JP4792580B2 - 発光寿命測定装置およびその測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、発光寿命測定装置およびその測定方法に関し、特に細胞内の微視的な環境変化を反映した発光寿命のわずかな変化を高感度かつ定量的に検出することができる発光寿命測定装置およびその測定方法に関する。

細胞の特定箇所や細胞内のタンパク質などを発光分子により標識し、顕微鏡を用いてその発光強度を観察する方法は、細胞生物学や分子生物学などにおいて必須の技術となっている。

細胞内に位置する発光分子の発光特性は、発光分子の周囲の環境によって変化することが知られている。このとき、発光特性は、イオン濃度やｐＨなどの細胞内の生理学的なパラメーターのみではなく、発光分子とタンパク質や水などとの相互作用によっても変化する。したがって、細胞内に位置する発光分子の発光強度の変化を測定することにより、その細胞の細胞内の微視的な変化を検出することができる。例えば、非特許文献１では、蛍光タンパク質カメレオンの発光強度の変化を測定することにより、細胞内のカルシウムイオンの濃度変化を検出している。

細胞内の生理学的パラメーターおよび分子間相互作用は、細胞分裂や細胞死などの進行、光刺激や外来刺激などの種々の外来刺激による影響、および細胞の活性度など（以下「細胞活性度等」という）と相関があると考えられている。したがって、細胞内に位置する発光分子の発光強度を測定することにより、細胞活性度等を測定することができる可能性がある。

ところで、発光強度ではなく発光寿命を測定する方法として、蛍光寿命画像顕微法(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy：以下「ＦＬＩＭ」と略記する)が知られている（非特許文献２参照）。ＦＬＩＭで発光寿命を算出するとき、時間ゲート法または時間相関単一光子計数法のいずれかが用いられることが多い。時間ゲート法は、迅速かつ簡便に発光寿命を算出することができるが、多成分の減衰や立ち上がり成分が存在すると、大きく異なった発光寿命を算出してしまうという問題点がある。一方、時間相関単一光子計数法は、正確な発光寿命を算出することができるが、測定時間が長くなるという問題点がある。
T. Nagai, S. Yamada, T. Tominaga, M. Ichikawa and A. Miyawaki, "Expanded dynamic range of fluorescent indicators for CA2+" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(29), 10554-10559. H. Wallrabe, A. Periasamy, "Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy" Curr. Opin. Biotechnol. 16(1), 19-27.

しかしながら、発光強度の変化を測定する方法では、細胞活性度等を測定することが困難であるという問題がある。

すなわち、発光強度の測定値は、発光分子の周囲の環境だけではなく、発光分子の濃度、発光分子の発光寿命、励起光強度、光学系、励起波長および不純物など非常に多くの要因に依存しているため、定量性に欠けている。したがって、発光強度の変化を測定する方法では、細胞活性度等の変化を反映した発光特性のわずかな変化をシグナルとして検出することができず、細胞活性度等を測定することができないのである。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、細胞活性度等の変化を反映した発光特性のわずかな変化を高感度かつ定量的にその場測定することができる発光寿命測定装置およびその測定方法を提供することを目的とする。

本発明の発光寿命測定装置は、パルス励起光を発するパルスレーザー光源部と、前記パルス励起光を試料に照射し、前記試料から放出される発光を出力する測定用光学系と、前記パルスレーザー光源部が前記パルス励起光を発してから複数の時間帯において前記発光の光子数を計測することで発光寿命を算出する時間ゲート法によって、前記試料の複数地点における発光寿命の値およびその空間分布を取得する発光寿命分布画像取得手段と、前記パルス励起光を検出してから前記発光の光子を検出するまでの時間、または前記発光の光子を検出してから前記パルス励起光を検出するまでの時間を測定することで発光減衰曲線を測定する時間相関単一光子計数法によって、前記試料の特定地点における発光減衰曲線を測定する発光減衰曲線測定手段と、を有する。

本発明の発光寿命測定方法は、パルス励起光を試料に照射するステップと、前記パルス励起光を照射してから複数の時間帯において、前記試料から放出される発光の光子数を計測することで発光寿命を算出する時間ゲート法によって、前記試料の複数地点における発光寿命の値およびその空間分布を取得するステップと、取得した空間分布から発光減衰曲線を測定する地点を特定するステップと、前記パルス励起光を検出してから前記発光の光子を検出するまでの時間、または前記発光の光子を検出してから前記パルス励起光を検出するまでの時間を測定することで発光減衰曲線を測定する時間相関単一光子計数法によって、前記試料の特定された地点における発光減衰曲線を測定するステップと、を有する。

本発明によれば、細胞活性度等の変化を反映した発光特性のわずかな変化を高感度かつ定量的にその場測定することができる。これにより、単一細胞内における様々な動的情報をその場で得ることができる。

本発明の発光寿命測定装置およびその測定方法は、発光強度ではなく発光寿命を測定することを特徴とする。ここで「発光」とは、蛍光や燐光、化学発光などを意味する。また、「発光寿命」とは、発光強度が１／ｅに低下するのに要する時間を意味する。発光寿命は、発光分子ごとに固有の値であるため、発光分子の濃度、励起光強度、光学系、励起波長および不純物などに依存しない。したがって、本発明の発光寿命測定装置およびその測定方法は、試料内に位置する発光分子の発光寿命を測定することで、発光分子の周囲の微細環境に関する情報を直接的に取得することができる。

また、本発明の発光寿命測定装置およびその測定方法は、時間ゲート法および時間相関単一光子計数法の二つの方法を用いて発光寿命を測定することも特徴とする。

時間ゲート法は、発光減衰曲線を数分割のウィンドウに分割し、各ウィンドウ内の積分発光強度の値を時間に対してプロットし、積分発光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定して発光寿命を求める方法である。時間ゲート法は、迅速かつ簡便に発光寿命を算出することができるが、発光強度（光子数）が単一指数関数的に減衰するという仮定に基づいているため、多成分の減衰や立ち上がり成分が存在すると、大きく異なった発光寿命を算出してしまうという問題点、および高いシグナル／ノイズ比でなければ定性的な発光寿命の値しか得られないという問題点がある。

