JP2734489B2 - 微生物生細胞の計数方法及び装置 - Google Patents
微生物生細胞の計数方法及び装置Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物細胞の計数方法に関し、特に食品プラ
ント、医薬品製造プラントにおける原料や製品の品質管
理や殺菌性能評価等に適用される生細胞の計数方法及び
装置に関する。
ント、医薬品製造プラントにおける原料や製品の品質管
理や殺菌性能評価等に適用される生細胞の計数方法及び
装置に関する。
生細胞の計数方法として従来最も広く用いられている
のは寒天培養法である。この方法は微生物の栄養源を溶
かし込んだ寒天に試料を分散させて培養し、寒天にコロ
ニーを形成させ、このコロニー数を計数することにより
生細胞数を求めるものであるが、培養操作を伴うため測
定に必要な時間は１〜数日と長時間必要であり、原料や
製品の品質管理、殺菌管理に支障をきたす場合が多い。
のは寒天培養法である。この方法は微生物の栄養源を溶
かし込んだ寒天に試料を分散させて培養し、寒天にコロ
ニーを形成させ、このコロニー数を計数することにより
生細胞数を求めるものであるが、培養操作を伴うため測
定に必要な時間は１〜数日と長時間必要であり、原料や
製品の品質管理、殺菌管理に支障をきたす場合が多い。
そこで、生細胞を短時間で計測しようとする試みがい
くつかなされている。例えば、生細胞中に存在するAT
P（アデノシン三リン酸）と、ホタル酵素であるルシフ
ェリンルシフェラーゼを作用させることにより生ずる発
光量を測定し、その発光量から間接的に生細胞数を求め
る方法、ウンベリフェロン誘導体を試料に作用させ、
生細胞に含まれる加水分解酵素との反応により生ずる蛍
光性のウンベリフェロンの蛍光強度を測定し、その蛍光
強度から生細胞数を間接的に求める方法などがある。
くつかなされている。例えば、生細胞中に存在するAT
P（アデノシン三リン酸）と、ホタル酵素であるルシフ
ェリンルシフェラーゼを作用させることにより生ずる発
光量を測定し、その発光量から間接的に生細胞数を求め
る方法、ウンベリフェロン誘導体を試料に作用させ、
生細胞に含まれる加水分解酵素との反応により生ずる蛍
光性のウンベリフェロンの蛍光強度を測定し、その蛍光
強度から生細胞数を間接的に求める方法などがある。
しかし、これらの方法は細胞濃度が約104個/ml以上存
在しないと発光量が少ないため計数が難しく、これ以下
の細胞濃度の試料の場合、４〜５時間以上かけて培養を
行い濃度を高めてから測定するか、又は遠心分離により
細胞を濃縮するなどの前処理が必要であり、低濃度（数
個/ml）の細胞試料を短時間に計測する目的からすると
適用することは難しかった。
在しないと発光量が少ないため計数が難しく、これ以下
の細胞濃度の試料の場合、４〜５時間以上かけて培養を
行い濃度を高めてから測定するか、又は遠心分離により
細胞を濃縮するなどの前処理が必要であり、低濃度（数
個/ml）の細胞試料を短時間に計測する目的からすると
適用することは難しかった。
さらに、上述のいずれかの従来法も連続的に計測する
ことができないため、殺菌プロセス、発酵プロセスに組
み込み、微生物を計測、制御することはできなかった。
ことができないため、殺菌プロセス、発酵プロセスに組
み込み、微生物を計測、制御することはできなかった。
〔発明が解決しようとする課題〕 従来の短時間微生物計測法であるATP法、ウンベリフ
ェロン法の最大の問題の一つは、微生物濃度の高い試料
しか適用できないことである。この原因はATP法の場
合、細胞に含まれるATPを熱処理又は界面活性剤などに
より溶液中に放出させてからルシフェリンルシフェラー
ゼを作用させ、液の発光量を測定することにより間接的
に細胞数を把握する方法であるため個々の細胞の発光計
測ができないこと、また測定装置も個々の細胞の発光計
数ができるシステム構成になっていないことなどがあげ
られ、これはウンベリフェロン誘導体を用いる方法でも
共通の課題である。
ェロン法の最大の問題の一つは、微生物濃度の高い試料
しか適用できないことである。この原因はATP法の場
合、細胞に含まれるATPを熱処理又は界面活性剤などに
より溶液中に放出させてからルシフェリンルシフェラー
ゼを作用させ、液の発光量を測定することにより間接的
に細胞数を把握する方法であるため個々の細胞の発光計
測ができないこと、また測定装置も個々の細胞の発光計
数ができるシステム構成になっていないことなどがあげ
られ、これはウンベリフェロン誘導体を用いる方法でも
共通の課題である。
本発明は上記技術水準に鑑み、短時間のうちに微生物
生細胞を計数できる方法及び装置を提供しようとするも
