KR102118533B1

KR102118533B1 - 세포 생존율 판정 장치

Info

Publication number: KR102118533B1
Application number: KR1020180047953A
Authority: KR
Inventors: 노리오 하세가와
Original assignee: 아즈빌주식회사
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2020-06-03
Also published as: JP2018183088A; US20180312797A1; CN108801991A; US10870828B2; KR20180120107A

Abstract

본 발명은, 세포의 생존율을 산출하고, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 것이 가능한 세포 생존율 판정 장치를 제공하는 것을 과제로 한다.
세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 피크 파장과, 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 여기광의 피크 파장에 기초하여, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출하는 생존율 산출부(301)와, 자가 형광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향과, 여기광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향에 기초하여, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 판정부(302)를 구비하는 세포 생존율 판정 장치가 제공된다.

Description

세포 생존율 판정 장치{APPARATUS FOR DETERMINING SURVIVAL RATE OF CELLS}

본 발명은 세포 배양 기술에 관한 것으로, 세포 생존율 판정 장치에 관한 것이다.

바이오 프로세스나 세포 배양의 분야에 있어서, 세포 배양의 조건을 제어하기 위해 및 세포 배양의 정지 시기를 판단하기 위해 등, 배양 세포의 생사를 판정하여 생존율이 측정된다. 세포의 생사를 판정하는 방법으로는, 세포 내의 핵산에 형광 색소를 결합시켜, 여기된 형광의 강도에 의해 세포의 생사를 판정하는 방법(예컨대 특허문헌 1 참조)이 제안되어 있다. 또한, 사세포의 세포막을 투과하여 사세포의 세포질을 푸르게 염색하는 트리판 블루 염색에 의해, 세포의 생사를 판정하는 방법도 알려져 있다.

그러나, 염색 시약은 고가이고, 또한, 세포를 염색하는 공정은 번잡하다. 또한, 염색 시약은 인체에 유해한 경우가 많다. 그 때문에, 염색 시약은, 관리되어 보관될 필요가 있다. 또한, 염색 시약으로 염색된 세포를 계속해서 배양하는 것은 어려우며, 폐액의 처리에도 주의할 필요가 있다. 여기서, 세포는 자가 형광을 발한다(예컨대 비특허문헌 1, 2 참조). 따라서, 염색 시약을 이용하지 않고, 세포가 발하는 자가 형광에 기초하여 세포의 생사를 판정하는 방법이 제안되어 있다(예컨대 특허문헌 2 참조).

일본 특허 제2592114호 공보 일본 특허 제4868879호 공보

Saskia M. Faassen 등, 「Fluorescence Spectroscopy and Chemometric Modeling for Bioprocess Monitoring」, Sensors, 2015, 15, 10271-10291 M J Miller 등, 「Evaluation of the BioVigilant IMD-A, A novel optical spectroscopy technology for the continuous and real-time environmental monitoring of viable and nonviable particles. PartI. Review of the Technology and comparative studies with conventional methods」, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2009, vol 63 (3), 245-258

특허문헌 2에 개시된 방법에서는, 세포의 자가 형광의 강도 변화에 의해 세포의 생사 상태를 판정하고 있다. 그러나, 본 발명자의 지견에 의하면, 세포의 자가 형광의 강도는, 세포의 생사 상태 이외의 요인으로도 변화할 수 있다. 그 때문에, 세포의 생사 상태 이외의 요인으로 세포의 자가 형광의 강도가 변화한 경우, 세포의 생사 상태에 변화가 없었음에도 불구하고, 세포의 생사 상태에 변화가 생겼다고 잘못 판정할 가능성이 있다. 따라서, 본 발명은, 세포의 생존율을 산출하고, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 것이 가능한 세포 생존율 판정 장치 및 세포 생존율 판정 방법을 제공하는 것을 목적의 하나로 한다.

본 발명의 제1 양태에 의하면, 세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 피크 파장과, 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 여기광의 피크 파장에 기초하여, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출하는 생존율 산출부와, 자가 형광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향과, 여기광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향에 기초하여, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 판정부를 구비하는 세포 생존율 판정 장치가 제공된다.

상기 제1 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 판정부가, 자가 형광의 파장 및 여기광의 파장을 좌표 성분으로 하는 좌표계에 있어서, 자가 형광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향을 나타내는 벡터와, 여기광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향을 나타내는 벡터의 합의 벡터를 산출해도 좋다.

상기 제1 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내인 경우, 판정부가, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있다고 판정해도 좋다.

상기 제1 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 밖인 경우, 판정부가, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 없다고 판정해도 좋다.

상기 제1 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 세포 집단이 부유 배양되어 있어도 좋다.

상기 제1 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 세포 집단의 각각의 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이어도 좋다.

