KR20110106373A - 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 특성화 방법 - Google Patents

고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 특성화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 내재적 형광(IF) 측정치를 사용한 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 스캐닝, 검출 및 모니터링 방법 및 시스템에 관한 것이다. 상기 방법은 추가로 상기 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 사용한 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출, 특성화 및/또는 동정에 관한 것이다.

Description

고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 특성화 방법{METHODS FOR THE CHARACTERIZATION OF MICROORGANISMS ON SOLID OR SEMI-SOLID MEDIA}
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 본 명세서에 포함되는 미국 가특허 출원 제61/122,925호(발명의 명칭: "Methods for Characterization of Microorganisms on Solid or Semi-Solid Media", 출원일: 2008년 12월 16일)의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출, 모니터링, 특성화 및/또는 동정 방법 및 시스템에 관한 것이다.
임상 진단의 목적으로 단리한 미생물뿐 아니라, 식료품, 의료용 티슈 또는 환경의 오염을 모니터링하기 위해 단리한 미생물은 종종 관찰되는 유기체의 존재에 대한 적절한 반응을 파악하기 위하여 특성화되어야 한다. 바이텍(Vitek)®, 포에닉스(Phoenix)™ 및 마이크로스캔(Microscan)® 시스템과 같은 종래의 자동 표현형 동정 분석, 또는 API와 같은 수동의 표현형 시험은 확고한 결과를 제공하기 위하여 미생물이 적절한 성장 단계에 있고, 간섭하는 배지 및 혈액 생성물이 없는 것을 필요로 한다. 이들 시스템은 플레이팅된 배지 상에서 16 내지 24시간 동안 성장시킨 콜로니를 사용하며, 그 후, 상기 콜로니로부터 표준화된 현탁액을 제조한 다음, 실제의 특성화 시험은 완료하는데 추가 4시간 내지 24시간의 인큐베이션을 필요로 한다.
내재적 형광(IF), 적외선 분광법(FTIR) 또는 라만 분광법(Raman spectroscopy)과 같은 광학 분광법은 미생물의 동정을 매우 빠르게 할 가능성을 가지나, 오직 "깨끗한" 미생물 현탁액으로만 작동하는 것으로 증명되었다. 간행물에는 기능 특성화를 가능하게 하기 위해 오직 매우 제한된 유기체 세트를 사용하거나, 특이적 결합 사건과 같은 추가의 측정을 필요로 하는 미생물 특성화를 위한 IF 방법이 기재되어 있다. 성장 배지 상의 미생물의 직접적인 시험은 배지 그 자체가 분광 패턴에 커다란 기여를 한다는 가정 때문에, 문제가 있는 것으로 여겨져 왔다.
본 발명은 고도의 형광 배지를 비롯한 형광 고체 및/또는 반고체 성장 배지 상에서 직접적으로 조사되는 미생물들을 분광학적으로 식별할 수 있는 방법을 제공함으로써 해당 분야의 문제점을 극복한다.
발명의 요약
본 발명은 고체 및/또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출, 모니터링, 특성화 및/또는 동정 방법을 제공한다. 특성화는 미생물의 광범위한 범주화 또는 분류뿐 아니라, 단일 종의 실제의 동정을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "동정"은 이전에 알려지지 않은 미생물이 속하는 과, 속, 종 및/또는 균주를 결정하는 것, 예를 들어, 이전에 알려지지 않은 미생물을 과, 속, 종 및/또는 균주 수준으로 동정하는 것을 의미한다. 본 명세서에 개시된 방법은 종래 기술보다 더 빠른 미생물의 검출, 특성화 및/또는 동정을 가능하게 하여, 오염된 물질(예를 들어, 식료품 및 약제)의 빠른 진단(예를 들어, 감염되었거나 감염된 것으로 의심되는 대상체에서) 및 동정을 초래한다. 본 발명의 방법에 수반되는 단계는 단기간에 수행되어, 임상적으로 유의미한 실행가능한 정보를 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 빠르게 성장하는 유기체를 단지 수시간 내에 검출하고 동정할 수 있다. 더 느리게 성장하는 유기체를 종래 기술보다 더 빨리 검출하고 동정할 수 있어, 유용한 시간 내에 결과를 제공한다. 단독의 동정/특성화 단계는 수분 이내에 수행될 수 있다. 또한, 상기 방법은 다수 유형의 미생물(예를 들어, 상이한 부류 및/또는 종)을 동시에(예를 들어, 혼합된 배양물에서) 검출하는 것, 모니터링하는 것, 특성화하는 것 및/또는 동정하는 것을 가능하게 한다. 유리하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 콜로니의 파괴 없이 동소(in situ)에서 수행하여, 추가의 시험 또는 이용을 위해 콜로니를 보존할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 부분적으로 또는 완전히 자동화하여, 감염성 물질을 핸들링하는 위험 및/또는 샘플을 오염시킬 위험을 줄일 수 있다.
본 발명의 일 면은
(a) 고체 또는 반고체 배지 상의 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 콜로니 내의 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
(b) 내재적 형광(IF) 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 특성화 및/또는 동정하는 단계를 포함하는, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 특성화 및/또는 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은
(a) 하나 이상의 미생물 콜로니를 함유하는 것으로 알려져 있거나, 이를 함유할 수 있는 배지를 스캐닝(scanning)하여, 배지 상에 존재하는 상기 콜로니의 위치를 확인하는 단계;
(b) 단계 (a) 중에 위치가 확인된 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 콜로니 내의 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
(c) 상기 내재적 형광(IF) 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 검출, 특성화 및/또는 동정하는 단계를 포함하는, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출 및 특성화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 면은
(a) 샘플 내에 존재하는 미생물을 고체 또는 반고체 배지 상에 성장시켜, 적어도 하나의 콜로니를 생성하는 단계;
(b) 배지 상의 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
(c) 생성된 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 특성화 및/또는 동정하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 미생물의 특성화 및/또는 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 면은
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 샘플 내에 존재하는 미생물을 고체 또는 반고체 배지 상에서 성장시키는 단계; 및
(c) 상기 고체 또는 반고체 배지의 점-대-점(point-by-point) 스캐닝을 행함으로써 배지 상에 존재하는 임의의 콜로니의 위치를 확인하여, 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 미생물의 존재의 검출 방법에 관한 것이며, 여기서, 생성된 측정치에 의해 위치가 확인된 하나 이상의 콜로니의 존재는 미생물이 샘플 내에 존재하는 것을 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 발명은 렌즈 시스템 또는 현미경과 같은 분광광도계 및 집속 소자(focusing optics)를 포함하는, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출, 특성화 및/또는 동정 시스템에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 상기 시스템은 배지의 표면을 스캐닝하는 메커니즘 및/또는 배지의(예를 들어, 이를 인큐베이션하는) 환경을 조절하는 메커니즘을 추가로 포함한다.
다른 실시형태에서, 콜로니를 조사하여, 콜로니의 미생물을 검출, 특성화 및/또는 동정하기 위하여 사용될 수 있는 측정치를 생성할 수 있다(예를 들어, 콜로니는 분광법을 사용하여 조사할 수 있다). 콜로니의 측정치(예를 들어, 스펙트럼)를 알려져 있는 미생물에서 취한 유사한 측정치(예를 들어, 스펙트럼(들))와 비교함으로써, 미생물을 특성화하고/하거나 동정할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 콜로니를 비침습적으로(예를 들어, 밀봉된 플레이트 내에서) 조사할 수 있다. 추가의 핸들링 없이, 콜로니 내에 함유된 미생물을 직접적으로(예를 들어, 밀봉된 플레이트 내에서) 특정화하고/하거나 동정하는 능력은 미생물 동정의 안전성을 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서, 분광 조사는 미생물의 내재적 특성(예를 들어, 내재적 형광)을 기준으로 한다. 다른 실시형태에서, 분광 조사는 부분적으로 본 발명의 방법 중에 첨가되는, 특정 미생물 또는 미생물 그룹과 상호작용하는 추가의 제제로부터 수득되는 신호를 기준으로 한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 콜로니를 회수하고, 콜로니를 재현탁화시키고, 추가의 동정 및/또는 특성화 시험(예를 들어, 약물 내성, 독성 인자, 안티바이오그램(antibiogram))을 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 본 명세서의 도면 및 하기 기재된 상세한 설명에서 더 상세히 설명된다.
도 1a 내지 1d는 막이 없는 접종되지 않은 혈액 아가(agar) 플레이트(BAP)(a), 또는 배지의 표면에 놓인 Pall 메트리셀(Metricel) 블랙 격자형 폴리에테르설폰 막(Pall)(b), 와트만(Whatman) 블랙 혼합형 에스테르 막(WME)(c) 또는 와트만 트랙-에치형(track-etched) 폴리카보네이트 블랙 막(WPC)(d)이 있는 BAP로부터의 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2a 내지 2c는 EC3(a) 및 SA1(b)로부터 수득된 BAP 위의 WME 막 상의 콜로니로부터의 스펙트럼, 및 SA1 스펙트럼에서 EC3 스펙트럼을 감산한 결과(c)를 나타낸 것이다.
도 3a 내지 3d는 EC1(a), SA1(b), EF1(c) 및 PA1(d)로부터 수득된, 막이 없는 BAP 상의 콜로니로부터의 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4f는 시행 F의 점-대-점 IF 검색 스캔의 3차원 플롯(plot)을 나타낸 것이며, 여기서, 높이는 형광 세기와 같다. 이 플롯은 6시간(a), 8시간(b), 10시간(c), 12시간(d), 16시간(e) 및 24시간(f)에서 취한 측정치를 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5b는 24시간 후의 시행 F로부터의 BAP의 접사(close-up) 이미지(a) 및 상응하는 콜로니 위치를 나타내는 12시간의 검색 스캔으로부터의 형광 세기의 등고선 플롯(contour plot)(b)을 나타낸 것이다.
본 발명은 상이한 형태로 구체화될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 실시형태로 제한되는 것으로 간주되어서는 안된다. 오히려, 이들 실시형태는 본 개시물이 충분하고 완전할 것이며, 본 발명의 범주를 당업자에게 완전히 전달하도록 제공된다. 예를 들어, 일 실시형태에 대하여 예시된 특징부는 다른 실시형태로 도입될 수 있으며, 특정 실시형태에 대하여 예시된 특징부는 그 실시예로부터 생략될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제시된 실시형태에 대한 다양한 변형 및 첨가가 본 발명으로부터 벗어남 없이, 본 개시물의 관점 내에서 당업자에게 명백할 것이다.
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 본 발명의 설명에 사용되는 용어는 오직 특정 실시형태를 기재하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
정의
본 명세서에서 사용되는 단수 표현은 1개 또는 1개 초과를 의미할 수 있다. 예를 들어, "하나의" 세포는 단일의 세포 또는 다수의 세포를 의미할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 관련하여 열거된 항목의 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐 아니라 대안("또는")으로 해석되는 경우, 조합의 부재를 지칭하고 포함한다.
게다가, 본 명세서에 사용되는 용어 "약"은 화합물 또는 제제의 양, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 지칭할 때 특정 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변이를 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "미생물"은 그램(Gram)-양성 또는 그램-음성 박테리아, 효모, 곰팡이(mold), 기생충 및 몰리큐트(mollicute)를 포함하나 이에 한정되지 않는, 실험실에서 증식 및 핸들링될 수 있는 일반적으로 단세포인 유기체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 그램-음성 박테리아의 비제한적인 예에는 하기의 속의 박테리아가 포함된다: 슈도모나스(Pseudomonas), 에스케리키아(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 엔테로박터(Enterobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 세라티아(Serratia), 프로테우스(Proteus), 캄필로박터(Campylobacter), 해모필러스(Haemophilus), 모르가넬라(Morganella), 비브리오(Vibrio), 예르시니아(Yersinia), 액시네토박터(Acinetobacter), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 브레분디모나스(Brevundimonas), 랄스토니아(Ralstonia), 아크로모박터(Achromobacter), 푸소박테리움(Fusobacterium), 프레보텔라(Prevotella), 브란하멜라(Branhamella), 네이세리아(Neisseria), 부르크홀데리아(Burkholderia), 시트로박터(Citrobacter), 하프니아(Hafnia), 에드워드시엘라(Edwardsiella), 에로모나스(Aeromonas), 모락셀라(Moraxella), 브루셀라(Brucella), 파스테우렐라(Pasteurella), 프로비덴시아(Providencia) 및 레지오넬라(Legionella). 본 발명의 그램-양성 박테리아의 비제한적인 예에는 하기 속의 박테리아가 포함된다: 엔테로코커스(Enterococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 바실러스(Bacillus), 페니바실러스(Paenibacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 리스테리아(Listeria), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus), 프로피오니박테리움(Propionibacte ? um), 클로스트리듐(Clostridium), 박테로이데스(Bacteroides), 가드네렐라(Gardnerella), 코쿠리아(Kocuria), 락토코커스(Lactococcus), 루코노스톡(Leuconostoc), 마이크로코커스(Micrococcus), 마이코박테리아(Mycobacteria) 및 코리네박테리아(Corynebacteria). 본 발명의 효모 및 곰팡이의 비제한적인 예에는 하기 속의 효모 및 곰팡이가 포함된다: 칸디다(Candida), 크립토코커스(Cryptococcus), 노카르디아(Nocardia), 페니실리움(Penicillium), 알테르나리아(Alternaria), 로도토룰라(Rhodotorula), 아스퍼질러스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 사카로미세스(Saccharomyces) 및 트리코스포론(Trichosporon). 본 발명의 기생충의 비제한적인 예에는 하기 속의 기생충이 포함된다: 트리파노소마(Trypanosoma), 바베시아(Babesia), 레이시마니아(Leishmania), 플라스모듐(Plasmodium), 부케리아(Wucheria), 브루기아(Brugia), 온코세카(Onchocerca) 및 네글레리아(Naegleria). 본 발명의 몰리큐트의 비제한적인 예에는 하기 속의 몰리큐트가 포함된다: 마이코플라즈마(Mycoplasma) 및 유레아플라즈마(Ureaplasma).