のである。
生細胞を計数できる方法及び装置を提供しようとするも
のである。
そこで、本発明者らは、先ず個々の細胞の発光計数を
可能とするため、種々化学物質について実験・検討した
結果、フルオレセイン誘導体が生細胞中に含まれる酵素
と反応し細胞内に蛍光物質であるフルオレセインを生成
・蓄積するのでウンベリフェロンのように細胞外へほと
んどの色素が流出してしまうことがなく励起光を照射し
た場合、個々の細胞が蛍光を発し、光の点として計測で
きることを知った。
可能とするため、種々化学物質について実験・検討した
結果、フルオレセイン誘導体が生細胞中に含まれる酵素
と反応し細胞内に蛍光物質であるフルオレセインを生成
・蓄積するのでウンベリフェロンのように細胞外へほと
んどの色素が流出してしまうことがなく励起光を照射し
た場合、個々の細胞が蛍光を発し、光の点として計測で
きることを知った。
本発明は上記知見に基いて、フルオレセン誘導体のよ
うな生細胞中の酵素と反応することにより細胞中に蛍光
物質を生成蓄積する性質をもつ物質を用い、細胞に励起
光を照射し、細胞内の蛍光物質を励起させ、蛍光を発す
る個々の細胞を計数することにより、短時間でかつ低濃
度の細胞でも測定を可能とすることができることを確認
し、本発明を完成するに至った。
うな生細胞中の酵素と反応することにより細胞中に蛍光
物質を生成蓄積する性質をもつ物質を用い、細胞に励起
光を照射し、細胞内の蛍光物質を励起させ、蛍光を発す
る個々の細胞を計数することにより、短時間でかつ低濃
度の細胞でも測定を可能とすることができることを確認
し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、 （１）微生物生細胞を計数する方法において、細胞内に
蓄積した蛍光物質を励起するに必要な波長を有する光
源、細胞試料を連続的に通過、測定するためのセル、生
細胞の発する蛍光を受光するための受光素子、受光素子
の出力をカウントするカウンターを設け、該セルは測定
部において該測定部の流れ方向と直交する断面形状が横
方向に長く縦方向に短い長方形であり、セルの側面部か
ら励起光を照射し横方向に長い正面部から細胞の発する
蛍光を受光素子により受光させることを特徴とする微生
物生細胞の計数方法。
蓄積した蛍光物質を励起するに必要な波長を有する光
源、細胞試料を連続的に通過、測定するためのセル、生
細胞の発する蛍光を受光するための受光素子、受光素子
の出力をカウントするカウンターを設け、該セルは測定
部において該測定部の流れ方向と直交する断面形状が横
方向に長く縦方向に短い長方形であり、セルの側面部か
ら励起光を照射し横方向に長い正面部から細胞の発する
蛍光を受光素子により受光させることを特徴とする微生
物生細胞の計数方法。
（２）細胞の発する蛍光を直線上に並んだ複数の受光素
子により受光させることを特徴とする請求項（１）記載
の微生物生細胞の計数方法。
子により受光させることを特徴とする請求項（１）記載
の微生物生細胞の計数方法。
（３）細胞内に蛍光物質を蓄積させる物質としてフルオ
レセン誘導体を使用することを特徴とする請求項（１）
〜（２）いずれかに記載の微生物生細胞の計数方法。
レセン誘導体を使用することを特徴とする請求項（１）
〜（２）いずれかに記載の微生物生細胞の計数方法。
（４）フルオレセン誘導体がフルオレセン・ジアセテー
トであることを特徴とする請求項（３）記載の微生物生
細胞の計数方法。
トであることを特徴とする請求項（３）記載の微生物生
細胞の計数方法。
（５）フルオレセン誘導体が５−カルボキシフルオレセ
ンジアセテート及び／又は６−カルボキシフルオレセン
ジアセテートであることを特徴とする請求項（３）記載
の微生物生細胞の計数方法。
ンジアセテート及び／又は６−カルボキシフルオレセン
ジアセテートであることを特徴とする請求項（３）記載
の微生物生細胞の計数方法。
（６）フルオレセン誘導体が５−カルボキシ−２′,7′
−ジクロロフルオレセンジアセテート及び／又は６′−
カルボキシ−２′,7′−ジクロロフルオレセンジアセテ
ートであることを特徴とする請求項（３）記載の微生物
生細胞の計数方法。
−ジクロロフルオレセンジアセテート及び／又は６′−
カルボキシ−２′,7′−ジクロロフルオレセンジアセテ
ートであることを特徴とする請求項（３）記載の微生物
生細胞の計数方法。
（７）生細胞の含有される流体状の細胞試料を供給する
手段と、蛍光物質を供給する手段と、前記の細胞試料及
び蛍光物質を混合する反応器と、細胞内に蓄積した蛍光
物質を励起するに必要な波長を有する光源と、反応器か
らの細胞試料を連続的に通過、測定するためのセルと、