본 발명의 제2 양태에 의하면, 세포 집단의 각각의 세포가 발하는 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도, 및 세포 집단의 각각의 세포에서 생기는 산란광의 강도 중에서 선택되는 적어도 제1 광강도 및 제2 광강도에 기초하여, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출하는 생존율 산출부와, 제1 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향과, 제2 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향에 기초하여, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 판정부를 구비하는 세포 생존율 판정 장치가 제공된다.

상기 제2 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 산란광의 강도의 3개의 광강도가 선택되어도 좋다.

상기 제2 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 판정부가, 제1 광강도 및 제2 광강도를 좌표 성분으로 하는 좌표계에 있어서, 제1 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터와, 제2 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터의 합의 벡터를 산출해도 좋다.

상기 제2 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내인 경우, 판정부가, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있다고 판정해도 좋다.

상기 제2 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 밖인 경우, 판정부가, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 없다고 판정해도 좋다.

상기 제2 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 세포 집단이 부유 배양되어 있어도 좋다.

상기 제2 양태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서, 세포 집단의 각각의 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이어도 좋다.

본 발명에 의하면, 세포의 생존율을 산출하고, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 것이 가능한 세포 생존율 판정 장치 및 세포 생존율 판정 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 제1 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치의 모식도이다.
도 2는 제1 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치의 모식도이다.
도 3은 제1 실시형태에 관한 세포의 자가 형광의 피크 파장과 여기광의 피크 파장의 관계를 나타내는 모식적인 그래프이다.
도 4는 제2 실시형태에 관한 세포의 제1 파장대역 자가 형광의 강도와, 제2 파장대역 자가 형광의 강도와, 산란광의 강도의 관계를 나타내는 모식적인 그래프이다.
도 5는 제3 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치의 모식도이다.
도 6은 제3 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치의 모식도이다.
도 7은 실시예 1에 관한 배양일수와 세포의 생존율의 관계를 나타내는 표이다.
도 8은 실시예 1에 관한 세포의 배양일수마다의 여기 형광 매트릭스이다.
도 9는 실시예 1에 관한 주성분 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 실시예 1에 관한 세포의 배양일수와, 자가 형광 및 산란광의 강도의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 11은 실시예 2에 관한 대장균 유래의 NADH의 고분자 획분의 여기 형광 매트릭스이다.
도 12는 실시예 2에 관한 대장균 유래의 NADH의 저분자 획분의 여기 형광 매트릭스이다.
도 13은 실시예 2에 관한 표피 포도상 구균 유래의 NADH의 고분자 획분의 여기 형광 매트릭스이다.
도 14는 실시예 2에 관한 표피 포도상 구균 유래의 NADH의 저분자 획분의 여기 형광 매트릭스이다.

이하에 본 발명의 실시형태를 설명한다. 이하의 도면의 기재에 있어서, 동일 또는 유사한 부분에는 동일 또는 유사한 부호로 나타내고 있다. 단, 도면은 모식적인 것이다. 따라서, 구체적인 치수 등은 이하의 설명에 비추어 판단해야 하는 것이다. 또한, 도면 상호간에 있어서도 서로의 치수의 관계나 비율이 상이한 부분이 포함되어 있는 것은 물론이다.

또, 이 개시의 일부를 이루는 기재 및 도면은 본 발명을 한정하는 것이라고 이해해서는 안된다. 이 개시로부터 당업자에게는 여러가지 대체 실시형태, 실시예 및 운용 기술이 밝혀지는 것이다. 따라서, 본 발명은 여기서는 기재하지 않은 여러가지 실시형태 등도 포함한다는 것을 이해해야 한다.

(제1 실시형태)

제1 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치는, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 피크 파장과, 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 여기광의 피크 파장에 기초하여, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출하는 생존율 산출부(301)와, 자가 형광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향과, 여기광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향에 기초하여, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 판정부(302)를 구비한다. 생존율 산출부(301) 및 판정부(302)는, 예컨대 연산 처리 장치(300)에 포함된다. 여기서, 단위시간이란, 예컨대 24시간이지만, 일정 시간이라면 특별히 한정되지 않고, 24시간보다 짧은 시간이어도 좋고, 24시간보다 긴 시간이어도 좋다.

세포는, 예컨대 부유 배양되어 있는 세포이다. 부유 배양에 있어서는, 세포를 배양기의 바닥면에 접착시키지 않고, 구형의 세포를 배양액 중에 부유시킨 상태로 증식시킨다. 세포는 접착 배양된 세포이어도 좋다. 세포는, 모든 종류의 세포를 포함한다. 세포의 일례로는, 항체 생성 세포를 들 수 있다. 항체 생성 세포의 예로는, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 들 수 있다. CHO 세포는, 주화(株化)한 CHO 세포를 포함한다. 또한, CHO 세포는, CHO-K1 세포나, 디히드로 엽산 환원 효소(DHFR) 결손 CHO-DG44 세포 등의 아종을 포함한다.

