CN104502317B - 用于在固体或半固体介质上表征微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用内荧光(IF)测量结果在固体介质或半固体介质上扫描、检测和监测微生物的方法和系统。该方法进一步涉及利用微生物特有的内荧光(IF)测量结果在固体或半固体介质上检测、表征和/或鉴定微生物。

Description

用于在固体或半固体介质上表征微生物的方法

本申请是申请日为2009年12月15日，申请号为200980156509.2，发明名称为“用于在固体或半固体介质上表征微生物的方法”的申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2008年12月16日提交的标题为“Methods for Characterization ofMicroorganisms on Solid or Semi-Solid Media(用于在固体或半固体介质上表征微生物的方法)”、编号为61/122,925的美国临时专利申请的权益，其被并入本文。

发明领域

本发明涉及用于在固体或半固体介质上检测、监测、表征、和/或鉴定微生物的方法和系统。

发明背景

为了临床诊断目的而分离出来的微生物以及用以监测食品、医疗组织 (medicaltissues)或环境的污染而分离出来的那些微生物通常需要被表征，以确定适当的反应来应对所发现的生物的存在。传统的自动化表型鉴定分析法，例如Phoenix^TM、和系统，或者例如API的人工表型试验，要求微生物处于适当的生长阶段且无干扰介质和血液制品，以提供稳健的结果。这些系统使用在铺板的介质上生长16－24小时的菌落，之后从所述菌落制备标准化悬浮液，随后实际的表征试验要求进一步孵育4－24小时来完成。

光学光谱学方法例如内荧光(intrinsic fluorescence，IF)、红外光谱 (FTIR)或拉曼光谱具有允许非常快速地鉴定微生物的潜能，但是仅被证明对“洁净的”微生物悬浮液起作用。出版物已经描述了用于微生物表征的IF法，其仅适用于有限的生物组，或其要求另外的测量例如特异性结合事件以满足功能性表征。由于介质自身对分光镜图案(pattern)的假定的大量影响，直接检查生长介质上的微生物被认为是存在问题的。

本发明通过提供以下方法克服了现有技术中的问题，所述方法能够对在荧光的固体和/或半固体生长介质、包括高荧光介质上直接进行分光镜探测(interrogate)的微生物进行区分。

发明概述

本发明提供用于在固体和/或半固体介质上检测、监测、表征、和/或鉴定微生物的方法。表征包括广泛的微生物的分类或分级，以及单一物种的实际鉴定。如本文所用，“鉴定”是指测定先前未知的微生物属于哪一科、属、种、和/或菌株。例如，鉴定一个先前未知的微生物到科、属、种、和/或菌株级别。本文公开的方法允许微生物的检测、表征和/或鉴定比先前技术更快速，促成了更快速的诊断(例如，在感染或疑似感染的受试者中)和受污染材料的鉴定(例如，食品和药品)。包括在本发明方法中的步骤可以在短时帧内执行，以产生临床相关的可操作的信息。在某些实施方式中，快速生长的生物可以仅在数小时内检测和鉴定。较慢生长的生物可以比先前技术更快速地检测和鉴定，在有用的时帧内提供结果。单独的鉴定/表征步骤可以在几分钟或更少时间内执行。该方法也允许同时(例如，在混合培养物中)检测、监测、表征、和/或鉴定多种类型的微生物(例如，不同的纲和/或种)。有益地，在一些实施方式中，本发明的方法可以原位完成，而不用破坏菌落，由此保存了所述菌落进行进一步的试验或使用。另外，本发明的方法可以部分或完全自动化，由此降低了操作传染性材料的风险和/或污染样品的风险。

本发明的第一方面涉及在固体或半固体介质上表征和/或鉴定微生物的方法，包括：

(a)在固体或半固体介质上探测一个或多个菌落以生成菌落中的微生物特有的内荧光(IF)测量结果；和

(b)基于内荧光(IF)测量结果表征和/或鉴定菌落中的微生物。

在一些实施方式中，其中所述菌落可以是具有小于50μm的直径的微菌落。

在一些实施方式中，其中，可以在探测步骤(a)之前，使已知含有或疑似含有微生物的样品在所述固体或半固体介质上生长，以生成至少一个菌落。

在一些实施方式中，其中所述探测步骤可以是非侵入性的。

在一些实施方式中，其中所述微生物可被表征到一个或多个分类模型，所述分类模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组、和天然内荧光组组成的组。

在一些实施方式中，其中所述微生物可被鉴定到属级别、种级别、或菌株级别。

在一些实施方式中，其中所述IF测量结果可通过光谱法产生，并且所述光谱法包括测定激发－发射矩阵(EEM)。优选地，其中可将所述EEM 与已知微生物的EEM的数据库相比较。优选地，其中所述EEM可包括至少2个不同的波长对。优选地，其中所述EEM可使用多变量分析进行比较。

在一些实施方式中，所述方法还可包括添加鉴定剂到所述介质或样品中，并且其中所述鉴定部分地基于所述鉴定剂在所述菌落或从所述菌落回收的微生物中的存在和/或数量。优选地，其中所述鉴定剂可以是亲和配体、抗体或其片段、核酸探针、抗生素、适体、肽模拟物、噬菌体来源的结合蛋白、凝集素、宿主防御肽、细菌素、噬菌体、染料，或其任何组合。

在一些实施方式中，其中所述固体或半固体介质可包括一种或多种对所述微生物的生长有用的营养素以及一种或多种添加剂，其中所述一种或多种添加剂增强在所述固体或半固体介质上的所述微生物菌落的所述内荧光测量结果。优选地，其中所述一种或多种添加剂可选自由以下组成的组：蛋白质水解产物、氨基酸、肉类和蔬菜提取物、糖源、缓冲剂、复苏剂、生长因子、酶辅因子、矿物盐、金属补充物、还原化合物、螯合剂、光敏化剂、猝灭剂、还原剂、氧化剂、洗涤剂、表面活性剂、消毒剂、选择剂和代谢抑制剂。

在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量落射荧光。

在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量反射光。

本发明的另一方面涉及在固体或半固体介质上检测和鉴定微生物的方法，包括：

(a)扫描已知含有或可能含有一个或多个微生物菌落的介质以定位存在于介质上的所述菌落；

(b)探测一个或多个步骤(a)中定位的菌落以生成所述菌落中的微生物特有的内荧光(IF)测量结果；和

(c)基于所述内荧光(IF)测量结果检测、表征和/或鉴定菌落中的微生物。

本发明的另一方面涉及表征和/或鉴定样品中微生物的方法，包括：

(a)使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长，以产生至少一个菌落；

(b)探测介质上一个或多个菌落，以生成微生物特有的内荧光(IF) 测量结果；和

(c)基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。

本发明的另一方面涉及检测样品中存在的微生物的方法，包括：

(a)获得已知含有或可能含有微生物的样品；

(b)使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长；和

(c)通过进行所述固体或半固体介质的逐点扫描以生成内荧光(IF) 测量结果，定位存在于介质上的任一菌落；其中，如通过生成的测量结果定位的一个或多个菌落的存在表明在样品中存在微生物。

在一些实施方式中，其中所述IF测量结果可通过光谱法产生，并且所述光谱法包括测定激发－发射矩阵(EEM)。优选地，其中所述EEM可包括至少2个不同的波长对。

在一个实施方式中，本发明涉及用于在固体或半固体介质上检测、表征和/或鉴定微生物的系统，该系统包括分光光度计和聚焦光学部件 (focusing optics)，例如透镜系统或显微镜。在其他实施方式中，该系统还包括用于扫描介质表面的机械装置和/或用于控制介质的环境(例如，孵育介质的环境)的机械装置。

在另一个实施方式中，可以探测菌落以产生测量结果，该测量结果可以用于检测、表征和/或鉴定该菌落的微生物(例如，可以使用光谱法探测该菌落)。可以通过将所述菌落的测量结果(例如，光谱)与源自已知微生物的相似测量结果(例如，一种或多种光谱)进行比较，来表征和/或鉴定微生物。在另一个实施方式中，可以非侵入性地探测菌落(例如，在密封平板中)。直接(例如，在密封平板中)表征和/或鉴定菌落中含有的微生物而不用进一步处理的能力增强了微生物鉴定的安全性。

在另一个实施方式中，分光镜的探测是基于微生物的内在特性(例如，内荧光)。在另一个实施方式中，分光镜的探测部分上基于从附加试剂获得的信号，该试剂在本发明方法过程中添加，并与特定的微生物或微生物组相互作用。

在另一个实施方式中，所述方法进一步包括回收菌落、重悬浮菌落和执行进一步鉴定和/或表征试验的步骤(例如，耐药性、毒力因子、抗菌谱)。

本发明的另一方面涉及一种在固体或半固体介质上检测和表征微生物的方法，该方法包括：

(a)扫描已知含有或可能含有一个或多个微生物菌落的固体或半固体介质以定位存在于所述介质上的任何菌落；

(b)探测在步骤(a)中定位的一个或多个菌落以生成所述菌落中微生物特有的内荧光(IF)测量结果；和

(c)基于所述内荧光(IF)测量结果表征所述菌落中的微生物。

在一些实施方式中，其中所述扫描可包括对所述固体或半固体介质的表面的逐点扫描。

在一些实施方式中，其中所述菌落可以是具有小于50μm的直径的微菌落。

在一些实施方式中，其中所述探测步骤可以是非侵入性的。优选地，其中所述微生物可被表征到属级别或种级别。

在一些实施方式中，其中所述微生物可被表征到一个或多个分类模型，所述分类模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组、和天然内荧光组组成的组。

在一些实施方式中，其中所述IF测量结果可通过光谱法产生，并且所述光谱法包括测定激发－发射矩阵(EEM)。优选地，其中所述EEM可包括至少2个不同的波长对。优选地，其中可将所述EEM与已知微生物的 EEM的数据库相比较。