본 명세서에서 사용되는 용어 "콜로니" 및 "마이크로콜로니(microcolony)"는 서로 근접하게 있으며, 표면상에 있고, 동소 복제에 의한 단일의 선조 미생물의 클론 자손인 미생물의 집단 또는 다양성을 지칭한다. 일반적으로, "콜로니"는 인간 육안에 보이며, 전형적으로 직경이 약 50 ㎛, 60 ㎛, 80 ㎛, 또는 100 ㎛ 초과이다. 그러나, 본 명세서에 사용되는 용어 "콜로니"는 다르게 기재되지 않는 한, 직경이 50 ㎛ 이상인 콜로니 및 직경이 50 ㎛ 이하인 "마이크로콜로니" 둘 모두를 포함하는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 "마이크로콜로니" 내의 미생물의 스캐닝, 검출, 특성화 및/또는 동정에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "마이크로콜로니"는 약 2 ㎛ 내지 약 50 ㎛ 또는 약 10 ㎛ 내지 약 50 ㎛ 범위일 수 있다. "마이크로콜로니"는 일반적으로 너무 작아서 육안에 보이지 않는다(예를 들어, 직경이 약 50 ㎛ 미만).
본 명세서에 사용되는 용어 "스캔" 또는 "스캐닝"은 사전결정된 영역을 체계적인 또는 사전결정된 패턴으로 또는 무작위적으로 검색하여, 대상체(예를 들어, 미생물 콜로니)의 무언가의 위치를 확인하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 미생물 콜로니를 검출하거나, 위치를 확인하거나, 다르게는 탐지하기 위하여, 체계적인 또는 사전결정된 패턴으로 또는 무작위적으로 표면에 걸쳐 광의 집속된 빔(focused beam)을 이동시킴으로써, 고체 또는 반고체 배지를 "스캔"할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 미생물 콜로니를 검출하거나, 위치를 확인하거나, 다르게는 탐지하기 위하여, 고체 또는 반고체 배지를 체계적인 또는 사전결정된 패턴으로 또는 무작위적으로 광 빔에 대해 이동시킬 수 있다. 이러한 실시형태에 따라, 광원은 전형적으로 빔 직경이 약 0.5 ㎜ 미만, 약 0.2 ㎜ 미만, 또는 0.1 ㎜ 미만이다. 다른 실시형태에서, 빔 직경은 약 5 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 또는 약 20 ㎛ 내지 약 80 ㎛이다.
일 실시형태에서, "스캐닝"은 고체 또는 반고체 배지의 점-대-점 "스캔"을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에 따라, 광원(예를 들어, 레이져 빔)은 존재할 수 있는 임의의 미생물 콜로니의 검출 및/또는 특성화를 위해 고체 또는 반고체 배지 상의 제1지점으로 이동하고, 스캐닝 또는 조사 단계를 수행할 수 있다. 대안적으로, 고체 또는 반고체 배지는 고체 또는 반고체 배지의 점-대-점 스캐닝이 행해지도록 광원에 대해 이동할 수 있다. 결과적으로, 배지 상의 제2지점을 스캔하고/하거나 조사할 수 있도록, 광원(예를 들어, 레이져 빔), 또는 고체 또는 반고체 배지가 이동할 수 있다. 이러한 점-대-점 스캐닝 과정은 주어진 검색 영역의 점-대-점 검색이 완료될 때까지 계속될 수 있다. 검색 영역은 고체 또는 반고체 배지(예를 들어, 배지 플레이트)의 전체 표면 또는 이의 서브셋(subset)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 선형 궤적을 따라(예를 들어, 배지를 가로지르는 직선을 따라) 한 지점에서 다른 지점으로 점-대-점 검색을 수행할 수 있다. 결과적으로, 광원 또는 배지를 제2직선으로 이동시키고, 제2직선의 선형 궤적을 따라 점-대-점 검색을 수행할 수 있다. 이러한 점-대-점 및 선-대-선 검색 패턴(또는 격자형 스캔)은 주어진 검색 영역이 완료될 때까지 계속될 수 있다. 검색 영역은 고체 또는 반고체 배지(예를 들어, 배지 플레이트)의 전체 표면 또는 이의 서브셋일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 스캔은 연속 스캐닝(즉, 연속 점-대-점 스캐닝)일 수 있다.
본 발명은 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출, 모니터링, 특성화 및/또는 동정 방법을 제공한다. 신속한 방법은 종래 기술보다 더 빠른 미생물의 검출, 특성화 및/또는 동정을 가능하게 하여, 오염된 물질(예를 들어, 식료품, 상수도 및 약제)의 더 빠른 진단(예를 들어, 감염되었거나 감염된 것으로 의심되는 대상체에서), 특성화 및/또는 동정을 초래한다. 본 발명의 방법에 수반되는 단계는 샘플을 수득하는 단계로부터 미생물의 특성화/동정까지 단기간에 수행되어, 임상적으로 유의미한 실행가능한 정보를 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 약 72시간 미만, 예를 들어, 약 18, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1시간 미만으로 수행할 수 있다. 특정 실시형태에서, 동정 단계는 60분 미만, 예를 들어, 약 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1분 미만으로 수행할 수 있다. 상기 방법을 사용하여, 본 명세서에 기재된 임의의 미생물을 특성화하고/하거나 동정할 수 있다. 일 실시형태에서, 미생물은 박테리아이다. 다른 실시형태에서, 미생물은 효모이다. 또 다른 실시형태에서, 미생물은 곰팡이이다. 상기 방법은 다수의 종류의 미생물, 예를 들어, 상이한 종, 속, 과, 목, 강, 문 및/또는 계의 미생물을 검출, 모니터링, 특성화 및/또는 동정하기 위해 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 샘플, 예를 들어, 혼합된 배양물 내에 존재하는 상이한 유형의 미생물의 일부 또는 전부의 특성화 및/또는 동정을 가능하게 한다. 다른 실시형태에서, 상기 방법은 둘 이상의 상이한 유형의 박테리아, 둘 이상의 상이한 유형의 효모, 둘 이상의 상이한 유형의 곰팡이, 또는 둘 이상의 상이한 유형의 박테리아, 효모 및/또는 곰팡이의 혼합물을 특성화하고/하거나 동정하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 유형의 미생물 각각의 검출은 동시에 또는 거의 동시에 발생할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법을 부분적으로 또는 완전히 자동화하여, 감염성 물질의 핸들링 위험 및/또는 샘플의 오염 위험을 줄일 수 있다.
본 발명의 제1면은
(a) 배지 상의 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 콜로니 내의 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
(b) 생성된 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 특성화하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 특성화 및/또는 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 면은
(a) 하나 이상의 미생물 콜로니를 함유하는 것으로 알려져 있거나, 이를 함유할 수 있는 배지를 스캐닝하여, 배지 상에 존재하는 상기 콜로니의 위치를 확인하는 단계;
(b) 단계 (a) 중에 위치가 확인된 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 콜로니 내의 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
(c) 생성된 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 특성화하고/하거나 동정하는 단계를 포함하는, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출, 특성화 및/또는 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 면은
(a) 샘플 내에 존재하는 미생물을 고체 또는 반고체 배지 상에 성장시켜, 적어도 하나의 콜로니를 생성하는 단계;
(b) 배지 상의 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
(c) 생성된 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 특성화 및/또는 동정하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 미생물의 특성화 및/또는 동정 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 면은
(a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 샘플을 수득하는 단계;
(b) 샘플 내에 존재하는 미생물을 고체 또는 반고체 배지 상에서 성장시키는 단계; 및
(c) 배지를 스캐닝함으로써 배지 상에 존재하는 임의의 콜로니의 위치를 확인하여, 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 미생물의 존재의 검출 방법에 관한 것이며, 여기서, 생성된 측정치에 의해 위치가 확인된 하나 이상의 콜로니의 존재는 미생물이 샘플 내에 존재하는 것을 나타낸다.
본 발명의 방법으로 시험할 수 있는 샘플에는 미생물 존재 및/또는 성장이 알려져 있거나 의심되는 임상 및 비임상 샘플뿐 아니라 미생물의 존재에 대하여 통상적으로 또는 때때로 시험하는 물질의 샘플이 포함된다. 사용되는 샘플의 양은 방법의 다능성 및/또는 감수성에 기인하여 크게 달라질 수 있다. 샘플 제조는 해당 분야의 숙련자에게 공지된 많은 기술에 의해 수행될 수 있다.
시험할 수 있는 임상 샘플에는 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 분획, 관절액, 소변, 정액, 타액, 대변, 뇌척수액, 위 내용물, 질 분비물, 조직 균질액, 골수 천자액, 골 균질액, 가래, 흡인물, 면봉(들) 헹굼액(swabs and swab rinsate), 다른 체액 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 전형적으로 임상 및/또는 연구 실험실에서 시험되는 임의의 종류의 샘플이 포함된다.
본 발명은 연구뿐 아니라 수의학 및 의학 응용에 사용된다. 임상 샘플을 수득할 수 있는 적합한 대상체는 일반적으로 포유동물 대상체이나, 임의의 동물일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "포유동물"에는 인간, 비-인간 영장류, 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 토끼, 설치류(예를 들어, 랫트 또는 마우스) 등이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 인간 대상체에는 신생아, 유아, 소아, 성인 및 노인 대상체가 포함된다. 샘플을 수득할 수 있는 대상체에는 비제한적으로 포유동물, 조류, 파충류, 양서류 및 조류가 포함된다.
시험할 수 있는 비-임상적 샘플에는 식료품, 음료, 약제, 화장품, 물(예를 들어, 식수, 비-음용수 및 폐수), 해수 밸러스트(seawater ballast), 공기, 토양, 하수, 식물 물질(예를 들어, 종자, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 과실), 혈액 생성물(예를 들어, 혈소판, 혈청, 혈장, 백혈구 분획 등), 공여자 기관 또는 조직 샘플, 생물전쟁 샘플 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 물질이 포함된다. 상기 방법은 또한 산업적 세팅에서 오염 수준, 공정 제어, 품질 제어 등을 모니터링하기 위한 실시간 시험에 특히 매우 적합하다.
샘플의 부피는 배지 상에 플레이팅할 때 하나 이상의 콜로니를 생성하도록 충분히 커야한다. 적절한 부피는 샘플의 공급원 및 샘플 내의 미생물의 예상 수준에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 감염된 상처로부터의 임상 면봉은 오염에 대해 시험해야할 식수 샘플보다 더 높은 부피당 미생물의 수준을 함유하여, 식수 샘플에 비해 더 적은 부피의 면봉 물질이 필요할 것이다. 일반적으로, 샘플 크기는 적어도 약 50 ㎖ 이상, 예를 들어, 100 ㎖, 500 ㎖, 1000 ㎖ 이상일 수 있다. 다른 실시형태에서, 샘플은 약 50 ㎖ 미만, 예를 들어, 약 40 ㎖, 30 ㎖, 20 ㎖, 15 ㎖, 10 ㎖, 5 ㎖, 4 ㎖, 3 ㎖, 또는 2 ㎖ 미만일 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플 크기는 약 1 ㎖ 이하, 예를 들어, 약 750 ㎕, 500 ㎕, 250 ㎕, 100 ㎕, 50 ㎕, 25 ㎕, 10 ㎕, 5 ㎕, 1 ㎕, 0.5 ㎕, 0.1 ㎕ 이하일 수 있다. 샘플 크기가 큰 실시형태에서, 샘플을 해당 분야에 잘 알려져 있는 방법(예를 들어, 원심분리, 증발 등)을 통해 여과(예를 들어, 필터 막을 통해) 및/또는 농축시켜, 샘플 내의 임의의 미생물의 부피를 줄이고/거나 미생물을 수집할 수 있다. 필터 막 상에 수집된 미생물을 재현탁화시키고, 고체 또는 반고체 배지 상에 두거나, 필터 막을 반고체 배지 상에 직접 둘 수 있다.
