JP2022554358A - 微生物検出プラットフォーム - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヌクレアーゼ活性化培養基質、ヌクレアーゼ活性化培養基質を使用して抗生物質耐性微生物を迅速に検出する方法、及びヌクレアーゼ活性化培養基質を含むキットに関する。一態様では、本発明は、試料中の目的の微生物を検出するための方法を提供する。本方法は、抗生物質耐性菌種であり得る目的の微生物の成長をサポートするための培養基質を提供することを含む。

Description

様々な態様及び実施形態における本発明は、薬剤耐性病原体の検出を含む微生物検出に関する。
抗生物質耐性菌は、世界中で急速に出現しており、医療薬を変革し、数百万人の命を救った抗生物質の有効性を危険にさらしている（Ｇｏｌｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｅｖ．Ｃｔｒｉｅｓ．２０１４；８（２）：１２９－１３６；Ｇｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．２０１３；４（２）：１８５－１９１；Ｗｒｉｇｈｔ，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４；６０（３）：１４７－１５４；Ｓｅｎｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１３；４：４７）。抗生物質耐性の危機は、抗生物質の乱用及び誤用に起因している。抗生物質耐性菌は、米国の医療制度に実質的な負担をかけており、疾病予防管理センター（ＣＤＣ）は、多くの細菌を緊急、深刻、及び懸念のある脅威として分類している。
抗生物質耐性微生物による感染症は、多くの場合、処置が困難である。その理由は、処置方策全体の中で最弱リンクが抗生物質耐性微生物のスクリーニング、検出、及び／または同定であるからである。そのような微生物の同定に使用される既知の試験は、複雑さ、完了時間、及び精度のレベルの点で異なる。検出及び識別にかかる時間は、多くの場合、１８～２４時間かかり、いくつかの場合では、さらに長くかかる。抗菌薬感受性試験を使用して微生物の診断を支援する場合、細菌の同定は、最初の試料を受け取ってから約４８時間かかる可能性が多い。そのような時間の遅れは、患者の処置を妨げ、感染管理の点から有害な影響を有し得る。
通常、病原体の検出方法は、液体または固体培地での培養を含む。発色性セフォキシチンベースの寒天培地の使用を含む本手法は、通常、２０～４８時間以内にメチシリン耐性及びメチシリン感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出する。ＰＣＲ及びハイブリダイゼーションアッセイを使用して、迅速なＭＲＳＡ／ＭＳＳＡ検出が可能であるが、これらのアッセイは、精巧な実験装置及び十分な訓練を受けた専門家を要する。診断、検出、及び識別の速度は、患者の管理及び細菌感染の制御において重要である。
従って、病原菌の迅速で正確な検出を提供し、労務費及び材料費を低減させ得、ならびに／または、病原菌の有無を確認するために、より少ない生化学的及び／もしくは血清学的確認試験を要する代替の微生物検出プラットフォームが当該分野で必要とされる。
本発明は、ヌクレアーゼ活性化可能な培養基質、及びそのようなヌクレアーゼ活性化可能な培養基質を使用して目的の微生物を迅速に検出するための方法を提供する。様々な実施形態では、本発明は、抗生物質耐性菌を検出するための方法を提供する。
抗生物質耐性微生物を検出するための従来の方法は、微生物の少なくとも２４時間またはさらには数日間のインキュベーションを必要とするプロセスを含む。さらに、従来の方法では、多くの場合、微生物の同一性を確認するために、生化学的または血清学的確認試験を要する。様々な実施形態では、本明細書に開示の方法は、単純で費用効果の高いヌクレアーゼ活性化可能な培養基質を使用することにより、抗生物質耐性微生物を検出及び同定することを可能にするという利点を有する。例えば、本明細書に開示の方法は、多くの場合、８時間未満、またはいくつかの実施形態では、６時間未満かかり、精巧または高価な機器を必要とせずに実施することができる。
一態様では、本発明は、試料中の目的の微生物を検出するための方法を提供する。本方法は、抗生物質耐性菌種であり得る目的の微生物の成長をサポートするための培養基質を提供することを含む。培養基質は、１つ以上の抗菌薬（例えば、抗生物質または抗真菌剤）、及びエンドヌクレアーゼ切断時に蛍光シグナルを発する核酸プローブを含む。本方法は、培養基質を試料と接触させ、培養基質を一定時間インキュベートして、目的の微生物の成長を可能にすること、及び、培養基質またはその一部における蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルを検出すること、も含む。本方法では、対照またはベースラインレベルよりも大きい蛍光シグナルの検出は、目的の微生物の存在を示す。対照またはベースラインの蛍光シグナルは、例えば、ａ）試料が適用されなかった培養基質の一部、または、ｂ）核酸プローブを含まない培養基質、から測定することができる。
本発明の別の態様は、いくつかの実施形態では、抗生物質耐性菌を含む、目的の微生物を検出するためのヌクレアーゼ活性化可能な培養基質に関する。培養基質は、寒天含有成長培地、１つ以上の抗菌薬（例えば、抗生物質または抗真菌剤）、及びエンドヌクレアーゼ切断時に蛍光シグナルを発する核酸プローブを含み、ヌクレアーゼ活性化可能な培養基質は、抗菌薬耐性微生物の成長をサポートすることが可能である。
核酸またはオリゴヌクレオチドプローブは、２～３０ヌクレオチド長であり、少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ切断部位、オリゴヌクレオチドに結合している少なくとも１つの蛍光消光剤、及びオリゴヌクレオチドに結合している少なくとも１つのフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、フルオロフォア及び蛍光消光剤は、エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接している。エンドヌクレアーゼ切断部位は、目的の微生物が産生したエンドヌクレアーゼに対して特異性を有する。核酸プローブのエンドヌクレアーゼ切断により、フルオロフォアを蛍光消光剤から分離し、蛍光シグナルの生成が可能になる。この蛍光シグナルの検出は、試料中に目的の微生物が存在することを示す。核酸プローブは、化学的に修飾されたヌクレオチドを含み得、一部の場合では、化学修飾は、試料中に存在し得る哺乳動物のエンドヌクレアーゼまたは他のヌクレアーゼに対する核酸プローブの耐性を提供する。核酸プローブの化学的修飾は、例えば、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり得る。
本開示は、抗生物質耐性菌を含む、試料中の目的の微生物の迅速な検出を提供する。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルは、インキュベーションの約１５時間以内、インキュベーションの約１２時間以内、インキュベーションの約１０時間以内、約８時間以内、または約６時間以内に検出される。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルは、インキュベーションの約４時間またはインキュベーションの約２時間以内に検出される。これらの実施形態では、本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、及びＥ．ｃｏｌｉを含む重要な病原体の効果的なスクリーニングを可能にする。さらに、様々な実施形態では、蛍光シグナルは、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、またはカルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）の検出を提供する。
本明細書に記載の培養基質及び方法は、研究所、食品及び水質試験、獣医診断用途、医療診断用途、及び医療診断画像における細菌汚染の検出に使用することができる。
本発明の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
Ａ～Ｃは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的ＮＰＴプローブを用いるＳ．ａｕｒｅｕｓの検出を示す。ＳＡＳｅｌｅｃｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）寒天プレート及びＡｔｔｏＰｏｌｙ Ｔ ４ｍｅｒのＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的プローブが埋め込まれた寒天プレートに、１０００細胞未満のＥ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）、及びＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ７００３２８）をストリークし、３７℃でインキュベートした。Ａは、プレートの概略図を示す。Ｂは、ＳＡＳｅｌｅｃｔ寒天プレートを示す。Ｃは、ＮＰＴプローブが埋め込まれた寒天プレート（ＮｕｃＡＰ（商標））を示す。時間は、接種及び画像取得間の間隔である。 ヌクレアーゼ応答性プローブを用いる寒天成長培地におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの迅速で特異的な検出を示す。２μＭのＡｔｔｏＰｏｌｙＴ ４ｍｅｒ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的プローブを含むＴＳＡベースの培地を含む９６ウェルプレート。示された細胞数（ＯＤで概算）をウェルに添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。バックグラウンドを差し引いた後の３回の平均を上のパネルに示す。１細胞／ウェル希釈の示された時点での個々のウェルの蛍光が中央のパネルに示される。後の時点でＳ．ａｕｒｅｕｓの２つのウェルのレベルが上昇していることに留意すべきである（中央及び下のパネルの実線矢印）。Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダー（上及び中央のパネル）またはＩＯＲｏｄｅｏ／ｉＰｈｏｎｅ（商標）カメラ（下のパネル）を用いて、蛍光を測定した。 メチシリン感受性（ＭＳＳＡ－ＡＴＣＣ２９２１３）及びメチシリン耐性（ＭＲＳＡ－ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１７０７）Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出の経時変化を示す。ＴＳ寒天に、プローブを埋め込まなかったか、または、示された濃度のＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ＡｔｔｏＰｏｌｙ Ｔ ４ｍｅｒプローブを埋め込んだ。プレートに、約１０，０００細胞（ＯＤで概算）の示された菌株をストリークし、３７℃でインキュベートした。画像を１時間毎に撮影した。選択された画像が表示される。時間ラベルは、接種及び画像取得間の間隔を示す。ＩＯＲｏｄｅｏ ＬＥＤ照明光源及びｉＰｈｏｎｅカメラで、画像を取得した。 ４μｇ／ｍＬのセフォキシチンの存在下または非存在下でのメチシリン感受性（ＭＳＳＡ－ＡＴＣＣ２９２１３）及びメチシリン耐性（ＭＲＳＡ－ＡＴＣＣ ＢＡＡ－１７０７）Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出及び同定の経時変化を示す。ＴＳ寒天に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ特異的プローブＡｔｔｏＰｏｌｙ Ｔ ４ｍｅｒを１μＭの濃度で埋め込んだ。プレートに、約１０，０００細胞（ＯＤで概算）の示された菌株をストリークし、３７℃でインキュベートした。画像を１時間毎に撮影した。選択された画像が表示される。時間ラベルは、接種及び画像取得間の間隔を示す。ＩＯＲｏｄｅｏ ＬＥＤ照明光源及びｉＰｈｏｎｅ（商標）カメラで、画像を取得した。 セフォキシチンあり／なしの、寒天に埋め込まれたＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的プローブを用いるＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの迅速な検出を示す。