CN100489501C - 用于探测微生物的存在并确定它们的生理状态的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于探测液体、空气中和非活体表面上微生物的方法和设备，其中样品暴露于能够激发各种代谢物、协同因子和细胞及孢子成分的特定能量的电磁辐射之下，待取样的微生物细胞包含于这些成分中(更具体地说是受激的代谢物，协同因子和/或其他细胞成分)，发射出可以被测得的荧光。从微生物成分的荧光信号中减去背景信号及散射激发信号，要求本征微生物成分的相对荧光信号处于生理范围之内，并且用背景校正的荧光信号的大小算出样品中的微生物含量。
Description
本发明涉及一种用于检验空气或液体中非活体表面上微生物(细菌、霉菌、原生动物、立克次体和/或微生物)和孢子存在的方法和装置。
发明背景
所有的微生物细胞最基本的就是通过呼吸为它们的细胞活动产生能量。当在活细胞中发生细胞呼吸时，吡啶核苷酸减少，黄素被氧化，并且产生其它的辅酶和代谢物。或者，发现孢子含有丰富的2，6-吡啶二羧酸钙复合物(而在自然界中稀有的荧光化合物)。吡啶核苷酸、黄素和其它辅助因子的氧化状态和/或2，6-吡啶二羧酸钙的存在可以通过在探测这些各个荧光团发出的特征辐射之后用适当的电磁辐射同时激发每种成分得以阐明。用对荧光细胞和内生孢子成分进行激发的多种特征能量同时激发样品以及随后收集并探测发射和反射/散射的光能量(与荧光团分别是有关的和独立的)对于通过本文所述方法探测样品或非活体表面上的微生物是基本的步骤。
在现实世界的样品中呼吸细胞的探测用上述方法更易于实施的原因有二。首先，用多种激发能量同时激发微生物并确保同时探测大量荧光信号减少了干涉的机会，因为干涉源复制大量荧光团的特征的可能性非常小。其次，已经发现本征代谢物以及由此导致的荧光信号的相对量落在限定的生理范围之内。信号的分析用一种能够有后面两种功能的方法实现：(1)把探测到的起源于任何存在的微生物的荧光信号与干涉或背景信号和/或散射激发信号分开，和(2)满足从微生物代谢物、微生物组份和孢子成分发出的信号强度落在生理范围之内的要求。因此，探测样品中微生物的基本原理由下列步骤组成：第一，用细胞代谢物、微生物成分和孢子成分的多种特征激发能同时激发样品；第二，随后收集大量的各个荧光团信号(与这些受激代谢物的最大和最小辐射有关)；和最后，用一种能够消除背景荧光团并将代谢物的相对信号幅值与已知的生理范围比较的方法分析收集到的信号。
用于微生物探测的长期建立的技术和方法依赖于由代谢反应、免疫捕获或期望核苷酸序列的放大导致的产物的探测。因为本发明采取从微生物中探测多个本征荧光团与分析由这些荧光团产生的信号相对量的分析结合，所以不仅可以判定微生物的存在与否，而且还能够区分活细胞、非活细胞和孢子。这种方法和装置不用反应试剂、不需要与样品物理接触，并且“实时”传输结果。
还有其它采用荧光的微生物探测方法。许多流式细胞计数法依赖于与作为分析物目标的免疫蛋白共轭的染料分子的荧光。在美国专利US4,745,285(Recktenwald等)中可以找到这样的一个例子。其它的荧光法采用附加的荧光代谢染料或染料共轭物(Peeters的美国专利US4,900,934)。
有一些基于荧光的微生物探测法利用本征细胞荧光团。一种方法(Reyes等的美国专利US5,424,959)简单地将样品荧光谱和频谱库比较。Alfano的美国专利US5,474,910中描述的一种方法将样品表面的荧光与清洁表面比较。用在微生物探测法中的盛行的本征荧光团是还原的吡啶核苷酸NADH。在Ho的美国专利US5,701,012中，在包含样品的强制气流中探测NADH荧光团并与空白试验比较。或者，在Powers的美国专利(US5,760,406和US5,968,760)中，采用NADH荧光团与散射的激励信号或其它荧光辐射之比。