본 발명자가 발견한 지견에 의하면, 자가 형광의 피크 파장과, 여기광의 피크 파장과, 세포 집단에서의 세포의 생존율의 관계는, 미리 취득하는 것이 가능하다. 예컨대, 세포의 배양을 시작하고 나서, 매일, 세포를 포함하는 용액에서의 자가 형광의 피크 파장과 여기광의 피크 파장을 측정하고, 또한, 세포를 포함하는 용액에서의 사세포 또는 생세포의 비율을 트리판 블루 염색 등의 기지의 방법으로 측정한다. 이에 따라, 자가 형광의 피크 파장과, 여기광의 피크 파장과, 세포 집단에서의 세포의 생존율의 관계가 취득된다. 상기 관계는, 예컨대, 자가 형광의 피크 파장 및 여기광의 피크 파장을 독립 변수로 하고, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 종속 변수로 하는 함수로 주어진다.

생존율 산출부(301)는, 세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 파장의 측정치와, 자가 형광의 피크 파장에 대응하는 여기광의 피크 파장의 측정치를 취득한다. 세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 파장의 측정치와, 여기광의 피크 파장의 측정치는, 여기광의 파장을 주사하면서 자가 형광의 스펙트럼을 측정함으로써 얻어진다. 또, 여기광의 파장을 주사하면서 얻어지는 자가 형광의 스펙트럼은, 여기 형광 매트릭스(EEM)로도 불린다. 생존율 산출부(301)는, 다른 측정 장치로부터, 측정이 끝난 세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 파장의 측정치와, 자가 형광의 피크 파장에 대응하는 여기광의 피크 파장의 측정치를 취득해도 좋다. 또한, 생존율 산출부(301)는, 미리 취득된 자가 형광의 피크 파장과, 여기광의 피크 파장과, 세포 집단에서의 세포의 생존율의 관계와, 자가 형광의 피크 파장 및 여기광의 피크 파장의 측정치를 이용하여, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출한다.

판정부(302)는, 세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 파장의 측정치의 시계열 데이터를 취득한다. 또한, 판정부(302)는, 자가 형광의 피크 파장에 대응하는 여기광의 피크 파장의 측정치의 시계열 데이터를 취득한다. 세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 파장의 측정치의 시계열 데이터와, 자가 형광의 피크 파장에 대응하는 여기광의 피크 파장의 측정치의 시계열 데이터는, 여기광의 파장을 주사하면서 자가 형광의 스펙트럼을 측정하는 것을, 계시적으로 반복하여 행함으로써 얻어진다.

판정부(302)는, 자가 형광의 파장 및 여기광의 파장을 좌표 성분으로 하는 좌표계에 있어서, 자가 형광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향을 나타내는 벡터와, 여기광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향을 나타내는 벡터의 합의 벡터를 산출한다.

여기서, 본 발명자가 발견한 지견에 의하면, 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포 집단의 배양 초기에 있어서, 생세포가 사세포보다 우위에 많고, 세포의 생존율이 높은 경우는, 미리 정해진 단위시간에서의 자가 형광의 피크 파장의 시프트량과, 여기광의 피크 파장의 시프트량은, 모두 작은 경향이 있다. 또한, 미리 정해진 단위시간에서의 자가 형광의 피크 파장의 시프트 방향과, 여기광의 피크 파장의 시프트 방향은, 모두 랜덤이 되는 경향이 있다.

그러나, 세포의 배양일수가 경과하고, 세포 집단에서의 사세포의 비율이 증가하면, 미리 정해진 단위시간에서의 자가 형광의 피크 파장의 시프트량과, 여기광의 피크 파장의 시프트량은, 모두 커지는 경향이 있다. 또한, 미리 정해진 단위시간에서의 자가 형광의 피크 파장의 시프트 방향과, 여기광의 피크 파장의 시프트 방향은, 모두 일정해지는 경향이 있다. 구체적으로는, 자가 형광의 피크 파장과 여기광의 피크 파장은, 장파장측으로 시프트하는 경향이 있다.

그 때문에, 세포 집단에서의 사세포의 비율이 증가하면, 단위시간에서의 자가 형광의 피크 파장의 시프트량 및 시프트 방향으로 표시되는 벡터와, 단위시간에서의 여기광의 피크 파장의 시프트량 및 시프트 방향으로 표시되는 벡터의 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치보다 커지고, 또한, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내에 들어가는 경향이 있다.

합의 벡터의 크기의 미리 정해진 임계치는, 예컨대, 세포 집단에 있어서 사세포의 비율이 증가했을 때의 합의 벡터의 크기를 미리 측정함으로써 설정된다. 또한, 합의 벡터의 방향의 미리 정해진 범위는, 세포 집단에 있어서 사세포의 비율이 증가했을 때의 합의 벡터의 방향을 미리 측정함으로써 설정된다. 이들 임계치는, 예컨대, 주성분 분석, 부분적 최소 제곱법(PLS) 및 판별 분석에 의해 설정되어도 좋다.