在一些实施方式中，所述方法还可包括添加鉴定剂到所述介质或样品中，并且其中所述鉴定部分地基于所述鉴定剂在所述菌落或从所述菌落回收的微生物中的存在和/或数量。优选地，其中所述鉴定剂可以是亲和配体、抗体或其片段、核酸探针、抗生素、适体、肽模拟物、噬菌体来源的结合蛋白、凝集素、宿主防御肽、细菌素、噬菌体、染料，或其任何组合。

在一些实施方式中，其中所述固体或半固体介质可包括一种或多种对所述微生物生长有用的营养素和一种或多种添加剂，其中所述一种或多种添加剂增强在所述固体或半固体介质上的所述微生物菌落的所述内荧光测量结果。优选地，其中所述一种或多种添加剂可选自由以下组成的组：蛋白质水解产物、氨基酸、肉类和蔬菜提取物、糖源、缓冲剂、复苏剂、生长因子、酶辅因子、矿物盐、金属补充物、还原化合物、螯合剂、光敏化剂、猝灭剂、还原剂、氧化剂、洗涤剂、表面活性剂、消毒剂、选择剂和代谢抑制剂。

在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量落射荧光。

在一些实施方式中，其中探测菌落可包括测量反射光。

本发明在本文附图中做更详细的解释，并且给出说明如下。

附图简述

图1A-1D显示了来自未接种的没有膜(A)的血琼脂平板(BAP)或具有置于介质表面上的Pall Metricel Black网格聚醚砜膜(Pall)(B)、 Whatman黑色混合酯膜(WME)(C)或Whatman径迹蚀刻聚碳酸酯黑色膜(WPC)(D)的BAP的光谱。

图2A-2C显示了获自EC3(A)和SA1(B)的BAP之上的WME膜上的菌落的光谱，以及从SA1光谱减去EC3光谱的结果(C)。

图3A-3D显示了获自EC1(A)、SA1(B)、EF1(C)、和PA1(D)的无膜 BAP上的菌落的光谱。

图4A-4F显示了运行F的逐点IF搜寻扫描的三维图，其中高度等于荧光强度。该图显示了取自6h(A)、8h(B)、10h(C)、12h(D)、16h(E)、和24h(F)的测量结果。

图5A-5B显示了24h后源自运行F的BAP的特写图像(A)，和显示相应菌落位点的源自12h的搜寻扫描的荧光强度的等高曲线图(B)。

发明详述

本发明能够以不同形式具体实施，并且不应理解为被本文所述实施方式所限制。另外，提供这些实施方式以使得本公开将是透彻和完整的，以及将完全地将本发明范围传达给本领域技术人员。例如，就一个实施方式阐述的特征可以引入到其他实施方式中，且就一个特定的实施方式阐述的特征可以从该实施方式中删除。另外，针对本文建议的实施方式的多种变化和添加，从本公开文本的角度来说，将对本领域技术人员是明显的，并不背离本发明。

除非另外说明，本文所用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。在此用于描述本发明的术语仅仅是用于描述特定的实施方式的目的，而并非旨在限制本发明。

定义

如本文所用，“一”、“一个”或“该”可指一个或多于一个。例如，“一个”细胞可以指一个单独的细胞或是多个细胞。

另如本文所用，“和/或”是指并且涵盖所列相关事项中的一个或多个的任何和所有可能的组合，以及当二选一说明时的不组合(“或”)。

此外，如本文所用的术语“大约”当涉及可测量的数值时，例如化合物或试剂的量、剂量、时间、温度、等等，意在涵盖指定量的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、或者甚至±0.1％的变化。

如本文所用，术语“微生物”旨在涵盖可以在实验室中繁殖和处理的通常是单细胞的生物，包括但不限于，革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、酵母、霉菌、寄生虫和柔膜体。本发明的革兰氏阴性细菌的非限制性例子包括如下所示的属的细菌：假单胞菌属(Pseudomonas)、埃希杆菌属 (Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、摩根氏菌属(Morganella)、弧菌属(Vibrio)、耶尔森菌属(Yersinia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、募养单胞菌属 (Stenotrophomonas)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、劳尔氏菌属 (Ralstonia)、无色杆菌属(Achromobacter)、梭形杆菌属(Fusobacterium)、普氏菌属(Prevotella)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、奈瑟菌属(Neisseria)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、爱德华菌属(Edwardsiella)、气单胞菌属 (Aeromonas)、莫拉菌属(Moraxella)、布氏菌属(Brucella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、和军团杆菌属 (Legionella)。本发明的革兰氏阳性细菌的非限制性例子包括如下所示的属的细菌：肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属 (Paenibacillus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、丙酸菌属(Propionibacterium)、梭菌属 (Clostridium)、拟杆菌属(Bacteroides)、加德纳菌属(Gardnerella)、库克菌属(Kocuria)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、微球菌属(Micrococcus)、分枝杆菌属(Mycobacteria)和棒状杆菌属(Corynebacteria)。本发明的酵母和霉菌的非限制性例子包括如下所示的属的这些：念珠菌属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、诺卡氏菌属 (Nocardia)、青霉属(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、赤酿母属 (Rhodotorula)、曲霉属(Aspergillus)、梭霉菌属(Fusarium)、酵母属 (Saccharomyces)和毛孢子菌属(Trichosporon)。本发明的寄生虫的非限制性例子包括如下所示的属的这些：锥虫属(Trypanosoma)、巴贝虫属 (Babesia)、利什曼原虫属(Leishmania)、疟原虫属(Plasmodium)、吴策线虫属(Wucheria)、布鲁丝虫属(Brugia)、盘尾属(Onchocerca)、和耐格里原虫属(Naegleria)。本发明的柔膜体的非限制性例子包括如下所示的属的这些：支原体属(Mycoplasma)和脲原体属(Ureaplasma)。

如本文所用，术语“菌落”和“微菌落”指的是彼此紧密靠近的、位于一个表面上的并且是单个祖先微生物通过原位复制产生的克隆后代的大量微生物或微生物的种群。通常，“菌落”对于人类眼睛是可见的，并且通常直径大于约50μm、60μm、80μm、或100μm。然而，如本文所用，除非另外说明，术语“菌落”意在包括具有50μm或以上直径的菌落，以及具有50μm或以下直径的“微菌落”。在其他实施方式中，本发明涉及扫描、检测、表征和/或鉴定“微菌落”中的微生物。如本文所用，“微菌落”可以包括从约2μm到50μm或从约10μm到50μm的范围。“微菌落”通常对于肉眼来说太小而看不到(例如，直径小于约50μm)。

如本文所用，术语“扫描”或“进行扫描”指的是以系统的或预定的模式或随机地搜索预先定义的区域，以定位目标物(例如，微生物菌落)。例如，可通过在一个表面上以系统的或预定的模式或随机地移动集中的光束来“扫描”固体或半固体介质，以检测、定位、或以其他方式侦测微生物菌落。在可替代的实施方式中，固体或半固体介质能够相对于光束以系统的或预定的模式或随机地移动，以检测、定位、或以其他方式侦测微生物菌落。根据该实施方式，光源典型地具有小于约0.5mm、小于约0.2mm 或小于约0.1mm的光束直径。在另一个实施方式中，光束直径从约5μm 到约500μm，从约10μm到约100μm或从约20μm到约80μm。

在一个实施方式中，“进行扫描”可能包括固体或半固体介质的逐点“扫描”。根据该实施方式，光源(例如，激光束)可以移动到固体或半固体介质上的第一点，执行扫描或探测步骤，以检测和/或表征任何可能存在的微生物菌落。可替代地，所述固体或半固体介质可以相对于光源移动，使得对该固体或半固体介质进行逐点扫描。随后，可以移动该光源(例如，激光束)或该固体或半固体介质，使得可以扫描和/或探测介质上的第二点。这种逐点扫描过程可以一直持续，直到完成给定的搜索区域的逐点扫描。该搜索区域可以是该固体或半固体介质(例如，介质平板)的整个表面或其一部分。

在另一个实施方式中，逐点搜索可以沿着线性轨迹(例如，跨过介质的长直线)点到点地执行。随后，光源或介质可以移动到第二线性行，并且沿着第二线性行的线性轨迹进行逐点搜索。这种逐点和逐行搜索模式 (或网格型扫描)可以一直持续，直到完成给定的搜索区域。该搜索区域可以是固体或半固体介质(例如，介质平板)的整个表面或其一部分。在另一个实施方式中，所述扫描是连续扫描(即，连续的逐点扫描)。

本发明提供了用于在固体或半固体介质上检测、监测、表征和/或鉴定微生物的方法。该快速方法允许微生物的检测、表征和/或鉴定比先前技术更快捷，形成更快速的诊断(例如，在感染或疑似感染的受试者中)，受污染材料(例如，食品、供水和药品)的表征和/或鉴定。包括在本发明的方法中的步骤，从获得样品到微生物的表征/鉴定，可以在短时帧内执行，以获得临床相关的可操作信息。在某些实施方式中，本发明方法可以在少于约72小时内执行，例如，少于约18、12、10、9、8、7、6、5、4、3、 2或1小时。在某些实施方式中，鉴定步骤可以在少于60分钟内执行，例如，少于约50、40、30、20、10、5、4、3、2或1分钟。该方法可以用于表征和/或鉴定本文所述的任何微生物。在一个实施方式中，微生物为细菌。在另一个实施方式中，微生物是酵母。在另一个实施方式中，微生物是霉菌。该方法可以用于检测、监测、表征和/或鉴定多种类型的微生物，例如，不同种、属、科、目、纲、门和/或界的微生物。在一个实施方式中，本发明的方法容许例如在混合培养物中表征和/或鉴定样品中存在的某些类型的微生物或所有不同类型的微生物。在其他实施方式中，该方法可以用于表征和/或鉴定两种或多种不同类型的细菌，两种或多种不同类型的酵母，两种或多种不同类型的霉菌，或两种或多种不同类型的细菌、酵母、和/或霉菌的混合物。多种类型微生物中的每一种的检测可以同时或几乎同时发生。另外，本发明的方法可以部分地或完全地自动化，由此降低了操作传染性材料和/或污染样品的风险。