一方、時間相関単一光子計数法は、１回の励起によって最初に発生する光子１個の時間軸上での発生確率分布（すなわち発光１光子の発生確率分布）を測定し、それを１回の励起によって発生する全光子の時間軸上での強度分布（すなわち発光減衰曲線）とみなすことにより発光寿命を求める方法である。時間相関単一光子計数法は、正確な発光減衰挙動を測定することができるが、１パルスの励起光につき最大１光子しか測定できないため、測定時間が長いという問題点がある。

本発明の発光寿命測定装置およびその測定方法は、時間ゲート法により試料の特定領域内の各地点における発光寿命を迅速に測定し、発光寿命分布画像を作成する（ＦＬＩＭ測定）。次いで、本発明の発光寿命測定装置およびその測定方法は、時間ゲート法の問題点を補うために、時間相関単一光子計数法により試料の特定地点（興味がある地点）における発光寿命を定量的に測定する。

このように、本発明の発光寿命測定装置およびその測定方法は、試料の特定領域における定性的な発光寿命の値の分布、および試料の特定地点における定量的な発光寿命の値を短時間で取得することができる。したがって、本発明の発光寿命測定装置およびその測定方法は、発光特性のわずかな変化をその場測定することができる。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施の形態に係る発光寿命測定装置の構成図である。矢印は光（励起光または発光）を示す。

図１において、本発明の発光寿命測定装置１００は、パルスレーザー光源部１１０、測定用光学系１２０、励起光検出部１３０、発光寿命分布画像取得部１４０、発光減衰曲線測定部１５０、および表示部１６０を備える。

パルスレーザー光源部１１０は、試料に照射するパルス励起光を繰り返し出力する。パルス励起光の種類は、特に限定されないが、超短パルスレーザー光が好ましい。

測定用光学系１２０は、パルスレーザー光源部１１０から入力したパルス励起光を試料に照射し、試料から放出される発光ならびにパルス励起光を照射した時刻に関する時間情報およびパルス励起光を照射した位置に関する位置情報を出力する。

励起光検出部１３０は、パルスレーザー光源部１１０から入力したパルス励起光を検出し、トリガー信号を生成する。また、励起光検出部１３０は、生成したトリガー信号を出力する。

発光寿命分布画像取得部１４０は、測定用光学系１２０から出力された発光および励起光検出部１３０から出力されたトリガー信号を入力し、時間ゲート法によって試料の特定領域内の各地点における発光寿命を算出する。また、発光寿命分布画像取得部１４０は、測定用光学系１２０から時間情報および位置情報を入力し、算出された発光寿命の値と組み合わせることで、発光寿命分布画像を作成する。

ここで、図２を用いて、時間ゲート法による発光寿命の測定について説明する。図２は、時間ゲート法の原理を説明するための試料の一地点における発光減衰曲線を示す図である。横軸は時間軸、縦軸は光子数（発光強度）を示す。また、点線は試料に照射したパルス励起光（トリガー信号に相当）を示し、実線は試料から放出された発光を示す。

時間ゲート法で発光寿命を算出するには、まず、試料の一地点における発光減衰曲線をパルス励起光（トリガー信号）からの遅延時間に応じて複数のウィンドウ（図２では１〜４の４つのウィンドウ）に分割し、各ウィンドウにおける積分発光強度の値を算出する。次いで、算出された積分発光強度の値を時間に対してプロットし、積分発光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定することで当該一地点における発光寿命を算出する。このとき、各ウィンドウの積分発光強度の値と位置情報を組み合わせることで、ウィンドウ数と同じ数の時間分解共焦点発光画像を作成することができる（実施例参照）。同様に、発光寿命の値と位置情報を組み合わせることで、発光寿命分布画像を作成することができる（実施例参照）。なお、時間ゲートのウィンドウ数（図２では４つ）およびウィンドウ幅（図２では２ナノ秒）は、任意に設定すればよい。

図１の説明に戻る。発光減衰曲線測定部１５０は、測定用光学系１２０から出力された発光および励起光検出部１３０から出力されたトリガー信号を入力し、時間相関単一光子計数法によって試料の特定地点における発光減衰曲線を測定する。

ここで、時間相関単一光子計数法による発光減衰曲線の測定について説明する。前記のとおり、時間相関単一光子計数法は、１回の励起によって特定地点において最初に発生する光子１個の時間軸上での発生確率分布を測定し、それを１回の励起によって特定地点において発生する全光子の時間軸上での強度分布とみなすことにより特定地点における発光減衰曲線を求める方法である。通常、発光減衰曲線測定部１５０は、トリガー信号をスタート信号とし、１回の励起によって光子を最初に検出した時をストップ信号とし、スタート信号とストップ信号との間の時間を測定することで発光減衰曲線を作成する。しかし、発光減衰曲線測定部１５０は、１回の励起によって光子を最初に検出した時をスタート信号とし、遅延回路などにより遅延させたトリガー信号をストップ信号としても、スタート信号とストップ信号との間の時間を測定することで発光減衰曲線を作成することができる（実施例参照）。後者の方法は、確実にストップ信号が入力されるという点で、前者の方法より優れている。

表示部１６０は、発光寿命分布画像取得部１４０が作成した発光寿命分布画像、および発光減衰曲線測定部１５０が作成した発光減衰曲線を表示する。

次に、上記構成を有する発光寿命測定装置の動作を説明する。

まず、パルスレーザー光源部１１０は、パルス励起光を測定用光学系１２０および励起光検出部１３０に出力する。

次いで、測定用光学系１２０は、パルスレーザー光源部１１０から入力したパルス励起光を試料に照射し、試料から放出される発光を発光寿命分布画像取得部１４０または発光減衰曲線測定部１５０に出力する。このとき、測定用光学系１２０は、パルス励起光を照射した時刻に関する時間情報およびパルス励起光を照射した位置に関する位置情報も発光寿命分布画像取得部１４０または発光減衰曲線測定部１５０に出力する。

また、励起光検出部１３０は、パルスレーザー光源部１１０から入力したパルス励起光を検出し、トリガー信号を生成する。生成されたトリガー信号は、発光寿命分布画像取得部１４０または発光減衰曲線測定部１５０に出力される。

次いで、発光寿命分布画像取得部１４０は、測定用光学系１２０から出力された発光および励起光検出部１３０から出力されたトリガー信号を入力し、時間ゲート法によって試料の特定領域内の各地点における発光寿命を測定する。また、発光寿命分布画像取得部１４０は、測定用光学系１２０から位置情報および時間情報を入力し、前記発光寿命の値と組み合わせることで、発光寿命分布画像を作成する。作成された発光寿命分布画像は、表示部１６０に出力される。

