JP2680713B2 - 微生物生細胞の計数方法 - Google Patents
微生物生細胞の計数方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物生細胞の計測方法に関し、特に食品プ
ラント、医薬品製造プラントにおける原料や製品の品質
管理や殺菌性能評価等に適用される生細胞の計数方法に
関する。
ラント、医薬品製造プラントにおける原料や製品の品質
管理や殺菌性能評価等に適用される生細胞の計数方法に
関する。
食品製造、医薬品製造プラントでは原料や製品の品質
管理、殺菌性能評価のため、微生物検査・計測が行われ
ており、これに多大な労力、時間が費やされている。従
来、微生物検査法として最も広く用いられているのは寒
天培養法であり、この方法は微生物の栄養源を溶かし込
んだ寒天に試料を分散・培養し、寒天にコロニーを形成
させて、このコロニー数を計数して生細胞を測定するも
のである。しかし、この方法は培養操作を伴うため通常
１〜数日と長時間の検査時間が必要であり、品質管理、
殺菌管理に支障をきたす場合が多い。
管理、殺菌性能評価のため、微生物検査・計測が行われ
ており、これに多大な労力、時間が費やされている。従
来、微生物検査法として最も広く用いられているのは寒
天培養法であり、この方法は微生物の栄養源を溶かし込
んだ寒天に試料を分散・培養し、寒天にコロニーを形成
させて、このコロニー数を計数して生細胞を測定するも
のである。しかし、この方法は培養操作を伴うため通常
１〜数日と長時間の検査時間が必要であり、品質管理、
殺菌管理に支障をきたす場合が多い。
従来法の最も大きな問題点では培養操作を伴うため、
検査・計測に長時間必要とすることである。
検査・計測に長時間必要とすることである。
本発明は上記従来法の問題点を解決し、短時間にか
つ、高感度に生細胞を計測できる方法を提供することに
ある。
つ、高感度に生細胞を計測できる方法を提供することに
ある。
そこで、特別な培養操作を必要とせず、生菌を検知す
る方法について種々検討を行った結果、フルオレセイン
誘導体の一種であるフルオレセインジアセテート（以
下、FDAと略す）を特別な条件で試料に作用させること
により生菌を短時間で高感度に検出する方法を見い出し
た。
る方法について種々検討を行った結果、フルオレセイン
誘導体の一種であるフルオレセインジアセテート（以
下、FDAと略す）を特別な条件で試料に作用させること
により生菌を短時間で高感度に検出する方法を見い出し
た。
FDAは酵素の一種であるエステラーゼは反応し、蛍光
物質であるフルオレセインを生成することは従来より知
られており、この性質を利用して動物細胞にFDAを作用
させ、細胞内に生成するフルオレセインの偏光度から細
胞質の流動性を求めて診断に利用されたり、植物細胞の
プロトプラスト細胞壁再生確認にFDAが用いられた例が
ある。しかしながら、微生物細胞生細胞の計測に適用さ
れた例は極めて少なく、FDAの使用条件、効果の有無に
ついてはほとんどわかっていない。
物質であるフルオレセインを生成することは従来より知
られており、この性質を利用して動物細胞にFDAを作用
させ、細胞内に生成するフルオレセインの偏光度から細
胞質の流動性を求めて診断に利用されたり、植物細胞の
プロトプラスト細胞壁再生確認にFDAが用いられた例が
ある。しかしながら、微生物細胞生細胞の計測に適用さ
れた例は極めて少なく、FDAの使用条件、効果の有無に
ついてはほとんどわかっていない。
本発明者等はFDAを用いた微生物生細胞の計測可能性
を検討するため、FDAの使用条件、蛍光発光特性に関す
る実験を行った結果、試料にFDAを作用させると、細胞
内に生成した蛍光物質（フルオレセイン）が細胞外に徐
々に流動して、バックグラウンドの蛍光も高くなり細胞
の蛍光とバックグラウンドの蛍光との差が小さくなって
正確な計測ができないという問題のあることを知った。
を検討するため、FDAの使用条件、蛍光発光特性に関す
る実験を行った結果、試料にFDAを作用させると、細胞
内に生成した蛍光物質（フルオレセイン）が細胞外に徐
々に流動して、バックグラウンドの蛍光も高くなり細胞
の蛍光とバックグラウンドの蛍光との差が小さくなって