本发明的第一方面涉及在固体或半固体介质上表征和/或鉴定微生物的方法，包括：

(a)在固体或半固体介质上探测一个或多个菌落，以生成菌落中微生物特有的内荧光(IF)测量结果；和

(b)基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。

本发明的另一方面涉及在固体或半固体介质上检测、表征和/或鉴定微生物的方法，包括：

(a)扫描已知含有或可能含有一个或多个微生物菌落的介质以定位存在于介质上的所述菌落；

(b)探测一个或多个步骤(a)中定位的菌落，以生成菌落中微生特有的内荧光(IF)测量结果；和

(c)基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。

本发明的另一方面涉及表征和/或鉴定样品中微生物的方法，包括：

(a)使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长，产生至少一个菌落；

(b)探测介质上的一个或多个菌落，以生成微生物特有的内荧光(IF) 测量结果；和

(c)基于生成的测量结果，表征和/或鉴定菌落中的微生物。

本发明的另一方面涉及检测样品中微生物的存在的方法，包括：

(a)获得已知含有或可能含有微生物的样品；

(b)使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长；和

(c)通过扫描介质生成内荧光(IF)测量结果，定位存在于介质上的任一菌落；

其中，就像生成的测量结果所定位的，一个或多个菌落的存在表明在样品中存在微生物。

可以利用本发明方法试验的样品包括临床和非临床的样品，其中微生物的存在和/或生长是已知的或可疑的，另外还包括接受常规的或临时的试验以确定微生物的存在的材料样品。由于本方法的通用性和/或灵敏度，所用样品的量可以差别很大。样品制备可以按照任何数目的本领域技术人员所知的技术来完成。

可以用于试验的临床样品包括通常在临床实验室和/或研究实验里进行试验的任一类型样品，包括但不限于，血液、血清、血浆、血液成分、关节液、尿液、精液、唾液、排泄物、脑脊液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓抽吸物、骨匀浆、痰、抽吸物、拭子和拭子冲洗物、其他体液、等等。

本发明应用于研究中以及兽医和医疗应用。可以自其获得临床样品的合适的受试者通常为哺乳动物受试者，但是可以是任何动物。如本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于，人类、非人类的灵长类、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗、兔、啮齿类(例如，大鼠或小鼠)等。人类受试者包括新生儿、婴儿、未成年人、成人和老龄受试者。可以自其获得样品的受试者包括但不限于，哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、和鱼类。

可以用于试验的非临床样品包括如下物质，其包括但不限于，食品、饮料、药品、化妆品、水(例如，饮用水、非饮用水、和废水)、海水压载物(seawater ballasts)、空气、土壤、污水、植物材料(例如，种子、叶、茎、根、花、果实)、血液制品(例如，血小板、血清、血浆、白细胞成分，等等)、供体器官或组织样品、生物武器(biowarfare)样品等等。本方法还特别适合实时试验，以监测污染水平、过程控制、质量控制、和工业环境中的其他类似情况。

样品的体积应该足够大，以在介质上铺板时产生一个或多个菌落。适当的体积将依赖于样品的来源和样品中微生物的预期水平。例如，来自感染伤口的临床拭子，应该比待检测污染程度的饮用水样品具有单位体积更高水平的微生物，所以，与饮用水样品相比，将需要较小体积的拭子材料。通常，样品大小可以为至少约50ml，例如，100ml、500ml、1000ml或更多。在其他实施方式中，样品可以少于约50ml，例如，少于约40ml、 30ml、20ml、15ml、10ml、5ml、4ml、3ml、或2ml。在某些实施方式中，样品大小可以为约1ml或更少，例如，约750μl、500μl、250μl、 100μl、50μl、25μl、10μl、5μl、1μl、0.5μl、0.1μl、或更少。对于样品大小较大的实施方式，样品可以使用本领域技术人员熟知的方法来过滤 (例如，经过过滤膜)和/或浓缩(例如，离心、蒸发，等)以减少体积和 /或收集样品中的任何微生物。在过滤膜上收集的微生物可以重悬和置于固体或半固体介质上，或者过滤膜可以直接置于半固体介质上。

待检测的样品被置于合适的介质上，并在有助于微生物生长的条件下孵育。可以基于已知存在于或疑似存在于样品中的微生物的类型来选择介质。对于本领域技术人员来说，不同微生物的合适的生长介质是已知的。生长介质可以是提供合适营养素和限制微生物运动(即，提供集中生长) 的任何介质。在一些实施方式中，介质可以是半固体介质，例如，琼脂、明胶、藻酸盐、角叉菜聚糖、或果胶。合适的介质包括具有本领域技术人员所熟知的不同功能的介质，包括但不限于，通用介质、选择性介质、鉴别性介质、和/或产色介质。可以选择和/或调整介质，以便可得到有意义的测量结果(例如，IF测量结果)。合适的半固体介质的例子包括但不限于：AC琼脂，醋酸杆菌琼脂，吖啶黄－头孢他啶琼脂，放线菌琼脂，放线菌分离琼脂，气单胞菌分离琼脂，厌氧琼脂，厌氧血琼脂，厌氧TVLS 琼脂，APT琼脂，Ashby甘露醇琼脂，曲霉分化琼脂，ASS琼脂，金黄色葡萄球菌琼脂，叠氮血琼脂，B.T.B.乳糖琼脂，杆菌琼脂，贝尔德-帕克琼脂，BiGGY琼脂，胆汁七叶苷琼脂，胆汁七叶苷叠氮琼脂，胆盐亮绿淀粉琼脂，亚硫酸铋琼脂，血琼脂，血琼脂SLMB，BPL琼脂，脑心浸液琼脂，布鲁尔琼脂，亮绿琼脂，亮绿胆汁琼脂，酚红亮绿乳糖蔗糖琼脂， BROLACIN琼脂，BROLACIN MUG琼脂，布氏琼脂，BSM琼脂，缓冲木炭酵母提取物琼脂，酪蛋白钙琼脂，弯曲杆菌选择性琼脂，念珠菌IDENT琼脂，酪蛋白酵母镁琼脂，CASO琼脂，CATC琼脂，蜡样芽孢杆菌选择性琼脂(Cereusselective agar)，溴化十六烷基三甲铵琼脂，查-斯二氏琼脂，中国蓝乳糖琼脂，厚垣孢子琼脂，克氏柠檬酸盐琼脂，克氏尿素琼脂，柠檬酸盐琼脂，CLED琼脂，梭菌琼脂，难辨梭菌琼脂，大肠菌类琼脂，哥伦比亚琼脂，哥伦比亚血琼脂，玉米粉琼脂，蛋白胨酵母玉米粉琼脂，CPC- 琼脂，Cramp琼脂，察氏琼脂，D.T.M.琼脂，戴维斯最小琼脂，DCLS琼脂，脱氧胆酸盐柠檬酸盐琼脂，脱氧核糖核酸酶试验琼脂，DEV远藤琼脂， DEV明胶琼脂，DEV营养琼脂，葡萄糖酪蛋白胨琼脂，葡萄糖淀粉琼脂， DHL琼脂，孟加拉红琼脂(Dichloran rose bengalagar)，白喉毒性琼脂，含甲苯胺的DNA酶试验琼脂，大肠杆菌琼脂，大肠杆菌O157：H7MUG 琼脂，ECC琼脂，ECC选择性琼脂，ECD琼脂，ECD MUG琼脂，EMB 琼脂，远藤琼脂，阪崎肠杆菌琼脂，屎肠球菌琼脂，肠球菌选择性琼脂，七叶苷铁琼脂，艾格琼脂，真菌琼脂，真菌生物琼脂(Fungobiotic agar)，加斯纳琼脂，加斯纳乳糖琼脂，明胶铁培养基，明胶盐琼脂，病菌计数琼脂，葡萄糖溴甲酚紫琼脂，GSP琼脂，Hektoen肠道琼脂，卡那霉素七叶苷叠氮琼脂，Karmali弯曲杆菌琼脂，KF-链球菌琼脂，King琼脂，克雷白氏杆菌选择性琼脂，Kligler琼脂，KRANEP琼脂，Kundrat琼脂，保加利亚乳杆菌琼脂，乳糖TTC琼脂，LB琼脂，Leifson琼脂，列文EMB琼脂，李斯特菌琼脂，李斯特菌单确证琼脂(Listeria mono confirmatory agar)，李斯特菌单鉴别琼脂，李斯特菌选择性琼脂，石蕊乳糖琼脂，LL琼脂， LPM琼脂，LS鉴别琼脂，L－top琼脂，Luria琼脂，赖氨酸精氨酸铁琼脂，赖氨酸铁琼脂，M肠球菌琼脂，M-17琼脂，麦康凯琼脂，含有结晶紫、氯化钠和0.15％胆盐的麦康凯琼脂，麦康凯MUG琼脂，麦康凯山梨醇琼脂，麦芽琼脂，麦芽提取物琼脂，甘露醇盐酚红琼脂，McBride琼脂，McClung Toabe琼脂，M-CP琼脂，肉肝琼脂，膜过滤肠球菌选择性琼脂，膜乳糖葡糖苷酸琼脂，M-远藤琼脂，M-远藤琼脂LES，MeReSa琼脂，M-FC 琼脂，Middlebrook 7H10琼脂，Middlebrook 7H11琼脂，牛奶琼脂，轻型唾液链球菌琼脂(Mitis salivarius agar)，MM琼脂，改良缓冲炭琼脂，MOX 琼脂，MRS琼脂，MS.O157琼脂，M-TEC琼脂，Mueller Hinton琼脂， MUG蛋白胨大豆琼脂，支原体琼脂，诺布尔琼脂，营养琼脂，营养明胶， OF测试营养琼脂，OGY琼脂，OGYE琼脂，桔汁琼脂(Orange serum agar)，牛津琼脂，PALCAM李斯特菌选择性琼脂，五氯孟加拉红酵母提取物琼脂 (Pentachloro rose bengal yeast agar)，蛋白胨酵母提取物琼脂，胨化牛奶琼脂，产气荚膜梭菌琼脂，酚红葡萄糖琼脂，酚红乳糖琼脂，酚红麦芽糖琼脂，酚红蔗糖琼脂，酚红酒石酸盐琼脂，酚酞磷酸盐琼脂，苯丙氨酸琼脂，平板计数琼脂，平板计数MUG琼脂，PLET琼脂，PM指示琼脂，马铃薯葡萄糖琼脂，马铃薯葡萄糖孟加拉红琼脂，马铃薯葡萄糖蔗糖琼脂，甘露醇琼脂，假单胞菌琼脂，R-2A琼脂，Raka-Ray琼脂，快速肠球菌琼脂，强化梭菌琼脂，水稻提取物琼脂，Rogosa琼脂，Rogosa SL琼脂，孟加拉红琼脂，孟加拉红氯霉素琼脂，S.F.P.琼脂，萨氏2％葡萄糖琼脂，萨氏4％葡萄糖琼脂，萨氏葡萄糖琼脂，具有氯霉素的萨氏葡萄糖琼脂，沙门氏菌琼脂，根据的沙门氏菌琼脂，沙门氏菌显色琼脂，SD琼脂，选择琼脂，致病真菌选择性琼脂，SFP琼脂，/LB琼脂，Shapton 琼脂，西蒙斯柠檬酸盐琼脂，脱脂牛奶琼脂，山梨酸琼脂，酒清蓝琼脂， SPS琼脂，SS琼脂，1号标准营养琼脂，葡萄球菌琼脂，链球菌选择性琼脂，嗜热链球菌隔离琼脂，硫酸API琼脂，亚硫酸铁琼脂，TBX琼脂，TCBS 琼脂，TCMG琼脂，-7琼脂，塞耶马丁琼脂，热酸化琼脂(Thermoacidurans agar)，Tinsdale琼脂，番茄汁琼脂，三丁酸甘油酯琼脂，三糖铁琼脂，胰蛋白酶大豆琼脂(tryptic soy agar)，蛋白胨琼脂，蛋白胨葡萄糖提取物琼脂，蛋白胨葡萄糖酵母提取物琼脂，蛋白胨大豆酵母提取物琼脂，蛋白胨酵母提取物琼脂，胰蛋白胨琼脂(Tryptose agar)，TSC琼脂，TSN琼脂，通用啤酒琼脂，UTI琼脂，弧菌琼脂，副溶血性弧菌蔗糖琼脂，紫红胆盐琼脂，紫红胆盐葡萄糖琼脂，紫红胆盐乳糖琼脂，紫红胆盐乳糖葡萄糖琼脂，维生素B₁₂培养琼脂，沃格尔-约翰逊琼脂，VRB MUG 琼脂，Wilkins Chalgren厌氧琼脂，威尔逊布莱尔琼脂，WL鉴别琼脂， WL营养琼脂，麦芽汁琼脂，XLD琼脂，XLT4琼脂，酵母琼脂，酵母提取物琼脂，酵母麦芽琼脂，酵母甘露醇琼脂，耶尔森氏菌隔离琼脂，耶尔森氏菌选择性琼脂，YGC琼脂，YPAD琼脂，YPDG琼脂，YPG琼脂，和 YT琼脂。在一个实施方式中，固体或半固体介质可以进一步包括一种或多种额外的添加剂，所述添加剂增强或另外增大在固体或半固体介质上的微生物菌落的内荧光(IF)测量结果。可以用来增强内荧光的适当的添加剂可以包括一种或多种蛋白质水解产物，氨基酸，肉类和蔬菜提取物，糖源(carbohydratesources)，缓冲剂，复苏剂，生长因子，酶辅因子，矿物盐，金属补充物(metalsupplements)，还原化合物，螯合剂，光敏化剂，猝灭剂，还原剂，氧化剂，洗涤剂，表面活性剂，消毒剂，选择剂(selective agents)，代谢抑制剂，或其组合。

