JPH0329837A - 微生物の迅速測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く産業上の利用分野〉 本発明は、微生物の迅速測定装置に関し、より詳細には
、被検査物の微生物をメンブランフィルターに捕捉して
螢光染色した試料等の微生物試料中の該微生物を測定す
るための微生物の迅速測定装置に関する。

く従来の技術〉 従来、微生物検査、たとえばビールなどの飲料、食品、
医薬品、化粧品などの製遣王程管理、製品品質管理など
における微生物検査は、多種多様な培地を必要とする培
養検査により行なわれており、検査が終了するまでに日
数を要していた。このため微生物の有無あるいは微生物
数などの検査結果の判明が遅れ、種々の分野における研
究、開発、製造あるいは製品出荷の段階で多大な制約が
あった。

このような背景から、現在に至るまで多くの迅速測定法
が考案されている（春川三佐夫他「食兄微生物検査の簡
易化、自動化、迅速化」、ｐ．１１，サイエンスフォー
ラム（１９８５）森地敏樹，　Ｎｅｗ　Ｆｏｏｄ　Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｙ　３０，４９（１９８９））が、いまだに
満足すべき方法あるいは装置は開発されていない。具体
的には、たとえばＡＴＰ測定法（Ｈｏｌｉｎ，Ｏ．、Ｍ
ｉｌｓｓｏｎ，　Ｌ．　、λｎｓｅｈｎ，　Ｓ　％　Ｊ
．ＣＩｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Ｉ８、５２１　
（１９８３））　、インピーダンス法（Ｂｒｏｗｎ，　
Ｄ．　、Ｗａｒｎｅｒ．　Ｍ．、Ｔａｙｌｏｒ．　Ｃ．
ｓＷａｒｒｅｎ．　Ｒ．、Ｊ．　ＣＩｉｎ．　Ｐａｔｈ
ｏ１．、３７、８５〜６９（１９８４））　、酵素一螢
光検出法（特開昭５８１１６７００公報）、あるいはメ
ンブランフィルター法と螢光顕微鏡法とを組み合わせた
ＤＥＦＴ法　（Ｇ．Ｌ．ＰＥＴＴＩＰＩＩＥＲ．ＵＢＡ
ＬＤＩＮＡＭ．Ｉ？ＯＤｌ？ＩＧＵＥＳ，Ｊ．　Ａｐｐ
ｌ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、５３，　３２３（１９８２
））などが開発され、これらの原理を応用した機器が市
販されてはいるが、精度あるいは迅速性の点で問題が残
されている。すなわち、現在のところ失用化されている
迅速測定法は、精度が最高のもので微生物２ １０　〜１０’個／　ｍｌである（１個の微生物がこの
菌数濃度に達するには通常１日を要する）。また、培地
、試薬等のランニングコストが高い等多くの難点があっ
た。

〔発明の概要〕

本発明は、上述の問題点を解決することを目的とし、螢
光顕微鏡と螢光測定装置とを組合わせると共に検出部か
らの電気信号のノイズを低減化させ、更に微生物試料の
走査を自動的に行なうと共に信号測定値のデータ処理お
よび微生物試料の信号検出位置の確認が自動的に行なえ
るようにすることにより、この目的を達成しようとする
ものである。

すなわち、本発明による微生物の迅速測定装置は、螢光
染色した微生物試料の載置用の電動ステ３　一 −　４ ージおよび一定波長の励起光を上記試料に照射する光源
手段を備えた螢光顕微鏡部と、微生物試料からの特定波
長の螢光を該顕微鏡部後方位置で検出して光電変換する
検出手段と、検出手段からの電気信号についてノイズに
由来する周波数の・：：シ域制限を行なう手段と、該帯
域制限を受けた検出手段からの信号出力値を読みとって
これを処理する信号処理手段と、上記ステージを駆動さ
せて微坐物試料の全面走査を可能にすると共に該試料に
おける信号検出部位を記憶してこの部位の螢光物を確認
できるようにする自動検査手段と、を有することを特徴
とするものである。

く作　用〉 螢光染色された微生物試料を螢光顕微鏡部のステージに
載置し、光源からの光を微生物試料に照射すると、微生
物試料から螢光が放射される。この螢光は該顕微鏡部を
通過した後に検出手段によって特定波長のものが感知さ
れて電気信号に変換される。この信号は、検出手段から
の電気信号についてノイズに由来する周波数の帯域制限
を行なう手段を通過することにより周波数の帯域制限を
受けてノイズに由来する電流の周波数布の電流が減衰さ
れ、これによってノイズが低減化される。