시험할 샘플을 적합한 배지 상에 두고, 미생물의 성장을 조장하는 조건 하에서 인큐베이션한다. 샘플 내에 있는 것으로 알려져 있거나 샘플 내에 있는 것으로 의심되는 미생물의 종류(들)를 기준으로 배지를 선택할 수 있다. 상이한 미생물에 적절한 배양 배지는 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 성장 배지는 적절한 영양분을 제공하고 미생물의 이동을 제한하는(즉 국소화된 성장을 제공하는) 임의의 배지일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 배지는 반고체 배지, 이를 테면 아가, 젤라틴, 알기네이트, 카라기난 또는 펙틴일 수 있다. 적합한 배지에는 비제한적으로 범용 배지, 선택적 배지, 분별 배지 및/또는 발색 배지를 포함하는, 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 상이한 기능을 갖는 배지가 포함된다. 배지는 유의미한 측정치(예를 들어, IF 측정치)가 수득될 수 있도록 선택되고/되거나 조정될 수 있다. 적합한 반고체 배지의 예에는 비제한적으로 A C 아가, 아세토박터 아가, 아크리플라빈-세프타지딤 아가, 액티노마이세스(Actinomyces) 아가, 액티노마이세트(Actinomycete) 분리 아가, 에로모나스(Aeromonas) 분리 아가, 무산소 아가, 무산소 혈액 아가, 무산소 TVLS 아가, APT 아가, 애쉬비즈(Ashby's) 만니톨 아가, 아스퍼질러스 분별 아가, ASS 아가, 아우레우스(Aureus) 아가, 아지드 혈액 아가, B.T.B. 락토오스 아가, 바실러스(Bacillus) 아가, 베어드 파커(Baird Parker) 아가, 비기(BiGGY) 아가, 담즙산 에스큘린(Bile esculin) 아가, 담즙산 에스큘린 아지드 아가, 담즙산 염 브릴리언트 그린(brilliant green) 전분 아가, 비스무스 설피트 아가, 혈액 아가, 혈액 아가 SLMB, BPL 아가, 뇌심장 침출액(Brain heart infusion) 아가, 브류어(Brewer) 아가, 브릴리언트 그린 아가, 브릴리언트 그린 담즙산 아가, 브릴리언트 그린 페놀 레드 락토오스 수크로오스 아가, 브로락신(BROLACIN) 아가, 브로락신 머그(MUG) 아가, 브루셀라(Brucella) 아가, BSM 아가, 완충된 챠콜(charcoal) 효모 추출물 아가, 칼슘 카세이네이트 아가, 캄필로박터 선택 아가, 칸디다 이덴트(Candida ident) 아가, 카세인 효모 마그네슘 아가, CASO 아가, CATC 아가, 세레우스(Cereus) 선택 아가, 세트리미드 아가, 샤프만 스톤(Chapman Stone) 아가, 차이나 블루(China blue) 락토오스 아가, 후막포자(Chlamydospore) 아가, 크리스텐젠(Christensen) 시트레이트 아가, 크리스텐젠즈 우레아 아가, 시트레이트 아가, CLED 아가, 클로스트리듐(Clostridium) 아가, 클로스트리듐 디피실리(difficile) 아가, 콜라이형(Coliform) 아가, 컬럼비아(Columbia) 아가, 컬럼비아 혈액 아가, 콘 밀 아가, 콘 밀 펩톤 효모 아가, CPC-아가, 크램프(Cramp) 아가, 자펙 독스(Czapek dox) 아가, D.T.M. 아가, 다비스(Davis) 최소(Minimal) 아가, DCLS 아가, 데옥시콜레이트 시트레이트 아가, 데옥시리보뉴클레아제 시험 아가, DEV ENDO 아가, DEV 젤라틴 아가, DEV 영양분 아가, 덱스트로스 카세인펩톤 아가, 덱스트로스 전분 아가, DHL 아가, 다이클로란 로즈 벵골(Dichloran rose bengal) 아가, 디프테리아 독성 아가, 톨루이딘을 사용한 DNase 시험 아가, 이. 콜라이(E. coli) 아가, 이. 콜라이(E. coli) O157:H7 머그 아가, ECC 아가, ECC 선택 아가, ECD 아가, ECD 머그 아가, EMB 아가, 엔도(Endo) 아가, 엔테로박터 사카자키(sakazakii) 아가, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium) 아가, 엔테로코커스 선택 아가, 에스큘린 철 아가, 유고닉(Eugonic) 아가, 진균류 아가, 펀고바이오틱(Fungobiotic) 아가, 개스너(Gassner) 아가, 개스너 락토오스 아가, 젤라틴 철 배지, 젤라틴 염 아가, 점 카운트(Germ count) 아가, 글루코오스 브롬크레솔(bromcresol) 퍼플(purple) 아가, GSP 아가, 헥토엔(Hektoen) 장용(enteric) 아가, 카나마이신 에스큘린 아지드 아가, 카말리(Karmali) 캄필로박터 아가, KF-스트렙토코커스 아가, 킹(King) 아가, 클레브시엘라 선택 아가, 클리글러(Kligler) 아가, KRANEP 아가, 쿤드라트(Kundrat) 아가, 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus) 아가, 락토오스 TTC 아가, LB 아가, 레이프손(Leifson) 아가, 레빈(Levine) EMB 아가, 리스테리아(Listeria) 아가, 리스테리아 모노 확인(confirmatory) 아가, 리스테리아 모노 분별 아가, 리스테리아 선택 아가, 리트머스(Litmus) 락토오스 아가, LL 아가, LPM 아가, LS 분별 아가, L-탑(top) 아가, 루리아(Luria) 아가, 라이신 아르기닌 철 아가, 라이신 철 아가, M 엔테로코커스 아가, M-17 아가, 맥콘키(MacConkey) 아가, 크리스탈 바이올렛(crystal violet), 염화나트륨 및 0.15% 담즙산염이 있는 맥콘키 아가, 맥콘키 머그 아가, 맥콘키-소르비톨 아가, 말트 아가, 말트 추출물 아가, 만니톨 염 페놀 레드 아가, 맥브라이드(McBride) 아가, 맥클렁 토아베(McClung Toabe) 아가, M-CP 아가, 미트 리버(Meat liver) 아가, 막 필터 엔테로코커스 선택 아가, 막 락토오스 글루쿠로니드 아가, M-엔도 아가, M-엔도 아가 LES, MeReSa 아가, M-FC 아가, 미들브룩(Middlebrook) 7H10 아가, 미들브룩 7H11 아가, 밀크(Milk) 아가, 미티스 살리바리어스(Mitis salivarius) 아가, MM 아가, 변형 완충된 챠콜 아가, MOX 아가, MRS 아가, MS.O157 아가, M-TEC 아가, 뮬러 힌튼(Mueller Hinton) 아가, 머그 트립톤 소야(soya) 아가, 마이코플라즈마(Mycoplasma) 아가, 노블(Noble) 아가, 영양분 아가, 영양분 젤라틴, OF 시험 영양분 아가, OGY 아가, OGYE 아가, 오렌지(Orange) 혈청 아가, 옥스포드(Oxford) 아가, PALCAM 리스테리아 선택 아가, 펜타클로로(Pentachloro) 로즈 벵갈 효모 추출물 아가, 펩톤 효모 추출물 아가, 펩톤화 밀크(milk) 아가, 퍼프리젠스(Perfringens) 아가, 페놀 레드 덱스트로스 아가, 페놀 레드 락토오스 아가, 페놀 레드 말토오스 아가, 페놀 레드 수크로오스 아가, 페놀 레드 타르트레이트 아가, 페놀프탈레인 포스페이트 아가, 페닐알라닌 아가, 플레이트 카운트 아가, 플레이트 카운트 머그 아가, PLET 아가, PM 인디케이터(indicator) 아가, 감자 덱스트로스 아가, 감자 글루코오스 로즈 벵갈 아가, 감자 글루코오스 수크로오스 아가, 프릴(Pril)® 만니톨 아가, 슈도모나스 아가, R-2A 아가, 라카-레이(Raka-Ray) 아가, 래피드(Rapid) 엔테로콕시(enterococci) 아가, 보강 클로스트리얼(Reinforced clostridial) 아가, 쌀 추출물 아가, 로고사(Rogosa) 아가, 로고사 SL 아가, 로즈 벵갈 아가, 로즈 벵갈 클로람페니콜 아가, S.F.P. 아가, 사부로(Sabouraud) 2% 글루코오스 아가, 사브로 4% 글루코오스 아가, 사브로 덱스트로스 아가, 클로람페니콜이 있는 사브로 글루코오스 아가, 살모넬라 아가, 오에노즈(Oenoz)에 따른 살모넬라 아가, 살모넬라 크로모젠(chromogen) 아가, SD 아가, 셀렉트(Select) 아가, 병원성 진균류에 대한 선택 아가, SFP 아가, S-Gal®/LB 아가, 샤프톤(Shapton) 아가, 시몬스(Simmons) 시트레이트 아가, 스킴(Skim) 밀크 아가, 소르브산 아가, 스피리트 블루(Spirit blue) 아가, SPS 아가, SS-아가, 표준 영양분 아가 1호, 스타필로코커스 아가, 스트렙토코커스 선택 아가, 스트렙토코커스 써모필러스(thermophilus) 분리 아가, 설페이트 API 아가, 설피트 철 아가, TBX 아가, TCBS 아가, TCMG 아가, 테르기톨(Tergitol)®-7 아가, 테이어 마틴(Thayer Martin) 아가, 써모아시듀란스(Thermoacidurans) 아가, 틴스데일(Tinsdale) 아가, 토마토 쥬스 아가, 트리부티린(Tributyrin) 아가, 트리플 슈가(Triple sugar) 철 아가, 트립틱 소야 아가, 트립톤 아가, 트립톤 글루코오스 추출물 아가, 트립톤 글루코오스 효모 추출물 아가, 트립톤 소야 효모 추출물 아가, 트립톤 효모 추출물 아가, 트립토스 아가, TSC 아가, TSN 아가, 유니버셜(Universal) 비어(beer) 아가, UTI 아가, 비브리오(Vibrio) 아가, 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahemolyticus) 수크로오스 아가, 바이올렛 레드 담즙산 아가, 바이올렛 레드 담즙산 글루코오스 아가, 바이올렛 레드 담즙산 락토오스 아가, 바이올렛 레드 담즙산 락토오스 덱스트로스 아가, 비타민 B12 배양 아가, 보겔-존슨(Vogel-Johnson) 아가, VRB 머그 아가, 윌킨스 샬그렌(Wilkins Chalgren) 무산소 아가, 윌슨 블레어(Wilson Blair) 아가, WL 분별 아가, WL 영양분 아가, 보트(Wort) 아가, XLD 아가, XLT4 아가, 효모 아가, 효모 추출물 아가, 효모 말트 아가, 효모 만니톨 아가, 예르시니아 분리 아가, 에르시니아 선택 아가, YGC 아가, YPAD 아가, YPDG 아가, YPG 아가 및 YT 아가가 포함된다. 일 실시형태에서, 고체 또는 반고체 배지는 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물 콜로니의 내재적 형광(IF) 측정치를 증진시키거나 다르게는 증가시키는 하나 이상의 부가적 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 내재적 형광을 증가시키는 적합한 첨가제는 하나 이상의 단백질 가수분해물, 아미노산, 고기 및 야채 추출물, 탄수화물 공급원, 완충제, 소생 제제(resuscitating agent), 성장 인자, 효소 보조인자, 무기염, 금속 보충물(metal supplement), 환원 화합물, 킬레이트제, 감광제(photosensitizing agent), 퀀칭제(quenching agent), 환원제, 산화제, 세제, 계면활성제, 소독제, 선택 제제(selective agent), 대사 억제제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 배지는 예를 들어, 반고체 배지의 상부에 놓여지는 필터(예를 들어, 필터 막 또는 유리 섬유 필터)일 수 있다. 다른 실시형태에서, 필터는 액체 배지에 노출(예를 들어, 그 안에 침지)된 적이 있는 물질(예를 들어, 흡수 패드) 위에 놓여진다. 일부 실시형태에서, 샘플(예를 들어, 대용량 샘플)을 필터를 통해 통과시켜, 샘플 내에 존재하는 임의의 미생물을 수집할 수 있다. 그 다음, 필터를 성장 배지의 상부에 두고, 미생물 성장에 적절한 조건 하에서 인큐베이션할 수 있다. 적합한 필터 막은 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 미생물을 수집하기에 적합하고/하거나 미생물 성장을 지지할 수 있는 임의의 막을 포함한다. 막 재료의 예에는 비제한적으로, 셀룰로오스, 혼합형 셀룰로오스 에스테르, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐클로라이드, 나일론, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리카보네이트 블랙 및 블랙 혼합형 에스테르와 이들의 임의의 조합이 포함된다. 필터는 액체를 여과하고/하거나 미생물을 수집하기에 적합한 기공 크기, 예를 들어, 효모에 대하여 약 1 내지 약 25 ㎛ 및 박테리아에 대하여 약 0.05 ㎛ 내지 약 2 ㎛, 예를 들어, 약 0.2 ㎛ 내지 약 1 ㎛의 기공 크기를 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 배지는 플레이트, 예를 들어, 표준 미생물 아가 플레이트 내에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 플레이트는 다수의 샘플의 시험을 위하여 예를 들어, 플레이트당 2, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 64, 96, 128개 또는 그 이상의 웰을 갖는 멀티웰(multiwell) 플레이트일 수 있다. 플레이트는 미생물을 성장시키기 위한 임의의 적합한 재료, 예를 들어, 폴리스티렌 또는 유리로 만들어질 수 있다. 플레이트는 임의로 덮개(lid)를 갖는다. 덮개가 제자리에 있는 동안 콜로니의 조사가 발생하는 경우, 덮개 및/또는 플레이트는 자외선, 가시광선 및/또는 근적외선 스펙트럼의 적어도 일부분에 투과성이어서, 덮개 및/또는 플레이트를 통한 조사를 가능하게 하는 적어도 하나의 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서, "샘플에 존재하는 미생물을 고체 또는 반고체 배지 상에서 성장시키는 것" 및 "샘플을 배지 상에 둔다"라는 어구는 샘플 내에 존재하는 미생물이 성장하고 콜로니를 생성할 수 있도록 샘플을 배지와 접촉시키는 임의의 방식을 포함한다. 특정 실시형태에서, 샘플을 고체 또는 반고체 배지의 표면상에 둔다. 다른 실시형태에서, 샘플을 액체 상태의 배지와 혼합한 다음, 고형화되게 하여(예를 들어, 플레이트에 부어서), 성장하는 임의의 콜로니가 배지 내에 매립되게 할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 샘플을 탈수된 배지와 혼합하여, 배지가 재수화된 다음 고형화되게 할 수 있다.
일 실시형태에서, 고체 또는 반고체 배지는 배지 위의 액체 내에 현탁화된 미생물을 함유하는 용기의 바닥에 있다. 그 다음, 용기를 조작하여(예를 들어, 원심분리하여), 미생물을 배지 상에 배치할 수 있다. 그 다음, 액체를 제거하고, 콜로니 성장을 위해 배지를 인큐베이션시킬 수 있다. 예를 들어, 혈액 샘플을 액체 성장 배지, 및 바닥에 고체 또는 반고체 배지를 함유하는 혈액 배양 튜브 내로 도입할 수 있다. 그 다음, 배양 튜브를 원심분리하여, 미생물을 고체 또는 반고체 배지 상에 배치하고(임의로, 적혈구가 용해된 후에), 액체를 제거하고, 본 발명의 방법에 따라 미생물을 성장시키고, 검출하고/하거나 동정한다.
