JP2735626B2 - 微生物の迅速測定装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、微生物の迅速測定装置に関し、より詳細に
は、被検査物の微生物をメンブランフィルターに捕捉し
て螢光染色した試料等の微生物試料中の該微生物を測定
するための微生物の迅速測定装置に関する。

＜従来の技術＞ 従来、微生物検査、たとえばビールなどの飲料、食
品、医薬品、化粧品などの製造工程管理、製品品質管理
などにおける微生物検査は、多種多様な培地を必要とす
る培養検査により行なわれており、検査が終了するまで
に日数を要していた。このため微生物の有無あるいは微
生物数などの検査結果の判明が遅れ、種々の分野におけ
る研究、開発、製造あるいは製品出荷の段階で多大な制
約があった。

このような背景から、現在に至るまで多くの迅速測定
法が考案されている（春田三佐夫他「食品微生物検査の
簡易化、自動化、迅速化」、p.11,サイエンスフォーラ
ム（1985）森地敏樹,New Food Industry30,49（198
9））が、いまだに満足すべき方法あるいは装置は開発
されていない。具体的には、たとえばATP測定法（Moli
n,．、Milsson,L.、Ånshn,S、J.Clin.Microbio
l.、18、521（1983））、インピーダンス法（Brown,
D.、Warner,M.、Taylor,C.、Warren,R.、Clin.Patho
l.、37、65〜69（1984））、酵素−螢光検出法（特開昭
58−116700公報）、あるいはメンブランフィルター法と
螢光顕微鏡法とを組み合わせたDEFT法（G.L.PETTIPHER,
UBALDINAM.RODRIGUES,J.Appl.Bacteriol.53,323（198
2））などが開発され、これらの原理を応用した機器が
市販されてはいるが、精度あるいは迅速性の点で問題が
残されている。すなわち、現在のところ実用化されてい
る迅速測定法は、精度が最高のもので微生物10²〜10⁴個
/mlである（１個の微生物がこの菌数濃度に達するには
通常１日を要する）。また、培地、試薬等のランニング
コストが高い等多くの難点があった。

〔発明の概要〕

本発明は、上述の問題点を解決することを目的とし、
螢光顕微鏡と螢光測定装置とを組合わせると共に検出部
からの電気信号のノイズを低減化させ、更に微生物試料
の走査を自動的に行なうと共に信号測定値のデータ処理
および微生物試料の信号検出位置の確認が自動的に行な
えるようにすることにより、この目的を達成しようとす
るものである。

すなわち、本発明による微生物の迅速測定装置は、螢
光染色した微生物試料の載置用の電動ステージおよび一
定波長の励起光を上記試料に照射する光源手段を備えた
螢光顕微鏡部と、微生物試料からの特定波長の螢光を該
顕微鏡部後方位置で検出して光電変換する検出手段と、
検出手段からの電気信号についてノイズに由来する周波
数の帯域制限を行なう手段と、該帯域制限を受けた検出
手段からの信号出力値を読みとってこれを処理する信号
処理手段と、上記ステージを駆動させて微生物試料の全
面走査を可能にすると共に該試料における信号検出部位
を記憶してこの部位の螢光物を確認できるようにする自
動検査手段と、を有することを特徴とするものである。

＜作 用＞ 螢光染色された微生物試料を螢光顕微鏡部のステージ
に載置し、光源からの光を微生物試料に照射すると、微
生物試料から螢光が放射される。この螢光は該顕微鏡部
を通過した後に検出手段によって特定波長のものが感知
されて電気信号に変換される。この信号は、検出手段か
らの電気信号についてノイズに由来する周波数の帯域制
限を行なう手段を通過することにより周波数の帯域制限
を受けてノイズに由来する電流の周波数帯の電流が減衰
され、これによってノイズが低減化される。微細部位が
測定できるこの顕微測光およびノイズの低減化により、
個々の微生物が正確に検出されると共に、試料中の微生
物数が少なくこれから放射される螢光強度が弱いもので
あっても確実に電気信号として検出される。