生細胞の発する蛍光を受光するための受光素子と、受光
素子の出力をカウントとするカウンターとを設け、該セ
ルは測定部において該測定部の流れ方向と直交する断面
形状が横方向に長く縦方向に短い長方形であり、セルの
側面部から励起光を照射し横方向に長い正面部から細胞
の発する蛍光を受光素子により受光させるよう前記光源
及び前記受光素子を配したことを特徴とする微生物生細
胞の計数装置。
手段と、蛍光物質を供給する手段と、前記の細胞試料及
び蛍光物質を混合する反応器と、細胞内に蓄積した蛍光
物質を励起するに必要な波長を有する光源と、反応器か
らの細胞試料を連続的に通過、測定するためのセルと、
生細胞の発する蛍光を受光するための受光素子と、受光
素子の出力をカウントとするカウンターとを設け、該セ
ルは測定部において該測定部の流れ方向と直交する断面
形状が横方向に長く縦方向に短い長方形であり、セルの
側面部から励起光を照射し横方向に長い正面部から細胞
の発する蛍光を受光素子により受光させるよう前記光源
及び前記受光素子を配したことを特徴とする微生物生細
胞の計数装置。
（８）細胞の発する蛍光を直線上に並んだ複数の受光素
子により受光させることを特徴とする請求項（７）記載
の微生物生細胞の計数装置。
子により受光させることを特徴とする請求項（７）記載
の微生物生細胞の計数装置。
である。
フルオレセイン誘導体を試料に所定温度、所定時間作
用させると、生細胞に含まれる酵素とフルオレセン誘導
体が反応し、生細胞中にフルオレセインが生成する。こ
の試料にフルオレセインを励起するに必要な波長を有す
る光を照射すると、フルオレセインは蛍光を発し生細胞
は個々の光の点として計測できるようになる。
用させると、生細胞に含まれる酵素とフルオレセン誘導
体が反応し、生細胞中にフルオレセインが生成する。こ
の試料にフルオレセインを励起するに必要な波長を有す
る光を照射すると、フルオレセインは蛍光を発し生細胞
は個々の光の点として計測できるようになる。
低濃度の試料でも精度よく計数するためには、例え
ば、数個/mlの試料の場合、最低でも1ml、信頼性のある
データを得ようとすれば10mlの試料を計測する必要があ
り、さらに微生物濃度が低い場合には測定試料もさらに
多くする必要がある。
ば、数個/mlの試料の場合、最低でも1ml、信頼性のある
データを得ようとすれば10mlの試料を計測する必要があ
り、さらに微生物濃度が低い場合には測定試料もさらに
多くする必要がある。
そこで多量の試料を処理・計測するための手段とし
て、透明セル内を連続的に試料を通過させ、このセルに
フルオレセインを励起させるための光を照射し、個々の
細胞から発する蛍光を光の点として計測する方法があ
る。この時重要なのはセルの形状であり、細胞の発する
蛍光を受光器に受光させるためにはなるべくセルの厚み
を薄くする必要がある。これは、セル厚みが大きいとセ
ルを通過する試料の液厚みも厚くなるため細胞に焦点を
あてにくくなり、細胞の蛍光を受光器に受光させる際感
度が低下するためである。そこでセル厚みが薄く、かつ
多量の試料の処理を可能とするため、横方向に長く、縦
方向に短い長方体のセルを採用し、縦方向に短いセルの
側面部から励起光を照射する。細胞の発する蛍光は横方
向に長いセルの正面部から受光、即ちセルの厚みの薄い
方向から受光することになる。
て、透明セル内を連続的に試料を通過させ、このセルに
フルオレセインを励起させるための光を照射し、個々の
細胞から発する蛍光を光の点として計測する方法があ
る。この時重要なのはセルの形状であり、細胞の発する
蛍光を受光器に受光させるためにはなるべくセルの厚み
を薄くする必要がある。これは、セル厚みが大きいとセ
ルを通過する試料の液厚みも厚くなるため細胞に焦点を
あてにくくなり、細胞の蛍光を受光器に受光させる際感
度が低下するためである。そこでセル厚みが薄く、かつ
多量の試料の処理を可能とするため、横方向に長く、縦
方向に短い長方体のセルを採用し、縦方向に短いセルの
側面部から励起光を照射する。細胞の発する蛍光は横方
向に長いセルの正面部から受光、即ちセルの厚みの薄い
方向から受光することになる。
横方向に長いセル部からの蛍光を受光するために、一
般的にはフォトマルチプライヤーを使用することが考え
られるが、横幅のセルでは集光が難しく、セル面を走査
するなど面倒な光学機構が必要となる。
般的にはフォトマルチプライヤーを使用することが考え
られるが、横幅のセルでは集光が難しく、セル面を走査
するなど面倒な光学機構が必要となる。
そこで、本発明では試料量が少なくセルが小さい場合
には、レンズ光学系を介して集光した蛍光を視野絞りで