９６ウェルプレートを、１μＭのＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的ＡｔｔｏＰｏｌｙ Ｔ ４ｍｅｒプローブを含むＴＳＡベースの培地に充填した。示された細菌細胞数（ＯＤで概算）のＭＲＳＡ及びＭＳＳＡを添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ１７０７）は、８～１０時間でＭＳＳＡ（ＡＴＣＣ２９２１３）と区別することができる。示された値は、２回の平均である。蛍光をＢｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーで測定した。 蛍光寒天によるＥ．ｃｏｌｉの迅速で特異的な検出に関連する。９６ウェルプレートに、０．５μＭのＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯ Ｅ．ｃｏｌｉ応答性プローブを含むＴＳＡベースの培地を充填した。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）、及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１２３４４）の示された細胞数（ＯＤで近似）を添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉは、早くも８時間で特異的に検出することができる。示された値は、３回の平均であり、１時間の時点（バックグラウンドを表す）の蛍光をそれぞれから差し引いた。蛍光レベルを、Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーで測定した。 菌株特異的ＮＰＴプローブを用いるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１２３４４）の検出を示す。寒天プレートに、０．５μＭのＳｅｌｆ－ＨｙｂＡＴＴＯプローブを埋め込み、約１０，０００細胞（ＯＤで概算）の指示された菌株をストリークし、３７℃でインキュベートした。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、３１時間後に現れる目に見える細菌コロニーの非存在下でも、１９時間で検出することができる。 選択的蛍光寒天でのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの迅速な検出に関連する。９６ウェルプレートに、０．５μＭのＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯ Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ応答性プローブを含むＴＳＡベースの培地を充填した。示された細胞数（ＯＤで概算）のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ１２３４４）を添加し、プレートを３７℃でインキュベートした。低濃度のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、コリスチン（２μｇ／ｍｌ）の存在下で検出することができ、１０時間以内にオフターゲットのグラム陰性菌の成長を排除する。蛍光レベルを、Ｂｉｏ－Ｔｅｋプレートリーダーで測定した。示される値は、３回の平均であり、エラーバー（Ｓ．Ｄ．）は、この３回のエラーが高いので、コリスチンなしの１細胞／ウェルの２０時間の値から省略された（この３回では、バクテリアが、かなり不足している可能性がある）。約１ＣＦＵ／ウェルのコリスチン含有試料にシグナルがないことは、これらのウェルに細菌細胞が存在しない可能性が高いことを留意すべきである。
本発明は、ヌクレアーゼ活性化可能な培養基質、及び、目的の微生物の同定／検出のための関連方法に関し、培養基質が、ｉ）エンドヌクレアーゼにより切断可能な部位を含み、ｉｉ）プローブの特異性を高める１つ以上の化学修飾を有してもよく、ｉｉｉ）フルオロフォア及び蛍光消光剤を含む核酸プローブを含む。いくつかの実施形態では、標的微生物は、標的微生物のヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ）による核酸プローブの切断により同定される。核酸プローブの切断時に、フルオロフォアは、蛍光消光剤から拡散し、蛍光シグナルが生成される。この蛍光シグナルは、検出可能であり、標的微生物の存在を示す。
いくつかの実施形態では、目的の微生物は、抗生物質耐性微生物であり、培養基質は、抗生物質耐性微生物のみの成長を可能にする抗菌薬（例えば、抗生物質または抗真菌剤）及び上記の核酸プローブを含む。培養基質が抗菌薬及び核酸プローブの両方を含む実施形態では、抗生物質耐性微生物の検出は、核酸プローブを含まない培養基質と比較して、より短い時間で実施される。いくつかの実施形態では、抗生物質及び核酸プローブの両方を含むことで、目的の微生物のより正確な選択／同定が可能になる。
一態様では、本発明は、試料中の目的の微生物を検出するための方法を提供する。本方法は、目的の微生物の成長をサポートする培養基質を提供することを含む。培養基質は、１つ以上の抗菌薬と、エンドヌクレアーゼ切断時に蛍光シグナルを発する核酸プローブを含む。本方法は、培養基質を試料と接触させ、培養基質を一定時間インキュベートして、目的の微生物の成長を可能にすること、及び、培養基質またはその一部における蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルを検出すること、も含む。本方法では、対照またはベースラインレベルよりも大きい蛍光シグナルの検出は、目的の微生物の存在を示し、これは、いくつかの実施形態では、抗生物質耐性菌である。対照またはベースラインの蛍光シグナルは、例えば、ａ）試料が適用されなかった培養基質の一部、または、ｂ）核酸プローブを含まない培養基質、から測定することができる。
本発明の別の態様は、目的の微生物を検出するためのヌクレアーゼ活性化可能な培養基質を提供する。培養基質は、寒天含有成長培地、１つ以上の抗菌薬（例えば、抗生物質または抗真菌剤）、及びエンドヌクレアーゼ切断時に蛍光シグナルを発する核酸プローブを含み、ヌクレアーゼ活性化可能な培養基質は、目的の微生物の成長をサポートすることが可能である。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、核酸プローブが標的生物のエンドヌクレアーゼにより切断される時に生成された蛍光シグナルの検出に基づく。核酸プローブは、標的生物のヌクレアーゼ、フルオロフォア、及び蛍光消光剤のための１つ以上の部位を含んでもよく、標的生物のヌクレアーゼが核酸プローブを切断する時に蛍光シグナルを生成するように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸プローブは、試料中に存在し得る哺乳動物ヌクレアーゼにより切断されないが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及びＥ．ｃｏｌｉなどの病原性細菌を含む標的微生物が産生したヌクレアーゼにより切断される。従って、プローブは、血液または血清、尿、組織スワブ、表面、食品などの生物試料中の標的微生物の存在を検出するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、培養基質は、エンドヌクレアーゼによる切断時に蛍光シグナルを発する核酸プローブを含む。標的生物のエンドヌクレアーゼによる核酸のこの切断は、試料中の標的生物を検出するための特異的で、感受性があり、効率的な手段を提供する。さらに、これらの方法により、標的微生物を検出するための期間が短縮される。培養基質からの蛍光シグナルの生成は、試料中の標的微生物の存在、非存在、または量を示す。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルは、インキュベーションの約２～約１８時間以内に検出される。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルは、インキュベーションの約１２時間以内、インキュベーションの約１０時間以内、約８時間以内、または約６時間以内に検出される。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルは、インキュベーションの約４時間またはインキュベーションの約２時間以内に検出される。
いくつかの実施形態では、培養基質は、試料を接種することができる寒天含有成長培地を含む。他の実施形態では、培養基質は、様々な多糖ゲル、例えば、カラギーナン、を含む、寒天以外の固体マトリックスを含む。
いくつかの実施形態では、核酸プローブにより生成された蛍光シグナルは、蛍光光度計または当該技術分野で利用可能な蛍光を検出する他の手段を使用して検出される。いくつかの実施形態では、標的微生物は、蛍光を使用して培養基質上に形成されたコロニーを視覚化することにより検出される。いくつかの実施形態では、コロニーは、細菌感染を診断するための手段として蛍光を使用して定量される。
オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼ）酵素のための基質であり、ｉ）１つ以上のヌクレアーゼ切断可能な塩基、例えば、ＲＮＡ塩基（この一部または全てが切断可能な結合として機能する）、ｉｉ）蛍光レポーター基及び蛍光消光剤基（視覚的なＦＲＥＴベースの蛍光消光検出法を可能にする組み合わせ及び近接性）を含み、ｉｉｉ）任意に、ＲＮａｓｅ耐性修飾ＲＮＡ塩基、ヌクレアーゼ耐性ＤＮＡ塩基、または非修飾ＤＮＡ塩基を含有してもよい。内部ＲＮＡ結合が切断可能な結合として機能する合成オリゴヌクレオチドＲＮＡ－ＤＮＡキメラは、例えば、米国特許第６，７７３，８８５号及び第７，８０３，５３６号に記載され、これらは、全体が本明細書で参照により組み込まれる。蛍光レポーター基及び蛍光消光剤基は、少なくとも１つのＲＮＡｓｅ切断可能な残基、例えば、ＲＮＡ塩基、により分離される。そのような残基は、リボヌクレアーゼの切断ドメインとして機能する。
いくつかの実施形態では、蛍光核酸プローブは、２～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含む。実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のピリミジンを含み、オリゴヌクレオチドのピリミジンの少なくとも１つは、化学的に修飾されている。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のプリンを含み、オリゴヌクレオチドのプリンの少なくとも１つは、化学的に修飾されている。いくつかの実施形態では、１つ以上のピリミジンは、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾されており、他の実施形態では、１つ以上のプリンは、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾されている。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸プローブは、完全に自己相補的であって、二本鎖核酸を生じる２つのオリゴヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、単一の自己ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドから構成される。「修飾」という用語は、共有結合的に修飾された塩基、糖、またはリン酸基を有するヌクレオチドを包含する。例えば、修飾ヌクレオチドは、３’位または５’位以外の位置で低分子量有機基に共有結合している糖を有するヌクレオチドを含む。従って、修飾ヌクレオチドは、２’置換糖、例えば、２’－Ｏ－メチル－；２－Ｏ－アルキル；２－Ｏ－アリル；２’－Ｓ－アルキル；２’－Ｓ－アリル；２’－フルオロ－；２’－ハロまたは２－アジド－リボース、炭素環式糖アナログα－アノマー糖；エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、及びセドヘプツロースも含んでもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、２’－メトキシエトキシＲＮＡ、２’－Ｏ－アリルＲＮＡ、２’－Ｏ－ペンチルＲＮＡ、及び２’－Ｏ－ブチルＲＮＡを含むが、これらに限定されない。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一般構造５’ｒ－ＮｎＮ－ｑ３’を有するＲＮＡ－２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチドであり、『Ｎ』は、約１～５つの２’修飾リボヌクレオチド残基を表し、『ｎ』は、１～１０の未修飾リボヌクレオチド残基を表し、『ｒ』は、蛍光レポーター基を表し、『ｑ』は、蛍光消光剤基を表す。レポーター及び消光剤の５’位及び３’位は、互換性がある。一実施形態では、蛍光レポーター基及び蛍光消光剤基は、オリゴヌクレオチドの対向する末端またはその近くに配置されるが、蛍光シグナルの場合、ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの切断が生じる限り、レポーター及び消光剤基が末端修飾である必要はない。一実施形態では、ヌクレアーゼ切断可能な結合がレポーター及び消光剤間にある限り、蛍光レポーター基及び蛍光消光剤基を内部に配置されてもよい。