일단 샘플이 배지 상에 배치되면(예를 들어, 표준 미생물 기법을 사용하여 액체 샘플을 배지 상에 스프레딩(spreading)시킴으로써 및/또는 필터 막을 반고체 배지 상에 둠으로써), 배지를 샘플 내에 존재하는 미생물의 성장에 적합한 조건 하에서 인큐베이션한다. 적절한 조건은 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 미생물 및 배지에 좌우될 것이다. 배지를 약 20 ℃ 내지 약 50 ℃, 예를 들어, 약 25 ℃ 내지 약 45 ℃, 예를 들어, 약 37 ℃의 온도에서 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 시간은 검출가능한 콜로니가 (가시적으로 또는 분광법으로)나타나기에 충분하며, 미생물(들), 온도, 배지, 영양분의 수준 및 성장 속도를 결정하는 다른 조건에 좌우될 것이다. 일부 실시형태에서, 인큐베이션 시간은 약 12 시간 이하, 예를 들어, 약 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1시간 이하일 수 있다. 특정 실시형태에서, 이를 테면 천천히 성장하는 조건 하에서 또는 천천히 성장하는 미생물(예를 들어, 마이코박테리아)과 함께, 인큐베이션 시간은 약 12시간 이상, 예를 들어, 약 18, 24, 36, 48, 또는 72시간 이상일 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지를 인큐베이터에서 인큐베이션하고, 배지를 인큐베이터로부터 1회 이상 제거하고, 배지 상에서 성장하는 임의의 콜로니를 검출하고/하거나 동정하기 위한 장치 내에 배치한다. 다른 실시형태에서, 배지를 콜로니를 검출하고/하거나 동정하는데 사용되는 장치 내에서, 예를 들어, 온도-제어 플레이트 홀더(holder) 내에서 직접 인큐베이션시킬 수 있다.
일 면에서, 본 발명은 콜로니를 생성하는 미생물을 동정하는 IF 측정치를 생성하기 위한, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 콜로니의 조사에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 조사는 형광 분광법에 의한다. 조사는 비침습적인 방식으로 발생할 수 있으며, 즉, 콜로니를 배지 상에 그대로 유지하면서 콜로니를 조사할 수 있다. 다른 실시형태에서, 배지 및 콜로니를 함유하는 플레이트를 조사 내내 밀봉 유지한다(예를 들어, 덮개를 제거하지 않는다). 이러한 실시형태에 따라, 플레이트 또는 이의 부분은 광(예를 들어, 근적외선(NIR; 700 nm-1400 nm), 자외선(UV; 190 nm-400 nm) 및/또는 가시광선(VIS; 400 nm-700 nm) 광 스펙트럼 중 적어도 한 부분)에 투과성인 임의의 재료로 구성될 수 있다. 적합한 재료의 예에는 아크릴릭, 메타크릴레이트, 석영, 용융 실리카, 사파이어, 사이클릭 올레핀 공중합체(COC) 및/또는 사이클로 올레핀 중합체(COP)(예를 들어, 제오넥스(Zeonex)®(Zeonex®, San Diego, CA))가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 플레이트를 동정 과정 내내 밀봉되게 유지하는 것뿐 아니라 절차 중 일부 또는 모두를 자동화하는 것과 임의로 결합되는 비-침습적인 방식으로 미생물을 검출하고/하거나 동정하는 능력은 감염성 및/또는 유해성이거나 감염성 및/또는 유해성일 수 있는 미생물의 핸들링 위험을 줄일 뿐 아니라, 샘플의 오염 위험도 줄인다. 또한, 펠렛의 추가의 처리(예를 들어, 현탁화, 재플레이팅(replating) 및/또는 다른 동정 분석) 없이, 직접적인 조사에 의하여 미생물을 동정하는 능력은 동정이 이루어질 수 있는 속도를 상당히 증가시킨다. 다른 실시형태에서, 콜로니를 조사 전에, 용액에 현탁화시키며, 임의로 배지로부터 제거한다. 또 다른 실시형태에서, 콜로니를 동소에서의 조사 후에, 용액에 현탁화시킨 다음, 추가의 조사를 수행한다. 예를 들어, 단리된 미생물에 적용할 수 있으나 배지 상의 미생물의 콜로니에는 적용할 수 없는 라텍스 응집(latex agglutination) 시험 또는 자동화된 표현형 동정 시험과 같은 기법을 재현탁화된 미생물 상에서 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 분광법을 사용하여, 미생물의 내재적 형광 특성, 예를 들어, 스테인(stain), 염료, 결합제 등과 같은 추가의 제제의 부재 하에서 미생물에 존재하는 특성을 분석할 수 있다. 다른 실시형태에서, IF를 분석하는 것 외에, 분광법을 사용하여, 미생물(들)의 하나 이상의 외인적 특성, 예를 들어, 추가의 제제의 도움으로만 검출할 수 있는 특성을 분석할 수도 있다. 분광학적 조사는 미생물의 하나 이상의 내재적 또는 외인적 특성을 검출하고/하거나 동정하기에 유효한 것으로 해당 분야의 숙련자에게 알려져 있는 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 전면(front-face) 형광(여기서, 여기 광 및 방출된 광이 동일한 광학 표면으로 유입되고 이를 떠나며, 만일 샘플이 일반적으로 광학적으로 두껍다면, 여기 광은 샘플 내로 매우 짧은 거리를 투과한다)(참조예: 문헌[Eisinger, J., and J. Flores, "Front-face fluorometry of liquid samples," Anal. Biochem. 94:15 (1983)])을 펠렛 내의 미생물의 동정을 위해 사용할 수 있다. 또한, 다른 형태의 측정, 예를 들어 표면형광(epifluorescence), 반사율, 흡광도 및/또는 산란 측정을 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명의 일 면에서, 렌즈 시스템 또는 현미경 셋 업(set up)과 같은 집속 소자를 사용하여 분광법을 수행하여, 분광광도계에 기능적으로 연결된 자외선, 가시광선 및 적외선 범위 내의 관찰을 가능하게 한다 (예를 들어, 광섬유 이용). 일 실시형태에서, 배지(예를 들어, 플레이트 내의)를 현미경 스테이지(stage) 위에 두고, 여기서, 이를 여기원에 의해 조사할 뿐 아니라 가시적으로 관찰할 수 있다(예를 들어, 현미경을 통해). 일 실시형태에서, 플레이트를 수동으로 조작하여, 플레이트 그 자체를 이동시키거나, 플레이트가 부착된 현미경 스테이지를 이동시킴으로써, 조사를 위해 콜로니의 위치를 확인할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 현미경 스테이지는 자동 제어되어(예를 들어, 동력화된 스테이지), 스테이지에 부착된 플레이트를 스캐닝할 수 있다(예를 들어, 스캐닝할 전체 섹션을 커버하도록 설계된 세트 패턴으로). 또 다른 실시형태에서, 레이져와 같은 집광 빔이 배지를 가로질러 스캐닝하고, 방출된 광이 영상(imaging) 또는 비-영상 검출기에 의해 검출되는 동안 배지를 움직이지 않게 유지한다. 추가의 실시형태에서, 현미경은 온도 제어부(예를 들어, 수조)가 있는 플레이트 인큐베이터를 포함하여, 배지의 인큐베이션 중에 플레이트가 여전히 현미경 하에 유지되고, 조사할 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 일 면에서, 여기원은 IF 측정치를 생성하도록 단일 콜로니를 지향한다. 콜로니는 정확한 측정이 이루어질 만큼 충분히 크다면, 조사 시에 임의의 크기일 수 있다. 일 실시형태에서, 콜로니가 인간 육안에 의해 검출가능하지 않은 때, 콜로니를 조사할 수 있다. 예를 들어, 콜로니가 약 10,000개 미만의 미생물, 예를 들어, 약 5000, 1000, 500, 400, 300, 200, 또는 100개 미만의 미생물을 포함할 때, 콜로니를 조사할 수 있다. 다른 실시형태에서, 콜로니의 직경이 약 1000 ㎛ 미만이거나 콜로니의 가장 긴 치수(콜로니가 원형이 아니라면)의 길이가 약 1000 ㎛ 미만일 때 콜로니를 조사할 수 있다. 예를 들어, 콜로니가 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 또는 25 ㎛ 이하일 때 콜로니를 조사할 수 있다. 일 실시형태에서, 여기 빔은 조사할 콜로니보다 직경이 더 작아서, 전체 빔이 콜로니를 지향할 수 있고, 배지가 실질적으로 IF 측정을 간섭하지 않게 한다. 특정 실시형태에서, 여기 빔은 직경이 약 1000 ㎛ 미만, 예를 들어, 약 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 또는 25 ㎛ 미만이다. 여기 빔의 크기뿐 아니라, 방출 빔의 크기는 예를 들어, 핀홀(pinhole)의 사용으로 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 여기 빔은 콜로니의 중앙을 지향한다. 다른 실시형태에서, 여기 빔은 콜로니의 다른 부분(예를 들어, 가장자리 및/또는 가장자리 근처)을 지향하며, 여기서, 미생물은 콜로니의 중심에서의 것과 상이한 성장 및/또는 대사 상태에 있을 수 있다. 추가의 실시형태에서, 여기 빔은 예를 들어, 공초점 현미경을 사용하여, 콜로니 내의 특정 깊이를 지향할 수 있다.
콜로니 조명원 또는 여기원은 당업자에게 알려져 있는 많은 적합한 광원으로부터 선택될 수 있다. 사용가능한 데이터를 생성하는 전자기 스펙트럼의 임의의 부분을 사용할 수 있다. 자외선, 가시광선 및/또는 근적외선 스펙트럼뿐 아니라 전자기 스펙트럼의 다른 부분에서 방출할 수 있는 광원이 이용가능하며, 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 광원은 자외선 광의 생성을 위한 중수소 또는 제논 아크(arc) 램프 및/또는 가시광선/근적외선 여기의 생성을 위한 텅스텐 할로겐 램프와 같은 연속 램프일 수 있다. 이들 광원은 넓은 방출 범위를 제공하며, 특정 여기 파장에 대한 스펙트럼 대역폭은 해당 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 광학 간섭 필터, 프리즘 및/또는 광학 회절격자(grating)를 사용하여 감소시킬 수 있다.
대안적으로, 발광 다이오드 및/또는 레이져와 같은 다수의 협대역(narrowband) 광원을 공간적으로 다중화하여, 다중-파장 여기원을 제공할 수 있다. 예를 들어, 발광 다이오드는 190 nm 내지 900 nm를 초과하여 이용가능하며, 광원은 20-40 nm의 스펙트럼 대역폭을 갖는다(최대치의 절반에서의 전폭). 레이져는 자외선 내지 근적외선의 이산 파장에서 이용가능하며, 당업자에게 잘 알려져 있는 다중화 방법을 사용하여 채용할 수 있다.
광원 중 임의의 것의 스펙트럼 선택성은 스캐닝 모노크로마터(scanning monochromator)와 같은 스펙트럼 판별 수단을 사용하여 개선될 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 다른 판별 방법, 예를 들어, 음향-광학 조정 필터(acousto-optic tunable filter), 액정 조정 필터(liquid crystal tunable filter), 광학 간섭 필터의 어레이, 프리즘 분광사진 등 및 임의의 조합을 사용할 수 있다. 스펙트럼 판별기를 선택하는 것에서의 고려사항은 조정가능성(tunability)의 범위뿐 아니라 선택성의 수준을 감안한다. 예시의 방식으로, 예를 들어, 판별기는 10 nm의 선택성과 함께 300 - 800 nm의 파장 범위를 사용할 수 있다. 이들 파라미터는 일반적으로 조정가능성 범위뿐 아니라 선택성을 달성하는데 필요한 최적의 기술을 결정한다.
전형적으로, 광원은 샘플의 여기를 야기하고, 소정의 시간에, 또는 연속적으로 샘플로부터의 형광 방출의 측정으로 이어진다. 유사하게, 여기원과 샘플의 상호작용으로부터의 반사광을 측정하여, 검출 및/또는 특성화를 위한 타당한 데이터를 제공할 수 있다.
샘플로부터의 방출은 임의의 적절한 스펙트럼 판별 수단에 의해, 그리고 일부 실시형태에서는 분광기를 사용하여 측정할 수 있다. 분광기는 특정 방출 파장을 검출하는 스캐닝 모노크로마터일 수 있으며, 여기서 모노크로마터로부터의 출력이 광증배기 튜브에 의해 검출되고/되거나 분광기는 영상 분광사진으로 구성될 수 있으며, 여기서, 출력은 전하-결합 소자(CCD) 검출기 어레이와 같은 영상 검출기에 의해 검출된다. 일 실시형태에서, 분별기는 광검출 수단(이를 테면, 광증배기 튜브, 애벌란시 포토다이오드(avalanche photodiode), CCD 검출기 어레이 및/또는 전자 다중화 전하 결합 소자(EMCCD) 검출기 어레이)에 의한 형광 및/또는 산란 신호의 관찰을 가능하게 한다.
