JPH02281131A - 微生物細胞の生死判別装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物細胞の生死を判別する装置に関し、特に
食品製造プラント、医薬品製造プラントにおける原料、
製品の品質管理や殺菌装置の性能確認等に適用される微
生物検査、モニタリング装置に関するものである。

〔従来の技術〕

食品製造プラント、医薬品製造プラントにおいては殺菌
が非常に重要な工程を占め、原料、製品の品質管理や殺
菌装置の性能確認のため、微生物検査・測定が不可欠で
ある。従来、微生物検査・測定法にはいくつかの方法が
あるが主なものは、顕微鏡による直接観察法、寒天塔養
法、バイオルミネッセンス法およびそれらの変法などで
ある。

顕微鏡による直接観察法は試料を直接又は試料濃度が薄
い場合には、フィルターな、どで−旦微生物細胞を捕集
した後、光学顕微鏡を用いて観察・測定する方法である
。しかし、この方法では細胞の生死判別がつかないため
殺菌できたかどうかの評価かで＠ない。

寒天培養法は従来最もよく用いられている方法である。

この方法は微生物の栄養源を溶は込ました球入上に試料
を分散させ適温で培養することにより微生物コロニーを
形成させて、これを測定することにより試料中の生きて
いる微生物数を把握するものであジ、コロニーを形成し
なければ試料中には微生物は存在しないか又は殺菌、死
滅していると判断するものである。しかし、この方法は
培養操作を伴うため、コロニーを形成させるまでに少な
くとも１０時間以上、菌の種類によっては数日間の測定
時間が必要であり、品質管理、殺菌性能把握に大きなネ
ックとなっている。

そこで、微生物の生死を判別できる迅速測定法について
最近多くの研究がなされているが、その一つがバイオル
ミネッセンス法である。バイオルミネッセンス法で実用
化されているのは、Ａ’Ｉ’Ｐ（アデノシン三すン敵）
とホタルの生物発光酵素であるルシフェリンルシフェラ
ーゼとの反応全利用するものである。この方法は生細胞
中に含まれる補酵素の−！ＭＡ　Ｔ　Ｐにルシフェリン
ルシフェラーゼを作用させると７オトンが放出される現
象を利用するもので、このフォトン量を測定することに
より生菌数を間接的に把握するものであるが、測定時間
が数十分〜１時間と寒天培養法に比較し大幅に短縮でき
る利点はあるものの、現段階では測定感度はまだ低いた
め、低濃度の細胞試料（数十個／　ｍｅ以下）に対して
は適用できず、まして１個の細胞の生死が問題となる試
料では対象外であった。

このように、従来法では１個の微生物細胞の生死を短時
間（瞬時または、それに近いレベル）に判別できる方法
はなかった。これができれば微生物検査・測定の自動化
・迅速化が可能となジ原料、製品の品質管理や殺菌装置
の信頼性・安全性向上に多大の貢献ができる。

〔発明が解決しようとする課題〕

上述したように、従来技術には■寒天培養法では測定時
間が長くかがり、生細胞は測定できるが死細胞との区別
はできない。■顕微鏡観察法では細胞の生死判別はでき
ない。■バイオルミネッセンス法は間接的に生細胞数を
推定するもので真値はわからず、また低濃度細胞試料に
適用はできないという技術課題があった。

そこで本発明者らは、１個の細胞゛の生死を瞬時に判別
する方法について研究を重ねた結果、細胞構成成分と結
びついて蛍光を発する色素を適当な濃度で細胞に作用さ
せ、・適当な波長を有する光を照射して色素を励起させ
、蛍光顕微鏡により細胞を観察すると、生菌、死菌の発
する光量に差異が見られる事笑を発見し、先にこの原理
を利用した微生物細胞の生死判別法を提案した。（特願
昭６３〜２６９３８３号）本発明は前記従来技術の課題
■、■、■を解決した上記提案力法の微生物細胞の生死
判別法を合目的に達成できる微生物細胞の生死゛判別装
置を提供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明（ま、 （１）蛍光色素に染色された微生物細胞試料に対して該
蛍光色素を励起させる元を照射する光源と、フィルター
を介して上記微生物細胞試料を撮像する撮像装置と、同
撮像装置の出力を受け任意に設足可能な輝度レベル内に
存在する画像のみ全出力する画像処理装置と、同画像処
理装置の出力を受けてその画像の数全数よるパーティク
ルカウンターとを有することを特徴とする微生物細胞の
生死判別装置（以下、これを第１発明という）及び （２）　　蛍光色素液と微生物細胞試料との混合流体を
通過させる透明な窓を有するフローセルと、同フローセ
ルの窓を介して上記蛍光色素を励起させる光を照射する
光源と、フィルターを介して上記フローセルの窓から出
た元を受光する受光器と、同受光器の出力をそれぞれ受
けそれぞれ異なる出力レベルのパルスをカウントスる２
つのパルスカウンターとを有すること全特徴とする微生
物細胞の生死判別装置（以下、これを第２発明という） である。

