DE112011103252T5

DE112011103252T5 - Fluoreszenzmessverfahren und Fluoreszenzmessvorrichtung

Info

Publication number: DE112011103252T5
Application number: DE112011103252T
Authority: DE
Inventors: Norikazu Nishino; Mitsuhiro Fukamachi; Fumio Obayashi
Original assignee: PEPTIDE SUPPORT Ltd; Yoshida Dental Mfg Co Ltd
Current assignee: PEPTIDE SUPPORT Ltd; Yoshida Dental Mfg Co Ltd
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2013-06-27
Also published as: WO2012042870A1; JP2012073109A; US8848188B2; US20130260405A1; JP5669087B2; KR101503274B1; KR20130052641A

Abstract

Um ein Fluoreszenzmessverfahren und eine Fluoreszenzmessvorrichtung bereitzustellen, die mit einer einfacheren Struktur versehen sind und preiswerter und dazu in der Lage sind, ein Fluoreszenzmaß unter Verwendung einer sehr kleinen Probenmenge zu messen, wird die Verwendung einer Fluoreszenzmessvorrichtung offenbart, die eine Licht blockierende Messbox, in die eine Mikroröhre geladen wird; einen Behälterhalteteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Behälterhalteteil die Mikroröhre vertikal hält; einen Erregerlichtquellenteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Erregerlichtquellenteil eine Lichtquelle aufweist, die Erregungslicht horizontal auf eine Seitenwandoberfläche der geladenen Mikroröhre bestrahlt; und einen Fluoreszenzdetektionsteil, der an einem oberen Teil der Messbox und oberhalb der geladenen Mikroröhre vorgesehen ist, umfasst, wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Fluoreszenzmaß in einem bestimmten Wellenlängenbereich von einer Zielprobe misst, eine Mikroröhre, die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllt ist, in die Messbox geladen wird, die Mikroröhre, die geöffnet ist, seitlich in einer horizontalen Richtung mit Erregungslicht bestrahlt wird, das eine bestimmte Peakwellenlänge hat, und ein Fluoreszenzmaß von der Zielflüssigkeitsprobe, die erregt wird durch Licht, das unter Verwendung einer Seitenwandoberfläche der Mikroröhre als ein Erregerlichtwellenleiter über den gesamten Bereich der Zielflüssigkeit innerhalb der Röhre verteilt ist, und Licht, das von der Seitenwandoberfläche austritt, durch einen Fluoreszenzdetektionsteil für einen bestimmten Wellenlängenbereich gemessen wird.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fluoreszenzmessverfahren und eine Fluoreszenzmessvorrichtung, wobei eine Mikroröhre, die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllt ist, geladen wird und die Mikroröhre, die geöffnet ist, seitlich in einer horizontalen Richtung mit Erregungslicht einer bestimmten Peakwellenlänge bestrahlt wird, um Fluoreszenz durch einen Fluoreszenzdetektionsteil für einen bestimmten Wellenlängenbereich, der oberhalb der Mikroröhre vorgesehen ist, zu messen.
Stand der Technik
In vergangenen Jahren wurden Fluoreszenzdetektionsvorrichtungen in weiten Bereichen, wie zum Beispiel medizinischen Diagnosen, die auf einer quantitativen Veränderung von beispielsweise einem Enzym basieren, wobei eine Krankheit beispielsweise durch ein proteolytisches Enzym erregt wird, Umwelterhebungen, die eine Enzymaktivität als Marker beispielsweise für Mikroorganismen verwenden, die in der Umwelt existieren, und für Beobachtungsoperationen in Detektionssystemen verwendet, in denen eine Fluoreszenzintensität durch eine chemische Reaktion nach und nach erhöht wird.
Als ein Beispiel einer solchen Fluoreszenzdetektionsvorrichtung wurde eine Fluoreszenzdetektionsvorrichtung vorgeschlagen, die enthält: Ein Probengefäß, das eine Probe enthält; einen Gefäßhalteteil, der das Probengefäß hält, wobei der Gefäßhalteteil dazu in der Lage ist, eine Temperatur der Probe in dem Probengefäß zu verändern; einen Fluoreszenzdetektor zum Messen einer Fluoreszenz von der Probe; und eine Lichtquelle, die ein Erregungslicht zum Anregen einer Probe für eine Fluoreszenzemission emittiert, wobei die Lichtquelle und der Gefäßhalteteil und der Gefäßhalteteil und der Fluoreszenzdetektor optisch über entsprechende optische Fasern verbunden sind und die optischen Fasern in dem Gefäßhalteteil installiert sind, um die Probe in dem Gefäß für eine Fluoreszenzemission von unterhalb des Probengefäßes, das durch den Gefäßhalteteil gehalten wird, anzuregen und Fluoreszenz, die durch die Probe emittiert wird, von unterhalb des Probengefäßes aufzunehmen (siehe beispielsweise Patentdokument 1). Wo Erregungsbestrahlung von einem Bodenabschnitt einer Mikroröhre, wie einer Eppendorf-Röhre durchgeführt wird, kann jedoch die Überwachung der Dicke und Form des Bodenabschnitts nicht als ausreichend angesehen werden, weil der Röhrenherstellungsprozess zu weiten optischen Variationen führt.
