JP2003144194A - 特定微生物の計量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 特定微生物を含有するか含有する可能性のあ
る液状検体から、特定微生物の計量を簡単かつ正確に行
うことができる方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 特定微生物を含有し得る液状検体から当
該特定微生物を微生物採取用フィルタ上に捕捉した後、
前記フィルタ上にて当該特定微生物を培養し、当該特定
微生物が産生分泌する物質を検出することにより当該特
定微生物の計量を行うことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特定微生物（微生
物の意味するところは少なくとも細菌と真菌を含む概念
である）、即ち、特定の細菌類および真菌類等を含有す
るか含有する可能性のある液状検体から、特定微生物の
計量を簡単かつ正確に行うことができる方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】特定微生物の計量は食品工場で行われる
ことが多く、食中毒の原因となり得る大腸菌などの特定
微生物の存在の有無を確認することは管理上の重要な要
素になっている。また、最近のＨＡＣＣＰの導入によっ
て、食品そのものの検査だけでなく、工場自体や作業行
程の検査、例えば、壁・床面、まな板・包丁などの調理
器具などの検査も行われており、食品そのものの管理及
び環境の管理が重要になっている。

【０００３】従来、この種の特定微生物を計量する特定
微生物計量方法に関するものとして、特開平７−１４０
１４８号に記載されるように蛍光物質で標識された抗体
を用いて特定微生物を発光検出するものが知られてい
る。また、この方法によれば、非特異的に染色する試薬
との併用で特定微生物と全微生物を把握することができ
る。

【０００４】しかしながら、このような従来の特定微生
物計量方法では、抗体を使用するので感度の高い計測が
行えるが、抗体を蛍光物質で標識化しなければならない
ので、その手間がかかるとともに費用的にも高くなる。
また、抗体を蛍光標識しているため抗体の反応精度や時
間などに課題があった。また、二次抗体を使用した場
合、操作の煩雑性や安定性などに問題があり、温度管理
や反応時間、操作手順など課題が存在していた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、特定微生物が
産生分泌する物質、例えば、酵素タンパク質を当該酵素
タンパク質により分解されて蛍光発色する化合物を生成
する基質物質を試薬として用いて検出することで特定微
生物の計量を行う方法が提案され、既に実用化もされて
いる。しかしながら、これまでに提案されている方法
は、特定微生物が産生分泌する物質と試薬を培地中で混
合し、６〜２４時間培養後、培地の色の変化などで検体
中における特定微生物の有無を確認するといったような
ものに過ぎず、検体中の特定微生物の計量までは行うこ
とができなかった。

【０００６】本発明は、このような従来の課題を解決す
るものであり、特定微生物を含有するか含有する可能性
のある液状検体から、特定微生物の計量を簡単かつ正確
に行うことができる方法を提供することを目的としてい
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の特定微生物の計
量方法は、上記目標を達成するため、請求項１記載の通
り、特定微生物を含有し得る液状検体から当該特定微生
物を微生物採取用フィルタ上に捕捉した後、前記フィル
タ上にて当該特定微生物を培養し、当該特定微生物が産
生分泌する物質を検出することにより当該特定微生物の
計量を行うことを特徴とする。そしてこの計量方法によ
れば、特定微生物を含有し得る液状検体から容易に特定
微生物を捕捉し得るので、当該特定微生物の培養も容易
に行うことができる。従って、当該特定微生物によって
産生分泌される物質の量が少量である場合でも、培養を
行うことで産生分泌される物質の量を蓄積させることが
できるので、特定微生物の正確な計量が可能となる。

【０００８】また、請求項２記載の計量方法は、請求項
１記載の計量方法において、特定微生物が産生分泌する
物質と反応する試薬を用いて検出することを特徴とす
る。そしてこの計量方法によれば、特定微生物が産生分
泌する物質を特定することで、特定微生物の種類を特定
し、さらに正確に特定微生物を計量することが可能とな
る。

【０００９】また、請求項３記載の計量方法は、請求項
１または２記載の計量方法において、特定微生物を微生
物採取用フィルタ上に捕捉した後、液状培地をフィルタ
上部から噴霧することにより当該特定微生物を培養する
ことを特徴とする。そしてこの計量方法によれば、フィ
ルタ上に捕捉された特定微生物の活性を高め、特定微生
物の産生分泌する物質量を増加させ、迅速に特定微生物
を計量することが可能となる。

