JPS59188557A - ヒト前立腺癌の分類および同定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒ１〜前立腺癌に対り゛る抗体産生細胞とイ
ンビｈ口において長期継代培養可能な細胞との間の融合
細胞（以下、ハイブリドーマと称する）Ｊ：り分泌され
る抗体、その誘導体またはその限定分解物を含有りる前
立腺癌の分類、同定用試薬およびその方法に関する。 ここでいう抗体の誘導体とは、該抗体に放剣活性物質、
螢光色素、酵素、電子顕微ｖｔ観察の為のマーカーまた
Ｌｔイれらを７次的に結合さＵるための構造を含む基を
化学的に結合させた生成物であり、抗体の限定分解物ど
は、該抗体を化学的処理または酵素処理にＪ、って限定
分解して生ずる分解物であって、これら自身−ｂ本発明
に包含される。 近年、癌はあらゆる疾患の中で死亡率の最も高い疾患に
なっｌおり、ネ１会的な問題と’Ｊっている。 その対策に関して、あらゆる方面から検討がなされてい
るものの、未だ恨木的ｆ、Ｔ解決払は見出されていない
。日本に於いては、従来より背馳、肺癌、肝癌が多く、
癌による死亡者全体の５０％以十以上めているが、近年
、生活様式の変化に伴って従来とは責イ

【っだ種類の癌
も増加の傾向にあり、前立腺癌を含め！ご泌尿器系悪性
腫瘍はその代表的な例である。 これらの癌に対重る治療法に関しては、手術を主体とし
、放射線療法、化学療法、免疫療法を組み合１！で行な
われているのが現状である。しかし、こういった治療法
も末期病や進行病では限界があり、あくまで早期診断、
早期治療が最善の方法とされている。その目的のために
、迅速で信頼性の高い癌細胞・癌組織の同定・診断方法
が求められている。 一方、癌細胞表面に存在する癌関連抗原・癌特質抗原に
ついては膨大な研究がイＴされており、特に実験動物を
用いた移植実験等でその存在が証明されているが、人癌
については充分な検討がなされていない１．現在、癌表
面にある抗原どしては、＝９− ■自家にの力存杓Ｊる抗原、■同Ｍｊの肝癌に共通して
存在する抗原、■他臓器の腫瘍あるいは正常細胞にも存
在覆る抗原などがとえられＣいる。抗原の分析を行なう
場合、免疫学的手法は非常に有用なものであるが、従来
の同秒又は箕種抗面清を用いて上記の３秤を８別する抗
血清を作製するためには、吸収操作を繰り返り必要があ
る。しかし、この操作は必然的に抗体価の低下を伴い、
実用に適さないものとなる。又、たとえ求めるものが得
られても、再現性よく同じ特異性をもつ抗体を得ること
は不可能に近い。以−にのことより、癌細胞表面の癌関
連抗原、癌特異抗原の同定には、新しい手法の導入が必
要と考えられる。 １９７５年、Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎらによって始められた
細胞融合法による干ツクローナル抗体の作製は、その目
的に合致した新しい手法の１つであり、ヒ１〜リンパ球
°リーブセット、ヒト白血病、ヒトメラノ〜マ１０− などのヒト細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体が
得られたとの報告が近年なされている。 しかし、細胞融合法によるセック１］−ナル抗体作製の
技法を用いれば、一般的に特異抗体の作製は可能である
とされでいるものの、癌細胞によってはその抗原性に変
動があり、果して目的とする特異性に（０れた抗体が得
られるかどうかは現在のところ予知できないとされてい
る。癌細胞に関しても」−述のごく一部の、しかも特定
の癌細胞についての報告しかなく、特に前立腺癌に関し