絞り込んで１個の受光素子で受講するようにしてもよい
が、なるべく複数個の受光素子をセル横方向に並べてお
き、レンズ光学系を介して受光素子に受光させるように
することが好ましい。本発明方法によりセル内を通過す
る全試料の計測が可能となりまたセルの幅を必要に応じ
て長くできるので多量の試料の処理が可能となる。
には、レンズ光学系を介して集光した蛍光を視野絞りで
絞り込んで１個の受光素子で受講するようにしてもよい
が、なるべく複数個の受光素子をセル横方向に並べてお
き、レンズ光学系を介して受光素子に受光させるように
することが好ましい。本発明方法によりセル内を通過す
る全試料の計測が可能となりまたセルの幅を必要に応じ
て長くできるので多量の試料の処理が可能となる。
本発明者らは、多くのフルオレセン誘導体につき実験
研究の結果、先ず、フルオレセンジアセテート（以下、
FDAと略称する）が上記目的を達成する好ましい物質で
あることを確認した。FDAと酵素の反応は下記の通りで
ある。
研究の結果、先ず、フルオレセンジアセテート（以下、
FDAと略称する）が上記目的を達成する好ましい物質で
あることを確認した。FDAと酵素の反応は下記の通りで
ある。
上述したように、FDAは十分それなりに効果を奏する
が、連続的に長時間計測を行っていると、セルの壁面に
未溶解のFDAが付着して計測が困難となったり、また試
料ラインに付着したFDAが剥離してセルを通過し誤計測
の原因となることが判り、長時間の連続計測を行う場
合、試料ラインやセル壁面を時々洗浄してやる必要のあ
ることが判った。この問題点のないフルオレセン誘導体
を更に探索した結果、５−カルボキシフルオレセンジア
セテート及び／又は６−カルボキフルオレセンジアセテ
ート（以下、Ｃ−FDAと略称する）又は５−カルボキシ
−２′,7′−ジクロロフルオレセンジアセテート及び／
又は６−カルボキシ−２′,7′−ジクロロフルオレセン
ジアセテート（以下、CDC−FDAと略称する）が極めて好
ましい物質であることが判った。
が、連続的に長時間計測を行っていると、セルの壁面に
未溶解のFDAが付着して計測が困難となったり、また試
料ラインに付着したFDAが剥離してセルを通過し誤計測
の原因となることが判り、長時間の連続計測を行う場
合、試料ラインやセル壁面を時々洗浄してやる必要のあ
ることが判った。この問題点のないフルオレセン誘導体
を更に探索した結果、５−カルボキシフルオレセンジア
セテート及び／又は６−カルボキフルオレセンジアセテ
ート（以下、Ｃ−FDAと略称する）又は５−カルボキシ
−２′,7′−ジクロロフルオレセンジアセテート及び／
又は６−カルボキシ−２′,7′−ジクロロフルオレセン
ジアセテート（以下、CDC−FDAと略称する）が極めて好
ましい物質であることが判った。
Ｃ−FDA,CDC−FDAはそれ自体に蛍光がないが、生細胞
内に存在する酵素、特にエステラーゼと反応して、蛍光
物質がある５−カルボキシフルオレセイン及び／又は６
−カルボキシフルオレセインあるいは５−カルボキシ−
２′,7′−ジクロロフルオレセイン及び／又は６−カル
ボキシ−２′,7′−ジクロロフルオレセインを細胞内に
蓄積する。Ｃ−FDA,CDC−FDAと酵素の反応は下記の通り
である。
内に存在する酵素、特にエステラーゼと反応して、蛍光
物質がある５−カルボキシフルオレセイン及び／又は６
−カルボキシフルオレセインあるいは５−カルボキシ−
２′,7′−ジクロロフルオレセイン及び／又は６−カル
ボキシ−２′,7′−ジクロロフルオレセインを細胞内に
蓄積する。Ｃ−FDA,CDC−FDAと酵素の反応は下記の通り
である。
Ｃ−FDA,CDC−FDAの水に対する溶解度は両者共100μg
/ml以上ある。細胞試料への添加量は50〜100μg/mlで行
うので十分溶解することができ、セル壁面や試料ライン
への付着といった問題は起こらない。
/ml以上ある。細胞試料への添加量は50〜100μg/mlで行
うので十分溶解することができ、セル壁面や試料ライン
への付着といった問題は起こらない。
ちなみに、FDAの溶解度は１μg/ml以下と水に対し非
常に難溶性であるため、未溶解のFDAがセル壁面、試料
ラインに徐々に付着し、洗浄操作が不可欠になるという
問題を生ずる。
常に難溶性であるため、未溶解のFDAがセル壁面、試料
ラインに徐々に付着し、洗浄操作が不可欠になるという
問題を生ずる。
細胞内に蓄積した蛍光物質を特定波長の光で励起させ
てやるとこれらが蛍光を発し、生きている細胞のみが光
るので、これを計数すれば生菌数を求めることができ
る。なお、死んだ細胞には酵素が失活しているため蛍光
物質を生ずる反応は起こらず従って励起光を照射しても
蛍光は発しない。