在分别于1998年6月2日和1999年10月19日提交的并在此引为参考的美国专利US5,760,406和US5,968,760中，公开了一种探测非活体表面和样品上的微生物的方法和设备。用波长大于350nm的电磁辐射(1)激发待检样品以促使存在于微生物细胞中的吡啶核苷酸激发，并且用波长小于340nm的电磁辐射(2)激发该样品以测量其它的环境特征。计算并比较微生物吡啶核苷酸荧光团辐射(由不同波长的激发导致)与反射的激发信号之比，作为探测和量化样品中存在的微生物的根据。本发明能够对非活体表面包括肉类上的微生物定位和定量。
鉴于Powers的前述发明对于单一代谢物的探测依据于荧光比率，本发明利用一种或多种荧光团的激发，结合一种减去由于散射/反射激发能导致的探测信号的算法。在设计和方法学上的这种区别使本发明比其它荧光法能够更好地探测和量化在液体和空气中的非活体表面的微生物。本发明在微生物的探测方面较为优越，因为多个本征荧光团的探测减少了背景干扰导致的假阳性结果的概率。使用前述方法和设备的微生物探测用于生物战用毒剂探测、细胞分选、医学诊断、灭菌检验、水质量测试、食物生产和制品的安全性，并且用于担负探测、净化污染和公共基础设施的保护的应激反应部队。
随着近来关于食物(肉食、家禽、海鲜、浆汁、水果和蔬菜)中细菌污染的宣布，有了一种对提供可用于探测食物中、食物上和食物制品表面上的微生物污染的方法和设备的需求。作为本发明目的的此方法和设备例如应该能在肉类和家禽生产设施中经济且快捷的操作。
本发明的另一个目的在于提供一种用在食物上微生物污染探测的方法和设备，其中通过电磁辐射激发吡啶核苷酸、黄素和其它协同因子以及孢子成分的荧光团，从而识别代谢反应以及食品组织中微生物的孢子成分，使得能够不与所述食物接触地判定食物上的微生物污染。
根据本发明的另一个目的，提供一种可以用在探测液体和空气中非活体表面上的微生物污染的方法和设备。作为本发明的一个特定的目的，本方法和设备可以用于例如健康检查设备、实验室研究、水处理和测试站、公共建筑和战场上经济且快捷地查找微生物和微生物污染。
本发明的另一个目的在于提供一种用于探测非活体表面及液体和空气中微生物污染的方法和设备，其中通过电磁辐射激发吡啶核苷酸、黄素和其它协同因子及孢子成分的荧光团，从而从介质或散射背景中区分微生物的代谢反应和/或孢子的存在，使得能够不与样品接触地确定样品中的微生物污染。
本发明的另一个目的在于提供一种用于在存活细胞、非存活细胞、孢子和无污染样品之间进行区分的方法和设备，其中通过每个具有不同相对量的本征荧光团的电磁辐射激发吡啶核苷酸、黄素和其它协同因子以及孢子成分的荧光团，从而从介质或散射背景中区分微生物的存在。
发明概述
本发明的主要方案在于提供一种用于微生物探测的方法和设备，其中样品暴露在大量特定能量的电磁辐射之下，这种特定的能量能够从各种代谢物、协同因子和细胞以及孢子成分中激发出荧光团。因而，其中包含的被取样的微生物细胞和孢子(以及更具体地说是受激代谢物、协同因子和/或其它细胞、病毒和/或孢子成分)发射可以被探测的荧光。利用这样一种方法分析收集到的荧光信号(与细胞/病毒/孢子成分发出的最大和/或最小信号有关)：该方法(1)能够消除任何背景或反射/散射激发信号，和(2)将代谢物、协同因子和孢子成分的相对荧光信号与已知的生理范围进行比较。
因此，本发明的方法和设备提供了一种不与样品接触即可扫描样品、从而探测和定量微生物污染的经济且快捷的方式。不接触地评估样品中的微生物污染减小了引入污染的风险。
根据本发明的此种形式，通常可以利用发射200nm以上的电磁辐射的光源。根据本发明的形式，光源发射的光限于或被滤波成通过能激发吡啶核苷酸、黄素、卟啉(porphorys)、协同因子和/或2，6-吡啶二羧酸钙的电磁能。
根据本发明的另一实施例，可以将紫外电磁辐射能(波长在200和300nm之间)导向样品。紫外光激发芳族氨基酸和核酸，它们的部分辐射被样品自吸收，结果激发2，6-吡啶二羧酸钙和吡啶核苷酸，而部分辐射被样品自吸收，反过来激发协同因子(如黄素)，部分辐射用于激发卟啉和其它黄素。如前所述地收集并分析样品的荧光辐射。紫外光的使用导致样品较浅的取样穿刺深度。