てはその報告もなく、まして実用化されている抗体もな
い。 本発明者らは、迅速で簡便なヒト前立腺癌の同定法につ
いて研究を重ねた結果、前立腺癌に対する抗体産生細胞
どインビトロにおいで長期継代培養可能な細胞との間の
ハイブリドーマにより分泌される抗体が前立腺癌の血清
学的な同定に使用できることを見出し、更にそれらを用
いた同定方法について検討を重ね、本発明を完成するに
〒つた。 本発明の抗体は、抗原に対！［る高１σに特異的な反応
性を有するために、従来法に比べて繁雑な手順を踏むこ
となく、迅速でしかも信頼＋！ｌの高い同定が可能にな
る。 本発明の方法を適用できる検体は、前立腺癌を含む検体
であればよく、例えば臨床的には前立腺癌が疑われる患
者から得た臨床材１す１、たとえば尿、リンパ節、骨髄
などの生検組織を用いることができる。 同定にあたつ−Ｃは、前Ａ″ｌｌ腺癌む検体と本発明の
抗体を含む試験液を接触させ、免疫螢光顕微鏡法、免疫
電子顕微鏡法、放ＤＡ活＋４１結合法、酵素免疫法など
によって同定を行なうことができる。 免疫螢光顕微鏡法の直接法による場合には、該抗体をフ
ルオレツセイン、ローダミン等で螢光標識した一ｂの、
免疫電子顕微鏡法を用いる場合には、）１リヂン等のマ
ーカーを標識したもの、放射活１２ｊ　　１３１ 性結合法ににる場合には、　■、　■等でラジオアイソ
１−一ブラベルしたもの、酵素免疫法による場合には、
ペルオキシダーゼ、アルカリフＡスターゼ等で酵素ラベ
ルしたものを用いるのが便利である。勿論、２次抗体ま
たはこれに代わる結合物（たとえばビオ−チンラベルし
た抗ヒト前立腺癌抗体を用い、２次抗体の代りにアビジ
ンを用いることによって間接法を行なうことができる）
を用いて間接法とすることもできる。また抗体そのもの
の代りに抗体を化学的および／または酵素的処理によっ
て限定分解して得た抗体の部分、たとえばＦ（ａｂ’）
ユ　を用いることも可能である。 本発明に使用する抗体は、例えば以下のように製造され
る。 一１３＝ Δ、１本産牛細１抱を皿欠プるＴ稈−：ヒト前立腺癌細
胞に対Ｍる抗体産生細胞はヒトを含めたいずれの動物種
から得てもよく、またあらかじめ免疫をｉｊなうことは
必須ではないが、これを行なうことによって目的とする
ハイブリドーマの採取効率を君しく十げることがで゛さ
る。 ヒトの細胞を用いる場合に（３１、前でｌ腺癌の病歴の
ある省や自消中の該細胞に対する抗体価が高い者を選ぶ
ことがて・きる。癌細胞の免疫においては、癌細胞その
ものまたはグルタルアルデヒド処ＪＩｌ＋やマイ］〜マ
イシン処理により増殖性を失わせた細胞を用いてもＪ、
く、また細胞より該表面抗原を適当な方法で分前、精製
したものを用いてもよい。Ｊ−だ免役に際し、フ「１イ
ン１〜完全３１、たは不完全アジュバントのＪ：うな助
剤を免疫原に混入して用いることができる。免疫の際の
免疫原投句法（：１、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注
射、皮内注剣、筋肉−１／ｌ− 肉汁０４　：’；いずれでもよいが、皮下性ｑ・１また
は腹腔内注目７＝Ｉが好ましい、２免疫は１回または適
当な間隔、好；１、（）＜は１週乃至５週をおいて繰り
返し行なってもよい。免疫した動物の自消中の該細胞に
対する抗体価を測定し、抗体価が充分高くなった動物を
抗体産生細胞のソースとして用いれば、その後の操（’
Ｉの効率を十げるごとができる。融合には、最終免疫後
３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を用いるのがりｒ