단위시간에서의 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치보다 커졌음에도 불구하고, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내에 들어가지 않은 경우는, 세포 집단에서의 사세포 비율의 증가 이외의 요인으로, 자가 형광의 피크 파장 및 여기광의 피크 파장의 적어도 한쪽이 시프트했다고 생각된다. 사세포 비율의 증가 이외의 요인으로는, 다른 형광 입자의 혼입이나, 백그라운드광의 강도의 변화 등을 들 수 있다.

따라서, 도 1에 나타내는 판정부(302)는, 단위시간에서의 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 단위시간에서의 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내인 경우, 생존율 산출부(301)에서 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있다고 판정한다. 또한, 판정부(302)는, 단위시간에서의 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 단위시간에서의 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 밖인 경우, 생존율 산출부(301)에서 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 없다고 판정한다.

판정부(302)는, 이상 검출 알고리즘을 이용하여 판정을 해도 좋다. 예컨대, 이상 검출 알고리즘의 예로는, 1 클래스 서포트 벡터 머신, 이상치 검출(LOF : Local Outlier Factor), 마하라노비스 거리 및 뉴럴 네트워크에 기초하고 있어도 좋다.

연산 처리 장치(300)에는, 예컨대 데이터 기억 장치(401)가 접속되어 있다. 데이터 기억 장치(401)는, 상기와 같이 미리 취득된 자가 형광의 피크 파장과, 여기광의 피크 파장과, 세포 집단에서의 세포의 생존율의 관계를 보존한다. 또한, 데이터 기억 장치(401)는, 합의 벡터의 크기의 미리 정해진 임계치를 보존한다. 또한, 데이터 기억 장치(401)는, 합의 벡터의 방향의 미리 정해진 범위를 보존한다.

연산 처리 장치(300)에는, 예컨대 일시 기억 장치(402), 신호 출력 장치(403), 신호 입력 장치(404), 신호 송수신 장치(405) 및 표시 장치(406) 등이 접속되어 있어도 좋다. 일시 기억 장치(402)는, 연산 처리 장치(300)의 연산 과정에서의 정보를 일시적으로 기억한다. 신호 출력 장치(403)는, 연산 처리 장치(300)가 연산한 신호를 출력한다. 신호 입력 장치(404)는, 연산 처리 장치(300)가 연산하는 신호를 입력한다. 신호 송수신 장치(405)는, 외부의 장치와 신호의 송수신을 한다. 표시 장치(406)는, 연산 처리 장치(300)의 처리 과정에서의 정보 및 처리 결과의 정보를 표시한다.

이상 설명한 제1 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 의하면, 개개의 세포의 생사를 판정하지 않더라도, 세포 집단에서의 자가 형광의 피크 파장과, 여기광의 피크 파장을 측정함으로써, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 계측하는 것이 가능하다. 또한, 제1 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 의하면, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 것이 가능하다.

예컨대, 항체 의약품 생산 등 바이오 프로세스에 있어서는, 항체 생성 세포의 생존율에 기초하여, 항체 생성 세포의 배양을 언제 정지할지를 결정하는 것이, 세포의 항체 생산 효율을 최대화하기 위해서 중요하다. 제1 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치를 이용하면, 신뢰할 수 있다고 판정된 세포의 생존율에 기초하여, 항체 생성 세포의 배양의 정지 시기를 결정하는 것이 가능하다.

(제2 실시형태)

제2 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 있어서는, 도 1에 나타내는 생존율 산출부(301)는, 세포 집단의 각각의 세포가 발하는 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제1 파장대역과는 상이한 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 세포 집단의 각각의 세포에서 생기는 산란광의 강도에서 선택되는 적어도 제1 및 제2 광강도에 기초하여, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출한다. 판정부(302)는, 제1 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향과, 제2 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향에 기초하여, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정한다.

본 발명자가 발견한 지견에 의하면, 적어도 제1 및 제2 광강도와, 세포 집단에서의 세포의 생존율의 관계는, 미리 취득하는 것이 가능하다. 예컨대, 세포의 배양을 시작하고 나서, 매일, 세포를 포함하는 용액에서의 적어도 제1 및 제2 광강도를 측정하고, 또한, 세포를 포함하는 용액에서의 사세포 또는 생세포의 비율을 트리판 블루 염색 등의 기지의 방법으로 측정한다. 이에 따라, 적어도 제1 및 제2 광강도와, 세포 집단에서의 세포의 생존율의 관계가 취득된다. 상기 관계는, 예컨대 적어도 제1 및 제2 광강도를 독립 변수로 하고, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 종속 변수로 하는 함수로 주어진다.

이하에서는, 세포 집단의 각각의 세포가 발하는 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 세포 집단의 각각의 세포에서 생기는 산란광의 강도가 모두 선택된 예를 설명한다.