根据本发明的另一实施例，可以导向能够激发特定的代谢物、协同因子和细胞/孢子成分的电磁辐射能以及不与微生物发生相互作用的辐射能。因此，根据本发明的本实施例，可以通过比较微生物的辐射信号与样品的反射/散射比来测量从样品(从微生物成分发出的荧光信号和从样品反射/散射的荧光信号)发出的荧光信号并确定微生物的存在。
根据本发明的实践，不仅用传感器探测本征荧光团产生的荧光，而且还探测反射或散射的电磁辐射。这样对信号归一化并补偿信号中可能由于在探针和被扫描样品之间改变距离导致的偏差以及不同样品或表面之间的偏差。
还发现通过迅速改变以不同于60Hz的频率导向样品的电磁辐射可以基本上把环境光(尤其是荧光)的影响减到最小。激发能的调制还使得能够移动传感器，从而在基本上不影响测量微生物含量的精确度的情况下把电磁辐射导向样品的不同部位。
大多数市场上的微生物探测器依赖于微生物培养，以获得之后用于物种(属)识别的不同代谢测试的应用所需的足够大的样品(生长物)。但是，需要细菌生长物的技术可能不能探测存活的但不能培养的细胞。反之，采用的生长介质可能对具有特定表型的细菌的生长有利。
其它的微生物探测方法依赖于微生物本身或它们的组分的免疫捕获。最通行的免疫测定法-酶链免疫吸附法(ELISA)具有最好的几百个细胞的探测极限(这远远低于非常强的传染性细菌，如弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)的ID50)。这些技术同样有很严重的问题，因为采用的抗体对pH值、离子浓度和温度的变化非常敏感。导向微生物组分的抗体不仅在开发和制备方面很昂贵，而且在“污秽”样品中易于受到许多蛋白水解酶的分解。另外，附着在表面(如微孔板或磁珠)上的抗体分子的密度不象通常所需的那样高。
更灵敏但不太迅速的鉴定方案利用聚合酶链式反应(PCR)放大细菌DNA或RNA以及随后的核酸排序，以探测特殊菌种的存在。这种一般的放大和排序技术要求技术专家进行操作，并且不适于在专门的实验室条件以外的地方使用。基于PCR的技术利用存在微生物这一结果，因为这种技术只提供对整体目标核酸序列而不一定是微生物的阳性分析。而且，在环境样品中特定微生物的探测由于干涉“污秽”或真实样品中目标DNA有效放大的材料的存在而难以进行。
在样品溶解或热解之后对挥发性细胞成分的质谱分析被用于探测细菌和病毒。不幸的是，因为微生物的挥发性组分的组成随着不同的生长环境条件而变化，所以分析物的识别不可靠。
基于免疫学、质谱和PCR的方法将均不能够断定样品中的微生物是否存活。基于免疫学的和PCR的方法都采用较为昂贵的需要特殊处理的反应试剂。此处所述的微生物探测法和设备能够确定探测到的细菌、霉菌、原生动物和立克次体的生存能力。该方法和设备不需要反应试剂，不与样品接触，操作不昂贵，“实时”传输结果。通过下面对优选实施例的详细描述以及权利要求书，本发明的这些及其它优点将变得更为明显。
附图简述
图1是本发明最基本特点的框图；
图2是采用345nm的辐射激发时低发荧光介质中细菌(苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))溶液的发射谱，其中实线表示细菌的发射谱，虚线表示瑞利散射对该谱线所起的作用；
图3表示(背景去除后)由于在不同波长处受激的各种本征荧光团，存活细胞、非存活细胞和孢子(苏云金芽孢杆菌)溶液的发射谱；
图4表示溶液中苏云金芽孢杆菌的存活细胞、非存活细胞和孢子之间荧光信号的分布差(背景去除后归一到440nm的辐射)；
图5表示背景去除后22种菌种的440nm到480nm荧光辐射率的分布；
图6表示本发明实施例中还原吡啶核苷酸(RPN)荧光辐射对无菌表面上存活的和非存活的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)细胞辐射的响应曲线；
