JPS6366465A

JPS6366465A - 細胞識別・定量方法

Info

Publication number: JPS6366465A
Application number: JP61211328A
Authority: JP
Inventors: Masao Karube; 征夫軽部
Original assignee: Research Development Corp of Japan
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1986-09-08
Filing date: 1986-09-08
Publication date: 1988-03-25
Anticipated expiration: 2011-08-07
Also published as: JP2522773B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はモノクローナル抗体と画像処理システムを利用
した細胞（微生物を含む）識別・定量方法に関するもの
で、その利用分野は臨床検査のみならず、医薬品工業、
食品工業、環境分野等多岐にわたるものである。

〔従来の技術〕

従来、細胞の識別・定量は、顕微鏡下での肉眼観察で行
われてきた。また微生物の識別では、ある種の微生物の
みが生育できる選択培地を用いて、コロニーの出現から
判定する方法も用いられている。また臨床検査における
癌の診断では直接細胞を調べるのではなく、α−フェト
プロティンやＣＥＡ（癌胎児性抗原）など体液中に現れ
る可溶性タンパク賞を測定することにより行われてきた
。

しかしこれらのタンパクは、癌が進行して細胞の壊死が
起き、膜抗原が可溶化して体液中に出てきたものである
。したがって癌がある程度進行しなければ検出すること
ができず、癌の早期診断を可能にするには、細胞レベル
で癌の診断を行う必要がある。癌においては特に早期診
断が重要であることから、細胞レベルで癌の診断を簡便
・迅速に行う方法が要望されていた。

このように細胞の識別・定量技術は立ち遅れていたが、
最近細胞の識別・定量を自動的に行う機器が登場してき
た。これらは、■フローサイトメーターと■自動細胞識
別装置とに大別される。

■のフローサイトメーターは、特定の細胞の股上に存在
する抗原を、螢光色素を結合させた抗体で標識してやり
、その試料液をフローセル中を流し、レーザー光で励起
した時の螢光シグナルから、特定の細胞のみを識別する
もので、分取機能を持ったものをセルソーターと称し、
非常に高速で、多量の試料を短時間に分析可能である。

また、■の自動細胞識別装置は、従来、検査技師が細胞
を見ながら判定する際に用いたアルゴリズムを、画像処
理技術を利用して全て機械（コンピュータ）にやらせよ
うというもので、正確であり、従来の知見がそのまま利
用できる利点がある。

また、補体共存下で癌細胞に特異的な抗′体が結合する
と補体が活性化され、細胞膜に障害を生じ、そのため位
相差顕微鏡下で、正常細胞が細胞内外の通過光に位相差
を生じて明るく見えるのに対し、細胞膜に障害を受けた
癌細胞は暗く見えることを利用し、これらの輝度差をイ
メージセンサでとらえて画像処理するものも提案されて
いる。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、検体処理速度の速いフローサイトメータ
ーは、＆ｌｌｒ＆切片や、凝集しやすい細胞試料には適
用が困蜂である問題点を存する。

一方、＆Ｉｌ！′ａ切片にも適用できて正確である自動
細胞識別装置による方法は、従来の細胞診と同様、Ｐａ
ｐａｎｉｃｏｌａｏｕ法と呼ばれる２０敗ステップにも
及ぶ煩雑な染色をせねばならず、操作が極めて複雑であ
り、コンピューターによる細胞の識別に時間がかかり処
理可能な検体数が非常に少ないといった欠点がある。

しかもこれらの装置は大型で非常に高価である。

また、癌細胞の細胞膜に障害を生じさせ、位相差顕微鏡
で癌細胞を検出するようにしたものは、癌細胞の検出下
限界（全細胞数に対する癌細胞の割合）がせいぜい１０
％程度であると共に、きれいに分散した浮遊状態の細胞
でないと測定できず、＆ｆｌ織切片中の癌細胞を識別・
定量することは極めて困難であった。

しかしながら一方では、将来、細胞レベルでの臨床診断
が中心となってくることが予想されることや、食品工業
を中心に品質管理のための微生物の迅速識別技術の要望
が高まっていることなどから、簡便で、迅速な細胞識別
及び定量技術は必要不可欠である。

本発明は以上のような従来法の問題点を解消するために
提案されたもので、簡便、迅速且つ高感度に、細胞もし
くは組織レベルでの特定細胞の識別・定量が可能である
比較的低コストの細胞識別・定量方法を提供することを
目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

そのために本発明の癌細胞識別・定量方法は、特定の細
胞の特異抗原又はレセプターを、標識物質を結合させた
モノクローナル抗体で標識し、生じた螢光又は発光を、
特定の細胞の画像信号として検出し、検出信号を画像処
理することにより、特定の細胞を特異的に識別・定量す
ること、及び特定の細胞の特異抗原又はレセプターを、
標識物質を結合させたモノクローナル抗体で標識し、生
じた螢光又は発光を、特定の細胞の画像信号として検出
し、検出信号を画像処理して特定の細胞を識別すると共
に、全細胞数を測定し、特定の細胞の割合を求めること
を特徴とする。

