CN102971747B - 使用分类学的层级分类鉴定和/或表征微生物菌剂 - Google Patents

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Abstract

用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法包括下列步骤：从微生物菌剂获得分析测试数据（例如，获得在发射波长的范围内的内在荧光值）。该分析测试数据被变换，从而最小化生物组内的菌株间变化。借助于编程计算机，执行被编码为对经变换的分析测试数据操作的一组处理指令的多级别分类算法。多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。

Description

使用分类学的层级分类鉴定和/或表征微生物菌剂
相关申请的交叉引用
本申请涉及下面的美国专利申请，其内容通过引用被并入本文：
2009年10月30日提交的标题为“Methods for the isolation andidentification of microorganisms”的美国序列号12/589,929。
2009年10月30日提交的标题为“Separation device for use in theseparation,identification and/or characterization of microorganisms”的美国序列号12/589,969。
2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using spectroscopy”的美国序列号12/589,952。
2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using mass spectrometry”的美国序列号12/589,936。
2009年10月30日提交的标题为“Method for separation and characterizationof microorganisms using identifier agents”的美国序列号12/589,985。
2009年10月30日提交的标题为“Method for detection,identification and/orcharacterization of microorganisms in a sealed container”的美国序列号12/589,968。
2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using Raman spectroscopy”的美国序列号12/589,976。
本申请还涉及在与本申请相同的日子提交的下面申请，其内容通过引用被并入本文:
2010年5月14日提交的标题为“System for rapid identification and/orcharacterization of a microbial agent in a sample”、律师档案号为09-271-B的美国序列号12/800,388。
2010年5月14日提交的标题为“Methods for rapid identification and/orcharacterization of a microbial agent in a sample”、律师档案号为09-271-A的美国序列号12/800,387。
联邦资助的研究的声明
不适用。
技术领域
本申请涉及用于自动表征和/或鉴定存在于储存在样品容器中的样本例如血液或其它生物样本中的微生物菌剂的方法的领域。作为例子，本公开的方法快速和自动地提供关于微生物菌剂的革兰氏(Gram)类型(阳性或阴性)、形态学、种的信息或其它相关的临床信息。
背景技术
目前在美国的市场上存在检测血液样本中的微生物的生长和因而检测微生物的存在的仪器。一种这样的仪器是本受让人bioMérieux公司的BacT/ALERT 3D仪器。该仪器接收包含例如来自人类患者的血液样本的血液培养瓶。该仪器培养该瓶。在培养箱中的光学检测单元在培养期间定期地分析合并到瓶中的比色传感器，以检测微生物生长是否出现在瓶内。在专利文献中描述了光学检测单元、样品容器和传感器，见美国专利4,945,060、5,094,955、5,162,229、5,164,796、5,217,876、5,795,773和5,856,175，每个专利的全部内容通过引用被并入本文。通常涉及生物样本中的微生物的检测的所关注的其它现有技术包括下面的专利：U.S.5,770,394、U.S.5,518,923、U.S.5,498,543、U.S.5,432,061、U.S.5,371,016、U.S.5,397,709、U.S.5,344,417、U.S.5,374,264、U.S.6,709,857和U.S.7,211,430。
在检测仪器例如BacT/ALERT 3D和类似的仪器中，一旦血液培养瓶被测试为对于微生物存在是阳性的，由于血液成分的干扰和包含样本的一次性系统(例如，瓶)的假象，获得微生物菌剂的高水平的表征或微生物菌剂的种的鉴定很难。因此，当前的方法使用如上所述的用于样本中的微生物的自然生长和检测的瓶或其它适当的一次性容器和有关仪器。一旦仪器指示瓶对于微生物菌剂的存在是阳性的，根据当前方法“阳性”瓶就从仪器被人工取回，且样本的一部分从瓶被人工移出并在琼脂平板上被人工培养。在本领域中存在使样本介质在培养平板上的划线分离和平板的培养自动化的仪器。在美国专利6,617,146中描述了一种这样的仪器。在划线分离之后，平板被人工放置在培养箱中并被定期检查微生物的传代培养物的生长。在传代培养物充分生长之后，培养物的样本从平板获取并被放置在试管中。试管接着被插入又一仪器中用于经由具有多个单独的孔的一次性测试样本卡进行鉴定测试。一次性测试卡在专利文献中是已知的，见例如美国专利4,118,280、3,963,355、4,018,65；4,116,775和4,038,151、5,609,828、5,746,980、5,766,553、5,843,380、5,869,005、5,916,812、5,932,177、5,951,952和6,045,758，这些专利的全部内容通过引用被并入本文。
接着在受让人的在本领域中被称为VITEK 2仪器的分析仪器中处理测试样本卡。VITEK 2仪器培养并使用阅读器单元(reader unit)定期地读取测试样本卡的孔。在卡的一个或多个孔中的样本的生长导致微生物菌剂的鉴定。在专利文献中描述了VITEK 2仪器，见美国专利5,762,873和6,086,824，其内容通过引用被并入本文。
从将样本引入到血液收集瓶中的时间起到通过VITEK 2仪器进行微生物的培养、微生物存在的检测和接着微生物的鉴定的这整个过程一般花费2-5天。发生在阳性瓶检测之后的单独的鉴定步骤一般占这些天中的1-3天。
发明内容
如果血液样本中的微生物菌剂的检测和鉴定以及将结果报告给临床医生所花费的时间可从当前的2-5天减小到少于一天，则对患者的相当大的和可能救命的临床益处是可能的。本文件公开了用于使用分类学的层级分类方法来快速鉴定和/或表征生物样本例如血液样本中的微生物菌剂的方法。
在第一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂(microbial agent)的方法。该方法包括从微生物菌剂获得在发射波长的范围内的内在荧光(intrinsic fluorescence)值的步骤。荧光值在多个激发波长处被获得。内在荧光测量结果(intrinsic fluorescence measurement)经受变换操作，从而最小化生物组(organism group)内的内在荧光测量结果的菌株间变化(strain to strain variation)。变换操作的例子包括自然对数变换和一阶导数运算。借助于编程计算机，该方法包括执行被编码为对经变换的内在荧光测量结果操作的一组处理指令的多级别分类算法(multi-level classification algorithm)的步骤。多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级(taxonomic hierarchy)中的不同级别。