Für weitere Beispiele wurde eine Fluoreszenzmessvorrichtung vorgeschlagen, in der eine flüssige Probe, die an einer Anregungslichtkonvektionsposition für eine Objektivlinse eines Epi-Illuminationsoptiksystems angeordnet ist, das einen fluoreszierenden Würfel verwendet, in einer Öffnung einer Probenhalteplatte gehalten wird, wobei sich die Öffnung durch die Probenhalteplatte parallel zu einer optischen Achse erstreckt (siehe zum Beispiel Patentdokument 2); eine Fluoreszenzmessvorrichtung mit einer Lichtquelle, die ein Erregungslicht emittiert, einen Sensorteil, der das Erregungslicht, das von einem Ende von ihm eintritt, innen leitet und evaneszentes Licht aus einem anderen Ende von ihm emittiert und eine fluoreszierende Substanz durch das Erregungslicht anregt, wobei die fluoreszierende Substanz die Existenz einer Messungs-Zielsubstanz in einer Probenflüssigkeit anzeigt, in die das andere Ende eingetaucht ist, und einen Fotodetektor, der Fluoreszenz detektiert, die von der fluoreszierenden Substanz durch die Anregung emittiert wird, wobei der Sensorteil einen im Wesentlichen säulenförmigen Sensorteilkörper und einen zylindrischen Abdeckabschnitt, der den Sensorteilkörper über einen Raum zwischen einer äußeren Umfangsoberfläche des Sensorteilkörpers zumindest benachbart zu dem anderen Ende und den zylindrischen Abdeckteil umgibt, aufweist, und wobei der Abdeckteil einen Verschlussabschnitt aufweist, der den Raum an einem Endabschnitt des Abdeckabschnitts an der anderen Endseite verschließt (siehe zum Beispiel Patentdokument 3); eine Enzymaktivitätsmessvorrichtung, die zumindest eine Laserlichtquelle für nahinfrarotes Femtosekunden-Laserlicht zum Induzieren eines Multiphoton-Anregungsprozesses eines Substrats oder eines Produkts eines Substratmetabolismus aufweist, einen Strahlungswellendetektionsteil, der eine Strahlungswelle detektiert, die von dem Prozess der Multiphoton-Anregung des Substrats oder des Produkts des Substratmetabolismus detektiert; und einen optischen Pfad, der das nahinfrarote Femtosekunden-Laserlicht an eine Stelle führt, wo ein Enzym existiert, und die Strahlungswelle zu dem Strahlungswellendetektionsteil führt (siehe zum Beispiel Patentdokument 4); eine Fluoreszenzmessvorrichtung mit einer Lichtquelle zum Erregen einer fluoreszierenden Substanz in einer Probe, einer Sammellinse, die Fluoreszenz sammelt, die von der fluoreszierenden Substanz emittiert wird, einem Raumfilter, der die Fluoreszenz, die durch die Sammellinse gesammelt wurde, transmittiert, einem Fotodetektor, der die Fluoreszenz detektiert, die durch den Raumfilter gelangt ist, einem Signalanalyseteil, der ein Ausgangssignal von dem Fotodetektor analysiert, und einem Einstellteil, der eine Anordnungsposition der Sammellinse und/oder des Raumfilters auf der Grundlage eines Analyseergebnisses einstellt, das durch den Signalanalyseteil erhalten wird (siehe zum Beispiel Patentdokument 5); und eine Fluoreszenzdetektionsvorrichtung mit einer Weißlichtquelle, einem erregungsseitigen Lichtdispersionsmittel zum Dispergieren von Licht, das von der Weißlichtquelle emittiert wurde, einem optischen Anregungssystem mit einem optischen Bildformsystem ohne eine optische Linse, aber bestehend aus einer Kombination von Spiegeln, wobei das optische Erregungssystem mit dem durch das erregungsseitige Lichtdispersionsmittel dispergierten Licht als Erregungslicht eine Probe bestrahlt, einem optischen Fluoreszenzsystem mit einem optischen Bildformsystem, ohne eine optische Linse, aber bestehend aus einer Kombination von Spiegeln, wobei das optische Fluoreszenzsystem Fluoreszenz sammelt, die von der Probe emittiert wird, die durch das Erregungslicht angeregt wird, einem fluoreszenzseitigen Dispersionsmittel zum Dispergieren der Fluoreszenz, die durch das optische Fluoreszenzsystem gesammelt wurde, und einem Detektor, der die Fluoreszenz detektiert, die durch das fluoreszenzseitige Dispersionsmittel dispergiert wurde (siehe zum Beispiel Patentdokument 6).
währenddessen sind als Beispiele für Periodontalerkrankung erregende Bakterien Porphyromonas Gingivalis, Treponema Denticola und Tannerella Forsythia bekannt und diese Bakterien bilden ein Bakteriennest innerhalb der Plaque (Biofilm), verursachen eine Entzündung an einer Grenzfläche zwischen einer Zahnwurzel und einem Zahnfleisch, wodurch sie Blutkomponenten zur Reproduktion aufnehmen. Es ist bekannt, dass zusammen mit der Entzündung, Neutrophile eindringen und als eine Folge die Aktivität von beispielsweise Leukocyte Elastase ansteigt. Auf der Grundlage dieses Wissens wurden Testsätze zum Analysieren einer Probe aus einer Mundhöhle eines Patienten zum Detektieren der Periodontalerkrankung des Patienten vorgeschlagen (siehe beispielsweise Patentdokument 7). Der Testsatz enthält einen ersten Detektionstest zum Detektieren einer ersten Substanz, die Arg-gingipain, abgeleitet vom Bakterium P. Gingivalis, ist, und einen zweiten Detektionstest zum Detektieren einer zweiten Substanz, die Human Neutrophil Elastase, abgeleitet von einem Immunsystem oder einem Entzündungssystem eines Patienten, ist.
Auch ein blattähnliches medizinisches Produkt für die in vitro-Diagnose wurde kommerziell bereitgestellt, die β-Naphthylamin detektiert, das als eine Folge eines BANA (N-benzoyl-DL-arginylβ-naphthylamido)-Substrat in einem Film freigesetzt wurde, wobei eine hierauf aufgebrachte Probe unter Verwendung einer BANA degradierenden Aktivität von jedem der drei Bakterientypen P. Gingivalis, T. Denticola und T. Forsythia in subgingivaler Plaque verringert wurde, um zu prüfen, ob diese Bakterien existieren oder nicht.
Stand der Technik Dokumente
Patentdokumente

