KR101535918B1 - 선택적 평면 조사 현미경을 이용한 나노 물질 위해성 평가 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나노 물질 위해성 평가 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM) 이용하여, 실제 세포배지내 및 세포에 전달되는 용량(Delivered & Cellular dose) 측정상의 종래 나노 물질 위해성 평가법의 오류를 개선한, 나노 물질 위해성 평가 방법에 관한 것이다.
본 발명은 나노물질의 위해성 평가에서 보다 정확하고 재현성 있는 평가결과를 얻어낼 수 있다.

Description

선택적 평면 조사 현미경을 이용한 나노 물질 위해성 평가 방법{A Method for the Toxicity Assessments of Nano-Materials using Selective Plane Illumination Microcopy}

본 발명은 나노 물질 위해성 평가 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM) 이용하여, 실제 세포배지내 및 세포에 전달되는 용량(Delivered & Cellular dose) 측정상의 종래 나노 물질 위해성 평가법의 오류를 개선한, 객관적이고 재현성 있는 나노 물질 위해성 평가 방법에 관한 것이다.

나노 크기의 입자(이하 나노물질)에 인체가 노출될 때에 발생할 수 있는 나노물질의 위해성은 최근 나노기술의 급격한 발달에 따라 새로운 문제로 대두되고 있다. 호흡에 의한 흡입, 구강에 의한 흡입, 및 피부 노출의 빈도가 점차 증가하고 있는 점을 고려하여 볼 때, 나노기술 및 나노물질의 안정성에 대하여 정확하고 과학적인 정보가 시급히 요청되고 있다

나노물질의 위해성은 매우 작은 크기와, 나노물질 특유의 벌크물질과 크게 다른 입자의 물리화학적 특성으로 인해 발생한다. 석면과 유리섬유와 같은 침상구조를 갖는 물질들의 암 유발 가능성과 같은 유해성에 대해서는 이미 오래전부터 잘 알려져 왔다. 나노물질의 경우 석면과 유리섬유와는 다르게 형상적 특성뿐만 아니라 매우 작은 크기로 인한 유해성이 더 주목을 받고 있다. 높은 표면 반응력과 세포막 투과능은 나노물질들이 쉽게 생체에 유입될 수 있도록 하고, 세포수준의 스트레스 유발가능성을 높이고 더 나아가 석면처럼 생체에 축적되어 지속적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 보고되고 있다. 나노물질은 마이크로사이즈의 물질과는 달리 인체 내에 더욱 깊숙한 곳까지 침투하여 침착이 가능하므로 심혈관계 질환에 영향을 미칠 수 있고, 특히 코 신경을 통해 침투된 나노물질은 혈액에 의해 체내에서 이동가능하여 뇌 손상에까지 영향을 미칠 수 있는 것으로 판단된다.

생체를 대상으로 한 나노물질의 위해성 연구의 대부분은 주사로 인한 주입이나 세포배양을 통해 이루어지며 주로 금속, 금속산화물, 탄소 나노물질 등을 대상으로 한다. 일반적으로 나노입자는 주사보다는 호흡기, 구강, 피부에 의해서도 인체에 유입되는 것으로 알려져 있다.

나노물질의 잠재적인 유해 영향을 미연에 방지하고 대비책을 마련하기 위한 국제협력활동이 적극적으로 추진되어야 하며, 무분별한 나노기술 개발 및 적용 그리고 부적절한 폐기 등 잠재적 위험성을 최소화 또는 감소하기 위한 제도적 장치 마련이 동시에 이루어져야 하는 시점에 와 있다.

그러나, 나노입자 등이 인체나 환경에 미치는 위해성이 심각할 것으로 인식되고 있는 것과는 달리 실제 나노물질에 의한 인체와 생태계 노출, 독성 및 유해 영향평가 기법조차 제대로 구축되어 있지 않은 실정이다.

현재까지는, 일반적으로 기존 화학물질에 사용되고 있는 위해성 평가 방법을 나노물질에 적용하는 경우가 많다. 그러나, 작은 크기의 입자일수록 그 표면적이 넓어져 생체조직에 대한 반응성과 그에 따른 독성이 증가하므로 나노크기의 특성을 고려한 나노 물질의 새로운 물리화학적 성질과 이로 인한 독성에 대한 조사가 무엇보다도 중요하다.

그러므로 나노 물질의 위험성 평가를 하기 위해서는 나노 입자의 독특한 특성과 문제점, 거동, 노출 및 독성의 잠재적인 영향에 대한 연구가 필요하다.

최근 다양한 산업분야에서 나노물질을 이용한 제품을 생산하고 있으며 생산된 많은 제품들을 소비함에 따라 소비자에 직접적인 나노물질의 노출이 급격하게 증가되고 있는 추세이다. 이에 따라 나노물질에 대한 독성연구가 세계적으로 진행되고 있으며 나노물질 독성평가방법 개발의 중요성 또한 부각되고 있다. 기존에 나노물질 독성평가에서 잘못 수행되고 있던 문제점들을 해결할 수 있는 프로토콜과 나노물질 독성 평가를 위한 새로운 형태의 기구를 개발함으로써 보완된 형태의 나노 물질 세포독성 평가 플랫폼이 요구된다.

이에, 본 발명자는 최소 2개 이상의 "선택적 평면 조사 현미경법"(Selective Plane Illumination Microscopy: SPIM)을 조합한 나노입자 실시간 모니터링 법을 이용하여 수용액상 나노입자의 응집 및 침전으로 인한 나노입자의 농도 균질성의 변화를 실시간 보정 하고, 세포배지내에서부터 세포로 전달되는 나노입자의 용량(Delivered & Cellular dose)과 세포내에 축적되는 나노물질의 양 (Cellular uptake of NPs) 을 실시간으로 객관적으로 측정할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용하여 나노물질의 위해성을 실시간으로 평가(모니터링)하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하기 위한, 나노 물질의 위해성 평가용 유세포 분석 플랫폼 또는 시스템을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

세포배지에 나노물질을 노출시키는 단계;

2이상의 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용하여 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수와 크기를 측정하는 단계;

상기 측정결과를 이용하여 나노물질의 세포에 대한 영향을 분석하는 단계를 포함하는, 나노물질 위해성 실시간 평가(모니터링)방법을 제공한다.

특히, 상기 SPIM은 나노물질 노출기구에 결합하는, 도 2에 도시된 레이저 기반 암시야의 형광 현미경으로 구성되어 있는 것을 특징으로 한다.

상기 SPIM의 이용은

IRIS 및 슬릿(slit)에 의한 레이저 빔 두께의 1차 감소;

실린더 렌즈(cylinderical lens)에 의한 판 모양으로의 빔 형태 변형;

대물렌즈(objective lens)에 의한 빔 두께의 2차 감소에 의해 이루어지는데, 이렇게 빔의 두께를 줄임으로써 빔의 투과 경로를 벗어나는 입자의 산란 혹은 형광 신호를 배제할 수 있기 때문에 고분해능, 고명암비의 영상을 얻을 수 있는 장점이 있다.

한편, 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수의 측정은 나노물질 이미지 분석을 통해 실시간으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 동영상 또는 연속촬영된 사진을 이용할 수 있다.

그리고, 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 크기의 분석은 나노물질의 브라운 운동에 따른 확산계수 D를 이용하는 것이 바람직하다:

이 때, k는 볼츠만 상수, T는 온도, η는 용액의 점도, r은 나노물질의 반지름이다.

상기 나노물질의 세포에 대한 영향 분석은 세포배지 내 나노물질의 응집 및 침전계수 계산, 세포 내 나노물질의 축적량 계산, 및 세포사멸과의 연관성 확인 등을 포함한다.

이 중에서, 상기 세포배지 내 나노물질의 응집 및 침전계수 계산은 PLS(parallel light sheet) 모드의 SPIM을 이용하여 2이상의 시료높이에서의 나노물질 농도 및 크기분포를 측정함으로써 수행될 수 있다.