正確な計測ができないという問題のあることを知った。
本発明はこの問題点を解決し、精度よく生細胞を計測
する方法を提供しようとするものである。
する方法を提供しようとするものである。
本発明の第１の発明は、 （１）測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作用さ
せ、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞か
ら発する蛍光を検出することにより、微生物生細胞数を
測定する方法において、溶媒で溶解したフルオレセイン
誘導体を試料に添加し、一定温度、一定時間保持した
後、酸を作用させてpHを低下させた後、当該試料に励起
光を照射し、細胞の発する蛍光を検出することを特徴と
する微生物生細胞の計数方法。（以下、第１発明とい
う） また、上記第１発明において、溶媒に溶解したフルオ
レセイン誘導体は一般的には更にリン酸バッファで数十
倍に希釈して試料に所定濃度で作用させているが、この
ようにするとFDAの劣化が著しく早く、調製後１〜２時
間経過した試薬では細胞の蛍光発光量が短時間で低下し
てしまう不具合がある。その解決法として本発明の第２
発明は次構成を採ることにする。
せ、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞か
ら発する蛍光を検出することにより、微生物生細胞数を
測定する方法において、溶媒で溶解したフルオレセイン
誘導体を試料に添加し、一定温度、一定時間保持した
後、酸を作用させてpHを低下させた後、当該試料に励起
光を照射し、細胞の発する蛍光を検出することを特徴と
する微生物生細胞の計数方法。（以下、第１発明とい
う） また、上記第１発明において、溶媒に溶解したフルオ
レセイン誘導体は一般的には更にリン酸バッファで数十
倍に希釈して試料に所定濃度で作用させているが、この
ようにするとFDAの劣化が著しく早く、調製後１〜２時
間経過した試薬では細胞の蛍光発光量が短時間で低下し
てしまう不具合がある。その解決法として本発明の第２
発明は次構成を採ることにする。
（２）測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作用さ
せ、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞か
ら発する蛍光を検出することにより、微生物生細胞数を
測定する方法において、溶媒で溶解し、リン酸バッファ
で希釈しないフルオレセイン誘導体を試料に添加し、一
定温度、一定時間保持した後、酸を作用させてpHを低下
させた後、当該試料に励起光を照射し、細胞の発する蛍
光を検出することを特徴とする微生物生細胞の計数方
法。（以下、第２発明という） 本発明において使用されるフルオレセイン誘導体とし
ては、FDAのほかフルオレセイン−ナトリウム（ウラニ
ン）や、フルオレセイン−（β−Ｄ−ガラクトフィラノ
シド）のが使用できる。
せ、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細胞か
ら発する蛍光を検出することにより、微生物生細胞数を
測定する方法において、溶媒で溶解し、リン酸バッファ
で希釈しないフルオレセイン誘導体を試料に添加し、一
定温度、一定時間保持した後、酸を作用させてpHを低下
させた後、当該試料に励起光を照射し、細胞の発する蛍
光を検出することを特徴とする微生物生細胞の計数方
法。（以下、第２発明という） 本発明において使用されるフルオレセイン誘導体とし
ては、FDAのほかフルオレセイン−ナトリウム（ウラニ
ン）や、フルオレセイン−（β−Ｄ−ガラクトフィラノ
シド）のが使用できる。
〔第１発明の作用〕 微生物生細胞でも動・植物細胞と同様、生細胞には酵
素エステラーゼが存在すると考えられ、死細胞では酵素
が失活しているので酵素は存在しない。従って、微生物
試料にFDAを作用させると生細胞だけがFDAと反応し細胞
中にフルオレセインを生成する。この時、反応を促進さ
せるためには温度、時間といった条件が必須となる。温
度に関しては35〜37℃が最適であり10℃以下、又は45℃
以上では反応は起こらない。