분광 기술을 사용하여 바람직하게는 여기-방출 매트릭스(EEM) 측정치로 제공되는 측정치가 수득된다. 본 명세서에서 사용되는 EEM은 여기 및 방출 파장 둘 모두의 함수로서 형광 물질의 발광 스펙트럼 방출 세기로 정의되며, 전체(full) 스펙트럼 또는 이의 서브셋을 포함하며, 여기서 서브셋은 단일의 또는 다중의 여기/방출 쌍을 포함할 수 있다. 또한, 고정된 여기 파장을 갖는 EEM의 단면을 사용하여 특정 여기 파장에 대한 방출 스펙트럼을 나타낼 수 있고, 고정된 방출 파장을 갖는 EEM의 단면을 사용하여 샘플에 대한 여기 스펙트럼을 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서, 1개 초과의 특정 여기-방출 파장 쌍, 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50개 또는 그 이상의 특정 여기-방출 파장 쌍에서 다중의 EEM을 측정한다. 특정 실시형태에서, 측정된 여기-방출 파장 쌍의 수, 예를 들어, 약 5 내지 약 30개 쌍, 예를 들어, 약 10 내지 약 20개 파장 쌍은 미생물의 정확한 종을 결정하기에 충분하다. 다른 실시형태에서, 측정된 여기-방출 파장 쌍의 수는 미생물을 적어도 부분적으로 동정하기에, 예를 들어, 실행하기에 충분히 유용한 정보, 예를 들어, 후술되는 분류 그룹을 동정하기에 충분한 정보를 수득하기에 충분하다. 예를 들어, 분류 그룹과 같은 실행에 유용한 정보를 제공하기에 적합한 여기-방출 파장 쌍의 수는 약 2 내지 약 8개 쌍, 예를 들어, 약 3 내지 약 5개 쌍일 수 있다.
본 발명에 따라서, 알려져 있는 미생물의 콜로니에 대한 대조군 측정치를 취하여, 당업자에게 알려져 있는 다양한 수학적 방법을 사용하여 측정된 시험 데이터와 대상 미생물의 특성화의 상관관계를 가능하게 한다. 예를 들어, 당업자에게 알려져 있는 소프트웨어 시스템을 사용하여 샘플로부터의 데이터를 기준선 또는 대조군 측정치와 비교할 수 있다. 더욱 특히, 데이터를 많은 다변수 분석 방법, 예를 들어, 일반적 판별 분석(General Discriminant Analysis; GDA), 부분 최소 제곱 판별 분석(PLSDA), 부분 최소 제곱 회귀, 주성분분석(PCA), 평행 인자 분석(Parallel Factor Analysis; PARAFAC), 신경망 분석(NNA) 및/또는 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine; SVM)에 의해 분석할 수 있다. 이들 방법을 사용하여, 이전에 이재된 바와 같이 유기체를 모니터링, 검출 및/또는 특성화하기 위한 시스템을 고안하는 데에서, 알려져 있지 않은 대상 미생물을 기존의 명명법에 기초하여 관련있는 그룹으로 분류하고/하거나 유기체의 대사, 병원성 및/또는 독성에 기초하여 자연 발생 그룹으로 분류할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 검출 시스템으로부터의 비-분광 측정치, 예를 들어 검출 시간 및 성장 속도를 사용하여, 콜로니로부터의 미생물의 특성화 및/또는 동정에 도움을 줄 수 있다. 또한, 고체 또는 반고체 배지의 사진 이미지로부터 취한 측정치는 콜로니 크기, 형상, 색상 및 밀도와 같은 콜로니 내의 미생물의 특성 및/또는 아이덴티티(identity) 상에 귀중한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 콜로니 내의 미생물의 특성화 및/또는 동정은 정확한 종의 동정을 포함할 필요가 없다. 특성화는 생물학적 입자의 넓은 카테고리화 또는 분류뿐 아니라 단일 종의 실제의 동정을 포함한다. 콜로니로부터의 미생물의 분류는 미생물에 대한 표현형 및/또는 형태상 특성의 결정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 입자의 특성화는 식별가능한 차이점, 이를 테면 조성, 형상, 크기, 클러스터링(clustering) 및/또는 대사에 기초하여 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상의 생물학적 입자의 분류는 주어진 생물학적 입자의 특징의 사전의 지식을 필요로 하지 않으나, 오직 실증적인 측정과의 일관된 상관관계를 요구할 수 있어, 이 방법을 특정 결합 사건 또는 대사 반응에 기초한 방법보다 더 일반적이고 용이하게 사용가능하게 한다. 본 명세서에 사용되는 "동정"은 이전에 알려져 있지 않은 미생물이 속하는 과, 속, 종 및/또는 균주를 결정하는 것을 의미하며, 예를 들어, 이전에 알려져 있지 않은 미생물을 과, 속, 종 및/또는 균주 수준으로 동정하는 것이다.
일부 예에서, 특성화는 취하는 작용에 대하여 충분히 유용한 정보를 제공하는 분류 모델을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 바람직한 분류 모델은 다음 중 하나 이상으로의 그룹화(grouping)를 포함한다: (1) 그램 그룹; (2) 임상적 그램 그룹; (3) 치료적 그룹; (4) 기능적 그룹; 및 (5) 천연 내재적 형광 그룹.
(1) 그램 그룹: 그램 그룹 분류 내에서, 미생물을 이들의 그램 염색 반응 및 전체 크기에 기초하여 3개의 넓은 분류 카테고리 중 하나로 배정할 수 있으며, 상기 그룹은 다음 중 하나 이상으로부터 선택된다: (a) 그램 염색으로 암청색으로 염색되는 그램 양성 미생물; (b) 그램 염색으로 적색으로 염색되는 그램 음성 미생물; 및 (c) 그램 염색으로 암청색으로 염색되나 이들의 형태학적 특징 및 크기로 박테리아와 구별되는 매우 큰 둥근 세포인 효모 세포.
(2) 임상적 그램 그룹: 그램 그룹을 현저한 형태적 특징을 나타내는 몇몇의 서브-카테고리로 추가로 나눌 수 있다. 이들 서브-카테고리는 숙련된 실험실 기술자가 보고한 모든 유의미한 임상 정보를 포함하여, 양성 또는 음성 그램 반응보다 더 높은 수준의 동정을 제공한다. 이러한 특정한 분류는 매우 유익한데, 이는 자동화된 시스템으로 동등한 임상적으로 유의미한 정보를 제공함으로써, 스미어(smear)를 판독하는 기술자의 기술 수준 및/또는 그램 염색의 품질에 의존하는 것에 대한 염려를 없애기 때문이다. 더욱 자세하게, 이러한 분류 모델에 기초한 미생물의 서브카테고리는 다음 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: (a) 작고 둥근 세포인 구균(cocci); (b) 함께 연결된 2개의 작고 둥근 세포인 쌍구균(diplococci); (c) 막대 형상인 간균(rod); 및 (d) 간균 형상인 바실러스(bacilli). 추가의 형태학적 정보에 의해 확인할 수 있는 이들 서브-카테고리의 예는 다음을 포함한다: (i) 그램 양성 구균; (ii) 사슬 내의 그램 양성 구균; (iii) 클러스터 내의 그램 양성 구균(즉, "포도-유사" 클러스터); (iv) 그램 양성 쌍구균; (v) 그램 양성 간균; (vi) 포자가 있는 그램 양성 간균; (vii) 그램 음성 간균; (viii) 그램 음성 구간균(coccobacilli); (ix) 그램 음성 쌍구균; (x) 효모; 및 (xi) 사상 진균.
(3) 치료적 그룹: 치료적 그룹은 특정 표본 유형으로부터 단리되는 경우, 동일한 부류의 항생제 또는 항생제의 혼합물로 처리되는 다수의 미생물 종을 포함한다(참고 문헌["Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008"]). 많은 경우에, 초기의 경험적인 치료법에서 더욱 표적화된 치료법으로의 변화를 가능하게 하기 위하여 임상의는 종 수준으로의 아이덴티티를 필요로 하지 않는데, 이는 1개 초과의 종이 동일한 항생제(들)의 선택으로 치료될 수 있기 때문이다. 이러한 분류 수준은 이들 "동일-치료" 미생물을 정확하게 단일의 치료적 카테고리에 배정한다. 이러한 특성화 수준의 예에는 감수성 EB 종으로부터 고내성 엔테로박테리아(Enterobacteriacae; EB) 종(이. 콜라이(E. coli)로부터 엔테로박터(Enterobacter) 종), 또는 감수성 칸디다(Candida) 종(씨. 알비칸스(C. albicans) 및 씨. 파라프실로시스(C. parapsilosis))으로부터 플루코나졸-내성 칸디다 종(씨. 글라브라타(C. glabrata) 및 씨. 크루제이(C. kruzei)) 등을 구별하는 능력이 포함된다.
(4) 기능적 그룹: 본 발명에 따라, 미생물을 또한 대사, 독성 및/또는 표현형 특징의 혼합에 기초하여, 몇몇의 그룹으로 배정할 수 있다. 비-발효 유기체는 발효 유기체로부터 명확하게 구별될 수 있다. 또한, 용혈소를 생성하는 미생물 종을 비-용혈소 종과 따로 그룹화할 수 있다. 일부 경우에, 이들 그룹은 속 수준(예를 들어, 콜라이형(coliform), 그램 음성 비-발효 간균)보다 더 넓은 카테고리를 나타내며, 일부는 속 수준(예를 들어, 엔테로코커스(Enterococcus), 칸디다)으로 나타내고, 일부는 종-수준 판별(예를 들어, 코아굴라제-음성 스타필로콕시(coagulase-negative staphylococci), 알파-용혈성 스트렙토콕시(alpha-hemolytic streptococci), 베타-용혈성 스트렙토콕시, 코아굴라제-양성 스타필로콕시, 즉, 에스. 아우레우스(S. aureus))에 근접하게 나타낸다.
(5) 천연 내재적 형광(" IF ") 그룹: 미생물을 또한 이들의 선천적 및/또는 내재적 형광 특징에 의해 함께 그룹화하는 이들의 천연의 경향에 기초하여 카테고리로 배정할 수 있다. 이들 그룹 중 일부는 치료적 그룹 및 기능적 그룹 카테고리에 통상적일 수 있다. 이들 그룹화는 특징적인 IF 시그니처를 갖는 이. 패칼리스(E. faecalis), 에스. 피오게네스(S. pyogenes) 또는 피. 아에루지노사(P. aeruginosa)와 같은 개별 종을 포함할 수 있고/있거나 상대적으로 보존된 IF 시그니처를 갖는 소그룹의 유기체, 이를 테면 이. 콜라이(E. coli)-케이. 옥시토카(K. oxytoca) 또는 이. 아에로지너스(E. aerogenes)-씨. 프레운디이(C. freundii) 그룹을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 동정 목적을 위해 미생물의 내재적 특성(예를 들어, 내재적 형광)을 측정하는 것 외에, 동정 과정을 돕기 위한 추가의 동정 제제(identifier agent)의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 친화성 리간드와 같은 특정 미생물에 결합하는 제제를 사용하여 미생물을 분리하고/하거나, 미생물의 부류 또는 종을 동정하고/하거나(예를 들어, 독특한 표면 단백질 또는 수용체에 대한 결합을 통해), 미생물의 특징(예를 들어, 항생제 내성)을 동정할 수 있다. 유용한 동정 제제에는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 및 이의 단편(예를 들어, 에스. 아우레우스(S. aureus) 동정을 위한 항-Eap), 핵산 프로브, 항생제(예를 들어, 페니실린, 반코마이신, 폴리믹신 B), 압타머(aptamer), 펩티드 모방체, 파지-유래 결합 단백질, 렉틴, 숙주 선천 면역 바이오마커(biomarker)(급성기 단백질, LPS-결합 단백질, CD14, 만노오스 결합 렉틴, 톨-유사 수용체), 숙주 방어 펩티드(예를 들어, 디펜신, 카텔리시딘, 프로테오그린, 마가이닌), 박테로신(예를 들어, 란티바이오틱, 이를 테면, 니신, 머사시딘, 에피더민, 갈리더민 및 플란타리신 C 및 클래스 II 펩티드), 박테리오파지, 및 핵산, 지질, 탄수화물, 다당류, 캡슐/슬라임(slime) 또는 단백질에 선택적인 형광 염료 및 이들의 임의의 조합이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 제제가 그 자체로 검출가능한 신호를 내지 않는 경우, 제제는 예를 들어 제제를 마커(예를 들어, 가시가능한 또는 형광)에 컨쥬게이트(conjugate)시킴으로써 검출가능한 신호를 제공하도록 표지될 수 있다. 마커에는 형광, 발광, 인광, 방사성 및/또는 비색 화합물이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 제제는 본 발명의 방법에서 임의의 단계에, 예를 들어, 샘플을 배지 상에 배치할 때 및/또는 콜로니를 검출한 후에, 미생물에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 콜로니 내의 제제의 존재 및/또는 양은 콜로니의 조사 중에 결정될 수 있다. 다른 유용한 동정 제제에는 미생물 효소를 위한 기질, 킬레이트제, 세제, 계면활성제, 소독제(예를 들어, 알코올, 표백제, 과산화수소) 및 독성 화합물(예를 들어, 아지드화나트륨, 시안화칼륨) 및 대사 억제제, 이를 테면 사이클로헥사미드 등이 포함된다. 유사하게, 미생물 세포 생존력, 대사 및/또는 막 전위를 측정하기 위한 많은 형광 화합물을 본 발명에서 동정 제제로 사용할 수 있다.
본 발명의 일 면에서, 상기 방법은 콜로니로부터 미생물(들)을 회수하고 추가의 시험을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 회수한 미생물(들)을 적합한 매질, 예를 들어, 염수에 현탁화시킬 수 있다. 일단 미생물(들)이 현탁화되면, 당업자에게 알려져 있을 바와 같이, 그리고 상술된 바와 같이 요망되는 임의의 추가의 시험으로 처리할 수 있다. 특히, 깨끗한 미생물 샘플을 필요로 하는 임의의 시험을 현탁화된 미생물(들)을 사용하여 수행할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가의 동정/특성화 시험을 수행할 수 있다. 동정 시험의 예에는 바이텍 2, 증폭 및 미-증폭 핵산 시험(NAT), 발색 및 라텍스 응집 분석, 면역분석(예를 들어, 표지된 1차 또는 2차 항체 및/또는 다른 리간드를 사용), 질량 분석법(예를 들어, MALDI-TOF 질량 분석법) 및/또는 광학 기술, 이를 테면 적외선 분광법(FTIR) 또는 라만 분광법이 포함된다. 또한, 약물 내성, 안티바이오그램 및/또는 독성 인자와 같은 추가의 특성화 시험을 수행할 수 있다. 추가의 특성화는 상기 방법의 초기 동정 단계 중에 시작된 시험의 일부일 수 있다. 예를 들어, 형광-표지된 페니실린을 콜로니의 성장 이전에 샘플에 첨가함으로써, 메티실린 내성 에스. 아우레우스(S. aureus)의 검출을 시작할 수 있다. 예를 들어, 콜로니 또는 콜로니로부터 회수된 미생물 내에서, 결합 페니실린의 존재 및/또는 양을 결정할 수 있다. 특정 실시형태에서, 동정 단계를 예를 들어, 동일한 장치에서 수행하는 동일한 시스템 내에서 하나 이상의 추가의 시험을 수행할 수 있다. 일 실시형태에서, 이루어진 동정에 기초하여, 특정 추가의 시험을 많은 이용가능한 시험으로부터 선택할 수 있다.
