JP4033754B2 - 微生物の存在の検出及びその生理学的状態の決定のための方法及び装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、非生体表面上、空気中、液体中の各種微生物（細菌、真菌、原生動物、リケッチア及び／又はその他の微生物）や各種芽胞（以下、胞子とも記載する）の存在を検知するための方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
初歩的事項ではあるが、微生物細胞は全て呼吸により細胞活動のためのエネルギーを産生する。細胞の呼吸が生きた細胞で起こると、ピリジンヌクレオチド類が還元され、フラビン類が酸化され、他の各種補酵素や各種代謝産物が産生される。また、胞子はジピコリン酸カルシウム複合体（胞子以外では自然では稀な蛍光化合物）に富むことが判明している。ピリジンヌクレオチド類、フラビン類、その他のコファクター類の酸化状態及び／又はジピコリン酸カルシウムの存在は、各化合物を適切な電磁放射 (electromagnetic radiation) で同時に励起し、蛍光団それぞれが発する特性放射 (characteristic radiation) を検出することにより、同時に明らかにすることができる。蛍光を発する細胞成分や胞子成分に対する特性励起エネルギーを複数種用いて試料を同時励起し、発光のエネルギーと反射／散乱光のエネルギー（前者は蛍光団に関連し、後者は蛍光団とは独立している）を集めて検出することが、本明細書に記載する方法による試料中や非生体表面の微生物の検出原理である。
【０００３】
現実の試料中の呼吸している各種細胞の検出において前記方法を用いると、次の２つの理由により信頼性が向上する。第一の理由は、複数の励起エネルギーを用いて微生物を同時に励起し、続いて多数の各種蛍光信号を同時に検出するので、干渉源が数々の蛍光団の特性を重ねる可能性が非常に小さくなるため、干渉の機会が減少することである。第二の理由は、各固有代謝産物同士の相対量ひいてはそれらの蛍光信号が一定の生理学的範囲に収まることがわかっているためである。次の（１）と（２）を可能とする方法によって各種信号の分析が達成される。（１）存在する各種微生物に由来する各検出蛍光信号を、干渉、バックグラウンド信号及び／又は散乱励起信号から区別すること。（２）微生物の代謝産物、微生物成分、胞子成分からの各種信号強度を生理学的な範囲に収まるように要求すること。即ち、試料中の微生物の検出は基本的には次のステップからなる。第一に、細胞の代謝産物、微生物成分、胞子成分それぞれの特性励起エネルギーを用いて試料を同時に励起する。第二に、続いて（これらの励起された代謝産物の最大発光及び最小発光に関連する）多数の各蛍光信号を集める。最後に集めた信号を、バックグラウンド蛍光を除去し各種代謝産物の相対信号強度を既知の生理学的範囲と比較することができる方法で分析する。
【０００４】
これまでの長い間で確立されてきた各種微生物検出技術や方法は、代謝反応産物、免疫学的捕捉産物、所望の塩基配列の増殖産物の検出を利用するものである。本発明は、各種微生物から得られる複数の内因性蛍光団の検出と共にこれらの蛍光団による各信号の相対量を検出するものであるので、微生物の存在を検出できるだけでなく、各種生菌、非生菌、胞子を分別することができる。本発明の方法及び装置は、試薬を使用せず、試料との物理的な接触もなく、リアルタイムの結果を提供するものである。
【０００５】
蛍光を利用する微生物検出方法は他にも存在する。フローサイトメトリーの各種方法の多くは、所望の分析対象物を標的とする免疫学的タンパク質にコンジュゲートした染料分子の蛍光によるものである。この例が米国特許第４７４５２８５号（Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄらに付与）に記載されている。また、蛍光を使用する他の方法では、蛍光性各種代謝染料や染料コンジュゲートを添加して使用している（米国特許第４９００９３４号（Ｐｅｅｔｅｒｓらに付与）に記載）。
【０００６】
蛍光に基づく微生物検出方法のあるものは、各種内因性細胞蛍光団を使用するものである。米国特許第５４２４９５９号（Ｒｅｙｅｓらに付与）の方法は、試料の蛍光スペクトルとスペクトルのライブラリーとを単に比較するものである。また、米国特許第５４７４９１０号（Ａｌｆａｎｏに付与）に記載の方法では、試料表面の蛍光とクリーンな表面の蛍光を比較する。各種微生物検出方法でよく使用される内因性蛍光団は還元型ピリジンヌクレオチドＮＡＤＨである。米国特許第５７０１０１２号（Ｈｏに付与）では、試料を含有する強制空気流中のＮＡＤＨ蛍光を検出しブランクと比較する。また、ＮＡＤＨ蛍光と散乱励起信号との比、又はＮＡＤＨ蛍光と他の蛍光放射との比がＰｏｗｅｒｓに付与された米国特許（第５７６０４０６号及び第５９６８７６６号）において使用されている。
【０００７】
本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許第５７６０４０６号及び第５９６８７６６号（それぞれ１９９８年６月２日、１９９９年１０月１９日発行）は、非生体表面や非生体試料上の各種微生物を検出する方法及び装置を開示している。測定試料は、（１）微生物細胞中の各種ピリジンヌクレオチドを励起する３５０ｎｍを超える波長と（２）測定環境の他の特性に対応する３４０ｎｍ未満の波長、の両方を有する電磁放射で励起される。微生物のピリジンヌクレオチドが（異なる波長で励起された結果）発する蛍光発光の、反射励起信号に対する比を、試料上に存在する微生物の検出及び定量のベースとして計測、比較する。この発明によれば、肉類等の非生体表面上の微生物を確定し定量することができる。
【０００８】
Ｐｏｗｅｒｓに付与された上記各特許は、１種類の代謝産物を蛍光比によって検出するものであるが、本発明では一以上の蛍光団の励起と、散乱／反射励起エネルギーによる検出信号を差し引くアルゴリズムとを組み合わせて用いる。設計及び方法にこのような差異があるため、蛍光を用いる他の各種方法に比べ、本発明は各種非生体表面上、各種液体中、空気中の各種微生物をよりよく検出、定量することができる。複数の内因性蛍光団を検出することによりバックグラウンド干渉による擬陽性の結果が出る可能性が低くなるため、本発明は各種微生物の検出において優れている。上記の方法及び装置による各種微生物の検出としては、生物兵器用剤の検出、細胞のソーティング、医学的診断、滅菌の確認、水質検査、食品の製造や調理における安全管理、非常時対応チームによる公共施設における微生物の検出、浄化、防御の用途が挙げられる。
【０００９】
近年、食品（獣肉、鶏肉、海産物、ジュース、果物、野菜）の細菌汚染が報じられており、食品内、食品表面、調理器具表面の微生物汚染を検出するのに使用できる方法や装置へのニーズがある。このようなニーズを満たす方法及び装置の提供は、本発明の一目的であるが、例えば獣肉生産施設や鶏肉生産施設などで低廉且つ迅速に使用しうるものである必要がある。
【００１０】
本発明の他の目的は、食品の微生物汚染の検出に使用するための方法及び装置を提供することであって、具体的には、各種ピリジンヌクレオチド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分が発する蛍光を電磁放射によって励起し、各種微生物の様々な代謝反応や胞子成分と食品組織を区別することにより、食品と接触することなく食品の微生物汚染を確認できる方法及び装置を提供することである。
【００１１】
従って、本発明の一目的は、各種非生体表面上、各種液体中、空気中の微生物汚染を検出するのに使用できる方法及び装置を提供することである。本発明の具体的な目的として、本方法及び装置は、例えば、各種ヘルスケア施設、研究所、水処理施設及び水質検査施設、公共建築物、戦場等で低廉且つ迅速に各種微生物や微生物汚染を見い出すために使用することができる。
【００１２】
本発明の他の目的は、各種非生体表面上、各種液体試料中、空気試料中の微生物汚染を検出するのに使用する方法及び装置であって、各種微生物の様々な代謝反応及び／又は胞子の存在を媒体のバックグラウンドや散乱光から区別するために、各種ピリジンヌクレオチド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分の蛍光を電磁放射によって励起し、試料と接触することなく試料の微生物汚染を確認できる方法及び装置を提供することである。
【００１３】