생존율 산출부(301)는, 세포 집단의 각각의 세포가 발하는 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 측정치와, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 측정치와, 세포 집단의 각각의 세포에서 생기는 산란광의 강도의 측정치를 취득한다. 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 산란광의 강도는, 세포 집단의 개개의 세포에 여기광을 조사함으로써 측정된다. 여기광의 파장은, 예컨대 340 nm 이상 410 nm 이하이지만, 이것에 한정되지 않는다.

또한, 생존율 산출부(301)는, 미리 취득된 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 산란광의 강도의 관계와, 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 측정치와, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 측정치와, 산란광의 강도의 측정치를 이용하여, 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출한다.

판정부(302)는, 세포 집단의 각각의 세포가 발하는 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 측정치의 시계열 데이터와, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 측정치의 시계열 데이터와, 세포 집단의 각각의 세포에서 생기는 산란광의 강도의 측정치의 시계열 데이터를 취득한다. 이들 시계열 데이터는, 세포 집단의 개개의 세포에, 여기광을 조사하여 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 산란광의 강도를 측정하는 것을, 계시적으로 반복하여 행함으로써 얻어진다.

판정부(302)는, 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 산란광의 강도를 좌표 성분으로 하는 좌표계에 있어서, 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터와, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터와, 산란광의 강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터의 합의 벡터를 산출한다.

여기서, 본 발명자가 발견한 지견에 의하면, 도 4에 나타낸 바와 같이, 세포 집단의 배양 초기에 있어서, 생세포가 사세포보다 우위에 많고, 세포의 생존율이 높은 경우는, 미리 정해진 단위시간에서의 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화량, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화량 및 산란광의 강도의 변화량은, 모두 작은 경향이 있다. 또한, 미리 정해진 단위시간에서의 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화 방향, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화 방향 및 산란광의 강도의 변화 방향은, 모두 랜덤이 되는 경향이 있다.

그러나, 세포의 배양일수가 경과하고, 세포 집단에서의 사세포의 비율이 증가하면, 미리 정해진 단위시간에서의 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화량, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화량 및 산란광의 강도의 변화량은, 모두 커지는 경향이 있다. 또한, 미리 정해진 단위시간에서의 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화 방향, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화 방향 및 산란광의 강도의 변화 방향은, 모두 일정해지는 경향이 있다.

그 때문에, 세포 집단에서의 사세포의 비율이 증가하면, 단위시간에서의 제1 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터와, 단위시간에서의 제2 파장대역의 자가 형광의 강도의 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터와, 단위시간에서의 산란광의 강도의 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터의 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치보다 커지고, 또한, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내에 들어가는 경향이 있다.

합의 벡터의 크기의 미리 정해진 임계치는, 예컨대, 세포 집단에 있어서 사세포의 비율이 증가했을 때의 합의 벡터의 크기를 미리 측정함으로써 설정된다. 또한, 합의 벡터의 방향의 미리 정해진 범위는, 세포 집단에 있어서 사세포의 비율이 증가했을 때의 합의 벡터의 방향을 미리 측정함으로써 설정된다.

단위시간에서의 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치보다 커졌음에도 불구하고, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내에 들어가지 않은 경우는, 세포 집단에서의 사세포 비율의 증가 이외의 요인으로, 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도 및 산란광의 강도의 적어도 하나가 변화되었다고 생각된다. 사세포 비율의 증가 이외의 요인으로는, 세포에서의 대사에 의한 자가 형광의 강도 변화, 다른 형광 입자의 혼입이나, 백그라운드광의 강도의 변화 등을 들 수 있다.

연산 처리 장치(300)에는, 예컨대 데이터 기억 장치(401)가 접속되어 있다. 데이터 기억 장치(401)는, 상기와 같이 미리 취득된 적어도 제1 및 제2 광강도와, 세포 집단에서의 세포의 생존율의 관계를 보존한다. 또한, 데이터 기억 장치(401)는, 합의 벡터의 크기의 미리 정해진 임계치를 보존한다. 또한, 데이터 기억 장치(401)는, 합의 벡터의 방향의 미리 정해진 범위를 보존한다.

제2 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치의 그 밖의 구성 요소는, 제1 실시형태와 동일하다. 제2 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치에 의해서도, 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 것이 가능하다.

(제3 실시형태)

제3 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치는, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 광학식 입자 검출 장치(500)를 더 구비한다. 광학식 입자 검출 장치(500)는, 예컨대, 세포를 포함하는 용액이 흐르는 제거 가능한 유로(501)와, 유로(501)에 접속된 제거 가능한 측정 셀(502)과, 측정 셀(502) 내에 측정광을 조사하는 조사기(503)와, 측정광이 조사된 측정 셀(502) 내에서 생긴 산란광 및 형광의 강도를 측정하는 광측정기(504)를 구비한다.