周波数の帯域制限を受けた検出手段からの電気信号
は、信号処理手段によって読みとられて処理され、螢光
物が測定される。この測定データについて、微生物試料
における信号検出部位を自動検査手段によって確認し、
この部位の顕微鏡像により微生物をその他の螢光物と識
別し、不用なデータが削除される。

信号処理手段および自動検査手段により、上記のよう
な微生物測定の工程、すなわち微生物試料の全面にわた
る走査、微生物試料からの螢光の測定、この測定による
データの処理、信号検出位置などの工程、が自動的に行
なわれる。

＜効 果＞ 本発明による微生物の迅速測定装置は、微量の螢光を
検出することが可能であると共に微生物の測定工程が自
動化されるので、測定の対象となる微生物試料中の微生
物数が少ない場合であっても、すなわち従来のように培
養に長時間かけて大きなコロニーを形成させるようなこ
とをしなくても、短時間で微生物を検出でき、更に微生
物試料における検出部位が自動的に認識される機能によ
りこの部位の顕微鏡像によって微生物をその他のものと
識別することができ、従って、精度の高い迅速な微生物
の自動測定が可能となる。

また、本発明による測定装置は、飲料、食品、医薬、
化粧品等の工程管理、製品品質管理等における微生物数
検査の他、生命工学等の種々の研究分野における微生物
検査、更には自家螢光をもつ微小片の検出および数の検
査等に応用できる。

〔発明の具体的説明〕

本発明による微生物の迅速測定装置は、前記のような
構成を有する自動検査装置であり、（ａ）微生物試料の
微細部分からの螢光が検出手段で光電変換された電気信
号について、ノイズに由来する周波数の帯域制限を行な
う手段によって該帯域制限を行なってこの信号のノイズ
を低下させ、これにより検出感度を増加させること、
（ｂ）周波数の帯域制限を受けた検出手段からの電気信
号を信号処理手段によって読みとって処理し、これを螢
光物として測定すること、（ｃ）上記（ｂ）の測定デー
タについて、自動検査手段によって、微生物試料におけ
る信号検出部位を確認し、この部位の顕微鏡像によりオ
ペレーターが微生物をその他の螢光物と識別できるよう
にすること、（ｄ）信号処理手段および自動検査手段に
より微生物測定の工程を自動的に行なうこと、により微
生物を測定することを基本原理とするものである。

本発明による測定装置に使用される螢光染色された微
生物試料は、好ましくは、被検査物、たとえば飲料、
水、空気、などの中の微生物（具体的にたとえば、ビー
ル中の酵母など）を適当な孔径を有するメンブランフィ
ルター上に捕捉し、このフィルター上の微生物を螢光物
質、たとえばフルオレセインジアセテート、プロピディ
ウム・イオダイド、フルオレセインイソチオシアネー
ト、アクリジンオレンジ、エチジュムブロマイドなど、
好ましくはフルオレセイジアセテート、によって染色し
たものであり、必要に応じて短時間培養後染色したもの
である。

本発明による測定装置の好ましい具体例は、第１〜第
３図に示されている。

以下は、第１〜第３図に従って本発明を更に具体的に
説明するものである。

この測定装置は、螢光染色した微生物試料ａの載置用
の電動ステージ７および一定波長の励起光を上記試料に
照射する光源手段（光源部２を含む）を備えた螢光顕微
鏡部１と、微生物試料ａからの特定波長の螢光を該顕微
鏡部１の後方位置、すなわち光学的下流位置、で検出し
て光電変換する検出手段３と、検出手段からの電気信号
についてノイズに由来する周波数の帯域制限を行なう手
段としての信号フィルタユニット５と、該帯域制限を受
けた検出手段３からの信号出力値を読みとってこれを処
理する信号処理手段としてのマイクロコンピュータ（P
C）６と、上記ステージ７を駆動させて微生物試料ａの
全面走査を可能にすると共に該試料ａにおける信号検出
部位を記憶してこの部位の螢光物を確認できるようにす
る自動検査手段としてのマイクロコンピュータ６、ドラ
イバユニット８およびＸ−Ｙステージスキャナ９と、を
有するものである（第１図および第３図参照）。