また、本発明の更に他の目的は、生存可能な各種細胞（viable cells; 以下、生菌とも称する）、生存不能な各種細胞（non-viable cells; 以下、非生菌とも称する）、各種胞子、汚染されていない各種試料の分別化に使用される方法及び装置を提供することであって、本方法及び装置においては各種ピリジンヌクレオチド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分が発する蛍光を、電磁放射によって励起するにあたり、それぞれの内因性蛍光団の相対量の差をもって微生物の存在を媒体のバックグラウンドや散乱光から区別する方法及び装置を提供することである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の思想は、各種代謝産物、コファクター、細胞成分、胞子成分からの蛍光を励起することができる複数の特定のエネルギーレベルの電磁放射に各種試料を暴露する、微生物の検出のための方法及び装置にある。これにより、試料に含まれる各種微生物細胞や胞子（より具体的には、そこに含まれる励起された代謝産物、コファクター及び／又は他の細胞成分、ウィルス成分、及び／又は胞子成分）は、測定可能な蛍光を発する。集めた蛍光信号（細胞／ウィルス／胞子成分から発せられる信号の最大値及び／又は最小値に関連する）は（１）バックグラウンドや反射／散乱励起信号の除去、及び（２）代謝産物、コファクター、胞子成分の相対蛍光信号値と既知の生理学的範囲との比較、が可能な方法で分析される。
【００１５】
即ち、本発明の方法及び装置は、試料をスキャンすることにより、該試料と接触せずに微生物汚染の存在を検出・定量する、低廉且つ迅速な方法を提供するものである。非接触下で試料中の微生物汚染を評価できるので、汚染を広げる危険性が低くなる。
【００１６】
上の目的を達成するために、本発明の一形態においては、多くの場合、２００ｎｍを超える波長の電磁放射を発する一又は複数の光源を使用することが好ましい。本発明のこのような形態においては、光源からの光は、ピリジンヌクレオチド類、フラビン類，ポルフォリン類、各種コファクター及び／又はジピコリン酸カルシウムを特異的に励起するものであるか、あるいは、フィルタに通すことによってピリジンヌクレオチド類、フラビン類，ポルフォリン類、各種コファクター及び／又はジピコリン酸カルシウムを特異的に励起するエネルギーを有する電磁放射としうるものである。
【００１７】
本発明の他の形態においては、異なる紫外エネルギー（波長：２００〜３００ｎｍの間）を有する電磁放射を試料に照射することができ、また、場合によってはそのようにすることが好ましい。紫外光は芳香族アミノ酸や核酸を励起する。その結果の発光の一部は試料に再吸収され、ジピコリン酸カルシウムやピリジンヌクレオチド類を順に励起していく。また、それらの発光の一部は試料に再吸収され、今度はコファクター類（フラビン等）を励起する。発光の一部はポルフォリン類や他のフラビン類を励起するのに使用される。試料が発する各種蛍光を上述の通りに集め分析する。紫外光を使用する場合は、比較的浅い試料サンプリング深度となる。
【００１８】
本発明の他の形態においては、各種代謝産物、各種コファクター、各種細胞／胞子成分を特異的に励起できる各種エネルギーレベル及び微生物と相互作用しないエネルギーレベルを有する電磁放射を照射することができ、また、場合によってはそのようにすることが好ましい。即ち、本発明のこのような形態においては、試料が発する蛍光信号（各種微生物成分が発したもの及び試料で単に反射／散乱したもの両方）を測定することができ、微生物が発した信号間の比と試料からの反射／散乱信号間の比を比較することによって微生物の存在を決定することができる。
【００１９】
本発明の実施にあたっては、センサを用いて内因性蛍光団による蛍光だけでなく、反射あるいは散乱した電磁放射も検出する。これにより、信号を標準化し、スキャンされる試料とプローブの距離の変動により生じる変動や、試料や表面が異なることによって生じる変動を補償する。
【００２０】
試料に照射する電磁放射を、６０ヘルツと異なる (different than 60 Herz) 周波数で急速に変化させることにより、周囲の光（特に蛍光）の影響を実質的に最小化することができることが判明した。また、励起エネルギーの調整により、微生物内容物 (microbial content) の測定精度に実質的影響を与えることなく、センサを動かして電磁放射を試料の種々の部分に照射することができる。
【００２１】
市販されている微生物検出器の多くは、微生物培養によって試料サイズを十分に大きなもの（増殖物）とした上で、種（属)の同定のための各種代謝テストに付すものである。しかしながら、細菌の増殖を必要とする技法では、生存可能ではあっても培養できない細胞については検出できないであろう。逆に言えば、使用した生育培地は、細菌を特定の表現型で成長させるのには好都合であるかもしれない。
【００２２】
微生物検出に関する他のアプローチは、微生物そのものの免疫学的捕捉、又は微生物成分の免疫学的捕捉に依存している。最もよく使われるイムノアッセイ法であるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）の細胞検出限界は数百細胞である。（これは、フレクスナー赤痢菌 (Shigella flexneri) 等非常に感染力の強い細菌の５０％感染量ＩＤ50よりも十分少ない菌体数である。）また、これらの技法は、使用する各種抗体がｐＨ、イオン強度、温度の変動に非常に影響されやすいという大きな問題点をかかえている。微生物成分に対する各種抗体は開発や製造にかかるコストが比較的高いというだけでなく、「汚れた」試料中ではタンパク質分解酵素によって分解されやすい。更に、各種表面（マイクロウェルプレート、磁気ビーズ等）上に支持されている抗体分子の密度は、通常必要とされるレベルに達していない。
【００２３】
感度はより高いが迅速ではないタイプの方法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって細菌のＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、続いて核酸配列を決定して特定の細菌種の存在を検出する。そのような増幅及び配列決定技法は一般に技術的な経験を必要とし、特化された実験室条件以外では簡単には利用できない。ＰＣＲに基づく各種技法は微生物が存在しているという推測を利用するものである。何故ならばこれらの技法は、必ずしも微生物を目的とした分析ではなく完全な標的核酸配列を目的とした分析であるからである。更に、標的ＤＮＡの効果的な増幅を阻む物質が「汚れた」、現実の試料中に存在すると、特定の微生物を環境試料から検出することが困難になってしまう。
【００２４】
細菌やウィルスの検出は、試料を溶菌や熱分解に付した後で揮発性細胞成分（例えば脂肪酸）をマススペクトル分析することで行われてきた。残念ながら、微生物の揮発性成分の組成は成長環境条件によって異なるので、分析対象物の同定結果は信頼性を欠く。
【００２５】
免疫学的な方法、マススペクトルによる方法、ＰＣＲによる方法はいずれも、微生物が試料中で生存可能であったかどうかについては確定できない。また、免疫学的方法やＰＣＲによる方法では、専門的な取扱いを必要とする比較的高価な試薬を使用する。本明細書に記載の方法及び装置を用いると、検出された細菌、真菌、原生動物、リケッチアの生存可能性を決定することができる。本方法及び装置は試薬を要さず、試料と接触せず、低コストで実施でき、リアルタイムの結果を得ることができる。本発明のこれらの及び他の目的、特徴、利点は、以下に記載する実施形態の詳細な説明や添付の請求項によって明確になるであろう。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の装置における基本構成要素を図１のブロックダイアグラムで示す。この装置は、光源、励起フィルタ、フォーカス光学部、集光光学部、エミッション・フィルタ及び検出器から構成される。電磁放射は光源から試料に向かい、必要に応じ励起フィルタやフォーカス光学部を通って試料中の内因性蛍光団を励起させる。散乱、反射された励起光は蛍光発光と共に、集光光学部で集められ、検出器に向かう。エミッション・フィルタは、所望のエネルギーだけを測定することができる。
【００２７】
本発明の実施形態としては、様々な形状や様々な構成要素の利用が可能である。本微生物検出法の基本的な構成要素は、複数の内因性微生物蛍光団を励起すること、発光して反射／散乱された光のエネルギーを集めて検出すること、及びバックグラウンド干渉を補正できると共に、既知の生理学的パラメータと相対信号強度を比較することができる方法で検出した信号を分析すること、を許容するものである。本法を利用する装置の形状や構成要素は、応用上の様々な要求及び予想される干渉に対応したものでなければならない。
【００２８】
広域イルミネーションを提供する光源を用いることができ、また、そのような光源の使用が時には好ましい。用いられる光源の種類は、所望の内因性微生物成分を励起させるのに必要な波長の電磁放射を生成する能力によって決まる。オフサイクルの間に、環境バックグラウンドを測定することのできるパルス光源の利用が望まれることもある。用いられる光源としては、各種電球（水銀、タングステン、重水素、キセノン等）を有するランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、及び要求される励起エネルギーに特異的なダイオードレーザが挙げられる。用いる光源の種類は、必要とされる励起光の強度や要求検出限界に依存する。
【００２９】
