM); e
- c) Identificar a bactéria na colônia com base nas referidas medições de fluorescência intrínseca (IF), em que referida identificação é da família, gênero, espécie e/ou nível de cepa.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a varredura compreende uma varredura de ponto por ponto da superfície do meio sólido ou semi-sólido.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a colônia é uma microcolônia tendo um diâmetro menor do que 50 µm.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a etapa de interrogação é não invasiva.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que as bactérias são caracterizadas em um ou mais modelos de classificação selecionados do grupo que consiste em Grupos Gram.
Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a EEM compreende pelo menos dois pares de comprimento de onda diferentes.
Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a EEM é comparada com um banco de dados de EEMs de bactérias conhecidas.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a adição de um agente identificador ao meio ou amostra e em que a identificação se baseia em parte na presença e/ou quantidade do agente identificador na colônia ou na bactéria recuperada da colônia.
Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente identificador é um ligando de afinidade, anticorpo ou fragmento do mesmo, sonda de ácido nucléico, antibiótico, aptâmero, mimética de peptídeo, proteína de ligação derivada de fago, lectina, peptídeo de defesa hospedeiro, bacterocina, bacteriófago, corante, ou qualquer combinação dos mesmos.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o meio sólido ou semi-sólido compreende um ou mais nutrientes úteis para o crescimento da bactéria um ou mais aditivos, em que um ou mais aditivos aumentam as medições de fluorescência intrínseca das colônias de bactérias no meio sólido ou semi-sólido.
Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que um ou mais aditivos são selecionados do grupo que consiste em hidrolisados de proteína, aminoácidos, extratos de carne e vegetais, fontes de carboidratos, agentes de tamponamento, agentes de ressuscitar, fatores de crescimento, co-fatores de enzimas, sais minerais, suplementos de metal, compostos de redução, agentes de quelação, agentes sensíveis à luz, agentes de resfriamento brusco, agentes de redução, agentes de oxidação, detergentes, tensoativos, desinfetantes, agentes seletivos e inibidores metabólicos.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a interrogação de uma colônia compreende ainda medir epifluorescência.
Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a interrogação de uma colônia compreende ainda medir luz refletida.