상기 세포 내 나노물질의 축적량 계산은 PLS(parallel light sheet) 모드의 SPIM; 및 HILO(Highly inclined and laminated optical sheet) 모드 또는 TIR(Total internal reflection) 모드의 SPIM의 조합을 이용하여 수행될 수 있는데, 이는 실제 노출된 나노물질의 농도 및 크기분포; 및 세포 내 축적된 나노물질의 농도 및 크기분포를 확인함으로써 계산할 수 있다.

그리고, 세포사멸과의 연관성 확인은 흡광염색법 또는 형광염색법을 이용한 염색법으로 세포 사멸 정량분석한 결과를, 상기 세포 내 나노물질의 축적량 계산결과를 조합하여 분석함으로써 가능하다.

이 때, 상기 흡광염색은 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), MTS(5-(3-caroboxymethoxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt), WST(4-[3-(4-Iodophenyl)-2(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate) 및 트립판 블루(trypanblue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 흡광염료를 이용하여 수행되고, 상기 형광염색은 유기형광 염료, 무기나노입자 또는 형광단백질을 이용하여 세포 사멸 정량분석을 수행할 수 있다.

본 발명에서 분석코자 하는 나노물질은 금나노, 은나노, SWCNT(single-walled carbon nanotube), MWCNT(multi-walled carbon nanotube),풀러린(fullerene, C60), 철 나노입자, 카본블랙, 이산화티탄, 산화알루미늄, 산화세륨, 산화아연, 이산화규소, 폴리스틸렌, 덴드리머, 나노클레이로 등으로 세포에 대해 위해성(유해성)을 나타내는 물질을들 비제한적으로 포함한다.

또한, 본 발명의 나노물질 위해성 평가방법은 유세포 분석법, 세포 이미지 분석법, 또는 역상노출기구를 이용한 분석법과 조합하여 수행될 수도 있다.

특히, 예를 들어, 미세유체칩과 결합되어 수행될 수 있는데, 이러한 시스템을 도 11에 도시하였다. 즉, 미세유체칩과 결합된 mSPIM 시스템에 따르면, 레이저 광원은 광섬유로 미세유체칩에 전달되고, 칩에 통합된 cylindrical lesn와 프리즘을 이용해 PLS와 HILO등의 조합을 동시에 가능하게 한다. 이를 이용하여 미세유체칩 내부에서의 나노입자의 변화를 실시간 모니터링 할 수 있고, 나노입자의 축적에 의한 세포 반응을 관찰할 수 있다.

이렇게 본 발명은 실시간 나노입자의 정량적, 크기적 분포를 직접적으로 측정하고, 나노입자의 세포배지내 응집계수, 세포내 나노입자 축적량등을 모니터링함으로써 기존 in-vitro 나노입자 노출 시험에서 발생하는 나노입자의 불균질성으로 인해 발생하는 오류를 줄이고 보다 정확하고 재현성 있는 나노입자 용량-반응관계를 평가할 수 있는 방법을 제공한다.

본 발명은 나노물질의 위해성 평가에 있어서 기존의 화학물질 위해성 평가시 사용하던 평가법의 프로토콜을 그대로 사용함에 있어서 생길 수 있는 다양한 문제점에 대해 제시하고, 실험자들이 많이 오류를 범하고 있는 부분에 대해 해결책 및 개선 방안을 제시하였다. 따라서, 본 발명에 기반한 나노물질 위해성 평가 플랫폼을 제작하여 앞으로의 나노물질의 위해성 평가에서 보다 정확하고 재현성있는 위해성 평가결과를 얻어낼 수 있을 것이다.

도 1은 나노입자가 실제 세포배양액에 노출되면 응집 및 침전에 따라 그 농도가 변함에 따른 오류가 발생과정을 그린 모식도이다[Justin G. Teeguarden et al., 2007]
도 2는 본 발명에 사용한 SPIM법을 이용할 수 있는 레이저 분광 시스템의 개략도이다.
도 3은 본 발명에서 사용될 수 있는 HILO 혹은 TIR 형태의 관찰이 가능한 샘플 홀더의 개략도이다.
도 4는 DI-water에 분산된 15nm, 30nm 금나노입자와 50nm 실리카 입자를 PLS모드로 관찰한 결과이다.
도 5는 분산된 15nm와 30nm 금나노입자를 HILO 모드로 관찰하고, 브라운 운동을 추적하여 각 입자의 크기분포를 측정한 것이다.
도 6은 세포 배양 과정에서 발생할 수 있는 나노입자의 농도 변화, 크기변화를 실시간 모니터링 할 수 있는 시스템의 개략도이다.
도 7은 도6과 같은 조건일 때 시간이 지남에 따라 높이에 따라 분산된 나노입자가 침전 및 응집되는 경향을 나타낸 것이다.
도 8은 세포내부에 축적되는 나노입자의 양을 측정하기 위한 HILO 모드와 용액내 분산된 나노입자를 동시에 측정하기 위한 PLS가 결합된 형태의 개략도이다.
도 9는 도 8과 같은 조건일 때의 나노입자의 모니터링 결과이다.
도 10은 실제 나노입자가 침전되어 세포 표면에서 브라운 운동하는 것을 광학 현미경과 HILO 모드로 관찰했을 때의 결과이다.
도 11은 미세유체칩과 결합된 SPIM 시스템의 모식도이다.

본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.

"나노물질(Nano materials)”이란 입자의 크기가 3차원 중 적어도 1개의 차원 길이가 100 nm보다 작은 나노입자와 나노구조물질을 말한다. 본 발명에서는 특히, 상기 나노물질을 나노입자와 병용하여 사용하고 있다.

"나노입자(Nanoparticles)”란 1～100 nm 범위의 직경을 가진 입자를 말한다.

"나노 물질 위해성"이란 나노 크기의 입자상 또는 액상의 물질이 가지는 위험성, 리스크, 유해성, 독성 등을 총칭하여 일컫는 용어로서, 엄밀하게 설명하면, 유해성(hazard)이란 장해를 야기할 수 있는 물질이나 행동을 일컬으며 위해의 근원을 말하며, 위해도(risk)란 유해물질의 특정농도나 용량에 노출된 개인 혹은 집단에게 유해한 결과가 발생할 확률(probability) 또는 가능성(likelihood)으로 정의됩니다. OECD에서는 위해도를 「위해도(Risk) = 유해성(Hazard)×노출량(Exposure)」으로 정의하고 있다.

일반적으로 작은 입자일수록, 비표면적이 넓어지면서 생체조직에 대한 반응성이 증가하고 그와 함께 독성도 증가할 수 있어 문제되고 있다. 특히, 동물세포에 침투 가능한 일부 나노물질은 세포막이나 뇌혈막을 통과할 수도 있다고, 이러한 성질은 의도하지 않은 세포나 조직에 영향을 미칠 수 있는 것이다. 따라서, 이러한 나노물질의 위해성을 연구하여 안전관리 지침 등의 마련이 요구되고 있는 실정이다. 문헌 보고에 의하면 탄소류, 실리카류, TiO2, 은나노 입자 등의 순서로 나노물질 위해성 검토가 이루어지고 있다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.

"세포사멸(apoptopsis)"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다.

본 발명에서 "모니터링" 또는 "실시간 평가"란 일정기간(시간) 동안 유효한 변수에 대한 조직적 검출(Traxler. 1997)을 의미한다. 즉 무엇이 무엇으로 어느 기간 동안 어떻게 변화하였는지를 찾아내는 것으로 풀이할 수 있다. 효과성 검증을 위한 한계치 또는 표준, 지표(Indicator)같은 것을 척도로 이용하는 규칙적인 모니터링 방법과 Survillance”의 의미로 조사(관찰) 전에 질적 표준치를 정하지 않는 불규칙한 모니터링의 방법이 있다. 본 발명에서는"모니터링"의 용어와 "평가"라는 용어를 혼용하여 사용하고 있다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

이하 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

현재 사용되고 있는 나노물질에 대한 독성 평가는 기존의 in vitro 세포기반 위해성 평가 시스템을 이용하여 수행하고 있다. 즉, petri dish나 multiwell plate의 바닥면에 세포를 배양한 상태에서 나노물질을 노출한 후 세포의 성장 또는 사멸정도를 다양한 형광 및 흡광 염료를 이용한 세포분석방법을 이용하여 나노물질의 세포독성을 측정해 왔는데 이러한 종래의 방법은 많은 오류를 내포하고 있다.