本発明の各実施形態に用いられる励起及びエミッション・フィルタ類としては、各種干渉フィルタ、含浸ガラス、一連のカットオフフィルタ、ゼラチンフィルタ、モノクロメータ、回折格子等が挙げられる。用いられる各種エミッション・フィルタの光カットオフ特性は、散乱・反射された励起光の信号がどれだけその分析方法で許容されるか、或いは、要求検出限界がどれ位かによる。所望のエネルギーのみを照射する光源を用いる場合は励起フィルタを必要としないであろう。一方、光源が（レーザ光のように）平行である場合は、フォーカス光学部は不要であろう。（フォーカス光学部を使用する目的は、励起光を２次元的あるいは３次元的サンプリング領域に向けることである。）マルチフォトン励起では、所望の蛍光団の励起エネルギーよりも小さいエネルギーの光源を用いることができるという点が重要である。
【００３０】
集光光学部は、微生物の励起された蛍光団から生じる光や試料から散乱・反射された光を検出器に運ぶ。干渉フィルタを用いて異なる発光エネルギーを分別する場合には、このフィルタが最適に作動するよう、集めた光を平行にしなければならない。光ファイバ・ケーブルも、試料に励起のための照射を行う際に、また、発光を集め、検出器に向ける際に用いることができる。紫外領域や可視領域で蛍光を示す多くの光学的成分としては、研磨金属反射する、サファイア、融合シリカ、石英、ＭｇＦ2、及び／又はＣａＦ2を用いることができ、また、時にはそれらの使用が望まれる。
【００３１】
発せられる電磁放射は、検出器により測定可能な電気信号に変換することができる。本発明の各種実施形態においては、光増幅管（ＰＭＴ）、電子なだれフォトダイオード（ＡＰＤ）、ピンダイオード、ＣＣＤ等の、異なる感度を有する多数の検出器を用いることができる。検出器の選択は、測定される放射光のエネルギー、発光信号の強度、及び装置の要求検出限界に基づいてなされる。
【００３２】
集めた発光エネルギー（増幅電気信号に変換したもの）を、すべてのバックグラウンド蛍光や散乱励起光の寄与分を除去できる方法で分析する。特定の実施形態で用いる励起・発光エネルギーは、標的微生物や予想される生理学的状態により選択する。表１は様々な微生物（及びタンパク質トキシン）に豊富に見られる内因性蛍光化合物のいくつかにおける、励起・発光の範囲を表しており、また、各微生物におけるそれぞれの化合物の存在の確からしさを示している。（タンパク質微生物トキシンは、本方法及び装置を、ウィルスの検出に用いる方法と同様に用いて検出することができる。）
【００３３】
【表１】
【００３４】
３４５ｎｍの光で励起した際に蛍光を殆ど発しない培地における、細菌（Bacillus thuringiensis）含有溶液の、発光スペクトルを図２に示す。実線は観察された細菌発光スペクトルを、破線はスペクトルへのレイリー散乱の寄与を示している。観察されたスペクトルからレイリーバックグラウンドを差し引いたところ、３４５ｎｍの光で励起される代謝産物の真の発光スペクトルとなった（図４（ａ））。波長λにおけるレイリー散乱によるバックグラウンドの大きさは、Ｉ＝Ａ／λ4＋Ｃで表すことができる。（この式において、Ｉは入射光の強度、Ａは実験条件により決定される値、定数Ｃは一般にデータ収集に用いた器具の特性により決定される値である。）細菌含有溶液を３２５ｎｍ、３４５ｎｍ及び５７０ｎｍで励起した際の発光スペクトルを合わせると、５１５ｎｍ及び８５０ｎｍ付近で最小値を示す。５１５ｎｍ及び８５０ｎｍで測定した蛍光強度を用い、前記の式中のＡ及びＣで表される未知の値を算出する。最後に、検出した信号からバックグラウンド信号を差し引く。レイリー散乱バックグラウンドを差し引くことは、とりわけ液体及び気体の試料に好適である。その他の試料媒体は、レイリー散乱バックグラウンドとは異なるバックグラウンドを示すが、適切な方法で処理することができる（例えば、Mie散乱等）。
【００３５】
図３及び図４は、生菌、非生菌及び胞子の各溶液（Bacillus thuringiensis）を２８０ｎｍ（図３（ａ））、３１５ｎｍ（図３（ｂ））、３２５ｎｍ（図３（ｃ））、３４５ｎｍ（図４（ａ））、５７０ｎｍ（図４（ｂ））、及び６６０ｎｍ（図４（ｃ））で励起した際の、溶液中の様々な内因性蛍光団による発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた値）を示す。図５は、前記生菌（ａ）、非生菌（ｂ）、及び胞子（ｃ）溶液の、蛍光信号（バックグラウンド差し引き後、４４０ｎｍでの発光に標準化した）がはっきり異なることを示す。本分析方法は、生菌、非生菌、及び胞子溶液の違いを用いて、試料中のこれらを区別する。検出しバックグラウンドを差し引いた信号の大きさにより、試料中の微生物の数を定量する。
【００３６】
本発明の一実施形態においては、３２５ｎｍ、３４５ｎｍ、及び５７０ｎｍの励起フィルタを使用することにより、生きている細胞、死細胞、胞子の検出及び区別を行うことができる。これらの励起フィルタは、還元型ピリジンヌクレオチド、各種フラビン、ジピコリン酸カルシウム、ヘモプロテイン類、及びその他の化合物を励起させることができる。励起した蛍光団からの発光を検出するフィルタの選択においては、４０５ｎｍ、４４０ｎｍ、４８０ｎｍ及び６５０ｎｍのフィルタを含むものとされよう。これらのフィルタは、励起した各蛍光団の発光スペクトルの最大値に対応している。加えて、その他のエミッション・フィルタ（５４５ｎｍ及び８５０ｎｍ）によって、反射／散乱バックグラウンドの大きさを測定できる。検出限界を低くするために、次のような形状とした。光源としては、干渉励起フィルタと共にパルスキセノンランプを用いた。また、光を平行にするため、フォーカス光学部を干渉フィルタの前に置いている。フォーカス及び集光光学部は、バックグラウンド蛍光をすべて除去するように、研磨された反射光学素子で構成した。放物線状の集光光学部（発生信号の約９０％を集めることができる）を、干渉エミッション・フィルタ、コリメート光学部、及びＰＭＴに取り付けた。計器の各種機能、データの収集、統合、及び分析は、マイクロコントローラにより制御した。
【００３７】
本発明のこの実施形態における検出方法では、検出しバックグラウンド補正した信号間の相対比を、ある生理学的パラメータの範囲に入るようにする必要がある。異なる２０を超える細菌種や胞子種を用いた５００個を超える試料を分析したところ、多くの比率が統計的に有意な同定結果をもたらしうることを示した。図６は、２２種類の細菌のこれら比率の中の一比率に関する分布状態（バックグラウンド差し引き後の、４４０ｎｍ／４８０ｎｍの比）を示しており、これによって、本検出方法に要求される生理学的パラメータの範囲を規定している。この方法により、無菌の培地やその他の各種生化学的バッファーから細菌含有溶液を区別することもできる。様々な方法や次の比率（６５０／４０５、４０５／４４０、４８０／４４０、６５０／４４０、４０５／４８０及び６５０／４８０）を用いて、例えば、Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎテスト、ファジィ論理、学習ニューラルネットワーク（多層パーセプトロン利用）により、細菌の存在を９９％、９５.６％及び１００％の検出確率で検出した。（この検出アルゴリズムのために取った５００個のデータポイントの擬陽性確率 (false alarm probability) は、次の通りである。Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ（０.０１％）、ファジィ論理（０％）、ニューラルネットワーク（０％）。）
【００３８】
図７は、スライドガラス上の生菌及び非生菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ細胞用の測定器を用いた、ある発光（ＲＰＮ）のデータを示す。生菌と非生菌の蛍光から得られる信号には、明確な違いがみられる。図８は、七面鳥の肉の表面上の大腸菌に対するＲＰＮ発光応答を示す。この方法は、他の微生物検出方法よりも低い検出限界での観察をリアルタイムで行うものであり、試薬を必要とせず、肉の表面にも触れずに行うことができる。
【００３９】
本発明の他の実施形態においては、図４（ａ）及び図４（ｃ）に示すように、約５７０ｎｍ及び約６６０ｎｍを中心とするＬＥＤを用いて胞子や死細胞中の成分を励起する。図９は、６６０ｎｍの光で励起した際の、紙片及び各種封筒入り試料の発光スペクトルを示す。図中の矢印は、胞子や非生菌を６６０ｎｍで励起する際の、予想される発光位置を示す。紙片及び封筒は、このスペクトル・ウインドウを有するので、紙の「後ろ (behind paper) 」や封筒の「内側 (inside envelopes) 」で細菌芽胞を検出することができる。非生菌成分からの６１０ｎｍ〜６８０ｎｍの間の発光は、このスペクトル・ウインドウで蛍光を発する胞子成分を励起するので、５７０ｎｍの励起を含めることができ、また時には５７０ｎｍの励起が好ましい。図１０は、封筒のみの場合と、同じ封筒に封入した凍結乾燥Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子試料の間の、７８０ｎｍのバックグラウンド差し引き蛍光信号の違いを示す。本発明のこの実施形態では、試薬、試料処理、試料との接触、封筒の開封を必要とせず、封筒に封入された胞子を素早く検出することができる。