螢光顕微鏡部１、光源部２、および検出手段３によっ
て螢光顕微測光装置部が構成されることになるが、この
螢光顕微測光装置部の主要な具体的構成は第２図に示さ
れている。

螢光顕微測光装置部は、水銀ランプあるいはキセノン
ランプなどの光源部２と、微生物試料ａを載置する電動
のステージ７と、光源部２からステージ７への光路中に
設けられた励起光選択用のフィルター10、ダイクロイッ
クミラー11および対物レンズ12と、光源部２からの励起
光の照射により試料ａから発生する螢光の特定波長選択
用のフィルター13および13′と、このフィルター13およ
び13′間に設けられた絞り用のスリット14と、このスリ
ット14およびフィルター13′を通過した微生物試料ａか
らの螢光を検出して光電変換する光電子増倍管、フォト
ダイオード、フォトトランジスタなどの検出部４、好ま
しくは光電子増倍管を有してなるものである。

螢光顕微測光装置部の電気信号的後段、すなわち検出
部４の後段、に信号フィルタユニット５が設けられてい
る。フィルタユニット５は、特定周波数帯の電流のみを
通過させるものであり、通信分野などで一般的に用いら
れている帯域制限用の回路、を用いることができる。帯
域制限を行なう周波数の範囲は、微生物試料ａの走査速
度、対物レンズ12の倍率、あるいはスリット14のスリッ
ト幅などの条件の組合わせによって適宜に設定するもの
である。

本発明による装置においては、第１図に示すように信
号の波形の変化を観測するためのオシロスコープ15を設
けてもよい。このオシロスコープ15によって信号フィル
タユニット５からの信号検出強度を設定し、一定の強度
以下の信号を遮断することによって、目的とする特定信
号のみを後述するマイクロコンピュータ６に読みとらせ
るようにすることが望ましい。

マイクロコンピュータ６は、微生物試料ａの測定工程
を自動的に行なう自動螢光検査機能と、前記帯域制限を
受けた検出部４からの信号出力値を読みとってこれを処
理する信号処理機能を有している。

自動螢光検査（Inspection）機能は、マイクロコンピ
ュータ６の自動螢光検査プログラムにより実行されるも
のであり、螢光染色された微生物試料、たとえばメンブ
ランフィルター（たとえば直径10〜50mm程度のもの）上
に微生物を捕捉してこれを螢光染色した微生物試料、の
全面を走査できるようにステージ７を駆動させる機能
と、微生物試料ａにおける信号検出部位を記憶してこの
部位の螢光物を試料を走査した後に顕微鏡観察によって
再確認できるようにする機能（Verify機能）である。こ
のような機能を有する構成は任意のものが可能である
が、好ましい例として下記のものがあげられる。

前者の機能の場合は、Ｘ−Ｙステージスキャナ９によ
りドライバユニット８を介して試料載置用のステージ部
７を駆動させその位置移動を制御するものである。後者
の機能の場合は、上記ドライバーユニット８によって電
動ステージ部７の移動量をマイクロコンピュータ６に読
み込ませて微生物試料ａにおける螢光出力検出部位、す
なわち信号検出部位をマイクロコンピュータ６に取り込
ませ、この部位を試料走査後、目視による顕微鏡観察に
よって確認できるようにするものである。これによりこ
の部位の螢光物を顕微鏡像によって確認し、微生物をそ
の他の螢光物と識別し、不正データを削除することがで
きる。

信号処理機能には、螢光出力値の取り込み機能と、検
査データの表示機能と、検査データファイル機能があ
る。

螢光出力値の取り込み機能は、フィルタユニット５を
通過した検出部４（または検出手段３）からの電気信号
の波形がマイクロコンピュータ６内のA/D変換ボード16
に入力されてA/D変換され、このマイクロコンピュータ
６によりこのデータの最大振幅値が捜し出され、これを
螢光出力値として読みとるものである（第３図参照）。