나노물질의 위해성 평가시 농도를 결정하는데 있어서 발생하는 중요한 오류의 원인중의 하나는 세포가 노출된 나노물질의 양, 즉 나노물질 노출용량(Dose)의 측정법이다.

"나노물질 노출 용량(예. 입자수, 입자크기분포, 입자표면적, 총량 등)"은 일반적인 방법으로 정확하게 측정하기 쉽지 않으며, 또한 노출 후 배지의 조건 등에 따라 입자의 크기 및 농도에 있어서 많은 변화를 수반하게 되므로, 나노물질 분산액의 준비방법, 노출시간이나 배지등 주변 환경에 따라 위해성 평가 결과의 재현성이 크게 나빠질 수 있다. 한 예를 들면, 나노물질을 세포 배양액에 분산시키면, 세포배양액의 높은 이온세기로 인하여 나노물질은 세포가 배양되기 전부터 수 시간 내에 응집되고 침전하는 현상이 발생한다. 따라서 표면부착형 세포를 이용한 인 비트로 시험법의 경우 실제로 노출된 나노입자의 농도는 초기 주입한 나노물질의 농도와 비하여 입자수, 입자 분포들에 있어서 많은 차이가 발생할 수 있다

수용액에 분산되어 있는 나노물질의 입자크기를 측정하는 일반적인 방법으로는 동적광산란분석법(Dynamic light scattering, DLS)을 이용하지만 이는 수 mL이상의 시료 양이 필요하고, 다양한 크기의 입자가 섞여있는 경우 정확한 입자크기분포의 측정이 어렵다. 앞에서 언급한 것처럼 나노입자가 세포 배양액에 노출되는 경우 수 마이크로 미터로 입자가 커질 수 있기 때문에 수십나노에서 수 마이크로 미터까지의 다양한 입자크기분포를 동시에 측정할 방법이 필요하고, 세포에 노출된 나노입자의 농도 변화를 실시간으로 측정할 방법이 필요하다.

또한, 이렇게 응집 후 침전된 입자에 의한 세포독성과 세포배지에 잘 분산되어 있는 나노입자가 유발하는 세포독성은 그 독성 기작이 상이할 수 있으며, 실제 나노입자에 의한 독성에 비하여 wellplate 바닥면으로 갈수록 "응집 및 침전"으로 인하여 높은 농도가 분포하는 나노입자의 불균일성으로 인하여 위해성 평가시 실제 나노입자의 독성보다 과대하게 평가할 가능성이 많으므로, 이러한 오류 원인들을 분명히 구별돼야 할 것이다. 한 예로, 응집 및 침전이 일어난 상태에서는 용액상에서 나노입자가 비균질한 상태로 분포하므로 투여한 나노입자의 농도에 비하여 세포 주변에는 과도한 나노입자 농도가 존재하게 된다. 이로 인한 나노입자 독성의 과대평가도 현재 사용되고 있는 나노입자의 위해성 평가 시스템에서 커다란 오류 중 하나이다.

상기 문제점들과 관련하여 이하 구체적인 방법에 따른 예시들을 통해 보다 상세히 설명한다.

우선, 본 발명과 관련성이 높은 종래 기술은 다음을 예로 들 수 있다.

ㆍ UV / VIS 분광계 : 본 발명과 유사한 종래 기술로써 용액상 분산된 나노입자의 농도를 정량하는데는 UV / VIS 분광계를 사용하여 나노입자의 산란 또는 흡수에 의한 Optical Density의 변화를 측정한다. 이 분광계는 자외선부터 가시광선 영역까지 빛의 파장을 바꾸어가면서 투과되는 빛의 양을 측정하여 나노입자를 포함한 분석시료의 농도를 결정할 수 있다. 분석시료의 농도가 진할수록 분석시료가 흡광 또는 산란하는 파장대역의 빛의 투과율은 감소하기 때문에 이것이 가능하다.

ㆍ 동적 광산란 (Dynamic light scattering, DLS) : 빛의 경로에 놓인 나노입자는 빛을 산란시킨다. 이 산란광의 세기는 나노입자의 브라운운동에 의하여 시간에 따른 함수로 변화하게 된다. 용액에 분산된 입자는 그 크기가 작을수록 브라운운동을 빠르게 하기 때문에 산란광의 변동속도 또한 빠르게 변한다. 이러한 성질을 이용하여 자기 상관함수 (autocorrelation Function)를 적용하면 입자들의 확산계수를 구할 수 있고 이로부터 입자의 수력학적 크기 (hydrodynamic size)를 구할 수 있다. 일반적으로 DLS분석법에서 제공해주는 나노입자의 분포는 number, volume, intensity의 3가지에 대한 정보를 제공하고 있다. Intensity는 DLS로 측정할 때 나오는 신호의 세기이며, volume는 부피에 대한 분포로 변환하였으며, number 그래프는 입자의 개수 분포를 나타낸 그래프이다. Intensity 그래프는 다양한 크기의 입자의 분포를 알 수 있는 장점이 있지만, 마이크로 크기의 입자는 단위 입자당 유발하는 신호가 커서 실제 대부분의 분포를 차지하는 것처럼 나타내는 단점이 있다. 반면 number 그래프는 입자 개수의 분포를 나타낸다는 장점이 있지만, 마이크로 사이즈는 거의 배제되어 그래프가 그려지는 단점이 있다.

ㆍTEM (Transmission electron microscopy) : 투과전자현미경(TEM, transmission electron microscopy)은 분말형태의 나노입자의 크기, 모양, 표면상태와 같은 나노물질의 형태를 분석할 수 있는 대표적인 장치이다. 나노입자들의 응집되기 전 각각의 입자의 크기인 primary size를 분석하기 위해서는 대표성 있는 충분한 개수의 나노입자의 TEM사진을 얻은 후 이미지 분석 프로그램을 이용하여 크기 분포를 분석 할 수 있다.

ㆍ XRD (X-ray Diffraction) : x 선 회절분석법은 분말형태의 나노입자의 결정상 및 크기를 실험적으로 측정할 수 있게 해준다. 특히 나노입자의 크기는 Scherrer식을 이용하여 최소결정의 크기를 계산할수 있다. 예를 들자면 결정입자가 작아질수록 (<0.2㎛) 회절된 x선의 퍼짐현상이 나타난다. 회절X선 peak의 반가폭(FWHM)을 측정하여 회절선의 퍼짐 정도를 정량화하고 이를 통하여 입자의 크기를 추정해 낼 수 있다.

ㆍ ICP-MS (Inductively coupled plasma mass spectrometry) : 화학 분석에서의 미량 원소 분석 방법은 중량법, 발색법, 원자흡광광도법, X선 형광법, 원자발광광도법 등이 발달되었으며, 그 중 유도결합 플라즈마 원자발광분광법(ICP-AES, Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy)은 현재 가장 널리 쓰이고 있는 분석 방법이다. 유도결합 플라즈마 질량분석법(ICP-MS, Inductively coupled plasma mass spectroscopy, 이하 ICP-MS로 칭함)은 ICPAES와 같이 분석 소스(source)로 고온의 플라즈마를 사용하고 있으며, 다 원소 동시 분석 및 빠른 분석 시간을 갖는 공통점이 있다. 하지만 ICP-MS는 ICP-AES 보다 수십에서 수천 배까지 검출한계가 낮기 때문에 보다 미량 원소 분석이 가능하다. 이러한 분석법들은 나노입자의 총량을 결정하는데 주로 사용된다.

즉, 나노입자에 노출된 세포의 변화를 관측하기 위하여는 나노입자용액을 세포배양액에 노출시키기전에 UV/VIS 분광계, ICP-MS를 이용하여 그 농도를 분석하고, 동적 광 산란분석법(DLS), TEM을 이용 그 크기분포를 분석해 왔다. 하지만 이러한 방법은 다음과 같은 문제점들을 불러일으킬 수 있다.