在一个实施方式中，多级别分类算法以分类层级中的较高级别到分类层级中的较低级别的顺序单调地进行。例如，多级别分类算法首先按革兰氏类别、接着按科并接着按种对微生物菌剂分类。
在一个实施方式中，多级别分类算法对于算法中的每个级别包括下列步骤：(a)对一组预定的激发/发射对的经变换的荧光值和协方差矩阵的逆矩阵(inverse)执行距离计算；(b)使用距离计算的结果以及最小距离阈值和低区别阈值(low discriminationthreshold)执行分类解释；以及(c)产生分类结果。这组预定的激发/发射对在激发和发射值的整个范围内从来自已知的微生物菌剂的内在荧光测量结果得到，这组预定的激发/发射对针对其区分开不同的微生物菌剂的能力而被选择。
在另一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法，其包括下列步骤：在激发和发射值的整个范围内从已知的微生物菌剂实验地获得内在荧光测量结果，并针对区分开不同的微生物菌剂的能力从这样的测量结果中选择一组激发/发射对；按照这组激发/发射，从未知的微生物菌剂获得内在荧光测量结果；变换来自未知的微生物菌剂的内在荧光测量结果，从而最小化在生物组内的内在荧光测量结果的菌株间变化；以及使用经变换的内在荧光测量结果和从已知的微生物菌剂实验地获得的内在荧光测量结果、借助于执行分类算法的编程计算机来鉴定和/或表征未知的微生物菌剂。
在优选实施方式中，分类算法包括被编码为对经变换的内在荧光测量结果操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。
方法通常可应用于微生物菌剂和样本。在一个可能的实现方式中，样本是人类或动物血液的样本，且微生物菌剂是存在于血液中的菌剂(例如，细菌)。
分类学的层级分类方法(taxonomic hierarchical classification method)除了内在荧光数据以外还可与不同的分析数据一起使用。概括本公开，公开了用于快速鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法，其包括下列步骤：获得微生物菌剂的分析测试数据(例如，质谱或拉曼散射数据)；变换该分析测试数据，从而最小化在生物组内的分析测试数据的菌株间变化；以及借助于编程计算机，执行被编码为对经变换的分析测试数据操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。
在又一方面中，公开了用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法，其包括下列步骤：从已知的微生物菌剂实验地获得分析测试数据，并针对区分开不同的微生物菌剂的能力从这样的测试数据选择测试数据的子集；从未知的微生物菌剂获得与分析测试数据的子集相关的分析测试数据；变换来自未知的微生物菌剂的分析测试数据，从而最小化在生物组内的内在荧光测量结果的菌株间变化；以及使用经变换的分析测试数据和从已知的微生物菌剂实验地获得的分析测试数据、借助于执行分类算法的编程计算机来鉴定和/或表征未知的微生物菌剂。
附图说明
图1是测量装置的示意图，在该测量装置中可使用本公开的方法。
图2A-2C是示出一系列处理指令的流程图，所述指令使用内在荧光测量结果来执行浓缩的微生物菌剂的鉴定和/或表征。
图3-8是内在荧光(IF)测量结果及其变换的曲线，其示出在最小化生物组内的菌株间变化方面图2A的预处理指令的益处。
图9和10是IF测量结果的自然对数变换的一阶导数的曲线，其示出对315nm和415nm的激发波长在种的子集之间的可能区别。
具体实施方式
本文描述了用于鉴定和/或表征微生物菌剂的方法。在优选实施方式中，对与样本中的其它成分分离的浓缩的微生物菌剂执行该鉴定和/或表征。可在浓缩的微生物菌剂储存在用于微生物菌剂的分离和浓缩的一次性设备中时执行该方法；可选地，可在微生物菌剂从一次性设备移出之后执行该方法。在标题为“System for rapid identificationand/or characterization of a microbial agent in a sample,e.g.,blood”、律师档案号为09-271-B的共同未决的申请序列号12/800,388中描述了用于样本例如血液中的微生物菌剂的分离和浓缩的方法、仪器和设备的例子，该申请通过引用被并入本文。这样的方法、仪器和设备对本公开的方法不是特别重要，且因此不提供详细描述，以便不使本公开不清楚。
现在将结合图1描述检测布置和一次性设备的一个代表性例子。图1是测量装置的示意性图示，在该测量装置中本公开的方法可被使用。该装置包括一次性分离和浓缩设备10，包含未知微生物菌剂的样本14放置在该设备10中。利用样本中的非微生物菌剂成分(例如，血细胞)的任选的选择性裂解、存在于设备10中的致密垫(density cushion)和离心作用将微生物菌剂12浓缩成团粒沉淀状块(pellet-like mass)。密度梯度和离心作用在存在于设备10中的毛细管15的底部浓缩微生物菌剂。
测量装置包括在激发波长处发射光18的光源16，以刺激内在荧光从微生物菌剂12产生。发射辐射20被导至任选地耦合到光谱仪24的传感器阵列22上。在波长波段中的荧光发射数据被发送到计算机26。计算机耦合到存储器30，其存储程序代码(包括执行图2A-2C所示的处理指令的序列的代码)、在模块中使用的常数、以及包括很多预期微生物菌剂和在特定的激发和发射对中的实验地获得的荧光数据的模型，所述激发和发射对以下面描述的方式区分开微生物。计算机26借助于存储在存储器30中的信息和代码来处理数据，并产生显示在所连接的工作台显示器28或其它适当的输出设备上的分类结果，其细节并不重要。
在下面的申请中更详细地描述了分离、浓缩和探询方法：2009年10月30日提交的标题为“Methods for the isolation and identification of microorganisms”的美国序列号12/589,929、2009年10月30日提交的标题为“Separation device for use in theseparation,identification and/or characterization of microorganisms”的美国序列号12/589,969、2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using spectroscopy”的美国序列号12/589,952、2009年10月30日提交的标题为“Method for separation,identification and/or characterization of microorganisms using massspectrometry”的美国序列号12/589,936、2009年10月30日提交的标题为“Method forseparation and characterization of microorganisms using identifier agents”的美国序列号12/589,985、2009年10月30日提交的标题为“Method for detection,identification and/or characterization of microorganisms in a sealedcontainer”的美国序列号12/589,968、2009年10月30日提交的标题为“Method forseparation,identification and/or characterization of microorganisms usingRaman spectroscopy”的美国序列号12/589,976，这些申请的内容通过引用被并入本文，本发明的方法不限于这些技术。
一旦存在于样本中的微生物或其它微生物菌剂在分离设备10中被分离和/或成团粒，分离的样本或团粒沉淀就如下所述的被探询(例如，利用光谱方法、使用内在荧光测量结果)，以表征和/或鉴定样本或团粒沉淀中的微生物。探询可以以非侵入式方式发生，也就是说，当团粒沉淀保留在用于分离和浓缩微生物菌剂的设备10中时，团粒沉淀可以被探询。以非侵入方式鉴定微生物的能力，任选地与在整个分离和表征/鉴定过程中保持设备10密封以及自动化该程序结合，避免了污染和/或感染的样本的持续处理，并极大增加了整个过程的安全性。此外，通过直接探询来表征和/或鉴定微生物而不进一步处理样本或团粒沉淀(例如，菌落的重新悬浮、接种和生长)的能力极大地增加了可进行鉴定/表征的速度。