Patent Dokument 1: Japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 6-34546
Patent Dokument 2: Japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 2010-190713
Patent Dokument 3: Japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 2008-185440
Patent Dokument 4: Japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 2008-289437
Patent Dokument 5: Japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 2004-354347
Patent Dokument 6: Japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichung Nr. 2004-325431
Patent Dokument 7: Japanische ungeprüfte Patentanmeldung Veröffentlichung (Übersetzung einer PCT Anmeldung) Nr. 2007-519923

Darstellung der Erfindung
Durch die Erfindung zu lösende Aufgabe
Die herkömmlichen Fluoreszenzmessvorrichtungen, die in den zuvor beschriebenen Patentdokumenten offenbart werden, bestehen jeweils aus komplizierten Konfigurationen und sind sehr teuer und wurden daher in der Wissenschaft verwendet, werden aber nicht für klinische Anwendungen in Betracht gezogen. Beispielsweise für Anwendungen als Werkzeuge für die Kommunikation zwischen einem Patienten und einem Zahnarzt inklusive einer Periodontalerkrankungsdiagnose, sind preiswerte und einfache Fluoreszenzmessvorrichtungen unverzichtbar. Darüber hinaus können im Fall von Messsystemen, die optische Fasern verwenden, Probleme, die in den Fasern liegen, wie zum Beispiel Endflächenverlust, Spleißverlust und das Materialproblem, beispielsweise für den ultravioletten Bereich, nicht ignoriert werden. Insbesondere im Fall des Leitens von dem Bodenabschnitt durch eine Faser können viele Probleme auftreten, beispielsweise bei der Berücksichtigung von einer Bestrahlung einer Endflächenverbindungsstruktur, von Schmutz auf dem Messpunktbodenabschnitt und von einer numerischen Apertur (NA) der optischen Faser sowie von einer Materialverschlechterung wegen kurzer Wellenlänge.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Fluoreszenzmessverfahren und eine Fluoreszenzmessvorrichtung bereitzustellen, die durch eine einfachere Struktur bereitgestellt werden und preiswerter und dazu in der Lage sind, ein Fluoreszenzmaß unter Verwendung einer sehr kleinen Probenmenge zu messen.
Mittel zur Lösung der Aufgabe
Die vorliegenden Erfinder haben ein Fluoreszenzmessverfahren, das durch eine günstigere Struktur einer leichteren Konfiguration bereitgestellt wird, gesucht und sich auf die Dicke, die Form und das Material einer Röhre konzentriert, die nicht mit der Bodenabschnittsstruktur verbunden ist, wodurch eine Idee entstand, mit einem Erregungslicht zu bestrahlen, das mit den Charakteristika der Dicke, der Form und des Materials in einer Querrichtung der Röhre im Sinne der Erregungslicht-Bestrahlungsoberfläche übereinstimmt; haben bestätigt, dass es möglich ist, dass eine Mikroröhre, die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllt ist, in eine Licht blockierende Messbox geladen wird, die Mikroröhre, die geöffnet ist, seitlich in einer horizontalen Richtung mit Erregungslicht bestrahlt wird, das eine bestimmte Peakwellenlänge aufweist, und ein Fluoreszenzmaß von der Zielflüssigkeitsprobe, die durch das Licht angeregt wird, das sich unter Verwendung einer Seitenwandoberfläche der Mikroröhre als ein Erregungslichtwellenleiter auf eine gesamte Zielflüssigkeit innerhalb der Röhre verteilt, und Licht, das aus der Seitenwandoberfläche heraustritt, durch einen Fluoreszenzdetektionsteil für einen bestimmten Wellenlängenbereich gemessen wird, der an einem oberen Teil der Messbox und oberhalb der gefüllten Mikroröhre vorgesehen ist; und haben folglich herausgefunden, dass eine Rolle als optischer Wellenleiter, was allgemein und herkömmlich eine Idee war, die eine vorliegende optische Faser einschloss, durch eine Seitenwand einer Mikroröhre erfüllt werden kann, und haben auch bestätigt, dass ein Fluoreszenzmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Notwendigkeit für Komponenten wie Mittel zum Dispergieren von Erregungslicht, eine Sammellinse, ein dichroischer Spiegel und eine optische Faser überwindet. Darüber hinaus haben die aktuellen Erfinder zur Optimierung, die einen minimalen Hintergrund und eine maximale Lichtaufnahmeeffizienz erreicht, 1) eine Einstellung eines Abstands zwischen der Mikroröhrenseitenwand und einer Oberseite des Erregungslichts, 2) eine vertikale Position einer Mitte eines Erregungslichts relativ zu einer Probenflüssigkeitsoberfläche der Mikroröhre und 3) eine Einstellung des Bestrahlungsenergieniveaus studiert und haben die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Mit anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung: (1) ein Fluoreszenzmessverfahren, das ein Laden einer Mikroröhre, die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllt ist, in eine Licht blockierende Messbox, seitliches Bestrahlen der geöffneten Mikroröhre in einer horizontalen Richtung mit Erregungslicht mit einer bestimmten Peakwellenlänge, und Messen eines Fluoreszenzmaßes von der Zielflüssigkeitsprobe, die durch Licht angeregt wird, das über einen gesamten Bereich der Zielflüssigkeit innerhalb der Probe unter Verwendung einer Seitenwandoberfläche der Mikroröhre als ein Erregungslicht-Wellenleiter verteilt ist, und Licht, das aus der Seitenwandoberfläche herausgelangt, durch einen Fluoreszenzdetektionsteil für einen bestimmten Wellenlängenbereich, der an einem oberen Teil der Messbox und oberhalb der geladenen Mikroröhre vorgesehen ist, (2) das Fluoreszenzmessverfahren gemäß vorigem (1), wobei eine Umgebungstemperatur der Zielflüssigkeitsprobe gesteuert wird; (3) das Fluoreszenzmessverfahren nach vorigem (1) oder (2), wobei Erregungslicht mit einem Wellenlängenband von 355 nm bis 375 nm für die Bestrahlung verwendet wird; (4) das Fluoreszenzmessverfahren nach einem der vorigen (1) bis (3), wobei eine LED als eine Lichtquelle für das Erregungslicht verwendet wird; (5) das Fluoreszenzmessverfahren nach einem der vorigen (1) bis (4), wobei die Mikroröhre eine Kunststoffmikroröhre ist, die das Erregungslicht nicht blockiert; (6) das Fluoreszenzmessverfahren nach einem der vorigen (1) bis (5), wobei das Fluoreszenzmaß von der Zielprobe ein Fluoreszenzmaß mit einem Wellenlängenband von 430 nm bis 455 nm ist, und (7) das Fluoreszenzmessverfahren nach einem der vorigen (1) bis (6), wobei das Fluoreszenzmaß von der Zielprobe von 7-amino-4-methyl-kumarin (hiernach auch als „AMC” bezeichnet) oder einer fluoreszierenden Verbindung ähnlich zu 7-amino-4-methyl-kumarin, die in der Probe enthalten sind, abgeleitet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch: (8) Eine Fluoreszenzmessvorrichtung mit einer Licht blockierenden Messbox, in die eine Mikroröhre geladen wird, einen Behälterhalteteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Behälterhalteteil die Mikroröhre vertikal hält, einen Erregungslichtquellenteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Erregungslichtquellenteil eine Lichtquelle aufweist, die horizontal Erregungslicht auf eine Seitenwandoberfläche der geladenen Mikroröhre bestrahlt, und einen Fluoreszenzdetektionsteil, der an einem oberen Abschnitt und oberhalb der geladenen Mikroröhre angeordnet ist, wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Fluoreszenzmaß in einem bestimmten Wellenlängenbereich von einer Zielprobe misst; (9) die Fluoreszenzmessvorrichtung nach dem vorherigen (8), wobei der Behälterteil ein Temperatursteuerungsmittel umfasst, das zum Einstellen einer Temperatur der Flüssigkeitsprobe innerhalb der Mikroröhre geeignet ist, (10) die Fluoreszenzmessvorrichtung nach voriger (8) oder (9), wobei der Regungslichtquellenteil eine LED Lichtquelle umfasst, (11) die Fluoreszenzmessvorrichtung nach einer vorigen (8) bis (10), wobei der Erregungslichtquellenteil ein Lichtgellenpositionssteuerungsmittel zum horizontalen oder vertikalen Einstellen einer Position, die mit dem Erregungslicht zu bestrahlen ist, enthält, (12) die Fluoreszenzmessvorrichtung nach einer der vorherigen (8) bis (11), wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Interferenzfilter aufweist, (13) die Fluoreszenzmessvorrichtung nach einer der vorigen (8) bis (12), wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Anzeigemittel zum Quantifizieren und Anzeigen einer Intensität der detektierten Fluoreszenz aufweist, (14) die Fluoreszenzmessvorrichtung nach einer der vorigen (8) bis (13), wobei der Fluoreszenzdetektionsteil einen Rechner zur Datenverarbeitung aufweist, und (15) eine Periodontalerkrankungsdiagnosevorrichtung, umfassend die Fluoreszenzmessvorrichtung nach einer der vorherigen (8) bis (14).
Effekt der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Fluoreszenzdetektionsvorrichtung dazu in der Lage, selbst mit einer extrem kleinen Probenmenge, ein Fluoreszenzmaß von der Probe zu detektieren, wodurch eine extrem kleine Menge der Probe leicht nicht-invasiv und extrem sicher erhalten und in einer kurzen Zeit analysiert werden und extrem preiswert bereitgestellt werden kann.
Kurze Figurenbeschreibung
1 ist ein Diagramm, das eine Basiskonfiguration einer Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung illustriert.
2 ist ein Diagramm, das Details eines Hauptteils der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung illustriert.
3 ist ein Diagramm, das eine Anordnung einer Erregungslichtquelleneinheit in der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung illustriert.
4 ist ein Diagramm, das Kalibrierkurven zeigt, die durch ein Plotten von Fluoreszenzintensitäten (FI) relativ zu entsprechenden AMC-Standardlösungen in jeder der verschiedenen Anordnungen (in einer vertikalen Richtung) der Erregungslichtquelleneinheit erhalten werden.
5 ist ein Diagramm, das Kalibrierkurven zeigt, die durch Plotten von FI-Intensitäten relativ zu entsprechenden AMC-Standardlösungen in jeder der verschiedenen Anordnungen (in einer horizontalen Richtung) der Erregungslichtquelleneinheit erhalten werden.
6 ist ein Diagramm, das Ergebnisse von Fluoreszenzintensitätsmessungen zeigt, die in einem eingestellten Zustand gemacht wurden, in dem unter Verwendung der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine AMC-Standardlösung mit Licht bestrahlt wurde, das einen Peak in einem Bereich von 365 nm ± 10 nm aufweist, und Licht einer Wellenlänge von 442 nm empfangen wurde.
7 ist ein Diagramm, das Ergebnisse einer Fluoreszenzintensitätsmessung zeigt, die in einem eingestellten Zustand gemacht wurde, in dem unter Verwendung der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung Trypsin dazu gebracht wurde, auf eine Substratlösung zu wirken, die dann mit Licht bestrahlt wurde, das einen Peak im Wellenlängenbereich von 365 nm ± 10 nm aufweist, und Licht einer Wellenlänge von 442 nm empfangen wurde.
8 ist ein Diagramm, das Ergebnisse von Fluoreszenzintensitätsmessungen zeigt, die in einem eingestellten Zustand gemacht wurden, in dem unter Verwendung der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Gingival Effusion von einem Patienten mit einer Periodontalerkrankung dazu gebracht wurde, auf eine Substratlösung zu wirken, die dann mit Licht mit einem Peak im Bereich von 365 nm ± 10 nm bestrahlt wurde, und Licht von 442 nm empfangen wurde.
Weg zur Ausführung der Erfindung
Ein Fluoreszenzmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt, solange das Verfahren ein Verfahren ist, das ein Laden einer Mikroröhre, die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllt ist, in eine Licht blockierende Messbox, ein seitliches Bestrahlen der geöffneten Mikroröhre in einer horizontalen Richtung mit Erregungslicht mit einer bestimmten Peakwellenlänge und Messen eines Fluoreszenzmaßes von der Zielflüssigkeitsprobe, die angeregt wird durch Licht, das sich über einen gesamten Bereich der Zielflüssigkeit innerhalb der Röhre unter Verwendung einer Seitenwandoberfläche der Mikroröhre als ein Erregungslicht-Wellenleiter verteilt, und Licht, das von der Seitenwandoberfläche heraustritt, durch einen Fluoreszenzdetektionsteil für einen bestimmten Wellenlängenbereich, der an einem oberen Abschnitt der Messbox und oberhalb der geladenen Mikroröhre angeordnet ist, umfasst, und auch eine Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt, solange die Vorrichtung umfasst: Eine Licht blockierende Messbox, in die eine Mikroröhre geladen ist; einen Behälterhalteteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Behälterhalteteil die Mikroröhre vertikal hält; einen Erregungslichtquellenteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Erregungslichtquellenteil eine Lichtquelle aufweist, die horizontal eine Seitenwandoberfläche der geladenen Mikroröhre mit Erregungslicht bestrahlt; und einen Fluoreszenzdetektionsteil, der an einem oberen Abschnitt der Messbox und oberhalb der geladenen Mikroröhre vorgesehen ist, wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Maß an Fluoreszenz in einem bestimmten Wellenlängenbereich von einer Zielprobe misst, und die Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kann effizient als eine Periodontalerkrankungsdiagnosevorrichtung verwendet werden. Darüber hinaus ist die Mikroröhre, die auch als