素エステラーゼが存在すると考えられ、死細胞では酵素
が失活しているので酵素は存在しない。従って、微生物
試料にFDAを作用させると生細胞だけがFDAと反応し細胞
中にフルオレセインを生成する。この時、反応を促進さ
せるためには温度、時間といった条件が必須となる。温
度に関しては35〜37℃が最適であり10℃以下、又は45℃
以上では反応は起こらない。
また、迅速計測の目的からは反応時間は短かいほど望
ましいが細胞内に計測可能となるだけの蛍光物質を生成
させる必要があり、このための反応時間は酵母の場合、
５〜10分、大腸菌、枯草菌などのバクテリアやカビ等の
胞子では10〜20分必要とする。
ましいが細胞内に計測可能となるだけの蛍光物質を生成
させる必要があり、このための反応時間は酵母の場合、
５〜10分、大腸菌、枯草菌などのバクテリアやカビ等の
胞子では10〜20分必要とする。
そこで、一定の温度、一定時間、FDAと試料を作用さ
せると細胞内に蛍光物質が生成するが、時間と共に細胞
内に生成した蛍光物質が細胞外にも流出を始め、生細胞
の蛍光発光量とバックグラウンドとの蛍光発光量との差
が小さくなり計測を難しくする欠点のあることがわかっ
た。そこで、この対策について種々検討した結果、試料
に酸を添加し、pHを４以下に調整することにより、バッ
クグラウンドの蛍光発光を消滅させるのである。なお細
胞には細胞壁、細胞膜といった防御機能があるため、酸
は細胞内に侵入するのに時間がかかり、細胞の蛍光発光
は消滅しないことがわかった。
せると細胞内に蛍光物質が生成するが、時間と共に細胞
内に生成した蛍光物質が細胞外にも流出を始め、生細胞
の蛍光発光量とバックグラウンドとの蛍光発光量との差
が小さくなり計測を難しくする欠点のあることがわかっ
た。そこで、この対策について種々検討した結果、試料
に酸を添加し、pHを４以下に調整することにより、バッ
クグラウンドの蛍光発光を消滅させるのである。なお細
胞には細胞壁、細胞膜といった防御機能があるため、酸
は細胞内に侵入するのに時間がかかり、細胞の蛍光発光
は消滅しないことがわかった。
この第１発明の方法により、生細胞とバックグラウン
ドとの蛍光発光量の差は大きくなり、感度よく、生細胞
を計測できるようになる。
ドとの蛍光発光量の差は大きくなり、感度よく、生細胞
を計測できるようになる。
生細胞中に生成する蛍光物質を励起させるためには、
特定波長域を含む光を照射する必要があるが、この励起
スペクトルは第２図に示すように490nm付近にピークを
有する比較的プロードな曲線である。また、490nmの波
長で励起させると、細胞内の蛍光物質は第３図に示すよ
うに510〜515nm付近にピークを有する蛍光スペクトルを
出す。
特定波長域を含む光を照射する必要があるが、この励起
スペクトルは第２図に示すように490nm付近にピークを
有する比較的プロードな曲線である。また、490nmの波
長で励起させると、細胞内の蛍光物質は第３図に示すよ
うに510〜515nm付近にピークを有する蛍光スペクトルを
出す。
従って、このような細胞内に生成した蛍光物質を励起
するに必要な波長を有する光を照射することにより、個
々の細胞は蛍光を発し、これを光の点として計測するこ
とにより、生細胞を精度良く、計測できるわけである。
するに必要な波長を有する光を照射することにより、個
々の細胞は蛍光を発し、これを光の点として計測するこ
とにより、生細胞を精度良く、計測できるわけである。
〔第２発明の作用〕 アセトンに溶解したFDAを一旦、リン酸バッファ液で
希釈してしまうと、FDAが変質、分解されやすくなり、
効果が急速に低下してしまうことが実験により判明し
た。そこで、従来、植物細胞等で行われていた方法とは
異なり、アセトンに溶解したFDAをリン酸バッファ液で
希釈することなく、直接、微生物試料に作用させた結
果、FDAの効果はアセトンに溶解後、10時間以上経過し
ても安定して維持できることがわかり、微生物生細胞に
対して大きな効果が得られた。
希釈してしまうと、FDAが変質、分解されやすくなり、
効果が急速に低下してしまうことが実験により判明し
た。そこで、従来、植物細胞等で行われていた方法とは
異なり、アセトンに溶解したFDAをリン酸バッファ液で