検査データの表示機能は、螢光染色された微生物試料
ａ上の微生物ａ′の検出位置のマップ表示、螢光強度別
の検出数のヒストグラム、総検出数の表示などである
（第４図参照）。

検査データファイル機能は、自動検査された結果を検
査終了時にファイルして保存することができ、必要に応
じてこのファイルをマイクロコンピュータ６の管理下で
任意に引き出して参照することができるものである。

また、このマイクロコンピュータ６の機能として、オ
シロスコープ15による信号検出強度の設定による機能と
同様の機能、すなわち信号フィルタユニット５からの一
定の強度以下の信号を遮断する機能、をもたせるように
構成することもできる。

本発明による測定装置の動作は、下記に説明される通
りである。

まず、被検査物（ビールなど）中の微生物をメンブラ
ンフィルターに捕捉して螢光染色した微生物試料ａを用
意してこれを螢光顕微鏡部１のステージ７上に載置す
る。この場合、実際には上記の微生物試料をスライドグ
ラスなどの上に固定し、これを検査用試料とする。光源
２から発せられた光は入射励起光選択用のフィルター10
を通って特定の波長（微生物試料ａの染色剤がフルオレ
セインダイアセテートであれば、たとえば490nm）の励
起光としてダイクロイックミラー11および対物レンズ12
を通過して微生物試料ａ面に照射される。ステージ７
は、マイクロコンピュータ６に制御されたドライバユニ
ット８によってスライド移動し、これによって微生物試
料ａはその全面が自動的に走査されることになる。微生
物試料ａ中の微生物ａ′に光が照射されると、ここから
螢光が放射される（第２図参照）。この螢光は、対物レ
ンズ12を通過し、螢光の特定波長（微生物試料ａの染色
剤がフルオレセインダイアセテートであれば、たとえば
530nm）選択用のフィルター13を通ってスリット14に集
光し、更にフィルター13と同様のフィルター13′を通過
して特定波長の反射光となる。

この反射光は検出手段３の検出部４によって感知され
て電気信号に変換される。この電気信号は、フィルタユ
ニット５を通過する際に周波数の帯域制限を受けてノイ
ズに由来する電流の周波数帯の電流が減衰され、これに
よってノイズが低減化される。該周波数の帯域制限を受
けた電気信号は、オシロスコープ15によって波形を確認
しながらその検出強度（スライスレベル）を適宜に設定
して一定の強度以上のものだけが次のマイクロコンピュ
ータ６に読みとられるようにしておくことが望ましい。

電気信号は、コンピュータ６のA/D変換ボード16に入
力されてA/D変換され、このマイクロコンピュータ６に
よりこのデータの最大振幅値が捜し出され、螢光出力値
として読みとられる。このようにして微生物試料ａから
の螢光が検出測定された際、ドライバユニット８によっ
てこの時のステージ７の移動位置、すなわち微生物試料
ａにおける走査位置、がマイクロコンピュータ６に取り
込まれ、微生物試料ａにおける信号検出位置が該コンピ
ュータ６に記憶される。

以上のような基本動作が、微生物試料ａ全面について
連続的に行なれる。マイクロコンピュータ６で電気信号
が読みとられた測定データはこのコンピュータ６内で処
理され、第４図に示されるように螢光物の信号検出総
数、信号検出位置のマップ、螢光強度別の信号検出数の
ヒストグラムなどがディスプレイ17上に表示される。

この測定データが出された後、マイクロコンピュータ
６の信号検出位置の確認機能を作動させることにより、
ステージ７が各検出位置で停止する。ここでオペレータ
が螢光顕微鏡部１の接眼レンズ18より螢光物の顕微鏡像
を確認し、微生物を被検査物の自家螢光物などその他の
螢光物と識別し、この不用なデータをマイクロコンピュ
ータ６上で削除することができる。

これらの測定データはマイクロコンピュータ６にファ
イルして保存され、必要があればこのファイルをマイク
ロコンピュータ６の管理下で任意に引き出して参照する
ことができる。