ましい。該抗体産生細胞は形質細胞およびその前駆細胞
であるリンパ球であり、これは個体のいずれの部位から
得でもよいが、一般には牌、リンパ節、末梢面またはこ
れらの適宜の組み合わせから得ることができる。 Ｂ、細胞融合のＴ稈： もう一方の親細胞であるインビｉ〜口において長１１１
１継代培養可能なｌＩｌ胞は、抗１ホ産−に細胞ど融合
して目的にかなったハイブリドーマを生ずるものであれ
ばいり“れぐ１）よいが、ぞの確率の高いのは骨髄腫等
の白面病細胞である。由来の秤も、ヒ１〜、ラット、マ
ウス等いずれＣ−しよい。後述覆るように、融合後混在
覆る親細胞を除くためにはヒポ１−勺ンブングアニン小
スホリボシル１−ランスフェラーゼ欠損株細胞またはヂ
ミジンキノ−−ゼ欠ＩＣ１株細胞を用いるのが好ましい
。例えば、ヒト由来のＧＭ　１５００−６Ｔ　Ｇ　　Ａ
　１２．　ＲＰ　Ｍ　Ｉ　８２２６．マウス由来ノＰ　
３−Ｘ　６３−Δ（１８，Ｐ　３−Ｎ　Ｓ　Ｉ　／　１
−Ａ　ａ４−１．　Ｓ　ｐ２１０−△０１４．　Ｘ　６
３−　Ａ　０８，６５３等を用いることができる。 上述の抗体産生細胞の由来する種と長期継代培養可能な
ｌ１ｌｌ胞の由来する種が同一であることは不可欠ひは
ないが、融合の効率、融合後の細胞の性質の安定性、／
１−Ｉ４Ｉ内で培養する際の簡便ざなどの点から、　般
にはＩｉ’ｉｌ−の１〕のを用いる１ノが右利である場
合が多い。特に長期継代培養可能な細胞として、マウス
由来のＰ　３−Ｘ　６３−　Ａ　！７８．　Ｐ　３−Ｎ
　Ｓ　Ｔ／１−ΔＱ４−１．　Ｓ　Ｄ２／　０−Ａ　！
１１４または×６１Ａｇ８．６！ｉ３を用いる場合には
、抗体産生細胞を得る動物として、同系マウスであるＢ
ＡＬＢ／ｃまたはその交雑マウスを用いるのが右利ｅあ
る。融合に際しでは、センダイウィルス、ポリエチレン
グリコール等の融合促進剤を用いるのがよく、特にポリ
エヂ１ノングリコール１０００．１５４０，２０００．
４０００または６０００　＜’にどを用いるのが好まし
い。これを約３０〜５５％含む溶液中で融合を行なわせ
る。助剤として更にラメヂルスルボキシドを添加しても
よい。 Ｃ，ハイブリドーマの樹立： 融合後の混合物中には、ハイブリドーマの他、親細胞で
ある抗体産生細胞とインビトロで長期継代ｊ８養可能な
細胞等が残存している。前者は通常長期間のインビトロ
の培養に耐えられないので問題はないが、後者は目的と
するハイブリドーマと　１７− 共に増殖する可能ｆ！■があるのにれを除くことが望ま
しい。このため後者として、ヒポ４．（Ｊ−レチングア
ニンホスホリボシル１〜ランスフ■ラーＵまたはヂミジ
ンキカーｔ！欠損株細胞を用いて融合をさせた後、ヒポ
−１−リンデン、アミノプテリンおＪ、びプテリンを含
む培地中で培養する。これによりハイブリドーマのみを
選択的に生育さ一１↓ることがＣぎる。親細胞どじでヒ
ポ１ｕｌｌ−ンチングアニンホスホリボシルトランスフ
Ｔラーゼまたはプテリン−（ナーゼ欠損株細胞を用いな
い場合には、融合に先だって該細胞を−Ｌメチンおよび
アクチノマイシンＤで処理して細胞の増殖性を失わせて
おくことにより、ハイブリトーンを親細胞どの混合物り
日ら選択してもＪ、い、。 このようにしｒ　１７　ｔ：：ハイブリトーンは、一般
には２種類以十のり［１−ンを含むことが多く完全に同
一のゼＩＹ′４を右１」る細胞の隼トｌ「（・は４１い
、、　ＩＩ！、Ｉ々の１８− クローンを分離したい場合には、クローン化を行なうこ
とが必要である。クローン化は、単一の特賃＋１をもつ
抗体を製造するためには勿論であるが、多種類のクロー
ンが混在する系において長期間培養を行なっている間に