(1) 나노입자의 응집 및 침전으로 인한 배지내 농도 불균질성

우선 산업적으로 널리 사용되고 있는 일반적인 제조나노입자들을 세포배지 (예, RPMI-1640, DMEM)에 분산시켰을시 도 1과 같이 나노입자는 세포배지의 높은 이온세기에 의해 대부분 응집되어 침전이 일어난다.

제조나노입자를 wellplate 바닥면에 세포를 배양하여 독성물질을 노출하는 기존의 in vitro 기반 평가 방법으로 세포독성을 평가했을시 나타나는 독성평가 결과는 응집 및 침전에 의하여 변화하는 나노입자의 농도를 고려하지 않고 수행되기 때문에 나노입자와 세포반응의 정량적인 관계를 얻기 어렵다. 따라서 세포반응이 나타나는 시점까지의 나노입자의 농도 변화를 실시간으로 측정할 수 있는 방법이 필요하다.

(2) 기존 나노입자 분석법의 한계

나노물질의 농도 측정을 위한 UV/VIS 분광계는 나노입자의 산란 또는 흡수에 의한 Optical Density의 변화를 측정하므로 나노입자의 종류나 수용액상의 변화(예, 응집, 표면변화 등)에 의하여 산란 또는 흡수특성이 변화되는 경우 그 측정값의 정량성이 떨어지게 된다.

ICP-MS의 경우 시료안에 존재하는 분석대상 원소의 총량을 검출하는 분석법이므로, 실제 나노입자 뿐만 아니라 용액상 다른 형태로 존재하는 같은 성분의 물질들(예, 입자로부터 용해된 이온) 또한 같이 검출되어 서로 구분할 수 없게 되는 문제점이 있다

동적 광 산란법(DLS)의 경우 다양한 크기의 입자가 용액내에 동시에 존재하는 경우 (polydisperse) 큰 입자로부터의 산란광이 크기 때문에 작은 입자의 정보는 얻기 어려워진다는 문제점이 존재하고, 수 ppm의 낮은 농도의 용액은 측정이 어렵다는 문제가 있다.

TEM 또는 XRD를 이용한 입자크기의 분석은 나노입자의 크기정보를 제공해 주고 있지만, 건조된 분말상태에서만 측정되기 때문에 실제 용액상에 분산된 나노입자의 정보를 정확히 알 수는 없다. 전처리과정에서 시료의 상태가 변할 수 있는 가정을 배제할 수 없기 때문이다. 또한 전처리 과정이 필요하기 때문에 실시간 나노입자의 크기변화를 실시간 검출하기는 어렵고, 결과로 얻어지는 영상은 시료 전체 중 극히 일부만을 보여 주기 때문에 대표성의 문제 또한 내재되어있다.

따라서, 상기 문제점들을 해결하기 위해, 본 발명에서는 나노입자의 세포독성평가에서 세포의 성장 또는 사멸 등에 대한 분석법을 실시간으로 측정된 나노입자의 농도, 크기분포와 관련하여 해석함으로써, 기존의 보고된 나노독성평가의 문제점들을 보완할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

즉, 본 발명은 나노물질이 세포 배양액에서 응집되어 발생하는 농도변화, 크기변화로 인해 유발되는 오류원인들을 제거하고, 나노입자와 세포간의 상호작용으로 생긴 세포의 반응만을 선택적으로 측정 분석한다.

일 관점에서, 본 발명은 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용한 나노물질 위해성 실시간 평가방법 및 시스템에 관한 것이다.

선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용하여 수용액상 나노입자의 응집 및 침전으로 인한 나노입자의 농도 균질성의 변화를 실시간 보정 하고, 세포배지내에서부터 세포로 전달되는 나노입자의 용량(Delivered & Cellular dose)과 세포내에 축적되는 나노물질의 양 (Cellular uptake of NPs) 을 실시간으로 측정함으로써 실제 세포배지내 및 세포에 전달되는 용량(Delivered & Cellular dose) 측정상의 오류를 해결하는 객관적인 분석법에 관한 것이다. 즉, 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용하여 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수와 크기를 측정하는 것을 일 특징으로 한다.

용액상에서 나노입자가 응집 및 침전을 일으키는 경우, 예를 들어, 200 nm 이상의 수용액상 크기를 갖는 나노입자는 용액 내에서 응집 및 침전이 일어나서 상기 나노입자가 매우 비균질한 상태로 분포하므로, 투여한 초기 나노입자의 농도에 비하여 well plate 바닥면의 세포 주변에는 과도한 나노입자 농도가 존재하게 된다.

일반적인 화학물질의 경우엔 응집이나 침전 현상이 없으므로 확산에 의한 세포내 전달이 주요 과정이지만 응집이나 침전 현상이 일어나는 나노물질의 경우엔 침전으로 인한 나노물질 농도의 비균질성 및 수동적인 세포내 전달이 나노물질 독성 평가에 있어서 중요한 오류의 원인이 된다. 또한 생체 내 혈관등의 기관들에서 조건과 비교하여도 세포가 상하좌우에 입체적으로 분포되어 있어 종래의 바닥면의 세포만을 고려한 시험법에 비균질 나노입자를 적용했을 때는 왜곡된 독성결과가 나타날 수 있다.

도 1은 Justin G. Teeguarden et al., 2007년 발표한 논문에서 제시한 내용으로 나노입자가 실제 세포배양액에 노출되면 응집 및 침전에 따라 그 농도가 변하므로 나노입자의 세포의 반응 또한 초기 노출 농도로만 정량한다면 오류가 발생한다는 내용이다. 또한 나노입자의 크기에 따라 확산 및 침전속도가 다르고, 이에 따라 높이에 따른 농도 불균질성이 발생할 수 있음을 보여준다. 따라서 배지의 바닥에서 배양되는 세포의 경우 나노입자의 침전에 의한 영향으로 세포반응이 더 크게 발현될 수 있다.

본 발명에서는 이러한 문제를 개선하기 위하여 본 발명은 최소 2개 이상의 "선택적 평면 조사 현미경법"(SPIM)을 조합한 나노입자 실시간 모니터링 법을 이용하여 나노입자의 위해성 평가가 실시되고 있는 세포배지내 분산된 나노입자 수의 정량적 분석법과 입자의 크기변화를 측정하는 방법을 제공하고 이들 측정값들을 이용하여 나노입자의 세포배지내 응집 및 침전계수, 세포내 나노입자 축적량 등을 제공한다.

본 발명의 구체적인 일례로서, 다음을 포함하는,나노물질 위해성 실시간 평가방법 및 시스템에 관한 것이다:

세포배지에 나노물질을 노출시키는 단계;

2이상의 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용하여 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수와 크기를 측정하는 단계; 및

상기 측정결과를 이용하여 나노물질의 세포에 대한 영향을 분석하는 단계.

그리고, 이 때, 상기 나노물질의 세포에 대한 영향 분석은 세포배지 내 나노물질의 응집 및 침전계수 계산, 세포 내 나노물질의 축적량 계산, 및 세포사멸과의 연관성 확인을 통해 수행될 수 있다.

상기 방법에 있어서, 우선, 분석대상 세포를 배양한 세포배지에 나노물질을 노출시킨다. 그리고 2이상의 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용하여 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수와 크기를 측정한다

상기 세포 배양에 필요한 조건 및 방법 등은 당업계에 공지된 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 배양한 세포 배지에 나노물질을 노출시켜 세포사멸을 유도한다.

위해성이 염려되는 나노 물질(나노 입자)로는 표 1에 기재되어 있는 이하와 같은 물질을 예로 들 수 있는데, 금나노, 은나노, SWCNT(single-walled carbon nanotube), MWCNT(multi-walled carbon nanotube),풀러린(fullerene, C60), 철 나노입자, 카본블랙, 이산화티탄, 산화알루미늄, 산화세륨, 산화아연, 이산화규소, 폴리스틸렌, 덴드리머, 나노클레이 등에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 금 나노입자를 사용하였다.