【００４０】
上で述べた本発明の実施形態は、単に例示に過ぎないものであって、当業者であれば前述の基本的発明思想に基づき、本発明の趣旨を逸脱せずに、他の各種形状物、変形物及び修正物とすることができる。微生物を検出するための本方法及び装置は、様々な内因性微生物蛍光団を同時に励起させ、次いで、検出された発光を分析するに当たり、バックグラウンド信号を明らかにすることと同時にその信号を生理学的範囲内にするという手法を用いる。すべての変形物、修正物及び形状は、添付のクレームに記載された本発明の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の最も基本的な特徴を示したブロックダイアグラムである。
【図２】３４５ｎｍでの照射により励起された細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）低蛍光媒体溶液の発光スペクトルである。実線は細菌の発光スペクトルを示し、破線はこのスペクトルに対するレイリー散乱の寄与を示す。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、異なる波長で励起された各種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を示す。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、異なる波長で励起された各種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を示す。
【図５】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの胞子、生菌、非生菌が溶液状態で発した蛍光信号間（４４０ｎｍの発光に標準化、バックグラウンドを差し引いた後）の分布の違いを示す図である。
【図６】２２の細菌種における４８０ｎｍの蛍光発光に対する４４０ｎｍの蛍光発光の比の分布を示す図（バックグラウンドを差し引いた後）である。
【図７】本発明の一実施形態として、無菌表面上のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの生菌及び非生菌に対する還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光発光応答を示す図である。
【図８】七面鳥表面上のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光発光応答を示す図である。
【図９】紙片、各種封筒サンプルの蛍光発光スペクトルにおけるスペクトル・ウインドウを示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態として、密封された封筒内の数ミリグラムのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子に対するバックグラウンド補正後の蛍光チャンネル（７８０ｎｍ）の応答を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、非生体表面上、空気中、液体中の各種微生物（細菌、真菌、原生動物、リケッチア及び／又はその他の微生物）や各種芽胞（以下、胞子とも記載する）の存在を検知するための方法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
初歩的事項ではあるが、微生物細胞は全て呼吸により細胞活動のためのエネルギーを産生する。細胞の呼吸が生きた細胞で起こると、ピリジンヌクレオチド類が還元され、フラビン類が酸化され、他の各種補酵素や各種代謝産物が産生される。また、胞子はジピコリン酸カルシウム複合体（胞子以外では自然では稀な蛍光化合物）に富むことが判明している。ピリジンヌクレオチド類、フラビン類、その他のコファクター類の酸化状態及び／又はジピコリン酸カルシウムの存在は、各化合物を適切な電磁放射 (electromagnetic radiation) で同時に励起し、蛍光団それぞれが発する特性放射 (characteristic radiation) を検出することにより、同時に明らかにすることができる。蛍光を発する細胞成分や胞子成分に対する特性励起エネルギーを複数種用いて試料を同時励起し、発光のエネルギーと反射／散乱光のエネルギー（前者は蛍光団に関連し、後者は蛍光団とは独立している）を集めて検出することが、本明細書に記載する方法による試料中や非生体表面の微生物の検出原理である。
【０００３】
現実の試料中の呼吸している各種細胞の検出において前記方法を用いると、次の２つの理由により信頼性が向上する。第一の理由は、複数の励起エネルギーを用いて微生物を同時に励起し、続いて多数の各種蛍光信号を同時に検出するので、干渉源が数々の蛍光団の特性を重ねる可能性が非常に小さくなるため、干渉の機会が減少することである。第二の理由は、各固有代謝産物同士の相対量ひいてはそれらの蛍光信号が一定の生理学的範囲に収まることがわかっているためである。次の（１）と（２）を可能とする方法によって各種信号の分析が達成される。（１）存在する各種微生物に由来する各検出蛍光信号を、干渉、バックグラウンド信号及び／又は散乱励起信号から区別すること。（２）微生物の代謝産物、微生物成分、胞子成分からの各種信号強度を生理学的な範囲に収まるように要求すること。即ち、試料中の微生物の検出は基本的には次のステップからなる。第一に、細胞の代謝産物、微生物成分、胞子成分それぞれの特性励起エネルギーを用いて試料を同時に励起する。第二に、続いて（これらの励起された代謝産物の最大発光及び最小発光に関連する）多数の各蛍光信号を集める。最後に集めた信号を、バックグラウンド蛍光を除去し各種代謝産物の相対信号強度を既知の生理学的範囲と比較することができる方法で分析する。
【０００４】
これまでの長い間で確立されてきた各種微生物検出技術や方法は、代謝反応産物、免疫学的捕捉産物、所望の塩基配列の増殖産物の検出を利用するものである。本発明は、各種微生物から得られる複数の内因性蛍光団の検出と共にこれらの蛍光団による各信号の相対量を検出するものであるので、微生物の存在を検出できるだけでなく、各種生菌、非生菌、胞子を分別することができる。本発明の方法及び装置は、試薬を使用せず、試料との物理的な接触もなく、リアルタイムの結果を提供するものである。
【０００５】
蛍光を利用する微生物検出方法は他にも存在する。フローサイトメトリーの各種方法の多くは、所望の分析対象物を標的とする免疫学的タンパク質にコンジュゲートした染料分子の蛍光によるものである。この例が米国特許第４７４５２８５号（Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄらに付与）に記載されている。また、蛍光を使用する他の方法では、蛍光性各種代謝染料や染料コンジュゲートを添加して使用している（米国特許第４９００９３４号（Ｐｅｅｔｅｒｓらに付与）に記載）。
【０００６】
蛍光に基づく微生物検出方法のあるものは、各種内因性細胞蛍光団を使用するものである。米国特許第５４２４９５９号（Ｒｅｙｅｓらに付与）の方法は、試料の蛍光スペクトルとスペクトルのライブラリーとを単に比較するものである。また、米国特許第５４７４９１０号（Ａｌｆａｎｏに付与）に記載の方法では、試料表面の蛍光とクリーンな表面の蛍光を比較する。各種微生物検出方法でよく使用される内因性蛍光団は還元型ピリジンヌクレオチドＮＡＤＨである。米国特許第５７０１０１２号（Ｈｏに付与）では、試料を含有する強制空気流中のＮＡＤＨ蛍光を検出しブランクと比較する。また、ＮＡＤＨ蛍光と散乱励起信号との比、又はＮＡＤＨ蛍光と他の蛍光放射との比がＰｏｗｅｒｓに付与された米国特許（第５７６０４０６号及び第５９６８７６６号）において使用されている。
【０００７】
本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する米国特許第５７６０４０６号及び第５９６８７６６号（それぞれ１９９８年６月２日、１９９９年１０月１９日発行）は、非生体表面や非生体試料上の各種微生物を検出する方法及び装置を開示している。測定試料は、（１）微生物細胞中の各種ピリジンヌクレオチドを励起する３５０ｎｍを超える波長と（２）測定環境の他の特性に対応する３４０ｎｍ未満の波長、の両方を有する電磁放射で励起される。微生物のピリジンヌクレオチドが（異なる波長で励起された結果）発する蛍光発光の、反射励起信号に対する比を、試料上に存在する微生物の検出及び定量のベースとして計測、比較する。この発明によれば、肉類等の非生体表面上の微生物を確定し定量することができる。
【０００８】