在其他实施方式中，所述介质可以是例如，置于半固体介质的顶部的过滤器(例如，过滤膜或玻璃纤维过滤器)。在其他实施方式中，该过滤器置于材料(例如，吸收垫)的上方，该材料暴露(例如，浸渍)于液体介质。在一些实施方式中，样品(例如，大体积样品)可以穿过过滤器以收集样品中存在的任何微生物。过滤器随后可以置于生长介质的顶部，并在适宜微生物生长的条件下孵育。合适的过滤膜对于本领域技术人员是已知的，并且包括适于收集微生物和/或能够支持微生物生长的任何膜。膜材料的例子包括但不限于，纤维素、混合纤维素酯、硝化纤维素、聚氯乙烯、尼龙、聚四氟乙烯、聚砜、聚醚砜、聚碳酸酯黑和混合酯黑，包括它们的任何组合。过滤器可以具有适于过滤液体和/或收集微生物的孔径，例如，对于酵母为约1μm至约25μm，以及对于细菌为约0.05μm至约2μm，例如约0.2μm至约1μm。

在某些实施方式中，介质可以存在于平板中，例如，标准的微生物琼脂平板。在一些实施方式中，所述平板可以是多孔平板，每个平板具有，例如，2、4、6、8、12、24、32、48、64、96、128、或更多的孔，以检测多个样品。该平板可以由任何适合微生物生长的材料制成，例如，聚苯乙烯或玻璃。任选地，该平板可以有盖子。如果在盖子盖在平板上的时候进行菌落的探测，那么盖子和/或平板可以含有可以透过至少部分紫外光、可见光、和/或近红外光谱的至少一个区域，以容许透过所述盖子和/或平板进行探测。

在本发明的方法中，词组“使样品中存在的微生物在固体或半固体介质上生长”和“位于介质上的样品”包括以任何方式使得样品与介质相接触，以使样品中存在的微生物能够生长并产生菌落。在某些实施方式中，样品位于固体或半固体介质的表面。在其他实施方式中，样品可以与液态的介质相混合，随后使其固化(例如，倾注平板)使得任何生长的菌落嵌入到介质中。在另一个实施方式中，样品可以与脱水介质混合，使得该介质复水化并且随后使其固化。

在一个实施方式中，固体或半固体介质位于容器的底部，该容器含有悬浮在所述介质上面的液体中的微生物。随后，该容器可经过处理(例如，离心)使得微生物位于介质上。之后，可以将液体移除，并孵育介质使得菌落生长。例如，血液样品可以引入到血液培养管，该培养管含有液态生长介质和位于底部的固体或半固体介质。该培养管随后经过离心，使得微生物位于固体或半固体介质上(任选地，在红细胞溶解后)，移除液体，培养微生物，根据本发明方法检测、和/或鉴定。

一旦样品被放置于介质上(例如，利用标准的微生物学技术在介质上涂布液体样品，和/或通过在半固体介质上放置过滤膜)，在适于样品中存在微生物的生长的条件下，对该介质进行孵育。所述适宜条件被本领域技术人员所熟知，并且依赖于具体的微生物和介质。可以在约20℃到约50℃的温度下孵育介质，例如约25℃到约45℃，例如约37℃。孵育时间要足以出现可检测到的菌落(通过视觉或分光镜)，并且依赖于微生物、温度、介质、营养素水平、和其他决定生长率的条件。在一些实施方式中，孵育时间可以约为12小时或更少，例如，约11、10、9、8、7、6、5、4、3、 2、或1小时或更少。在某些实施方式中，例如在缓慢生长条件下或对于缓慢生长的微生物来说(例如，分枝杆菌)，孵育时间可以约为12小时或更多，例如，大约18、24、36、48、或72小时或更多。在一些实施方式中，在培养箱中孵育介质，并且从培养箱中移除介质一次或多次，将介质置于一种装置中来检测和/或鉴定任何在介质上生长的菌落。在其他实施方式中，可以直接在用来检测和/或鉴定菌落的装置中孵育介质，例如，在控温平板支持器(temperature-controlled plate holder)中。

一方面，本发明涉及在固体或半固体介质上探测微生物菌落，以生成鉴定构成该菌落的微生物的IF测量结果。在一个实施方式中，可以通过荧光光谱来探测。探测过程能够以非入侵的方式进行，即，当探测菌落时其可以完整地保留在介质上。在另一个实施方式中，含有介质和菌落的平板在探测过程自始至终都保持密封(例如，不移动盖子)。根据这个实施方式，所述平板，或其部分，可以由透光(例如，近红外光(NIR；700nm-1400 nm)光谱、紫外光(UV；190nm-400nm)光谱和/或可见光(VIS；400nm-700 nm)光谱的至少一部分)的材料组成。合适材料的例子包括但不限于，丙烯酸、甲基丙烯酸酯、石英、熔凝硅石、蓝宝石、环烯烃共聚物(COC)和 /或环烯烃聚合物(COP)(例如(,San Diego,CA))。能够以非入侵方式检测和/或鉴定微生物，任选地加上在鉴定过程自始至终保持平板密封，以及某些或全部操作自动化，这些都降低了处理具有或可能具有传染性和/或危害性的微生物所带来的风险，还降低了污染样品的风险。此外，能够通过直接探测来鉴定微生物，而不用进一步处理片状物(pellet) (例如，悬浮和重铺板(replating)和/或其他鉴定方法)，大大增加了可作出鉴定的速度。在其他实施方式中，菌落可以悬浮于溶液中，并且任选地在探测之前从介质中移除。在另一个实施方式中，在原位探测之后菌落悬浮于溶液中，随后执行进一步探测。可应用于已分离的微生物而不是介质上的微生物的菌落的技术，例如，乳胶凝集试验或自动化表型鉴定试验，可以在悬浮的微生物上执行。