이러한 나노 물질의 노출에 따른 위험성(독성)를 파악하고 이해하기 위해서는 무엇보다도 나노 물질의 물리 화학적 특성의 이해와 물리적 거동을 파악하고 세포 생리학적인 생체 내 작용의 이해가 필요하다.

(표 1)

본 발명에서, 세포배지로의 나노 물질의 노출은 통상의 나노물질 노출장치를 이용하여 수행할 수 있다.

예를 들어, 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane), PDMS), 폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides), 폴리우레탄(polyurethanes) 등의 고분자 재질로 제작된 미세유체 칩 또는 wellplate용 노출기구를 사용해도 무방하다.

본 발명의 일 실시예에서는 PDMS 구조체를 만들어 샘플 홀더로 사용하였다. 특히, 나노입자의 용액이 담기는 본 발명에서의 샘플 홀더의 크기는 기존의 수 밀리 리터의 부피를 갖는 샘플 홀더에 비해 더 작은 용량을 갖도록 제작하여 대류 현상 및 주변 진동에 의한 용액의 흐름을 억제토록 한다. 이를 통해 레이저 기반 암시야 및 형광 현미경을 이용한 용액에 분산된 나노입자의 관찰시 나노입자가 브라운 운동 이외의 요인으로 움직이는 것을 줄인다.

더욱 바람직하게는 벽면의 산란을 줄이기 위하여 샘플 홀더의 표면을 코팅하여 사용한다. 예를 들어, PDMS 홀더에 PDMS를 n-hexane에 희석한 pre-polymer 용액으로 코팅함으로써 PDMS 표면의 거칠기로 인하여 난반사를 유발하던 표면을 더 매끄럽고 투명하게 개선할 수 있다.

또한, 상기 샘플홀더를 기존의 미세유체 칩의 채널과 결합하여 미세유체 칩 내의 분산된 나노물질의 정량 및 크기 분석이 가능토록 할 수도 있다. 이 때, 미세유체칩의 마스터 몰드 위에 테프론 구조물을 올리고 기존의 미세유체칩 제작방법에 따르거나, 혹은 PDMS의 미세유체 칩 층과 테프론 틀을 이용한 PDMS 층을 각각 만든 후 산소 플라즈마 조건으로 두 층을 붙이는 방법을 사용할 수 있다.

2가지 이상의 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)은 상기 나노물질 노출장치(기구)에 결합하여 사용할 수 있는데, 예를 들어, 도 2에 도시된 레이저 기반 암시야의 형광 현미경으로 구성되어 이하와 같은 특징을 가진다:

IRIS 및 슬릿(slit)에 의한 레이저 빔 두께의 1차 감소;

실린더 렌즈(cylinderical lens)에 의한 판 모양으로의 빔 형태 변형; 및

대물렌즈(objective lens)에 의한 빔 두께의 2차 감소에 의해 빔의 두께를 수 마이크로 미터로 줄임으로써 빔의 투과 경로를 벗어나는 입자의 산란 혹은 형광 신호를 배제할 수 있기 때문에 배경잡음신호(background noise)를 최소화 하고 고분해능, 고명암비의 영상을 얻을 수 있게 된다.

도 2에 본 발명의 SPIM법을 이용할 수 있는 레이저 분광 시스템의 개략도를 도시하고 있다.

여러 방향으로 레이저가 조사될 수 있고, iris, slit, cylindrical lens, objective lens등으로 레이저 빔이 얇고 넓게 성형된다. 또한 프리즘을 통해 샘플로 주입되는 각도 또한 변경될 수 있다. 샘플로부터 발생된 산란 혹은 형광은 detecting objective lens (도면에서는 생략) 및 CCD 카메라 등으로 수집되어 이미지로 저장 된다.

용액내 분산된 나노입자를 레이저를 이용한 산란 또는 형광법으로 그 수를 직접 세어 용액내 나노입자 농도의 정량적 측정이 가능하고, 브라운 운동하는 나노입자의 단위 시간에 대한 이동거리를 측정함으로써 나노입자의 크기 분포의 변화를 실시간 분석할 수 있다. 이러한 나노입자 실시간 분석을 위하여 본 발명에서는 최소 2가지 이상의 SPIM(Selected Plane Illumination Microscopy)법을 조합하여 사용한다.

한 예로 세포배지내 응집계수 측정이 목적인 경우 사용되는 SPIM법으로는 최소 2개 이상의 시료높이에 따라 PLS(parallel light sheet) 모드의 SPIM을 사용하고, 세포내 나노입자 축적량을 실시간 모니터링하기 위해서는 앞에서 사용한 PLS 모드 SPIM와, HILO(Highly inclined and laminated optical sheet) 모드 또는 TIR(Total internal reflection) 모드의 SPIM을 조합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 PLS 모드 SPIM와 HILO 모드 SPIM을 조합하여 사용한다.

상기 2이상의 SPIM을 이용하여 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수와 크기를 측정한다.

이 때, 세포배지 내 분산된 나노물질의 수의 측정은 나노물질 이미지 분석을 통해 실시간으로 이루어질 수 있다. 이미지 분석은 동영상 또는 연속촬영된 사진을 이용하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, imageJ를 이용한 이미지 분석법을 사용할 수 있다.

그리고, 나노물질의 브라운 운동에 따른 확산계수 D를 이용하여 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 크기를 분석한다.

이 때, k는 볼츠만 상수, T는 온도, η는 용액의 점도, r은 나노물질(나노입자)의 반지름이다.

세포 배지내 분산된 나노입자 크기변화를 실시간 측정하기 위하여 나노입자 이미지의 동영상 (또는 연속 촬영된 이미지들의 모음)을 이미지 분석하고 나노입자의 움직인 거리 제곱의 평균인 mean-square-displacements(MSD)로부터 브라운 운동을 하는 나노입자의 확산계수, D를 측정할 수 있다. 이를 stoke-einstein 식인 상기 식에 대입하여 나노입자의 크기를 계산할 수 있다.

상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수와 크기 분석에 의한 나노물질의 세포에 대한 영향은 세포배지 내 나노물질의 응집 및 침전계수 계산, 세포 내 나노물질의 축적량 계산, 및 세포사멸과의 연관성 확인을 통해 분석할 수 있다.

이 때, 상기 세포배지 내 나노물질의 응집 및 침전계수 계산은 PLS(parallel light sheet) 모드의 SPIM을 이용하여 2이상의 시료높이에서의 나노물질 농도 및 크기분포를 측정함으로써 수행될 수 있다.

시료높이가 낮은 부분의 경우 시간에 따라 입자수와 입자의 크기가 증가한다. 반면 시료높이가 높은 부분의 경우 입자는 응집 후 침전하여 시간에 따라 그 수는 감소하고, 분산되어 있는 입자는 크기가 작은 입자만이 남게 된다.

또한, 상기 세포 내 나노물질의 축적량 계산은 PLS(parallel light sheet) 모드의 SPIM; 및 HILO(Highly inclined and laminated optical sheet) 모드 또는 TIR(Total internal reflection) 모드의 SPIM의 조합을 이용하여 수행될 수 있다.

즉, 상기 2가지 이상의 SPIM의 조합을 통해 실제 노출된 나노물질의 농도 및 크기분포; 및 세포 내 축적된 나노물질의 농도 및 크기분포를 측정함으로써 세포 내 나노물질의 축적량을 계산할 수 있다. 브라운 운동하는 입자의 경로를 추적해보면 그 움직임이 둔화되는 시점으로 세포내 축적여부를 결정할 수 있다.

샘플 홀더 아랫면에는 세포가 배양되고, 이 배양액에 분산된 나노입자가 노출될 때 나노입자는 배양액의 조건에 따라 응집, 침전 되어 실제 세포 내로 유입되는 나노입자의 축적량은 배양액에 처음 주입한 양과는 차이가 있을 수 있다. 따라서 실제 세포내 유입되는 나노입자의 양을 측정하기 위하여 HILO 형태의 레이저 광원을 도입할 수 있다. 프리즘을 투과하여 레이저가 바닥면으로 기울어지게 조사되는 HILO형태로 세포 내부의 축적되는 나노입자를 측정할 수 있고, 이와 동시에 샘플의 중간에서 PLS 형태로 분산된 나노입자를 관측할 수 있기 때문이다.

