JPH0923896A - 微小細胞の計数測定装置及びその計数測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 食品プラント，廃水処理プラント，医薬品製
造プラントにおける原料（原水）や製品（処理水）およ
び製造（処理）プロセス等における微小細胞の計数を測
定する測定装置及び測定方法を提供する。 【解決手段】 特定の種類の微小細胞を特異的に検出し
計数を測定する装置において、蛍光物質が付いた抗体と
細胞を抗原抗体反応させ、該抗原抗体反応後の細胞を含
有する液を、連続的に通過測定するためのセルＶ₂ と、
該セルＶ₂ 内の細胞含有液の蛍光物質を励起するに必要
な波長を有する光源１と、該抗原抗体反応後の細胞に付
いた蛍光物質の発する蛍光を受光するための受光素子１
０と、該受光素子の出力をカウントするパルスカウンタ
１１とを設けてなり、且つ上記セルＶ₂ は、測定部にお
いて該測定部の被測定物の流れ方向と直交する断面形状
が横方向に長く縦方向に短い長方形であり、上記光源１
からの励起光を照射し、横方向に長い正面部から細胞に
付いた蛍光物質の発する蛍光を上記受光素子１０により
受光させ、計数を測定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、特に食品プラン
ト，廃水処理プラント，医薬品製造プラントにおける原
料（原水）や製品（処理水）および製造（処理）プロセ
ス等における微小細胞の計数を測定する測定装置及び測
定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、細胞の計数方法として広く用
いられている方法としては、寒天培養法がある。この方
法は微生物の栄養源を溶かし込んだ寒天に試料を分散さ
せて培養し、該寒天にコロニーを形成させ、このコロニ
ー数を計数するもので寒天の栄養源の種類を変える事に
より、試料中に含有される特定の種類の細胞数を求める
ものである。

【０００３】しかしながらこの方法は、培養に数日を要
するため、結果の判別には、長時間必要であり、原料，
製造プロセスや製品管理に支障をきたす事が多い。

【０００４】一方、細胞と蛍光物質の付いた抗体とで抗
原抗体反応を行った後の試料を、蛍光顕微鏡下で蛍光の
輝点としてとらえて、特定の種類の細胞数を求める方法
が提案されている。

【０００５】しかしながら、この方法は、細胞が微小な
ものでは蛍光の輝点を目視等で検知出来ないという問題
がある。または検知出来たとしても、細胞の液中濃度が
１０⁷ 個／ml程度以上でないと顕微鏡視野内に計数上必
要な輝点数が得られないので、計数値の測定に誤差を生
じるという問題がある。

【０００６】更にこの方法では一視野で測定値を求める
と誤差が大きくなりすぎるので、数多くの視野について
計数する必要があり、抗原抗体反応から顕微鏡下での計
数までを含めると、その測定に１日以上を要するという
問題がある。

【０００７】この様に従来の方法では測定に長時間を要
する、または測定出来る濃度に制限が有る、更には測定
出来ない場合が有る等の不具合が有った。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】前述のごとく、従来法
は培養に数日間という長時間を要したり、蛍光の輝点が
弱く蛍光顕微鏡で検出出来ない場合が有り、検出出来て
も測定可能濃度が１０⁷個／ml程度以上と制限が有る等
の問題点を有する。

【０００９】本発明は短時間で特定の種類の微小細胞を
選択して、かつ計数出来る測定装置及びその測定方法を
提供することを目的とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成すべく本
発明者等は鋭意研究を重ねた結果、以下のことを知見し
た。

【００１１】すなわち、先ず本発明者等は微小細胞の例
として乳酸菌を取り上げ、乳酸菌に５（and ６）カルボ
キシフルオレセインジアセテート（以下「Ｃ−ＦＤＡ」
という）を作用させた。上記Ｃ−ＦＤＡは、細胞内に入
り込み、細胞内に存在するエステラーゼにより加水分解
され、細胞内に蛍光物質である５（and ６）カルボキシ
フルオレセインとなる。