在一个实施方式中，光谱方法可用于分析微生物的一种或多种固有特性，例如当没有额外的剂例如着色剂、染料、载色剂等时存在于微生物中的特性。在其它实施方式中，光学光谱学方法可用于分析微生物的一种或多种非固有特性，例如只可借助于额外的鉴定用试剂检测的特性。使用荧光光谱法来执行优选形式的探询。例如，前端面荧光(其中激发光和发射光进入并离开同一光学表面，且如果样本通常是光学上厚的，激发光穿透一段非常短的距离进入样本中)(见例如Eisinger,J.和J.Flores的"Front-face fluorometry ofliquid samples,"Anal.Biochem.94:15(1983))可用于鉴定团粒沉淀中的微生物。
一般，光源16或激发源导致样本的激发，后面是在预定的时间点或连续地测量样本的荧光的发射20。类似地，来自激发源与样本的交互作用的反射光可被测量，以提供用于鉴定和/或表征的相关数据。可通过光谱鉴别的任何适当的方式、最优选地使用光谱仪24来测量来自样本的发射。
在目前优选的实施方式中，进行对照测量(例如，荧光光谱)，以获得存储在存储器30中的已知的微生物和数据，因而允许使用本领域中的技术人员已知的各种数学方法来将所测量的测试数据与所关注的微生物的表征相关联。来自已知的微生物的所测量的测试数据存储在机器可读存储器30中，例如在实现本方法的仪器内或在相关的数据处理设备例如所连接的工作台内。这些方法可用于基于现有的命名法将正被测试的样本中的所关注的未知微生物分类到相关的组(例如种)中，和/或在设计用于如前所述监控、检测和/或表征生物的系统时基于生物的代谢、病原性和/或毒性将未知微生物分类到自然出现的组中。
样本照明源(见图1)或激发源16可选自如本领域中的技术人员已知的任何数量的适当光源。可使用产生可用的数据的电磁光谱的任何部分。能够在紫外、可见光和/或近红外光谱以及电磁光谱的其它部分中发射的光源可被利用并且是本领域中的技术人员已知的。例如，光源可以是连续光谱灯(continuum lamp)，例如用于产生紫外光的氘或氙弧灯和/或用于产生可见光/近红外激发的钨卤素灯。这些光源提供宽的发射范围，且特定的激发波长的光谱带宽可使用光学干涉滤波器、棱镜和/或光栅来减小，如本领域中公知的。
可选地，多个窄带光源例如发光二极管和/或激光器可以在空间和/或时间上被多路复用以提供多波长激发源。例如，从240nm到超过900nm的发光二极管是可用的，且源具有20-40nm的光谱带宽(半高全宽)。激光器在从紫外到近红外的分立波长(discretewavelength)中是可用的，并可使用本领域中的技术人员公知的多路复用方法来使用。
可通过使用光谱鉴别装置例如扫描单色仪来提高光源中的任一个的光谱选择性。如本领域中的技术人员已知的，可利用其它鉴别方法，例如声光可调谐滤波器、液晶可调谐滤波器、光学干涉滤波器的阵列、棱镜摄谱仪等，以及以任何组合。在选择光谱鉴别器时的考虑因素考虑可调谐性的范围以及选择性的水平。作为例证，例如鉴别器可以按10nm的选择性来利用300-800nm的波长范围。这些参数通常确定实现可调谐性范围以及选择性所必需的最佳技术。
来自光源16的照明导致样本的激发，后面是在预定的时间点或连续地测量样本的荧光的发射。类似地，来自激发源与样本的交互作用的反射光可被测量，以提供用于鉴定和/或表征的相关数据。
可通过光谱鉴别的任何适当的方式、最优选地使用光谱仪24来测量来自样本的发射。光谱仪可以是检测特定的发射波长的扫描单色仪，由此，来自单色仪的输出由光电倍增管检测，和/或光谱仪可配置为成像摄谱仪，由此，输出由成像检测器阵列例如电荷耦合器件(CCD)检测器阵列检测。在一个实施方式中，鉴别器允许通过光电检测装置(例如光电倍增管、雪崩光电二极管、CCD检测器阵列和/或电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)检测器阵列)来观察荧光和/或散射信号。
光谱技术用于获得优选地被提供为激发-发射矩阵(EEM)测量的测量。如本文使用的，EEM被定义为作为激发波长和发射波长的函数的荧光物质的发光光谱发射强度，并包括全光谱或其子集，其中子集可包含单个或多个激发/发射对。此外，具有固定的激发波长的EEM的横截面可用于显示特定的激发波长的发射光谱，而具有固定的发射波长的EEM的横截面可用于显示样本的激发光谱。在一个实施方式中，在多于一个特定的激发-发射波长对处例如在2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个特定的激发-发射波长对处测量多个EEM。
已发现，前端面荧光光谱法在测量高度散射和高度淬火的样本的荧光和/或反射特性时提供优点。在一个实施方式中，前端面方法可能是特别有用的。例如，前端面荧光可能在高度吸收的样本中特别有用，因为激发和发射光束不需要穿过样本的主体(bulk)传播，并因此可能较少受可能包含在其中的干扰成分(例如，血细胞和微生物培养基)的影响。可在这样的角处照射分离设备1904的光学表面，以便提供如本领域中的技术人员已知的可接受的结果(例如，Eisinger,J.和J.Flores的"Front-face fluorometry of liquidsamples,"Anal.Biochem.94:15-21(1983))。在一个实施方式中，系统被设计成使得光谱系统除了最少在一个固定角处测量发射荧光以外还最少在一个固定角处测量漫反射光。
在一些实施方式中，在分离的样本或团粒沉淀中的微生物的表征和/或鉴定不需要涉及确切的种的鉴定。表征包括生物颗粒的广泛归类或分类以及单个种的实际鉴定。来自分离的样本或团粒沉淀的微生物的分类可包括微生物的表型和/或形态学特征的确定。例如，生物颗粒的表征可基于可观测的差异例如成分、形状、尺寸、成簇(clustering)和/或代谢来实现。在一些实施方式中，所关注的生物颗粒的分类可能不需要给定生物颗粒的特征的预先知识，而只需要与经验测量结果的一致关联，因而使这种方法比基于特定的结合事件或代谢反应的方法更通用和容易接受。如本文使用的，“鉴定”意指确定以前未知的微生物属于哪个科、属、种和/或菌株。例如，鉴定以前未知的微生物到科、属、种和/或菌株级别。
在一些实例中，表征包括对于将采取的行动提供足够的有用信息的分类模型。如本文使用的，优选的分类模型包括分组到下列项中的一个或多个中：(1)革兰氏组；(2)临床革兰氏组；(3)治疗组；(4)功能组；以及(5)自然内在荧光组。
(1)革兰氏组：在革兰氏组分类之内，微生物可基于其革兰氏染色反应和总尺寸被置于三种广泛的分类类别之一中，所述组选自下列项中的一个或多个：(a)使用革兰氏染色染深蓝色的革兰氏阳性微生物；(b)使用革兰氏染色染红色的革兰氏阴性微生物；以及(c)使用革兰氏染色染深蓝色的酵母细胞，但其为按照其形态学特征和尺寸与细菌区分开的非常大的圆细胞。
(2)临床革兰氏组：此革兰氏组可进一步分成代表区分形态学特征的几个子类别。这些子类别包括由有经验的实验室技术专家报告的所有相关临床信息，并因此比阳性或阴性革兰氏反应提供更高级别的鉴定。这个特定的分类是非常有帮助的，因为它消除了关于依赖于革兰氏染料的质量和/或技术人员的技能水平的忧虑，技术人员通过使用自动化系统提供等效的临床相关信息来读取涂片。更具体地，基于这个分类模型的微生物的子类别可选自下列项中的一个或多个：(a)球菌，其是小的圆细胞；(b)双球菌，其是结合在一起的两个小圆细胞；(c)杆状菌(rod)，其是矩形形状的；以及(d)杆菌(bacilli)，其是杆状的。可由额外的形态学信息确定的这些子类别的例子包括：(i)革兰氏阳性球菌；(ii)成链的革兰氏阳性球菌；(iii)成簇的革兰氏阳性球菌(即，“葡萄状”簇)；(iv)革兰氏阳性双球菌；(v)革兰氏阳性杆状菌；(vi)具有内生孢子的革兰氏阳性杆状菌；(vii)革兰氏阴性杆状菌；(viii)革兰氏阴性球杆菌；(ix)革兰氏阴性双球菌；(x)酵母；以及(xi)丝状真菌。