修飾ヌクレオチドは、当該技術分野で既知であり、限定としてではなく例として、アルキル化プリン及び／もしくはピリミジン；アシル化プリン及び／もしくはピリミジン；または他の複素環を含む。これらのクラスのピリミジン及びプリンは、当該技術分野で既知であり、シュードイソシトシン；Ｎ４，Ｎ４－エタノシトシン；８－ヒドロキシ－Ｎ６－メチルアデニン；４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル；５－フルオロウラシル；５－ブロモウラシル；５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウラシル；５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル；ジヒドロウラシル；イノシン；Ｎ６－イソペンチル－アデニン；１－メチルアデニン；１－メチルシュードウラシル；１－メチルグアニン；２，２－ジメチルグアニン；２－メチルアデニン；２－メチルグアニン；３－メチルシトシン；５－メチルシトシン；Ｎ６－メチルアデニン；７－メチルグアニン；５－メチルアミノメチルウラシル；５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル；β－Ｄ－マンノシルケオシン；５－メトキシカルボニルメチルウラシル；５－メトキシウラシル；２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン；ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル；シュードウラシル（ｐｓｕｅｏｕｒａｃｉｌ）；２－チオシトシン；５－メチル－２チオウラシル、２－チオウラシル；４－チオウラシル；５－メチルウラシル；Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル；ウラシル５－オキシ酢酸；クオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）；２－チオシトシン；５－プロピルウラシル；５－プロピルシトシン；５－エチルウラシル；５－エチルシトシン；５－ブチルウラシル；５－ペンチルラシル；５－ペンチルシトシン；及び２，６、－ジアミノプリン；メチルシュードウラシル（ｍｅｔｈｙｌｐｓｕｅｄｏｕｒａｃｉｌ）；１－メチルグアニン；１－メチルシトシンを含む。
本開示のオリゴヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合ヌクレオチドを使用して合成され、当該技術分野で既知の標準的な固相または液相合成手法を使用して合成されてもよい。ヌクレオチド間の結合は、代替の結合分子を使用してもよい。例えば、式Ｐ（Ｏ）Ｓ、（チオエート）；Ｐ（Ｓ）Ｓ、（ジチオエート）；Ｐ（Ｏ）ＮＲ’２；Ｐ（Ｏ）Ｒ’；Ｐ（Ｏ）ＯＲ６；ＣＯ；またはＣＯＮＲ’２の結合基（式中、Ｒは、Ｈ（もしくは塩）またはアルキル（１－１２Ｃ）であり、Ｒ６は、アルキル（１－９Ｃ）である）は、－Ｏ－または－Ｓ－を介して隣接するヌクレオチドに連結されている。
本開示の特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ピリミジンの２’Ｏ－メチル修飾などの追加の修飾を有する。他の実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの全ては、２’Ｏ－メチル修飾されている。あるいは、ピリミジン、または全てのヌクレオチドは、２’フルオロ（ピリミジン及びプリンの両方）で修飾されてもよい。
オリゴヌクレオチドは、短く、例えば、２～３０ヌクレオチド長（またはその間の任意値）である。特定の実施形態では、そのオリゴヌクレオチドは、４～１５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、そのオリゴヌクレオチドは、４～１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、０～５０％のプリン（またはその間の任意値）を含む。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１００％のピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡのみまたはＲＮＡのみも含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ポリデオキシチミジン配列を含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４－ｍｅｒ、５－ｍｅｒ、６－ｍｅｒ、７－ｍｅｒ、８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、または１０－ｍｅｒであるポリＴ配列を含む。
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の表１に示される配列のうちの１つ以上を含む：
Figure 2022554358000002
ＰｏｌｙＴプローブ及び表１に示されるＰ２＆３ ＴＴプローブは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのミクロコッカスヌクレアーゼに感受性がある。表１に示されるＤＮＡ－ＳＨ、ＳＨ－Ｆｌ ５ＵＵＵ、及びＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯプローブは、腸内細菌科（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む）の十分に保存されたヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼＩに感受性がある。表１に示されるＳＨ－Ｆｌ ５ＵＵＵ及びＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯプローブは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのヌクレアーゼに感受性がある。２’－ＯＭｅ Ｐｙｒ ＳＨプローブは、Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓなどの様々なマイコプラズマ種が産生したヌクレアーゼに感受性があると予想される。２’－ＯＭｅ ＳＨプローブは、ほとんどのヌクレアーゼに耐性があり、それ故、それは、このプローブを切断し得るヌクレアーゼの非常に特異的なシグネチャを提供し得る。
ポリｄＴプローブは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの分泌されたヌクレアーゼであるミクロコッカスヌクレアーゼに応答し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの負荷が低い場合でも、プレーティングから８時間以内にＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニーを検出することを可能にする。ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡを区別する抗生物質（例えば、セフォキシチン）を用いることにより、ＭＲＳＡは、従来のプレーティング手法よりもはるかに迅速に検出することができる。従って、本発明の実施形態による、例えば、鼻腔スワブを使用する、ＭＲＳＡの存在についての個体のスクリーニングが容易になり得る。
配列番号１（Ｓｅｌｆ－Ｈｙｂ）に基づいた自己ハイブリダイズプローブは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを検出するのに有用であり、プローブは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの特定のグラム陰性菌種にも応答することができる。コリスチンなどのグラム陰性菌の成長を防ぐ抗生物質を用いることにより、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの特異的検出が可能になる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓは、溶連菌感染による扁桃腺炎（咽頭炎）及び他の軽度の感染症の病原因子であり、従って、いくつかの実施形態における本発明は、迅速な所要時間でこれらの感染症（例えば、咽頭スワブ由来）のスクリーニングを可能にする。
さらに、エンドヌクレアーゼＩ応答性プローブを含有する基質上に試料をプレーティングすることにより、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの他の共生細菌を区別することを提供する。これらの試験は、１０時間未満で実行することができる。基質にカルバペネムなどの抗生物質を含むことにより、抗生物質耐性腸内細菌科を検出することができる（例えば、ＣＲＥ）。例えば、尿路由来のＥ．ｃｏｌｉ及び薬剤耐性Ｅ．ｃｏｌｉの検出が、尿路感染症を診断するために、日常的に行われる。これらの実施形態における本発明は、このプロセスを容易にする。
プリン及びピリミジンの特定の組み合わせは、哺乳動物のヌクレアーゼに耐性がありながら、細菌のエンドヌクレアーゼに感受性がある。エンドヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼとは対照的に、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素であり、エキソヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖の末端でホスホジエステル結合を切断する。これらの細菌ヌクレアーゼは、通常、認識部位及び切断パターンを要する制限酵素のように配列特異的ではない。一本鎖核酸分子を切断するエンドヌクレアーゼもあれば、二本鎖核酸分子を切断するエンドヌクレアーゼもある。
いくつかの実施形態では、プローブの感受性及び特異性は、適切な緩衝条件に依存する。例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのミクロコッカスヌクレアーゼは、酵素活性のためにカルシウムを要する。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、マグネシウムを要し、他の実施形態では、ヌクレアーゼは、二価カチオンを要しない。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼに対する特異性は、本明細書に概説される選択的培地を用いて達成することができる。
核酸プローブは、自動合成装置を備えた固相ホスホルアミダイト化学（例えば、全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第６，７７３，８８５号を参照）を使用して合成することができる。但し、核酸合成の他の方法（例えば、Ｈ－ホスホナート法）が使用されてもよい。核酸の化学合成により、修飾結合、キメラ組成物、及び核酸の全長にわたって選択された場所に結合している非標準的な塩基または修飾基との、様々な形態の核酸の生成が可能になる。