次いで、発光減衰曲線測定部１５０は、測定用光学系１２０から出力された発光および励起光検出部１３０から出力されたトリガー信号を入力し、時間相関単一光子計数法によって試料の特定地点における発光減衰曲線を測定する。測定された発光減衰曲線は、表示部１６０に出力される。

次いで、表示部１６０は、発光寿命分布画像取得部１４０が作成した発光寿命分布画像、および発光減衰曲線測定部１５０が測定した発光減衰曲線を表示する。

次に、図３に示されるフローチャートを用いて、上記構成を有する発光寿命測定装置を用いて試料の発光寿命を測定する手順を説明する。

まず、ステップＳ１０００において、試料を測定用光学系１２０のステージに置く。試料は、特に限定されないが、生体組織（固定組織または生組織）、細胞（固定細胞または生細胞）、高分子薄膜などを用いることができる。例えば、細胞活性度等を測定する場合、試料は、生体組織（生組織）または生細胞（培養細胞）を用いればよい。

次いで、ステップＳ１１００において、測定用光学系１２０を用いて試料の発光強度画像を取得する。

次いで、ステップＳ１２００において、取得した発光強度画像から発光寿命分布画像を取得する領域を特定する。

次いで、ステップＳ１３００において、測定用光学系１２０および発光寿命分布画像取得部１４０を用いて試料の時間分解発光画像を取得する。

次いで、ステップＳ１４００において、発光寿命分布画像取得部１４０を用いて試料の特定領域内の各地点における発光寿命を時間分解発光画像から時間ゲート法により算出し、発光寿命分布画像を取得する。

次いで、ステップＳ１５００において、取得した発光寿命分布画像から発光減衰曲線を測定する地点を特定する。

次いで、ステップＳ１６００において、測定用光学系１２０および発光減衰曲線測定部１５０を用いて試料の特定地点における発光減衰曲線を取得する。

次いで、ステップＳ１７００において、他に発光減衰曲線を測定する地点があるか否かを判断する。測定する地点がある場合（Ｓ１７００：ＮＯ）は、ステップＳ１５００に戻る。測定する地点が無い場合（Ｓ１７００：ＹＥＳ）は、本フローを終了する。

以上のように、本発明によれば、試料の特定領域における発光寿命の定性的な値の空間分布を示す発光寿命空間分布画像を迅速に取得できるだけでなく、その画像を基に発光寿命を定量的に調べたい地点を特定し、その特定地点の発光減衰曲線を測定することができる。本発明によれば、従来の発光強度の測定や試薬などを用いた方法と異なり、（１）実時間で、（２）特別な試薬やサンプリングなどを必要とせずに、（３）顕微鏡で観察しながら容易に、その場測定を行うことができる。

また、本発明によれば、参考例に示されるように、単一生細胞内の発光寿命の経時変化を測定することができ、細胞活性度等の経時変化を高感度に検出することができる。

また、本発明によれば、参考例に示されるように、高分子薄膜の発光寿命の空間分布を測定することができ、高分子薄膜のモルフォロジーを高感度に検出することができる。

なお、本実施の形態では、発光寿命分布画像および発光減衰曲線を取得するようにしたが、参考例に示されるように、さらに発光減衰曲線測定部が時間分解蛍光スペクトルも取得するようにしてもよい。

また、本実施の形態では、表示部で発光寿命分布画像および発光減衰曲線を表示するようにしたが、発光寿命分布画像および発光減衰曲線を他の機器に出力するようにしてもよい。

以下、本発明のより具体的な実施の形態（実施例）について説明する。なお、本発明は、本実施例に限定して解釈されるものではない。

［実施例１］
本実施例では、本発明に係る発光寿命測定装置を用いて、多重標識されたウシ肺動脈内皮細胞（固定標本）の発光（蛍光）寿命分布画像および特定地点の発光（蛍光）減衰曲線を取得した例を示す。

（発光寿命測定装置）
まず、本実施例で用いた発光寿命測定装置について説明する。図４は、本実施例で用いた発光寿命測定装置の構成図である。矢印は光（励起光または発光）を示す。

図４において、本実施例の発光寿命測定装置２００は、パルスレーザー光源部３００、測定用光学系４００、励起光検出部５００、発光寿命分布画像取得部６００、発光減衰曲線測定部７００、および表示部８００を備える構成とした。

パルスレーザー光源部３００は、半導体励起ｃｗ固体レーザー３０２（Millennia；スペクトラ・フィジックス）、フェムト秒チタンサファイアレーザー３０４（Tsunami；スペクトラ・フィジックス；７７０〜９８０ｎｍ、８０フェムト秒、８０ＭＨｚ）、パルスピッカー３０６（350-160I；Conoptics）およびＢＢＯ結晶３０８（０.５ｍｍ）を備える構成とした。

測定用光学系４００は、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２（倒立顕微鏡（TE2000-E；ニコン）およびスキャナヘッド（デジタルエクリプスＣ１；ニコン））を備える構成とした。

励起光検出部５００は、フォトダイオード５０２および前置増幅器５０４（VT120；ORTEC）を備える構成とした。

発光寿命分布画像取得部６００は、フィルターボックス６０２、発光寿命解析ユニット６０４（LIMO；ニコンヨーロッパビーブイ）およびコンピューター６０６を備える構成とした。

発光減衰曲線測定部７００は、フィルターボックス７０２、モノクロメーター分光器７０４（G-250；ニコン）、マイクロチャンネルプレート光電子増倍管７０６（R-3809U-52；浜松ホトニクス）、前置増幅器７０８（C5594；浜松ホトニクス）、波高弁別器７１０，７１４（583；ORTEC）、時間電圧変換器７１２（457；ORTEC）、遅延回路７１６（425A；ORTEC）、多チャンネル波高分析器７１８（MCA7700；セイコー・イージーアンドジー）、コンピューター７２０、およびパルスモーター７２２を備える構成とした。