본 발명의 일 면에서, 상기 방법 단계의 일부 또는 모두를 자동화할 수 있다. 본 명세서에서, 용어 "자동화된"은 컴퓨터로 제어되는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 다양한 형광 방출 검출 및 연관성 단계를 자동화하고, 이 방법으로부터 수득된 생성 정보를 자동화하여 사용하여, 데이터베이스를 생성한다. 추가의 실시형태에서, 콜로니의 검출 및/또는 조사와 같은 상기 방법의 다른 단계도 또한 자동화할 수 있다. 상기 방법의 단계를 자동화하는 것은 더 많은 샘플을 더 효율적으로 시험하게 할 뿐 아니라, 유해하고/하거나 감염성인 미생물을 함유할 수 있는 샘플을 핸들링하는 데에서 사람 실수의 위험을 줄이고, 샘플의 오염 기회 및/또는 샘플에 대한 취급자의 노출 기회를 줄인다. 일 실시형태에서, 본 발명은 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물을 검출 및/또는 동정하는 시스템에 관한 것이며, 이 시스템은 분광광도계 및 집속 소자, 이를 테면 렌즈 시스템 또는 현미경을 포함한다. 다른 실시형태에서, 시스템은 배지의 표면을 스캐닝하기 위한 메커니즘 및/또는 배지의(예를 들어, 이를 인큐베이션하는) 환경을 제어하기 위한 메커니즘을 추가로 포함한다.
본 발명의 일 면은 고체 또는 반고체 배지 상의 콜로니의 검출에 관한 것이다. 검출에 이어, 임의로 콜로니 내의 미생물의 동정/특성화가 뒤따른다. 일 실시형태에서, 샘플이 배치된 배지를 콜로니의 존재에 대해 수동으로 스캐닝한다. 일 실시형태에서, 콜로니를 육안으로 가시적으로 검출할 수 있다. 다른 실시형태에서, 콜로니를 현미경을 사용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 현미경 스테이지 상에 배치된 배지를 현미경 대물렌즈 하에 수동으로 이동시켜, 콜로니의 존재에 대해 배지의 일부를 스캔하면서, 배지를 현미경 하에서 관찰할 수 있다. 배지 그 자체를 조작하거나(예를 들어, 배지를 포함하는 플레이트를 이동) 배지가 배치된 현미경 스테이지를 이동시킴으로써, 배지를 이동시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 스캐닝은 자동으로 수행한다. 일 실시형태에서, 배지의 표면을 가로지르는 검색 패턴으로 대물렌즈 하에서 배지를 이동시키도록 동력화된 현미경 스테이지를 프로그램화하여, 배지의 개별 부분이 차례로 관찰될 수 있도록 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 배지는 레이져와 같은 집광 빔이 배지를 가로질러 스캐닝하고, 방출된 광이 영상 또는 비-영상 검출기에 의해 검출되는 동안 움직이지 않게 유지된다. 일 실시형태에서, 배지를 여기 빔의 치수에 상응하는 동일한 부분(예를 들어, 약 100, 250, 500, 또는 1000 ㎛2 이상)으로 나누고, 현미경 스테이지를 단계적으로 증가시켜, 각 부분이 조사를 위해 대물렌즈 하에 배치되게 할 수 있다. 다른 실시형태에서, 배지를 콜로니에 대하여 대규모(예를 들어, 전체 플레이트 또는 이의 큰 분획(예를 들어, 절반, 3분의 1, 4분의 1, 10분의 1 또는 그 미만))로 관찰할 수 있다. 어느 하나의 실시형태에서, 콜로니의 위치를 배지의 스캔으로부터 생성된 맵에 기초하여 결정할 수 있다. 일 실시형태에서, 현미경 스테이지를 각 검출된 콜로니로 차례로 이동하도록 프로그램화하여, 각 콜로니의 IF 스펙트럼을 수득할 수 있다. 일 실시형태에서, 수동 또는 자동 스캐닝을 규칙적인 간격(예를 들어, 매 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 또는 12 시간 이상마다)으로 반복하여, 콜로니의 출현 및/또는 성장을 모니터링할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 가시광을 사용하여 배지를 스캔하여, 콜로니, 예를 들어, 현미경 하에서 관찰되기에 충분히 큰 콜로니를 검출한다. 다른 실시형태에서, 배지를 조명하여, 콜로니의 내재적 특성(예를 들어, IF)이 검출되게 한다. 배지의 백그라운드(background) 수준에 대한 IF의 피크는 콜로니의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 배지의 형광 맵은 예를 들어, 스캐닝 여기 빔(예를 들어, 레이져) 및 단순한 비-영상 검출기를 사용하여 제작할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 이미지 캡쳐/획득 장치(예를 들어, 카메라 또는 스캐너, 이를 테면 CCD 선형 어레이 스캐너, CCD 라인-스캔(line-scan) 카메라, CCD 2D 어레이 카메라, 레이져 스캐닝 카메라 또는 기타 장치)를 사용한 대면적 영상은 제WO 03/022999호 및 미국 특허 제5,912,115호, 제6,153,400호 및 제6,251,624호에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 검출 방법은 또한 검출된 미생물의 동정과 함께, 또는 검출된 미생물의 동정 없이, 샘플 내의 미생물(들)의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출 방법은 미생물에 의한 오염에 대하여 샘플, 예를 들어 식료품, 약제, 식수 등을 모니터링하기 위하여 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 오염에 대한 지속적인 모니터링을 위하여 반복적인 방식, 예를 들어, 1달에 1회, 1주에 1회, 1일에 1회, 1시간에 1회, 또는 임의의 다른 시간 패턴으로 수행할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 샘플을 필요에 따라, 예를 들어, 오염이 의심되거나, 오염의 부재가 확인될 필요가 있는 경우에 시험할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 검출 방법은 임상 샘플에서, 예를 들어 상처 또는 혈액 배양물로부터의 미생물의 존재를 찾기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 샘플을 특정 시간에 혈액 배양물로부터 제거하고, 검출 방법을 샘플 상에서 수행하여, 혈액 배양물이 양성인지를 결정할 수 있다. 일 실시형태에서, 샘플을 배양의 접종 이후 설정 시간, 예를 들어, 접종 24 시간 후에 취하여, 혈액 배양물이 양성인지를 결정할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 샘플을 혈액 배양물로부터 정기적으로, 예를 들어, 매 12, 6, 4, 2, 1 또는 0.5시간 마다 취하여, 검출가능하게 양성이 되는 짧은 시간 내에 양성 혈액 배양물을 동정할 수 있다. 검출 방법의 특정 실시형태에서, 상기 검출 단계는 임의로 본 명세서에 기재된 동정/특성화 방법으로 이어질 수 있다. 다른 실시형태에서, 검출 방법은 특히 샘플의 반복적 모니터링을 수반하는 실시형태를 위하여 부분적으로 또는 완전히 자동화한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 미생물 대신 동물 또는 식물 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 콜로니, 클럼프(clump), 또는 다른 3차원 구조로 성장할 수 있고, 3차원 기재상에 성장하는 동물 세포(예를 들어, 포유동물, 조류, 곤충 세포) 또는 식물 세포를 본 명세서에 개시된 기법을 사용하여 검출, 모니터링, 특성화 및/또는 동정할 수 있다. 3차원 콜로니로 성장하는 적합한 세포의 예에는 비제한적으로, 줄기 세포, 섬유모세포 및 신생 세포가 포함된다.
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 상술되며, 실시예는 예시의 방식으로 제공되며, 본 발명을 어떤 방식으로도 제한하고자 하지 않는다. 해당 분야에 잘 알려져 있는 표준 기술 또는 특별히 후술되는 기술을 사용한다.
실시예
실시예 1. 플레이트 및 막 상의 콜로니로부터 스펙트럼의 수득
콜로니의 유용한 스펙트럼이 블랙 막과 함께 그리고 이것 없이, 혈액 아가 플레이트(BAP; 5% 양 혈액이 있는 트립틱 소이(tryptic soy) 아가) 상에서 직접적으로 수득될 수 있는지를 결정하기 위하여 시험을 행하였다(표 1). 이. 콜라이(E. coli)(EC), 에스. 아우레우스(S. aureus)(SA), 이. 패칼리스(E. faecalis)(EF) 및 피. 아에루지노사(P. aeruginosa)(PA)의 콜로니를 표 2에 나타낸 바와 같이 성장시키고, 광섬유 어댑터와 결합된 UV 현미경(10X 대물렌즈)를 통해 플루오로로그(Fluorolog)3 분광계(Horiba Jobin Yvon, Edison NJ) 및 PMT 검출기로 스펙트럼을 취하였다. 여기(Ex) = 260-550 nm 및 방출(Em) = 280-600 nm의 파장 범위, 슬릿 폭 = 5 nm을 사용한 매 5 nm를 통해 EEM을 획득하였다. 나타낸 경우, 방출 경로 내에 1 mm 핀홀을 배치함으로써 조사 영역을 좁혀, 대략 0.1 mm의 관찰 영역을 야기한다. 핀홀 없이, 콜로니 상에 투사된 여기 및 방출 원은 대략 1 mm 직경으로 동일하였다. 각 시험 시행에 포함되었던 샘플을 표 2에 나타내었다.
시험 시행 A1 A2 A3 A4 B1 B2
대략적 콜로니 직경(㎜) 0.4 블랭크(blank) 0.2-0.35 1.0-3.0 1.0-3.0 1.0-3.0
막 PALL 모두 WME 없음 없음 WME
EM 빔 직경(㎜) 0.1 0.1 0.1 0.1 1.0 1.0
조사 시간(초) 1 0.5 0.5 0.5 0.1 0.1
막:
없음 = 양 혈액 아가(SBA)
PALL = SBA 상의 PALL 매트리셀 블랙 격자형 폴리에테르설폰 막
WPC = SBA 상의 와트만 트랙-에치형 폴리카보네이트 블랙 막
WME = SBA 상의 와트만 블랙 혼합형 에스테르 막
A1 EC1 = ATCC 25922, SBA 플레이트 상의 PALL 매트리셀 블랙 격자형 폴리에테르설폰 막 상에서 주위 온도(AT)에서 25시간. 대략적 전체 콜로니 직경은 약 3 격자점에 걸쳐있고, 핀홀은 콜로니 직경의 대략 1/4-1/5 및 콜로니 면적의 1/20을 커버한다.
A2 순전한 BAP 및 BAP 상의 각각의 막

A3
 EC3 = ATCC 25922, 주위 온도(AT)에서 밤샘(O/N) + 36℃에서 4시간으로, WME 막 상에 350 미크론 직경 콜로니 생성
SA1 = ATCC 25923, 실온에서 밤샘 + 36℃에서 4시간으로, WME 막 상에 200 미크론 직경 콜로니 생성

A4
 EC2 = ATCC 25922, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니
SA2 = ATCC 25923, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니
EF1 = ATCC 29212, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니
PA1 = ATCC 27853, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니


B1

 EC1 = ATCC 25922, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 = 2.3㎜ 직경
EC2 = ATCC 25922, 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 = 2.3㎜ 직경, 슬릿 폭 = 3㎚
SA1 = ATCC 25923, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 = 2.0㎜ 직경
EF1 = ATCC 29212, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 = 1.2㎜ 직경
PAl = ATCC 27853, BAP 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 = 3.0㎜ 직경




B2



 ECl = ATCC 25922, SBA 상의 WME 막 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 2.0㎜
EC2 = ATCC 25922, SBA 상의 WME 막 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.6㎜
SA1 = ATCC 25923, SBA 상의 WME 막 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.2㎜
SA2 = ATCC 25923, 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.2㎜, 조사 시간 = 0.05초, 슬릿 = 2.5㎚
SA3 = ATCC 25923, 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.2㎜, 조사 시간 = 0.1초, 슬릿 = 3.0㎚
SA4 = ATCC 25923, SBA 상의 WME 막 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.1㎜
SA5 = ATCC 25923, SBA 상의 WME 막 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.2㎜
EF1 = ATCC 29212, SBA 상의 WME 막 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.0㎜
PA1 = ATCC 27853, SBA 상의 WME 막 상에서 36℃에서 밤샘 콜로니, 콜로니 직경 = 1.1㎜
미접종 플레이트의 시험 시행 A2로부터의 스펙트럼을 도 1a 내지 1d에 나타내었다. 각 도면상의 세로축은 Ex 범위를 나타내며, 가로축은 Em 범위를 나타낸다. 스펙트럼을 미생물 없이, BAP(도 1a), PALL 막(도 1b), WME 막(도 1c) 및 WPC 막(도 1d)으로부터 수득하였다. 처음의 관찰은 Pall 및 와트만 막과 BAP 간의 백그라운드 형광의 차이였다. 놀랍게도, 스펙트럼의 영역에서 강하게 형광화된 블랙 Pall 막은 마스크되지 않은(unmasked) BAP보다 미생물 현탁액의 분류에 훨씬 더 중요한 것으로 이전에 관찰되었다. 그러나, WME 막은 모두 중에서 가장 적은 백그라운드 형광을 제공하였다.