微細部位が測定できるこの顕微測光およびノイズの低減
化により、個々の微生物が正確に検出されると共に、試
料中の微生物数が少なくこれから放射される螢光強度が
弱いものであっても確実に電気信号として検出される。

周波数の帯域制限を受けた検出手段からの電気信号は、
信号処理手段によって読みとられて処理され、螢光物が
測定される。この測定データについて、微生物試料にお
ける信号検出部位を自動検査手段によって確認し、この
部位の顕微鏡像により微生物をその他の螢光物と識別し
、不用なデータが削除される。

信号処理手段および自動検査手段により、上記のような
微生物測定の工程、すなわち微生物試料の全面にわたる
走査、微生物試料からの螢光の測定、この測定によるデ
ータの処理、信号検出位置などの工程、が自動的に行な
われる。

−　６ く効　果〉 本発明による微生物の迅速測定装置は、微量の螢光を検
出することが可能であると共に微生物の測定工程が自動
化されるので、測定の対象となる微生物試料中の微生物
数が少ない場合であっても、すなわち従来のように培養
に長時間かけて大きなコロニーを形成させるようなこと
をしなくても、短時間で微生物を検出でき、更に微生物
試料における検出部位が自動的に認識される機能により
この部位の顕微鏡像によって微生物をその他のものと識
別することができ、従って、精度の高い迅速な微生物の
自動測定が可能となる。

また、本発明による測定装置は、飲料、食品、医薬、化
粧品等の工程管理、製品品質管理等における微生物数検
査の他、生命工学等の種々の研究分野における微生物検
査、更には自家螢光をもつ微小片の検出および数の検査
等に応用できる。

〔発明の具体的説明〕

本発明による微生物の迅速測定装置は、前記のような構
成を有する自動検査装置であり、（ａ）微生物試料の微
細部分からの螢光が検出手段て光電変換された電気信号
について、ノイズに由来する周波数の帯域制限を行なう
手段によって該帯域制限を行なってこの信号のノイズを
低下させ、これにより検出感度を増加させること、（ｂ
）周波数の帯域制限を受けた検出手段からの電気信号を
信号処理手段によって読みとって処理し、これを螢光物
として測定すること、（ｃ）上記（ｂ）の測定データに
ついて、自動検査手段によって、微生物試料における信
号検出部位を確認し、この部位の顕微鏡像によりオペレ
ーターが微坐物をその他の螢光物と識別できるようにす
ること、（ｄ）信号処理手段および自動検査手段により
微生物測定の工程を自動的に行なうこと、により微生物
を測定することを基本原理とするものである。

本発明による測定装置に使用される螢光染色された微生
物試料は、好ましくは、被検査物、たとえば飲料、水、
空気、などの中の微生物（具体的にはたとえば、ビール
中の酵母など）を適当な孔径を有するメンブランフィル
ター上に補捉し、このフィルター上の微生物を螢光物質
、たとえばフルオレセインジアセテート、プロピディウ
ム・イオダイド、フルオレセインイソチオシアネート、
アクリジンオレンジ、エチジュムブロマイドなど、好ま
しくはフルオレセインジアセテ−１・、によって染色し
たものであり、必要に応じて短時間培養後染色したもの
である。

本発明による測定装置の好ましい具体例は、第１〜第３
図に示されている。

以下は、第１〜第３図に従って本発明を更に具体的に説
明するものである。

この測定装置は、螢光染色した微生物試料ａの載置用の
電動ステージ７および一定波長の励起光を上記試料に照
射する光源手段（光源部２を含む）を備えた螢光顕微鏡
部１と、微生物試料ａからの特定波長の螢光を該顕微鏡
部１の後方位置、すなわち光学的下流位置、で検出して
光電変換する検出手段３と、検出手段からの電気信号に
ついてノイズに由来する周波数の帯域制眼を行なう手段
としての信号フィルタユニット５と、該帯域制眼を受け
た検出手段３からの信号出力値を読みとってこれを処理
する信号処理手段としてのマイクロコンピュータ（ＰＣ
）６と、上記ステージ７を駆動させて微生物試料ａの全
面走査を可能にすると共に該試料ａにおける信号検出部
位を記憶してこの部位の螢光物を確認できるようにする
自動検査手段としてのマイクロコンピュータ６、ドライ
バユニット８およびＸ−Ｙステージスキャナつと、を有
するものである（第１図および第３図参照）。