しばしば起こるボビコレーションの変化を防ぐ意味から
も有効であり、行なうことが望ましい。クローン化の方
法としては、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法
を用いることができる。また螢光活性化細胞選別装置を
用いてクローン化の際の細胞の分離を行なうことも可能
である。また、長期間培養の間に起こる変異株の出現に
対し、時々クローン化を行なうことで元の細胞の性質を
もった細胞を保存することができる。以上のような製造
方法に従って作製したヒト前立腺癌に対する抗体を分泌
するハイブリドーマの例としては、後述の実施例に示す
ようにＰ−００１，Ｐ−００２，Ｐ−００３−１，ｔｃ
ハＰ−００４が挙げられる。 本発明のハイ１リドーマは、対数増Ｗ１期に、１夕いて
、凍害防御物質としＣ！】％（Ｖ／Ｖ）のジメチルスル
ホニ１−シトを添加した牛脂児面ｈ′１中に　１へ・１
０×１０　　個／口１１に懸濁して凍結覆ることで長期
間保存することができる。その場合、凍結前の冷７ＪＩ
速度は−１℃／分であることが望Ｊ、シく、Ｊ、た保存
は一８０℃以１・【・行イ「うのが好ましい。 解凍はなるや←ｊみやかに行なうのが、Ｊ、く、融解後
直ちに細胞を１８地て゛洗浄してジメチルスル小キシド
をとり除けば、そのまま通常の培地に懸濁して培養を再
開することができる。但し解凍した時点での細胞の生存
率が悪く、増殖活性が著しく低い場合には、適宜マウス
牌細胞などを加λる必要がある。 Ｄ−匠潜Ｊυ町ｉｉ！、。 抗体のＩＶ１８１造にあたっては、と１〜前立腺病細胞
に対する抗体を産生するハイブリドーマを、インヒト［
１または生体内（インビボ）で培口する。 インピ１−口の培養の場合には、本発明のハイブリドー
マ増殖のために適当な栄養培地、たとえば１０％（Ｖ／
Ｖ）の牛脂児自消、５Ｘ１０”Ｍのβ−メルカプトエタ
ノール、１１１１Ｍのピルビン酸ナトリウムおよび抗生
物質を含有したＲ　ＰＭ　Ｉ　１６４０培地を用いるこ
とができる。また、ＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地に代えて
、４．５（１／Ｌのグルコースを含むＪ）ｕｌｂｃｃｃ
ｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｆａｇｌｏ’ｓ　　ＭＥ
Ｍ　（Ｊｙ、下、Ｄ−ＭＥＭと略す）を用いてもよい。 細胞を増殖さける時の適当な初期濃度は、各々のハイブ
リドーマによって異なるが一般に約１０　　個／ｍｌで
あり、培養中の細胞濃度は２Ｘ１０６個／ｍｌを越えな
いことが望ましい。 また、本発明のハイブリドーマを生体に移植して固型ま
たは腹水型で増殖させ、その生体より体液、′望ましく
は面清または腹水を採取することに２１− より、該ハイ１リドーマが分泌η−る抗体を製造Ｊるこ
とができる。この方法によ−）（得られる１’ｌｌ製抗
体液は、不純物どしく宿主と４Ｔっｉ＜７牛体由来の種
々の物質を含むという欠点をもつ一方、生体外（イン１
１〜口）の１８養にＪ：って得られる抗体液に比べて著
しく高濃度の目的抗体を含むという点で優れている。ハ
イブリドーマを腹腔に移植して増殖させる場合において
は、移植の前、好ましくは３・〜９週間前にブリスタン
（２，６，１０，１４−テトラメヂルペンタデカン）を
腹腔内に投与しておくことにより、粗製抗体液の収帛を
高めることができるが、この処置は必須ではない。ｔｒ
お、宿主として用いる生体は、移Ｉｌｉ′Ｉするハイブ
リドーマの親細胞と同種同系の動物が望ましい。この場