송액 장치(505)에 의해, 유로(501)에 세포를 포함하는 용액이 흐른다. 송액 장치(505)는, 송액 제어부(506)에 의해 제어되고, 용액의 유량 등을 설정한다. 유로(501)는, 광학식 입자 검출 장치(500)로부터 제거 가능하다. 제거된 유로(501)는, 세정되어도 좋고, 새로운 청정한 유로(501)와 교환되어도 좋다. 측정 셀(502)은, 측정광 및 산란광이 투과 가능한 투명 부재로 이루어진다. 측정 셀(502)의 재료로는, 석영 유리를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 측정 셀(502)은, 광학식 입자 검출 장치(500)로부터 제거 가능하다. 제거된 측정 셀(502)은, 세정되어도 좋고, 새로운 청정한 측정 셀(502)과 교환되어도 좋다.

유로(501) 및 측정 셀(502)이 청정하지 않은 경우, 전회 측정한 세포가 유로(501) 및 측정 셀(502)에 잔존하여, 그 후의 측정에 영향을 미칠 가능성이 있다. 이것에 대하여, 제3 실시형태에 관한 유로(501) 및 측정 셀(502)은, 광학식 입자 검출 장치(500)로부터 제거 가능하므로, 유로(501) 및 측정 셀(502)을 청정하게 하는 것이 용이하다.

조사기(503)는, 예컨대, 레이저 광원과, 레이저 광원의 제어 장치를 구비한다. 조사기(503)는, 측정 셀(502) 내에, 예컨대 레이저광인 측정광을 조사한다. 측정 셀(502) 내에 촛점을 맺도록 렌즈를 배치해도 좋다. 측정 셀(502) 내의 세포에 측정광이 조사되면, 세포에 있어서 미산란광이 생긴다. 또한, 세포가 자가 형광을 발한다. 광측정기(504)는, 세포에서 생긴 산란광 및 세포가 발한 자가 형광의 강도를 측정한다. 광측정기(504)에서 측정된 산란광 및 자가 형광의 강도는, 신호 송수신 장치(405) 등을 통해 생존율 산출부(301)에 보내진다.

제3 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치의 다른 구성 요소는 제2 실시형태와 동일하기 때문에, 설명은 생략한다.

[실시예 1]

L-글루타민(종농도 6 mmol/L), 항응집제(Anti-Clumping Agent)(종농도 1%)를 첨가한 배지(CD OptiCHO, 등록상표, 단백질 불함유, 동물 유래 성분 불함유, 인비트로젠 제조)를 준비했다. 상기 배지에서, 트라스투주맙을 생성하는 CHO-K1 세포를 37℃, 5% CO₂로 부유 배양했다. 부유 배양 개시후, 정기적으로 세포를 포함하는 배지를 샘플링했다.

샘플링한 배지에 포함되는 세포를 트리판 블루로 염색하고, 셀 카운터를 이용하여 총세포수와 염색 세포수를 계수했다. 염색된 세포는 사세포로 판정했다. 판정 결과로부터 세포의 생존율을 산출했다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 배양 8일째 이후에 세포의 생존율이 급격히 저하되었다.

또한, 샘플링한 배지를 원심하여, 침전된 세포를 인산 완충 생리식염수(PBS)에 현탁했다. 이 현탁액을, 형광 분광 광도계(FP-8500, 니혼분코 제조)로 분석하여, 여기 형광 매트릭스(EEM)를 얻었다. EEM은, 여기광의 파장, 자가 형광의 파장 및 자가 형광의 강도의 3차원 매트릭스이다. 또, 분석할 때에는, 산란에 의한 미광을 제거할 목적으로, 385 nm보다 긴 파장의 광을 투과시키는 필터를 형광 검출기에 사용했다.

얻어진 EEM을 도 8에 나타낸다. EEM을 분석한 바, 세포의 생존율이 높았던 배양 7일째까지는, 자가 형광의 피크 파장은 450 nm 부근이고, 자가 형광의 피크 파장에 대응하는 여기광의 피크 파장은 340 nm 부근이었다. 그러나, 세포의 생존율이 대략 절반으로 저하된 배양 8일째부터는, 자가 형광의 피크 파장은 460 nm 부근으로 시프트하고, 자가 형광의 피크 파장에 대응하는 여기광의 피크 파장은 360 nm 부근으로 시프트했다.

도 8에 나타낸 EEM을 주성분 분석한 바, 도 9에 나타낸 바와 같이, 배양 8일째 및 배양 9일째의 EEM은, 배양 0일째부터 7일째의 EEM으로부터 이격되었다.

또한, EEM의 측정과 병행하여, 샘플링한 배지를 미리 정해진 배율로 희석하고, 입자 검출 장치(IMD-W, 아즈빌 제조)를 이용하여, 배지에 포함되는 세포의 각각에 레이저광을 조사하고, 세포의 각각에서 생기는 미산란광의 강도, 및 세포가 발한 청색대역 및 녹색대역의 자가 형광의 강도를 측정했다.