【００１２】従って、上記Ｃ−ＦＤＡを作用させた後の
細胞に、励起光を照射すると細胞が一つ一つ蛍光を発生
するようになる。このＣ−ＦＤＡを作用させた後の細胞
を、後述する実施例に示す計数装置によって蛍光輝点の
数として計数することを試みたが、各細胞の蛍光強度が
弱く計数出来なかった。

【００１３】そこで、本発明者等は蛍光物質の付いた抗
体と抗原である細胞とを抗原抗体反応させ、特定の種類
の微小細胞のみに蛍光物質を付けた。その際に、抗原抗
体反応後の細胞は抗体を介して複数個の細胞が結合する
抗原抗体反応条件を与えた。また、試料中の蛍光物質の
付いた細胞（複数細胞でひとつの粒子となっている）
に、励起光を照射して生じる蛍光を高感度に検出し得る
計数装置を用いて蛍光による輝点を計数した。

【００１４】すなわち、高感度な計数装置を用いること
と一粒子の蛍光を強いるものとすることとで、短時間に
特定の種類の細胞を従来法よりはるかに低濃度域で測定
出来ることを種々検討の結果知見し、本発明を完成させ
たものである。

【００１５】＜本発明の計数測定装置の構成＞係る知見
に基づく本発明の特定微小細胞の計算測定装置の構成
は、特定の種類の微小細胞を特異的に検出し計数を測定
する装置において、蛍光物質が付いた抗体と抗原である
細胞とを抗原抗体反応させ、該抗原抗体反応後の細胞を
含有する液を、連続的に通過測定するためのセルと、該
セル内の細胞含有液の蛍光物質を励起するに必要な波長
を有する光源と、該抗原抗体反応後の細胞に付いた蛍光
物質の発する蛍光を受光するための受光素子と、該受光
素子の出力をカウントするカウンタとを設けてなり、且
つ、該セルは測定部において該測定部の被測定物の流れ
方向と直交する断面形状が横方向に長く縦方向に短い長
方形であり、上記励起光を照射し横方向に長い正面部か
ら細胞に付いた蛍光物質の発する蛍光を受光素子により
受光させることを特徴とする。

【００１６】上記微小細胞の計数装置において、上記励
起光が、被測定物の流れ方向と直交する断面形状が横方
向に長く縦方向に短い長方形であるセルの縦方向に短い
側面部から照射されることを特徴とする。

【００１７】上記微小細胞の計数装置において、微小細
胞と蛍光物質付き抗体との抗原抗体反応により、複数個
の細胞が抗体を介して結合し、反応前の生体より大きな
粒状物質となり、元の細胞に蛍光物質を付けた場合より
その粒状物質に含まれる蛍光物質量が多くなり、励起光
を照射した際の粒子からの蛍光量が増大出来ることを特
徴とする。

【００１８】上記微小細胞の計数装置において、微小細
胞と一次抗体とを反応させた後に、蛍光物質の付いた二
次抗体を反応させる事により、細胞が抗体を介して結合
し、反応前の細胞より大きな粒状物質となり、元の細胞
に蛍光物質を付けた場合よりその粒状物質に含まれる蛍
光物質量が多くなり、励起光を照射した際の粒子からの
蛍光量が増大出来ることを特徴とする。

【００１９】＜本発明の計数測定方法の構成＞一方の本
発明の微小細胞の計数測定方法は、蛍光物質の付いた抗
体と抗原である細胞とを抗原抗体反応させ、該抗原抗体
反応を行う特定の種類の微小細胞のみに蛍光物質を付
け、抗原抗体反応後の細胞が抗体を介して複数個の細胞
の結合とし、試料中の蛍光物質の付いた上記細胞に、励
起光を照射して生じる蛍光を検出し、蛍光による輝点を
計数することを特徴とする。