在一些实施方式中，光谱法可以用于分析微生物的内荧光特性，例如，在缺少额外的剂时存在于微生物内的特性，这些额外的剂比如，着色剂 (stain)、染料、结合剂，等等。在其他实施方式中，除了分析IF，光谱法还可以用于分析微生物的一个或多个外在特性，例如，仅仅在有额外的剂的帮助下才能检测的特性。分光镜的探测可以通过本领域技术人员所知的可以有效检测和/或鉴定微生物的一种或多种内在或外在特性的任何技术来完成。例如，前面荧光(front face fluorescence，其中激发光和发射光从同一光学表面进入和离开，如果样品具有通常的光学厚度，那么激发光穿过非常短的距离进入到样品中(参见，例如，Eisinger,J.,和J.Flores, “Front-face fluorometry of liquid samples(液体样品的前面荧光测定),”Anal. Biochem.94:15(1983))可以用于片状物中微生物的鉴定。其他形式的测量，例如，落射荧光(epifluorescence)、反射、吸收、和/或散射测量，也可以用于本发明。

在本发明的一个方面，光谱法通过使用聚焦光学部件例如镜头系统或显微镜装置执行，以容许提供功能性连接到分光光度计(例如，使用纤维光学部件)的紫外、可见光和红外范围的观测。在一个实施方式中，介质 (例如，位于平板内)置于显微镜载物台上，在这里可以通过激发源探测介质以及可视地观察(例如，通过显微镜)探测介质。在一个实施方式中，可以通过移动平板本身或移动附着有平板的显微镜载物台手动操作平板来确定菌落位置以便探测。在另一个实施方式中，显微镜载物台为自动控制的(例如，动力载物台)，以便扫描附着在载物台上的平板(例如，以设计用以覆盖待扫描的整个部分的设置模式)。在另一个实施方式中，当集中光束例如激光扫描整个介质时，介质保持静止，发射光被成像或非成像检测器检测。在另一个实施方式中，显微镜可以包括能控制温度(例如，水浴)的平板培养箱，使得平板可以保持在显微镜下并且在介质孵育过程中进行探测。

在本发明的一方面，激发源直接对准单个菌落，以生成IF测量结果。探测时，菌落可以是任何大小，只要足够大以便形成精确的测量结果。在一个实施方式中，当人眼无法检测时，可以对菌落进行探测。例如，当菌落包括少于约10，000个微生物时，例如，少于约5000、1000、500、400、 300、200、或100个微生物，该菌落可以进行探测。在其他实施方式中，当菌落直径小于约1000μm或在其最长尺度上长度小于约1000μm(如果该菌落不是圆形)时，该菌落可以进行探测。例如，当菌落为约900、800、 700、600、500、400、300、200、100、50、或25μm或更少时，该菌落可以进行探测。在一个实施方式中，激发光束的直径小于待探测的菌落，使得完整光束可以直接落在菌落上，并且介质基本不会干扰IF测量结果。在某些实施方式中，激发光束的直径小于约1000μm，例如，小于约900、 800、700、600、500、400、300、200、100、50、或25μm。激发光束的尺寸，以及发射光束的尺寸是可控的，例如，使用小孔。在某些实施方式中，激发光束直接落在菌落中心。在其他实施方式中，激发光束直接落在菌落的其他部位(例如，在边缘和/或边缘附近)，该部位的微生物与位于菌落中心的微生物相比，可能处于不同的生长和/或新陈代谢状态。在另外的实施方式中，激发光束可以直接落在菌落内的某一特定深度，例如，使用共聚焦显微镜。

菌落的照明源或激发源，可以选自为本领域技术人员所知的任何数量的合适光源。可以使用能产生可用数据的电磁波谱的任何部分。可以使用能够发射紫外光谱、可见光谱和/或近红外光谱的光源，以及电磁光谱的其他部分，这些为本领域技术人员所知。例如，光源可以是连续能谱的灯，比如，生成紫外光的氘或氙弧灯和生成可见/近红外激发的钨卤素灯。如本技术领域所熟知，这些光源提供宽广的发射范围，并且针对特殊的激发波长的光谱带宽可以使用光学干涉过滤器、棱镜和/或光栅来减少。

可替代的，多数窄带光源，例如发光二极管和/或激光，可以空间多路传输以提供多波长的激发源。例如，发光二极管在190nm到超过900nm 是可用的，该源具有20-40nm的谱带宽度(半高全宽)。激光在从紫外到近红外的离散波长中是可用的，并可以用于本领域技术人员熟知的多路方法。

任何光源的光谱选择性可以通过利用光谱区分装置来改善，例如扫描单色器。也可以使用其他的区分方法，如本领域技术人员所熟知的，例如声光可调滤波器、液晶可调滤波器、光学干涉滤波器阵、棱镜摄谱仪，等等，及其任何组合。选择光谱鉴别器要考虑的是调节范围和选择性水平。举例说明，例如，鉴别器可以使用波长范围300-800nm和选择性10nm。这些参数通常决定达到调节范围和选择性而必需的最适宜技术。

通常，光源引起样品激发，随后在预设时间点或连续测量从样品发射的荧光。类似的，可以测量来自激发源和样品的相互作用的反射光，以提供检测和/或表征的有关数据。

来自样品的发射可以通过任何合适的光谱区分装置测量，在某些实施方式中使用分光计。该分光计可以是扫描单色器，其检测特定的发射波长，其中扫描单色器的输出由光电倍增管检测，和/或该分光计可以被配置成摄谱仪，其中输出由图像检测器阵例如电荷耦合器件(CCD)检测器阵检测。在一个实施方式中，鉴别器允许通过光电检测装置(例如光电倍增管、雪崩光电二极管、CCD检测器阵、和/或电子倍增电荷耦合器件(EMCCD) 检测器阵)观察荧光和/或散射信号。

分光镜技术用于获得如下测量结果：所述测量结果被优选提供为激发 -发射矩阵(EEM)测量结果。如本文所用，EEM被定义为荧光物质的发光光谱发射强度，是激发波长和发射波长两者的函数，包括完整光谱或其子集，其中子集可以含有一个或多个激发/发射对。另外，具有固定激发波长的 EEM截面图可以用于显示特定激发波长的发射光谱，具有固定发射波长的 EEM截面图可以用于显示样品的激发光谱。在一个实施方式中，多个EEM 在多于一个的特定激发-发射波长对处被测量，例如，至少在2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20、25、50，或更多特定激发-发射波长对。在某些实施方式中，测量的激发-发射波长对的数量要足以确定精确的微生物的种，例如，约5至约30对，例如，约10至约20波长对。在其他实施方式中，测量的激发-发射波长对的数量要足以至少部分地鉴定微生物，例如获得足够有用的活动信息，例如，足以鉴定如下文所述的分类组的信息。例如，提供有用活动信息(例如，分类组)的激发-发射波长对的适当数量可以为约2至约8对，例如约3至约5对。

根据本发明，将已知微生物菌落作为对照测量结果，因此允许使用本领域技术人员所知的各种数学方法，将测量的试验数据与目标微生物的表征相联系。例如，可以使用本领域技术人员所知的软件系统，将样品数据与基线或对照测量结果进行对比。更具体地，数据可以通过多种多变量分析方法进行分析，例如，比如广义判别分析(GDA)、偏最小二乘判别分析(PLSDA)、偏最小二乘回归(PLSR)、主成分分析(PCA)、平行因子分析(PARAFAC)、神经网络分析(NNA)、和/或支持向量机(SVM)。在设计用于如前所述地监测、检测和/或表征生物的系统中，这些方法可以用于将未知的目标微生物基于现有的命名法归类成有关组，和/或基于生物的新陈代谢、病原性和/或毒力归类成天然存在组。

在另一个实施方式中，来自检测系统的非分光镜的测量结果，例如检测时间和生长率，可以用于辅助表征和/或鉴定来自菌落的微生物。另外，源自固体或半固体介质的摄影图像的测量结果可以提供有价值的关于菌落中微生物表征和/或鉴定的信息，例如，菌落大小，形状、颜色和密度。

在本发明的一些实施方式中，菌落中微生物的表征和/或鉴定不需要包括精确的种的鉴定。表征包括生物粒子的广泛的分类或分级，以及单一种的实际鉴定。来自菌落的微生物的分类可以包括微生物表型和/或形态学特征的测定。例如，生物粒子的表征可以基于可见的差别来完成，例如，组分、形状、大小、群集和/或新陈代谢。在一些实施方式中，目标生物粒子的分类可以不要求对给定生物粒子的特征的先前了解，而是仅要求与经验的测量结果相一致的相关性，因此使得这种方法与基于特定结合事件或新陈代谢反应的方法相比，更加通用和容易适应。如本文所用的，“鉴定”是指确定先前未知的微生物属于哪一科、属、种和/或菌株。例如，鉴定一种先前未知的微生物到科、属、种和/或菌株级别。

在某些例子中，表征包括分类模型，其为将采取的行动提供足够有用的信息。如本文所用，优选的分类模型包括分成如下一个或多个组：(1) 革兰氏组；(2)临床革兰氏组；(3)治疗组；(4)功能组；和(5)天然内荧光组。