(3)治疗组：此治疗组包括多个微生物种，其当从特定的样品类型分离时使用同一类的抗生素或抗生素的混合物来治疗(例如，如在“Sanford Guide to AntimicrobialTherapy 2008”中所述的)。在很多情况下，临床医师不需要种级别的鉴定来实现从初始经验治疗到更定向的治疗的改变，因为多于一个种可使用相同的抗生素选择来治疗。这个分类级别正确地将这些“相同治疗”微生物置于单个治疗类别中。这个表征级别的例子包括区分开高度耐药的肠杆菌科(Enterobacteriacae，EB)的种与敏感的EB种(区分开肠杆菌属的种与肠埃希氏菌)，或区分开抗氟康唑的念珠菌属(Candida)的种(光滑念珠菌(C.glabrata)和克柔念珠菌(C.krusei))与敏感的念珠菌属的种(白色念珠菌(C.albicans)和近平滑念珠菌(C.parapsilosis))，等等。
(4)功能组：根据本发明，微生物还可基于代谢、毒性和/或表型特征的混合来被置于几个组中。非发酵的生物可以清楚地与发酵的生物区分开。此外，产生溶血素的微生物种可与非溶血的种分开地被分组。在一些情况下，这些组代表比属级别宽的类别(例如，大肠杆菌类、革兰氏阴性非发酵杆状菌)，一些在属级别(例如，肠球菌属(Enterococcus)、念珠菌属)，而一些较接近于种级别区别(例如，凝固酶阴性的葡萄球菌、α-溶血性链球菌、β-溶血性链球菌、凝固酶阳性的葡萄球菌，即，金黄色葡萄球菌(S.aureus))。
(5)自然内在荧光(“IF”)组：微生物还可基于其自然倾向被置于类别中以按照其固有和/或内在荧光特征分组在一起。这些组中的一些可能对治疗和功能组类别是共同的。这些分组可包括具有特征IF标记的单独的种例如粪肠球菌(E.faecalis)、化脓性链球菌(S.pyogenes)或绿脓杆菌(P.aeruginosa)，和/或可包含具有相对保守的IF标记的小生物组，例如肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)-产酸克雷伯菌(K.oxytoca)或产气肠杆菌(E.aerogenes)-阴沟肠杆菌(E.cloacae)组。
除了为了鉴定目的而测量微生物的内在特性(例如内在荧光)以外，该方法可使用额外的鉴定用试剂来帮助分离和/或鉴定过程。结合到特定的微生物例如亲和配体的菌剂可用于分离微生物，以鉴定微生物的类别或种(例如，通过结合到唯一的表面蛋白质或受体)和/或鉴定微生物的特征(例如，抗生素抗性)。有用的鉴定用试剂没有限制地包括单克隆和多克隆抗体及其片段(例如，用于金黄色葡萄球菌鉴定的抗Eap)、核酸探针、抗生素(例如盘尼西林、万古霉素、多粘菌素B)、适体、肽模拟物、噬菌体衍生的结合蛋白、凝集素、宿主天然免疫生物标志(急性期蛋白质、LPS结合蛋白、CD 14、甘露糖结合凝集素、Toll样受体)、宿主防御肽(例如，防御素、cathelicidin、proteogrin、爪蟾抗菌肽(magainin))、细菌素(bacterocin)(例如羊毛硫抗生素(lantibiotic)，如乳酸链球菌肽(nisin)、杆菌肽(mersacidin)、表皮素、gallidermin和植物乳杆菌素C(plantaricin C)以及II类肽)、噬菌体和对于核酸、脂质、碳水化合物、多糖、荚膜/黏液或蛋白质选择性的染料、或其任何组合。如果菌剂本身不发出可检测的信号，菌剂可被标记以例如通过将菌剂缀合到标志物(例如，可见的或荧光的标志物)来提供可检测的信号。标志物没有限制地包括荧光的、发光的、发磷光的、放射性的和/或比色的化合物。菌剂可在本发明的方法中的任一步骤添加到微生物，例如当样本被获得时，在裂解期间和/或在分离期间。在一些实施方式中，在团粒沉淀中的菌剂的存在可在团粒沉淀的探询期间被确定。其它有用的鉴定用试剂包括微生物酶的底物、螯合剂、光增敏剂、淬火剂、还原剂、氧化剂、缓冲剂、酸、碱、溶剂、固定剂、洗涤剂、表面活性剂、消毒剂(例如，酒精、漂白剂、过氧化氢)和有毒化合物(例如，叠氮化钠、氰化钾)和代谢抑制剂例如环已酰胺等。类似地，用于测量微生物细胞生存力、代谢和/或膜电位的很多荧光化合物在本发明中可用作鉴定用试剂。如本领域技术人员将容易认识到的，特定的微生物对影响其物理状态或代谢的任何化合物例如抗生素的敏感性可通过将化合物添加到样本、裂解缓冲液、致密垫或其任何混合物来快速确定。
现在将结合图2-10描述使用内在荧光和层级分类学的分类过程来执行微生物菌剂的鉴定和/或表征的方法的实施方式。基本上，该方法可以体现为存储在存储器中并使用常规数据处理器或计算机26执行的一系列处理指令。处理指令执行图2A-2C所示的算法，其设计成：给定来自预定的一组发射波长的对血液培养分离菌(浓缩的团粒沉淀)的内在荧光(IF)扫描，提供对该分离菌的鉴定。该算法可适合于其它类型的分析测试数据(例如，拉曼散射或质谱法)。
在优选实施方式中，该方法被编码为实现多级别鉴定算法的软件指令。获取输入数据并确定微生物的鉴定的传统分类算法使用单个分类模型。给定来自对未知生物以一组预定的波长进行的内在荧光扫描的数据，多级别鉴定算法按照分类学的等级的分支——革兰氏类别、科和种——对生物分类。唯一的特征是在每个鉴定步骤从最高革兰氏类别到最低种级别的单独的分类模型的使用。此外，该方法合并并行分类模型的使用以评估结果之间的一致性。因此，准确的鉴定和/或表征的概率被最大化，且不正确的鉴定或表征结果的产生被最小化。
鉴定方法包括一组数据预处理步骤(被示为图2A的块5102、5104和5106)和一组分析步骤(图2B、2C中的其余块5108、5110等)。该方法确定在分类层级的多个级别处的生物的鉴定。预处理步骤设计成获取IF扫描数据，并执行最小化在给定生物组或种内的微生物菌剂的不同菌株之间的变化的数据变换。数据分析步骤使用并行的分类模型实现多级别鉴定，如从下面的讨论中将理解的。
如上所述，优选实施方式提供在革兰氏、科和种级别的生物鉴定。通常存在于血液培养物中的生物可由算法鉴定，包括但不一定限于表1中列出的生物。很明显，对于不同的应用(例如，血液、水、环境样本等)，生物可不同于表1中列出的生物，然而方法是相同的。
(a)表1：内在荧光算法鉴定生物列表
现在将详细描述图2A-C所示的处理步骤或模块。
预处理
步骤5102：获得荧光值nij，对于每个激发值，i＝1,2,…,x，且对于每个发射值，j＝1,2,…,y，组合。比率，即发射值/激发值，必须落在区间(1.05,1.95)内。
步骤5104：对于每个荧光值nij，计算自然对数值ln(nij)。
步骤5106：在给定的激发波长i，对于每个发射值，j＝2,3,…,y-1，计算自然对数值(来自步骤5104)的一阶导数。
使用步骤5104和5106变换原始荧光数据以最小化每个生物组内的菌株间变化是有利的。此外，变换过程倾向于在整个生物组中产生类似的变化(variance)。图3、4和5作为例子示出对在激发315处在整个发射范围内评估的金黄色葡萄球的多个菌株菌执行所述预处理的效果。在图3中，每条线代表来自单个菌株的荧光信号。线5202指示在每个发射值处的平均荧光信号。图4示出在应用自然对数变换(步骤5104)之后荧光信号的菌株间变化；注意，所有菌株的曲线形状一起靠拢。图5示出在计算自然对数变换的一阶导数(步骤5106)之后在315nm的激发处的菌株间变化。再次，注意，所有菌株的曲线形状一起靠拢得非常近，特别是在400-610nm的发射范围处。
作为另一例子，图6示出在执行变换步骤之前在415nm的激发值处近平滑念珠菌的荧光信号的菌株间变化。注意在400-650nm的范围内的发射上的广泛变化。图7示出了在执行自然对数变换之后在415nm的激发处这个生物的菌株间变化。图8示出了在执行一阶导数变换之后的菌株间变化。注意，在图8中，菌株间变化减小很多。
可使用额外的数据变换。一种数据变换是对于特定的激发波长将每个发射点处的荧光值标准化为所有发射对的平均值。
在另一预处理方法中，荧光值到沿着每个发射和/或激发波长线的最大信号的标准化可鉴定光谱的附近非峰值区域，其提供使用非标准化数据不可能的相当大的分类益处。在一些情况下，在应用其它标准化和/或分析策略之前，将荧光值首先标准化为较不可变的细胞荧光团，例如色氨酸，可能更准确。此外，瑞利散射(漫反射)数据可潜在地用于补偿分离设备中的表面变化和/或在微生物细胞团粒沉淀和/或光学系统内的变化。
分析