BAP 위의 WME 막 상의 콜로니의 시험 시행 A3으로부터의 스펙트럼을 도 2a 내지 2c에 나타내었다. 스펙트럼을 EC3(도 2a) 및 SA1(도 2b)으로부터 수득하고, EC3 스펙트럼을 SA1 스펙트럼으로부터 감산한 결과를 도 2c에 나타내었다. 콜로니의 스펙트럼은 에스. 아우레우스(S. aureus)와 이. 콜라이(E. coli) 간의 분명한 차이를 보여준다. 스펙트럼의 일부분이 이. 콜라이(E. coli)에 대해서 더 높고, 다른 부분은 에스. 아우레우스(S. aureus)에 대하여 더 높다는 사실은 전반적인 패턴에서 차이가 있으며, 단순한 세기 규모의 차이가 아님을 보여준다.
막이 없는 BAP 상의 콜로니의 시험 시행 B1로부터의 스펙트럼을 도 3a 내지 3d에 나타내었다. 스펙트럼을 EC1(도 3a), SA1(도 3b), EF1(도 3c) 및 PA1(도 3d)로부터 수득하였다. 상이한 측정 파라미터가 A3 스펙트럼보다 훨씬 더 큰 세기를 생성하지만, 그리고 블랙 막 없이 BAP 상에서 직접 측정하였음에도, 상대적 패턴은 박테리아의 각각의 종에 대하여 여전히 유사하다.
이들 실험은 블랙 막의 도움과 함께, 또는 블랙 막의 도움 없이, BAP 상에서 직접 현미경을 통해 콜로니의 내재적 형광 스펙트럼을 수득하여, 백그라운드 형광을 줄일 수 있었음을 보여주며, 관찰된 패턴은 상이한 미생물 유형에 대해 특징적이었다.
실시예 2. 현미경을 통한 마이크로콜로니에 대한 스캐닝
점-대-점 IF 측정을 사용함으로써, 동력화된 스테이지 상의 현미경 하에서 성장하는 콜로니의 위치를 확인하고, 각각의 검출된 콜로니의 IF 스펙트럼을 자동으로 수집할 수 있는지를 결정하기 위한 시험을 실시하였다. UV 현미경을 플루오로로그3(Horiba Jobin Yvon, Edison NJ) 분광계에 결합시켰으며, 이 분광계는 광섬유 케이블을 통해, 형광 여기원 및 방출 측정 장치로 소용된다. 현미경의 동력화된 스테이지에 36℃로 설정된 순환 수조에 의해 공급되는 튜빙의 코일(coils of tubing)과 함께 제작된 컴팩트(compact) 플레이트 인큐베이터를 장착하였다. 또한, 인큐베이터에 석영 커버슬립(coverslip)으로 이루어진 UV 투과성 윈도우(wondow)를 장착하였다. 다양한 아가 배지를 스프레드(spread) 방법에 의해 표 3에 나타낸 바와 같이, 이. 콜라이(E. coli) ATCC 25922(EC) 및/또는 에스. 아우레우스(S. aureus) ATCC 25923(SA)로 접종하였다. 일부 시행은 블랙 와트만 혼합형 에스테르(WME) 막 또는 챠콜 중 어느 하나의 차광 물질을 사용하여, 배지 그 자체로부터 나오는 형광을 줄였다.
접종 후에, 현미경의 동력화된 스테이지를 프로그램화하여, 검색 격자에서 아가 플레이트를 가로질러 주기적으로 이동시키고, 각 지점에서 하나 이상의 여기/방출 파장 쌍과 함께 형광을 측정하였다. 플루오로로그3을 10 nm로 설정된 슬릿 폭 및 500 ms(시험 시행 A-E) 또는 1000 ms(시험 시행 F-H)로 설정된 조사 시간으로 프로그램화하였다. 아가의 표면상에 투사된 여기 빔을 현미경 내에서 여기 빔에 핀홀을 배치함으로써 대략 0.1 mm 직경으로 제한하였다. 이러한 빔 크기와 상응하게, 현미경 스테이지를 단계적으로 0.1 mm 증가시켜, 10단계가 1 mm의 거리를 커버하게 하였다. 방출 빔을 핀홀로 제한하지 않았으나, 측정 중에 현미경을 가려, 여기 빔에 의해 생성되지 않는 임의의 미광이 검출되는 것을 방지하였다.
시험 시행 G 및 H에 대하여, 성장하는 콜로니의 위치를 자동으로 계산하기 위하여 알고리듬을 개발하였다. 시행 H에 대하여, 프로그램을 추가로 증강시켜, 검출되는 모든 콜로니는 현미경 스테이지가 순서대로 그들의 위치로 이동하게 하고, 이들의 IF 스펙트럼을 수집하게 하였다. 수집한 스펙트럼은 필요한 획득 시간을 줄이기 위하여 선택된 300 EEM 포인트로 이루어진 전체 매트릭스 스캔의 서브셋이었다. 또한, 시간의 이익을 위하여, 10개 이하의 콜로니의 스펙트럼을 취하도록 기기를 프로그램화하였다.
각 실험 시행에 대한 변수
시행 박테리아 검색 파장 면적 단계 스캔 시간 배지
A EC 305-365 & 440-525 59 X 60 87분 WME-SBA
B EC 305-365 & 440-525 68 X 68 115분 WME-SBA
C EC 305-365 71 X 71 125분 2% 챠콜과 함께 TSA
D EC 440-525 100 X 100 122분 2% 챠콜과 함께 TSA
E EC 305-365 97 X 97 115분 SBA
F EC & SA 440-525 72 X 73 111분 SBA
G EC & SA 305-365 61 X 61 46분 SBA
H EC & SA 440-525 70 X 70 61분 SBA
시행 A는 6시간 후에 프로그램이 중단되는 기기 문제를 가졌으며, 콜로니가 그 시간 동안 검출되지 않았다.
시행 B는 8시간에 백그라운드 형광을 겨우 넘는 하나의 콜로니를 나타내었으며, 10시간에는 2개가 분명히 보였고, 12시간 이후에는 3개가 분명히 보였다. 콜로니 신호와 백그라운드 간의 차이는 305-365 nm(대략 2X 백그라운드)에서보다 440-525 nm(대략 4X 백그라운드)에서 더 컸다.
시행 C는 낮은 접종물 때문에, 스캔 영역 내에 콜로니가 없었다.
시행 D는 8시간에 1개의 콜로니를 보여주었으며, 10시간 이후에 3개의 콜로니를 보여주었다.
시행 E는 처음에는 시야에 콜로니가 없었다. 12시간에 하나의 콜로니가 시야 가장자리에 성장하고, 14시간 이후에 3개의 콜로니가 성장하였다.
혼합형 접종물을 사용한 시행 F는 8시간까지 EC로 결정된 10개의 콜로니, 10시간까지 추가로 3개의 SA 및 12시간 초과의 시간에 2개 더 많은 SA를 나타내었다. 시행 F의 점-대-점 IF 검색 스캔의 3차원 플롯을 도 5a 내지 5f에 나타내었으며, 여기서, 높이는 형광 세기와 같다. 플롯은 6시간에 취한 측정치를 보여주며, 여기서, 처음(도 4a), 8시간(도 4b), 10시간(도 4c), 12시간(도 4d), 16시간(도 4e) 및 24시간(도 4f)에 검출된 콜로니가 관찰되었다. 8시간에 눈에 보이는 모든 콜로니가 이. 콜라이(E. coli)였던 반면, 10시간 이후에 관찰되는 추가의 콜로니가 에스. 아우레우스(S. aureus)였음을 주목하길 바란다. 시행 F로부터의 BAP의 접사 이미지를 약술된 검색 스캔 영역과 함께 도 5a에 나타내었으며, 상응하는 콜로니 위치를 나타내는 12시간의 검색 스캔으로부터의 형광 세기의 등고선 플롯을 도 5b에 나타내었다.
시행 G는 8시간에 1개의 EC 콜로니와 9시간에 2개의 EC 콜로니를 나타내었다. 10시간 및 12시간에 기기 오류가 획득을 중지시켰으나, 12시간에 재시작하였을 때 5개의 콜로니가 검출되었다; 2개의 EC 및 3개의 SA. 콜로니 검출 알고리듬으로, 모든 5개의 콜로니의 위치를 성공적으로 동정하였다.
시행 H는 9시간 전에 모든 스캔을 간섭하는 관찰 윈도우 상의 응축을 가졌으며, 이때 3개의 EC 콜로니를 검출하고, 스펙트럼을 취하였다. 동일한 3개의 EC를 이후의 스캔에서 검출하고, 13시간에 시작하여, 4개의 SA 콜로니를 또한 검출하고, 스펙트럼을 취하였다.
실험 결과는 내재적 형광을 사용하여 백그라운드 차단 막 또는 챠콜이 사용되든지 아니든지 간에, 이들이 아가 플레이트 상에서 직접 성장하는 동안에, 미생물 마이크로콜로니의 존재 및 수를 검출할 수 있음을 보여준다. 또한, 일단 위치가 결정되면, 분류를 위하여 동소에서 마이크로콜로니의 전체 스펙트럼을 취하는 것은 상대적으로 간단하다.
실시예 3. 아가 플레이트 상의 미생물 콜로니의 분류
미생물 콜로니를 미생물이 성장한 아가 플레이트 상에서 직접 취한 IF 스펙트럼으로부터 분류할 수 있는지를 결정하기 위한 시험을 수행하였다.
필요한 획득 시간을 줄이기 위하여 선택된 300 EEM 포인트의 서브셋에서, 각각 파장 260-580 nm 및 260-680 nm의 여기(Ex) 및 방출(Em) 매트릭스를 가로질러 스펙트럼 획득을 행하였다. 또한, 모든 반사 파장(여기서, Ex = Em)도 판독하였다. 형광에 대하여, 슬릿 폭을 5 nm 통과 주파수 대역(bandpass)으로 설정하고, 조사 시간은 1000 ms였다. 각각의 300 포인트 획득은 완료하는데 대략 8.1분 걸렸다.
표 4는 총 120개 시험에 대하여, 각각 20개 종의 6개 단리물로 이루어진 시험한 미생물을 열거한 것이다. 종에 의한 것이 아닌 그룹화를 나타내기 위해 사용되는 경우, 용어 임상적 그램(ClinGram)은 단지 양성, 음성 또는 효모가 아닌, 그램 염색을 판독하는 매우 숙련된 관찰자에 의해 가능한 분류 수준을 지칭한다(표 5). 예를 들어, 스타필로콕시는 클러스터 내의 그램 양성 구균인 반면, 많은 스트렙토콕시는 사슬 내의 그램 양성 구균이다.
그램 음성 그램 양성 효모
에이. 바우마니이
(A. baumanii), 6개 단리물		 에스. 아우레우스
(S. aureus), 6개 단리물		 씨. 트로피칼리스
(C. tropicalis), 6개 단리물
이. 아에로지너스
(E. aerogenes), 6개 단리물 		에스. 에피더미스
(S. epidermidis), 6개 단리물		 씨. 글라브라타(C. glabrata), 6개 단리물
이. 클로아카에
(E. cloacae), 6개 단리물		 에스. 뉴모니에
(S. pneumoniae), 6개 단리물		 씨. 알비칸스(C. albicans), 6개 단리물
이. 콜라이(E. coli),
6개 단리물		 이. 패슘(E. faecium),
6개 단리물
케이. 뉴모니에
(K. pneumoniae), 6개 단리물		 이. 패칼리스(E. faecalis),
6개 단리물
피. 아에루지노사
(P. aeruginosa), 6개 단리물		 에스. 피오게네스, 6개 단리물
에스. 말토필리아
(S. maltophilia), 6개 단리물		 에스. 아갈락티아에
(S. agalactiae), 6개 단리물
에스. 마르세슨스
(S. marcescens), 6개 단리물		 비. 서브틸리스
(B. subtilis), 6개 단리물
비. 세레우스(B. cereus),
6개 단리물
표 5는 "리브-원-아웃(Leave-one-out)" 교차-검증을 사용하는 포워드 스텝와이즈 선형 판별 분석(Forward Stepwise Linear Discriminant Analysis)에 의한 분류 모델링의 결과를 나타낸 것이다. "리브-원-아웃" 교차-검증이 작은 데이터 세트를 효과적으로 이용하기 때문에, "리브-원-아웃" 교차-검증을 선택하였으며, 시험을 2배 만큼이나 시행할 필요 없이, 많은 "미지물질(unknowns)"을 "트레이닝(training)" 세트와 동등하게 시험하는 것처럼 결과를 추정한다. 표에서, "DA 단계의 수"는 완료된 판별 분석 단계의 수를 지칭하며, 이는 지시된 결과를 생성하는데 사용되는 EEM 포인트의 실제 수일 수도 있고, 이의 실제 수가 아닐 수도 있다. 전형적으로, 단계 수는 모델에서 ExEm 포인트의 수와 동일하나, 때때로, 포인트가 일부 단계 중에 가해지기보다는 제거되는 경우에, 모델 포인트의 수는 더 적다.
판별 분석이 데이터 내의 무작위적 변동 내의 잘못된 상관관계를 "찾을" 수 있기 때문에, 충분한 수의 충분히 "노이즈가 있는(noisy)" 데이터 포인트가 주어지면, 교차 검증은 주어진 분류 모델의 실제(true) 성공을 추정하는데 필수적이다. 일반적으로, 비-교차-검증된 결과는 증가하는 단계 카운트를 사용한 100% 보정으로 지향될 것이며, 교차-검증된 결과는 피크로 올라간 다음, 다시 아래로 떨어진다. 교차-검증 피크 근처의 단계 수를 갖는 모델을 주어진 데이터 세트에 대해 최적화된 것으로 간주할 수 있다. 표 5는 교차 검증된 결과가 최적화된 포인트에서의 교차 검증이 있는, 그리고 교차 검증이 없는 둘 모두의 각 분류 모델 시행의 결과를 나타낸 것이다.