Ｐｏｗｅｒｓに付与された上記各特許は、１種類の代謝産物を蛍光比によって検出するものであるが、本発明では一以上の蛍光団の励起と、散乱／反射励起エネルギーによる検出信号を差し引くアルゴリズムとを組み合わせて用いる。設計及び方法にこのような差異があるため、蛍光を用いる他の各種方法に比べ、本発明は各種非生体表面上、各種液体中、空気中の各種微生物をよりよく検出、定量することができる。複数の内因性蛍光団を検出することによりバックグラウンド干渉による擬陽性の結果が出る可能性が低くなるため、本発明は各種微生物の検出において優れている。上記の方法及び装置による各種微生物の検出としては、生物兵器用剤の検出、細胞のソーティング、医学的診断、滅菌の確認、水質検査、食品の製造や調理における安全管理、非常時対応チームによる公共施設における微生物の検出、浄化、防御の用途が挙げられる。
【０００９】
近年、食品（獣肉、鶏肉、海産物、ジュース、果物、野菜）の細菌汚染が報じられており、食品内、食品表面、調理器具表面の微生物汚染を検出するのに使用できる方法や装置へのニーズがある。このようなニーズを満たす方法及び装置の提供は、本発明の一目的であるが、例えば獣肉生産施設や鶏肉生産施設などで低廉且つ迅速に使用しうるものである必要がある。
【００１０】
本発明の他の目的は、食品の微生物汚染の検出に使用するための方法及び装置を提供することであって、具体的には、各種ピリジンヌクレオチド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分が発する蛍光を電磁放射によって励起し、各種微生物の様々な代謝反応や胞子成分と食品組織を区別することにより、食品と接触することなく食品の微生物汚染を確認できる方法及び装置を提供することである。
【００１１】
従って、本発明の一目的は、各種非生体表面上、各種液体中、空気中の微生物汚染を検出するのに使用できる方法及び装置を提供することである。本発明の具体的な目的として、本方法及び装置は、例えば、各種ヘルスケア施設、研究所、水処理施設及び水質検査施設、公共建築物、戦場等で低廉且つ迅速に各種微生物や微生物汚染を見い出すために使用することができる。
【００１２】
本発明の他の目的は、各種非生体表面上、各種液体試料中、空気試料中の微生物汚染を検出するのに使用する方法及び装置であって、各種微生物の様々な代謝反応及び／又は胞子の存在を媒体のバックグラウンドや散乱光から区別するために、各種ピリジンヌクレオチド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分の蛍光を電磁放射によって励起し、試料と接触することなく試料の微生物汚染を確認できる方法及び装置を提供することである。
【００１３】
また、本発明の更に他の目的は、生存可能な各種細胞（viable cells; 以下、生菌とも称する）、生存不能な各種細胞（non-viable cells; 以下、非生菌とも称する）、各種胞子、汚染されていない各種試料の分別化に使用される方法及び装置を提供することであって、本方法及び装置においては各種ピリジンヌクレオチド、フラビン類、他のコファクター類、各種胞子成分が発する蛍光を、電磁放射によって励起するにあたり、それぞれの内因性蛍光団の相対量の差をもって微生物の存在を媒体のバックグラウンドや散乱光から区別する方法及び装置を提供することである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の思想は、各種代謝産物、コファクター、細胞成分、胞子成分からの蛍光を励起することができる複数の特定のエネルギーレベルの電磁放射に各種試料を暴露する、微生物の検出のための方法及び装置にある。これにより、試料に含まれる各種微生物細胞や胞子（より具体的には、そこに含まれる励起された代謝産物、コファクター及び／又は他の細胞成分、ウィルス成分、及び／又は胞子成分）は、測定可能な蛍光を発する。集めた蛍光信号（細胞／ウィルス／胞子成分から発せられる信号の最大値及び／又は最小値に関連する）は（１）バックグラウンドや反射／散乱励起信号の除去、及び（２）代謝産物、コファクター、胞子成分の相対蛍光信号値と既知の生理学的範囲との比較、が可能な方法で分析される。
【００１５】
即ち、本発明の方法及び装置は、試料をスキャンすることにより、該試料と接触せずに微生物汚染の存在を検出・定量する、低廉且つ迅速な方法を提供するものである。非接触下で試料中の微生物汚染を評価できるので、汚染を広げる危険性が低くなる。
【００１６】
上の目的を達成するために、本発明の一形態においては、多くの場合、２００ｎｍを超える波長の電磁放射を発する一又は複数の光源を使用することが好ましい。本発明のこのような形態においては、光源からの光は、ピリジンヌクレオチド類、フラビン類，ポルフォリン類、各種コファクター及び／又はジピコリン酸カルシウムを特異的に励起するものであるか、あるいは、フィルタに通すことによってピリジンヌクレオチド類、フラビン類，ポルフォリン類、各種コファクター及び／又はジピコリン酸カルシウムを特異的に励起するエネルギーを有する電磁放射としうるものである。
【００１７】
本発明の他の形態においては、異なる紫外エネルギー（波長：２００〜３００ｎｍの間）を有する電磁放射を試料に照射することができ、また、場合によってはそのようにすることが好ましい。紫外光は芳香族アミノ酸や核酸を励起する。その結果の発光の一部は試料に再吸収され、ジピコリン酸カルシウムやピリジンヌクレオチド類を順に励起していく。また、それらの発光の一部は試料に再吸収され、今度はコファクター類（フラビン等）を励起する。発光の一部はポルフォリン類や他のフラビン類を励起するのに使用される。試料が発する各種蛍光を上述の通りに集め分析する。紫外光を使用する場合は、比較的浅い試料サンプリング深度となる。
【００１８】
本発明の他の形態においては、各種代謝産物、各種コファクター、各種細胞／胞子成分を特異的に励起できる各種エネルギーレベル及び微生物と相互作用しないエネルギーレベルを有する電磁放射を照射することができ、また、場合によってはそのようにすることが好ましい。即ち、本発明のこのような形態においては、試料が発する蛍光信号（各種微生物成分が発したもの及び試料で単に反射／散乱したもの両方）を測定することができ、微生物が発した信号間の比と試料からの反射／散乱信号間の比を比較することによって微生物の存在を決定することができる。
【００１９】
本発明の実施にあたっては、センサを用いて内因性蛍光団による蛍光だけでなく、反射あるいは散乱した電磁放射も検出する。これにより、信号を標準化し、スキャンされる試料とプローブの距離の変動により生じる変動や、試料や表面が異なることによって生じる変動を補償する。
【００２０】
試料に照射する電磁放射を、６０ヘルツと異なる (different than 60 Herz) 周波数で急速に変化させることにより、周囲の光（特に蛍光）の影響を実質的に最小化することができることが判明した。また、励起エネルギーの調整により、微生物内容物 (microbial content) の測定精度に実質的影響を与えることなく、センサを動かして電磁放射を試料の種々の部分に照射することができる。
【００２１】
市販されている微生物検出器の多くは、微生物培養によって試料サイズを十分に大きなもの（増殖物）とした上で、種（属)の同定のための各種代謝テストに付すものである。しかしながら、細菌の増殖を必要とする技法では、生存可能ではあっても培養できない細胞については検出できないであろう。逆に言えば、使用した生育培地は、細菌を特定の表現型で成長させるのには好都合であるかもしれない。
【００２２】
微生物検出に関する他のアプローチは、微生物そのものの免疫学的捕捉、又は微生物成分の免疫学的捕捉に依存している。最もよく使われるイムノアッセイ法であるＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immunosorbent assay）の細胞検出限界は数百細胞である。（これは、フレクスナー赤痢菌 (Shigella flexneri) 等非常に感染力の強い細菌の５０％感染量ＩＤ50よりも十分少ない菌体数である。）また、これらの技法は、使用する各種抗体がｐＨ、イオン強度、温度の変動に非常に影響されやすいという大きな問題点をかかえている。微生物成分に対する各種抗体は開発や製造にかかるコストが比較的高いというだけでなく、「汚れた」試料中ではタンパク質分解酵素によって分解されやすい。更に、各種表面（マイクロウェルプレート、磁気ビーズ等）上に支持されている抗体分子の密度は、通常必要とされるレベルに達していない。
【００２３】
感度はより高いが迅速ではないタイプの方法では、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって細菌のＤＮＡ又はＲＮＡを増幅し、続いて核酸配列を決定して特定の細菌種の存在を検出する。そのような増幅及び配列決定技法は一般に技術的な経験を必要とし、特化された実験室条件以外では簡単には利用できない。ＰＣＲに基づく各種技法は微生物が存在しているという推測を利用するものである。何故ならばこれらの技法は、必ずしも微生物を目的とした分析ではなく完全な標的核酸配列を目的とした分析であるからである。更に、標的ＤＮＡの効果的な増幅を阻む物質が「汚れた」、現実の試料中に存在すると、特定の微生物を環境試料から検出することが困難になってしまう。