螢光顕微鏡部１、光源部２、および検出手段３によって
螢光顕微測光装置部が構成されることになるが、この螢
光顕微測光装置部の主要な只体的構成は第２図に示され
ている。

螢光顕微測光装置部は、水銀ランプあるいはキセノンラ
ンプなどの光源部２と、微生物試料ａを載置する電動の
ステージ７と、光源部２からステージ７への光路中に設
けられた励起光選択用のフィルター１０、ダイクロイッ
クミラ−１１および対物レンズ１２と、光源部２からの
励起光の照射により試料ａから発生する螢光の特定波長
選択用のフィルター１３および１３′と、このフィルタ
ー１３および１３′間に設けられた絞り用のスリット１
４と、このスリット１４およびフィルター１３′を通過
した微生物試料ａからの螢光を検出して光電変換する光
電子増倍管、フォトダイオード、フォトトランジスタな
どの検出部４、好ましくは光電子増倍管を有してなるも
のである。

螢光顕微測光装置部の電気信号的後段、すなわち検出部
４の後段、に信号フィルタユニット５が設けられている
。フィルタユニット５は、特定周波数帯の電流のみを通
過させるものであり、通信分野などで一般的に用いられ
ている帯域制限用の回路、を用いることができる。・：
１｝域制眼を行なう周波数の範囲は、微生物試料ａの走
査速度、対物レンズ１２の倍率、あるいはスリッ１・１
４のスリット幅などの条件の組合わせによって適宜に設
定するものである。

本発明による装置においては、第１図に示すように信号
の波形の変化を観測するためのオシロスコープ１５を設
けてもよい。このオシロスコープ１５によって信号フィ
ルタユニット５からの信号検出強度を設定し、一定の強
度以下の信号を遮断することによって、目的とする特定
信号のみを後述するマイクロコンピュータ６に読みとら
せるようにすることが望ましい。

マイクロコンピュータ６は、微生物試料ａの７１１１１
定工程を自動的に行なう自動螢光検査機能と、前記帯域
制限を受けた検出部４からの信号出力値を読みとってこ
れを処理する信号処理機能を有している。

自動螢光検査（　Ｉ　ｎｓｐｃｃｔ　ｔｏｎ）機能は、
マイクロコンピュータ６の自動螢光検査プログラムによ
り実行されるものであり、螢光染色された微坐物試料、
たとえばメンブランフィルター（たとえば直径１０〜５
０ｍｍ程度のもの）上に微生物を捕捉してこれを螢光染
色した微生物試料、の全面を走査できるようにステージ
７を駆動させる機能と、微生物試料ａにおける信号検出
部位を記憶してこの部位の螢光物を試料を走査した後に
顕微鏡観察によって再確認できるようにする機能（　ｖ
ｅｒｉ　Ｉ’ｙ機能）１１ １２　一 である。このような機能を有する構成は任意のものが可
能であるが、好ましい例として下記のものがあげられる
。

前者の機能の場合は、Ｘ−Ｙステージスキャナ９により
ドライバユニット８を介して試料載置用のステージ部７
を駆動させその位置移動を制御するものである。後者の
機能の場合は、上記ドライバーユニット８によって電動
ステージ部７の移動量をマイクロコンピュータ６に読み
込ませて微生物試料ａにおける螢光出力検出部位、すな
わち信号検出部位をマイクロコンピュータ６に取り込ま
せ、この部位を試料走査後、目視による顕微鏡観察によ
って確認できるようにするものである。これによりこの
部位の蚕光物を顕微鏡像によって確認し、微生物をその
他の螢光物と識別し、不正データを削除することができ
る。

信号処理機能には、螢光出力値の取り込み機能と、検査
データの表示機能と、検査データファイル機能がある。

螢光出力値の取り込み機能は、フィルタユニ・ソト５を
通過した検出部４（または検出手段３）からの電気信号
の波形がマイクロコンピュータ６内のＡ／Ｄ変換ボード
１６に人力されてＡ／Ｄ変換され、このマイクロコンピ
ュータ６によりこのデータの最大振幅値が捜し出され、
これを螢光出力値として読みとるものである（第３図参
照）。