Mikrozentrifugenröhre bezeichnet wird, nicht besonders beschränkt, solange die Mikroröhre eine Röhre ist, die eine Form wie eine konische Form mit einer geschlossenen Spitze hat, die dann gekappt und zur Benutzung verwendet werden kann, wie zum Beispiel Reaktion, Extraktion, Kultur und Zentrifugaltrennung, wobei die Röhre keinen Abschwächungs- oder Blockadeeffekt für Erregungslicht mit einer bestimmten Peakwellenlänge hat, wobei eine Seitenwandoberfläche der Röhre dazu in der Lage ist, als ein Anregungslichtwellenleiter verwendet zu werden, und wofür ein Material für eine solche Röhre, zum Beispiel Kunststoff oder Glas, bevorzugt Polypropylen oder Polyethylen verwendet werden kann, und ein Material, das gegenüber organischen Lösungen resistent ist, bevorzugt wird. Auch können bevorzugte Beispiele der Mikroröhre eine Röhre umfassen, die ein Volumen von 1,0 bis 2,0 ml, bevorzugt 1,5 ml, einen Außendurchmesser von 5 bis 20 mm, bevorzugt 8 bis 15 mm und eine Seitenwanddicke von 0,5 bis 1,5 mm, bevorzugt 0,8 bis 1,2 mm aufweist. Darüber hinaus können im Hinblick auf die Form der Mikroröhre genaue Beispiele der Form eine Mikroröhre vom Assist-Röhrentyp, hergestellt durch K. K. Assist, oder eine Mikroröhre vom Eppendorf-Röhrentyp, hergestellt durch die Eppendorf AG, umfassen; aber eine Form einer Mikroröhre mit Eigenschaften, die im Wesentlichen dieselben wie diejenigen der obigen sind, die durch ein anderes Unternehmen verkauft wird, kann ebenfalls verwendet werden.
Beispiele eines Materials der Messbox in der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung können Metallmaterialien, wie zum Beispiel Aluminium und technische Kunststoffe umfassen, die eine Licht blockierende Eigenschaft und Steifigkeit haben, die die Mikroröhre vertikal halten kann, und auch Beispiele des Behälterhalteteils, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, können eine zylindrische hohle Struktur mit einem geöffneten oberen Abschnitt hiervon umfassen, wobei die Struktur einen Bodenabschnitt aufweist, der die Mikroröhre vertikal halten kann. Die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllte Mikroröhre, die in einen solchen Behälterhalteteil geladen wird, wird geöffnet und daher kann ein Fluoreszenzmaß von der Zielflüssigkeitsprobe, die angeregt wird durch Licht, das über den gesamten Bereich der Zielflüssigkeit innerhalb der Röhre unter Verwendung der Seitenwandoberfläche der Mikroröhre als ein Erregungslicht-Wellenleiter verteilt ist, und Licht, das aus der Seitenwandoberfläche austritt, durch den Fluoreszenzdetektionsteil für einen bestimmten Wellenlängenbereich gemessen werden, der an einem oberen Abschnitt der Messbox und oberhalb der geladenen Mikroröhre vorgesehen ist. Die Licht blockierende Eigenschaft ist nicht auf einen Fall beschränkt, wo Licht perfekt blockiert wird und ist eine Idee, die Transmission von etwas Licht zu ermöglichen: Eine gesamte Lichtstrahl-Transitivität ist bevorzugt nicht mehr als 10%, weiter bevorzugt nicht mehr als 5%, ferner bevorzugt nicht mehr als 3%, besonders bevorzugt nicht mehr als 1% und über all dem ist fast 0% bevorzugt.
Bei dem Fluoreszenzmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist es ferner bevorzugt, eine Umgebungstemperatur der Zielflüssigkeitsprobe zu steuern, und es ist damit bevorzugt, dass der Behälterhalteteil in der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ein Temperatursteuerungsmittel aufweist, das dazu in der Lage ist, eine Temperatur der Flüssigkeitsprobe innerhalb der Mikroröhre zu steuern. Für ein solches Temperatursteuerungsmittel kann ein bekanntes verwendet werden und beispielsweise kann ein Temperatursensor verwendet werden, der eine Umgebungstemperatur der Zielflüssigkeitsprobe misst, und ein Temperatursteuerungsmittel zum Vergleichen eines Rückmeldungssignals von dem Sensor und eines Programminhalts, der zuvor gestaltet wurde und eine Anweisung ausgibt, einen Bereich in der Umgebung der Zielflüssigkeitsprobe falls nötig zu erhitzen, kann verwendet werden, und um diesen Zweck zu erreichen, kann beispielsweise ein Mikrocomputer verwendet werden. Die Umgebungstemperatur der Zielflüssigkeitsprobe kann auf eine optimale Temperatur für ein Enzym oder für Mikroorganismen in der Zielflüssigkeitsprobe, beispielsweise 30°C oder 37°C gesteuert werden, und eine Sicherheitssteuerungsvorrichtung für den Fall einer außergewöhnlichen Temperaturerhöhung kann für einen Fall enthalten sein, wo eine Temperatur innerhalb der Box auf 70°C oder mehr steigt.
Bei dem Fluoreszenzmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist es für die Verbesserung des S/N-Verhältnisses wichtig, eine Steuerung durchzuführen, um zu vermeiden, was „Overlap” genannt wird, und eine der Maßnahmen hierfür wird für Erregungslicht bevorzugt, eine Lichtquelle für Erregungslicht mit einer Richtungscharakteristik für einen kleineren Winkel und mit einer kleineren Halbwertsbreite auszuwählen, und für die Richtungscharakteristik ist ein Bereich von 1° bis 45° bevorzugt, ein Bereich von 2° bis 30° ist weiter bevorzugt, ein Bereich von 3° bis 20° ist ferner bevorzugt und ein Bereich von 5° bis 15° ist besonders bevorzugt. Darüber hinaus wird für die Halbwertsbreite nicht mehr als 40 nm bevorzugt, nicht mehr als 30 nm weiter bevorzugt, nicht mehr als 20 nm ferner bevorzugt und nicht mehr als 10 nm besonders bevorzugt.
Ein weiteres Mittel zum Durchführen einer Steuerung, um den zuvor genannten „Overlap” zu vermeiden, kann ein Auswählen einer fluoreszierenden Substanz umfassen, die in der Zielflüssigkeitsprobe enthalten sein soll, wobei die fluoreszierende Substanz eine Peakwellenlänge von Fluoreszenz aufweist, die von derjenigen des Erregungslichts so weit wie möglich entfernt ist, und beispielsweise eine fluoreszierende Substanz, die nicht weniger als 60 nm von der Peakwellenlänge des Erregungslichts entfernt ist, wird bevorzugt, eine fluoreszierende Substanz, die nicht weniger als 70 nm von derselben entfernt ist, wird weiter bevorzugt, eine fluoreszierende Substanz, die nicht weniger als 80 nm von derselben entfernt ist, wird weiter bevorzugt, eine fluoreszierende Substanz, die nicht weniger als 90 nm von derselben entfernt ist, wird ferner bevorzugt und eine fluoreszierende Substanz, die nicht weniger als 100 nm von derselben entfernt ist, wird besonders bevorzugt.