表示部８００は、モニター８０２を備える構成とした。

次に、上記構成を有する発光寿命測定装置の動作を説明する。

パルスレーザー光源部３００では、半導体励起ｃｗ固体レーザー３０２は、フェムト秒チタンサファイアレーザー３０４に励起レーザー光を出力し、フェムト秒チタンサファイアレーザー３０４内のレーザー活性媒質を励起する。励起されたフェムト秒チタンサファイアレーザー３０４は、フェムト秒パルスレーザー光を出力する。出力されたフェムト秒パルスレーザー光は、その一部はトリガー信号用に励起光検出部５００に出力され、残りは励起光用にＢＢＯ結晶３０８によって２倍波にされ、シングルモード光ファイバーを介して測定用光学系４００に出力される。なお、発光減衰曲線を測定するときは、フェムト秒パルスレーザー光は、パルスピッカー３０６によって繰り返し周波数を９ＭＨｚに調整される。

測定用光学系４００では、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２は、入力した励起光（２倍波にされたフェムト秒パルスレーザー光）を試料（細胞）に照射し、試料から放出された発光をマルチモード光ファイバーを介して発光寿命分布画像取得部６００または発光減衰曲線測定部７００に出力する。このとき、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２は、小さく絞ったレーザー光スポットで試料を走査しながら照射する。また、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２は、走査に関する位置情報も発光寿命分布画像取得部６００または発光減衰曲線測定部７００に出力する。

励起光検出部５００では、フォトダイオード５０２は、入力したフェムト秒パルスレーザー光を検出し、トリガー信号を生成する。生成されたトリガー信号は、前置増幅器５０４により増幅され、発光寿命分布画像取得部６００または発光減衰曲線測定部７００に出力される。

発光寿命分布画像取得部６００では、測定用光学系４００から出力された発光は、フィルターボックス６０２を介して発光寿命解析ユニット６０４に入力される。発光寿命解析ユニット６０４およびコンピューター６０６は、時間ゲート法により、入力したトリガー信号、発光および位置情報から、時間分解共焦点発光画像を作成する。さらに、コンピューター６０６は、時間分解共焦点発光画像の各ピクセルにおける発光強度の経時変化から発光寿命を算出し、算出された発光寿命をプロットすることで蛍光寿命分布画像を作成する。作成された発光寿命分布画像は、表示部８００に出力される。

発光減衰曲線測定部７００では、測定用光学系４００から出力された発光は、フィルターボックス７０２およびモノクロメーター分光器７０４を介してマイクロチャンネルプレート光電子増倍管７０６に入力される。マイクロチャンネルプレート光電子増倍管７０６は、入力した発光を検出し、発光光子信号を生成する。生成された発光光子信号は、前置増幅器７０８により増幅され、波高弁別器７１０によって波高弁別され、時間電圧変換器７１２にスタート信号として入力される。また、励起光検出部５００から入力したトリガー信号は、波高弁別器７１４によって波高弁別され、遅延回路７１６によって時間調整され、時間電圧変換器７１２にストップ信号として入力される。時間電圧変換器７１２、多チャンネル波高分析器７１８およびコンピューター７２０は、ピコ秒時間相関単一光子計数法により、入力したスタート信号およびストップ信号から発光減衰曲線を算出する。算出された発光減衰曲線は、表示部８００に出力される。なお、後述する参考例に示されるように、コンピューター７２０およびパルスモーター７２２によりモノクロメーター分光器７０４に波長を掃引させることにより、試料の特定地点における時間分解発光スペクトルを測定することもできる。

表示部８００では、モニター８０２は、発光寿命分布画像取得部６００から入力した発光寿命分布画像および発光減衰曲線測定部７００から入力した発光減衰曲線を表示する。

（測定手順）
次に、本実施例における測定手順を説明する。

発光寿命分布画像の取得を以下のように行った。
（１）まず、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２の検出器を用いて共焦点発光画像を取得した。励起光の波長は、４５０ｎｍとした。
（２）次に、得られた共焦点発光画像から発光寿命分布画像を取得したい領域を特定し、スキャンヘッドの走査範囲を設定した。本実施例では、走査範囲を２５６×２５６ピクセルとした。
（３）次に、発光を伝播させるマルチモードファイバーを、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２の検出器から発光寿命解析ユニット６０４に接続されたフィルターボックス６０２に繋ぎ替え、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２の連続走査を開始させた。このとき、パルス励起光の波長は、４１０ｎｍ、４４０ｎｍまたは４５０ｎｍとした。また、１ピクセルあたりのレーザー光照射時間を５０マイクロ秒とし、平均化を１０回行った。このような条件の場合、約２分の測定時間で時間分解共焦点発光画像を得ることができた。また、必要に応じてフィルターボックス６０２内にフィルター（色ガラス）を装着した。
（４）最後に、発光寿命解析ユニット６０４およびコンピューター６０６により、（２）で特定された領域の時間分解発光画像を取得し、その領域の発光寿命分布画像を作成した。本実施例では、時間ゲート法のウィンドウは２ナノ秒ごとに４つとした。したがって、得られる４枚の時間分解発光画像は、トリガー信号が入力されてから０〜２ナノ秒、２〜４ナノ秒、４〜６ナノ秒、６〜８ナノ秒の間に試料から放出された発光を示す画像となる。

引き続き、発光減衰曲線の測定を以下のように行った。
（５）次に、得られた発光寿命分布画像を参照して発光減衰曲線を測定したい地点を特定し、スキャンヘッドの走査範囲を必要最小限の大きさに設定した。本実施例では、走査範囲を１６×１６ピクセルとした。
（６）次に、発光を伝播させるマルチモードファイバーを、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２の検出器からモノクロメーター分光器７０４に接続されたフィルターボックス７０２に繋ぎ替え、共焦点レーザー走査型顕微鏡４０２の連続走査を開始させた。このとき、パルス励起光の波長は、４１０ｎｍ、４４０ｎｍまたは４５０ｎｍとした。また、必要に応じてフィルターボックス７０２内にフィルターを装着した。
（７）最後に、時間電圧変換器７１２、多チャンネル波高分析器７１８およびコンピューター７２０により、（５）で特定した地点の発光減衰曲線を測定した。

（測定結果）
測定試料は、BODIPY FL（微小管）、テキサスレッド−Ｘファロイジン（Ｆ−アクチン）およびDAPI（核）で多重標識されたウシ肺動脈内皮細胞の既成スライド（モレキュラープローブス：F-14781）、またはMito Tracker Red CMXRos（ミトコンドリア）、BODIPY FLファラシジン（Ｆ−アクチン）およびDAPI（核）で多重標識されたウシ肺動脈内皮細胞の既成スライド（モレキュラープローブス：F-14780）を用いた。