本発明は、培養基質上で、例えば、固体培地または液体培地上で、成長／培養することができる任意の標的微生物の検出に使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明を使用する検出／同定され得る標的微生物は、ヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼ、を分泌する微生物を含む。いくつかの実施形態では、標的微生物は、特定の抗生物質に対して耐性がある。いくつかの実施形態では、標的微生物に対する抗生物質は、培養基質に含まれ、抗生物質耐性微生物の選択及び定量化を可能にする。いくつかの実施形態では、抗生物質は、セフトリアキソン、セフェピム、Ｖａｂｏｍｅｒｅ、Ａｖｙｃａｚ、トリメトプリム／スルファメトキサゾール（通常、組み合わせて使用）、ストレプトマイシン、ホスホマイシン、シプロフロキサシン、アジスロマイシン、アモキシシリン；β－ラクタム、例えば、メチシリン、オキサシリン、セフォキシチン；ペナム、セファム、モノバクタム；カルバペネム、例えば、メロペネム、エルタペネム、イミペネム；セファロスポリン及びセファマイシン；β－ラクタマーゼ阻害薬、コリスチン、ペニシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、セフタジジム、レボフロキサシン、リネゾリド、ダプトマイシン、及びセフタロリンから選択される。いくつかの実施形態では、培養基質に含まれる抗生物質は、抗生物質耐性微生物との関連で、例えば、疾病管理センター及び食品医薬品局の抗生物質耐性（ＡＲ）分離株バンクで、特定される。
いくつかの実施形態では、培養基質は、ポリエン、例えば、アンホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、リモシジン；イミダゾールを含むアゾール、例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール；トリアゾール、例えば、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イザブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール；チアゾール、例えば、アバファンギン；アリルアミン、例えば、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、及びテルビナフィン；エキノカンジン、例えば、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギンから選択される抗真菌薬を含む。
いくつかの実施形態では、標的微生物は、真菌病原体であり得る。例えば、標的微生物は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓから選択される真菌種であり得る。
いくつかの実施形態では、標的微生物は、任意の病原性細菌であり得る。例えば、標的微生物は、ＣＤＣ及びＦＤＡ抗生物質耐性（ＡＲ）分離株バンクからの微生物であり得る。ＡＲ分離株バンクは、耐性生物の精選されたコレクションを提供する。分離株は、ＣＤＣの発生対応及び監視プログラムを通じて収集され、検証され、試験のためにシーケンシングされ、次に、精選される。分離株は、医療関連、食品媒介性、淋病、及び地域社会関連の感染症由来の試料を表す。
いくつかの実施形態では、微生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、及び／またはメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のエンドヌクレアーゼにより、またはＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のエンドヌクレアーゼにより特異的に切断可能な蛍光プローブに関する。そのようなプローブは、本明細書に記載の方法またはヌクレアーゼ活性化可能な培養基質で使用することができる。
本明細書で使用される「生物試料」という用語は、対象から得られた試料、あるいは、直接の臨床試料、例えば、体液、例えば、血液、血漿、もしくは尿、または咽頭スワブ、鼻腔スワブ、咽頭スワブ、便試料、唾液試料、組織試料、毛髪試料、皮膚試料、皮膚スワブ、気管支吸引物試料、気管支洗浄試料、肛門周囲スワブ試料、滑液試料、脳脊髄液試料、血液培養試料、細菌培養分離試料、尿培養試料、及び外科的生検試料を意味する。生物試料は、病院または細菌に感染する傾向のある他の場所から得られるような様々な環境からの細菌の純粋な培養物も意味し得る。
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、１つ以上のフルオロフォアまたは蛍光レポーター基に作動可能に結合している。フルオロフォアは、特徴的な波長で光を吸収（すなわち、励起）し、２番目の低エネルギー波長で光（すなわち、蛍光）を放出する分子である。本発明の核酸分子に組み込むことができる蛍光レポーター基は、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、テトラメチルローダミン、ローダミン、シアニン誘導体色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ、及びアレクサ色素を含むが、これらに限定されない。これらのそれぞれの特徴的な吸収及び放出波長は、当業者らに周知である。
本発明の核酸分子は、また、蛍光消光剤に作動可能に結合している。蛍光消光剤は、励起されたフルオロフォア（すなわち、レポーター）からエネルギーを吸収または放出して、そのフルオロフォアに固有の波長で蛍光を発することなく、フルオロフォアをより低いエネルギー状態に戻す分子である。消光が起こる場合、レポーター及び消光剤は、物理的に近接しなければならず、従って、核酸分子上または核酸分子内のフルオロフォア及び蛍光消光剤の位置／場所は、核酸分子が無傷である時、蛍光消光剤により消光されるようなものである。例えば、核酸の切断に起因して、レポーター及び消光剤が分離される時、レポーターにより吸収されたエネルギーは、もはや消光剤に伝達されず、代わりに、レポーターに固有の波長の光として放出される。従って、消光の除去後のレポーター基からの蛍光シグナルの出現は、検出可能なイベントであり、試料中の標的微生物の存在を示す「陽性シグナル」を構成する。
蛍光消光剤基は、いかなる蛍光シグナルも発しない分子（「ダーク消光剤」）と、それ自体がフルオロフォアである分子（「蛍光消光剤」）を含む。「蛍光消光剤」を用いる核酸は、無傷の状態及び切断された状態の両方で発光する。無傷の状態では、レポーターにより捕捉されたエネルギーは、ＦＲＥＴを介して消光剤に伝達され、蛍光消光剤に特徴的な波長の光として放出される。切断された状態では、レポーターにより捕捉されたエネルギーは、レポーターに特徴的な波長の光として放出される。蛍光消光剤を使用する組成物がＦＲＥＴアッセイで使用される時、蛍光光度計を使用して検出を行うべきである。特定の実施形態では、「ダーク消光剤」を用いる核酸プローブは、切断状態でのみ発光し、シグナル検出を視覚的に実行できるようにする（検出は、また、蛍光光度計を使用して行われてもよい）。視覚的な検出は、迅速で便利であり、専用装置の利用を何も必要としない。本発明の検出アッセイには、利用可能な選択肢として視覚的検出方法を有することが望ましい。「ダーク消光剤」を用いる核酸プローブは、標的微生物の視覚的検出を可能にするが、「蛍光消光剤」を用いる核酸プローブは、視覚的検出アッセイと互換性がない。
いくつかの実施形態では、核酸プローブは、それ自体が蛍光シグナルを発せず、すなわち、「ダーク消光剤」である、蛍光消光剤基を含む。本発明の組成物に有用な「ダーク消光剤」は、ダブシル、ＱＳＹ．ＴＭ．－７、ＱＳＹ－３３（４’，５－ジニトロフルオレセイン、ピペコリン酸アミド）及びＢｌａｃｋ－Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）１、２、及び３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州ノバート）を含むが、これらに限定されない。従って、アッセイ結果（すなわち、切断された核酸プローブからのシグナル）を視覚的に検出することができる。任意に、蛍光シグナルは、蛍光光度計または定量的または定性的な方法で蛍光発光を検出することが可能な他の任意のデバイスを使用して検出することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸プローブは、表２に記載のフルオロフォアから選択される少なくとも１つのフルオロフォアを含む。
Figure 2022554358000003
Figure 2022554358000004
いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、近赤外範囲の発光を有する。一実施形態では、フルオロフォアは、ＡＴＴＯ４８８である。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸プローブは、表３に記載のものから選択される少なくとも１つの蛍光消光剤を含む。本発明の核酸プローブで使用され得る追加の消光剤は、米国特許第７，４３９，３４１号（全体が本明細書で参照により組み込まれる）に記載される。
Figure 2022554358000005
いくつかの実施形態では、蛍光消光剤は、ＺＥＮ蛍光消光剤（「ダーク消光剤」）またはＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱＲＱ蛍光消光剤（ＲＱＳｐ）（「ダーク消光剤」）である。従来のダーク消光剤は広く吸収し、発光せず、１回のアッセイで同じ消光剤で複数のレポーター色素を使用することができる。この特徴により、マルチプレックスアッセイの拡張された選択肢が可能になり、１つのプローブは、複数の標的微生物を検出するために使用することができる。また、ダーク消光剤は、シグナルクロストークを低減して、レポーター色素の検出を簡素化し、幅広い画像解析機器との互換性を高める。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＡＴＴＯ４８８フルオロフォアであり、蛍光消光剤は、ＺＥＮ及び／またはＲＱＳｐである。
特定の実施形態では、本発明に記載されるプローブの核酸は、リンカーを用いてフルオロフォア及び／または消光剤に結合している。特定の実施形態では、脂肪族またはエチレングリコールリンカー（当業者に周知であるような）は、フルオロフォアまたは消光剤を核酸に結合させる目的で使用されてもよい。特定の実施形態では、リンカーは、ホスホジエステル結合である。特定の実施形態では、リンカーは、ホスホロチオエート結合である。特定の実施形態では、染料及び消光剤のような修飾基と塩基との間の他の修飾結合は、これらの結合をより安定にし、それにより、ヌクレアーゼへの分解を制限するために使用される。
特定の実施形態では、リンカーは、結合ペアである。特定の実施形態では、「結合ペア」は、その結果、対が互いに特異的に結合する特性を有するように、例えば、イオン性、共有結合性、疎水性、ファンデルワールス、及び水素結合を含む様々な分子間力のいずれかを介して互いに相互作用する２つの分子を指す。特異的結合は、結合ペアのメンバーが、別の分子に結合しない条件下で互いに結合を示すことを意味する。結合ペアの例は、ビオチン－アビジン、ホルモン－受容体、受容体－リガンド、酵素－基質、ＩｇＧ－プロテインＡ、抗原－抗体などである。特定の実施形態では、結合ペアの第１のメンバーは、アビジンまたはストレプトアビジンを含み、結合ペアの第２のメンバーは、ビオチンを含む。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、共有結合を介してフルオロフォア及び／または消光剤に結合している。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ、すなわち、フルオロフォア及び消光剤に作動可能に結合しているオリゴヌクレオチドもまた、固体基質に作動可能に結合している。オリゴヌクレオチドにフルオロフォア及び消光剤を結合するために使用することができる化学作用、例えば、ジスルフィド結合、アミノ結合、共有結合などは、当該技術分野で既知である。特定の実施形態では、当業者らに周知の脂肪族またはエチレングリコールリンカーを使用することができる。特定の実施形態では、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ならびに／または染料及び消光剤のような修飾基間の他の修飾結合が使用される。これらの結合は、プローブに安定性を提供し、それにより、核酸塩基への分解を制限する。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、核酸プローブによる吸収に適する光で培養基質を照射するステップ、及び、核酸プローブが発した蛍光シグナルを検出するステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、試料中に存在する標的微生物の存在、非存在、及び／またはレベルもしくは量を検出するために使用することができる。例えば、対象から得られた試料は、培養基質上で一定期間インキュベートされ、培養基質からの蛍光シグナルが検出及び／または定量される。標的微生物が試料中に存在する場合、培養基質は、培養基質に存在する核酸プローブの切断によって蛍光シグナルを生成する。しかし、標的微生物が試料に存在しない場合、蛍光シグナルは、検出されないか、または、バックグラウンドレベルの蛍光シグナルのみが検出される。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルは、標的微生物を含有する試料が接種される培養プレートで、もしくは培養プレートの一部で成長する個々のコロニーに存在するか、またはコロニーから生じている。他の実施形態では、蛍光シグナルは、例えば、液体培養物に試料を接種し、特定の時間間隔でインキュベートする場合に、培養物全体から検出される。