【００２０】上記微小細胞の計数測定方法において、上
記蛍光物質の付いた細胞は複数細胞でひとつの粒子とし
たことを特徴とする。

【００２１】

【発明の実施の形態】以下、本発明の発明を実施する形
態を説明する。

【００２２】本発明の微小細胞の計数測定装置の概略を
図１に示す。同図に示すように、特定の種類の微小細胞
を特異的に検出し計数を測定する装置において、蛍光物
質が付いた抗体と抗原である細胞とを抗原抗体反応さ
せ、該抗原抗体反応後の細胞を含有する試料液を、連続
的に通過測定するためのセルＶ ₂ と、該セルＶ₂ 内の細
胞含有液の蛍光物質を励起するに必要な波長を有する光
源１と、該抗原抗体反応後の細胞に付いた蛍光物質の発
する蛍光を受光するための受光素子１０と、該受光素子
の出力をカウントするパルスカウンタ１１とを設けてな
るものである。上記セルＶ₂ は、測定部において該測定
部の被測定物の流れ方向と直交する断面形状が横方向に
長く縦方向に短い長方形であり、上記光源１からの励起
光を照射し、横方向に長い正面部から細胞に付いた蛍光
物質の発する蛍光を上記受光素子１０により受光させる
ようにしている。

【００２３】また、上記測定に際しては、微小細胞と蛍
光物質付き抗体との抗原抗体反応により、複数個の細胞
が抗体を介して結合し、反応前の生体より大きな粒状物
質として、元の細胞に蛍光物質を付けた場合よりその粒
状物質に含まれる蛍光物質量が多くするとで、上記光源
１からの励起光を照射した際の粒子からの蛍光量を増大
させるようにしている。

【００２４】上記抗体としては、特定の種類の細胞と特
異的に結合する性質を有するモノクロナール抗体を用い
ている。抗原である細胞濃度に対して反応させるモノク
ロナール抗体の濃度を変化させると複数の細胞がモノク
ロナール抗体との結合によって一つの粒子となることが
考えられる。

【００２５】ここで、細胞数の計数の面からは２個程度
の細胞が抗体によって一つの粒子を構成することが望ま
しい。これは、多くの細胞から一つの粒子が構成される
と、一粒子に含まれる細胞数の変動が大きくなり、もと
の細胞数を粒子数から求めることが困難となるからであ
る。

【００２６】上記モノクロナール抗体に蛍光物質を付け
る場合は、この抗体と細胞とで抗原抗体反応をさせ、一
方、モノクロナール抗体に蛍光物質を付けない場合は、
この抗体を一次抗体として細胞と抗原抗体反応をさせた
後に、一次抗体と特異的に反応する二次抗体に蛍光物質
を付けておいて抗原抗体反応をさせると、複数の細胞
（望ましくは２個程度）が一つの粒子となり、この粒子
が含有する蛍光物質量が細胞一つに蛍光物質を作用させ
た場合より多くなり、従って粒子からの蛍光強度を増大
出来る。

【００２７】細胞に蛍光物質を作用させた細胞に励起光
で励起して蛍光を生じさせる場合、細胞が小さくなる程
に細胞からの蛍光強度は弱いものとなる。例えば、乳酸
菌の様な微小細胞を対象とする際、蛍光物質が付いた細
胞が２つ程度で一粒子を構成すると、細胞１個より蛍光
強度は上昇するが、いずれにしても微弱な強度である。

【００２８】そこで、蛍光輝点の計数には、高感度化を
計った上述した図１に示すような計数装置を用いて行っ
ている。

【００２９】

【実施例】以下、本発明の好適な一実施例について説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【００３０】図１は本発明を実施する高感度化を計った
計数装置である。図１中、符号１は励起光源、２，４は
ミラー、３はピンホールスリット、５，６，８は集光レ
ンズ、７はバンドパスフィルタ、９は視野絞り、１０は
受光素子、１１はパルスカウンタ、Ｖ₂ はセル及び１２
はポンプを各々図示する。

【００３１】図１において、ラインＰ₁ より抗原抗体反
応によって蛍光物質を付けた細胞を含む被測定液がポン
プ１２によってラインＰ₂ を通ってセルＶ₂ に流入す
る。ここで蛍光物質を励起させるために光源１から励起
光を照射する。本実施例では、蛍光物質としては、Fluo
rescein Isothiocyanate（以下「ＦＩＴＣ」と略称す
る）を用いた。