希釈することなく、直接、微生物試料に作用させた結
果、FDAの効果はアセトンに溶解後、10時間以上経過し
ても安定して維持できることがわかり、微生物生細胞に
対して大きな効果が得られた。
試験に用いた生細胞計測装置の構成を第１図に示す。
第１図において、１は励起光源であり出力100Wの水銀
ランプ、２は水銀光を集光するためのコレクターレン
ズ、３は励起フィルタであり生細胞中に生成した蛍光物
質を励起するに必要な波長だけを通過させるフィルタで
ある。この実験では450〜490nmの波長領域を通過する励
起フィルタを用いた。
ランプ、２は水銀光を集光するためのコレクターレン
ズ、３は励起フィルタであり生細胞中に生成した蛍光物
質を励起するに必要な波長だけを通過させるフィルタで
ある。この実験では450〜490nmの波長領域を通過する励
起フィルタを用いた。
４はミラー、５は対物レンズで倍率が20倍のものを使
用している。FDAと反応させpHを低下させた微生物試料
をスライドグラスの上に滴下し、カバーグラスでおおっ
た後、試料台６にのせ、励起光を照射すると生細胞から
510〜515nmを主波長とする蛍光を発する。７は吸収フィ
ルタで510nm以上の波長の光を通過させ、レンズ８を介
してテレビカメラ９により発光細胞を撮像する。10は任
意に設定可能な輝度レベル内に存在する発光細胞の画像
を出力することができる画像処理装置で、画像処理され
た画像はモニタ12に写し出される。11はパーティクルカ
ウンタで任意の輝度範囲にある細胞数を計測する。13は
データ処理解析装置で、所定の輝度範囲にある細胞数、
細胞の輝度分布がアウトプットされ、生細胞数を正確に
求めることができる。
用している。FDAと反応させpHを低下させた微生物試料
をスライドグラスの上に滴下し、カバーグラスでおおっ
た後、試料台６にのせ、励起光を照射すると生細胞から
510〜515nmを主波長とする蛍光を発する。７は吸収フィ
ルタで510nm以上の波長の光を通過させ、レンズ８を介
してテレビカメラ９により発光細胞を撮像する。10は任
意に設定可能な輝度レベル内に存在する発光細胞の画像
を出力することができる画像処理装置で、画像処理され
た画像はモニタ12に写し出される。11はパーティクルカ
ウンタで任意の輝度範囲にある細胞数を計測する。13は
データ処理解析装置で、所定の輝度範囲にある細胞数、
細胞の輝度分布がアウトプットされ、生細胞数を正確に
求めることができる。
次に、上記装置を用いた試験実施例を示す。
（１）試験に用いた細胞 ポテトデキストロース寒天培地で約１週間培養した黒
カビ（Aspergillus nigar）から胞子を回収し、生理食
塩水（pH7.0）に、約107個/mlの濃度に懸濁させたもの
を試料とした。
カビ（Aspergillus nigar）から胞子を回収し、生理食
塩水（pH7.0）に、約107個/mlの濃度に懸濁させたもの
を試料とした。
（２）FDA溶液 アセトンにFDAを溶解し1mg/mlの濃度とした。
（３）作用温度,pH 温度、pHは各々37℃、7.0に設定し、細胞懸濁液1mlを
試験管にとりFDA溶液を添加した後、一定時間反応を行
わせた。
試験管にとりFDA溶液を添加した後、一定時間反応を行
わせた。
（４）実験 アセトンにFDAに溶解し1mg/mlの濃度としたものを、p
H7.0のリン酸バッファで５倍に希釈し、細胞懸濁液に対
し1:1（FDA濃度として0.1mg/ml）の割合で添加したもの
と、希釈することなく細胞懸濁液に直接0.1mg/mlになる
ように添加した試料について、所定時間毎に20分間反応
を行わせ細胞の輝度計測を行った。
H7.0のリン酸バッファで５倍に希釈し、細胞懸濁液に対
し1:1（FDA濃度として0.1mg/ml）の割合で添加したもの
と、希釈することなく細胞懸濁液に直接0.1mg/mlになる
ように添加した試料について、所定時間毎に20分間反応
を行わせ細胞の輝度計測を行った。
第４図に、細胞の平均輝度と時間の関係を示す。これ
からわかるように、リン酸バッファで希釈したものは時
間が経過すると細胞輝度が急速に低下するのに対し、FD
Aを溶解したアセトン液を直接添加した場合には長時間
にわたり安定した発光が得られることがわかる。