图7表示火鸡表面大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)的RPN荧光辐射的响应曲线；
图8表示纸张和各种信封样品的荧光发射谱中的频谱窗；
图9表示本发明实施例中背景校正的780nm的荧光通道对密封的信封中几百万苏云金芽孢杆菌孢子的响应曲线。
发明的详细描述
本发明所述设备的基本元件示于图1中的框图。该设备由光源、激发滤波器、聚焦光学元件、会聚光学元件、发射滤波器和探测器组成。电磁辐射从光源指向样品，如果需要的话，经激发滤波器和聚焦光学元件激励样品中的本征荧光团。散射及反射的激发辐射与发射的荧光辐射一起被会聚光学元件会聚并导向探测器。发射滤波器确保只测量到感兴趣的能量。
包括不同结构并使用发散元件的本发明的各个实施例是可行的。微生物探测法的基本元件允许：激发多个微生物本征荧光团，会聚并探测发射的和反射/散射的光能量，并利用能够校正背景干扰和比较相对信号强度与已知生理学参数的方法分析探测到的信号。在利用此方法的任何设备中采用的结构和元件应该与应用的要求以及预料到的干涉相匹配。
利用一种能够提供宽带照明的光源是可行的并且有时也是需要的。采用的光源类型受光源能产生激发感兴趣的本征微生物组分所需波长的电磁辐射的能力影响。另外，有时希望采用一种能够在中止周期期间测量环境背景的脉冲光源。可以使用的光源包括用于所需激发能的各种灯泡(如汞、钨、氘、氙)的灯，发光二极管(LED)和二极管激光器。使用的光源的种类依据于必需的激发辐射的强度和所需探测范围。
用在本发明各个实施例中的激发和发射滤波器包括干涉滤波器、浸渍玻璃、截止滤波器系列、明胶滤波器、单色仪和光栅等。使用的发射滤波器的光截止特征依据于其分析法可以承受的散射和反射激发辐射信号的多少或者需要怎样的探测范围。如果采用只有所需能量的光源，则激发滤波器可能就不是必需的；如果光源是准直的(如激光)，则可能就不需要聚焦光学元件。(聚焦光学元件的目的是将激发辐射导向抽样区域或空间)。注意到采用多光子激发是很重要的，它可以使用能量小于感兴趣荧光团的激发能的光源。
会聚光学元件的目的是把从受激微生物荧光团发出的光以及从样品散射和反射的光传输到探测器。如果用干涉滤波器鉴别这些辐射能量，则需要为这些滤波器对汇集的光束准直以优化操作。也可以用光纤光缆把激发辐射传输到样品并会聚发出的辐射，将它们导向探测器。因为许多光学元件在紫外和可见波段显示荧光，所以有时希望并且可以利用抛光的金属反射体、蓝宝石、熔融硅、石英、MgF2、和/或CaF2光学元件。
探测器用于把发出的电磁辐射转变成可以测量的电信号。有很多不同灵敏度的探测器可以用于本发明的实施例：光电倍增管(PMTs)、雪崩光电二极管(APDs)、针形二极管、CCD等。选择的探测器依据于待测的辐射的能量，发射信号的强度以及设备所需的探测限度。
用一种能够去除任何背景荧光和散射的激发辐射的方法分析被转变成放大电信号的会聚的发射能量。用于特定实施例中的激发和发射能量的选取依据于目标微生物呵它们预期的生理状态。表I列出了在各种微生物(和蛋白质毒物)中发现的一些更丰富的本征荧光化合物的激发和辐射范围并表示每种存在的可能性。(蛋白质微生物毒物可以利用本方法和设备以类似于病毒检测的方式检测)。
表I.微生物荧光团的激发和发射范围
| 激发范围(nm) | 发射范围(nm) | 荧光团 | 存活细胞 | 非存活细胞 | 孢子 | 病毒 | 毒物 |
| 260-285 | 340-360 | 核酸 | X | X | X | X | |
| 265-280 | 340-360 | 色氨酸 | X | X | X | X | X |
| 265-280 | 340-360 | 酪氨酸 | X | X | X | X | X |
| 270-280 | 380-400 | ATP | X | ||||
| 270-290 | 460-480 | 2，6-吡啶二羧酸钙 | X | ||||
| 310-330 | 400-430 | 2，6-吡啶二羧酸钙 | X | ||||