【００１０】また、請求項４記載の計量方法は、請求項
３記載の計量方法において、特定微生物が産生分泌する
物質を検出するための試薬を液状培地中に含有せしめて
おくことを特徴とする。そしてこの計量方法によれば、
特定微生物が産生分泌する物質を特定することで、特定
微生物の種類を特定し、特定微生物の活性を高め、特定
微生物の産生分泌する物質量を増加させ、さらに迅速に
特定微生物を計量することが可能となる。

【００１１】また、請求項５記載の計量方法は、請求項
１乃至４のいずれかに記載の計量方法において、特定微
生物が産生分泌する物質が酵素タンパク質であることを
特徴とする。そしてこの計量方法によれば、特定微生物
の種類を限定することができ、特定微生物の検知精度を
高めることが可能となる。

【００１２】また、請求項６記載の計量方法は、請求項
５記載の計量方法において、酵素タンパク質により分解
されて蛍光発色する化合物を生成する基質物質を試薬と
して用いて検出することを特徴とする。そしてこの計量
方法によれば、発光体の量により、特定微生物の菌数を
計測することでさらに簡易的に特定微生物を計量するこ
とが可能となる。

【００１３】また、請求項７記載の計量方法は、請求項
１乃至６のいずれかに記載の計量方法において、微生物
採取用フィルタを黒色とすることを特徴とする。そして
この計量方法によれば、正確な微生物の計量を阻害する
要因となる背景（バックグランド）の発光を効果的に抑
制することが可能となる。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明の特定微生物の計量方法
は、特定微生物を含有し得る液状検体から当該特定微生
物を微生物採取用フィルタ上に捕捉した後、前記フィル
タ上にて当該特定微生物を培養し、当該特定微生物が産
生分泌する物質を検出することにより当該特定微生物の
計量を行うことを特徴とするものである。

【００１５】特定微生物を含有し得る液状検体は、検査
対象が液状のものはそれ自体が液状検体となる。検査対
象が食材屑やまな板などの場合は綿棒などを用いて特定
微生物を採取し、これを生理食塩水などに遊離させて液
状検体とする。また、大気中に浮遊している特定微生物
を計測する場合は、インピンジャーの捕集法を利用し
て、生理食塩水などの液中に特定微生物を捕捉し、液状
検体とする

【００１６】微生物採取用フィルタとしては、孔径が
０．１μｍ〜０．５μｍのメンブレンフィルタが好適に
使用される。微生物採取用フィルタは黒色のものを使用
することが望ましい。黒色とすることで正確な微生物の
計量を阻害する要因となる背景（バックグランド）の発
光を効果的に抑制することが可能となるからである。

【００１７】微生物採取用フィルタ上への特定微生物の
捕捉は、特定微生物を含有し得る液状検体を微生物採取
用フィルタを介して吸引濾過するなどの手段により行え
ばよいが、微生物採取用フィルタの前段に異物除去用フ
ィルタを設けておき、異物を異物除去用フィルタで極力
除去した上で特定微生物の捕捉を行うことが望ましい。
なお、異物除去用フィルタの孔径は異物を極力除去する
ためには５μｍ〜２０μｍであることが望ましい。

【００１８】また、微生物採取用フィルタへの特定微生
物の捕捉は、フィルタと吸引手段を組み合わせたユニッ
トを使用し、吸引濾過をポンプの作動による圧力変化に
よって行い、その後、ユニットを分解してピンセットの
ような細かい作業を行うことができる道具を用いて特定
微生物が捕捉されたフィルタを回収し、次の工程として
フィルタ上に捕捉した特定微生物の培養を行うようにし
てもよいが、フィルタの前段にプレフィルタとしての異
物除去用フィルタと後段に微生物採取用フィルタを組み
合わせてなり、特定微生物を含有し得る液状検体から特
定微生物を吸引濾過して微生物採取用フィルタ上に特定
微生物を捕捉する微生物採取チップと吸引濾過手段とか
らなる微生物採取キットを用いることにより、ポンプな
どの大掛かりな装置やピンセットなどの道具を使用する
ことなくより簡便にフィルタ上に捕捉した特定微生物の
培養を行うことができる。このような微生物採取キット
においては、微生物採取チップにおける微生物採取用フ
ィルタを含む部位を単独にて取り外しが可能なものと
し、吸引濾過手段を陰圧管としたもの（陰圧管の口部に
中心部が薄層となっているゴム栓を設けておき、微生物
採取チップの下部に陰圧管内部に届く中空針を設けてお
けば操作性は更に向上する）が好適に用いられる。