いくつかの実施形態では、培養基質から得られた蛍光シグナルは、試料中に存在する標的微生物の量を定量化するために使用することができる。例えば、蛍光シグナルが培養基質から検出される場合、その強度は、測定し、蛍光シグナルの強度を培養基質に存在する標的微生物の量と比較する標準曲線と比較することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、標的微生物を含有する試料を接種された培養基質から生成された蛍光シグナルを対照蛍光シグナルと比較することを含む。対照蛍光シグナルは、例えば、以下から測定することができる：ａ）試料が適用されなかった培養基質の一部、または、ｂ）核酸プローブを含まない培養基質。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、試料を接種された培養基質から得られた蛍光シグナルと、対照蛍光シグナルを比較するステップを含む。例えば、対照蛍光シグナルよりも大きい蛍光シグナルの検出は、試料が標的微生物を含有することを示し、対照蛍光シグナルよりも小さい蛍光シグナルの検出は、試料が標的微生物を含有しないことを示す。
他の実施形態では、標準曲線を使用して試料中に存在する標的微生物の量を定量するために、蛍光シグナルを測定し、対照蛍光シグナルと比較することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、さらに、個々のコロニーからの蛍光シグナルの検出に基づいて、培養基質上の標的微生物の個々のコロニーを計数することにより標的微生物を数えるステップを含む。
いくつかの実施形態では、本発明に記載の核酸プローブは、例えば、蛍光シグナルを発する。本信号は、当該技術分野で既知の蛍光検出の方法を使用して検出することができる。一部の実施形態では、蛍光シグナルは、分光蛍光光度計；マイクロプレートリーダー；蛍光顕微鏡；蛍光スキャナー；フローサイトメーター；蛍光ゲルイメージングデバイス；トランスイルミネーター、光フィルター、及びカメラの組み合わせ；または他の蛍光イメージングデバイスを使用して検出される。例えば、培養基質の試料のインキュベーション後に、蛍光発光は、蛍光光度計を使用して検出することができる。蛍光検出装置は、単一試料キュベットデバイス及びマルチウェルプレートリーダーを含むが、これらに限定されない。マルチウェルプレートフォーマットを使用すると、２００μｌ以下などの少ないサンプル量、及び、一度に多数の試料の高スループットロボット処理が可能になる。本フォーマットは、特定の産業用ＱＣ設定で使用される。本方法は、ＲＮａｓｅフリーのキュベットで実施されるアッセイも提供する。蛍光検出を使用すると、高感度で定量的な検出が可能になる。
本発明は、さらに、以下の非限定例により説明される。
実施例１：材料及び方法
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの成長用の６０ｍｍの寒天ペトリ皿の調製
トリプティックソイ寒天（ＢＤカタログ番号２３６９５０）を、製造者の指示に従ってオートクレーブ処理し、５０～６０℃に冷却した。次に、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（以下の貯蔵液を使用して５０ｍＭに調整：Ｒｏｃｋｌａｎｄカタログ番号ＭＢ０２８－１０００）及びＣａＣｌ２（以下の貯蔵液を使用して１５ｍＭに調整：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２１１１５－１００ＭＬ）を含む事前滅菌済み構成成分を添加し、得られた混合物を６０ｍｍのペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４３０５８９）に注いだ。示される場合に、１μＭまたは２μＭのＡｔｔｏＰｏｌｙ Ｔ ４ｍｅｒ（ＩＤＴ、カスタムオーダー）及び４μｇ／ｍＬのセフォキシチン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒカタログ番号ＡＡＪ６６８９１０３）も含まれていた。寒天混合物を固化させ、次に、ペトリ皿をパラフィルム（Ｂｅｍｉｓカタログ番号９９９）で密封し、４℃で保存し、光から保護した。
ペトリ皿でのＳ．ａｕｒｅｕｓの成長及びイメージング
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）培養物を、トリプシン大豆ブロス（ＢＤカタログ番号２１１８２５）中、３００～４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。１０，０００細胞／μＬに希釈し、これらを１μＬの較正された白金耳（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄカタログ番号２２３６３６０１）を用いて寒天ペトリ皿にストリークした。皿を３７℃でインキュベートし、ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ蛍光イメージャー（ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ、大型、青色ＬＥＤ）及びｉＰｈｏｎｅ（商標）８カメラを使用してイメージングした。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの成長用の９６ウェル寒天プレートの調製
トリプティックソイ寒天（ＢＤカタログ番号２３６９５０）を、製造者の指示に従ってオートクレーブ処理し、５０～６０℃に冷却した。次に、トリス＊ＨＣｌ（ｐＨ９．０）（以下の貯蔵液で５０ｍＭに調整：Ｒｏｃｋｌａｎｄカタログ番号ＭＢ０２８－１０００）及びＣａＣｌ２（以下の貯蔵液で１５ｍＭに調整：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号２１１１５－１００ＭＬ）を含む事前滅菌済み添加剤を添加した。示される場合に、１μＭまたは２μＭのＡｔｔｏＰｏｌｙ Ｔ ４ｍｅｒ及び４μｇ／ｍＬのセフォキシチン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒカタログ番号ＡＡＪ６６８９１０３）も含まれていた。９０μＬの寒天混合物を透明底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｎｕｎｃカタログ番号２６５３０１）のウェルにピペッティングし、固化させた。次に、プレートを光学的に透明なフィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３０６３１１）で密封し、４℃で保存し、光から保護した。
９６ウェルプレートでのＳ．ａｕｒｅｕｓの成長及びイメージング
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）培養物を、トリプシン大豆ブロス（ＢＤカタログ番号２１１８２５）中、３００～４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。１，０００細胞／μＬ～０．１細胞／μＬに希釈し、記載の寒天混合物を含有する９６ウェルプレートのウェルにピペッティングした（１０μＬ／ウェル）。プレートを３７℃でインキュベートし、ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ蛍光イメージャー（ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ、大型、青色ＬＥＤ）及びｉＰｈｏｎｅ（商標）８カメラを使用してイメージングし、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で蛍光も同時に測定した。
Ｅ．ｃｏｌｉの成長のための６０ｍｍの寒天ペトリ皿の調製
トリプティックソイ寒天（ＢＤカタログ番号２３６９５０）を、製造者の指示に従ってオートクレーブ処理し、５０～６０℃に冷却した。次に、トリス＊ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（以下の貯蔵液で５０ｍＭに調整：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＢＰ１７５８－１００）、ＭｇＣｌ２（以下の貯蔵液で２０ｍＭに調整：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ９５３０Ｇ）、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（以下の貯蔵で１％に調整：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号５０－７５１－７０９０）を含む事前滅菌済み構成成分を添加し、得られた混合物を６０ｍｍのペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４３０５８９）に注いだ。示される場合、０．５μＭのＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯも含まれていた。寒天混合物を固化させ、次に、ペトリ皿をパラフィルム（Ｂｅｍｉｓカタログ番号９９９）で密封し、４℃で保存し、光から保護した。
ペトリ皿でのＥ．ｃｏｌｉの成長及びイメージング
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）培養物を、トリプシン大豆ブロス（ＢＤカタログ番号２１１８２５）中、３００～４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。１０，０００細胞／μＬに希釈し、１μＬの較正された白金耳（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄカタログ番号２２３６３６０１）を用いて寒天ペトリ皿にストリークした。皿を３７℃でインキュベートし、ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ蛍光イメージャー（ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ、大型、青色ＬＥＤ）及びｉＰｈｏｎｅ（商標）８カメラを使用してイメージングした。
Ｅ．ｃｏｌｉ成長用の９６ウェル寒天プレートの調製
トリプティックソイ寒天（ＢＤカタログ番号２３６９５０）を、製造者の指示に従ってオートクレーブ処理し、５０～６０℃に冷却した。次に、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（以下の貯蔵液で５０ｍＭに調整：ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＢＰ１７５８－１００）、ＭｇＣｌ２（以下の貯蔵液で２０ｍＭに調整：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ９５３０Ｇ）、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（以下の貯蔵液で１％に調整：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号５０－７５１－７０９０）を含む予め滅菌された構成成分を添加した。示される場合、０．５μＭのＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯも含まれていた。９０μＬの寒天混合物を透明底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｎｕｎｃカタログ番号２６５３０１）のウェルにピペッティングし、固化させ、次に、プレートを光学的に透明なフィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３０６３１１）で密封し、４℃で保存し、光から保護した。
９６ウェルプレートでのＥ．ｃｏｌｉの成長及びイメージング