〔作用〕

本発明によると、特定の細胞の特異抗原又はレセプター
を、標識物質を結合させたモノクローナル抗体で標識し
、生じた螢光又は発光を、特定の細胞の画像信号として
検出し、検出１３号を画像処理することにより、きれい
に分散した浮遊状態の細胞試料のみならず、組織切片や
、凝集した細胞試料中に含まれる細胞も識別・定量する
ことができ、従来必要とされた複雑な染色も必要とせず
、迅速に癌等の診断が可能となる。また全細胞数を求め
ることにより、混合細胞懸濁液中の特異細胞の割合を自
動的に求めることができる。

〔実施例〕

以下、実施例を因習に基づき説明する。

第１図は本発明による細胞を識別・定量するための装置
の全体構成を示す図で、図中１は螢光顕微鏡、２は励起
光源、３はミラー、４は試料、５はオートステージ、６
はＳＩＴカメラ、７はコントローラ、８はパーソナルコ
ンピュータ、９は画像処理ボード、１０はＲＡＭ、１１
はＣＰＵ、１２はビデオモニタ、１３はＣＲＴ、１４は
ＦＤＤ。

１５はプリンタである。

、先ず、例えば肝癌細胞の表面膜上に存在する特異抗原
を、螢光色素ＦＩＴＣを結合させた七ツクローナル抗体
ＳＣａと免疫反応させた試料４をオートステージ５に載
置し、これに水銀灯やレーザー等の励起光源２の発光光
を照射し、抗体から得られる螢光を、イメージセンサと
してのＳＩＴカメラ６を用いて検出する。検出した画像
信号は、画像処理ボード上で２値化処理した後、”Ｈ４
ｇｈルベルの画素数のみをカウントしてＲＡＭｌ０に記
憶させ、癌細胞を定量する。測定は１つの試料（プレパ
ラート）に対してコンビエータでコントロールした顕微
鏡１のオートステージ５をスキャンさせて２００回測定
した。２００回の測定に要する時間は１０分程度である
。

この装置で、Ｋ５６２細胞（非特異細胞）中の、Ｌ−１
０細胞（モルモット肝癌細胞特異細胞）の識別・定量を
行ワたところ、第２図に示すように１〜２％程度まで検
知可能であった。

なお、前述の説明では標識物質として螢光色素を用いた
が、これ以外にも例えば発光を触媒するような酵素等で
標識してもよい。

またＤＮＡ螢光プローブ（ＤＮＡと特異的に結合する螢
光色素）　ＤＡＰＩ　（４’　＋６−Ｄｉａｍｉｄｉｎ
ｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌ−ｄｉｈｙｄｒｏｃｈ
ｌｏｒ（ｄ　）　、発光を生じさせるような酵素を用い
て槙の染色を行うこと、或いは発光を生じさせるような
酵素プローブを用いることにより、全細胞数の測定を行
うことも可能であり、両者を併用することにより、混合
細胞！Ｑ濁液中の特異細胞の割合を自動的に求めること
ができる。

また前述のような抗原が細胞膜表面上に存在する場合に
限らず、本発明は、特定の細胞に由来する生体物質を、
螢光色素、或いは発光を触媒する酵素等で標識し、生じ
た螢光又は発光を光電子増倍管等に導き、これを画像処
理することにより、特定の細胞を定量・識別することが
でき、広範囲の応用が可能となる。

以下に本発明による具体的な測定例について説明する。

細　　　面ｒ、　びレセブ　−の細胞膜表面に存在する癌特異抗原の定量は、癌の進行度
を推し図る上でも重要である。ｔ＋ｌｌＩ胞膜表面に存
在する特異抗原やレセプターを、螢光色素を結合させた
モノクローナル抗体で標識した。この時、発せられる螢
光の強さは、抗体やレセプターの量と対応する。

螢光画像をイメージセンサ−（ＳＩＴ管）でとらえ、細
胞の部分以外を明るさ０”のレベルにする処理を行なっ
たのち、細胞１個毎に発光部分の面積と、輝度レベル値
の積算を行った。これにより一画面上に分布する数１０
〜１００個程度の細胞の個々の輝度レベル積算値を一度
に算出することができ、極めて迅速に、細胞膜上の抗原
の存在量を測定することができた。

に　　　　　る　　呻Ｉ旧胞の８５′１　・　　・組織
切片を、ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体で染色すると
、組織中に分布する癌細胞のみを特異的に識別できた。

一方組織切片では非特異染色も見られ、これらは一般に
特異染色に比べて明るさが強い、従って、組織切片の場
合には、イメージセンサ−を通じてとりこんだ画像をあ
る明るさ以下だけでなく、ある明るさ以上についても切
り捨てることが必要である。

このような画像処理をした結果、＆ＩＩｍ切片上の癌細
胞のみを画像として切り出すことが可能となる。また前
述した画像解析を用いることにより、癌細胞の発光部分
の面積と輝度レベルを細胞毎に求めて、癌細胞の存在量
と、個々の細胞の膜上の癌特異抗原の存在量とから、癌
の進行度を推定することができる。