【００１９】微生物採取用フィルタ上に捕捉した特定微
生物の培養手段としては、液状培地をフィルタ面上部か
ら噴霧する方法が簡便であり望ましい。しかしながら、
培養手段はこの方法に限定されず、メンブレンフィルタ
のようにフィルタ下面からその上面に毛細管現象により
液状培地を供給し得るようなものの場合には、液状培地
の表面に特定微生物を捕捉した微生物採取用フィルタを
静置するような方法であってもよい。なお、使用する液
状培地は計量目的となる特定微生物の種類に応じて適宜
選択すればよい。また、培地成分に抗生物質や乳糖等の
特定微生物の増殖や活性を高める成分を含有せしめるこ
とで、培養時間の短縮化を図ることが可能となり、計量
を迅速に行うことができるようになる。培養条件は特定
微生物の種類に応じて、温度２５℃〜４０℃、期間１時
間〜５日間の条件範囲内で適宜設定すればよい。

【００２０】特定微生物の計量を行うための標的となる
特定微生物が産生分泌する物質としては、例えば、酵素
タンパク質が挙げられる。例えば、大腸菌はβ−グルク
ロニダーゼを特異的に産生分泌し、大腸菌群はβ−ガラ
クトシダーゼを特異的に産生分泌している。従って、β
−グルクロニダーゼを標的として検出することで大腸菌
の計量が可能となり、β−ガラクトシダーゼを標的とし
て検出することで大腸菌群の計量が可能となる。同様に
して、黄色ブドウ球菌やサルモネラなども計量が可能と
なる。

【００２１】特定微生物が産生分泌する物質として酵素
タンパク質を標的とする場合、これを試薬を用いて検出
する方法が簡便に採用される。例えば、酵素タンパク質
により分解されて蛍光発色する化合物を生成する基質物
質を試薬として用いることにより、酵素タンパク質の検
出、ひいては特定微生物の計量を蛍光観察にて行うこと
ができる。

【００２２】特定微生物が大腸菌である場合、４−メチ
ルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（誘導体で
あってもよい）を試薬として用いれば、大腸菌が存在し
た場合、大腸菌が産生分泌するβ−グルクロニダーゼが
これを分解し、４−メチルウンベリフェロンが生成され
る。４−メチルウンベリフェロンは紫外光に対して励起
され蛍光を発するので、蛍光観察により大腸菌の計量が
可能となる。

【００２３】特定微生物が大腸菌群である場合、４−メ
チルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド（誘導体
であってもよい）を試薬として用いれば、大腸菌群が存
在した場合、大腸菌群が産生分泌するβ−ガラクトシダ
ーゼがこれを分解し、４−メチルウンベリフェロンが生
成され、大腸菌の場合と同様に、蛍光観察により大腸菌
群の計量が可能となる。

【００２４】試薬の添加手段はどのような方法によって
もよいが、当該試薬を液状培地中に含有せしめておくこ
とが簡便である。

【００２５】なお、特定微生物の計量を行うための標的
となる特定微生物が産生分泌する物質としては、酵素タ
ンパク質の他に代謝ガス成分（例えば、硫化水素、アン
モニアなど）が挙げられる。これらは培地成分を酸化反
応により変色させることから、この現象を利用して当該
代謝ガス成分を検出し、特定微生物を計量することも可
能である。

【００２６】以上のようにして微生物採取用フィルタ上
に捕捉され、培養された特定微生物は、当該特定微生物
が産生分泌する物質を検出することに基づいて、種々の
微生物計量装置により計量することができる。以下にそ
の一例を記載する。