＜実施例＞ 以下は、本発明による測定装置を用いた微生物測定の
実施例を示すものであるが、本発明はこれによって限定
されるものではない。

実施例1: 紅茶飲料（キリンビール社製品）100ml中に酵母（Sac
charomyces uvarum）生菌84ケを混合し、これに直径47m
/m、ポアサイズ0.4μのニュクレポアフィルター（野村
マイクロサイエンス製）で、吸引過、無菌水洗洗浄
後、麦芽寒天培地上で25℃15時間培養し、微小コロニー
（微細酵母集落、酵母数４〜10¹cells）を形成させた。
このフィルターを100μmol濃度フルオレセインダイアセ
テート（pH5.3）で15〜30分間染色し、その後、２分間
フィルター裏面より水洗した。このフィルターを風乾
後、57×76m/mのスライドガラスの上にエンテランアセ
トン溶液で固定し、供試試料を調製した。

同試料を本発明による装置にて、光電子増倍管電圧50
0ボルト、対物レンズ10倍、スリット幅２×1m/m、信号
強度スライスレベル＋0.9〜−1.0ボルト、４〜250Hz領
域を通過させるフィルター、入射励起光490nm（B₂励
起）および反射光受光部530nm干渉フィルター、以上の
ような条件で自動検査した結果、104ケ所で螢光が検出
された。顕微鏡確認の結果84ケのコロニーが確認された
（検出率100％）。残りの20ケは製品由来の微細自家螢
光物であった。

実施例2: 瓶ビール（大瓶１本）633ml中に酵母（Saccharomyces
uvarum）296ケを混合し、これを実施例（１）と同様に
して、供試試料を調製した。但し、培養は25℃12時間と
した。同試料を本発明の装置にて、光電子倍増管電圧51
9ボルト、その他条件については実施例（１）と同一条
件で自動検査した結果445ケ所で螢光が検出された。顕
微鏡確認の結果260ケのコロニーが確認された（検出率8
8％）。^注）。

注） 見のがし率約12％の原因については、自家螢光物
が隣接していたためと推定された。

実施例3: 無菌生理食塩水100ml中に47ケの酵母を混合し、実施
例（１）に準じて、螢光染色した酵母を有する試料を調
製した。同実施例では培養は全く行なわなかった（した
がってコロニーでなく単一セルの酵母を供試した）。同
試料を本発明の装置にて、対物レンズ20倍、スリット幅
４×2m/m、その他の条件は実施例（１）と同一にして自
動検査した結果、83ケ所で螢光が検出された。顕微鏡確
認の結果、47ケの酵母が確認された（検出率100％）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による一実施例の測定装置全体の構成
の説明図である。 第２図は、第１図の測定装置における顕微測光装置部分
の基本的構成の一例を示す説明図である。 第３図は、試料から発生する螢光の出力値のマイクロコ
ンピュータへの取り込みの流れを示す説明図である。 第４図は、微生物検査結果の表示の一例を示す説明図で
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−53447（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−32356（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−9483（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／4045（ＷＯ，Ａ１)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】螢光染色した微生物試料の載置用の電動ス
   テージおよび一定波長の励起光を上記試料に照射する光
   源手段を備えた螢光顕微鏡部と、微生物試料からの特定
   波長の螢光を該顕微鏡部後方位置で検出して光電変換す
   る検出手段と、検出手段からの電気信号についてノイズ
   に由来する周波数の帯域制限を行なう手段と、該帯域制
   限を受けた検出手段からの信号出力値を読みとってこれ
   を処理する信号処理手段と、上記ステージを駆動させて
   微生物試料の全面走査を可能にすると共に該試料におけ
   る信号検出部位を記憶してこの部位の螢光物を確認でき
   るようにする自動検査手段と、を有することを特徴とす
   る、微生物の迅速測定装置。
2. 【請求項２】微生物からの螢光の検出手段における光電
   変換手段が光電子増倍管である、請求項１記載の微生物
   の迅速測定装置。
3. 【請求項３】微生物試料が、メンブランフィルターに被
   検査物中の微生物を捕捉して該微生物を螢光染色したも
   のである、請求項１記載の微生物の迅速測定装置。