步骤5108：在执行预处理步骤之后在分析中的分类的第一级别是革兰氏分类5108。在这个步骤，处理包括两个分支，一个由步骤5110和5112表示，而另一个由步骤5114和5116表示。图2A并非意在暗示分支不能够被连续地执行；分支可以连续地或并行地执行。
步骤5110：革兰氏分类距离计算。使用对一组预定的激发/发射对的一阶导数变换，对于在模型中定义的每个革兰氏类别，计算距离，
da＝[(m-ma)t∑-1(m-ma)]1/2
其中
-a＝1,2,3，表示在模型中定义的革兰氏类别
-m表示对每个激发/发射对i,j的自然对数变换的一阶导数的计算值mij的矢量
-ma表示在每个激发/发射对i,j处来自对每个类别a的分布的平均值ma(ij)的矢量
-t表示矢量的转置
-(m-ma)表示对于每个激发/发射对i,j，差值mij-ma(ij)的矢量
-∑-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵。这组激发和发射对从已知微生物的荧光测量结果实验地确定(利用所执行的预处理)(见图9和10以及下面的讨论)。
术语“模型”用于指一组已知的微生物菌剂，在预定的激发波长处对所述微生物菌剂的IF测量结果(包括变换)以前被获得，且对于所述微生物菌剂，样品是用于分类的候选物，例如表1中列出的菌剂。
步骤5112：革兰氏分类解释。
-让ug表示最大距离阈值
-如果所有距离d1、d2和d3都大于ug，则分类结果是未知的
-否则，确定dmin的值，即，d1、d2和d3的最小值
-让wg表示低区别阈值因子(low discrimination threshold factor)
-如果多于一个距离d1、d2和d3小于(dmin*wq)，则分类结果是在具有小于(dmin*wq)的距离的革兰氏类别之间的低区别。
-如果只有一个距离d1、d2和d3小于(dmin*wq)，则分类结果是相应的革兰氏类别。
步骤5114：所有科分类距离计算
使用对一组预定的激发/发射对的一阶导数变换，对于在模型中定义的每个生物科，计算距离，
da＝[(m-ma)t∑-1(m-ma)]1/2
其中
-a＝1,2,…,k，表示在模型中定义的所有生物科
-∑-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵(与如上所述的相同，这组激发和发射对被实验地确定)。
-m表示对于每个激发/发射对i,j的自然对数变换的一阶导数的计算值mij的矢量
-ma表示在每个激发/发射对i,j处来自对每个类别a的分布的平均值ma(ij)的矢量
-t表示矢量的转置
-(m-ma)表示对于每个激发/发射对i,j，差值mij-ma(ij)的矢量
步骤5116：所有科分类解释
-让uf表示最大距离阈值
-如果所有距离d1、d2,…,da都大于uf，则分类结果是未知的
-否则，确定dmin的值，即，d1、d2,…,da的最小值
-让wf表示低区别阈值因子
-如果多于一个距离d1、d2,…,da小于(dmin*wf)，则分类结果是在具有小于(dmin*wf)的距离的生物科之间的低区别
-如果只有一个距离d1、d2,…,da小于(dmin*wq)，则分类结果是相应的科。
步骤5118：对最终革兰氏分类结果合并革兰氏和所有科分类解释。
如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是单个选择，若科分类落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是所指示的革兰氏类别。
如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是单个选择，若科分类未落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是未知的。
如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是低区别，若与最短距离相关的科落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是所指示的革兰氏类别。
如果革兰氏分类是单个选择且所有科分类是低区别，若与最短距离相关的科未落在革兰氏类别的分类层级之下，则合并的分类结果是未知的。
如果革兰氏分类是低区别且所有科分类是单个选择，则合并的分类结果是如下革兰氏类别：其相应于在分类层级上科存在于之下的革兰氏类别。
如果革兰氏分类是低区别且所有科分类是单个选择，若没有一个革兰氏类别相应于在分类层级上科存在于其下的革兰氏类别，则合并的分类结果是未知的。
如果革兰氏分类和所有科分类都是未知的，则合并的分类结果是未知的。
处理接着继续进行到步骤5120，革兰氏科分类——在分类层级中第二较低的分类级别。这个步骤由子步骤5122、5124和5126组成。
步骤5122：革兰氏科分类距离计算。
使用对于革兰氏分类结果特定的一组预定的激发/发射对的一阶导数估计值，对于在模型中定义的每个生物科，计算距离，
da＝[(m-ma)t∑-1(m-ma)]1/2
其中
-a＝1,2,…,k，表示在模型中定义的生物科的数量
-∑-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵(如前面关于那些对所述的相同)。
-m表示对于每个激发/发射对i,j的自然对数变换的一阶导数的计算值mij的矢量
-ma表示在每个激发/发射对i,j处来自对每个类别a的分布的平均值ma(ij)的矢量
-t表示矢量的转置
-(m-ma)表示对于每个激发/发射对i,j，差值mij-ma(ij)的矢量
步骤5124：革兰氏科分类解释
让ut表示最大距离阈值
如果所有距离d1、d2,…,da都大于ut，则分类结果是未知的
否则，确定dmin的值，即，d1、d2,…,da的最小值
让wt表示低区别阈值因子
如果多于一个距离d1、d2,…,da小于(dmin*wt)，则分类结果是在具有小于(dmin*wt)的距离的生物科之间的低区别
如果只有一个距离d1、d2,…,da小于(dmin*wt)，则分类结果是相应的科。
步骤5126革兰氏科分类结果。
如果革兰氏科分类结果是未知的，则测试生物分类在革兰氏级别处结束。
如果革兰氏科分类结果是低区别，则测试生物分类作为包括在低区别中的革兰氏和科而结束。
如果革兰氏科分类结果是单个科，则来自测试生物的IF数据被进一步分析以确定种级别鉴定是否可被确定。
步骤5128革兰氏科种分类。处理指令继续进行到革兰氏科种分类级别——由子步骤5130、5132和5134组成的在分类层级中第三和甚至更低的分类级别。
步骤5130革兰氏科种分类距离计算。
使用对革兰氏科分类结果特定的一组预定的激发/发射对的一阶导数估计值，对于在模型中定义的每个生物种，计算距离，
da＝[(m-ma)t∑-1(m-ma)]1/2
其中
-a＝1,2,…,k，表示在模型中定义的生物种的数量
-∑-1表示该组预定的激发/发射对的协方差矩阵的逆矩阵(与如前面所述的相同)
-m表示对于每个激发/发射对i,j的自然对数变换的一阶导数mij的计算值的矢量
-ma表示在每个激发/发射对i,j处来自对每个类别a的分布的平均值ma(ij)的矢量
-t表示矢量的转置
-(m-ma)表示对于每个激发/发射对i,j，差值mij-ma(ij)的矢量
步骤5132：革兰氏科种分类解释。
-让us表示最大距离阈值。
-如果所有距离d1、d2,…,da都大于ut，则分类结果是未知的。
-否则，确定dmin的值，即，d1、d2,…,da的最小值。
-让ws表示低区别阈值因子。
-如果多于一个距离d1、d2,…,da小于(dmin*ws)，则分类结果是在具有小于(dmin*ws)的距离的生物种之间的低区别
-如果只有一个距离d1、d2,…,da小于(dmin*wt)，则分类结果是相应的种。
步骤5134革兰氏科种分类结果。
如果革兰氏科种分类结果是未知的，则测试生物分类在革兰氏和科级别处结束。
如果革兰氏科种分类结果是低区别，则测试生物分类作为包括在低区别中的革兰氏、科和种而结束。
如果革兰氏科种分类结果是单个种，则测试生物分类在革兰氏、科和种级别处结束。
在步骤5136，在步骤5134、5118和5126确定的结果例如在鉴定仪器的用户界面上返回并报告给用户，传输到所连接的工作台，返回到另一软件模块，或以另外方式为用户产生。