(1)革兰氏组：在革兰氏组分类中，基于微生物的革兰氏染色反应及其总尺寸，可以将微生物分为3个广泛的分类类别，所述组选自如下的一个或多个：(a)革兰氏阳性微生物，其革兰氏染色呈深蓝色；(b)革兰氏阴性微生物，其革兰氏染色呈红色；和(c)酵母细胞，其革兰氏染色呈深蓝色，但酵母细胞是非常大的圆形细胞，通过其形态学特征和大小可以和细菌区别开。

(2)临床革兰氏组：革兰氏组可以进一步分成若干个代表形态学特征差异的亚类。这些亚类包括由具有经验的实验室技术人员报道的所有相关的临床信息，由此，与阳性或阴性革兰氏反应相比，提供了更高水平的鉴定。这个特定的分类非常有帮助，因为其通过使用自动系统提供等效的临床相关信息排除了关于依赖革兰氏染色的质量和/或技术人员读取涂片的技术水平的许多忧虑。更特别的，基于这种分类模型的微生物亚类可以选自如下的一种或多种：(a)球菌，其为小圆细胞；(b)双球菌，其为两个彼此连接的小圆细胞；(c)杆状菌，其为矩形形状；和(d)杆菌，其为杆状。可以通过附加的形态学信息而确定的这些亚类的例子包括：(i)革兰氏阳性球菌；(ii)革兰氏阳性链状球菌；(iii)革兰氏阳性簇状球菌群集 (即，“葡萄样”簇(cluster))；(iv)革兰氏阳性双球菌；(v)革兰氏阳性杆状菌；(vi)革兰氏阳性的具有内生孢子的杆状菌；(vii)革兰氏阴性杆状菌；(viii)革兰氏阴性球杆菌；(ix)革兰氏阴性双球菌；(x)酵母；和 (xi)丝状真菌。

(3)治疗组：治疗组包括多个微生物的种，当从特定样本类型中分离时，这些种用相同类别的抗生素或抗生素混合物治疗(参考：“Sanford Guide to AntimicrobialTherapy 2008(桑福德抗微生物治疗指南2008)”)。在许多情况下，临床医生不需要种级别的身份来使得最初的经验疗法能够变为更有针对性的疗法，因为超过一个种可以用相同的抗生素选择来治疗。这个分类等级正确地把这些“相同-治疗”微生物分到一个治疗类别中。这种表征水平的例子包括，把高度耐药的肠杆菌科(EB)的种和敏感的 EB的种(来自大肠杆菌的肠杆菌属菌(Enterobacter spp.))区分，或把耐 -氟康唑的念珠菌属的种(光滑念珠菌(C.glabrata)和克鲁斯念珠菌(C. kruzei))和敏感的念珠菌属的种(白色念珠菌(C.albicans)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis))区分开，等等。

(4)功能组：根据本发明，微生物还可以基于新陈代谢、毒力、和/ 或表型特征的混合而分成若干个组。非发酵微生物可以清楚地与发酵微生物区分。此外，产生溶血素的微生物种可以与非溶血性的种分别分组。在某些情况下，这些组代表着比属级别更大的类别(例如，大肠杆菌类，革兰氏阴性非发酵类杆状菌)，处于属级别的某些类别(例如，肠球菌属、念珠菌属)，更接近种级别的区别的某些类别(例如，凝固酶阴性葡萄球菌、α-溶血性链球菌、β-溶血性链球菌、凝固酶阳性葡萄球菌即金黄色葡萄球菌)。

(5)天然内荧光(“IF”)组：还可以基于微生物聚成一组的自然趋势按照其固有的和/或内在的荧光特征来对微生物进行分类。某些组可能为治疗组和功能组类别所共有。这些分组可以包括具有特征性IF谱貌(signature) 的单个的种，例如，粪肠球菌(E.faecali)、化脓性链球菌(S.pyogenes) 或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和/或可以含有具有相对保守的IF谱貌的生物小组，例如大肠杆菌、产酸克雷白氏杆菌(K.oxytoca)或产气肠杆菌(E.aerogenes)和弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)组。

除了为鉴定目的测量微生物内在特性(例如，内荧光)以外，本发明方法可以进一步包括使用添加的鉴定剂(identifier agent)来辅助鉴定过程。结合特定微生物的试剂，例如亲和配体，可以用于分离微生物，以鉴定微生物的类别或种(例如，通过结合到独特的表面蛋白或受体)，和/或鉴定微生物的特性(例如，抗生素耐药性)。有用的鉴定剂包括但不限于，单克隆抗体和多克隆抗体及其片段(例如，鉴定金黄色葡萄球菌的抗-Eap)、核酸探针、抗生素(例如，盘尼西林、万古霉素、多粘菌素B)、适体、肽模拟物、噬菌体来源的结合蛋白、凝集素、宿主先天免疫生物标志物(急性期蛋白、LPS结合蛋白、CD14、甘露糖结合凝集素、Toll样受体)、宿主防御肽(例如，防御素、cathelicidin、proteogrin、爪蟾抗菌肽)、细菌素 (例如，硫醚抗生素(lantibiotic)比如，乳酸链球菌肽、mersacidin、表皮素、gallidermin和植物乳杆菌素C和II类肽)、噬菌体以及核酸、脂质、碳水化合物、多糖、荚膜/粘质或蛋白的选择性荧光染料，包括其任何组合。如果试剂本身没有可检测信号，那么试剂可以被标记以提供可检测信号，例如通过将试剂轭合到标记物上(例如，可见的或荧光的标记物)。标记物包括但不限于，荧光的、发光的、发磷光的、放射性的、和/或比色的化合物。所述试剂可以在本发明方法的任何步骤加入到微生物中，例如，当样品位于介质上时和/或当菌落被检测完后。在某些实施方式中，所述试剂在菌落中的存在和/或数量可以在探测菌落过程中来测定。其他有用的鉴定剂包括，微生物酶的底物、螯合剂、洗涤剂、表面活性剂、消毒剂(例如，酒精、漂白剂、过氧化氢)和有毒化合物(例如，叠氮化钠、氰化钾)和代谢抑制剂例如环己酰胺、等等。类似地，许多用于测量微生物细胞活力、新陈代谢和/或膜电位的荧光化合物，可以用作本发明的鉴定剂。

在在本发明的一个方面，该方法进一步包括从菌落中回收微生物以及执行附加试验的步骤。回收的微生物可以悬浮于适当的介质中，例如，盐水。一旦悬浮，微生物可以进行任何需要的进一步试验，如本领域技术人员所知和上文所述的。特别的，任何要求洁净微生物样品的试验可以用悬浮的微生物执行。在某些实施方式中，可以执行附加的鉴定和/或表征试验。鉴定试验的例子包括Vitek 2，扩增的和非扩增的核酸试验(NAT)，产色和乳胶凝集测定，免疫测定(例如，使用标记的一抗或二抗和/或其他配体)，质谱法(例如，MALDI-TOF质谱法)和/或其他光学技术，例如红外光谱 (FTIR)或拉曼光谱。也可以执行附加的表征试验，例如耐药性、抗菌谱、和/或毒力因子。附加的表征可以是在本方法起始鉴定步骤中启动的试验的一部分。例如，耐受甲氧西林的金黄色葡萄球菌的检测可以通过在菌落生长之前向样品中添加荧光标记的盘尼西林来启动。结合的盘尼西林的存在和/或数量可以随后测定，例如，在菌落中或在从菌落回收的微生物中。在某些实施方式中，一个或多个附加试验可以在与进行鉴定步骤相同的系统中执行，例如，在相同的装置中。在一个实施方式中，特定的附加试验可以基于所作的鉴定选自许多可用的试验。

在本发明的一个方面，某些或全部的方法步骤可以实现自动化。如本文所用，术语“自动化”是指计算机控制。在一个实施方式中，不同的荧光发射检测和相关步骤是自动化的，并且由该方法获得的结果信息自动化地用于填充数据库。在进一步的实施方式中，该方法的其他步骤，例如菌落的检测和/或探测，也可以自动化。实现该方法步骤的自动化不仅允许更多样品进行更快速的试验，而且减低了处理可能含有有害的和/或有传染性的微生物的样品时人为误差所带来的风险以及减低了污染样品和/或将操作者暴露于样品的机会。在一个实施方式中，本发明涉及用于在固体或半固体介质上检测和/或鉴定微生物的系统，该系统包括分光光度计和聚焦光学部件，例如镜头系统或显微镜。在其他实施方式中，该系统进一步包括用于扫描介质表面的机械装置，和/或用于控制介质的环境(例如，孵育介质的环境)的机械装置。

本发明的一方面涉及在固体或半固体介质上检测菌落。任选地，检测之后是鉴定/表征菌落中的微生物。在一个实施方式中，对放置样品的介质进行手动扫描以确定菌落的存在。在一个实施方式中，可以用肉眼对菌落进行视觉上的检测。在其他实施方式中，可以使用显微镜对菌落进行检测。例如，可以在显微镜下观察介质，同时在显微镜物镜下用手移动位于显微镜载物台上的介质以扫描介质部分，来确定菌落的存在。介质的移动可以通过操作介质本身(例如，移动含有介质的平板)或者移动载有介质的显微镜载物台来实现。在其他实施方式中，自动进行扫描。在一个实施方式中，动力显微镜载物台可以按照程序在物镜下以跨介质表面的搜索模式移动介质，以至介质的各个部分可以依次被观察到。在另一个实施方式中，当集中光束例如激光扫描介质并且发射出的光被成像或非成像检测器检测时，介质保持静止。在一个实施方式中，介质可以分割为对应激发光束的尺度的相等的部分(例如，约100、250、500、或1000μm²或更多)，显微镜载物台可以被逐步推进，使得每个部分位于物镜下以便探测。在另一个实施方式中，可以在大范围菌落内观察介质(例如，整个平板或其大部分(例如，一半、三分之一、四分之一、十分之一或更小))。在任一个实施方式中，基于从介质扫描创建的地图，可以对菌落的位置进行测定。在一个实施方式中，显微镜载物台可以程控为依次移动到每个检测的菌落上，获得每个菌落的IF光谱。在一个实施方式中，手动或自动的扫描可以按照固定的间隔进行重复(例如，每0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或 12小时或更多)以监测菌落的出现和/或生长。在本发明的一个实施方式中，可以使用可见光扫描介质来监测菌落，例如，尺寸大到足以在显微镜下可看见的菌落。在另一个实施方式中，照射介质以使得检测菌落的内在特性(例如，IF)。超过介质本底水平的IF峰表明了菌落的存在。例如，介质的荧光地图可以通过比如使用扫描激发光束(例如激光)和单一的、非成像检测器来构建。在另一个实施方式中，使用图像捕获/采集装置(例如，照相机或扫描仪，比如CCD线阵扫描仪、CCD线扫描照相机、CCD 2D 列阵照相机、激光扫描照相机或其他装置)的大面积成像可以如WO 03/022999和美国专利号5,912,115、6,153,400、和6,251,624所描述的使用。