てやるとこれらが蛍光を発し、生きている細胞のみが光
るので、これを計数すれば生菌数を求めることができ
る。なお、死んだ細胞には酵素が失活しているため蛍光
物質を生ずる反応は起こらず従って励起光を照射しても
蛍光は発しない。
〔実施例１〕 本発明の一実施例を第１図によって説明する。第１図
において、（ａ）は本発明を実施する装置の全体図、
（ｂ）は第１図（ａ）のＩ−Ｉ断面図、（ｃ）は第１図
（ａ）のII−II断面図である。
において、（ａ）は本発明を実施する装置の全体図、
（ｂ）は第１図（ａ）のＩ−Ｉ断面図、（ｃ）は第１図
（ａ）のII−II断面図である。
ラインP1より測定対象試料が反応器V1に流入し、ライ
ンP2よりアセトンで溶解されたFDAが注入される。反応
器V1で試料とFDAは一定時間、一定温度に保たれた後、
セルV2に流入する。
ンP2よりアセトンで溶解されたFDAが注入される。反応
器V1で試料とFDAは一定時間、一定温度に保たれた後、
セルV2に流入する。
対象微生物の種類により、作用させるFDA濃度、反応
時間は異なるが、酵母の場合FDA濃度は50〜100μg/ml、
反応時間は５〜10分、大腸菌、枯草菌ではFDA濃度は100
〜150μg/ml、反応時間は10〜20分が適当である。な
お、反応温度は30〜37℃が適当であり、10℃以下又は45
℃以上の条件では生菌とFDAとはほとんど反応せず計測
はできなくなる。
時間は異なるが、酵母の場合FDA濃度は50〜100μg/ml、
反応時間は５〜10分、大腸菌、枯草菌ではFDA濃度は100
〜150μg/ml、反応時間は10〜20分が適当である。な
お、反応温度は30〜37℃が適当であり、10℃以下又は45
℃以上の条件では生菌とFDAとはほとんど反応せず計測
はできなくなる。
反応器V1にて、試料中の生菌だけがFDAと反応して細
胞内にフルオレセインを蓄積したセルV2に流入するが、
ここでフルオレセインを励起させるために光を照射す
る。１はそのための励起光源、２は集光レンズ、３は励
起フィルターであり、ここでは励起光源として水銀ラン
プ、励起フィルターとして450〜490nmの波長を通過する
特性をもつものを使用している。フルオレセインを励起
させることができる波長（450〜490nm）を有すれば励起
光源は水銀ランプでなくとも構わない。
胞内にフルオレセインを蓄積したセルV2に流入するが、
ここでフルオレセインを励起させるために光を照射す
る。１はそのための励起光源、２は集光レンズ、３は励
起フィルターであり、ここでは励起光源として水銀ラン
プ、励起フィルターとして450〜490nmの波長を通過する
特性をもつものを使用している。フルオレセインを励起
させることができる波長（450〜490nm）を有すれば励起
光源は水銀ランプでなくとも構わない。
励起光をセルV2の側面部から照射すると、照射された
部分に存在する生細胞は蛍光を発する。セルV2には横方
向に長い正面部にスリット４が設けられており、このス
リット４部を通過する細胞のみを計数するためにスリッ
ト４以外の部分は光を通過しないようにしてある。
部分に存在する生細胞は蛍光を発する。セルV2には横方
向に長い正面部にスリット４が設けられており、このス
リット４部を通過する細胞のみを計数するためにスリッ
ト４以外の部分は光を通過しないようにしてある。
このスリット４の幅は細胞の種類、大きさによっても
異なるが、酵母の場合、50μｍ、またセルV2の大きさは
励起光照射側の側面部で、100μｍ、蛍光受光側の正面
部（横方向）は500μｍのものを使用した。なお、セルV
2の上下は試料の通過、洗浄を行いやすくするため大き
くしてある。
異なるが、酵母の場合、50μｍ、またセルV2の大きさは
励起光照射側の側面部で、100μｍ、蛍光受光側の正面
部（横方向）は500μｍのものを使用した。なお、セルV
2の上下は試料の通過、洗浄を行いやすくするため大き
くしてある。
生細胞の発する蛍光スペクトルは512nm付近にピーク
をもつ。５は蛍光フィルターで510nm以上の波長の光を
通過させ、450〜490nmの励起光をカットする役割を果
す。
をもつ。５は蛍光フィルターで510nm以上の波長の光を
通過させ、450〜490nmの励起光をカットする役割を果
す。
スリット４を通過する生細胞の蛍光は蛍光フィルター
５、集光レンズ６を介し、スリット４に対応して直線上
に並んだ複数個の受光素子７に受光させる。受光素子７
の数は細胞の種類、セルV2幅によって異なるが、酵母の
場合10個の受光素子をもつフォトダイオードアレイを用
いた。
５、集光レンズ６を介し、スリット４に対応して直線上
に並んだ複数個の受光素子７に受光させる。受光素子７