パルス励起光の波長は、４１０ｎｍ（図５）または４４０ｎｍ（図６）とした。

図５（Ａ）〜（Ｄ）は、発光寿命分布画像取得部を用いて測定した、ウシ肺動脈内皮細胞（F-14781）の時間分解共焦点蛍光画像である。図５（Ａ）は、トリガー信号が入力されてから０〜２ナノ秒、図５（Ｂ）は２〜４ナノ秒、図５（Ｃ）は４〜６ナノ秒、図５（Ｄ）は６〜８ナノ秒の間の時間分解共焦点蛍光画像である。

図５（Ｅ）は、共焦点レーザー走査型顕微鏡の検出器によって測定した、ウシ肺動脈内皮細胞（F-14781）の共焦点蛍光画像である。得られた画像は、発光寿命分布画像取得部によって測定した時間分解共焦点蛍光画像（図５（Ａ）〜（Ｄ））とほぼ同一であることがわかる。

図５（Ｆ）は、図５（Ａ）〜（Ｄ）の結果を解析して得られた蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラムである。また、図５（Ｇ）は、図５（Ａ）〜（Ｄ）の結果を解析して得られた蛍光寿命の値の空間的分布を示す蛍光寿命分布画像である。図５（Ｇ）から、蛍光寿命は、細胞内の位置によって異なることがわかる。すなわち、蛍光寿命は、核では１.８〜２.０ナノ秒であるのに対し、核の周辺部では２.５〜３.０ナノ秒であることがわかる。また、図５（Ｆ）のヒストグラムには、１.８ナノ秒および２.６ナノ秒の２つのピークが存在している。それぞれのピークは、核を標識する蛍光色素の蛍光寿命と、核の周辺部を標識する蛍光色素の蛍光寿命に対応している。

図６（Ａ）は、共焦点レーザー走査型顕微鏡の検出器によって測定した、ウシ肺動脈内皮細胞（F-14780）の共焦点蛍光画像である。また、図６（Ｂ）は、発光寿命分布画像取得部によって測定した、ウシ肺動脈内皮細胞（F-14780）の蛍光寿命分布画像である。図６（Ｃ）は、図６（Ｂ）の結果を解析して得られた蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラムである。図６（Ｄ）は、発光減衰曲線測定部によって測定した、ウシ肺動脈内皮細胞の特定地点（図６（Ａ）の×印）の蛍光減衰曲線である。

図６（Ｄ）から、時間ゼロ付近においてデルタ関数的な鋭いピークがあることがわかる。このピークは、共焦点レーザー走査型顕微鏡のダイクロイックミラー、フィルター、モノクロメーター分光器によって取り除くことができなかった散乱光によるものである。したがって、蛍光減衰曲線から蛍光寿命を算出する際には、この部分を除いて算出する。実際に、時間ゼロ付近のピークを除き、蛍光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を算出すると、この地点の蛍光寿命は約２.９ナノ秒となった。この値は、発光寿命分布画像取得部によって算出された蛍光寿命と一致していた。

このように、本実施の形態に係る発光寿命測定装置は、発光寿命の定性的な値の空間分布を示す発光寿命空間分布画像を取得できるだけでなく、その画像を基に発光寿命を定量的に調べたい地点を特定し、その地点の発光減衰曲線を測定することができる。

［実施例２］
本実施例では、実施例１と同じ発光寿命測定装置を用いて、ｐＨ感応性色素である2',7'-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein（ＢＣＥＣＦ）によって染色された高度好塩菌の発光（蛍光）寿命分布画像および特定地点の発光（蛍光）減衰曲線を取得した例を示す。

測定試料は、ＢＣＥＣＦによって染色された、生きている高度好塩菌（Halobacterium Salinarum）を用いた。ＢＣＥＣＦは、蛍光強度だけでなく蛍光寿命もｐＨと相関関係を有することが報告されている（H. Szmacinski and J. R. Lakowicz, "Optical measurements of pH using fluorescence lifetime and phase-modulation fluorometry" Anal. Chem. 65, 1668-1674.）。

パルス励起光の波長は、４５０ｎｍとした。また、フィルターを用いて、時間分解共焦点蛍光画像を取得する際には５１５〜５６０ｎｍの波長の蛍光を観察し、蛍光減衰曲線を取得する際には５３０ｎｍの波長の蛍光を観察した。

図７（Ａ）〜（Ｄ）は、発光寿命分布画像取得部を用いて測定した、ＢＣＥＣＦによって染色された高度好塩菌の時間分解共焦点蛍光画像である。図７（Ａ）は、トリガー信号が入力されてから０〜２ナノ秒、図７（Ｂ）は２〜４ナノ秒、図７（Ｃ）は４〜６ナノ秒、図７（Ｄ）は６〜８ナノ秒の間の時間分解共焦点蛍光画像である。

図７（Ｅ）は、図７（Ａ）〜（Ｄ）の結果を解析して得られた蛍光寿命の値の空間的分布を示す蛍光寿命分布画像である。また、図７（Ｆ）は、図７（Ａ）〜（Ｄ）の結果を解析して得られた蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラムである。細胞内のＢＣＥＣＦの蛍光寿命がｐＨに依存しているとすると、図７（Ｅ）から細胞内のｐＨの空間分布を取得することができる。また、図７（Ｆ）のヒストグラムから、細胞内のｐＨの数値分布を取得することができ、平均ｐＨを算出することができる。

図７（Ｇ）は、発光減衰曲線測定部によって測定した、ＢＣＥＣＦによって染色された高度好塩菌の蛍光減衰曲線である。図７（Ｇ）から、蛍光強度が単一指数関数的に減衰すると仮定して蛍光寿命を算出すると、この地点の蛍光寿命は約２.９ナノ秒となった。この値は、発光寿命分布画像取得部によって算出された蛍光寿命（２.６〜２.７ナノ秒）と約１０％異なっていた。これは、ウィンドウ（時間領域）数を４つに設定したことにより、時間ゲート法による蛍光寿命の算出の精度が非常に粗くなってしまったためだと考えられる。