【００２４】
細菌やウィルスの検出は、試料を溶菌や熱分解に付した後で揮発性細胞成分（例えば脂肪酸）をマススペクトル分析することで行われてきた。残念ながら、微生物の揮発性成分の組成は成長環境条件によって異なるので、分析対象物の同定結果は信頼性を欠く。
【００２５】
免疫学的な方法、マススペクトルによる方法、ＰＣＲによる方法はいずれも、微生物が試料中で生存可能であったかどうかについては確定できない。また、免疫学的方法やＰＣＲによる方法では、専門的な取扱いを必要とする比較的高価な試薬を使用する。本明細書に記載の方法及び装置を用いると、検出された細菌、真菌、原生動物、リケッチアの生存可能性を決定することができる。本方法及び装置は試薬を要さず、試料と接触せず、低コストで実施でき、リアルタイムの結果を得ることができる。本発明のこれらの及び他の目的、特徴、利点は、以下に記載する実施形態の詳細な説明や添付の請求項によって明確になるであろう。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明の装置における基本構成要素を図１のブロックダイアグラムで示す。この装置は、光源、励起フィルタ、フォーカス光学部、集光光学部、エミッション・フィルタ及び検出器から構成される。電磁放射は光源から試料に向かい、必要に応じ励起フィルタやフォーカス光学部を通って試料中の内因性蛍光団を励起させる。散乱、反射された励起光は蛍光発光と共に、集光光学部で集められ、検出器に向かう。エミッション・フィルタは、所望のエネルギーだけを測定することができる。
【００２７】
本発明の実施形態としては、様々な形状や様々な構成要素の利用が可能である。本微生物検出法の基本的な構成要素は、複数の内因性微生物蛍光団を励起すること、発光して反射／散乱された光のエネルギーを集めて検出すること、及びバックグラウンド干渉を補正できると共に、既知の生理学的パラメータと相対信号強度を比較することができる方法で検出した信号を分析すること、を許容するものである。本法を利用する装置の形状や構成要素は、応用上の様々な要求及び予想される干渉に対応したものでなければならない。
【００２８】
広域イルミネーションを提供する光源を用いることができ、また、そのような光源の使用が時には好ましい。用いられる光源の種類は、所望の内因性微生物成分を励起させるのに必要な波長の電磁放射を生成する能力によって決まる。オフサイクルの間に、環境バックグラウンドを測定することのできるパルス光源の利用が望まれることもある。用いられる光源としては、各種電球（水銀、タングステン、重水素、キセノン等）を有するランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、及び要求される励起エネルギーに特異的なダイオードレーザが挙げられる。用いる光源の種類は、必要とされる励起光の強度や要求検出限界に依存する。
【００２９】
本発明の各実施形態に用いられる励起及びエミッション・フィルタ類としては、各種干渉フィルタ、含浸ガラス、一連のカットオフフィルタ、ゼラチンフィルタ、モノクロメータ、回折格子等が挙げられる。用いられる各種エミッション・フィルタの光カットオフ特性は、散乱・反射された励起光の信号がどれだけその分析方法で許容されるか、或いは、要求検出限界がどれ位かによる。所望のエネルギーのみを照射する光源を用いる場合は励起フィルタを必要としないであろう。一方、光源が（レーザ光のように）平行である場合は、フォーカス光学部は不要であろう。（フォーカス光学部を使用する目的は、励起光を２次元的あるいは３次元的サンプリング領域に向けることである。）マルチフォトン励起では、所望の蛍光団の励起エネルギーよりも小さいエネルギーの光源を用いることができるという点が重要である。
【００３０】
集光光学部は、微生物の励起された蛍光団から生じる光や試料から散乱・反射された光を検出器に運ぶ。干渉フィルタを用いて異なる発光エネルギーを分別する場合には、このフィルタが最適に作動するよう、集めた光を平行にしなければならない。光ファイバ・ケーブルも、試料に励起のための照射を行う際に、また、発光を集め、検出器に向ける際に用いることができる。紫外領域や可視領域で蛍光を示す多くの光学的成分としては、研磨金属反射する、サファイア、融合シリカ、石英、ＭｇＦ2、及び／又はＣａＦ2を用いることができ、また、時にはそれらの使用が望まれる。
【００３１】
発せられる電磁放射は、検出器により測定可能な電気信号に変換することができる。本発明の各種実施形態においては、光増幅管（ＰＭＴ）、電子なだれフォトダイオード（ＡＰＤ）、ピンダイオード、ＣＣＤ等の、異なる感度を有する多数の検出器を用いることができる。検出器の選択は、測定される放射光のエネルギー、発光信号の強度、及び装置の要求検出限界に基づいてなされる。
【００３２】
集めた発光エネルギー（増幅電気信号に変換したもの）を、すべてのバックグラウンド蛍光や散乱励起光の寄与分を除去できる方法で分析する。特定の実施形態で用いる励起・発光エネルギーは、標的微生物や予想される生理学的状態により選択する。表１は様々な微生物（及びタンパク質トキシン）に豊富に見られる内因性蛍光化合物のいくつかにおける、励起・発光の範囲を表しており、また、各微生物におけるそれぞれの化合物の存在の確からしさを示している。（タンパク質微生物トキシンは、本方法及び装置を、ウィルスの検出に用いる方法と同様に用いて検出することができる。）
【００３３】
【表１】
３４５ｎｍの光で励起した際に蛍光を殆ど発しない培地における、細菌（Bacillus thuringiensis）含有溶液の、発光スペクトルを図２に示す。実線は観察された細菌発光スペクトルを、破線はスペクトルへのレイリー散乱の寄与を示している。観察されたスペクトルからレイリーバックグラウンドを差し引いたところ、３４５ｎｍの光で励起される代謝産物の真の発光スペクトルとなった（図４（ａ））。波長λにおけるレイリー散乱によるバックグラウンドの大きさは、Ｉ＝Ａ／λ4＋Ｃで表すことができる。（この式において、Ｉは入射光の強度、Ａは実験条件により決定される値、定数Ｃは一般にデータ収集に用いた器具の特性により決定される値である。）細菌含有溶液を３２５ｎｍ、３４５ｎｍ及び５７０ｎｍで励起した際の発光スペクトルを合わせると、５１５ｎｍ及び８５０ｎｍ付近で最小値を示す。５１５ｎｍ及び８５０ｎｍで測定した蛍光強度を用い、前記の式中のＡ及びＣで表される未知の値を算出する。最後に、検出した信号からバックグラウンド信号を差し引く。レイリー散乱バックグラウンドを差し引くことは、とりわけ液体及び気体の試料に好適である。その他の試料媒体は、レイリー散乱バックグラウンドとは異なるバックグラウンドを示すが、適切な方法で処理することができる（例えば、Mie散乱等）。
【００３５】
図３及び図４は、生菌、非生菌及び胞子の各溶液（Bacillus thuringiensis）を２８０ｎｍ（図３（ａ））、３１５ｎｍ（図３（ｂ））、３２５ｎｍ（図３（ｃ））、３４５ｎｍ（図４（ａ））、５７０ｎｍ（図４（ｂ））、及び６６０ｎｍ（図４（ｃ））で励起した際の、溶液中の様々な内因性蛍光団による発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた値）を示す。図５は、前記生菌（ａ）、非生菌（ｂ）、及び胞子（ｃ）溶液の、蛍光信号（バックグラウンド差し引き後、４４０ｎｍでの発光に標準化した）がはっきり異なることを示す。本分析方法は、生菌、非生菌、及び胞子溶液の違いを用いて、試料中のこれらを区別する。検出しバックグラウンドを差し引いた信号の大きさにより、試料中の微生物の数を定量する。
【００３６】
本発明の一実施形態においては、３２５ｎｍ、３４５ｎｍ、及び５７０ｎｍの励起フィルタを使用することにより、生きている細胞、死細胞、胞子の検出及び区別を行うことができる。これらの励起フィルタは、還元型ピリジンヌクレオチド、各種フラビン、ジピコリン酸カルシウム、ヘモプロテイン類、及びその他の化合物を励起させることができる。励起した蛍光団からの発光を検出するフィルタの選択においては、４０５ｎｍ、４４０ｎｍ、４８０ｎｍ及び６５０ｎｍのフィルタを含むものとされよう。これらのフィルタは、励起した各蛍光団の発光スペクトルの最大値に対応している。加えて、その他のエミッション・フィルタ（５４５ｎｍ及び８５０ｎｍ）によって、反射／散乱バックグラウンドの大きさを測定できる。検出限界を低くするために、次のような形状とした。光源としては、干渉励起フィルタと共にパルスキセノンランプを用いた。また、光を平行にするため、フォーカス光学部を干渉フィルタの前に置いている。フォーカス及び集光光学部は、バックグラウンド蛍光をすべて除去するように、研磨された反射光学素子で構成した。放物線状の集光光学部（発生信号の約９０％を集めることができる）を、干渉エミッション・フィルタ、コリメート光学部、及びＰＭＴに取り付けた。計器の各種機能、データの収集、統合、及び分析は、マイクロコントローラにより制御した。
【００３７】