이와 같이, 세포배지내 나노물질의 응집ㆍ침전계수 계산 및 세포내 나노물질의 축적량 계산을 바탕으로, 흡광염색법 또는 형광염색법 등의 염색법에 의한 세포 사멸 정량분석 결과를 조합하여, 실제 세포가 흡수한 나노입자에 대한 세포반응 관계를 분석할 수 있다.

나노 물질은 시간이 지남에 따라 세포 내에 확산(diffusion)되어 다양한 농도를 가지게 되고, 세포층 내의 세포들은 상기 나노 물질에 일정시간 노출됨으로써 세포사멸 과정을 거치게 된다,

이러한 세포의 사멸과정은 세포고사, 괴사 등으로 나누어지는데 정상상태에서의 세포분열과 반대로 유해 물질에 의해 노출로 인한 손상 받은 세포는 퇴화하는 방향으로 변화가 일어나기 때문에, 정상세포와 대비하여 다른 대사과정 즉, 그 중에서도 세포가 퇴화되는 죽음의 과정을 알아보면서 세포의 유해성물질에 대한 반응 기작을 확인할 수 있다.여기서 세포의 죽음의 과정을 두 가지로 분류하면, 세포의 손상이 심해서 세포에서는 부종이 일어나고 용해가 일어나 세포 내용물이 밖으로 분출되는 '세포괴사(Necrosis)'라 불리는 세포 죽음의 과정이 일어난다. 또한 다른 세포의 죽음과정은 '세포고사(Apoptosis)'로 특징적으로 세포의 초기의 수축이며, 조직에서는 이웃하고 있는 세포들과 세포-세포 결합이 파괴되는 것을 의미한다. 세포고사 과정에서 세포의 부피는 작아지고 세포질 내의 내막, 리보솜, 사구체와 다른 세포 소기관 등은 수축된다.

상기 세포사멸 정량을 위해 기존의 흡광염색법 또는 형광염색법 등의 염색법을 사용할 수 있는데, 상기 흡광염색은 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), MTS(5-(3-caroboxymethoxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt), WST(4-[3-(4-Iodophenyl)-2(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate) 및 트립판 블루(trypanblue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 흡광염료를 이용하여 수행될 수 있고, 상기 형광염색은 유기형광 염료, 무기나노입자 또는 형광단백질을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, DCF, DiOC6, Hoechest 33432 등의 유기 형광염료; 또는 양자점(QD) 등의 무기나노입자; 또는 GFP, RFP, YFP 등의 형광단백질 등을 사용할 수 있다.

이 때, 흡광염색을 사용하는 경우는, 이후 세포별 이미지 분석(Image Cytometry)을; 형광염색을 사용하는 경우는, 이후 유세포 분석(Flow Cytometry)을 사용하는 경우가 일반적이다. 뿐만 아니라, 상기 염색은 비표지(label-free) 방식으로 이루어질 수도 있다.

상기 세포의 촬영은 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), LED 광원 및 레이저 광원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원; 대물렌즈로부터 모아진 세포영상을 검출하는 CCD(Charge Coupled Device) 카메라: 세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼; 사용되는 흡광염료에 적용되는 최대 흡광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치: 및 상기 CCD 카메라로부터 얻어진 이미지를 분석하여 세포별 흡광인자, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 영상처리 프로그램을 포함하는 세포 영상 분석 장치를 이용하여 실시할 수 있다.

상기 세포사멸 정도의 정량화 단계는 촬영된 이미지로부터 각 세포가 차지하는 면적(area) 및 원형성(Circularity)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형태인자값 또는 흡광인자로서 세포별 평균 흡광도(Mean Absorbance) 및 세포별 총 흡광도(Integrated Absorbance)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포별 흡광도를 분석하여 정량화할 수 있다.

원형성 = 4π x (세포면적 / 세포둘레²)

세포별 평균 흡광도(Mean Absorabnce) = 세포 영역 내 각 픽셀들의 흡광도값의 평균

세포별 총 흡광도 (Integrated Absorbance) = 세포별 평균 흡광도 x 세포가 차지하는 영역의 픽셀 수

세포사멸 정도를 정량화 하는 단계에서 이미지 분석을 통해 얻어진 세포별 흡광도를 포함하는 변수들을 개별적으로 단일 변수분석하여 용량-반응 곡선을 얻고 세포 사멸 진행 정도의 정량화를 실시할 수 있다. 이러한 세포별 흡광 이미지 분석을 이용한 분석과 관련하여는 한국 특허출원 10-2009-0133151호를 참조할 수 있다.

또한, 본 발명에서는 선택적으로, 세포별 이미지 분석법, 유세포 분석법, 또는 정립ㆍ역립 노출장치를 이용한 분석법 등을 추가로 도입하여 본 발명의 방법과 조합하여 이용할 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 유세포 분석 장치는, 상업적으로 판매되는 유세포 분석기 (Flow Cytometry 또는 Fluorescence Activated Cell Sorter)를 이용할 수도 있고, 미세유체 유세포 분석 기구 (microfluidic flow cytometry)를 이용할 수도 있다.

도 11은 미세유체칩과 결합된 본 발명의 SPIM 시스템의 모식도이다. 레이저 광원은 광섬유로 미세유체칩에 전달되고, 칩에 통합된 cylindrical lesn와 프리즘을 이용해 PLS와 HILO등의 조합을 동시에 가능하게 한다. 이를 이용하여 미세유체칩 내부에서의 나노입자의 변화를 실시간 모니터링 할 수 있고, 나노입자의 축적에 의한 세포 반응을 관찰할 수 있다.

특히, 미세유체 유세포 분석 기구는 일 예로써,

자외선 및 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프(tungsten lamp), 수은 및 할로젠 램프, LED 광원 및 레이저 광원 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 광원;

세포로부터 산란 또는 형광방출되는 광신호를 검출하는 PMT(photomultiplier tube) 또는 CCD(Charge Coupled Device) 로 이루어진 검출 장치; 세포층을 포함하는 세포 배양시스템을 배치시키기 위한 세포배양 플랫폼;

사용되는 형광 염료에 적용되는 최대 흡광 또는 형광 영역에서의 이미지를 얻기 위해 광원에서 파장을 선택적으로 통과시키기 위한 장치;

상기 장치로부터 얻어진 Data를 분석하여 세포별 전방(FS) 및 측방(SS) 산란세기, 형광세기, 세포의 개수 및 형태인자값으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포사멸 인자를 추출하고 세포사멸과정을 정량화 할 수 있는 Data처리 프로그램을 포함할 수 있다. 이러한 미세유체 유세포 분석 기구와 관련하여는 한국 특허출원 10-2009-0076436호를 참조할 수 있다.

이와 같이, 본 발명은 실시간 나노입자의 정량적, 크기적 분포를 직접적으로 측정하고, 나노입자의 세포배지내 응집계수, 세포내 나노입자 축적량등을 모니터링함으로써 나노입자의 불균질성으로 인해 발생하는 오류를 줄이고 보다 정확하고 재현성 있는 나노입자 용량-반응관계를 평가할 수 있는 방법을 제공한다.

따라서, 나노 물질의 노출에 따른 위험성(독성)를 정확히 파악하고 이해할 수 있게 함으로써, 나노 물질의 생산, 환경, 건강에 미칠 수 있는 유해성에 대한 안전지침을 확보하는 등에 유용하다.

(실시예)

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 레이저 기반 암시야 및 형광 현미경 구성

레이저 기반 암시야 및 형광 현미경은 도 2 와 같이 구성되었다.

광원으로 사용되는 레이저는 다양한 파장의 형광 발생을 위하여 여러 파장의 레이저를 동시에 사용할 수 있도록 구성되어 있으며, dichroic mirror를 이용하여 단파장의 레이저는 반사시키고, 장파장의 레이저는 투과하도록 구성하여 여러 파장의 레이저가 동시에 샘플에 도달하도록 하였다.