Das Erregungslicht ist nicht besonders beschränkt, solange das Erregungslicht seitlich in der horizontalen Richtung die gekappte Mikroröhre bestrahlt und die Zielflüssigkeitsprobe anregt durch Licht, das unter Verwendung der Seitenwandoberfläche der Mikroröhre als ein Erregungslichtwellenleiter auf den gesamten Bereich der Zielflüssigkeit innerhalb der Röhre verteilt ist, und Licht, das von der Seitenwandoberfläche austritt,; es wird jedoch bevorzugt, dass das Erregungslicht horizontal oder im Wesentlichen horizontal ein Niveau bestrahlt, das gleich oder im Wesentlichen gleich einer Oberfläche der Zielflüssigkeitsprobe innerhalb der Röhre ist, und damit weist der Erregungslichtquellenteil in der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt ein Lichtquellenpositionssteuerungsmittel zum Einstellen einer Position in der horizontalen Richtung und/oder der vertikalen Richtung auf, die mit dem Erregungslicht zu bestrahlen ist. Für ein solches Lichtquellenpositionssteuerungsmittel kann eine bekannte vertikal und horizontal gleitende Bühne effektiv verwendet werden.
Das Erregungslicht ist nicht besonders beschränkt, solange das Erregungslicht eine fluoreszierende Substanz in der Zielflüssigkeitsprobe anregt, wodurch es eine Messung eines Fluoreszenzmaßes von der erregten Zielflüssigkeitsprobe ermöglicht; aber wenn 7-amino-4-methyl-kumarin oder eine fluoreszierende Verbindung ähnlich zu 7-amino-4-methyl-kumarin in der Zielflüssigkeitsprobe enthalten ist, ist ein Wellenlängenband des Erregungslichts bevorzugt 330 nm bis 400 nm, mehr bevorzugt 350 nm bis 380 nm, ferner bevorzugt 355 nm bis 375 nm und besonders bevorzugt 360 nm bis 370 nm, und ein solches Erregungslicht wird bevorzugt verwendet, beispielsweise wo ein Substrat für ein zu untersuchendes Enzym, das in einer Probe enthalten ist, 7-amino-4-methylkumarin oder eine fluoreszierende Verbindung ähnlich zu 7-amino-4-methyl-kumarin ist.
Besondere Beispiele der Lichtquelle für das Erregungslicht, die in dem Erregungslichtquellenteil in der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, können Xenonleuchten, Quecksilberleuchten, Halogenleuchten, Laserlichter, UV-Leuchten und LEDs (Leuchtdioden) umfassen; LEDs sind jedoch dahingehend bevorzugt, dass sie eine kleine Größe aufweisen, preiswert sind und eine lange Lebensdauer aufweisen; stabile Temperaturcharakteristika aufweisen; eine Veränderung der Lichtmenge in kurzer Zeit nach dem Einschalten stabilisiert ist; und sie dazu geeignet sind, ultraviolett angeregte Ausgangsfluktuation und Wellenlängenfluktuation wegen einer angelegten Spannung zu steuern, wobei ein preiswerter regulierter Stromschaltkreis verwendet wird; und ein Bestrahlungswinkel und ein Bestrahlungsabstand mit Erregungslicht für eine optimale Eingabe von Anregungslicht in die Mikroröhren-Seitenwand leicht eingestellt wird, und vor allem ist eine LED mit einer bombenförmigen oberen Form besonders bevorzugt, und wo eine solche Lichtquelle verwendet wird, besteht kein Erfordernis für eine komplizierte Konfiguration unter Verwendung eines Erregungsfilters, einer Sammellinse und eines dichroischen Spiegels.
Ein Wellenlängenband, für das ein Fluoreszenzmaß von der Zielprobe gemessen wird, ist bevorzugt ein Wellenlängenband von 410 nm bis 475 nm, mehr bevorzugt 425 nm bis 465 nm, ferner bevorzugt 430 nm bis 455 nm und besonders bevorzugt 435 nm bis 450 nm, und ein solches Wellenlängenband kann bevorzugt verwendet werden, wo das Fluoreszenzmaß von der Zielprobe von 7-amino-4-methyl-kumarin oder einer fluoreszierenden Verbindung ähnlich zu 7-amino-4-methyl-kumarin abgeleitet wird, was in der Probe enthalten ist.
Es wird bevorzugt, dass der Fluoreszenzdetektionsteil in der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ferner einen Interferenzfilter enthält. Obwohl eine Bestrahlung mit Erregungslicht in dem Fluoreszenzmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht in Richtung des oberen Teils durchgeführt wird, ist es unmöglich, den Effekt des Überlappens der Halbwertsbreite des Erregungslichts, welche die Erregungslichtquelle beispielsweise aufgrund von Totalreflexion und Streuung hat, vollständig zu verhindern und damit ist es bevorzugt, eine Konfiguration bereitzustellen, in der Fluoreszenz zu einem Lichtaufnahmeelement unter Verwendung eines Interferenzfilters geleitet wird, welches das Erregungslicht abschneidet und ein bestimmtes Wellenlängenband entsprechend einer Fluoreszenz überträgt, und beispielsweise da, wo eine fluoreszierende Zielprobe 7-amino-4-methyl-kumarin oder eine fluoreszierende Verbindung ähnlich zu 7-amino-4-methyl-kumarin ist, ist das bestimmte Wellenlängenband für das Interferenzfilter bevorzugt 430 nm bis 455 nm, weiter bevorzugt 432 nm bis 452 nm und weiter bevorzugt 435 nm bis 450 nm.
Für den Fluoreszenzdetektionsteil in der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird einer, der ein Anzeigemittel zum Quantifizieren und Anzeigen einer Intensität detektierter Fluoreszenz und einen Computer zur Datenverarbeitung aufweist, bevorzugt, und für ein solches Quantifizierungs- und Anzeigemittel und den Computer zur Datenverarbeitung können auf dem Markt befindliche Produkte verwendet werden. Für das Anzeigemittel wird eines, das dazu in der Lage ist, Daten, die sich auf eine Messung beziehen, an ein übergeordnetes System zu übertragen, das damit verbunden ist, falls nötig eine Datenanalyse durchzuführen und eine Datenverarbeitung entsprechend dem jeweiligen Zweck durchzuführen, und das eine Anzeige in einem gewünschten Anzeigeformat im Hinblick auf anzuzeigende Dinge gemäß einer voreingestellten Referenz oder einer Anweisung von einer Eingabevorrichtung bereitstellt, bevorzugt.
Ein Beispiel der Zielflüssigkeitsprobe kann eine extrahierte Flüssigkeit, eine Grundflüssigkeit und eine Streuhemmung einer festen Probe, wie zum Beispiel einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organs zusätzlich zu den flüssigen Proben, wie Zahnfleischeffusion, Speichel, Blut, Urin, Schweiß und Tränenflüssigkeit enthalten und etwa 10 μl sind ausreichend für eine Menge der Zielflüssigkeitsprobe, die in dem Fluoreszenzmessverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung notwendig ist, und daher kann mit nur einer Menge der Probe an einem sich verjüngenden Spitzenabschnitt der Mikroröhre das Fluoreszenzmaß von der Zielprobe gemessen werden. Beispielsweise dort, wo die Aktivität eines bestimmten Enzyms in der Zielprobe gemessen wird, wird ein fluoreszierend markiertes Substrat, das durch Markieren eines Substrats für ein solches bestimmtes Enzym durch eine fluoreszierende Substanz erhalten wird, der Zielflüssigkeitsprobe hinzugefügt, und das Fluoreszenzmaß von der Zielflüssigkeitsprobe wird als ein Fluoreszenzmaß von der fluoreszierenden Substanz gemessen, das als eine Folge einer Aktion des bestimmten Enzyms freigesetzt wird, und genauer kann das Fluoreszenzmaß aus der Zielflüssigkeitsprobe durch Füllen einer Probe, die von einem Subjekt erhalten wurde, in die Mikroröhre, zusammen mit einem fluoreszierend markierten Substrat für ein Enzym, von dem erwartet wird, dass es in der Probe enthalten ist, gemessen werden.