【００２７】図１は微生物計量装置の一態様を示す概念
図である。この微生物計量装置は、光源１０４、光源集
光手段としてのレンズ１１０、受光部１１１を含む。光
源１０４から発せられた励起光から目的の波長を取り出
すために励起光分光フィルタ１１２で分光する。分光さ
れた励起光はプリズム１１３を経て、光路を変化させら
れる。光路を変化させられた励起光はレンズ１１０を経
て検査台１１６に設置された微生物採取用フィルタ１
（黒色のプレパラート２上に静置されている）の表面に
集光される。そこで励起光によって励起された蛍光は、
再びプリズム１１３を透過する。その際、蛍光はプリズ
ム１１３をそのまま透過し、受光部１１１に到達する。
受光部１１１に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り
出すために蛍光分光フィルタ１１４を経て、受光部１１
１に内蔵された光電変換素子１１５に到達し、信号化さ
れ、認識される。また、図には示していないが、この微
生物計量装置は検査台１１６を移動する手段を備えてお
り、微生物採取用フィルタ１の表面の蛍光発光を全て、
若しくは一部を受光することができる。

【００２８】光電変換素子１１５に到達した蛍光は、微
生物判断手段１０５において特定微生物由来の蛍光また
は異物由来の蛍光と判断され、特定微生物由来と判断さ
れた蛍光は積算されて、その数量が計量される。

【００２９】光源１０４より発生した励起光は、レンズ
１１０によって集光されるが、その際、レンズ１１０に
よって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光さ
れる。この場合、微小な一定面積とは微生物の大きさに
基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ〜７．０μｍ程
度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微
生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基
づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微
生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が
近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があ
り、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとし
て認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、こ
の場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合
わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ〜５００μ
ｍ程度の範囲を指し示す。

【００３０】レンズ１１０によって集光された励起光の
照射時間は、蛍光を発する化合物の消光時間と励起光強
度に依存する。化合物の種類によっては、自然界に存在
する紫外光によっても分解する場合があり、２秒〜３０
０秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。

【００３１】発光を検出する際、光源１０４の波長の幅
が広いものである場合は、励起光分光フィルタ１１２に
よって励起波長を調整、分光することが可能となる。励
起光分光フィルタ１１２は、目的の検出対象に応じて変
えられるため、様々な蛍光を発する化合物に対応でき
る。また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いもので
ある場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィ
ルタ１１４を目的の検出対象に応じて変えることで様々
な蛍光を発する化合物に対応できる。

【００３２】光源１０４としては、各種ダイオード、ハ
ロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、
ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これら
の光源のうち最大励起波長が比較的限定されているダイ
オード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光
分光フィルタ１１２および蛍光分光フィルタ１１４を使
用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲン
ランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィル
タ１１２および蛍光分光フィルタ１１４を使用する必要
がある場合がある。

【００３３】プリズム１１３およびレンズ１１０は、必
要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫
外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスな
どが挙げられる。これにより紫外光で励起される化合物
などにも対応できる。微生物採取用フィルタ１を設置す
る検査台１１６は回転能を有する。レンズ１１０により
集光された励起光は、微生物採取用フィルタ１の外周部
より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分
の距離を移動する。その際、レンズ１１０により集光さ
れた励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存
在するときで検査台１１６の回転速度を変化させること
によって、レンズ１１０により集光された励起光が外周
部に存在するときと中心部に存在するときで励起された
化合物が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防
止することができる。

【００３４】図１に示したように検査台１１６はプレパ
ラート２上に静置された微生物採取用フィルタ１を嵌合
させるための陥没部分（装置溝）を有し、ここにプレパ
ラート２上に静置された微生物採取用フィルタ１をその
まま組み込むことができる形状としてある。

【００３５】なお、集光した位置を認識する手段を設け
ることでレンズ１１０によって集光された励起光の位置
を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れ
た場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。

【００３６】なお、励起光を照射する微小な一定面積
は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形等でも
可能であり、検体を照射できるものであればよい。

【００３７】なお、励起光若しくは蛍光を分光する手段
として回折格子などを利用することも可能である。

【００３８】なお、検査台１１６の回転速度を調整する
ことで蛍光の残像および残光を防ぐこととしたが、励起
光を照射するレンズ１１０の移動速度を調整することで
残像および残光を防ぐことも可能である。

【００３９】なお、集光した位置を認識する手段は、必
ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、微
生物採取用フィルタ１上の軌道を把握するものであれば
よい。