本発明のこの実施形態における検出方法では、検出しバックグラウンド補正した信号間の相対比を、ある生理学的パラメータの範囲に入るようにする必要がある。異なる２０を超える細菌種や胞子種を用いた５００個を超える試料を分析したところ、多くの比率が統計的に有意な同定結果をもたらしうることを示した。図６は、２２種類の細菌のこれら比率の中の一比率に関する分布状態（バックグラウンド差し引き後の、４４０ｎｍ／４８０ｎｍの比）を示しており、これによって、本検出方法に要求される生理学的パラメータの範囲を規定している。この方法により、無菌の培地やその他の各種生化学的バッファーから細菌含有溶液を区別することもできる。様々な方法や次の比率（６５０／４０５、４０５／４４０、４８０／４４０、６５０／４４０、４０５／４８０及び６５０／４８０）を用いて、例えば、Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎテスト、ファジィ論理、学習ニューラルネットワーク（多層パーセプトロン利用）により、細菌の存在を９９％、９５.６％及び１００％の検出確率で検出した。（この検出アルゴリズムのために取った５００個のデータポイントの擬陽性確率 (false alarm probability) は、次の通りである。Ｎｅｙｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ（０.０１％）、ファジィ論理（０％）、ニューラルネットワーク（０％）。）
【００３８】
図７は、スライドガラス上の生菌及び非生菌Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ細胞用の測定器を用いた、ある発光（ＲＰＮ）のデータを示す。生菌と非生菌の蛍光から得られる信号には、明確な違いがみられる。図８は、七面鳥の肉の表面上の大腸菌に対するＲＰＮ発光応答を示す。この方法は、他の微生物検出方法よりも低い検出限界での観察をリアルタイムで行うものであり、試薬を必要とせず、肉の表面にも触れずに行うことができる。
【００３９】
本発明の他の実施形態においては、図４（ａ）及び図４（ｃ）に示すように、約５７０ｎｍ及び約６６０ｎｍを中心とするＬＥＤを用いて胞子や死細胞中の成分を励起する。図９は、６６０ｎｍの光で励起した際の、紙片及び各種封筒入り試料の発光スペクトルを示す。図中の矢印は、胞子や非生菌を６６０ｎｍで励起する際の、予想される発光位置を示す。紙片及び封筒は、このスペクトル・ウインドウを有するので、紙の「後ろ (behind paper) 」や封筒の「内側 (inside envelopes) 」で細菌芽胞を検出することができる。非生菌成分からの６１０ｎｍ〜６８０ｎｍの間の発光は、このスペクトル・ウインドウで蛍光を発する胞子成分を励起するので、５７０ｎｍの励起を含めることができ、また時には５７０ｎｍの励起が好ましい。図１０は、封筒のみの場合と、同じ封筒に封入した凍結乾燥Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子試料の間の、７８０ｎｍのバックグラウンド差し引き蛍光信号の違いを示す。本発明のこの実施形態では、試薬、試料処理、試料との接触、封筒の開封を必要とせず、封筒に封入された胞子を素早く検出することができる。
【００４０】
上で述べた本発明の実施形態は、単に例示に過ぎないものであって、当業者であれば前述の基本的発明思想に基づき、本発明の趣旨を逸脱せずに、他の各種形状物、変形物及び修正物とすることができる。微生物を検出するための本方法及び装置は、様々な内因性微生物蛍光団を同時に励起させ、次いで、検出された発光を分析するに当たり、バックグラウンド信号を明らかにすることと同時にその信号を生理学的範囲内にするという手法を用いる。すべての変形物、修正物及び形状は、添付のクレームに記載された本発明の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の最も基本的な特徴を示したブロックダイアグラムである。
【図２】３４５ｎｍでの照射により励起された細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）低蛍光媒体溶液の発光スペクトルである。実線は細菌の発光スペクトルを示し、破線はこのスペクトルに対するレイリー散乱の寄与を示す。
【図３】（ａ）〜（ｃ）は、異なる波長で励起された各種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を示す。
【図４】（ａ）〜（ｃ）は、異なる波長で励起された各種内因性蛍光団により生菌、非生菌、胞子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の溶液が発した発光スペクトル（バックグラウンドを差し引いた後）を示す。
【図５】Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの胞子、生菌、非生菌が溶液状態で発した蛍光信号間（４４０ｎｍの発光に標準化、バックグラウンドを差し引いた後）の分布の違いを示す図である。
【図６】２２の細菌種における４８０ｎｍの蛍光発光に対する４４０ｎｍの蛍光発光の比の分布を示す図（バックグラウンドを差し引いた後）である。
【図７】本発明の一実施形態として、無菌表面上のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉの生菌及び非生菌に対する還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光発光応答を示す図である。
【図８】七面鳥表面上のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからの還元型ピリジンヌクレオチド（ＲＰＮ）蛍光発光応答を示す図である。
【図９】紙片、各種封筒サンプルの蛍光発光スペクトルにおけるスペクトル・ウインドウを示す図である。
【図１０】本発明の一実施形態として、密封された封筒内の数ミリグラムのＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子に対するバックグラウンド補正後の蛍光チャンネル（７８０ｎｍ）の応答を示す図である。
Claims (23)
- 微生物の検出と計数をする方法であって、次のａ〜ｆ、
ａ．２００ｎｍを超える特定の励起範囲の電磁放射波長を有する少なくとも１以上の内因性蛍光団を励起することにより、微生物中の前記内因性蛍光団を励起して蛍光を発せしめ、
ｂ．微生物蛍光の最大値及び最小値に関連する信号強度を検出し、更に、
ｃ．無励起で微生物蛍光の最大値及び最小値におけるバックグラウンド信号強度を検出し、
ｄ．特定のアルゴリズムでバックグラウンド除去された最小値の前記信号強度から微生物蛍光の最大値における反射／散乱信号強度を算出し、
ｅ．前記微生物蛍光の前記検出蛍光信号から前記算出反射／散乱信号強度及び測定バックグラウンド信号強度を引くことにより、バックグランド及び反射／散乱の寄与を除去した前記検出蛍光の信号強度によって、微生物の数を決定し、そして、
ｆ．前記算出反射／散乱信号強度及び測定バックグラウンド信号強度が引かれた複数の特定波長における蛍光信号強度の比を決定し、それにより、次の条件、即ち、反射／散乱及びバックグラウンド補正後の蛍光信号強度の比が、内因性蛍光団の既知の蛍光信号強度に基づく生理学的パラメータの範囲内にあり、且つその比が前記パラメータの範囲内にある前記検出信号の強度によって微生物の計数を決定する条件に依存して微生物の生理学的な状態の検出がなされる、を含む方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記微生物蛍光団が核酸ポリマー、トリプトファン含有タンパク質、チロシン含有タンパク質、アデノシン三リン酸、ジピコリン酸カルシウム、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質及び６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の成分からなる群から選ばれるものである方法。
- 請求項１に記載の方法であって、検出される生存可能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又はリケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、チロシン含有タンパク質、トリプトファン含有タンパク質、アデノシン三リン酸、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の成分を含む方法。
- 請求項１に記載の方法であって、検出される生存不能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又はリケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、トリプトファン含有タンパク質、チロシン含有タンパク質、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の成分を含む方法。