の数は細胞の種類、セルV2幅によって異なるが、酵母の
場合10個の受光素子をもつフォトダイオードアレイを用
いた。
８は受光器回路、９は受光器回路からの出力をカウン
トするパルスカウンタであり、スリット４を通過する生
細胞数を計数するためのものである。
トするパルスカウンタであり、スリット４を通過する生
細胞数を計数するためのものである。
〔実施例２〕 Ｃ−FDAを用いて行った本発明の一実施例を第２図に
よって説明する。ラインP1より測定対象試料が反応器V1
に流入し、ラインP2よりアセトンで1mg/mlの濃度に調整
したＣ−FDAを注入する。注入量は対象試料に対し容量
比で1/10〜1/20程度（Ｃ−FDAの添加濃度としては50〜1
00μg/ml）が適当である。
よって説明する。ラインP1より測定対象試料が反応器V1
に流入し、ラインP2よりアセトンで1mg/mlの濃度に調整
したＣ−FDAを注入する。注入量は対象試料に対し容量
比で1/10〜1/20程度（Ｃ−FDAの添加濃度としては50〜1
00μg/ml）が適当である。
反応器V1で試料とＣ−FDAは一定時間、一定温度に保
たれた後P3を経由してセルV2に流入する。
たれた後P3を経由してセルV2に流入する。
実験で用いた試料は約103個/mlの濃度に調整した酵母
菌であり、この場合反応器V1にて37℃、５分間試料とＣ
−FDAを作用させた。反応器V1ではＣ−FDAと生酵母が有
する酵素との反応により酵母の中に蛍光物質である５−
カルボキシフルオレセイン及び／又は６−カルボキシフ
ルオレセインが蓄積される。
菌であり、この場合反応器V1にて37℃、５分間試料とＣ
−FDAを作用させた。反応器V1ではＣ−FDAと生酵母が有
する酵素との反応により酵母の中に蛍光物質である５−
カルボキシフルオレセイン及び／又は６−カルボキシフ
ルオレセインが蓄積される。
第３図に上記蛍光物質の励起スペクトル、蛍光スペク
トルを示す。これからわかるように励起スペクトルの最
大値は490nm近辺に、また蛍光スペクトルの最大値は515
nm近辺に有する。
トルを示す。これからわかるように励起スペクトルの最
大値は490nm近辺に、また蛍光スペクトルの最大値は515
nm近辺に有する。
そこで、蛍光物質を励起する光源１としては490nmに
近い波長である488nmのアルゴンレーザー（出力1mW）を
用いた。レーザー光はミラー迷光除去用のピンホールス
リット３、ミラー４、集光レンズ５を介してセルV2を通
過する細胞試料に照射されるが、このときレーザー光は
集光レンズ５にて直径0.01cmの大きさにまで絞り込ま
れ、セルV2に照射される。セルV2ではレーザー光が通過
する直径0.01cm、長さ0.1cmの部分に存在する生細胞は
蛍光を発する。
近い波長である488nmのアルゴンレーザー（出力1mW）を
用いた。レーザー光はミラー迷光除去用のピンホールス
リット３、ミラー４、集光レンズ５を介してセルV2を通
過する細胞試料に照射されるが、このときレーザー光は
集光レンズ５にて直径0.01cmの大きさにまで絞り込ま
れ、セルV2に照射される。セルV2ではレーザー光が通過
する直径0.01cm、長さ0.1cmの部分に存在する生細胞は
蛍光を発する。
この蛍光を集光レンズ6,8で集光し視野絞り９を介し
て１個の受光素子で受光可能な大きさに絞り込み、受光
素子（こゝでは光電子増倍管）10で蛍光を増倍し、パル
スカウンタ（こゝではフォトンカウンタ）11で蛍光をカ
ウンティングすることにより細胞数を計数する。
て１個の受光素子で受光可能な大きさに絞り込み、受光
素子（こゝでは光電子増倍管）10で蛍光を増倍し、パル
スカウンタ（こゝではフォトンカウンタ）11で蛍光をカ
ウンティングすることにより細胞数を計数する。
なお、集光レンズ6,8の間では蛍光スペクトルの最大
値である515nm近辺の波長のみを通過するバンドパスフ
ィルタ７を設置した。
値である515nm近辺の波長のみを通過するバンドパスフ
ィルタ７を設置した。
セルV2の大きさは横0.1cm、縦0.01cm、高さ5cmであ
り、励起光の照射は、縦方向に短いセルの側面部から行
い、細胞の発する蛍光は横方向に長いセルの正面部から
受光、すなわち、セルV2の厚みの薄い方向から受光する
こととし、試料のセルV2内の通過速度は1cm/secとし
た。
り、励起光の照射は、縦方向に短いセルの側面部から行
い、細胞の発する蛍光は横方向に長いセルの正面部から
受光、すなわち、セルV2の厚みの薄い方向から受光する
こととし、試料のセルV2内の通過速度は1cm/secとし
た。
第４図はこの計測結果であり、10秒間にセルを通過す
る細胞数をカウントしたものである。