关于生物鉴定(步骤5134)，只有当(发射值的自然对数变换的)一阶导数的值对至少一个激发波长在发射范围的某个部分处对模型中的每个种是唯一的时，在种之间的区别才是可能的。图9和10示出对于激发波长315nm(图9)和415nm(图10)在种的子集之间可能的区别。参考图9，显然这些种中的几个可基于在激发波长315处的一阶导数与其它种区分开。数学模型使用发射的(自然对数变换的)一阶导数值，其中视觉差异作为输入而存在以区分开种。使用在整个发射范围内的值的选定部分，下面的种可清楚地与其它种区分开：肠埃希氏菌、流感嗜血杆菌、绿脓杆菌和肺炎链球菌。此外，金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌可与其它种而不是与彼此区分开。在给定的激发波长处在整个发射范围内的值的部分(section)是在如上所述的处理步骤中的距离计算中的逆矩阵∑-1中的预定对。这些对可例如是在315nm处的激发和由图9中所示的圆圈指示的发射值的范围，即，(315/300-450)、(315,485-500)、(315/570-580)。
参考图10，显然在激发波长415nm处的发射具有区分开种的能力。使用在整个发射范围内的值的选定部分，近平滑念珠菌(C.parasilosis)和铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)可明确地与其它种区分开。注意到出现在大约发射450nm处的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的一阶导数值之间的差异也是有意义的。当来自波长315和415(图9和10)的整个发射范围内的值的选定部分的信息被组合时，模型中的所有种可以高比值(＞97％可靠性)彼此区分开。
为了增强荧光信号，微生物可在离心/浓缩之前被涂有金和/或银纳米粒子，和/或内部光学表面可被预先涂有特定尺寸和形状的金属胶体(参考文献：关于荧光，Lakowicz,Anal.Biochem.337:171(2005)；关于SERS，Efrima等人,J.Phys.Chem.B.(Letter)102:5947(1998))。在另一实施方式中，纳米粒子在离心之前存在于在分离设备中存在的致密垫中并当微生物穿过致密垫时与微生物相关联。
上面在图2-10的背景中解释的分类学的层级分类方法适用于从微生物菌剂的探询得到的其它数据集。例如，在拉曼散射数据或质谱数据而不是内在荧光数据从浓缩的微生物菌剂得到情况下，分类方法是同样有用的。在拉曼散射的情况下，数据从已知的微生物菌剂获得，且这样的数据被分析(一般在变换步骤被执行之后)以确定在革兰氏、科和种之间区分开的数据的子集以及结果，即，所存储的有差别的子集。类似地，来自未知的微生物菌剂的数据经受变换步骤以最小化种之间的菌株间变化；变换可以是自然对数、一阶导数或其它变换，基于已知的微生物菌剂的数据的检查，变换的选择和细节将在本领域中的技术人员的能力范围内。图2A-2C的处理(在革兰氏、科和种级别的层级分类)接着继续进行。用于分类的最小距离计算的可选方案例如公知的K-最近邻分类算法(K-Nearest Neighborclassification algorithm)可用于在每个分级级别处的测试样本的分类。也将明显，可能需要在图2A-2C的流程图中未示出的额外的预处理步骤，其对分析测试方法例如背景减除或标准化是唯一的，但这些步骤在本领域中是已知的，且因此详细描述是不必要的。
概括前述内容，我们描述了用于快速鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法，其包括下列步骤：
获得微生物菌剂的分析测试数据；变换该分析测试数据，从而最小化在生物组内的分析测试数据的菌株间变化；以及借助于编程计算机，执行被编码为对经变换的分析测试数据执行的一组处理指令的多级分类算法，多个级别相应于被怀疑在样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别。在一些实施方式中，分析测试数据(例如，内在荧光、拉曼散射)被执行，同时微生物菌剂浓缩在菌剂被分离和浓缩的测试设备内，如图1所示；在其它实施方式中，浓缩的菌剂从测试设备移出，且通过单独的仪器例如质谱仪来受到分析。在美国专利6,780,602中公开了可被使用的分析方法的另外例子，该专利的内容通过引用被并入本文。
虽然公开了样本是人类或动物血液的实施方式，显然本发明通常适用于可以是临床或非临床样本的样本。方法还可以用于鉴定从平板或其它形式的微生物培养设备中取出的微生物菌落，且在这种情况下，这样的菌落生长所来自的样本同样可以是临床或非临床样本，且因此不一定是血液。例如，样本可以是被怀疑包含一种或多种微生物菌剂的临床或非临床样本。临床样本例如体液包括但不限于血液、血清、血浆、血液成分(bloodfraction)、关节液、尿液、精液、唾液、粪便、脑脊髓液、胃内容物、阴道分泌物、组织匀浆、骨髓抽出物、骨匀浆、痰、抽出物、拭子和拭子漂洗液(swab rinsate)、其它体液等。可被测试的非临床样本包括但不限于食品、饮料、药品、化妆品、水(例如，饮用水、非饮用水、以及废水)、海水压舱物(seawater ballast)、空气、土壤、污水、植物物质(例如，种子、叶、茎、根、花、果实)、血液产品(例如，血小板、血清、血浆、白细胞成分等)、捐赠器官或组织样本、生物战样本(biowarfare sample)等。
偏离所公开的实施方式的来自具体细节的变化当然是可能的，而不偏离本发明的范围。涉及范围的所有问题应通过参考所附权利要求来回答。

Claims (18)

1.一种用于快速鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法，包括下列步骤：
从所述微生物菌剂获得对于发射波长的范围的荧光测量结果，所述发射波长的范围在多个激发波长处被获得；
变换所述荧光测量结果，从而最小化生物组内的荧光测量结果的菌株间变化；以及
借助于编程计算机，执行被编码为对经变换的荧光测量结果操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在所述样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别；
其中所述多级别分类算法对于所述多级别分类算法中的每个级别包括下列步骤：
对一组预定的激发/发射对的经变换的荧光测量结果和协方差矩阵的逆矩阵执行距离计算；
使用所述距离计算的结果以及最小距离阈值和低区别阈值执行分类解释；以及
产生分类结果；
其中所述一组预定的激发/发射对在激发和发射值的整个范围内从来自已知的微生物菌剂的内在荧光测量结果得到，所述一组预定的激发/发射对针对其区分开不同的微生物菌剂的能力而被选择。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多级别分类算法以所述分类层级中的较高级别到所述分类层级中的较低级别的顺序单调地进行。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述多级别分类算法首先按革兰氏类别、接着按科并接着按种对所述微生物菌剂分类。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述变换步骤包括计算给定的激发波长的所述荧光测量结果的自然对数并计算所述自然对数的值的一阶导数的步骤。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述多级别分类算法包括处理指令的革兰氏分类级别组，以及
其中所述革兰氏分类级别组包括处理指令的第一分支，所述处理指令的第一分支包括对在包括被怀疑在所述样本中的一组微生物菌剂的模型中限定的每个革兰氏类别的距离计算和革兰氏分类解释步骤；
其中所述革兰氏分类级别组包括处理指令的第二分支，所述处理指令的第二分支包括对在所述模型中限定的所有生物科的距离计算和所有科分类解释步骤；以及