からわかるように、リン酸バッファで希釈したものは時
間が経過すると細胞輝度が急速に低下するのに対し、FD
Aを溶解したアセトン液を直接添加した場合には長時間
にわたり安定した発光が得られることがわかる。
このことは、第２発明によれば頻繁にFDA溶液を作り
変えることなく信頼性のあるデータが得られることを意
味し、作業効率上、極めて好都合であることがわかる。
変えることなく信頼性のあるデータが得られることを意
味し、作業効率上、極めて好都合であることがわかる。
次に、細胞懸濁液1mlに0.1mg/mlの濃度になるよう
に、FDA溶解アセトン液を直接添加し、反応時間を変化
させて細胞の輝度、バックグラウンドを計測した結果を
第５図に示す。横軸は細胞の発光量（輝度）、縦軸は所
定輝度範囲にある全細胞数Noに対する計測された発光細
胞数の割合を示す。
に、FDA溶解アセトン液を直接添加し、反応時間を変化
させて細胞の輝度、バックグラウンドを計測した結果を
第５図に示す。横軸は細胞の発光量（輝度）、縦軸は所
定輝度範囲にある全細胞数Noに対する計測された発光細
胞数の割合を示す。
この結果から、反応時間５分では細胞の発光量も全体
的に低いレベルにあり、バックグラウンド以下の細胞も
全体の約40％存在するが、反応時間10分では発光量が全
体的に高くなるもののまだ、約10％がバックグラウンド
以下の発光量で計測されない。
的に低いレベルにあり、バックグラウンド以下の細胞も
全体の約40％存在するが、反応時間10分では発光量が全
体的に高くなるもののまだ、約10％がバックグラウンド
以下の発光量で計測されない。
反応時間20分、30分と時間が長くなるに従って、細胞
内の生成された蛍光物質が細胞外に流出し、バックグラ
ウンドの値が高くなると共に、バックグラウンド以下の
細胞数も全体の25％、40％と増加する。
内の生成された蛍光物質が細胞外に流出し、バックグラ
ウンドの値が高くなると共に、バックグラウンド以下の
細胞数も全体の25％、40％と増加する。
第６図は本発明法であり、同様に各時間毎に試料を試
験管から一定量取り出した後1N塩酸によりpHを３〜４に
調整した後発光細胞の計測を行ったものである。この結
果から明らかなように、反応時間10分以上ではいづれの
条件もバックグラウンドの値が低下し、全細胞数の100
％が計測されていることがわかる。ただし、本発明法で
は酸を添加した後長時間をおくと添加した酸が細胞内に
まで侵入し、細胞内の蛍光物質の発光を阻害するので注
意を要する。本発明法は黒カビ胞子のほか、酵母、枯草
菌胞子、大腸菌に対しても適用される。
験管から一定量取り出した後1N塩酸によりpHを３〜４に
調整した後発光細胞の計測を行ったものである。この結
果から明らかなように、反応時間10分以上ではいづれの
条件もバックグラウンドの値が低下し、全細胞数の100
％が計測されていることがわかる。ただし、本発明法で
は酸を添加した後長時間をおくと添加した酸が細胞内に
まで侵入し、細胞内の蛍光物質の発光を阻害するので注
意を要する。本発明法は黒カビ胞子のほか、酵母、枯草
菌胞子、大腸菌に対しても適用される。
従来法では、微生物生細胞の計測時間が１〜数日と長
時間必要であったが、本発明方法では約10分と格段に早
く、かつ感度よく計測できることから、食品、医薬品分
野における原料、製品の迅速な品質管理、殺菌性能評価
が可能となり、生産コストの低減に対し著大な効果を奏
する。
時間必要であったが、本発明方法では約10分と格段に早
く、かつ感度よく計測できることから、食品、医薬品分
野における原料、製品の迅速な品質管理、殺菌性能評価
が可能となり、生産コストの低減に対し著大な効果を奏
する。
第１図は本発明の一実施例を行うに際して使用した装置
の概略図、第２図は生細胞の蛍光発光に必要な励起波長
スペクトルのグラフ、第３図は生細胞の発する蛍光スペ
クトルのグラフ、第４図は本発明の実施例に係るFDA溶
液作成時からの時間経過に伴う細胞輝度の変化を示すグ
ラフ、第５図は従来法に係る輝度と細胞数比の関係グラ
フ、第６図は本発明の実施例に係る輝度と細胞数比の関
係グラフである。
の概略図、第２図は生細胞の蛍光発光に必要な励起波長
スペクトルのグラフ、第３図は生細胞の発する蛍光スペ