Ｔリンパ　亜集団の−１・Ｔリンパ球細胞の亜集団であるサプレッサーＴ細胞とヘ
ルパーＴ細胞の存在比は、ＡＩＤＳ　（後天性免疫不全
症候群）の診断にとって重要な指標である。サプレッサ
ーＴ細胞の細胞膜表面に存在する０ＫＴ８抗原を螢光色
素ＦＩＴＣを結合させたモノクローナル抗体でＩｌｍし
、ヘルパーＴ細胞の細胞膜表面に存在する０ＫＴ４抗原
を螢光色素ＲＩＴＣを結合させたモノクローナル抗体で
標識した。これを螢光顕微鏡の励起波長を変化させるこ
とによりそれぞれの細胞数を計数した。すなわち、Ｂ２
励起ではヘルパーＴ細胞とサプレッサーＴ細胞が、Ｇ励
起ではヘルパーＴ細胞のみが観察されるので、各々の細
胞数を求めることができる。

これにより、抗体に非特異的なリンパ球を含む混合細胞
懸濁液中のヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞の定量
及び存在比の決定ができた。

原性；　　のヰ　　・病原性酵母Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓはＣａｎ
ｄｉｄａ症を引き起こすことから、Ｃａｎｄｉｄａ　ａ
ｌｂｉｃａｎｓの分析は重要な臨床検査項目である。通
常血液中のＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓｉ１度は１
０個７ｍ１２以下であるが、異常増殖の結果１０４個／
＝＊以上にもなる。（イ）画側ａ　ａｌｂｉｃａ皿に特
異的なモノクローナル抗体を作成し、Ｃａｎｄｉｄａ　
ａｌｂｉｃａｎｓを、ＦＩＴＣを結合させたモノクロー
ナル抗体で標識した。オートステージを移動させながら
取り込んだ５００画面について、ある一定値く閾値）以
上の輝度を示す標識細胞の数をカウントすることちより
血液中のＣａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓの濃度を定
量することができた。５００回の測定に要する時間は２
５分程度である。

〔発明の効果〕

以上のように本発明によれば、標識物質を結合させたモ
ノクローナル抗体を利用した免疫反応を細胞識別に利用
することにより、きれいに分散した浮遊状態の細胞試料
のみならず、組織切片や、凝集した細胞試料中に含まれ
る特定の細胞も識別・定量することができる。これによ
り、従来必要とされた複雑な染色も必要とせず、迅速に
癌等の診断が可能となる。具体的には、試料中に１〜２
％程度含まれる癌細胞が、５分程度で計測可能である。

特に、癌細胞の発光部分の面積と輝度レベルを細胞毎に
求めることにより、癌細胞の存在量と、個々の細胞膜上
の癌特異抗原の存在量が判るので、癌の進行度を早期に
推定することが可能となる。

また、例えばＤＮＡと特異的に結合する螢光色素ＤＡＰ
Ｉを用いて核の染色をして全細胞数を求めることにより
、混合細胞懸濁液中の特異細胞の割合を求めることが可
能となる。

また、二重染色法を用いることにより、混合細胞懸濁液
中に含まれるヘルパーＴ細胞の各々の定量と存在比を求
めることができた。これにより、ＡＩＤＳＩ天性免疫不
全症候群）など免疫不全に関係した症患が容易に診断可
能となる。

また本発明の方法を血液中に僅かに含まれる病原性微生
物細胞の検知・定量に適用することができた。また細胞
数を定量することにより疾病の進行度を推定することが
可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による細胞識別・定量を行うための装置
の全体構成を示す図、第２図は混合細胞！Ｌ！、濁液中
の癌細胞の割合を示す図である。１・・・螢光顕微鏡、２・・・励起光源、３・・・ミラ
ー、４・・・試料、５・・・オートステージ、６・・・
ＳＩＴカメラ、７・・・コントローラ、８・・・パーソ
ナルコンピュータ、９・・・画像処理ボード、１０・・
・ＲＡＭ、１１・・・ＣＰＵ、１２・・・ビデオモニタ
、１３・・・ＣＲＴ。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）特定の細胞の特異抗原又はレセプターを、標識物
質を結合させたモノクローナル抗体で標識し、生じた螢
光又は発光を、特定の細胞の画像信号として検出し、検
出信号を画像処理することにより、特定の細胞を特異的
に識別・定量することを特徴とする細胞識別・定量方法
。
（２）前記細胞の識別・定量は、特定の細胞の数と螢光
又は発光の強度との関係を求めることにより行うことを
特徴とする特許請求の範囲第１項記載の細胞識別・定量
方法。
（３）前記細胞が組織切片中のものであるとき、前記画
像処理においては、第１の輝度レベル以下、及び第２の
輝度レベル以上の画像信号は切り捨てることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の細胞識別・定量方法。
（４）特定の細胞の特異抗原又はレセプターを、標識物
質を結合させたモノクローナル抗体で標識し、生じた螢
光又は発光を、特定の細胞の画像信号として検出し、検
出信号を画像処理して特定の細胞数を識別すると共に、
全細胞数を測定し、特定の細胞の割合を求めることを特
徴とする細胞識別・定量方法。