| 320-330 | 430-450 | RPN | X | ||||
| 340-365 | 430-450 | RPN | X | ||||
| 340-360 | 470-490 | RPN | X | ||||
| 430-450 | 520-535 | 黄素 | X | ||||
| 470-485 | 560-580 | 黄素 | X | ||||
| 560-585 | 615-680 | 卟啉 | X | X | |||
| 560-580 | 620-700 | 黄素 | X | X | |||
| 610-650 | 750-800 | 未知 | X | X | |||
| 650-670 | 730-780 | 未知 | X | X |
(在表I中，ATP为三磷酸腺苷，RPN指还原的吡啶核苷酸)
图2表示当用345nm的光激发时，发荧光最少的介质中细菌溶液的发射谱(苏云金芽孢杆菌)。实线表示观察到的细菌发射谱，虚线表示瑞利散射对该谱线的作用。从观察到的频谱中减去瑞利散射背景产生由于345nm的光激发的代谢物所致的实际发射谱(图3D)。由波长λ处的瑞利散射产生的背景量值可以由方程I＝A/λ4+C表示。(在此方程中，I是入射光强度；A由实验条件决定；常数C的值主要由用于收集数据的仪器特征决定)。用325nm、345nm和570nm的光激发时的细菌溶液的合并发射谱在接近515nm和850nm处最小。用在515nm和850nm处测得的荧光强度由前述方程计算未知值A和C，最终能够从探测信号中减去背景信号。瑞利散射背景减法特别适合于液体和空气样品；其他的样品介质显示出不同的背景并且可以用合适的方法(如Mie散射等)处理。
图3表示存活细菌、非存活细菌和孢子溶液(苏云金芽孢杆菌)由于在280nm(A)，315nm(B)，325nm(C)，345nm(D)，570nm(E)和660nm(F)处激发的不同本征荧光团所产生的减去背景的发射谱。图4表示在所述存活细胞(A)、非存活细胞(B)和孢子(C)溶液之间的荧光信号的显著差异(减去背景散射之后归一到440nm的发射谱)。该分析方法利用活细胞、非存活细胞和孢子溶液之间的这些差异区分这些样品。探测到的并减去了背景散射的信号量值用于量化样品中的微生物数量。
在本发明的实施例中，利用325nm、345nm和570nm的激发滤波器将能够探测和区分存活细胞、死亡细胞和孢子。这些激发滤波器将能够激发还原的吡啶核苷酸、各种黄素、2，6-吡啶二羧酸钙、血红素蛋白和其他成分。用于受激荧光团发射谱探测的滤波器的选择包括那些在405nm、440nm、480nm和650nm的滤波器；这些滤波器对应于受激荧光团的发射谱的最大值。另外，其他发射滤波器(545nm和850nm)使得能够确定反射/散射背景的量值。为了达到低的探测限度，构成下列结构。用脉冲氙灯作为具有干涉激发滤波器的光源。加入聚焦光学元件以在到达干涉滤波器之前准直光束。聚焦光学元件和会聚光学元件由抛光的反射光学元件构成，消除了任何背景荧光。会聚大约90％发射信号的抛物面会聚光学元件与干涉发射滤波器、准直光学元件和PMT装配在一起。仪器的功能、数据汇集、积分和分析由微控制器控制。
在本发明的实施例中，探测法要求探测到的和校正了背景的信号的相对比例处于一定的生理范围之内。对不止二十种的不同菌种和孢子的500多份样品进行的分析表明，大量的比例可以用于确保统计学显著的鉴别。图5只表示22种菌种中的一个比例(减去背景之后440nm/480nm之比)，由此限定了该探测法要求的生理范围。该方法还可以从无菌介质和其他生化缓冲液中识别包含细菌的溶液。利用各种方法和下列比例(650/405，405/440，480/440，650/440，405/480和650/480)，如Neyman-Pearson测试、模糊逻辑和训练的神经网络(利用多层感知器)，这些方法分别给出探测细菌存在的概率为：99％、95.6％和100％。(这些探测法对500个数据点发出错误信息的概率为：Neyman-Pearson(0.01％)，模糊逻辑(0％)，和神经网络(0％))。