クトルのグラフ、第４図は本発明の実施例に係るFDA溶
液作成時からの時間経過に伴う細胞輝度の変化を示すグ
ラフ、第５図は従来法に係る輝度と細胞数比の関係グラ
フ、第６図は本発明の実施例に係る輝度と細胞数比の関
係グラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作
用させ、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細
胞から発する蛍光を検出することにより微生物生細胞数
を測定する方法において、溶媒で溶解したフルオレセイ
ン誘導体を試料に添加し、一定温度、一定時間保持した
後、酸を作用させてpHを低下させた後、当該試料に励起
光を照射し、細胞の発する蛍光を検出することを特徴と
する微生物生細胞の計数方法。 - 【請求項２】測定対象試料にフルオレセイン誘導体を作
用させ、生細胞中に蓄積する蛍光物質を励起させて生細
胞から発する蛍光を検出することにより微生物生細胞数
を測定する方法において、溶媒で溶解しリン酸バッファ
で希釈してないフルオレセイン誘導体を試料に添加し、
一定温度、一定時間保持した後、酸を作用させてpHを低
下させた後、当該試料に励起光を照射し、細胞の発する
蛍光を検出することを特徴とする微生物生細胞の計数方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3837190A JP2680713B2 (ja) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | 微生物生細胞の計数方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3837190A JP2680713B2 (ja) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | 微生物生細胞の計数方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03244395A JPH03244395A (ja) | 1991-10-31 |
| JP2680713B2 true JP2680713B2 (ja) | 1997-11-19 |
Family
ID=12523425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3837190A Expired - Fee Related JP2680713B2 (ja) | 1990-02-21 | 1990-02-21 | 微生物生細胞の計数方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2680713B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105431544A (zh) * | 2013-05-29 | 2016-03-23 | 株式会社佐竹 | 微生物的检查方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4555232B2 (ja) * | 2006-01-25 | 2010-09-29 | Ｈｏｙａ株式会社 | 組織の蛍光染色方法 |
| JP2007332073A (ja) | 2006-06-15 | 2007-12-27 | Pentax Corp | 消化管内腔蛍光染色像のコントラスト増強剤 |
-
1990
- 1990-02-21 JP JP3837190A patent/JP2680713B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105431544A (zh) * | 2013-05-29 | 2016-03-23 | 株式会社佐竹 | 微生物的检查方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03244395A (ja) | 1991-10-31 |
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