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）培養物を、トリプシン大豆ブロス（ＢＤカタログ番号２１１８２５）中、３００～４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。１，０００細胞／μＬ～０．１細胞／μＬに希釈し、寒天混合物を含有する９６ウェルプレートのウェルにピペッティングした（１０μＬ／ウェル）。プレートを３７℃でインキュベートし、ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ蛍光イメージャー（ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ、大型、青色ＬＥＤ）及びｉＰｈｏｎｅ（商標）８カメラを使用してイメージングし、さらに、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、蛍光も同時に測定した。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの成長用の６０ｍｍの寒天ペトリ皿の調製
トリプティックソイ寒天（ＢＤカタログ番号２３６９５０）を、製造者の指示に従ってオートクレーブ処理し、５０～６０℃に冷却した。次に、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（以下の貯蔵液で５０ｍＭに調整：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＢＰ１７５８－１００）及びＭｇＣｌ２（以下の貯蔵液で２０ｍＭに調整：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ９５３０Ｇ）を含む事前滅菌済み構成成分を添加し、得られた混合物を６０ｍｍのペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４３０５８９）に注いだ。示される場合に、０．５μＭのＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯ及び２μｇ／ｍＬのコリスチン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒカタログ番号ＡＡＪ６７４１５ＸＦ）も含まれていた。寒天混合物を固化させた。次に、ペトリ皿をパラフィルム（Ｂｅｍｉｓカタログ番号９９９）で密封し、４℃で保存し、光から保護した。
ペトリ皿でのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの成長及びイメージング
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）１２３４４）培養物を、トリプシン大豆ブロス（ＢＤカタログ番号２１１８２５）中、３００～４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。１０，０００細胞／μＬに希釈し、１μＬの較正された白金耳（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄカタログ番号２２３６３６０１）を用いて寒天ペトリ皿にストリークした。皿を３７℃でインキュベートし、ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ蛍光イメージャー（ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ、大型、青色ＬＥＤ）及びｉＰｈｏｎｅ（商標）８カメラを使用してイメージングした。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの成長用の９６ウェル寒天プレートの調製
トリプティックソイ寒天（ＢＤカタログ番号２３６９５０）を、製造者の指示に従ってオートクレーブ処理し、５０～６０℃に冷却した。次に、トリス－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（以下の貯蔵液で５０ｍＭに調整：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＢＰ１７５８－１００）及びＭｇＣｌ２（以下の貯蔵液で２０ｍＭに調整：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号ＡＭ９５３０Ｇ）を含む事前滅菌済み構成成分を添加した。示される場合に、０．５μＭのＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯ及び２μｇ／ｍＬのコリスチン（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒカタログ番号ＡＡＪ６７４１５ＸＦ）も含まれていた。９０μＬの寒天混合物を透明底９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｎｕｎｃカタログ番号２６５３０１）のウェルにピペッティングし、固化させた。次に、プレートを光学的に透明なフィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３０６３１１）で密封し、４℃で保存し、光から保護した。
９６ウェルプレートでのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの成長及びイメージング
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）１２３４４（商標））培養物をトリプシン大豆ブロス（ＢＤカタログ番号２１１８２５）中、３００～４００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。１，０００細胞／μＬ～０．１細胞／μＬへの希釈を調製し、寒天混合物を含有する９６ウェルプレートのウェルにピペッティングした（１０μＬ／ウェル）。プレートを３７℃でインキュベートし、ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ蛍光イメージャー（ＩＯ－Ｒｏｄｅｏ、大型、青色ＬＥＤ）及びｉＰｈｏｎｅ（商標）８カメラでイメージングし、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて、蛍光も同時に測定した。
蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブ
アイオワ州コーラルビルのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）が、オリゴヌクレオチドプローブを合成及びＨＰＬＣ精製した。プローブは、ＡｔｔｏＰｏｌｙ Ｔ ４ｍｅｒ：５’－ＡＴＴＯ４８８－ＴＴＴＴ－ＺＥＮ－ＲＱＳｐ－３’；及びＳｅｌｆ－Ｈｙｂ ＡＴＴＯ：５’－ＡＴＴＯ４８８－ｆＣ－ｆＵ－ｆＡ－ｆＣ－ｆＧ－ｆＵ－ｆＡ－ｆＧ－ＺＥＮ－ＲＱＳｐ－３’（ＡＴＴＯ４８８は、Ａｔｔｏ４８８フルオロフォア（ＡＴＴＯ－ＴＥＣＧｍｂＨ、独国ジーゲン）であり、ＺＥＮは、ＺＥＮ蛍光消光剤（ＩＤＴ）であり、ＲＱＳｐは、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ蛍光消光剤（ＩＤＴ、スペーサーアームで結合している）である）で構成されていた。ヌクレオチドは、以下のように表される：Ｔは、デオキシチミジンであり、ｆＣは、２’－フルオロ修飾Ｃであり、ｆＵは、２’－フルオロ修飾Ｕであり、ｆＡは、２’－フルオロ修飾Ａであり、ｆＧは、２’－フルオロ修飾Ｇである。
実施例２：蛍光寒天を使用して細菌を検出するための方法
寒天成長培地での標的細菌種の成長を検出するために、２つの蛍光測定フォーマットを使用した。青色光を発するＬＥＤトランスイルミネーター（ＩＯＲｏｄｅｏ）に、６０ｍｍの皿に注がれた寒天培地、または９６ウェル透明底プレートのウェルに分配された寒天培地を配置した。ＬＥＤ発光を遮断するためにプレートまたは皿の上に、光フィルターを配置したが、フィルターは、依然として、ｉＰｈｏｎｅ（商標）カメラでキャプチャされる緑色光を通過させることが可能である。ＬＥＤの青色光が、オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＴＴＯ４８８）に含まれるフルオロフォアを効率的に励起し得、これにより、緑色発光がもたらされるので、この構成は、標的フルオロフォアを測定して、オリゴヌクレオチドプローブのヌクレアーゼ媒介性切断を示す手段を提供する。緑色蛍光用に調整された蛍光フィルターを使用するＢｉｏ－Ｔｅｋ蛍光プレートリーダーを用いて、９６ウェルプレートの蛍光も測定して、定量データを得た。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの分泌ヌクレアーゼであるミクロコッカスヌクレアーゼに応答するポリデオキシチミジンプローブが埋め込まれた寒天培地により、プレーティングから８時間以内のＳ．ａｕｒｅｕｓコロニーの強力な検出が可能となった（図１Ｃ、左パネル）。対照的に、特異性を制御するために含まれていたＥ．ｃｏｌｉ及びＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓは、この初期の時点では蛍光を発せず、後の時点では低レベルの蛍光のみ発した。これは、細菌自体の自家蛍光に起因する可能性がある。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのコロニーと共局在する蛍光の上昇に加えて、示された２０．５時間後の時点で、蛍光の上昇は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓがストリークされたプレートの四半部の全体にわたって拡散パターンで目に見える（図１Ｃ、右パネル）。従って、プローブが埋め込まれた寒天により、蛍光プレートイメージングとともに、早ければプレート接種の８時間後に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの特異的検出が可能になる。対照的に、市販の発色性寒天であるＳＡＳｅｌｅｃｔは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを検出するためにさらに数時間を要した（図１Ｂ）。
本発明者らは、９６ウェルプレートフォーマットのこのＳ．ａｕｒｅｕｓ応答性蛍光寒天も評価した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの負荷が低いと、８時間以内に強力な蛍光シグナルが生成された（図２）。Ｅ．ｃｏｌｉもＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓも８時間以内に実質的な蛍光発生を生じなかったので、蛍光寒天は、再度、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して特異性を示した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの１細胞／ウェルの希釈液の蛍光は、この希釈液が８時間でプレーティングされた３つのウェルのうち２つで上昇した（図２、中央及び下のパネルを参照；注記：グラフに使用されるスケールのために、この上昇は、図２の上のパネルであまり明らかではない）。バクテリアを約１細胞／ウェルに希釈すると、バクテリアのランダム分布のために、細胞がないウェルが時折得られる。実に、この低濃度のＳ．ａｕｒｅｕｓでプレーティングされた個々のウェルの蛍光を綿密に調べると、一晩のインキュベーション後でも蛍光を発生しないウェルが時折明らかになっている。１細胞／ウェルのＳ．ａｕｒｅｕｓ希釈液でプレーティングされた３つのウェルのうち２つは、一晩のインキュベーション後に蛍光の上昇を呈した（図２、下のパネル）。これらは、８時間の時点で蛍光の上昇を示したのと同じ２つのウェルである（図２の矢印、中央及び下のパネルを参照）。これらの結果は、ストリークされたペトリ皿の結果（図１）とともに、本明細書に記載の方法が、８時間以内にＳ．ａｕｒｅｕｓの非常に低い細菌負荷（おそらく１ＣＦＵ）を検出することができるという結論をサポートする。メチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）の迅速な検出を可能にするのに加えて、本方法は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）の迅速な検出にも効果的であった（図３～５）。ＭＲＳＡの検出は、プローブに加えて、寒天にセフォキシチンを用いることにより可能になった（すなわち、ＭＲＳＡ対ＭＳＳＡの成長を分離する確立された手段）（図４及び５）。図４及び５に示すように、ＭＲＳＡは、早ければ、このアプローチで接種した８時間後に特異的に検出することができる。これらの結果に基づいて、この蛍光寒天は、収集から８時間以内に鼻腔スワブ検体のＭＲＳＡスクリーニングを可能にすることが予想される。通常のＭＲＳＡスクリーニングに現在使用される発色性培地のものとほぼ同じ方法で、この培地を臨床ワークフローに組み込むと、ＭＲＳＡのより迅速な検出が可能になることが、本明細書では想定される。培地により可能になり得る追加の用途は、陽性の血液培養におけるＭＳＳＡ／ＭＲＳＡの安価で迅速な同定である。このアプローチは、単純、使いやすさ、及びコストで、特に、先進国ならびに低及び中所得国の資源の乏しい環境では、より高価で技術的に要求の厳しい分子法の魅力的な代替手段となり得る。