입자 검출 장치에서 얻어진 산란광, 및 청색대역 및 녹색대역의 자가 형광의 강도의 3차원 그래프를 도 10에 나타낸다. 배양 0일째부터 배양 5일째까지는, 산란광, 및 청색대역 및 녹색대역의 자가 형광의 강도의 계측치를 좌표 성분으로 하는 좌표의 변동은, 미리 정해진 범위 내였다. 그러나, 생존율이 저하되기 시작한 배양 6일째부터, 계측치의 좌표는, 청색대역 및 녹색대역의 자가 형광의 강도의 각각이 커지는 방향으로 시프트하고, 산란광의 강도가 작아지는 방향으로 시프트했다. 이것은, 강도의 피크에서의 자가 형광의 파장이, 입자 검출 장치의 형광 검출기의 검출 파장대역을 향해 시프트한 것, 및 세포의 생존율의 저하에 따라, 검출되는 소입자가 증가한 것을 반영하고 있다고 생각된다.

[실시예 2]

세포 및 미생물이 갖는 환원형 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH)는, 여기광이 조사되면 자가 형광을 발한다. 단백질에 결합하고 있는 NADH와, 유리되어 있는 NADH는, 상이한 형광 스펙트럼을 나타낸다는 보고가 있다(예컨대, Z. Long 등, 「The real-time quantification of autofluorescence spectrum shape for the monitoring of mitochondrial metabolism」, J. Biophotonics, 8, No. 3,247-257 (2015) 참조.).

여기서, 대장균(E.coli, ATCC13706)을 준비하고, 300 mL 삼각 플라스크 내의 100 mL의 TSB 배지 중, 32℃에서 하룻밤, 호기 조건하에서 대장균을 배양했다. 그 후, PBS 버퍼로 대장균을 집균하여 세정했다. 다시, 대장균을 PBS 버퍼에 현탁하고 대장균을 초음파로 파쇄하여, 파쇄액을 얻었다. 파쇄액을 5000 rpm으로 10분간 원심하여 데브리를 제거했다. 원심된 파쇄액의 상청을 1300 rpm으로 30분간 원심하고, 또한 상청을 1300 rpm으로 30분간 원심하여, 얻어진 상청을 대장균의 추출액으로서 얻었다.

얻어진 추출액을 PBS 버퍼로 평형화한 겔여과 컬럼(PD-10, GE 헬스케어)으로 여과하여, 분자량이 5000 이상인 NADH의 고분자량 획분과, 분자량이 1000 이하인 NADH의 저분자량 획분을 얻었다. NADH의 고분자량 획분은, 단백질과 결합하고 있는 NADH이고, NADH의 저분자량 획분은, 유리되어 있는 NADH라고 생각된다.

도 11에 나타내는 대장균 유래의 단백질과 결합하고 있는 NADH를 형광 분광 광도계(FP-8500, 니혼분코 제조)로 분석하여, 얻어진 EEM을 분석한 바, 자가 형광의 피크 파장은 430 nm, 여기광의 피크 파장은 340 nm이었다. 이것에 대하여, 도 12에 나타내는 대장균 유래의 유리되어 있는 NADH의 EEM을 분석한 바, 자가 형광의 피크 파장은 450 nm, 여기광의 피크 파장은 355 nm이었다. 따라서, 대장균 유래의 NADH에 있어서, 유리되어 있는 NADH가 증가할수록, 자가 형광의 피크 파장 및 여기광의 피크 파장은 장파장측으로 시프트하는 것이 시사되었다.

또한, 표피 포도상 구균(Staphylococcus epidermidis, ATCC12228)을 준비하고, 300 mL 삼각 플라스크 내의 100 mL의 TSB 배지 중, 32℃에서 하룻밤, 호기 조건하에서 표피 포도상 구균을 배양했다. 그 후, PBS 버퍼로 표피 포도상 구균을 집균하여 세정했다. 다시, 표피 포도상 구균을 PBS 버퍼에 현탁하고, 표피 포도상 구균을 파쇄 키트(OmniLyse Lysis Kit, 등록상표, 쿠라레몬트 바이오 솔루션즈)로 파쇄하여, 분자량이 5000 이상인 NADH의 고분자량 획분과, 분자량이 1000 이하인 NADH의 저분자량 획분을 얻었다. 전술한 바와 같이, NADH의 고분자량 획분은, 단백질과 결합하고 있는 NADH이고, NADH의 저분자량 획분은, 유리되어 있는 NADH라고 생각된다.

도 13에 나타내는 표피 포도상 구균 유래의 단백질과 결합하고 있는 NADH를 형광 분광 광도계(FP-8500, 니혼분코 제조)로 분석하여, 얻어진 EEM을 분석한 바, 자가 형광의 피크 파장은 435 nm, 여기광의 피크 파장은 335 nm이었다. 이것에 대하여, 도 14에 나타내는 표피 포도상 구균 유래의 유리되어 있는 NADH의 EEM을 분석한 바, 자가 형광의 피크 파장은 445 nm, 여기광의 피크 파장은 365 nm이었다. 따라서, 표피 포도상 구균 유래의 NADH에 있어서도, 유리되어 있는 NADH가 증가할수록, 자가 형광의 피크 파장 및 여기광의 피크 파장은 장파장측으로 시프트하는 것이 시사되었다.