〔作　用〕

微生ｖ！ＪａＩ胞に蛍光色素を適当な酸度で作用させ、
水銀ランプ、レーザー等で色素全励起させることにより
、生菌、死菌の間に発光量の差異が見られる事実全適用
すれは、１個の細胞の生死でも瞬時又はそれに近いレベ
ルで判別が可能となり、微生物検査・測定の自動化・迅
速化ができることになる。

生きた細胞が熱や薬剤（アルカリ、酸など）の作用によ
ジ死滅すると、細胞の外側にある細胞壁やその内側にあ
る細胞膜が変性、損傷を受け、その結果、死滅した細胞
の方が生細胞に比較して蛍光色素が細胞内に浸透しゃす
くなジ、特に細胞内物質である核酸に結合して蛍光を発
する色素ＣＣ６−ジアミデイノー２−フェニルインドー
ル（ＤＡＰＩ）、ローダミン６Ｇなど〕を用いた場合、
死菌は生菌に比較して明るく発光する。

提た、生菌に存在する酵素と反応する色素（たとえば酵
素エステラーゼと結びつくフルオレセインニ酢酸）を用
いると死菌では、酵素活性は低いので生菌の万が死菌に
比較して、明るく発光する。

なお、不発明においては細胞に作用させる蛍光色素の濃
度が重要なポイントであり色素の濃度が高いと生細胞・
死細胞は同程度に染まって判別しにくくなり、また濃度
が低いと両方の細胞共９壕く染色されないので最適な濃
度に調整した色素を用いることが必要である。

本発明で用いられる蛍光色素としては下記のようなもの
から選択して使用しつる。

■　細胞内物質である核酸に結合して蛍光を発する色素 ４；６−ジアミデイノー２−フェルインドール（ＤＡＰ
　Ｉ　）、ローダミン６Ｇ、アクリジンオレンジ（ＡＯ
）など ■　アミン基に結合して蛍光を発する色素フルオレスカ
ミン、Ｏ−７タルアルデヒド、ダンジルクロライド、フ
ルオレセインイソチ７ネ−）、７−クロロ−４−ニトロ
ベンソー２−オキサ−１，６−ジアゾールなど ■　チオール基に結合して蛍光を発する色素ダンシルア
シリジン、５−（ヨードアセトアミドエチル）アミノナ
フタレン−１−スルホン酸、５−ヨードアセトアミドフ
ルオレセイン、フルオレセインマーキュリアセテート、
Ｎ−（３−ピレン）マレイミドなど ■　非共有結合性色素 アリルナフタレンスルホン酸、オーラミン０、クロロテ
トラサイクリン、シアニン色素、エオシン、ジフェニル
ヘキサトリエン、ε−アデノシンなど ■　そのほか、それ自体は蛍光を発しないが酵素の作用
により蛍光を発するもの フルオレセイニンニ酢酸 また、蛍光色素の最適濃度は、対象細胞の犬きさ、種類
、細胞の懸濁している液の組成などによって異なる可能
性があるため、予め実験により決定することが必要であ
る。

更にまた、蛍光色素を励起させるに必要な波長を有する
光源の選択も、作用する蛍光色素の種類、対象細胞によ
って異なるので、これも予め実験により確認することが
必要である。

使用する（蛍光）色素につき上記のような注意を払うこ
とによって、本発明によジ微生物細胞の生死を瞬時に判
別することができる。

〔実施例１〕（第１発明） （１）試験に用いｆｃ細胞 約１０６個／−に調整したＢａｋｅｒ’ｓ　ｙｅａｓｔ
（酵母）およびこれを１２１℃、５分間加熱殺菌したも
の （２）　　使用した蛍光色素と濃度 ４、′６−ジアミデイノー２−フェニルインドール（Ｄ
ＡＰ　Ｉ　）を細胞液に対し、１０μｙ／−の割合で添
加 （３１ｆｌ胞の観察・測定 細胞の観察・測定に用いた第１発明装置の一態様である
蛍光顕微鏡の光学系を第１図に示す。第１図において、
１は光源である水銀灯であジ、出力１００Ｗのものを使
用した。

２は水銀光を集光するコレクターレンズ、３は蛍光色素
を励起させるに必要な波長を選定する励起フィルターで
あり、　ＤＡＰＩの励起フィルターとしては３３０〜５
８０　ｎｍ　のものを使用した。４はミラー　５は対物
レンズであり、こ＼では２０倍のものを使用した。６は
試料台、７は試料である。

対物レンズ５全通して、励起フィルター３で選定された
特定の波長域の元が試料台上の試料７に照射され蛍光色
素を励起する。励起光は対物レンズ５を通過し、吸収フ
ィルター８により励起光の中の特定の波長域の光をカッ
トしたものを接眼レンズ９全通してカメラ１０に捕えさ
せ、任意に設定可能な輝度レベル内に存在する画像のみ
を出力する画像処理装置１１で画像処理された後、モニ
ター１２に写し出される。発光量の異なる細胞数を個々
に計数するには、画像処理装置１１で画像処理された信
号をパーティクルカウンター１６と連結することによジ
、光の強弱に応じた細胞数を読み取ることができる。