Beispiele des Enzyms können Trypsin, Chymotrypsin, Elastase, Subtilisin, Kollagenase, Gingipain, Dentilisin, Neutrophil Elastase, Thrombin, Glucosidase und saure Glucosidase enthalten. Auch können Beispiele des fluoreszierend markierten Substrats ⁱBoc-Gly-Gly-Arg-MCA (Isobutyloxycarbonyl-glycylglycyl-L-arginine-7-amino-4-methylkumarinamid) enthalten, worauf Gingipain oder Trypsin wirkt, und verschiedene Typen von Peptidyl Lys(Ac)-MCA, die durch Binden von acetyliertem Lysin und 7-amino-4-methyl-kumarin an einen Carboxyanschluss von Oligopeptid, wie zum Beispiel Ac-Lys-Gly-Leu-Gly-Lys(Ac)-MCA, Ac-Leu-Gly-Lys(Ac)-MCA und Boc-Gly-Lys(Ac)-MCA mit einer Histon H4-abgeleiteten Folge, auf die Histon Deacetylase (HDAC) wirkt, Ac-Ser-Arg-His-Lys-Lys(Ac)-MCA mit einer p53-abgeleiteten Folge und Ac-Met-Pro-Ser-Asp-Lys(Ac)-MCA mit einer Tubulin-abgeleiteten Folge enthalten und können auch Peptide enthalten, die eine Aminosäurefolge ähnlich zu den obigen enthalten, die durch Verbinden einer fluoreszierenden Verbindung ähnlich zu 7-amino-4-methyl-kumarin erhalten wird.
Das Fluoreszenzmessverfahren und die Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung werden unten mit Bezug auf die Zeichnungen genau beschrieben; aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf die in diesen Zeichnungen beschriebene Ausführungsform beschränkt. 1 illustriert eine Grundkonfiguration der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung und 2 illustriert Details eines Hauptteils der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
Eine geöffnete Mikroröhre 2, die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllt ist, wird in einen Behälterhalteteil 3 eingeführt, der innerhalb einer Messbox 1 vorgesehen ist, wobei der Behälterhalteteil 3 die Mikroröhre 2 vertikal hält. Eine LED 4, die die Mikroröhre 2 seitlich in einer horizontalen Richtung mit Erregungslicht bestrahlt, das eine bestimmte Peakwellenlänge aufweist, ist als eine Erregungslichtquelle angebracht und Erregungslicht mit einer bestimmten Peakwellenlänge von 365 nm bestrahlt die Zielflüssigkeitsprobe innerhalb der Mikroröhre. Eine Einstellung für ein optimales Bestrahlungslichtquellenniveau wird durch einen Stromsteuerungsteil 21 und vertikal/horizontal Positionssteuerungsteile 5 und 6 bewirkt. Das Erregungslicht wird auf den gesamten Bereich der Zielflüssigkeit innerhalb der Röhre unter Verwendung der Seitenwandoberfläche als ein Erregungslichtwellenleiter und unter Verwendung der Mikroröhrenseitenwand als ein Wellenleiter verteilt, und die Zielflüssigkeitsprobe wird durch Licht erregt, das von der Seitenwandoberfläche austritt. Fluoreszenz, die als eine Folge der Anregung erzeugt wird, wird durch ein Lichtaufnahmeelement 8 an einem oberen Abschnitt der Licht blockierenden Box durch ein vorbestimmtes Interferenzfilter 7 (für eine mittlere Wellenlänge von 442 nm ± –10 nm) detektiert und an einen Signalverstärker 22 (Strom-Spannungswandlungsverstärker + Signalverstärkung: Detektionsbereichsmaßstabseinstellung), der in einem Steuerungsteil innerhalb einer Steuerungsbox 20 angeordnet ist, eingegeben, und das Signal wird einem Hauptsteuerungsteil (PIC + ADC) einer Verarbeitung sowie einer dynamischen Bereichseinstellung unterworfen und die Ergebnisse werden durch eine LCD-Anzeige 23 in Form von vorbestimmten Anzeigeinhalten (erster Wert, letzter Wert, Zeitverlauf, Zustandsanzeige und Temperaturanzeige) bekanntgegeben. Wo weiter eine Datenverarbeitung nötig ist, wird das Signal von dem Hauptsteuerungsteil 24 an ein Hauptsystem 27 übertragen.
Eine Temperatursteuerung für die Zielflüssigkeitsprobe wird durch eine Temperatursteuerungsheizung PTC (Positive Temperatursteuerung) 9 durchgeführt, die innerhalb der Messbox im Hinblick auf eine schnelle Antwort und Sicherheit vorgesehen ist, und eine Temperatursteuerung, die einen Vergleich zwischen einem Rückmeldungssignal von einem Rückmeldungstemperatursensor 10, der eine Umgebungstemperatur einer Zielflüssigkeitsprobe misst, die in der Umgebung des Sensors eingestellt ist, und einem Programminhalt, der im Voraus gestaltet wurde, und eine Ausgabe einer Anweisung ermöglicht, eine Fläche in der Umgebung der Zielflüssigkeitsprobe gegebenenfalls zu erhitzen, wird durch Temperatursteuerungsteile 25 und 26 durchgeführt.
Darüber hinaus wird, um die Mikroröhrenseitenwand quer mit Erregungslicht zu bestrahlen, eine Einstellung durchgeführt, um eine vertikale und horizontale Position der LED durch vertikal/horizontal Positionssteuerungsteile 5 und 6 zu optimieren, so dass das Erregungslicht eine wesentliche Oberfläche der Mikroröhrenzielprobenmenge bestrahlen kann, was eine Miniaturisierung eines Hintergrundfluoreszenzniveaus der Mikroröhren ermöglicht.
2 illustriert, dass der Hauptteil die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllte Mikroröhre 2, die Erregungslichtquelle LED 4, das Aufnahmeelement für detektiertes Licht 8, das lichtempfangende Interferenzfilter 7, den Rückmeldungstemperatursensor 10, die Temperatursteuerungsheizung PTC 9 und eine obere Betätigungskappe der Messbox 11 aufweist und in einem Zwischenteil der vorliegenden Messvorrichtung installiert ist.
Der Behälterhalteteil 3, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, kann die Mikroröhre 2 vertikal halten und kann beispielsweise eine Mikroröhre mit jeder verschiedenen Art von Volumen halten, 0,2 ml, 1,5 ml und 2,0 ml, bevorzugt eine weit verbreitete 1,5 ml Mikroröhre.
Für eine Lichtquelle für Erregungslicht wird eine mit einer oberen Linse ausgestattete bombenförmige LED mit einem Peak von 365 nm ± –10 nm verwendet, nämlich die NSHU590B, hergestellt durch die Nichia Corporation.
Eine weitere genaue Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele bereitgestellt; die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht durch die Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
(Optimieren der Position des Erregungslichtquellenteils)
In der vorliegenden Erfindung wird ein Fluoreszenzmaß von einer Zielprobe durch das Beer'sche Gesetz für eine Menge monochromatischen Lichts, das durch eine Probe absorbiert wird, abgeleitet und wird ausgedrückt durch: F = φP(1 – 10exp(–abc)) wenn –abc < 0,01 F = 2,303φPabc wobei