其中产生分类结果的步骤包括合并来自革兰氏分类解释和所有科分类解释的结果的步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述多级别分类算法包括革兰氏-科分类级别，其中所述革兰氏-科分类级别包括处理指令，所述革兰氏-科分类级别包括的处理指令执行对在包括被怀疑在所述样本中的一组微生物菌剂的模型中限定的每个生物科的距离计算和使用对在模型中限定的每个生物科的距离计算的结果、最小距离阈值和低区别阈值的革兰氏-科分类解释步骤。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述多级别分类算法包括革兰氏-科种分类级别，其中所述革兰氏-科种分类级别包括处理指令，所述革兰氏-科种分类级别包括的处理指令执行对在包括被怀疑在所述样本中的一组微生物菌剂的模型中限定的每个生物种的距离计算和使用对在模型中限定的每个生物种的所述距离计算的结果、最小距离阈值和低区别阈值的革兰氏-科种分类解释步骤。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述样本包括动物血液的样本。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述动物血液是人类血液。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述微生物菌剂浓缩到团粒沉淀或团粒沉淀状块中，且其中所述荧光测量结果从所述团粒沉淀或团粒沉淀状块得到。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述团粒沉淀或团粒沉淀状块被包含在密封的一次性设备内。
12.一种用于快速鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的测量设备，包括：
用于从所述微生物菌剂获得对于发射波长的范围的荧光测量结果的装置，所述发射波长的范围在多个激发波长处被获得；以及
计算机，其被编程为变换所述荧光测量结果从而最小化生物组内的荧光测量结果的菌株间变化，且被编程为执行被编码为对经变换的荧光测量结果操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在所述样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别；
其中所述多级别分类算法对于所述多级别分类算法中的每个级别包括下列步骤：
对一组预定的激发/发射对的经变换的荧光测量结果和协方差矩阵的逆矩阵执行距离计算；
使用所述距离计算的结果以及最小距离阈值和低区别阈值执行分类解释；以及
产生分类结果；
其中所述一组预定的激发/发射对在激发和发射值的整个范围内从来自已知的微生物菌剂的内在荧光测量结果得到，所述一组预定的激发/发射对针对其区分开不同的微生物菌剂的能力而被选择。
13.一种用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的方法，其包括下列步骤：
在激发和发射值的整个范围内从已知的微生物菌剂实验地获得内在荧光测量结果，并针对区分开不同的微生物菌剂的能力从这样的测量结果中选择一组激发/发射对；
按照所述一组激发/发射对，从未知的微生物菌剂获得内在荧光测量结果；
变换来自未知的微生物菌剂的所述内在荧光测量结果，从而最小化在生物组内的内在荧光测量结果的菌株间变化；以及
使用经变换的内在荧光测量结果和所述从已知的微生物菌剂实验地获得的内在荧光测量结果、借助于执行分类算法的编程计算机来鉴定和/或表征所述未知的微生物菌剂；
其中所述分类算法包括被编码为对所述经变换的内在荧光测量结果操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在所述样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别；
其中所述多级别分类算法对于所述多级别分类算法中的每个级别包括下列步骤：
对一组预定的激发/发射对的经变换的内在荧光测量结果和协方差矩阵的逆矩阵执行距离计算；
使用所述距离计算的结果以及最小距离阈值和低区别阈值执行分类解释；以及
产生分类结果；
其中所述一组预定的激发/发射对在激发和发射值的整个范围内从来自已知的微生物菌剂的内在荧光测量结果得到，所述一组预定的激发/发射对针对其区分开不同的微生物菌剂的能力而被选择。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述样本包括动物血液的样本。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述动物血液是人类血液。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述未知的微生物菌剂被浓缩到团粒沉淀或团粒沉淀状块中，且其中所述未知的微生物菌剂的内在荧光测量结果从所述团粒沉淀或团粒沉淀状块得到。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述团粒沉淀或团粒沉淀状块被包含在密封的一次性设备内。
18.一种用于鉴定和/或表征存在于样本中的微生物菌剂的测量设备，包括：
用于存储在激发和发射值的整个范围内从已知的微生物菌剂实验地获得的内在荧光测量结果的存储器，所存储的测量结果为针对区分开不同的微生物菌剂的能力而选择的一组激发/发射对；
用于按照所述一组激发/发射对从未知的微生物菌剂获得内在荧光测量结果的装置；以及
计算机，其被编程为变换来自未知的微生物菌剂的所述内在荧光测量结果从而最小化在生物组内的内在荧光测量结果的菌株间变化，并被编程为使用经变换的内在荧光测量结果和所述从已知的微生物菌剂实验地获得的内在荧光测量结果、使用分类算法来鉴定和/或表征所述未知的微生物菌剂；
其中所述分类算法包括被编码为对所述经变换的内在荧光测量结果操作的一组处理指令的多级别分类算法，多个级别相应于被怀疑在所述样本中的微生物菌剂的在分类层级中的不同级别；
其中所述多级别分类算法对于所述多级别分类算法中的每个级别包括下列步骤：
对一组预定的激发/发射对的经变换的内在荧光测量结果和协方差矩阵的逆矩阵执行距离计算；
使用所述距离计算的结果以及最小距离阈值和低区别阈值执行分类解释；以及
产生分类结果；
其中所述一组预定的激发/发射对在激发和发射值的整个范围内从来自已知的微生物菌剂的内在荧光测量结果得到，所述一组预定的激发/发射对针对其区分开不同的微生物菌剂的能力而被选择。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6706267B2 (ja) * 2015-03-06 2020-06-03 ポカード・ディアグノスティクス・リミテッドＰｏｃａｒｅｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｌｔｄ． 迅速内部蛍光法を使用した耐性遺伝子を含む細菌の無試薬同定
CN108827936B (zh) * 2018-06-15 2024-03-08 何坚 一种血液培养报阳检测装置与方法
CN109554437B (zh) * 2018-12-10 2022-05-17 湖南长沙天地人生物科技有限公司 一种双波长微生物生化反应动态判读检测方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4018653A (en) 1971-10-29 1977-04-19 U.S. Packaging Corporation Instrument for the detection of Neisseria gonorrhoeae without culture
US3963355A (en) 1972-05-22 1976-06-15 Mcdonnell Douglas Corporation Process and apparatus for analyzing specimens for the presence of microorganisms therein
US4116775A (en) 1976-05-03 1978-09-26 Mcdonnell Douglas Corporation Machine and process for reading cards containing medical specimens