なお、吸収フィルター８は、４２０　ｎｍ以下の波長域
をカットするものを使用した。

第１図は試料の移動がない場合であるが、連続的に試料
の計数を行う場合カメラ１０を高速シャッターカメラ等
の高速度カメラに置き換えれば対応が可能となる。

（４）　　測定結果 ＤＡＰＩで蛍光染色した酵母は、生細胞は弱い青色の光
を放つのに対し、死細胞は明るいほぼ白色に近い元を放
つ。この発光量の差異を輝度レベルで見ると、第２図に
示すように、死細胞の輝度を１．０とした場合、生細胞
は約ａ、５の輝度を有する。

従って、この両者の発光量の差異を光学的に検知、計数
することによｐ生細胞、死細胞数をただちに知ることが
できる。

ちなみに死細胞と生細胞を等量混合し、ＤＡＰＩを１０
μｔ／−の濃度で調整し、この（ＬＤ１ｍｌ’ｉスライ
ドグラス上にとって、生細胞数、死細胞数をパーティク
ルカウンターで計数した場合（輝度レベル１９以上の細
胞を死細胞、（Ｌ５以下の細胞を生細胞とした）、生細
胞数は約６０個／１視野、死細胞数も約６０個／１視野
と混合量に応じた数値をただちに得ることができ、本発
明方法の優位性が立証された。

〔実施例２〕（第２発明） 第３図は、試料を連続的に計数する時、有効と考えられ
るシステム構成図である。

試験に用いた細胞及び使用した蛍光色素・濃度は実施例
１と同じである。

試料はＰｌを経由して蛍光色素混合槽１に入り、蛍光色
素はＰ２より混合槽１に入る。蛍光色素と細胞試料との
混合液はＰ３よりフローセル２に入ｖ１フローセル内を
流れてＰ４より出る。フローセルの一部は透明なウィン
ドー６になっていて、この部分を流れる細胞に光を照射
する。光源３より発生した光はコレクターレンズ４によ
り集光され、励起フィルター５を介して励起に必要な波
長の光をウィンドー６より照射する。

励起光は、フィルター７を介して測定に必要な波長域の
光を選定し、ミラー８、レンズ９を介してフォトダイオ
ードもしくは、フォトマル等の受光器１０により、細胞
の発する光を検知し電気信号に変換する。１１．１２は
細胞の発する光の強さ（輝度）を受光器１０により電気
信号（例えば電圧）に変換した時に、電気回路中を流れ
るパルス状信号を計測するパルス計数器である。パルス
計数器１１はレベル１．以上の振幅を有するパルスのみ
をカウントし、パルス計数器１２はレベルＩ、以上の振
幅を有するパルスをカウントする。

従って生菌、死菌の両方をカウントするには例えば輝度
レベルα２以上に相当する振幅にパルス計数器１１を調
整・設定し、死菌をカウントするＶＣは輝度レベルを０
．９以上に相当する振幅にパルス計数器１２を調整、設
定することによりその差から生菌、死菌の個々の値を求
めることができる。

すなわち、この実施例は細胞の発する光の強弱を、電気
パルスに変換し、そのパルス数、強弱の関係より、生菌
、死菌数を求めようとするものである。

〔発明の効果〕

本発明によジ、従来測定時間が数十時間要していた微生
物ａ胞の生死判別が、低濃度（１個でもつの細胞に対し
ても、瞬時に可能となり、食品製造プラント、医薬品製
造プラント等における原料、製品の品質管理、また殺菌
装置の性能把握が迅速にかつ容易に行えるようになる。

その結果、これら製品、装置の信頼性、安全性の向上に
加え、手間のかかる培養方法に比較し、大幅な検査時間
、労力の省力化が可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１実施例に係る装置の概略図、第２
図は本発明の第１実施例に係る生死細胞の輝度レベルの
模式図、第６図は本発明の第２実施例に係る装置の概略
図である。 明

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛍光色素に染色された微生物細胞試料に対して該
   蛍光色素を励起させる光を照射する光源と、フィルター
   を介して上記微生物細胞試料を撮像する撮像装置と、同
   撮像装置の出力を受け任意に設定可能な輝度レベル内に
   存在する画像のみを出力する画像処理装置と、同画像処
   理装置の出力を受けてその画像の数を数えるパーティク
   ルカウンターとを有することを特徴とする微生物細胞の
   生死判別装置。
2. （２）蛍光色素液と微生物細胞試料との混合流体を通過
   させる透明な窓を有するフローセルと、同フローセルの
   窓を介して上記蛍光色素を励起させる光を照射する光源
   と、フィルターを介して上記フローセルの窓から出た光
   を受光する受光器と、同受光器の出力をそれぞれ受けそ
   れぞれ異なる出力レベルのパルスをカウントする２つの
   パルスカウンターとを有することを特徴とする微生物細
   胞の生死判別装置。