F: eine Fluoreszenzintensität ist,
φ: eine Quantenausbeute ist,
b: eine optische Weglänge ist und
c: eine Konzentration ist.

Auf dieser Grundlage wurden optimale Komponentenspezifikationen herausgefunden.
Für die Position des Erregungslichtquellenteils wurde eine Prüfung durchgeführt für jeden der Fälle, wo eine Lichtquelle vertikal angeordnet ist (bei V-0, V-1 und V-2) und horizontal (bei H(1), (2) und (3)), wie in 3 illustriert ist. Für die Prüfung der vertikalen Positionen wird die Lichtquelle horizontal fixiert (bei H(3)) und 4 zeigt Kalibrierungskurven mit FI Intensitäten, die relativ zu 0 bis 5 μM AMC Standardlösungen für die jeweilige V-Position aufgetragen sind: V-0, V-1 und V-2. In der Figur zeigt

1 Messwerte bei der Position V-(0);
2 Messwerte bei der Position V-(1); und
3 Messwerte bei der Position V-(2).

Kalibrierungskurve 1 für V-(0), was eine Flüssigkeitsebene ist, weist die größte Neigung auf, was zeigt, dass die Kalibrierkurve 1 eine Kalibrierkurve ist, die für AMC Standardlösung am besten geeignet ist.
Als nächstes kann die horizontale Einstellung als hauptsächlich die dynamische Reichweite in Verbindung mit der Bestrahlung von Energie und Bestrahlungsrichtungscharakteristik betreffend angesehen werden. In 5 zeigt 1 Messwerte bei der Position H-(3) und zeigt 2 Messwerte bei der Position H-(2) (wobei die vertikale Position bei V-(0) fixiert wurde). Messwerte an der Position H-(1) werden ausgelassen.
Beispiel 2
(Fluoreszenzintensität gegen Produktkonzentration)
AMC wurde in einen 0,1 M HEPES Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 gelöst, um 1 bis 10 μM Lösungen vorzubereiten und 100 μl von jeder der Lösungen werden in eine Mikroröhre gefüllt (A-1500, hergestellt durch K. K. Assist, mit einem Volumen von 1,5 ml, einer Länge von 450 mm, einer Länge unterhalb eines Schraubverschlusses von 350 mm, einer Verjüngungsposition von 20 mm vom Boden, einem Außendurchmesser von 10 mm, einem Innendurchmesser von 8 mm und einer Seitenwanddicke von 1 mm), und unter Verwendung der Fluoreszenzmessvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung, die in 1 illustriert ist, wurde die Fluoreszenzintensität mit einer eingestellten Bedingung gemessen, um mit Licht mit einem Peak von 365 nm ± –10 nm zu bestrahlen und Licht von 442 nm aufzunehmen. 6 zeigt die Ergebnisse. Eine im Wesentlichen lineare Beziehung wurde zwischen der Fluoreszenzintensität und der AMC Konzentration gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die vorliegende Erfindung ein Messen von Fluoreszenz von AMC mit hoher Genauigkeit ermöglicht, um die AMC Konzentration zu messen.
Beispiel 3
(Fluoreszenzintensität gegen Trypsin-Konzentration)
ⁱBoc-Gly-Gly-Arg-MCA wurde in einem 0,1 M HEPES Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 gelöst und 100 μl der resultierenden Lösung wurden in einer Mikroröhre (A-1500) gefüllt und 5 μl einer Trypsin-Lösung mit einer eingestellten Konzentration wurden hinzugefügt und dann wurde eine Fluoreszenzintensitätsmessung für 10 Minuten durchgeführt, um Unterschiede in der Fluoreszenzintensität ΔFI über die 10 Minuten zu erhalten. 7 zeigt die Ergebnisse. Wo die ΔFI-Trypsin-Konzentrationsbeziehung aufgezeichnet wurde, wurde eine lineare Korrelation erhalten. Aus den Ergebnissen wurde bestätigt, dass gemäß der vorliegenden Erfindung eine Rate für Trypsin um AMC auszuschneiden unter Verwendung von ⁱBoc-Gly-Gly-Arg-MCA als ein Substrat aus einem Anstieg der AMC Konzentration gemessen werden kann.
Beispiel 4
(Fluoreszenzintensität gegen Periodontaltaschentiefe)
ⁱBoc-Gly-Gly-Arg-MCA wurde in einer 0,1 M HEPES Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 gelöst und 100 μl der sich hieraus ergebenden Lösung wurden in eine Mikroröhre (A-1500) gefüllt, 0,1 μl Zahnfleischeffusion eines Patienten mit einer Periodontalerkrankung wurde über einen Papierpunkt aufgenommen und diese wurde als eine Probe verwendet und zu ⁱBoc-Gly-Gly-Arg-MCA-Lösung in der Mikroröhre hinzugefügt. Fluoreszenzintensitätsmessung wurde über 10 Minuten durchgeführt und Unterschiede der Fluoreszenzintensität ΔFI über die 10 Minuten wurden relativ zu den Zahnfleischtaschen (Taschentiefe: PD), gemessen durch eine Zahnarzt, aufgetragen. 8 zeigt die Ergebnisse. Aus den Ergebnissen wurde bestätigt, dass eine Enzymaktivität des Enzyms Arg-Gingipain, produziert durch P. Gingivalis, was ein Zahnfleischerkrankung erzeugendes Bakterium ist, wobei Arg-Gingipain die Fähigkeit des Ausschneidens von AMC hat, im Zahnfleischausfluss gemessen wird, um zu bestimmen, ob die Zahnfleischerkrankung in einer aktiven Phase ist oder nicht, was für ein Formulieren einer therapeutischen Strategie effektiv ist.
Bezugszeichenliste

1: Messbox
2: Mikroröhre
3: Behälterhalteteil
4: LED
5: Vertikalpositionssteuerungsteil
6: Horizontalpositionssteuerungsteil
7: Interferenzfilter
8: Lichtaufnahmeelement
9: Temperatursteuerungsheizung PTC
10: Temperatursensor
11: obere Betätigungskappe der Messbox
20: Steuerungsbox
21: Stromsteuerungsteil
22: Signalverstärker
23: LCD-Anzeige
24: Hauptsteuerungsteil
25: Temperatursteuerungsteil (1)
26: Temperatursteuerungsteil (2)
27: Hauptsystem

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

JP 6-34546 [0007]
JP 2010-190713 [0007]
JP 2008-185440 [0007]
JP 2008-289437 [0007]
JP 2004-354347 [0007]
JP 2004-325431 [0007]
JP 2007-519923 [0007]

Claims

Fluoreszenzmessverfahren, umfassend ein Laden einer Mikroröhre, die mit einer Zielflüssigkeitsprobe gefüllt ist, in eine Licht blockierende Messbox, seitliches Bestrahlen der geöffneten Mikroröhre in einer horizontalen Richtung mit Erregungslicht, das eine bestimmte Peakwellenlänge aufweist, und Messen eines Fluoreszenzmaßes von der Zielflüssigkeitsprobe, das angeregt wird durch Licht, das unter Verwendung einer Seitenwandoberfläche der Mikroröhre als ein Erregungslichtwellenleiter über einen gesamten Bereich der Zielflüssigkeit innerhalb der Röhre verteilt ist, und Licht, das von der Seitenwandoberfläche heraustritt, durch einen Fluoreszenzdetektionsteil für einen bestimmten Wellenlängenbereich, der an einem oberen Abschnitt der Messbox und oberhalb der geladenen Mikroröhre vorgesehen ist.
Fluoreszenzmessverfahren nach Anspruch 1, wobei eine Umgebungstemperatur der Zielflüssigkeitsprobe gesteuert wird.
Fluoreszenzmessverfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Erregungslicht mit einem Wellenlängenband von 355 nm bis 375 nm zur Bestrahlung verwendet wird.
Fluoreszenzmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine LED als eine Lichtquelle für das Erregungslicht verwendet wird.
Fluoreszenzmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mikroröhre eine Kunststoffmikroröhre ist, welche das Erregungslicht nicht blockiert.
Fluoreszenzmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Fluoreszenzmaß von der Zielprobe ein Fluoreszenzmaß mit einem Wellenlängenband von 430 nm bis 455 nm ist.
Fluoreszenzmessverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Fluoreszenzmaß von der Zielprobe von 7-amino-4-methyl-kumarin oder einer fluoreszierenden Verbindung ähnlich zu 7-amino-4-methyl-kumarin, was in der Probe enthalten ist, abgeleitet wird.
Fluoreszenzmessvorrichtung, umfassend: eine Licht blockierende Messbox, in die eine Mikroröhre geladen ist; einen Behälterhalteteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Behälterhalteteil die Mikroröhre vertikal hält; einen Erregungslichtquellenteil, der innerhalb der Messbox angeordnet ist, wobei der Erregungslichtquellenteil eine Lichtquelle enthält, die eine Seitenwandoberfläche der geladenen Mikroröhre horizontal mit Erregungslicht bestrahlt; und einen Fluoreszenzdetektionsteil, der an einem oberen Abschnitt der Messbox und oberhalb der geladenen Mikroröhre vorgesehen ist, wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Fluoreszenzmaß in einem bestimmten Wellenlängenbereich von einer Zielprobe misst.
Fluoreszenzmessvorrichtung nach Anspruch 8, wobei der Behälterhalteteil ein Temperatursteuerungsmittel aufweist, das zum Einstellen einer Temperatur der Flüssigkeitsprobe innerhalb der Mikroröhre geeignet ist.
Fluoreszenzmessvorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, wobei der Erregungslichtquellenteil eine LED-Lichtquelle enthält.
Fluoreszenzmessvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der Erregungslichtquellenteil ein Lichtquellenpositionssteuerungsmittel zum horizontalen oder vertikalen Einstellen einer Position, die mit Erregungslicht zu bestrahlen ist, aufweist.
Fluoreszenzmessvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Interferenzfilter aufweist.
Fluoreszenzmessvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei der Fluoreszenzdetektionsteil ein Anzeigemittel zum Quantifizieren und Anzeigen der Intensität von detektierter Fluoreszenz aufweist.
Fluoreszenzmessvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei der Fluoreszenzdetektionsteil einen Computer zur Datenverarbeitung umfasst.
Periodontalerkrankungsdiagnosevorrichtung, umfassend die Fluoreszenzmessvorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 14.