【００３２】図２にＦＩＴＣの励起スペクトルと蛍光ス
ペクトルを示す。図２に示すように、ＦＩＴＣの励起ス
ペクトルの最大値は４９５nm付近、また蛍光スペクトル
の最大値は５２５nm付近である。

【００３３】そこで、本実施例では蛍光物質を励起する
光源１としては４９５nmと近い波長である４８８nmのア
ルゴンレーザを用いた。

【００３４】励起光としての光源１からのレーザ光は、
ミラー２、迷光除去用のピンホールスリット３、ミラー
４、集光レンズ５を介してセルＶ₂ に導かれ、該セルＶ
₂ 内を通過する細胞試料に照射されるが、この時に細胞
と結合しているＦＩＴＣが蛍光を発する。

【００３５】この蛍光を集光レンズ６，８で集光し、視
野絞り９を介して受光素子（本実施例では光電子増倍管
を用いた。）１０で蛍光を増倍し、パルスカウンタ（本
実施例ではフォトカウンタを用いた。）１１で蛍光をカ
ウンティングすることにより細胞数を計数した。

【００３６】なお集光レンズ６，８の間には、蛍光スペ
クトルの最大値である５２５nm近辺の波長のみが通過す
るバンドパスフィルタ７を設置した。

【００３７】本実施例では、上記セルＶ₂ として、セル
内の流路の寸法は、励起光照射側の側面部（縦方向：
Ｄ）で５０μｍ、蛍光受光側の正面部（横方向：Ｗ）で
１mm、高さ（Ｈ）４cmをこの場合に使用した。

【００３８】この時重要なのは上記セルＶ₂ のセルの形
状であり、細胞に結合した蛍光物質の発する蛍光を受光
素子に受光させるためにはなるべくセル内の液の厚みを
薄くする必要がある。これは、セル厚み（図中Ｄ方向）
が大きいと、該セル内を通過する試料の液厚みも厚くな
る為に細胞に受光側の焦点が合わせにくくなり、細胞か
らの蛍光を受光素子に受光させる際に感度が低下する為
である。

【００３９】そこでセル厚みが薄く、かつ多くの試料の
処理を可能とする為、横方向（Ｗ）に長く、縦方向
（Ｄ）に短い長方体のセルを採用し、縦方向に短いセル
の側面部から励起光を照射した。細胞からの蛍光は横方
向に長いセルの正面部から受光、即ちセルの厚みの薄い
方向から受光した。

【００４０】つぎに本実施例の際に用いた抗原抗体反応
について述べる。

【００４１】細胞（抗原）として微小細胞であるLactob
acillus fermentum （ＪＣＭ１１７３）（以下、「乳酸
菌Ｆ」と略称する）を用いた。この乳酸菌を含む液を原
液とした。一次抗体は本細胞用にマウスを用い作成した
モノクロナール抗体（クローニングを行ったハイブリド
マーの培養上清を実際には用いた。）を用いた。

【００４２】二次抗体はＦＩＴＣ付のＡＮＴＩ−ＭＯＵ
ＳＥ ＩｇＧとＦＩＴＣ付のＡＮＴＩ−ＭＯＵＳＥ Ｉ
ｇＭを等量混合したものを用いた（以下、この等量混合
物を「ＦＩＴＣ付２次抗体」と略称する）。なお、蛍光
物質のついた一次抗体のみを用いることも出来る。

【００４３】まず乳酸菌Ｆを含む原液中の菌をGiemsa染
色して顕微鏡下で計数して濃度を求めたところ1.１６×
１０⁹ 個／mlであった。

【００４４】この原液に一次抗体を添加混合し３７℃で
４０分間反応させた後にＦＩＴＣ付二次抗体を添加混合
し３７℃で４０分間反応させた。

【００４５】蛍光顕微鏡下で蛍光輝点を計数したとこ
ろ、6.１８×１０⁸ 個／mlであった。抗原抗体反応前の
原液中の菌濃度は反応後の輝点濃度の１．９倍であり、
抗原抗体反応の結果、２個の菌が付きあって１つの粒子
を構成している。２個の菌が付きあっていることは蛍光
顕微鏡下の観察でも確認出来た。