検査データの表示機能は、螢光染色された微生物試料ａ
上の微生物ａ′の検出位置のマップ表示、螢光強度別の
検出数のヒストグラム、総検出数の表示などである（第
４図参照）。

検査データファイル機能は、自動検査された結果を検査
終了時にファイルして保存することができ、必要に応じ
てこのファイルをマイクロコンピュータ６の管理下で任
意に引き出して参照することができるものである。

また、このマイクロコンピュータ６の機能として、オシ
ロスコープ１５による信号検出強度の設定による機能と
同様の機能、すなわちｆｓ号フィルタユニット５からの
一定の強度以下の信号を遮断する機能、をもたせるよう
に構成することもてきる。

本発明による測定装置の動作は、下記に説明される通り
である。

まず、被検査物（ビールなど）中の微生物をメンブラン
フィルターに捕捉して螢光染色した微生物試料ａを用意
してこれを螢光顕微鏡部１のステージ７上に載置する。

この場合、実際には上記の微生物試料をスライドグラス
などの上に固定し、これを検査用試料とする。光源２か
ら発せられた光は入射励起光選択用のフィルター１０を
通って特定の波長（微生物試料ａの染色剤がフルオレセ
インダイアセテートであれば、たとえば４９０ｎｍ）の
励起光としてダイクロイックミラ−１１および対物レン
ズｌ２を通過して微生物試料ａ面に照射される。ステー
ジ７は、マイクロコンピュータ６に制御されたドライバ
ユニット８によってスライド移動し、これによって微生
物試料ａはその全面が自動的に走査されることになる。

微ｌＬ物試料ａ中の微生物ａ′に光が照射されると、こ
こから螢光が放射される（第２図参照）。この螢光は、
対物レンズ１２を通過し、螢光の特定波長（微生物試料
ａの染色剤がフルオレセインダイアセテートであれば、
たとえば５３０ｎｍ）選択用のフィルター１３を通って
スリット１４に集光し、更にフィルター１３と同様のフ
ィルター１３′を通過して特定波長の反射光となる。

この反射光は検出手段３の検出部４によって感知されて
電気信号に変換される。この電気信号は、フィルタユニ
ット５を通過する際に周波数の帯域制限を受けてノイズ
に由来する電流の周波数帯の電流が減衰され、これによ
ってノイズが低減化される。該周波数の帯域制限を受け
た電気信号は、オシロスコープ１５によって波形を確認
しながらその検出強度（スライスレベル）を適宜に設定
して一定の強度以上のものだけが次のマイクロコンピュ
ータ６に読みとられるようにしておくことが望ましい。

電気信号は、コンピュータ６のＡ／Ｄ変換ボード１６に
入力されてＡ／Ｄ変換され、このマイクロコンピュータ
６によりこのデータの最大振幅値１５　ー １６　− が捜し出され、螢光出力値として読みとられる。

このようにして微生物試料ａからの螢光が検出測定され
た際、ドライバユニット８によってこの時のステージ７
の移動位置、すなわち微生物試料ａにおける走査位置、
がマイクロコンピュータ６に取り込まれ、微生物試料ａ
における信号検出位置が該コンピュータ６に記憶される
。

以上のような基本動作が、微／ＪＥ物試料ａ全面につい
て連続的に行なわれる。マイクロコンピュータ６で電気
信号が読みとられた測定データはこのコンピュータ６内
で処理され、第４図に示されるように螢光物の信号検出
総数、信号検出位置のマップ、螢光強度別の信号検出数
のヒストグラムなどがディスプレイ１７上に表示される
。

この測定データが出された後、マイクロコンピュータ６
の信号検出位置の確認機能を作動させることにより、ス
テージ７が各検出位置で停止する。

ここでオペレータが螢光顕微鏡部１の接眼レンズ１８よ
り螢光物の顕微鏡像を確認し、微生物を被検査物の自家
螢光物などその他の螢光物と識別し、この不用なデータ
をマイクロコンピュータ６上で削除することができる。

これらの測定データはマイクロコンピュータ６にファイ
ルして保存され、必要があればこのファイルをマイクロ
コンピュータ６の管理下で任意に引き出して参照するこ
とができる。