る細胞数をカウントしたものである。
セルの断面積は0.1×0.01＝0.001cm2、流速は1cm/sec
であるから、流量は0.001cm3/secとなり、10秒間では0.
01cm3通過することになる。第４図から、パルスカウン
ト数は11個存在するから、11個/0.01cm3＝1.1×103個/m
lの濃度の細胞数であったことがわかり、調整した試料
濃度の約103個/mlとほぼ一致する。
であるから、流量は0.001cm3/secとなり、10秒間では0.
01cm3通過することになる。第４図から、パルスカウン
ト数は11個存在するから、11個/0.01cm3＝1.1×103個/m
lの濃度の細胞数であったことがわかり、調整した試料
濃度の約103個/mlとほぼ一致する。
ちなみにFDAを使用した場合（反応条件、通水条件は
Ｃ−FDAと同じ）通水10分程度まではうまく測定できる
が、それ以上通水を続けると壁面に未溶解のFDAが付着
し測定できなくなるのに対し、Ｃ−FDAでは10時間以上
通水しても安定に計測が可能である。
Ｃ−FDAと同じ）通水10分程度まではうまく測定できる
が、それ以上通水を続けると壁面に未溶解のFDAが付着
し測定できなくなるのに対し、Ｃ−FDAでは10時間以上
通水しても安定に計測が可能である。
〔実施例３〕 実施例２のＣ−FDAに代え、CDC−FDAを用いて本発明
の実施例を行った結果、実施例２と同様な結果が得られ
た。
の実施例を行った結果、実施例２と同様な結果が得られ
た。
本発明により従来１〜数日と長時間必要であった生細
胞の測定が分単位で行えるようになり、また、セルの形
状、励起光照射方法、蛍光受光方法の新しい配設手段に
よって多量の試料処理が可能となり、低濃度の細胞試料
でも計測ができるようになった。
胞の測定が分単位で行えるようになり、また、セルの形
状、励起光照射方法、蛍光受光方法の新しい配設手段に
よって多量の試料処理が可能となり、低濃度の細胞試料
でも計測ができるようになった。
また、本発明は食品分野等における微生物検査の省力
化、原料・製品の品質管理、殺菌管理に極めて高い効果
を発揮するものである。
化、原料・製品の品質管理、殺菌管理に極めて高い効果
を発揮するものである。
第１図は本発明を実施する装置の一態様を示し、（ａ）
はその全体図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ断面図、（ｃ）
は（ａ）のII−II断面図である。 第２図は本発明の実施する装置の他の態様を示す図、第
３図はＣ−FDAによって生成された蛍光物質の励起、蛍
光スペクトルを示す図表、第４図は本発明の実施例２で
計数した計測結果を示す図表である。
はその全体図、（ｂ）は（ａ）のＩ−Ｉ断面図、（ｃ）
は（ａ）のII−II断面図である。 第２図は本発明の実施する装置の他の態様を示す図、第
３図はＣ−FDAによって生成された蛍光物質の励起、蛍
光スペクトルを示す図表、第４図は本発明の実施例２で
計数した計測結果を示す図表である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 土井 崇史 神奈川県横浜市金沢区幸浦１丁目８番地 １ 三菱重工業株式会社基盤技術研究所 内 (72)発明者 大西 巍 神奈川県横浜市中区錦町12番地 三菱重 工業株式会社横浜研究所内 (72)発明者 松本 和典 神奈川県横浜市中区錦町12番地 三菱重 工業株式会社横浜研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−186854（ＪＰ，Ａ)
Claims (8)
- 【請求項１】微生物生細胞を計数する方法において、細
胞内に蓄積した蛍光物質を励起するに必要な波長を有す
る光源、細胞試料を連続的に通過、測定するためのセ
ル、生細胞の発する蛍光を受光するための受光素子、受
光素子の出力をカウントするカウンターを設け、該セル
は測定部において該測定部の流れ方向と直交する断面形
状が横方向に長く縦方向に短い長方形であり、セルの側
面部から励起光を照射し横方向に長い正面部から細胞の
発する蛍光を受光素子により受光させることを特徴とす
る微生物生細胞の計数方法。 - 【請求項２】細胞の発する蛍光を直線上に並んだ複数の
受光素子により受光させることを特徴とする請求項
（１）記載の微生物生細胞の計数方法。 - 【請求項３】細胞内に蛍光物質を蓄積させる物質として
フルオレセン誘導体を使用することを特徴とする請求項
（１）〜（２）いずれかに記載の微生物生細胞の計数方
法。 - 【請求項４】フルオレセン誘導体がフルオレセン・ジア
セテートであることを特徴とする請求項（３）記載の微