【００４０】なお、黒色のプレパラートを用いたのは、
紫外線領域の励起光の反射を防止するためであるが、黒
色のプレパラートの代わりに紫外線を吸収する酸化チタ
ンやシリコンなどの素材の上にフィルタを静置しても同
様の効果が得られる。

【００４１】

【実施例】図１で示した微生物計量装置を用いて大腸菌
の計量を行った。詳細は以下の通りである。なお、本発
明は以下の記載に何ら限定されるものではない。

【００４２】微生物採取用フィルタとして孔径が０．４
μｍの黒色のメンブレンフィルタ（ミリポア社製の商品
名：ブラックメンブレンフィルタ・ＧＴＢＰ０１３０
０）を市販の濾過装置に設置し、特定微生物として大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ ＩＦＯ ３３
０１）を１０³〜１０⁵個／ｍＬの濃度で含有する検体１
ｍＬを吸引濾過することでフィルタ上に大腸菌を捕捉し
た。この大腸菌が捕捉されたフィルタを黒色のプレパラ
ート上に静置した。フィルタ面上部より試薬として４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（以下
ＭＵＧと示す）を含有した液状培地（日水製薬社製の商
品名：ブルーライト培地）を０．７０μＬ／ｍ²以上の
量で噴霧した後、インキュベータ中にて３５℃〜３７℃
で１２０分間培養した。培養後のフィルタを図１で示し
た微生物計量装置の検査台に設置し、大腸菌の計測を行
った。その際、励起波長は３５０ｎｍ〜３８０nm、蛍光
波長は４００ｎｍ〜４５０nｍとした。

【００４３】フィルタ上の発光体数を計測し、発光体数
と大腸菌の濃度１０³〜１０⁵個／ｍＬとの相関を確認し
た。また、計測後、市販の大腸菌遺伝子と結合し発色す
る試薬を計測後のフィルタに滴下したところ、発光体の
中心に遺伝子と結合し発色する発光体を確認した。

【００４４】培養開始から所定時間後において、上記と
同様の計測を行ったところ、培養開始から１５分〜６時
間程度までは発光体数の増加現象が確認された。

【００４５】

【発明の効果】本発明によれば、特定微生物を含有する
か含有する可能性のある液状検体から、特定微生物の計
量を簡単かつ正確に行うことができる方法が提供され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の特定微生物の計量を行うのに好適な
装置の一態様の概略図である。

【符号の説明】

１ 微生物採取用フィルタ ２ プレパラート １０４ 光源 １０５ 微生物判断手段 １１０ レンズ １１１ 受光部 １１２ 励起光分光フィルタ １１３ プリズム １１４ 蛍光分光フィルタ １１５ 光電変換素子 １１６ 検査台

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 島北 寛仁 大阪府大阪市城東区今福西６丁目２番61号 松下精工株式会社内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ05 QR02 QS02 QS39 QX02

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特定微生物を含有し得る液状検体から当
   該特定微生物を微生物採取用フィルタ上に捕捉した後、
   前記フィルタ上にて当該特定微生物を培養し、当該特定
   微生物が産生分泌する物質を検出することにより当該特
   定微生物の計量を行うことを特徴とする特定微生物の計
   量方法。
2. 【請求項２】 特定微生物が産生分泌する物質と反応す
   る試薬を用いて検出することを特徴とする請求項１記載
   の計量方法。
3. 【請求項３】 特定微生物を微生物採取用フィルタ上に
   捕捉した後、液状培地をフィルタ上部から噴霧すること
   により当該特定微生物を培養することを特徴とする請求
   項１または２記載の計量方法。
4. 【請求項４】 特定微生物が産生分泌する物質を検出す
   るための試薬を液状培地中に含有せしめておくことを特
   徴とする請求項３記載の計量方法。
5. 【請求項５】 特定微生物が産生分泌する物質が酵素タ
   ンパク質であることを特徴とする請求項１乃至４のいず
   れかに記載の計量方法。
6. 【請求項６】 酵素タンパク質により分解されて蛍光発
   色する化合物を生成する基質物質を試薬として用いて検
   出することを特徴とする請求項５記載の計量方法。
7. 【請求項７】 微生物採取用フィルタを黒色とすること
   を特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の計量方
   法。