このように、本実施の形態に係る発光寿命測定装置は、生細胞においても、発光寿命の定性的な値の空間分布を示す発光寿命空間分布画像を取得できるだけでなく、その画像を基に発光寿命を定量的に調べたい地点を特定し、その地点の発光減衰曲線を測定することができる。本発明に係る発光寿命測定装置は、時間ゲート法による発光寿命の定性的な値の空間分布の測定と、時間相関単一光子計数法による特定地点における発光寿命の定量的な値の測定とを組み合わせることで、細胞内の光励起ダイナミクスに関して詳細な情報を得ることができる。

［参考例１］
本参考例では、実施例１と同じ発光寿命測定装置を用いて、ＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞（生細胞）において、飢餓による細胞死誘導に伴いＧＦＰの蛍光寿命が経時的に変化する様子を観測した例を示す。

測定試料は、ＣＭＶプロモーターによりＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞（生細胞）を用いた。本参考例では、栄養分の無い環境下に置かれたＨｅｌａ細胞の蛍光寿命を経時的に測定した。

パルス励起光の波長は、４４０ｎｍとした。また、フィルターボックス内のフィルターはすべて取り外した。

図８（Ａ）は、共焦点レーザー走査型顕微鏡の検出器によって測定した、ＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光画像である。また、図８（Ｂ）は、発光寿命分布画像取得部を用いて測定した、ＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の測定開始直後の蛍光寿命分布画像である。本実施例で用いたＧＦＰは、単量体だけではなく、tudorと呼ばれるタンパク質の凝集体（顆粒）も形成する。図８（Ａ）から、顆粒部分の蛍光強度は、周囲と比較して非常に強いことがわかる。一方、図８（Ｂ）から、顆粒部分の蛍光寿命は、周囲と比べて大きな違いはないことがわかる。

図８（Ｂ）〜（Ｉ）は、発光寿命分布画像取得部を用いて測定した、ＧＦＰを発現させたＨｅｌａ細胞の蛍光寿命分布画像である。図８（Ｂ）は測定を開始してから０分後、図８（Ｃ）は測定を開始してから１０分後、図８（Ｄ）は測定を開始してから２０分後、図８（Ｅ）は測定を開始してから３０分後、図８（Ｆ）は測定を開始してから５０分後、図８（Ｇ）は測定を開始してから７０分後、図８（Ｈ）は測定を開始してから１００分後、図８（Ｉ）は測定を開始してから１２０分後の蛍光寿命分布画像である。図８（Ｂ）〜（Ｉ）から、ＨｅＬａ細胞を栄養分の無い環境に放置すると、蛍光寿命の分布に変化が生じることがわかる。すなわち、測定開始から２０分程度までは、顆粒とその周囲のＧＦＰの蛍光寿命の違いは小さいのに対し（図８（Ｂ）〜（Ｄ）参照）、測定開始から５０分以上経過すると、顆粒以外の部分の蛍光寿命が長くなり、蛍光寿命分布画像からも顆粒の存在を認識することができるようになる（図８（Ｆ）〜（Ｉ）参照）。

図９（Ａ）は、図８に示される細胞の特定地点（Ａ〜Ｃ地点）における蛍光寿命の経時的変化を示すグラフである。顆粒以外の部分であるＡ地点およびＢ地点では、ＧＦＰの蛍光寿命は時間の経過とともに長くなることがわかる。一方、顆粒があるＣ地点では、ＧＦＰの蛍光寿命は時間が経過しても大きな変化は見られなかった。図９（Ｂ）は、画像内の全領域（２５６ピクセル×２５６ピクセル）内における、ＧＦＰの蛍光寿命のヒストグラムである。蛍光寿命の分布は、観測を開始した直後は２.０ナノ秒および２.５ナノ秒の２つのピークを有するが、細胞死に伴い長寿命の方向に移動し、３.３ナノ秒に中心を有するように変化する。このように、図８および図９から、顆粒以外の部分のＧＦＰの蛍光寿命が、細胞死に伴い長くなることがわかる。

このように、本実施の形態に係る発光寿命測定装置は、単一生細胞内の発光寿命の経時変化を測定することができ、細胞死に伴う発色分子周囲の微視的な環境変化を高感度に検出することができる。

［参考例２］
本参考例では、実施例１と同じ発光寿命測定装置を用いて、ＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞（生細胞）において、抗Ｆａｓモノクローナル抗体による細胞死誘導に伴いＧＦＰの蛍光寿命が経時的に変化する様子を観測した例を示す。

測定試料は、ＣＭＶプロモーターによりＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞（生細胞）を用いた。本参考例では、抗Ｆａｓモノクローナル抗体を導入したＨｅＬａ細胞の蛍光寿命を経時的に測定した。

パルス励起光の波長は、４４０ｎｍとした。また、フィルターボックス内のフィルターはすべて取り外した。

図１０（Ａ）〜（Ｅ）は、発光寿命分布画像取得部を用いて測定した、ＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の蛍光寿命分布画像である。また、図１０（Ｆ）〜（Ｊ）は、図１０（Ａ）〜（Ｅ）の結果を解析して得られた蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラムである。図１０（Ａ）および（Ｆ）は抗Ｆａｓモノクローナル抗体を細胞に導入してから０分後、図１０（Ｂ）および（Ｇ）は９０分後、図１０（Ｃ）および（Ｈ）は１８０分後、図１０（Ｄ）および（Ｉ）は２４０分後、図１０（Ｅ）および（Ｊ）は３８０分後の結果である。

抗Ｆａｓモノクローナル抗体を細胞に導入した直後は、約２.３ナノ秒にピークを有する蛍光寿命の分布のみが観測される（図１０（Ｆ）参照）。しかし、時間の経過とともに２.５〜３.０ナノ秒の領域にブロードな蛍光寿命の分布が出現し、その相対量が増加する様子がわかる。このように、ＧＦＰの蛍光寿命は、細胞死に伴い長くなることがわかる。

このように、本実施の形態に係る発光寿命測定装置は、単一生細胞内の発光寿命の経時変化を測定することができ、細胞死に伴う発色分子周囲の微視的な環境変化を高感度に検出することができる。