US4118280A (en) 1976-05-03 1978-10-03 Mcdonnell Douglas Corporation Automated microbial analyzer
US4038151A (en) 1976-07-29 1977-07-26 Mcdonnell Douglas Corporation Card for use in an automated microbial detection system
US5217876A (en) 1988-03-15 1993-06-08 Akzo N.V. Method for detecting microorganisms
US5164796A (en) 1988-03-15 1992-11-17 Akzo N.V. Apparatus and method for detection of microorganisms
US5518895A (en) 1990-02-15 1996-05-21 Akzo N.V. Device for detecting microorganisms using piezoelectric means
US4945060A (en) 1988-03-15 1990-07-31 Akzo N. V. Device for detecting microorganisms
US5162229A (en) 1988-03-15 1992-11-10 Akzo N.V. Device and method for enhanced recovery and detection of microbial growth in the presence of antimicrobial substances
US5094955A (en) 1988-03-15 1992-03-10 Akzo N.V. Device and method for detecting microorganisms
US5432061A (en) 1992-09-01 1995-07-11 Becton Dickinson And Company Method and apparatus for detecting microorganisms
US5344417A (en) 1992-09-11 1994-09-06 Becton, Dickinson And Company Universal fitting for inoculation receptacles
US5371016A (en) 1993-04-26 1994-12-06 Becton, Dickinson And Company Detecting biological activities in culture vials
US5397709A (en) 1993-08-27 1995-03-14 Becton Dickinson And Company System for detecting bacterial growth in a plurality of culture vials
US5498543A (en) 1994-06-07 1996-03-12 Becton Dickinson And Company Sub-compact blood culture apparatus
US5609828A (en) 1995-05-31 1997-03-11 bio M erieux Vitek, Inc. Sample card
US5800778A (en) 1995-05-31 1998-09-01 Biomerieux Vitek, Inc. Sealant for sample holder
KR100436473B1 (ko) 1995-06-05 2004-11-26 악조 노벨 엔.브이. 미생물검출장치및방법
US5518923A (en) 1995-06-06 1996-05-21 Becton Dickinson And Company Compact blood culture apparatus
US5762873A (en) 1996-02-21 1998-06-09 Biomerieux Vitek, Inc. Automatic sample testing machine
US5770394A (en) 1996-05-22 1998-06-23 Becton Dickinson And Company Method and apparatus for detecting bacteria using a blood culture froth
DE19882221T1 (de) 1997-03-17 2000-02-10 Canadian Space Agency Saint Hu Verfahren und Vorrichtung zum automatischen Impfen von Kulturmedien mit bakteriellen Proben aus klinischen Probenbehältern
US6709857B2 (en) 2001-06-26 2004-03-23 Becton, Dickinson And Company System and method for optically monitoring the concentration of a gas in a sample vial using photothermal spectroscopy to detect sample growth
US7211430B2 (en) 2001-08-03 2007-05-01 Becton, Dickinson And Company System for stirring growth medium
US6780602B2 (en) 2001-11-01 2004-08-24 Microbiosystems, Limited Partnership Taxonomic identification of pathogenic microorganisms and their toxic proteins
DE10155185A1 (de) * 2001-11-12 2003-05-22 Synthon Kg Verfahren zur Charakterisierung und/oder Identifizierung von Wirkmechanismen antimikrobieller Prüfsubstanzen
CN101432739A (zh) * 2004-07-29 2009-05-13 金实验室公司 超灵敏传感器和分析物的快速检测
CN100593172C (zh) * 2008-04-18 2010-03-03 首都师范大学 一种基于显微图像的微生物识别系统及方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a Hierarchical Classification System with Artificial Neural Networks and FT-IR Spectra for the Identification of Bacteria;THOMAS UDELHOVEN等;《APPLIED SPECTROSCOPY》;20001031;第54卷(第10期);摘要，第1471页右栏最后1行-第1472页左栏第3行，第1472页左栏第15-20行，右栏第31-35行，第51-53行 *
Learning Classifiers Using Hierarchically Structured Class Taxonomies;Feihong Wu等;《6th International Symposium》;20050729;3.1节第2段，附图1 *

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Publication number Publication date
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