生物生細胞の計数方法。 - 【請求項５】フルオレセン誘導体が５−カルボキシフル
オレセンジアセテート及び／又は６−カルボキシフルオ
レセンジアセテートであることを特徴とする請求項
（３）記載の微生物生細胞の計数方法。 - 【請求項６】フルオレセン誘導体が５−カルボキシ−
２′,7′−ジクロロフルオレセンジアセテート及び／又
は６′−カルボキシ−２′,7′−ジクロロフルオレセン
ジアセテートであることを特徴とする請求項（３）記載
の微生物生細胞の計数方法。 - 【請求項７】生細胞の含有される流体状の細胞試料を供
給する手段と、蛍光物質を供給する手段と、前記の細胞
試料及び蛍光物質を混合する反応器と、細胞内に蓄積し
た蛍光物質を励起するに必要な波長を有する光源と、反
応器からの細胞試料を連続的に通過、測定するためのセ
ルと、生細胞の発する蛍光を受光するための受光素子
と、受光素子の出力をカウントとするカウンターとを設
け、該セルは測定部において該測定部の流れ方向と直交
する断面形状が横方向に長く縦方向に短い長方形であ
り、セルの側面部から励起光を照射し横方向に長い正面
部から細胞の発する蛍光を受光素子により受光させるよ
う前記光源及び前記受光素子を配したことを特徴とする
微生物生細胞の計数装置。 - 【請求項８】細胞の発する蛍光を直線上に並んだ複数の
受光素子により受光させることを特徴とする請求項
（７）記載の微生物生細胞の計数装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP19910250047 EP0443700A3 (en) | 1990-02-21 | 1991-02-19 | Method for counting living cells of microbes and apparatus therefor |
| US07/658,646 US5389544A (en) | 1990-02-21 | 1991-02-21 | Method for counting living cells of microbes and apparatus therefor |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3837290 | 1990-02-21 | ||
| JP2-38372 | 1990-02-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03272697A JPH03272697A (ja) | 1991-12-04 |
| JP2734489B2 true JP2734489B2 (ja) | 1998-03-30 |
Family
ID=12523455
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29905690A Expired - Fee Related JP2734489B2 (ja) | 1990-02-21 | 1990-11-06 | 微生物生細胞の計数方法及び装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2734489B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6221210B2 (ja) * | 2012-09-11 | 2017-11-01 | 株式会社サタケ | 微生物の検査方法及びその装置 |
| JP6201285B2 (ja) * | 2012-08-24 | 2017-09-27 | 株式会社サタケ | 微生物の検査方法及びその装置 |
| TWI619809B (zh) * | 2012-08-24 | 2018-04-01 | 佐竹股份有限公司 | 微生物之檢查方法及其裝置 |
| KR101970691B1 (ko) * | 2016-09-06 | 2019-04-19 | 피엠씨씨 주식회사 | 유체포커싱채널부를 구비하는 세포 계수 및 세포 크기 측정시스템 |
-
1990
- 1990-11-06 JP JP29905690A patent/JP2734489B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03272697A (ja) | 1991-12-04 |
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|---|---|---|---|
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