图6表示用于玻璃载片的表面上存活和非存活伤寒沙门氏菌细胞的仪器的发射谱数据(RPN)。此荧光信号中存活细胞和非存活信号的差异很清楚。图7表示在火鸡表面上对大肠埃希氏杆菌的RPN发射响应。探测限度远远低于用其他微生物的探测法的探测限度，不需要反应剂或触碰肉体表面而实时观测。
在本发明的另一个实施例中，用以570nm和660nm为中心的LED来激发在图3D和3F中所示孢子和死细胞中发现的成分。图8表示当用660nm的光激发时纸张和各种信封样品时的发射谱；图中的箭头表示在此激发中预期的孢子和非活体的发射位置。因为纸张和信封包含此频谱窗，所以可以探测到纸张后面及信封内部的细菌内生孢子。作为在610nm和680nm之间激发在前述频谱窗中发荧光的孢子成分所得的非活体细胞成分的发射谱，有时希望并且可以包括在570nm的激发谱。图9表示信封和密封在同样信封内部的冻干的苏云金芽孢杆菌孢子样品在780nm背景校正过的荧光信号方面的差异。利用本发明的实施例，可以迅速探测信封中的孢子，不需要反应剂、样品处理、与样品接触或打开信封。
以上所述的本发明实施例意在举例，利用上述基本原理的其他结构、变化和改型对于本领域的技术人员都是显而易见的，不会背离本发明的实质。探测微生物的本方法和设备的范围包括利用同时激发多个本征微生物荧光团，随后利用描述背景信号并要求所述信号处于生理范围内的方法分析探测到的发射谱。所有的变化、改型和结构都将落在本发明权利要求限定的范围之内。
Claims (27)
1.一种探测和定量微生物的方法，包括：
a.激发至少一个具有在200nm以上电磁辐射波长的特定激发范围的本征微生物荧光团；由此激发微生物内的本征荧光团以发射荧光；
b.探测与最大和最小的受激微生物荧光团有关的荧光信号强度；
c.探测在没有激发的情况下在最小和最大的微生物荧光处的背景信号强度；
d.由减去背景的最小强度计算最大的微生物荧光的反射和散射强度；
e.从探测到的微生物荧光团的信号中减去计算的反射和散射信号强度和测量的背景强度；已减去背景、反射和散射因素的探测到的荧光的大小与微生物的数量直接成比例；和
f.由探测到的、已减去背景、反射和散射因素的荧光的大小定量样本中的微生物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于确定已减去测定的背景和计算的反射和散射强度的多个荧光信号强度的比例，由此，根据下列要求探测微生物的生理状态：背景、散射和反射校正过的荧光信号的比例处于特定的生理范围以及由比例处于所需范围的探测到的信号的大小决定微生物的数量。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于从以下组中选取微生物荧光团：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于待测的存活微生物包括至少以下一种：细菌、霉菌、原生动物和立克次体；用于探测微生物的本征微生物荧光团包括至少以下成分之一：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于待测的非存活微生物包括至少以下一种：细菌、霉菌、原生动物和立克次体；用于探测微生物的本征微生物荧光团包括至少以下成分之一：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于待测微生物是细菌内生孢子，用于探测内生孢子的本征荧光团包括至少以下成分之一：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于待测微生物包括病毒，用于探测病毒的本征荧光团包括核酸聚合物、含酪氨酸的蛋白质和含色氨酸的蛋白质。
8.一种用于探测和定量微生物的方法，包括：