- 請求項１に記載の方法であって、検出される前記微生物が細菌芽胞であり、前記芽胞の検出に使用される前記内因性蛍光団は、核酸ポリマー、チロシン含有タンパク質、トリプトファン含有タンパク質、ジピコリン酸カルシウム又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の成分を含む方法。
- 請求項１に記載の方法であって、検出される前記微生物はウィルスを含み、前記ウィルスの検出に使用される前記内因性蛍光団は核酸ポリマー、チロシン含有タンパク質又はトリプトファン含有タンパク質を含む方法。
- 微生物の検出と計数をする方法であって、次のａ〜ｆ、
ａ．２００ｎｍ〜３００ｎｍの種々の波長の紫外電磁放射を用いて複数の内因性微生物蛍光団を励起することにより、存在するいずれかの微生物中の内因性蛍光団を励起し蛍光を発せしめ、その一部を自己吸収して他の微生物蛍光団を励起し新たに蛍光を発せしめ、
ｂ．微生物蛍光の最大値及び最小値に関連する蛍光信号強度を検出し、
ｃ．無励起で微生物蛍光の最大値及び最小値におけるバックグラウンド信号強度を検出し、
ｄ．特定のアルゴリズムでバックグラウンド除去された最小値の前記信号強度から微生物蛍光の最大値における反射／散乱信号強度を算出し、
ｅ．前記微生物蛍光の前記検出蛍光信号強度から前記算出反射／散乱信号強度及び測定バックグラウンド信号強度を差し引き、
ｆ．バックグラウンド及び反射／散乱の寄与を除去した複数の特定波長における前記検出蛍光信号の比が内因性蛍光団の既知の蛍光信号強度に基づく生理学的パラメータの範囲内にあることを決定し、それにより、バックグラウンド及び反射／散乱の寄与を除去し、その比が前記パラメータの範囲内にある前記検出蛍光信号の強度から微生物の数を決定して、微生物の生理学的な状態の検出がなされる、を含む方法。 - 請求項７に記載の方法であって、前記微生物の前記内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、トリプトファン含有タンパク質、アデノシン三リン酸及びジピコリン酸カルシウム化合物からなる群から選択される１種以上のものを含む方法。
- 請求項７に記載の方法であって、２次励起された微生物蛍光団が、ジピコリン酸カルシウム、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質及び６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される細胞成分等からなる群から選択される１種以上のものを含む方法。
- 請求項７に記載の方法であって、検出される生存可能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又はリケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、チロシン含有タンパク質、トリプトファン含有タンパク質、アデノシン三リン酸、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される細胞成分を含む方法。
- 請求項７に記載の方法であって、検出される生存不能な微生物は、細菌、真菌、原生動物又はリケッチアを含み、当該微生物の検出に使用される前記内因性微生物蛍光団は、核酸ポリマー、トリプトファン含有タンパク質、チロシン含有タンパク質、還元型ピリジンヌクレオチド、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される細胞成分を含む方法。
- 請求項７に記載の方法であって、検出される前記微生物が細菌芽胞であり、前記芽胞の検出に使用される前記内因性蛍光団は、核酸ポリマー、チロシン含有タンパク質、トリプトファン含有タンパク質、ジピコリン酸カルシウム又は６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される芽胞成分を含む方法。
- 微生物タンパク質トキシンの検出と計数をする方法であって、次のａ〜ｅ、
ａ．２００ｎｍを超える特定の励起範囲の電磁放射波長を有する少なくとも１以上の内因性蛍光団を励起することにより、タンパク質トキシン中の蛍光団を励起して蛍光を発せしめ、
ｂ．励起された蛍光団の最大値及び最小値に関連する蛍光信号強度を検出し、
ｃ．無励起で蛍光の最大値及び最小値におけるバックグラウンド信号強度を検出し、
ｄ．特定のアルゴリズムでバックグラウンド除去された最小値の前記信号強度から蛍光の最大値における反射／散乱信号強度を算出し、
ｅ．前記蛍光の前記検出信号強度から前記算出反射／散乱信号強度及び測定バックグラウンド信号強度を引くことにより、バックグランド及び反射／散乱の寄与を除去した前記検出蛍光の信号強度によって、タンパク質トキシンの数を決定する、を含む方法。 - 請求項１３に記載の方法であって、前記微生物蛍光団がトリプトファン含有タンパク質及びチロシン含有タンパク質からなる群から選択されるものである方法。
- 芽胞及び生存不能な細菌の検出と計数をする方法であって、次のａ〜ｅ、
ａ．５５０ｎｍを超え７００ｎｍ未満の特定の励起範囲の電磁放射波長を有する少なくとも１以上の内因性蛍光団を励起することにより、芽胞及び生存不能な細菌中の内因性蛍光団を励起して蛍光を発せしめ、
ｂ．励起された蛍光団の最大値及び最小値に関連する蛍光信号強度を検出し、
ｃ．無励起で蛍光団の最大値及び最小値におけるバックグラウンド信号強度を検出し、
ｄ．特定のアルゴリズムでバックグラウンド除去された最小値の前記信号強度から微生物蛍光の最大値における反射／散乱信号強度を算出し、
ｅ．前記励起された微生物蛍光の前記検出信号強度から前記算出反射／散乱信号強度及び測定バックグラウンド信号強度を引くことにより、バックグランド及び反射／散乱の寄与を除去した前記検出蛍光の信号強度によって、芽胞及び生存不能な細菌の計数をする、を含む方法。 - 請求項１５に記載の方法であって、検出してバックグラウンドを補正した後の複数の特定波長における蛍光信号強度の比を決定し、それにより、次の条件即ち、バックグラウンド補正後の前記蛍光信号強度の比が内因性蛍光団の既知の蛍光信号強度に基づく生理学的パラメータの範囲内にあり、且つその比が前記パラメータの範囲内にある前記検出信号の強度によって芽胞の計数を決定する条件に依存して芽胞と生存不能な細菌との差別化がなされる方法。
- 請求項１５に記載の方法であって、前記芽胞及び生存不能な細菌の検出に使用される前記内因性微生物蛍光団が、フラビン、ポルフォリン含有タンパク質及び６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の成分を含む群から選択されるものである方法。
- 請求項１５に記載の方法であって、前記芽胞及び生存不能な細菌は、表面上、紙製封筒内、紙を通して、溶液中又はエアロゾル中で検出されるものである方法。
- 芽胞及び生存不能な細菌を検出し、計数する方法であって、次のａ〜ｆ、
ａ．５５０ｎｍ〜６４０ｎｍの種々の励起波長の電磁放射を用いて複数の内因性微生物蛍光団を励起することにより、芽胞と生存不能な細菌中のいずれかにおける内因性蛍光団を励起し蛍光を発せしめ、その一部を自己吸収して他の芽胞蛍光団を励起し新たに蛍光を発せしめ、
ｂ．微生物蛍光の最大値及び最小値に関連する蛍光信号強度を検出し、
ｃ．無励起で内因性蛍光団の最大値及び最小値におけるバックグラウンド信号強度を検出し、
ｄ．特定のアルゴリズムでバックグラウンド除去された最小値の前記信号強度から微生物蛍光の最大値における反射／散乱信号強度を算出し、
ｅ．前記励起された微生物蛍光の前記検出信号強度から前記算出反射／散乱信号強度及び測定バックグラウンド信号強度を差し引き、
ｆ．バックグランド及び反射／散乱の寄与を除去した複数の特定波長における前記検出蛍光信号の比が内因性蛍光団の既知の蛍光信号強度に基づく生理学的パラメータの範囲内にあることを決定し、それにより、バックグランド及び反射／散乱の寄与を除去し、その比が前記パラメータの範囲内にある前記検出蛍光信号強度から芽胞及び生存不能な細菌の数を決定する、を含む方法。 - 請求項１９に記載の方法であって、前記微生物の前記内因性微生物蛍光団は、フラビン、ポルフィリン含有タンパク質及び６１０〜６７０ｎｍの波長領域で励起される他の成分からなる群から選択される１種以上のものを含む方法。
- 請求項１９に記載の方法であって、２次励起された微生物蛍光団が、６１０〜６８０ｎｍの波長領域で励起される内因性成分類からなる群から選択される１種以上のものを含む方法。
- 請求項１９に記載の方法であって、前記生存不能な細菌及び細菌芽胞は、表面上、紙製封筒内、紙を通して、溶液中又はエアロゾル中で検出されるものである方法。
- 請求項１９に記載の方法であって、前記芽胞及び生存不能な細菌は紙製封筒内で検出されるものであり、前記２次励起される微生物蛍光団は前記励起された紙製品からの光放射により励起される方法。
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