く尖施例〉 以下は、本発明による測定装置を用いた微生物測定の実
施例を示すものであるが、本発明はこれによって限定さ
れるものではない。

実施例１： 紅茶飲料（キリンビール社製品）１００ｍｌ中に酵母（
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕｍ）生菌８４
ケを混合し、これに直径４７ｍｌＩＩｌ、ボアサイズ０
．４μのニュクレポアフィルター（野村マイクロサイエ
ンス製）で吸引枦過、無菌水洗浄後、麦芽寒天培地上で
２５℃１５時間培養し、微小コロニー（微細酵母集落、
酵母数４〜１　０’　ｃｅｌｌｓ　）を形成させた。こ
のフィルターを１００μＩＩｌｏ１濃度フルオレセイン
ダイアセテート（ｐＨ５．３）で１５〜１８　一 ３０分間染色し、その後、２分間フィルター裏面より水
洗した。このフィルターを風乾後、５７×７６　　ｍ／
ｍのスライドガラスの上にエンテランアセトン溶液で固
定し、供試試料を調製した。

同試料を本発明による装置にて、光電子増倍管電圧５０
０ボルト、対物レンズ１０倍、スリット幅２Ｘ１＋ｎ／
ｍ，信号強度スライスレベル→−０，９〜−１．０ボル
ト、４〜２５０Ｈｚ領域を通過させるフィルター、人躬
励起光４９０ｎｍ（Ｂ，励起）および反射光受光部５３
０ｎｍ千渉フィルタ、以上のような条件で自動検査した
結集、１０４ケ所で螢光が検出された。顕微鏡確認の桔
果８４ケのコロニーが確認された（検出率１００％）。

残りの２０ケは製品由来の微細自家螢光物であった。

実施例２： 瓶ビール（大瓶１本）６３３ｍｌ中に酵母（Ｓａｅｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｕｖａｒｕ＋＋＋）　２　９　６ケ
を混合し、これを実施例（１）と同様にして、供試試料
を調製した。但し、培養は２５°０１２時間とした。同
試料を本発明の装置にて、光電子倍１曽管電圧５１９ボ
ルト、その他条件については実施例（１）と同一条件で
自動検査した結果４４５ケ所で螢光が検出された。顕微
鏡確認の結果２６０ケのコロニが確認された（検出率８
８％）注） 注）　見のがし率約１２％の原囚については、自家螢光
物が隣接していたためと推定された。

実施例３： 無菌生理食塩水１００ｍｌ中に４７ケの酵母を混合し、
実施例（１）に準じて、螢光染色した酔母を有する試料
を調製した。同実施例では培養は全く行なわなかった（
したがってコロニーでなく単一セルの酵母を供試した）
。同試料を本発明の装置にて、対物レンズ２０倍、スリ
ット幅４×２ｍ／ｆｆｌｓその他の条件は実施例（１）
と同一にして自動検査した結果、８３ケ所で螢光が検出
された。

顕微鏡確認の結果、４７ケの酵母が確認された（検出率
１００％）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による一実施例の測定装置全体の構或
の説明図である。 第２図は、第１図の測定装置における顕微測光装置部分
の基本的横成の一例を示す説明図である。 第３図は、試料から発生する螢光の出力値のマイクロコ
ンピュータへの取り込みの流れを示す説明図である。 第４図は、微生物検査結果の表示の一例を示す説明図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、螢光染色した微生物試料の載置用の電動ステージお
   よび一定波長の励起光を上記試料に照射する光源手段を
   備えた螢光顕微鏡部と、微生物試料からの特定波長の螢
   光を該顕微鏡部後方位置で検出して光電変換する検出手
   段と、検出手段からの電気信号についてノイズに由来す
   る周波数の帯域制限を行なう手段と、該帯域制限を受け
   た検出手段からの信号出力値を読みとってこれを処理す
   る信号処理手段と、上記ステージを駆動させて微生物試
   料の全面走査を可能にすると共に該試料における信号検
   出部位を記憶してこの部位の螢光物を確認できるように
   する自動検査手段と、を有することを特徴とする、微生
   物の迅速測定装置。 ２、微生物からの螢光の検出手段における光電変換手段
   が光電子増倍管である、請求項１記載の微生物の迅速測
   定装置。 ３、微生物試料が、メンブランフィルターに被検査物中
   の微生物を捕捉して該微生物を螢光染色したものである
   、請求項１記載の微生物の迅速測定装置。