a.用激发波长在200nm-300nm范围的紫外电磁辐射激发多个微生物本征荧光团，由此使存在的包含本征荧光团的任何微生物受到激发，发出荧光，其中有一些荧光是自吸收的，它们反过来激发其它的微生物荧光团发射荧光；
b.探测与最大和最小的受激微生物荧光团有关的荧光信号强度；
c.探测在没有激发的情况下在最小和最大的微生物荧光处的背景信号强度；
d.由减去背景的最小强度计算最大的微生物荧光的反射和散射强度；
e.从探测到的微生物荧光团的信号中减去计算的反射和散射信号强度和测量的背景强度；
f.确定处于生理范围之内的探测到的已经减去背景、反射和散射成分的荧光信号之比例，此探测到的已经减去背景、反射和散射成分的荧光信号的大小直接与微生物的数量成比例；和
g.由比例处于生理范围内的探测到的、已减去背景、反射和散射因素的荧光信号的大小定量样本中的微生物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述微生物的本征微生物荧光团包括下列成分中的一种或多种：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷和2，6-吡啶二羧酸钙。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于通过从核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷和2，6-吡啶二羧酸钙的发射自吸收激发的微生物荧光团包括下列成分中的一种或多种：2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于待测的存活微生物包括至少以下一种：细菌、霉菌、原生动物和立克次体；用于探测微生物的本征微生物荧光团包括至少以下成分之一：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于待测的非存活微生物包括至少以下一种：细菌、霉菌、原生动物和立克次体；用于探测微生物的本征微生物荧光团包括至少以下成分之一：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于待测微生物是细菌孢子，用于探测细菌孢子的本征荧光团包括至少以下成分之一：核酸聚合物、含色氨酸的蛋白质、含酪氨酸的蛋白质、三磷酸腺苷、2，6-吡啶二羧酸钙、还原吡啶核苷酸、黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
14.一种用于探测非存活表面或空气或液体中微生物的设备，包括：
a.用于将电磁辐射导向样品的装置，所述装置适于发射至少能够激发一个200nm以上的本征微生物荧光团的辐射能量从而激发含有所述本征荧光团的微生物以发射荧光，其中用聚焦光学元件将电磁辐射导向样本，所述电磁辐射由至少以下一种光源发出：汞灯泡、钨灯泡、氘灯泡、氙灯泡、发光二极管、二极管激光器或这些电磁辐射源的组合；任选的用适当的干涉滤波器、浸渍玻璃滤波器、截止滤波器、截止滤波器系列、明胶滤波器、单色仪、光栅或它们的组合滤过导向样本的电磁辐射以激发所述本征荧光团，和
b.电磁辐射探测器，能够将发射的与最大和最小的微生物荧光团有关的荧光信号、反射的激发能量和散射的激发辐射转换成电信号，所述探测器适于探测离散波长范围在320nm以上的电磁辐射，以探测与所述微生物荧光团的荧光发射有关的最小和最大荧光，以及反射和散射的激发能量，其中用适当的干涉滤波器、浸渍玻璃滤波器、截止滤波器、截止滤波器系列、明胶滤波器、单色仪、光栅或它们的组合过滤所述探测到的能量，其中用光电倍增管、雪崩光电二极管、针形二极管、CCD阵列将所述发射的荧光信号转换成电信号；和
c.将每一个测量到的电信号转换成数字信号；和
d.由最小荧光信号、反射数字信号和散射数字信号计算背景数字信号；
e.用于通过从与微生物最大荧光相关的数字信号中减去背景数字信号，从而当该差值大于零时探测微生物的分析数字信号以确定微生物的存在的装置。
15.权利要求14所述的设备，其特征在于用于激发本征微生物荧光团的电磁辐射以时间调制脉冲被导向微生物。