【００４６】なお、抗原抗体反応時の菌濃度に対する一
次抗体添加濃度には注意を要し、一次抗体の添加量が少
なすぎまたは多すぎると菌２個で粒子１個となる条件か
らはずれる。

【００４７】また、Giemsa染色後の検鏡と蛍光顕微鏡に
よる計数は各々１日と長時間を要した。次に、細胞とし
てLactobacillus homohiochii （以下、「乳酸菌Ｈ」と
略称する）を同条件（乳酸菌Ｆの際と同じ一次抗体とＦ
ＩＴＣ付二次抗体を同条件で使用）で用い反応させた後
に、蛍光顕微鏡下で調べたところ輝点は認められなかっ
た。

【００４８】そこで、前述のごとく菌濃度を検鏡で求め
ておいた乳酸菌Ｆを含む原液に、乳酸菌Ｈが濃度で約1/
4 含まれる様に乳酸菌Ｈを含む液を一定量加え良く混合
したものを原液（以下原液Ｍと略称する）として作成し
た。

【００４９】更に、原液Ｍを菌を含まない液で希釈した
５種類の濃度の液を作成し試料とした。各試料中の乳酸
菌Ｆの濃度は原液Ｍ中の乳酸菌Ｆ濃度が分っているので
算出出来る。

【００５０】そこで各試料に前述の乳酸菌Ｆ用の抗原抗
体反応の条件で一次抗体（モノクロナール抗体）とＦＩ
ＴＣ付二次抗体を反応させた後に、各々を図１の計数装
置を用いて測定した。上記計数装置には0.1 ml／分の流
量で試料を送液した。

【００５１】図３は0.２０４８秒間にセルを通過した蛍
光輝点を検出したもので、この間に図中の３個のピーク
として観測されている。0.２０４８秒間では0.1 ml／分
×１０００μｌ／ml÷６０秒／分×0.２０４８秒＝0.３
４１３μl の試料中の蛍光輝点をとらえているにすぎ
ず、これから測定値を求めると誤差が大きすぎる。

【００５２】そこで一試料について、２０4.８秒（3.１
４３分）間にセルを通過した蛍光輝点を観測することと
した。観測した試料液量は0.1 ml／分×3.４１３分＝0.
３４１ml（３４１μｌ）である。

【００５３】図４に先に述べた５種類の濃度の試料につ
いて得られた結果を示す。ここで、横軸は蛍光顕微鏡下
で求めた輝点濃度に基づく乳酸菌Ｆの濃度、縦軸は本発
明に用いた計数装置（モニタ）により測定した濃度であ
る。

【００５４】計数装置（モニタ）による測定値は測定時
間内に観測された蛍光のピーク数を測定時間内に送液さ
れた液量で除した値である。

【００５５】蛍光顕微鏡下で求めた輝点濃度に基づく濃
度と、本発明に用いた計数装置（モニタ）で求めた濃度
とは良好な一致を示した。輝点濃度は抗原抗体反応前の
菌体（細胞）濃度の1/2 であるから、元の菌体（細胞）
濃度は本計数装置（モニタ）で求めた濃度の２倍として
求められた。乳酸菌ＦとＨの混合液中で乳酸菌Ｆのみを
特異的にその濃度を求めることが出来た。

【００５６】濃度の異なる５種類の試料を測定するに要
した時間は、抗原抗体反応を行い、計数装置で測定値を
求めるまでに４時間以内と短く、これは従来法と比較し
て格段に短時間であり、濃度測定可能域も約５０００個
／ml以下と非常に低濃度域で可能となった。