실시예 1의 도 8에 나타낸 바와 같이, 세포의 배양일수가 진행되고, 사세포의 비율이 증가하면, 자가 형광의 피크 파장 및 여기광의 피크 파장은 장파장측으로 시프트했다(도 8에서 세포는 파쇄되지 않았다). 이것은, 도 11 내지 도 14에 나타낸 결과로부터, 산소 부족에 의해, NADH가 결합하는 산화 환원 효소의 반응이 정체되고, 유리 NADH가 증가되었기 때문이라고 생각된다. 따라서, 자가 형광의 피크 파장 및 여기광의 피크 파장이 장파장측으로 시프트한 것은, NADH 의존형 산화 환원 효소 반응의 정체를 수반하는 세포사를 반영하고 있는 것이 나타났다.

종래, 바이오 프로세스에 있어서는, 산소 이동 용량 계수가 계산되는 경우가 있다. 산소 이동 용량 계수의 값이 클수록, 배양조의 산소 공급 능력이 높은 것을 나타내고 있다. 배양조의 스케일업의 경우는, 산소 이동 용량 계수가 변화하지 않도록, 스케일업 조건을 검토하고 있다. 이것에 대하여, 실시형태에 관한 세포 생존율 판정 장치를 이용하면, 산소 결핍에 의한 세포사를 검출할 수 있기 때문에, 산소 이동 용량 계수의 값을 계산하지 않고, 스케일업을 판단하는 것이 가능하다.

300 : 연산 처리 장치, 301 : 생존율 산출부, 302 : 판정부, 401 : 데이터 기억 장치, 402 : 일시 기억 장치, 403 : 신호 출력 장치, 404 : 신호 입력 장치, 405 : 신호 송수신 장치, 406 : 표시 장치, 500 : 광학식 입자 검출 장치, 501 : 유로, 502 : 측정 셀, 503 : 조사기, 504 : 광측정기, 505 : 송액 장치, 506 : 송액 제어부

Claims

세포 생존율 판정 장치에 있어서,
세포 집단이 발하는 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 피크 파장과, 상기 자가 형광의 피크 강도를 부여하는 여기광의 피크 파장에 기초하여, 상기 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출하는 생존율 산출부와,
상기 자가 형광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향과, 상기 여기광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향에 기초하여, 상기 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 판정부
를 포함하는 세포 생존율 판정 장치.
제1항에 있어서,
상기 판정부는, 상기 자가 형광의 파장 및 상기 여기광의 파장을 좌표 성분으로 하는 좌표계에 있어서, 상기 자가 형광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향을 나타내는 벡터와, 상기 여기광의 피크 파장의 단위시간당 시프트량 및 시프트 방향을 나타내는 벡터의 합의 벡터를 산출하는 것인 세포 생존율 판정 장치.
제2항에 있어서,
상기 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내인 경우, 상기 판정부는, 상기 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있다고 판정하는 것인 세포 생존율 판정 장치.
제2항에 있어서,
상기 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 밖인 경우, 상기 판정부는, 상기 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 없다고 판정하는 것인 세포 생존율 판정 장치.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 집단의 각각의 세포는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포인 것인 세포 생존율 판정 장치.
세포 생존율 판정 장치에 있어서,
세포 집단의 각각의 세포가 발하는 제1 파장대역의 자가 형광의 강도, 제2 파장대역의 자가 형광의 강도, 및 상기 세포 집단의 각각의 세포에서 생기는 산란광의 강도 중에서 선택되는 적어도 제1 광강도 및 제2 광강도에 기초하여, 상기 세포 집단에서의 세포의 생존율을 산출하는 생존율 산출부와,
상기 제1 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향과, 상기 제2 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향에 기초하여, 상기 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있는지 아닌지를 판정하는 판정부
를 포함하는 세포 생존율 판정 장치.
제6항에 있어서,
상기 판정부는, 상기 제1 광강도 및 상기 제2 광강도를 좌표 성분으로 하는 좌표계에 있어서, 상기 제1 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터와, 상기 제2 광강도의 단위시간당 변화량 및 변화 방향을 나타내는 벡터의 합의 벡터를 산출하는 것인 세포 생존율 판정 장치.
제7항에 있어서,
상기 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 내인 경우, 상기 판정부는, 상기 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 있다고 판정하는 것인 세포 생존율 판정 장치.
제7항에 있어서,
상기 합의 벡터의 크기가 미리 정해진 임계치 이상이고, 상기 합의 벡터의 방향이 미리 정해진 범위 밖인 경우, 상기 판정부는, 상기 산출된 세포의 생존율을 신뢰할 수 없다고 판정하는 것인 세포 생존율 판정 장치.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 집단의 각각의 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 것인 세포 생존율 판정 장치.