16.权利要求14所述的设备，其特征在于所述用于导引电磁波的装置包括时间调制电磁辐射的装置。
17.一种用于探测和定量微生物蛋白质毒物的方法，包括：
a.激发至少一个具有在200nm以上电磁辐射波长特定激发范围的本征荧光团，由此，在蛋白质毒物中存在的所述荧光团被激发以发射荧光；
b.探测与最大和最小的受激荧光团有关的荧光信号强度；
c.探测在没有激发的情况下在最小和最大的微生物荧光处的背景信号强度；
d.由减去背景的最小强度计算最大的微生物荧光的反射和散射强度；
e.从探测到的微生物荧光团的信号中减去计算的反射和散射信号强度和测量的背景强度；已减去背景、反射和散射因素的探测到的荧光的大小与存在的蛋白质毒物的量直接成比例；和
f.由探测到的、已减去背景、反射和散射因素的荧光的大小定量样本中的蛋白质毒物的量。
18.权利要求17所述的方法，其特征在于所述微生物荧光团选自含色氨酸的蛋白质或含酪氨酸的蛋白质。
19.一种探测和定量孢子和非存活细菌的方法，包括：
a.激发至少一个具有在610-670nm激发波长范围的本征微生物荧光团；从而激发在孢子和非存活细菌中存在的所述本征荧光团；
b.探测与最大和最小的荧光有关的信号强度；
c.探测在没有激发的情况下在最小和最大的微生物荧光处的背景信号强度；
d.由减去背景的最小强度计算最大的微生物荧光的反射和散射强度；
e.从探测到的受激微生物荧光团的信号中减去计算的反射和散射信号强度和测量的背景强度；已减去背景、反射和散射因素的探测到的荧光的大小与存在的孢子和非存活细菌的量直接成比例；和
f.由探测到的、已减去背景、反射和散射因素的荧光的大小定量样本中的孢子和非存活细菌的量。
20.权利要求19所述的方法，其特征在于确定多个探测到的、背景校正过的信号的比例；由此根据下列要求区别孢子和非存活细菌：背景校正过的荧光信号的比例处于特定的生理范围以及由比例处于所需范围的探测到的信号的大小决定微生物的数量。
21.权利要求19所述的方法，其特征在于用于探测非存活细菌和细菌孢子的本征微生物荧光团选自：黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
22.权利要求19所述的方法，其特征在于探测表面、纸信封内部、穿过纸、以及溶液中或气溶胶中的非存活细菌和细菌孢子。
23.一种用于探测和定量孢子和非存活细菌的方法，包括：
a.激发多个具有在550-640nm波长之间电磁辐射范围的本征微生物荧光团，由此激发包含本征荧光团的孢子和非存活细菌以发射荧光，其中的部分是在610-670nm被自吸收，以反过来激发其它孢子荧光团发射荧光；
b.探测与最大和最小的荧光有关的荧光信号强度；
c.探测在没有激发的情况下在最小和最大的微生物荧光处的背景信号强度；
d.由减去背景的最小强度计算最大的微生物荧光的反射和散射强度；
e.从探测到的受激微生物荧光团的信号中减去计算的反射和散射信号强度和测量的背景强度；已减去背景、反射和散射因素的探测到的荧光的大小与存在的细菌孢子和非存活细菌的量直接成比例；和
f.由探测到的、已减去背景、反射和散射因素的、其比例位于生理范围内的荧光信号的大小定量样本中的孢子和非存活细菌的量。
24.权利要求23所述的方法，其特征在于所述微生物的本征微生物荧光团包括以下一种或多种：黄素、含卟啉的蛋白质以及其它在610-670nm波段被激发的成分。
25.权利要求23所述的方法，其特征在于二次激发的微生物荧光团包括以下的一种或多种：在610-670nm被激发的本征成分。
26.权利要求23所述的方法，其特征在于探测表面、纸信封内部、穿过纸、溶液中或气体中的所述非存活细菌和孢子。
27.权利要求23所述的方法，其特征在于探测纸信封内部的非存活细菌和孢子，并且通过受激纸产品的辐射激发二次受激的微生物荧光团。
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