【００５７】

【発明の効果】以上説明したように本発明によれば、従
来数日以上と長時間を要していた特定微小細胞の検出計
数の測定が４時間以内で行えるようになり、また、測定
濃度域も１０⁷ 個／ml程度以上であったものが、本発明
では５０００個／ml以下で計測出来るようになった。こ
れは抗原抗体反応によって複数の微小細胞を結合させる
と共に蛍光物質を付け、生成した粒子からの蛍光強度を
増大させると共に、セル形状，励起光照射方法、蛍光受
光方法が蛍光検知上で高感度化が計られている計数装置
を用いて、試料を測定することにより達成されたもので
ある。

【００５８】また、本発明は食品分野等における微生物
検査の省力化，原料，製造工程，製品の品質管理に極め
て高い効果を発揮するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明実施例に係る計数装置の概略図である。

【図２】本発明実施例に係るＦＩＴＣの励起スペクトル
と蛍光スペクトルを示す図である。

【図３】本発明の実施例で得られた蛍光ピークの測定例
を示す図である。

【図４】従来法と本発明の方法により得られた測定値を
比較して示す図である。

【符号の説明】

１ 励起光源 ２，４ ミラー ３ ピンホールスリット ５，６，８ 集光レンズ ７ バンドパスフィルタ ９ 視野絞り １０ 受光素子 １１ パルスカウンタ Ｖ₂ セル

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特定の種類の微小細胞を特異的に検出し
   計数を測定する装置において、 蛍光物質が付いた抗体と抗原である細胞とを抗原抗体反
   応させ、該抗原抗体反応後の細胞を含有する液を、連続
   的に通過測定するためのセルと、 該セル内の細胞含有液の蛍光物質を励起するに必要な波
   長を有する光源と、 該抗原抗体反応後の細胞に付いた蛍光物質の発する蛍光
   を受光するための受光素子と、 該受光素子の出力をカウントするカウンタとを設けてな
   り、 且つ、該セルは測定部において該測定部の被測定物の流
   れ方向と直交する断面形状が横方向に長く縦方向に短い
   長方形であり、上記励起光を照射し横方向に長い正面部
   から細胞に付いた蛍光物質の発する蛍光を受光素子によ
   り受光させることを特徴とする微小細胞の計数測定装
   置。
2. 【請求項２】 請求項１記載の微小細胞の計数装置にお
   いて、 上記励起光が、被測定物の流れ方向と直交する断面形状
   が横方向に長く縦方向に短い長方形であるセルの縦方向
   に短い側面部から照射されることを特徴とする微小細胞
   の計数測定装置。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載の微小細胞の計数装
   置において、 微小細胞と蛍光物質付き抗体との抗原抗体反応により、
   複数個の細胞が抗体を介して結合し、反応前の生体より
   大きな粒状物質となり、元の細胞に蛍光物質を付けた場
   合よりその粒状物質に含まれる蛍光物質量が多くなり、
   励起光を照射した際の粒子からの蛍光量が増大出来るこ
   とを特徴とする微小細胞の計数測定装置。
4. 【請求項４】 請求項１〜３記載の微小細胞の計数装置
   において、 微小細胞と一次抗体とを反応させた後に、蛍光物質の付
   いた二次抗体を反応させる事により、細胞が抗体を介し
   て結合し、反応前の細胞より大きな粒状物質となり、元
   の細胞に蛍光物質を付けた場合よりその粒状物質に含ま
   れる蛍光物質量が多くなり、励起光を照射した際の粒子
   からの蛍光量が増大出来ることを特徴とする微小細胞の
   計数測定装置。
5. 【請求項５】 蛍光物質の付いた抗体と抗原である細胞
   とを抗原抗体反応させ、該抗原抗体反応を行う特定の種
   類の微小細胞のみに蛍光物質を付け、 抗原抗体反応後の細胞が抗体を介して複数個の細胞の結
   合とし、 試料中の蛍光物質の付いた上記細胞に、励起光を照射し
   て生じる蛍光を検出し、蛍光による輝点を計数すること
   を特徴とする微小細胞の計数測定方法。
6. 【請求項６】 請求項５記載の微小細胞の計数測定方法
   において、 上記蛍光物質の付いた細胞は複数細胞でひとつの粒子と
   したことを特徴とする微小細胞の計数測定方法。