全ての生物がヌクレアーゼを発現するので、追加の細菌種のヌクレアーゼベースの検出は、理論上は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓで実証されるアプローチを用いて実施することもできる。Ｅ．ｃｏｌｉは、もう１つの影響の大きい細菌性病原体であり、多くの追加の関連病原性細菌種を含む腸内細菌科ファミリーのメンバーである。このファミリーで十分に保存されるヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼＩにより効率的に消化される蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ及び腸内細菌科の他のメンバーを検出する手段を、本発明者らは開発した。本明細書では、エンドヌクレアーゼＩ応答性プローブと組み合わせる時、インキュベーションから８～１０時間以内にＥ．ｃｏｌｉ（対Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の特異的な検出を可能にする寒天培地製剤を、本発明者らは開発した（図６）。
図７（細菌が寒天プレート上にストリーク）及び図８（細菌が９６ウェルプレートの寒天に添加）に示されるように、影響の大きいグラム陽性細菌病原体であるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを、ヌクレアーゼ活性化寒天で検出することもできる。図７では、プローブが埋め込まれたプレートの蛍光は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓがストリークされる側でのみ上昇し、プローブを含まない対照プレートの蛍光は、バクテリアでストリークされていないプローブが埋め込まれたプレートの側面と同様に低くなる。図８の実験は、９６ウェルプレートフォーマットでのＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの定量的検出を示しており、実験の２０時間の時間経過にわたって細菌負荷に応じてシグナルが発生する。加えて、本実験は、ほとんどのグラム陰性菌種の成長を妨げる抗生物質であるコリスチンと、プローブベースの検出を組み合わせる可能性を示す。本明細書で使用されるヌクレアーゼプローブは、Ｅ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性菌種のヌクレアーゼに応答するが、コリスチンを含めることで、これらの種の成長を排除する簡単で確立された手段が提供され、それにより、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの特異的検出が可能になる。
実施例３：蛍光寒天を使用する利点
鼻腔スワブのＭＳＳＡ／ＭＲＳＡスクリーニングは、外科的処置前に、患者にこれらの生物が定着しているかどうかを判断するために広く使用される。
Ｅ．ｃｏｌｉ及び関連細菌種の検出は、尿路感染症を診断する過程で日常的に実行される。カルバペネム耐性生物を選択する抗生物質と、腸内細菌科（Ｅ．ｃｏｌｉは、この細菌ファミリーのメンバーである）のプローブを組み合わせると、カルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）の特異的検出が可能になり得る。腸内細菌科ファミリーの様々なメンバーが、本明細書でＥ．ｃｏｌｉを検出するために使用するプローブに応答することを、本発明者らは以前に示している（例えば、Ｆｌｅｎｋｅｒ，Ｋａｔｉｅ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．“Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｔｒａｃｔ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５．６（２０１７）：１３５３－１３６２．を参照）。従って、寒天培地との関連でＥ．ｃｏｌｉを検出する際のこのプローブの機能は、ほとんどの腸内細菌科に拡張可能であると予想され、ＣＲＥの検出を可能にし得る。肛門周囲スワブなどの様々な試料のＣＲＥスクリーニングは、多くの医療設定で日常的である。
蛍光寒天によるＭＳＳＡ／ＭＲＳＡ及びＣＲＥの迅速な検出は、陽性の血液培養におけるこれらの病原体の迅速な同定も可能にし得る。本蛍光寒天法は、これらのプレートのコストが低いので、低リソース設定での陽性血液培養に特に有用であろう。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）は、多くの場合、連鎖球菌性咽頭炎を引き起こし、頻繁に、咽頭スワブでスクリーニングされる。高価な（＄３０～＄５０）分子試験は、約２時間でこの種の存在を判断するために使用することができる。１８～２４時間というはるかに長いターンアラウンドタイムにもかかわらず、発色性寒天などのより安価な培養ベースの方法が多くの場合使用される。比較的低コストであるが、所要時間が短い単純な方法は、現在の培養ベースの方法の魅力的な代替手段であり得る。
等価物
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載したが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変型、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
当業者であれば、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態の多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、本明細書に全体が参照により組み込まれる。

Claims (68)

  1. 試料中の微生物を検出するための方法であって、
    目的の微生物の成長をサポートする培養基質を提供すること、を含み、前記培養基質が、１つ以上の抗菌薬と、エンドヌクレアーゼ切断時に蛍光シグナルを発する核酸プローブを含む、さらに、前記方法が、
    前記培養基質を前記試料と接触させること、及び、前記培養基質を一定時間インキュベートして、前記目的の微生物の成長を可能にすること、ならびに
    前記培養基質またはその一部における蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルを検出すること、を含み、バックグラウンドまたは対照よりも大きい蛍光シグナルの検出が、前記目的の微生物の存在を示す、前記方法。
  2. 前記蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルが、インキュベーションの約１５時間以内に検出される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルが、インキュベーションの約１２時間以内に検出される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記蛍光シグナルの存在、非存在、またはレベルが、インキュベーションの約１０時間以内、約８時間以内、もしくは約６時間以内、インキュベーションの約４時間以内、または約２時間以内に検出される、請求項２に記載の方法。
  5. 前記培養基質が、寒天含有成長培地を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記蛍光シグナルが、分光蛍光光度計；マイクロプレートリーダー；蛍光顕微鏡；蛍光スキャナー；フローサイトメーター；蛍光ゲルイメージングデバイス；トランスイルミネーター、光フィルター、及びカメラの組み合わせ；または他の蛍光イメージングデバイスを使用して検出される、請求項５に記載の方法。
  7. さらに、蛍光コロニーを視覚化すること、及び、コロニーを定量化すること、を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記蛍光プローブが、
    少なくとも１つのエンドヌクレアーゼ切断部位を含む２～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、
    前記オリゴヌクレオチドに結合している少なくとも１つの蛍光消光剤、
    前記オリゴヌクレオチドに結合している少なくとも１つのフルオロフォア、を含み、
    前記フルオロフォア及び蛍光消光剤が、前記エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接している、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記微生物のエンドヌクレアーゼによる切断が、前記フルオロフォアを前記蛍光消光剤から分離して、前記蛍光シグナルの生成を可能にする、請求項８に記載の方法。
  10. 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上のピリミジンを含み、前記オリゴヌクレオチドの前記ピリミジンの少なくとも１つが、化学的に修飾されている、請求項８に記載の方法。
  11. 前記ピリミジンの１つ以上が、２’－Ｏ－メチル修飾されている、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ピリミジンの１つ以上が、２’－フルオロ修飾されている、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上のプリンを含み、前記オリゴヌクレオチドの前記プリンの少なくとも１つが、化学的に修飾されている、請求項８に記載の方法。
  14. 前記プリンの１つ以上が、２’－Ｏ－メチル修飾されている、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記プリンの１つ以上が、２’－フルオロ修飾されている、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記プローブが、完全に自己相補的であって、二本鎖核酸を生じる２つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
  17. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む、請求項８に記載の方法。
  18. 前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
  19. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
  20. 前記オリゴヌクレオチドが、ポリデオキシチミジン配列を含み、任意に、ＴＴＴＴ配列、またはＰ２＆３ ＴＴプローブである、請求項８に記載の方法。
  21. 前記目的の微生物が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓである、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記抗菌薬が、セフォキシチンであり、蛍光シグナルが、ＭＲＳＡの存在を示す、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記試料が、鼻腔スワブである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記オリゴヌクレオチドが、ｆＣｆＵｆＡｆＣｆＧｆＵｆＡｆＧ配列またはｆＵｆＵｆＵｆＡｆＵｆＧｆＣｆＡｆＵｆＡｆＡｆＡ配列を含み、ｆが、２’フルオロを示す、請求項８に記載の方法。
  25. 前記目的の微生物が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記培養基質が、コリスチンを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記試料が、咽頭スワブである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記蛍光プローブが、エンドヌクレアーゼＩ応答性プローブであり、任意に、ＣＴＡＣＧＴＡＧ、ｆＵｆＵｆＵｆＡｆＵｆＧｆＣｆＡｆＵｆＡｆＡｆＡ、及びｆＣｆＵｆＡｆＣｆＧｆＵｆＡｆＧから選択されるオリゴヌクレオチド配列を含み、ｆが、２’フルオロを示す、請求項８に記載の方法。