在本发明的某些实施方式中，所述检测方法还可以用于检测样品中微生物的存在，包括或不包括待检测微生物的鉴定。在某些实施方式中，检测方法可以用于监测样品的微生物污染，例如，食品、药品、饮用水，等等。在一个实施方式中，该方法可以重复的方式执行，以持续监测污染，例如，每月一次、每周一次、每天一次、每小时一次、或任何其他时间类型。在另一个实施方式中，样品可以按照需要进行试验，例如，当怀疑污染或需要证实污染不存在的时候。在进一步的实施方式中，检测方法可以用于寻找在临床样品中微生物的存在，例如，从伤口或血液培养物中。例如，样品可以在特定时间点从血液培养物中移出，并且在样品上执行该检测方法，以确定是否血液培养物呈阳性。在一个实施方式中，可以在培养物孵育之后的规定的时间点采集样品，例如孵育后24小时，以测定血液培养物是否呈阳性。在另一个实施方式中，样品可以有规律地从血液培养物中采集，例如，每12、6、4、2、1或0.5小时，以在可检测阳性的短时间内鉴定阳性血液培养物。在检测方法的某些实施方式中，检测步骤后面可以任选地跟随本文所述的鉴定/表征方法。在其他实施方式中，检测方法部分地或全部地为自动化，特别是对于包括重复监测样品的实施方式。

在某些实施方式中，本发明的方法可以对动物或植物细胞进行，而不是微生物。特别的，可以使用本文公开的技术检测、监测、表征、和/或鉴定能够以集落、丛集(clump)或其他三维结构生长或在三维基质上生长的动物细胞(例如，哺乳动物、鸟类、昆虫的细胞)或植物细胞。以三维集落生长的适合的细胞的例子包括但不限于，干细胞、成纤维细胞、和赘生细胞。

本发明在下述实施例中进一步详述，这些实施例通过举例说明方式提供，而不是用来以任何方式限制本发明。利用了本领域所熟知的标准技术或者以下具体描述的技术。

实施例

实施例1.从平板和膜上的菌落获得光谱

进行试验，以测定是否可以在具有或不具有黑膜的血琼脂平板(BAP；具有5％绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂)上直接获得菌落的有用的光谱(表 1)。大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)、粪肠球菌(EF)、和铜绿假单胞菌(PA)的菌落如表2所示进行生长，通过借助光纤适配器耦合到 Fluorolog3光谱仪(Horiba Jobin Yvon,Edison NJ)和PMT检测器的UV显微镜(10×物镜)进行采集光谱。通过以下采集EEM：激发波长范围(Ex)＝ 260-550nm，和发射波长范围(Em)＝280-600nm，每5nm具有狭缝宽度＝ 5nm。在标明的地方，通过在发射路径上放置1mm的小孔，使得探测区域变窄，这导致观察到的区域约为0.1mm。没有该小孔时，投射在菌落上的激发圈和发射圈的直径等于约1mm。包含在每个试验运行中的样品显示在表2中。

表1

膜：

无＝绵羊血琼脂(SBA)

Pall＝在SBA上的Pall Metricel Black网格聚醚砜膜

WPC＝在SBA上的Whatman径迹蚀刻聚碳酸酯黑色膜

WME＝在SBA上的Whatman黑色混合酯膜

表2

来自未接种平板的试验运行A2的光谱显示在图1A-1D中。每幅图中的垂直轴表示Ex范围，以及水平轴表示Em范围。由无微生物的BAP(图 1A)、Pall膜(图1B)、WME膜(图1C)、和WPC膜(图1D)获得光谱。首先在Pall和Whatman膜与BAP之间，观察背景荧光的不同。令人惊奇的是，黑Pall膜在一光谱区域强烈地发出荧光，该区域是之前发现的对于微生物悬浮液的分类重要的区域，远比未掩蔽的BAP强烈。但是，WME膜给出了所有当中最少的背景荧光。

图2A-2C显示了BAP上的WME膜上的菌落的试验运行A3的光谱。从EC3(图2A)和SA1(图2B)获得光谱，并且从SA1光谱减去EC3光谱的结果显示在图2C中。菌落的光谱显示金黄色葡萄球菌和大肠杆菌之间的清楚的差别。光谱的某些部分对于大肠杆菌来说更高并且其他部分对于金黄色葡萄球菌来说更高，这一事实显示，差别存在于整体图案中，而不只是强度范围的差别。

图3A-3D显示了来自无膜的BAP上的菌落的试验运行B1的光谱。获得EC1(图3A)、SA1(图3B)、EF1(图3C)、和PA1(图3D)的光谱。虽然测量参数的不同产生了比A3光谱高得多的强度，以及虽然直接在无黑膜的BAP上测量，但是细菌相应的种的相对图案仍然类似。

这些实验显示，可以直接在BAP上通过显微镜获得菌落的内荧光光谱，所述BAP借助或不借助黑膜来减少背景荧光，以及观察到的图案是不同类型微生物所特有的。

实施例2.通过显微镜扫描微菌落

进行试验以测定在动力载物台上的显微镜下生长的菌落是否能通过使用逐点IF测量来定位并且能否自动采集自每个检测菌落的IF光谱。UV 显微镜经过光纤电缆与用作荧光激发源和发射测量装置的Fluorolog3 (Horiba Jobin Yvon,Edison NJ)光谱仪耦合。显微镜的动力载物台配有由螺旋管构建的紧密平板培养箱，该螺旋管由设定为36℃的循环水浴供应。该培养箱还装备了由石英盖玻片制成的UV透射窗口。通过涂布的方法，将大肠杆菌ATCC 25922(EC)和/或金黄色葡萄球菌ATCC 25923(SA)接种到不同的琼脂介质上，如表3所示。某些运行使用阻光材料，黑Whatman 混合酯膜(WME)或活性炭，以降低来自介质自身的荧光。

接种后，显微镜的动力载物台程控为周期性地在搜索网格中横跨琼脂平板移动，以及在每个点用一个或多个激发/发射波长对测量荧光。如下程控Fluorolog3：设定狭缝宽度为10nm，积分时间设定为500ms(试验运行A-E)或1000ms(试验运行F-H)。在显微镜内，通过在激发光束放置小孔，使得投射到琼脂表面上的激发光束被限定在约0.1mm直径。对应上述光束尺寸，显微镜载物台以0.1mm增量逐步推进，使得10步覆盖1mm 的距离。发射光束不用小孔进行限制，但是显微镜在测量时被遮蔽，以防止不是由激发光束产生的任何的杂散光被检测。

对于试验运行G和H，开发了算法来自动计算生长的菌落的位置。对于运行H，程序进一步增强，使得所有被检测的菌落触发显微镜载物台按顺序移动到其位置并采集其IF光谱。采集的光谱为全矩阵扫描的子集，其包括300个选择的EEM点来降低需要的采集时间。同样由于时间的原因，仪器程控为采集不超过10个菌落的光谱。

表3

运行A有一个仪器问题，该问题在6小时后结束程序，并且在那段时间里没有检测到菌落。

运行B在第8小时显示勉强在背景荧光之上的一个菌落，在第10小时显示清楚可见的2个菌落，在第12小时和随后显示3个菌落。菌落信号和背景之间的差别，在440-525nm(大约4倍于背景)比在305-365nm (大约2倍于背景)更大。

由于接种量低，运行C在扫描区域内没有菌落。

运行D在第8小时显示1个菌落，在第10小时和随后显示3个。

开始时，运行E在视野里没有菌落。在第12小时视野边缘产生一个菌落，在第14小时和随后出现3个。

在第8小时，具有混合接种物的运行F显示了10个测定为EC的菌落，在第10小时增加3个SA，和在12小时之后又测定2个SA。运行F的逐点IF搜索扫描的三维图显示在图4A-4F中，其中，高度等于荧光强度。这些图显示了在6h即观察到第一个检测的菌落时(图4A)、8h(图4B)、 10h(图4C)、12h(图4D)、16h(图4E)、和24h(图4F)采集的测量结果。注意到在第8小时所有可见的菌落是大肠杆菌，而在第10小时和随后可见的另外的菌落是金黄色葡萄球菌。24小时后，来自运行F的BAP的特写图像显示在图5A中，其中绘出了搜索扫描区域的轮廓，显示相应的菌落位置的来自第12小时搜索扫描的荧光强度的等高线图显示在图5B中。

运行G在第8小时显示了1个EC菌落，在第9小时显示了2个EC 菌落。在第10小时和12小时由于仪器故障停止采集，但是在第12小时重新启动时显示了5个检测到的菌落；2个EC和3个SA。菌落检测算法成功地鉴定了所有5个菌落的位置。