［参考例３］
本参考例では、実施例１と同じ発光寿命測定装置を用いて、時間分解蛍光スペクトルを測定した例を示す。

測定試料は、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescent Protein：以下「ＣＦＰ」と略記する）と黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescent Protein：以下「ＹＦＰ」と略記する）とをリンカーで連結したタンパク質をＣＭＶプロモーターにより発現させたＨｅＬａ細胞（生細胞）を用いた。また、培養液中のｐＨを監視するために、ｐＨ指示薬としてフェノールレッドを培養液に加えた。

パルス励起光は、４４０ｎｍを用いた。また、フィルターボックス内のフィルターはすべて取り外した。

図１１は、発光減衰曲線測定部を用いて測定した、ＣＦＰとＹＦＰを連結したタンパク質を発現させたＨｅＬａ細胞の時間分解蛍光スペクトルである。上段から、励起光を照射してから０〜６１ピコ秒、６１〜１８３ピコ秒、１８３〜３６６ピコ秒、３６６ピコ秒〜２.８０６ナノ秒、２.８０６〜７.６８６ナノ秒、７.６８６ナノ秒〜１３.７８６ナノ秒の間の蛍光スペクトルである。横軸は波長、縦軸は蛍光強度を示す。

図１１から、ＣＦＰを励起させると、４５０〜５５０ｎｍの領域にＣＦＰおよびＹＦＰの蛍光が観察されるだけではなく、５５０〜６５０ｎｍの領域にフェノールレッドの蛍光も観察されることがわかる。さらに、フェノールレッドの蛍光強度は、励起直後は非常に弱いが、約５００ピコ秒の時定数で緩やかに増加することもわかる。これらのことから、細胞内の蛍光タンパク質から培養液中のフェノールレッドに約５００ピコ秒の時定数で励起エネルギーの移動が起きていることがわかる。

このように、本実施の形態に係る発光寿命測定装置は、単一生細胞について時間分解蛍光スペクトルを測定することができ、細胞内外の励起エネルギーの移動なども高感度に検出することができる。

［参考例４］
本参考例では、実施例１と同じ発光寿命測定装置を用いて、励起光を吸収する有機色素がドープされた高分子薄膜のモルフォロジー像を測定した例を示す。

測定試料は、４−ジメチルアミノ−４’−ニトロスチルベン（ＤＮＳ）をドープしたポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）薄膜を用いた。この薄膜は、酸化インジウムスズ（Indium-Tin-Oxide：ＩＴＯ）が均一に蒸着された石英基板上にＰＭＭＡを含むベンゼン溶液を滴下し、スピンコート法により作成した。作成された薄膜の厚さは、約７００ｎｍであった。

パルス励起光の波長は、４１０ｎｍとした。ＰＭＭＡ膜中におけるＤＮＳの吸収極大波長および蛍光極大波長は、それぞれ４３５ｎｍと６００ｎｍである。

図１２（Ａ）〜（Ｄ）は、フィルターボックス内のフィルターをすべて取り外して発光寿命分布画像取得部を用いて測定した、ＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の時間分解共焦点蛍光画像である。図１２（Ａ）は、トリガーパルスが入力されてから０〜２ナノ秒、図１２（Ｂ）は２〜４ナノ秒、図１２（Ｃ）は４〜６ナノ秒、図１２（Ｄ）は６〜８ナノ秒の間の時間分解共焦点蛍光画像である。図１２（Ｅ）は、図１２（Ｂ）の画像にコントラストの補正を行ったものである。図１２（Ｆ）は、共焦点レーザー走査型顕微鏡の検出器によって測定した、ＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の共焦点蛍光画像である。

図１３（Ａ）〜（Ｄ）は、フィルターボックス内に５２０ｎｍから長波長側の蛍光を観察するためのフィルターを装着して発光寿命分布画像取得部を用いて測定した、ＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の時間分解共焦点蛍光画像である。図１３（Ａ）は、トリガーパルスが入力されてから０〜２ナノ秒、図１３（Ｂ）は２〜４ナノ秒、図１３（Ｃ）は４〜６ナノ秒、図１３（Ｄ）は６〜８ナノ秒の間の時間分解共焦点蛍光画像である。図１３（Ｅ）は、図１３（Ｂ）の画像にコントラストの補正を行ったものである。図１３（Ｆ）は、共焦点レーザー走査型顕微鏡の検出器によって測定した、ＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の共焦点蛍光画像である。

図１２（Ａ）に示される０〜２ナノ秒の間の時間分解共焦点蛍光画像から、楕円形が複雑に入り組んだＰＭＭＡ膜のモルフォロジー像が明瞭に観測された。一方、図１２（Ｂ）〜（Ｄ）に示される２ナノ秒以降の時間分解共焦点蛍光画像では、コントラストが悪くモルフォロジー像を見ることができなかった。しかし、図１２（Ｅ）から、コントラストの補正を行えば、２〜４ナノ秒の間の時間分解共焦点蛍光画像からもＰＭＭＡ膜のモルフォロジー像が観測されることがわかる。このとき、図１２（Ａ）に示される画像と図１２（Ｅ）に示される画像とでは、モルフォロジー像の明暗が逆であった。

図１３（Ａ）に示される０〜２ナノ秒の間の時間分解共焦点蛍光画像からも、楕円形が複雑に入り組んだＰＭＭＡ膜のモルフォロジー像が観測された。また、図１３（Ａ）に示される画像と図１３（Ｅ）に示される画像とでは、モルフォロジー像の明暗が同じであった。さらに、図１３（Ａ）に示される画像と図１３（Ｆ）に示される画像とでも、モルフォロジー像の明暗が同じであった。

フィルターを用いて測定した図１３（Ａ）ではモルフォロジー像の明暗の逆転が見られなかったことから、図１２（Ａ）に示される明瞭なモルフォロジー像は、ダイクロイックミラーから漏れ出た試料からの錯乱光と蛍光との重ね合わせによるものであり、明るい部分は錯乱光によるものであることが示唆された。

このように、本実施の形態に係る発光寿命測定装置は、高分子薄膜にも適用することができ、発光画像だけでなく錯乱光による明瞭なモルフォロジー像を得ることもできる。

本発明に係る発光寿命測定装置およびその測定方法は、細胞分裂や細胞死などによる細胞内の微視的な変化を反映した発光特性のわずかな変化を高感度かつ定量的にその場測定することができるので、医療用または生物学用の光学機器などに有用である。