분산된 빛을 차단하기 위해 iris 및 slit을 이용하여 1차적으로 레이저 빔의 두께를 줄인다. 2차적으로 Cylinder lens를 통해 얇은 판상이 되도록 빔 형태를 변형 시키고, 3차적으로 objective lens를 통해 빔의 두께를 수 마이크로 미터로 줄인다. 빔의 두께를 줄임으로써 빔의 투과 경로를 벗어나는 입자의 산란 혹은 형광 신호를 배제할 수 있기 때문에 고분해능, 고명암비의 영상을 얻을 수 있다. 이를 이용하여 용액내 수~수백 ppb의 농도로 분산된 수십 나노미터의 입자를 관측할 수 있다. 도 3 과 같이 샘플 홀더 앞에 프리즘을 두어 HILO 혹은 TIRF 모드로 관측하는 것도 가능하다. 이때 HILO, TIRF를 결정하는 것은 프리즘의 각도이다.

도 3는 HILO 혹은 TIR 형태의 관찰이 가능한 샘플 홀더의 개략도이다. 샘플과 수평하게 주입되는 레이저는 미세유체칩 앞쪽에 반데르발스 힘으로 부착된 프리즘을 통과하면서 굴절되어 HILO 혹은 TIR을 구현할 수 있다. HILO의 경우 레이저가 수평면에서 수 °로 기울어진 형태로 레이저가 굴절되어 조사된다. TIR의 경우 전반사되는 면에서 evanescent field가 형성되어 바닥면에서 수백 nm 높이 내의 샘플 관찰이 가능하다.

실시예 2. 샘플 홀더의 제작

테프론 주형을 이용하여 PDMS 구조체를 만들어 샘플 홀더로 사용하였다.

나노입자의 용액이 담기는 샘플 홀더의 크기는 2 mm x 5 mm x 3 mm로 cuvet과 같은 기존의 수 밀리 리터의 부피를 갖는 샘플 홀더에 비해 작은 용량을 갖도록 하였다.

또한 벽면의 산란을 줄이기 위하여 1차적으로 테프론 구조체를 이용하여 제작한 PDMS 홀더에 PDMS를 n-hexane에 희석한 pre-polymer 용액으로 코팅함으로써 PDMS 표면의 거칠기로 인하여 난반사를 유발하던 표면을 더 매끄럽고 투명하게 개선하였다.

상기 제작한 샘플홀더를 기존의 미세유체 칩의 채널과 결합시켜 미세유체 칩 내의 분산된 나노물질의 정량 및 크기 분석을 수행하였다.

칩을 다음과 같은 방법으로 제작하였다. 미세유체칩의 마스터 몰드 위에 테프론 구조물을 올리고 기존의 미세유체칩을 제작하는 방법대로 경화제와 PDMS가 1:10으로 혼합된 pre-polymer를 부은 후 60℃ 오븐에서 PDMS를 경화시켰다.

실시예 3. 용액내 분산된 나노입자 수의 실시간 측정

각기 다른 크기의 나노입자가 분산된 용액에서 나노입자 수 측정을 위하여 BBI에서 제조된 15nm 금입자 (0.477 ppm), 30nm 금입자 (0.546ppm), Biterials에서 제조한 50nm SiO2 (0.2ppm) 가 분산된 용액을 각각 관찰하였다.

희석된 용액을 높이 3mm인 샘플 홀더에 채운 후 파장이 473nm인 레이저를 샘플홀더의 벽면에 수직하게 조사하였다. 이때 레이저의 투과 경로에서 산란되어 밝게 보이는 나노입자를 20x 대물렌즈와 CCD 카메라를 이용하여 이미지로 저장한다.

저장된 이미지는 도 4와 같다. 도 4는 DI-water에 분산된 15nm, 30nm 금나노입자와 50nm 실리카 입자를 PLS모드로 관찰한 결과로, 레이저 빔은 얇게 성형되기 때문에 초점면을 벗어난 곳에서는 산란광이 발생하지 않아 배경은 검게 보이고, 레이저 빔의 진행 경로에 위치한 나노입자는 빛을 산란시키므로 밝은 점으로 나타났다.

상기 저장된 이미지를 imageJ를 이용한 이미지 분석법으로 분석하여 나노입자의 수를 측정하였다. 통계적으로 신뢰되는 데이터를 얻기위해 100장 이상의 이미지를 저장하고, 이를 imageJ의 Macro기능을 통해 입자수를 측정하였다. Macro의 Threshold, size 항목에 들어가는 변수는 변경될 수 있고, maximum filter 같은 이미지 보정과정이 있을 수 있다.

실시예 4. 용액내 분산된 나노입자 크기의 실시간 측정

용액내 분산된 나노입자의 영상을 약 50ms 이하의 시간 간격으로 100장 찍은 후 밝은 점으로 나타나는 나노입자의 움직인 거리 제곱의 평균인 mean-square-displacements(MSD)로부터 브라운 운동을 하는 나노입자의 확산계수, D를 측정하였다.

즉, stoke-einstein 식인

에 대입하여 나노입자의 크기를 계산하였다. 상기 stoke-einstein식에서 k는 볼츠만 상수, T는 온도, η는 용액의 점도이고, r은 입자의 반지름이다.

브라운 운동을 하는 나노입자의 자취를 측정하기위해 도 5 와 같이 HILO모드로 15nm와 30nm 크기의 금나노 입자가 분산된 용액을 관찰하였다.

두께 1mm 글라스 위에 각 금나노 용액을 떨어뜨린 후 다시 커버슬립을 덮었다. 덮은 커버 슬립 앞에 밑면의 각도가 약 32°프리즘을 놓게 되면 레이저는 글라스면으로 굴절되어 들어간 후 글라스와 공기면에서 전반사되어 나노입자 용액층으로 약 4.3°굴절각을 가지며 들어가게 되는 것을 확인하였다. 이 때 관측된 나노입자 크기분포는 도 5 와 같이 분포의 중간값은 각각 19.3nm 와 36.7nm로 관측되었다.

실시예 5. 나노입자의 응집 및 침전 속도계수 측정

세포배양액에 노출된 나노입자의 응집 및 침전 속도계수를 측정하기 위하여 도 6과 같은 미세 유체칩을 제작하였다.

도 6은 세포 배양 과정에서 발생할 수 있는 나노입자의 농도 변화, 크기변화를 실시간 모니터링 할 수 있는 시스템의 개략도이다. 서로 다른 높이의 PLS형태의 레이저 빔이 샘플 홀더인 세포 배양 챔버의 서로 다른 높이를 동시에 조사하여 나노입자의 확산, 응집, 침전에 의한 농도 및 크기 변화를 측정하였다.

만들어진 미세 유체 세포 칩 내부에는 세포 배양액으로 채우고 6시간 동안 37℃ 세포 배양기에 두어 세포가 배양 될 수 있는 조건으로 만들어 주었다. 이 후에 미세 유체 세포 칩 중에 세포 배양 채널에는 계대 배양 후에 남은 세포를 일정량 주입하고 37℃ 세포 배양기에서 48시간 이상 배양하였다. 세포를 잘 배양 한 뒤, PBS buffer를 사용하여 나노 입자를 수 ppm에서 수 ppb 의 낮은 농도로 희석하여 미세 유체 세포 칩에 주입하였다.

도 2 과 같이 구성된 "선택적 평면 조사 현미경법"(SPIM)에 기반한 암시야 및 형광 현미경에 준비 된 미세 유체 세포 칩을 놓고 PLS 형태의 laser 광원을 사용하여 실시간으로 세포 배양액에 분산된 나노입자의 응집 및 침전에 따른 개수변화를 관찰하였다.

약 50ms 시간 이하의 시간간격으로 100장의 분산 된 나노입자의 연속 적인 이미지를 얻었다. 30분 후 약50ms 시간 간격으로 100장의 이미지를 또 얻었다. 이렇게 30분 간격마다 50ms 시간 이하의 시간간격으로 100장의 연속된 영상을 총 10시간 동안 수집하였다. 수집된 영상으로부터 시간에 따른 나노입자의 개수 변화 및 크기변화를 측정하여 나노입자의 응집 및 침전에 따른 개수 변화 속도 및 크기변화 속도를 측정하였을 때 도7과 같은 결과를 예측할 수 있다.