在第9小时前，由于观察窗口出现冷凝作用，干扰了运行H的所有扫描，在第9小时，检测到了3个EC菌落并采集到光谱。这3个相同的EC 在后来的扫描中检测，并且，在第13小时开始，还检测到4个SA菌落并采集到光谱。

实验结果显示，无论是否使用背景阻断膜或活性炭，当微生物微菌落直接在琼脂平板上生长时，内荧光可用于检测微生物微菌落的存在和数目。此外，一旦定位，原位采集微菌落的全部光谱用于分类是相对简单的。

实施例3.琼脂平板上的微生物菌落的分类

进行试验以测定微生物菌落能否由在它们所生长的琼脂平板上直接采集的IF光谱分类。

跨过分别具有260－580nm和260－680nm波长的激发(Ex)和发射 (Em)矩阵，在选择的300个EEM点的子集中对光谱进行采集，选择300 个EEM点以降低需要的采集时间。另外，所有反射波长(其中Ex＝Em) 也被读取。对于荧光，狭缝宽度设定为5nm带通，且积分时间为1000ms。每个300点采集耗费约8.1min来完成。

表4列出了试验的微生物，其中包括20个种中每个种的6个分离物 (isolate)，一共120个试验。当用于显示不是按种分组时，术语临床革兰氏(ClinGram)指的是可能被技术相当熟练的观察者读取革兰氏染色的一种分类等级，不只是阳性、阴性、或酵母(表5)。例如，葡萄球菌是革兰氏阳性的簇状球菌，而许多链球菌是革兰氏阳性链状球菌。

表4

表5显示了利用正向逐步线性判别分析法(Forward Stepwise LinearDiscriminant Analysis)的分类建模的结果，该分析法使用“留一 (Leave-one-out)”交叉验证。选择“留一”交叉验证是因为其有效地使用小数据集，如同多个“未知集”被试验等于“训练”集来评价结果，而不用像许多试验一样需要运行两次。在这个表格中，“DA步骤数”指的是完成的判别式分析步骤的数目，该数目可能是或可能不是用于生成所示结果的EEM点的实际数目。典型地，步骤数等于模型中ExEm的点数，但是如果在某些步骤中，点被移除而不是增加的话，有时模型点数会更少。

由于判别式分析可以“找出”数据内随机波动中错误的相关性，所以给出足够数目的充分地“噪声”数据点，交叉验证对于评价给定的分类模型的真实成功性是必要的。通常，随着步骤计数增加，非交叉验证结果将倾向于100％正确，而交叉验证结果将升到顶峰，随后尾部回落。具有接近交叉验证顶峰的步骤数目的模型可以被认为对于给定的数据集是最优化的。表5显示使用或没使用交叉验证，在交叉验证结果为最优化的所有点，每个分类模型运行的结果。

如果模型对于分类的首次选择是微生物的实际身份，那么无论曾如何接近其他选择，利用判别分析对每个微生物的分类被认为是正确的。还显示了实际身份位于模型分类的前3个选择中的微生物的数目和百分比，表明其即使尚不完美，也是一个良好的预测性分类模型。

来自菌落的光谱清楚地显示对微生物分类的潜力。如通过将2个邻近的ExEm点框并(binning)改进了结果的事实所示，数据中可能存在某些噪声。形成噪声数据的两个已知因素来自，测量光束在菌落上定位不一致，以及通过该装置到达检测器的光线的低水平。对于这项研究，用显微镜照相机将激发光束在菌落中心定位是困难的，因为能够用于可视化的采光不是最优的。事实上，在某些场合观察不到定位，虽然被校正，但是有可能其他错误定位仍没有被注意到。荧光信号本身中的噪声也很大，因为到达检测器的荧光能量的量比微生物的悬浮液低超过1000倍。这是由于光纤和显微镜配置，其是一个灵活的研究工具，但对于这种类型的测量不是最优的。为这个任务设计的光学系统可以轻易地克服这个问题。

表5

实施例4.具有更少噪声的菌落的改进分类

进行试验以测定更好的定位和增加的光通量是否可以改进具有内荧光的微生物菌落的分类。重复实施例3的实验，使用相同的设备和相同的微生物菌株，但使用调整的方法。在相同的激发(Ex)和发射(Em)波长范围(Ex＝260-580nm，Em＝260-680nm)下进行光谱采集，但使用覆盖了光谱的相同关键区域、但是比之前的子集更有利于数值框并的312个波长的不同子集。使用子集的主要原因是减少使用现有设备采集光谱所需的时间。单色狭缝宽度被拓宽到7nm带通，而非之前的5nm，这使测量的荧光增加了大约2倍。探测时间保持在1000ms，每次采集用大约9.8min 来完成。

表6显示了使用正向逐步线性判别分析法的分类建模的结果，该分析法利用“留一”交叉验证。如前所述，如果模型对于分类的首次选择是微生物的实际身份，那么无论曾如何接近其他选择，分类被认为是正确的。基于独立的数据点(不框并)、对ExEm矩阵上呈“L”图案的3个相邻荧光读数的框并以及对正方形中4个相邻的EEM点的框并，显示分类性能到种级别。同样，分类到临床革兰氏级别也显示呈“3L”框并。

改进荧光读数的一致性与增加的光通量相结合的方法改变显著改进了分类的成功性。在主要的改进中，更好的定位可能比增加的光通量提升性能的贡献更大，并且很可能从每个菌落的超过一个位点得到荧光读数可用于进一步增强分类精确度。现有设备的限制只允许信号适度增加2倍，而不降低光谱分辨率或大幅增加扫描时间，很显然在荧光光谱中仍然存在明显的读取噪声(read noise)。

通过对相邻的点框并可以部分克服读取噪声，这对于其他影响分类成功性的因素来说没有积极效果，但是相应地降低了光谱分辨率。框并还帮助显示，在一个优化系统中可牺牲一些光谱分辨率来改进读取噪声。但是，利用框并的改进不如这些数据与之前方法的结果之间的差异那样大，这可能表明测量的定位起到更大的作用。进一步改进分类的成功性可以通过用自动定位和优化的光学来实现，如本领域技术人员所熟知的。

上述举例说明了本发明，并且不能解释为对其的限制。本发明由下述权利要求与包括于其中的权利要求的等效物限定。对于含有参考信息的句子和/或段落的相关教导，所有的出版物、专利申请、专利、专利公布，和本文所引用的任何其他参考文献均通过引用整体并入到本文。

表6

Claims (20)

1.一种在固体或半固体生长介质上表征和/或鉴定微生物的方法，该方法包括：

(a)利用具有小于1000μm的直径的激发光束在固体或半固体生长介质上探测一个或多个菌落，以生成所述菌落中微生物特有的内荧光(IF)测量结果，其中所述激发光束的直径小于待探测的菌落，使得完整光束可以直接落在所述菌落上并且所述介质基本不干扰IF测量；和

(b)基于所述内荧光(IF)测量结果表征和/或鉴定所述菌落中的微生物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述菌落是具有小于50μm的直径的微菌落。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在探测步骤(a)之前，使已知含有或疑似含有微生物的样品在所述固体或半固体生长介质上生长，以生成至少一个菌落。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述探测是非侵入性的。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物被表征到一个或多个分类模型，所述分类模型选自由革兰氏组、临床革兰氏组、治疗组、功能组、和天然内荧光组组成的组。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物被鉴定到属级别、种级别、或菌株级别。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述IF测量结果通过光谱法产生，并且所述光谱法包括测定激发－发射矩阵(EEM)。

8.根据权利要求7所述的方法，其中将所述EEM与已知微生物的EEM的数据库相比较。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述EEM包括至少2个不同的波长对。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述EEM使用多变量分析进行比较。

11.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括添加鉴定剂到所述固体或半固体生长介质或样品中，并且其中所述鉴定部分地基于所述鉴定剂在所述菌落或从所述菌落回收的微生物中的存在和/或数量。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述鉴定剂是亲和配体、抗体或其片段、核酸探针、抗生素、适体、肽模拟物、噬菌体来源的结合蛋白、凝集素、宿主防御肽、细菌素、噬菌体、染料，或其任何组合。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体或半固体生长介质包括一种或多种对所述微生物的生长有用的营养素以及一种或多种添加剂，其中所述一种或多种添加剂增强在所述固体或半固体生长介质上的微生物的所述菌落的所述内荧光测量结果。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述一种或多种添加剂选自由以下组成的组：蛋白质水解产物、氨基酸、肉类和蔬菜提取物、糖源、缓冲剂、复苏剂、生长因子、酶辅因子、矿物盐、金属补充物、螯合剂、光敏化剂、猝灭剂、还原剂、氧化剂、洗涤剂、表面活性剂、消毒剂、选择剂和代谢抑制剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述还原剂是还原化合物。

16.根据权利要求1所述的方法，其中探测菌落包括测量落射荧光。

17.根据权利要求1所述的方法，其中探测菌落包括测量反射光。

18.一种检测样品中微生物的存在的方法，该方法包括：

(a)获得已知含有或可能含有微生物的样品；

(b)使样品中存在的任何微生物在固体或半固体生长介质上生长；和

(c)通过利用具有小于1000μm的直径的激发光束对所述固体或半固体生长介质进行逐点扫描以生成内荧光(IF)测量结果，定位存在于所述固体或半固体生长介质上的任何菌落，其中所述激发光束的直径小于待探测的菌落，使得完整光束可以直接落在所述菌落上并且所述介质基本不干扰IF测量；

其中，按生成的测量结果所定位的一个或多个菌落的存在表明在样品中存在微生物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述IF测量结果通过光谱法产生，并且所述光谱法包括测定激发－发射矩阵(EEM)。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述EEM包括至少2个不同的波长对。