本発明の一実施の形態に係る発光寿命測定装置の構成を示すブロック図 時間ゲート法を説明するための発光減衰曲線を示す図 本発明の一実施の形態に係る発光寿命測定装置を用いて試料の発光寿命を測定する手順を説明するフローチャート 実施例で用いた発光寿命測定装置の構成を示すブロック図 実施例１の結果を示す図。（Ａ）〜（Ｄ）はウシ肺動脈内皮細胞の時間分解共焦点蛍光画像、（Ｅ）はウシ肺動脈内皮細胞の共焦点蛍光画像、（Ｆ）はウシ肺動脈内皮細胞の蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラム、（Ｇ）はウシ肺動脈内皮細胞の蛍光寿命分布画像である。 実施例１の結果を示す図。（Ａ）はウシ肺動脈内皮細胞の共焦点蛍光画像、（Ｂ）はウシ肺動脈内皮細胞の蛍光寿命分布画像、（Ｃ）はウシ肺動脈内皮細胞の蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラム、（Ｄ）はウシ肺動脈内皮細胞の特定地点の蛍光減衰曲線である。 実施例２の結果を示す図。（Ａ）〜（Ｄ）はＢＣＥＣＦによって染色された高度好塩菌の時間分解共焦点蛍光画像、（Ｅ）はＢＣＥＣＦによって染色された高度好塩菌の蛍光寿命分布画像、（Ｆ）はＢＣＥＣＦによって染色された高度好塩菌の蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラム、（Ｇ）はＢＣＥＣＦによって染色された高度好塩菌の蛍光減衰曲線である。 参考例１の結果を示す図。（Ａ）はＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の共焦点蛍光画像、（Ｂ）〜（Ｉ）はＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の蛍光寿命分布画像である。 参考例１の結果を示す図。（Ａ）は図８に示される細胞の特定地点における蛍光寿命の経時的変化を示すグラフ、（Ｂ）はＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラムである。 参考例２の結果を示す図。（Ａ）〜（Ｅ）はＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の蛍光寿命分布画像、（Ｆ）〜（Ｊ）はＧＦＰを発現させたＨｅＬａ細胞の蛍光寿命の値の分布を示すヒストグラムである。 参考例３の結果を示す時間分解蛍光スペクトル 参考例４の結果を示す図。（Ａ）〜（Ｄ）はＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の時間分解共焦点蛍光画像、（Ｅ）は（Ｂ）の画像にコントラストの補正を行った画像、（Ｆ）はＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の共焦点蛍光画像である。 参考例４の結果を示す図。（Ａ）〜（Ｄ）はＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の時間分解共焦点蛍光画像、（Ｅ）は（Ｂ）の画像にコントラストの補正を行った画像、（Ｆ）はＤＮＳをドープしたＰＭＭＡ薄膜の共焦点蛍光画像である。

符号の説明

１００，２００ 発光寿命測定装置
１１０，３００ パルスレーザー光源部
１２０，４００ 測定用光学系
１３０，５００ 励起光検出部
１４０，６００ 発光寿命分布画像取得部
１５０，７００ 発光減衰曲線測定部
１６０，８００ 表示部
３０２ 半導体励起ｃｗ固体レーザー
３０４ フェムト秒チタンサファイアレーザー
３０６ パルスピッカー
３０８ ＢＢＯ結晶
４０２ 共焦点レーザー走査型顕微鏡
５０２ フォトダイオード
５０４，７０８ 前置増幅器
６０２，７０２ フィルターボックス
６０４ 発光寿命解析ユニット
６０６，７２０ コンピューター
７０４ モノクロメーター分光器
７０６ マイクロチャンネルプレート光電子増倍管
７１０，７１４ 波高弁別器
７１２ 時間電圧変換器
７１６ 遅延回路
７１８ 多チャンネル波高分析器
７２２ パルスモーター
８０２ モニター

Claims (8)

1. パルス励起光を出射するパルスレーザー光源部と、
   前記パルスレーザー光源部から出射された前記パルス励起光の一部を検出してトリガー信号を生成し、前記トリガー信号を出力する励起光検出手段と、
   前記パルスレーザー光源部から出射された前記パルス励起光の他の一部を試料に照射し、前記試料から放出される発光を出力する測定用光学系と、
   前記トリガー信号を入力してから複数の時間帯において前記発光の光子数を計測することで発光寿命を算出する時間ゲート法によって、前記試料の複数地点における発光寿命の値およびその空間分布を取得する発光寿命分布画像取得手段と、
   前記トリガー信号を入力してから前記発光の光子を検出するまでの時間、または前記発光の光子を検出してから前記トリガー信号を入力するまでの時間を測定することで発光減衰曲線を測定する時間相関単一光子計数法によって、前記試料の特定地点における発光減衰曲線を測定する発光減衰曲線測定手段と、
   を有する発光寿命測定装置。
2. 前記発光寿命分布画像取得手段は、前記試料の複数地点における発光寿命の値およびその空間分布を経時的に取得する、請求項１記載の発光寿命測定装置。
3. 前記パルス励起光はフェムト秒パルスレーザー光である、請求項１記載の発光寿命測定装置。
4. 前記測定用光学系は共焦点レーザー走査型顕微鏡である、請求項１記載の発光寿命測定装置。
5. 前記発光減衰曲線測定手段は、さらに、前記試料の特定地点における時間分解蛍光スペクトルを測定する、請求項１記載の発光寿命測定装置。
6. 前記試料は細胞である、請求項１記載の発光寿命測定装置。
7. 前記試料は高分子薄膜である、請求項１記載の発光寿命測定装置。
8. 光源からパルス励起光を出射させるステップと、
   前記パルス励起光の一部を検出して、トリガー信号を生成するステップと、
   前記パルス励起光の他の一部を試料に照射して、前記試料から発光を放出させるステップと、
   前記トリガー信号を入力してから複数の時間帯において前記発光の光子数を計測することで発光寿命を算出する時間ゲート法によって、前記試料の複数地点における発光寿命の値およびその空間分布を取得するステップと、
   取得した空間分布から発光減衰曲線を測定する地点を特定するステップと、
   前記トリガー信号を入力してから前記発光の光子を検出するまでの時間、または前記発光の光子を検出してから前記トリガー信号を入力するまでの時間を測定することで発光減衰曲線を測定する時間相関単一光子計数法によって、前記試料の特定された地点における発光減衰曲線を測定するステップと、
   を有する発光寿命測定方法。