  29. 前記培養基質が、カルバペネムを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記目的の微生物が、エンドヌクレアーゼを分泌する、請求項１に記載の方法。
  31. 前記目的の微生物が、病原性細菌であり、任意に、グラム陽性またはグラム陰性である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記目的の微生物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ （ＭＲＳＡ）、及びメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）から選択される、請求項３０に記載の方法。
  33. 前記試料が、生物試料である、請求項１に記載の方法。
  34. 前記生物試料が、対象から得られる、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記生物試料が、血液試料、血漿試料、尿試料、鼻孔スワブ、咽頭スワブ、便試料、唾液試料、組織試料、毛髪試料、皮膚試料、皮膚スワブ、気管支吸引物試料、気管支洗浄試料、肛門周囲スワブ試料、滑液試料、脳脊髄液試料、血液培養試料、細菌培養分離株試料、尿培養試料、及び外科的生検試料から選択される、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記少なくとも１つのフルオロフォアが、表２に記載のフルオロフォアから選択される、請求項８に記載の方法。
  37. 前記少なくとも１つの蛍光消光剤が、表３に記載の蛍光消光剤から選択される、請求項８に記載の方法。
  38. 前記少なくとも１つのフルオロフォアが、近赤外範囲の発光を有する、請求項８に記載の方法。
  39. 前記少なくとも１つのフルオロフォアが、ＡＴＴＯ４８８である、請求項８に記載の方法。
  40. 前記少なくとも１つの蛍光消光剤が、ＺＥＮ蛍光消光剤またはＩｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ蛍光消光剤（ＲＱＳｐ）である、請求項８に記載の方法。
  41. 前記フルオロフォアが、ＡＴＴＯ４８８フルオロフォアであり、前記蛍光消光剤が、ＺＥＮ及び／またはＲＱＳｐである、請求項８に記載の方法。
  42. さらに、
    ａ）前記試料が接触していない前記培養基質の一部、または
    ｂ）前記核酸プローブを含まない対照培養基質、
    のうちの１つ以上の対照蛍光シグナルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  43. さらに、前記対照蛍光シグナルを前記蛍光シグナルと比較するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記抗菌薬が、セフトリアキソン、セフェピメ、Ｖａｂｏｍｅｒｅ、Ａｖｙｃａｚ、トリメトプリム及びスルファメトキサゾール、ストレプトマイシン、ホスホマイシン、シプロフロキサシン、アジスロマイシン、アモキシシリン、ベータラクタム、メチシリン、オキサシリン、セフォキシチン、ペナム、セファム、モノバクタム、カルバペネム、メロペネム、エルタペネム、イミペネム、セファロスポリン、セファマイシン、β－ラクタマーゼ阻害薬、コリスチン、ペニシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、セフタジジム、レボフロキサシン、リネゾリド、ダプトマイシン、セフタロリン、アンホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、リモシジン、アゾール、イミダゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、トリアゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール、チアゾール、アバフンギム（Ａｂａｆｕｎｇｉｍ）、アリルアミン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、エキノカンジン、アニデュラファンギン、カスポファンギン、及びミカファンギンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  45. さらに、核酸プローブによる吸収に適する光で前記培養基質を照射するステップ、及び、前記発せられた蛍光シグナルを検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
  46. さらに、個々の蛍光コロニーを計数することを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 目的の微生物を検出するためのヌクレアーゼ活性化可能な培養基質であって、
    寒天含有成長培地、
    １つ以上の抗菌薬、及び
    エンドヌクレアーゼ切断時に蛍光シグナルを発する核酸プローブを含み、
    前記ヌクレアーゼ活性化可能な培養基質が、抗菌薬耐性微生物の成長をサポートすることが可能である、前記ヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  48. 前記核酸プローブが、
    ２～３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、
    前記オリゴヌクレオチドに作動可能に結合している少なくとも１つのフルオロフォア、及び
    前記オリゴヌクレオチドに作動可能に結合している少なくとも１つの蛍光消光剤
    を含み、
    前記オリゴヌクレオチドが、前記目的の微生物のエンドヌクレアーゼによる特異的切断が可能である、請求項４７に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  49. 前記エンドヌクレアーゼによる前記特異的切断が、前記フルオロフォアを前記蛍光消光剤から分離して、前記試験蛍光シグナルの生成を可能にする、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  50. 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上のピリミジンを含み、前記オリゴヌクレオチドの前記ピリミジンの少なくとも１つが、化学的に修飾されている、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  51. 前記ピリミジンの１つ以上が、２’－Ｏ－メチル修飾されている、請求項５０に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  52. 前記ピリミジンのうちの１つ以上が、２’－フルオロ修飾されている、請求項５０に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  53. 前記オリゴヌクレオチドが、１つ以上のプリンを含み、前記オリゴヌクレオチドの前記プリンの少なくとも１つが、化学的に修飾されている、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  54. 前記プリンの１つ以上が、２’－Ｏ－メチル修飾されている、請求項５３に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  55. 前記プリンの１つ以上が、２’－フルオロ修飾されている、請求項５３に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  56. 前記プローブが、完全に自己相補的であって、二本鎖核酸を生じる２つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  57. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  58. 前記オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡを含む、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  59. 前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを含む、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  60. 前記オリゴヌクレオチドが、ポリデオキシチミジン配列を含む、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  61. 前記オリゴヌクレオチドが、ＴＴＴＴ配列を含み、前記培養基質が、任意にセフォキシチンを含む、請求項６０に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  62. 前記オリゴヌクレオチドが、ｆＣ－ｆＵ－ｆＡ－ｆＣ－ｆＧ－ｆＵ－ｆＡ－ｆＧを含み、ｆが、２’－フルオロであり、前記培養基質が、任意に、コリスチンを含む、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  63. 前記オリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼＩ応答性プローブであり、前記培養基質が、任意に、カルバペネムを含む、請求項４８記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  64. 前記蛍光プローブが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、及びメチシリン感受性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）から選択される１つ以上の微生物に由来するエンドヌクレアーゼにより特異的に切断され得る、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  65. 前記蛍光プローブが、腸内細菌科またはＥ．ｃｏｌｉに由来するエンドヌクレアーゼにより特異的に切断され得る、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  66. 前記蛍光プローブが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに由来するエンドヌクレアーゼにより特異的に切断され得る、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  67. 前記蛍光プローブが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するエンドヌクレアーゼにより特異的に切断され得る、請求項４８に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
  68. さらに、セフトリアキソン、セフェピメ、Ｖａｂｏｍｅｒｅ、Ａｖｙｃａｚ、トリメトプリム及びスルファメトキサゾール、ストレプトマイシン、ホスホマイシン、シプロフロキサシン、アジスロマイシン、アモキシシリン、ベータラクタム、メチシリン、オキサシリン、セフォキシチン、ペナム、セファム、モノバクタム、カルバペネム、メロペネム、エルタペネム、イミペネム、セファロスポリン、セファマイシン、β－ラクタマーゼ阻害薬、コリスチン、ペニシリン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、セフタジジム、レボフロキサシン、リネゾリド、ダプトマイシン、セフタロリン、アンホテリシンＢ、カンジシジン、フィリピン、ハマイシン、ナタマイシン、ナイスタチン、リモシジン、アゾール、イミダゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、トリアゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、ボリコナゾール、チアゾール、アバフンギム（Ａｂａｆｕｎｇｉｍ）、アリルアミン、アモロルフィン、ブテナフィン、ナフチフィン、テルビナフィン、エキノカンジン、アニデュラファンギン、カスポファンギン、及びミカファンギンからなる群より選択される抗菌薬を含む、請求項４７に記載のヌクレアーゼ活性化可能な培養基質。
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