즉, 시간이 지남에 따라 분산된 나노입자가 침전 및 응집되므로 분산된 나노입자의 아랫쪽을 관찰하는 LS#1의 경우는 나노입자는 시간이 지남에 따라 그 크기가 커져 가라앉아 그 수가 증가하였다. 그리고, 분산된 용액의 위쪽을 보는 LS#2의 경우는 시간이 지남에 따라 응집되어 그 크기가 커진 입자는 가라앉아 위쪽에 남아있지 않게 되기 때문에 점차 그 수는 감소하고, 입자 크기는 작은 입자만이 남게되는 경향을 보임을 나타냈다

다시 말해, 관찰하는 높이가 낮은 부분은 시간에 따라 입자수는 증가하고, 입자의 크기도 증가하지만, 높이가 높은 부분은 입자의 응집 및 침전에 의해 시간에 따라 그 수는 감소하고, 크기도 작은 입자만이 남게 되었다.

실시예 6. 세포내 나노입자 축적량 측정

샘플 홀더 아랫면에는 세포가 배양되고, 이 배양액에 분산된 나노입자가 노출될 때 나노입자는 배양액의 조건에 따라 응집, 침전 되어 실제 세포 내로 유입되는 나노입자의 축적량은 배양액에 처음 주입한 양과는 차이가 있을 수 있다.

따라서 실제 세포내 유입되는 나노입자의 양을 측정하기 위하여 도 8과 같이 HILO 형태의 레이저 광원을 도입하였다. 프리즘을 투과하여 레이저가 바닥면으로 기울어지게 조사되는 HILO형태로 세포 내부의 축적되는 나노입자를 측정할 수 있고, 이와 동시에 샘플의 중간에서 PLS 형태로 분산된 나노입자를 관측할 수 있기 때문이다.

도 8은 세포내부에 축적되는 나노입자의 양을 측정하기 위한 HILO 모드와 용액내 분산된 나노입자를 동시에 측정하기 위한 PLS가 결합된 형태의 개략도이다. 샘플 홀더 바닥면에 배양되는 세포를 가로지르는 HILO형태의 광원으로 세포내에 축적된 나노입자를 직접 측정하면서(HILO#1) 샘플홀더 중간을 가로지르는 PLS형태의 광원으로 시간에 따라 변하는 나노입자를 모니터링하였다.(LS#2)

그 결과, 도 9와 같이 세포내 축적되는 양은 시간이 지남에 따라 증가하는 반면(HILO#1) 세포 위쪽의 분산된 나노입자의 양은 시간이 지남에 따라 감소하였다(LS#2).

브라운 운동하는 입자의 경로를 추적해보면 그 움직임이 둔화되는 시점으로 세포내 축적여부를 결정할 수 있으므로, 실제 HILO형태로 세포와 배양액에 분산된 입자를 관찰하였을 때의 결과를 도 10에 나타내었다.

그 결과, 세포에 축적되기 전 분산된 입자가 세포 표면에서 브라운 운동을 하고 있음을 관찰되었다.

한편, 나노 입자에 노출 된 세포는 세포 사멸과 관련 되는 흡광염료를 사용하여 염색한 후 이미지를 촬영하고 세포 사멸 정량분석을 실시하였다.

흡광염색에 사용되는 흡광염료로는 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide))를 사용하였다. 획득한 이미지로부터 Image J라는 소프트 웨어를 사용하여 이미지 분석(Image Cytometry)을 실시하였다. 분석 된 결과로부터 흡광인자 및 원형성에 해당하는 정보를 이용하여 세포의 사멸 정도를 정량적으로 분석하였다.

그리고, HILO형태로 측정한 실제 세포내부에 축적된 나노입자의 양과 이미지 분석법으로 측정한 세포 사멸정도를 연관시킴으로써 실제 세포가 흡수한 나노입자에 대한 세포반응 관계를 분석하였다.

Claims (17)

1. 세포배지에 나노물질을 노출시키는 단계;
   2이상의 선택적 평면 조사 현미경(Selective Plane Illumination Microcopy, SPIM)을 이용하여 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수와 크기를 측정하는 단계;
   상기 측정결과를 이용하여 나노물질의 세포에 대한 영향을 분석하는 단계를 포함하고,
   상기 나노물질의 세포에 대한 영향 분석은 세포배지 내 나노물질의 응집 및 침전계수 계산, 세포 내 나노물질의 축적량 계산, 및 세포사멸과의 연관성 확인을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 나노물질 위해성 실시간 평가방법.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 SPIM의 이용은
   IRIS 및 슬릿(slit)에 의한 레이저 빔 두께의 1차 감소;
   실린더 렌즈(cylinderical lens)에 의한 판 모양으로의 빔 형태 변형;
   대물렌즈(objective lens)에 의한 빔 두께의 2차 감소에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 수의 측정은
   나노물질 이미지 분석을 통해 실시간으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 나노물질 이미지 분석은 동영상 또는 연속촬영된 사진을 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 세포배지 내 분산된 나노물질의 크기의 분석은
   나노물질의 브라운 운동에 따른 확산계수 D를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법:
   

   

   
   이 때, k는 볼츠만 상수, T는 온도, η는 용액의 점도, r은 나노물질의 반지름이다.
   
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 세포배지 내 나노물질의 응집 및 침전계수 계산은
   PLS(parallel light sheet) 모드의 SPIM을 이용하여 2이상의 시료높이에서의 나노물질 농도 및 크기분포를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제1항에 있어서, 상기 세포 내 나노물질의 축적량 계산을 위해
   PLS(parallel light sheet) 모드의 SPIM; 및
   HILO(Highly inclined and laminated optical sheet) 모드 또는 TIR(Total internal reflection) 모드의 SPIM의 조합을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 세포 내 나노물질의 축적량 계산은
    실제 노출된 나노물질의 농도 및 크기분포; 및 세포 내 축적된 나노물질의 농도 및 크기분포를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 제1항에 있어서, 상기 세포사멸과의 연관성 확인은
    흡광염색법 또는 형광염색법을 이용한 염색법으로 세포 사멸 정량분석 결과와 세포 내 나노물질의 축적량 계산결과를 조합하여 분석함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제11항에 있어서, 상기 흡광염색은 MTT(3-(4,5-dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)), MTS(5-(3-caroboxymethoxyphenyl)-2H-tetra-zolium inner salt), WST(4-[3-(4-Iodophenyl)-2(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]1,3-benzene disulfonate) 및 트립판 블루(trypanblue)로 이루어진 군으로부터 선택되는 흡광염료를 이용하여 수행되고, 상기 형광염색은 유기형광 염료, 무기나노입자 또는 형광단백질을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제1항에 있어서, 상기 SPIM은 나노물질 노출장치에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 나노물질 노출장치는 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane),PDMS),폴리메틸메타클릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 폴리아크리레이트(polyacrylates), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리시클릭 올레핀(polycyclic olefins), 폴리이미드(polyimides) 및 폴리우레탄(polyurethanes)으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 고분자 재질로 제작된 미세유체 칩 또는 wellplate용 노출기구를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
15. 제1항에 있어서, 상기 나노물질은 금나노, 은나노, SWCNT(single-walled carbon nanotube), MWCNT(multi-walled carbon nanotube),풀러린(fullerene, C₆₀), 철 나노입자, 카본블랙, 이산화티탄, 산화알루미늄, 산화세륨, 산화아연, 이산화규소, 폴리스틸렌, 덴드리머, 나노클레이로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 나노물질인 것을 특징으로 하는 방법.
    
16. 제1항에 있어서, 상기 나노물질 위해성 평가방법은
    유세포 분석법, 세포 이미지 분석법, 또는 역상노출기구를 이용한 분석법과 조합하여 수행될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 나노물질 위해성 평가방법은 미세유체칩과 결합되어 수행될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.

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