다른 선택이 얼마나 가까울 수 있는지와 상관없이, 분류를 위한 모델의 첫번째 선택이 미생물의 실제 아이덴티티(identity)였다면, 판별 분석에 의한 각 미생물에 대한 분류를 정확한 것으로 간주하였다. 또한, 실제 아이덴티티가 모델 분류의 상위 3개 선택 내에 있는 미생물의 수 및 백분율을 나타내었으며, 아직 불완전하다면, 분류에 대한 훌륭한 예측 모델을 나타낸다.
콜로니로부터의 스펙트럼은 미생물의 분류 가능성을 명확히 보여준다. 결과가 2개의 근접한 ExEm 포인트를 비닝(binning)함으로써 개선되는 사실로 나타난 바와 같이, 데이터에는 아마도 몇몇의 노이즈가 있을 것이다. 노이즈가 있는 데이터에 기여하는 알려져 있는 2개의 인자는 콜로니 상의 측정 빔의 일치하지 않는 위치 결정 및 장치를 통과하여 검출기에 도달하는 낮은 광 수준으로부터 생긴다. 이러한 연구를 위하여, 여기 빔을 현미경 카메라로 콜로니의 중앙으로 위치 결정하는 것은 어려운데, 이는 가시화에 이용가능한 조명이 최적이 아니었기 때문이다. 사실상, 위치 결정은 일부 경우에 벗어난 것으로 관찰되었으며, 이는 보정되나, 다른 오(miss)-위치 결정은 간과될 것 같다. 또한, 형광 신호 그 자체에서의 노이즈가 큰데, 이는 검출기에 도달하는 형광 에너지의 양이 미생물의 현탁액에 대한 것보다 1000배가 넘게 더 낮았기 때문이다. 이는 유연한 연구 도구이나, 이러한 유형의 측정에 대하여 최적화되지 않은 광섬유 및 현미경 구성 때문이다. 이러한 업무를 위해 고안된 광학 시스템은 이러한 문제를 쉽게 극복할 수 있었다.
분류 그룹화 DA 단계의 수 교차 검증을 사용하지 않은 정확한 수(%) 교차 검증을 사용한 정확한 수(%) 교차 검증을 사용한 상위 3개 내의 수(%) 비닝된 EEM 포인트
종 30 118 98.3% 86 71.7% 108 90.0% 1
종 18 113 94.2% 94 78.3% 114 95.0% 2
임상적 그램 18 118 98.3% 112 93.3% 118 98.3% 2
실시예 4. 노이즈가 더 적은 콜로니의 개선된 분류
더 나은 위치 결정 및 증가된 광 처리량이 내재적 형광을 사용한 미생물 콜로니의 분류를 개선시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 시험을 행하였다. 실시예 3의 실험을 동일한 장비 및 동일한 미생물 균주를 사용하나, 변형된 방법을 사용하여 반복하였다. 동일한 여기(Ex) 및 방출(Em) 파장 범위(Ex = 260-580 nm, Em = 260-680 nm)에 걸쳐, 그러나, 동일한 주요 스펙트럼 영역을 커버하나 이전의 서브셋이었던 것보다 값의 비닝에 더 기여하는 312 파장의 상이한 서브셋으로 스펙트럼 획득을 행하였다. 서브셋을 사용하는 주요 이유는 현재 장비를 사용하여 스펙트럼을 수집하는 데 필요한 시간을 줄이기 위한 것이다. 모노크로메이터(monochromator) 슬릿 폭을 이전의 5 nm보다 크게 7 nm 통과 주파수 대역으로 넓혔고, 이는 측정된 형광을 대략 2배로 증가시킨다. 조사 시간을 1000 ms로 유지하고, 각 획득을 완료하는데 대략 9.8분 걸렸다.
표 6은 "리브-원-아웃" 교차-검증을 사용하는 포워드 스텝와이즈 선형 판별 분석에 의한 분류 모델링의 결과를 나타낸 것이다. 이전과 같이, 분류는 다른 선택이 얼마나 가까울 수 있는지와 상관없이, 모델의 분류에 대한 첫번째 선택이 미생물의 실제 아이덴티티였다면 정확한 것으로 간주하였다. 종 수준으로의 분류 성능은 개별 데이터 포인트(비닝 없음), ExEm 매트릭스 상에서 "L" 패턴의 3개의 인접 형광 판독치의 비닝 및 사각형의 4개의 인접 EEM 포인트의 비닝에 기초하여 나타내었다. 또한, 임상적 그램 수준으로의 분류는 "3L" 비닝으로 나타내었다.
증가된 광 처리량과 결합된 형광 판독의 일관성을 개선시키기 위한 방법 변화는 분류 성공을 실질적으로 개선시킨다. 주요 개선 중에, 더 나은 위치 결정은 아마도 증가된 광 처리량보다 성능 이득에 더 기여할 것이며, 각 콜로니 내의 1개 초과의 위치로부터의 형광 판독치가 분류 정확성을 추가로 증가시키기 위하여 사용될 수 있을 것이다. 현재 장비의 한계는 실질적으로 스펙트럼 해상도의 감소 또는 스캔 시간의 증가 없이, 오직 신호의 온건한 2배 증가만을 허용하였으며, 형광 스펙트럼에서 여전히 상당한 판독 노이즈가 있는 것이 분명하다.
판독 노이즈는 인접 포인트를 비닝함으로써 부분적으로 극복되며, 이는 분류 성공에 영향을 미치는 다른 인자에 긍정적인 효과를 갖지 않으나 이에 따라 스펙트럼 해상도를 감소시킨다. 이러한 비닝 지원은 또한, 최적화된 시스템에서 판독 노이즈를 개선하기 위하여 일부 스펙트럼 해상도가 희생될 수 있음을 나타낸다. 그러나, 비닝으로의 개선은 이들 데이터와 이전의 방법의 결과 간의 차이만큼 크지 않았으며, 이는 아마도 측정의 위치 결정이 더 큰 역할을 수행하는 것을 나타낼 것이다. 분류 성공에서의 추가의 개선을 숙련자의 기술 내에 있을 것과 같은 자동화된 위치 결정 및 최적화된 광학소자로 이룰 수 있다.
상기한 것은 본 발명을 예시하는 것이며, 이의 제한으로 간주되어서는 안된다. 본 발명은 하기의 청구범위 및 거기에 포함되는 청구범위의 등가물에 의해 한정된다. 모든 간행물, 특허 출원서, 특허, 특허 공보 및 본 명세서에 기재된 임의의 다른 참고문헌은 참고가 나타난 문장 및/또는 단락에 관련된 교시를 위하여 그들 전문이 참고로 포함된다.
분류 그룹화 DA 단계의 수 교차 검증을 사용하지 않은 정확한 수(%) 교차 검증을 사용한 정확한 수(%) 교차 검증을 사용한 상위 3개 내의 수(%) 비닝된 EEM 포인트
종 28 120 100% 105 87.5% 116 96.7% 1
종 40 120 100% 109 90.8% 113 94.2% 3
종 40 120 100% 107 89.2% 117 97.5% 4
임상적 그램 28 120 100% 119 99.2% 120 100.0% 3

Claims (34)

  1. (a) 하나 이상의 미생물 콜로니를 함유하는 것으로 알려져 있거나, 이를 함유할 수 있는 고체 또는 반고체 배지를 스캐닝(scanning)하여, 배지 상에 존재하는 상기 콜로니의 위치를 확인하는 단계;
    (b) 단계 (a) 중에 위치가 확인된 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 상기 콜로니 내의 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
    (c) 상기 내재적 형광(IF) 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 특성화하는 단계를 포함하는, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 검출 및 특성화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스캐닝이 상기 고체 또는 반고체 배지의 표면의 점-대-점(point-by-point) 스캐닝을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 콜로니는 직경이 50 ㎛ 미만인 마이크로콜로니(microcolony)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 조사 단계가 비-침습적인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 그램 그룹, 임상적 그램 그룹, 치료적 그룹, 기능적 그룹 및 천연 내재적 형광 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분류 모델로 특성화되는, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 미생물이 속 수준 또는 종 수준으로 특성화되는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 IF 측정치가 분광법에 의해 생성되며, 상기 분광법이 여기-방출 매트릭스(EEM)를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 EEM이 2개 이상의 상이한 파장 쌍을 포함하는, 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 EEM을 알려져 있는 미생물의 EEM의 데이터베이스와 비교하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 배지 또는 샘플로의 동정 제제(identifier agent)의 첨가를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 동정은 부분적으로 콜로니 또는 콜로니로부터 회수되는 미생물 내의 상기 동정 제제의 존재 및/또는 양을 기준으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 동정 제제가 친화성 리간드, 항체 또는 이의 단편, 핵산 프로브, 항생제, 압타머(aptamer), 펩티드 모방체, 파지-유래 결합 단백질, 렉틴, 숙주 방어 펩티드, 박테로신, 박테리오파지, 염료 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 고체 또는 반고체 배지가 상기 미생물의 성장에 유용한 하나 이상의 영양분 및 하나 이상의 첨가제를 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 첨가제가 상기 고체 또는 반고체 배지 상의 상기 미생물 콜로니의 상기 내재적 형광 측정치를 증가시키는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 단백질 가수분해물, 아미노산, 고기 및 야채 추출물, 탄수화물 공급원, 완충제, 소생 제제(resuscitating agent), 성장 인자, 효소 보조인자, 무기염, 금속 보충물(metal supplement), 환원 화합물, 킬레이트제, 감광제(photosensitizing agent), 퀀칭제(quenching agent), 환원제, 산화제, 세제, 계면활성제, 소독제, 선택 제제(selective agent) 및 대사 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 콜로니를 조사하는 것이 표면형광(epifluorescence)을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 콜로니를 조사하는 것이 반사광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  16. (a) 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나 미생물을 함유할 수 있는 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 샘플 내에 존재하는 임의의 미생물을 고체 또는 반고체 배지 상에서 성장시키는 단계; 및
    (c) 상기 고체 또는 반고체 배지의 점-대-점 스캐닝을 행함으로써 배지 상에 존재하는 임의의 콜로니의 위치를 확인하여, 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 미생물의 존재의 검출 방법으로서,
    여기서, 생성된 측정치에 의해 위치가 확인된 하나 이상의 콜로니의 존재가 미생물이 샘플 내에 존재함을 나타내는 것인, 샘플 내의 미생물의 존재의 검출 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 IF 측정치가 분광법에 의해 생성되며, 상기 분광법이 여기-방출 매트릭스(EEM)를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 EEM이 2개 이상의 상이한 파장 쌍을 포함하는, 방법.
  19. (a) 고체 또는 반고체 배지 상의 하나 이상의 콜로니를 조사하여, 콜로니 내의 미생물의 특징적인 내재적 형광(IF) 측정치를 생성하는 단계; 및
    (b) 내재적 형광(IF) 측정치를 기준으로 콜로니 내의 미생물을 특성화 및/또는 동정하는 단계를 포함하는, 고체 또는 반고체 배지 상의 미생물의 특성화 및/또는 동정 방법
  20. 제19항에 있어서, 상기 콜로니는 직경이 50 ㎛ 미만인 마이크로콜로니인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 조사 단계 (a) 이전에, 미생물을 함유하는 것으로 알려져 있거나, 미생물을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 상기 고체 또는 반고체 배지 상에서 성장시켜, 1개 이상의 콜로니를 생성하는, 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 조사 단계가 비-침습적인, 방법.
  23. 제19항에 있어서, 상기 미생물이 그램 그룹, 임상적 그램 그룹, 치료적 그룹, 기능적 그룹 및 천연 내재적 형광 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 분류 모델로 특성화되는, 방법.
  24. 제19항에 있어서, 상기 미생물이 속 수준, 종 수준 또는 균주 수준으로 동정되는, 방법.
  25. 제1항에 있어서, 상기 IF 측정치가 분광법에 의해 생성되며, 상기 분광법이 여기-방출 매트릭스(EEM)를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 제6항에 있어서, 상기 EEM을 알려져 있는 미생물의 EEM의 데이터베이스와 비교하는, 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 EEM이 2개 이상의 상이한 파장 쌍을 포함하는, 방법.
  28. 제19항에 있어서, 상기 EEM을 다변(multivariate) 분석을 사용하여 비교하는, 방법.
  29. 제19항에 있어서, 배지 또는 샘플로의 동정 제제의 첨가를 추가로 포함하며, 여기서, 상기 동정은 부분적으로 콜로니 또는 콜로니로부터 회수되는 미생물 내의 상기 동정 제제의 존재 및/또는 양을 기준으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 동정 제제가 친화성 리간드, 항체 또는 이의 단편, 핵산 프로브, 항생제, 압타머, 펩티드 모방체, 파지-유래 결합 단백질, 렉틴, 숙주 방어 펩티드, 박테로신, 박테리오파지, 염료 또는 이들의 임의의 조합인, 방법.
  31. 제19항에 있어서, 상기 고체 또는 반고체 배지가 상기 미생물의 성장에 유용한 하나 이상의 영양분 및 하나 이상의 첨가제를 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 첨가제가 상기 고체 또는 반고체 배지 상의 상기 미생물 콜로니의 상기 내재적 형광 측정치를 증가시키는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 하나 이상의 첨가제가 단백질 가수분해물, 아미노산, 고기 및 야채 추출물, 탄수화물 공급원, 완충제, 소생 제제, 성장 인자, 효소 보조인자, 무기염, 금속 보충물, 환원 화합물, 킬레이트제, 감광제, 퀀칭제, 환원제, 산화제, 세제, 계면활성제, 소독제, 선택 제제 및 대사 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제19항에 있어서, 콜로니를 조사하는 것이 표면형광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
  34. 제19항에 있어서, 콜로니를 조사하는 것이 반사광을 측정하는 것을 포함하는, 방법.
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