合には、通常、特別の処置をしなくてもハイブリドーマ
はその生体内で増殖するが、ハイブリドーマと宿主の組
織適合性抗原型が一致しない場合、一般に宿主２２− 生体に抗リンパ球抗体投！ｉ、Ｘ線照Ｑ４等の処置をあ
らかじめ施しておくことが必要である。移植後、細胞が
〈１長してくる５１．でに通常１週間から３週間を散型
る。 ハイブリドーマを生体外または生体内で培養して抗体を
産生分泌させる時に、放射性同位元素標識の１：Ｉイシ
ン）１、たはリシン等の放射活性物質を培地中に添加ま
たは宿主に投与することにより、分子内部に放射活性物
質を含み、化学構造が非標識物と全く変わらない抗体を
製造づることができる。 本発明のヒ］〜前立腺癌に対する抗体の例として、後記
表−１に示すハイブリドーマが分泌する抗体が挙げられ
る。その特異性、免疫グロブリンクラスは後記表−２に
示す通りである。 本発明の抗体は、粗製抗体液のまま使用してもよいが、
硫酸アンモニウム分画法やイオン交換クロマトグラフィ
ーなど免疫グロブリン精製の常法に従って、或いは、ｐ
　ｒｏｔｅｒｎ　　Δや抗原によるアフィニティクロマ
トグラフィー等により精製して用いることができる。 また、これらの抗体、その誘導体またはその限定分解物
は必要に応じて混合して用いることもできる。さらに、
担体または希釈剤と混合して組成物とすることもできる
。 以下、具体的な実施例を述べる。 長期インビト目継代培養ヒト前立腺癌細胞８ＰＣ９３２
Ｘ１０　　個を、１００ｍｍ培養ＩＩＩ　（Ｆ　ａｌｃ
ｏｎ　３００３）中で、イーグルスＭ　ＩＴ　Ｍアール
Ｉｎ　（以下ＭＥＭと略）に１０％（Ｖ／Ｖ　’）牛胎
児血清および抗生物質硫酸カナマイシン（最終ＥＩ　Ｕ
　６（１ｍｏ／　ｌ−）を添加した培地で、３７℃、５
％炭酸ガスを含む湿った雰囲気中で」８養した。３日後
、細胞をポリスマンで剥離し、培養上清を遠心で除き、
さらに、リン酸緩衝生理食塩水（ＩＩＨ７，２、以下Ｐ
　１３　Ｓと略）で遠心分離洗）ｐ後、ＰＢＳに懸濁さ
せた。１枚の培養■Ｊこり約２×１０　　個の細胞が得
られた。 （２）骨髄腫細胞の培養 マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２１０−Ａｇ１４１０’個／ｍｌ
を、Ｄ−Ｍ　Ｅ　Ｍ　ニ牛脂児血清１０％（ｖ／ｖ）、
ヒルヒン酸１ｍＭ、グルタミン２１１１ＭおＪ：び硫酸
カナマイシン６０ｍｏ／　Ｌを添加した培地で培養し、
３日ごとに継代した。Ｓ　ｐ２／　Ｏ−Ａ　ｏ１４は、
細胞融合を行なう前日に２．５Ｘ　１０　　個／ｍｌに
細胞濃度を調整し、上記の培地で培養した。 （，３）、８ＰＣ９３細胞にＪ：る免疫雌性ＢＡＩＢ／
Ｃマウス（日本チャールズリバー社、９週令）に０．５
ｍｌのＰＢＳに懸濁した上記（１）の１ＩＰＣ９３細胞
１０７個を２回、約３週問お２５− きに腹腔内に注ＤＡすることで免疫した。 （４）細胞の融合 細胞の融合をＫｉｈｌｅｒおＪ、びＭｉｌｓｔｅｉｎの
ｈ法に摩じて実施した（　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ
　；　Ｃ１ｉｎｉｃａｌｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　１−
ｅｃｂｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　Ｉｈｃ　１９８０’ｓ　
ｅｄ。 ｂｙ　　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｅ、　Ｓ、　ＡｌａｎＲ，ｍ１ｓｓ、Ｉｎｃ、Ｎ、　
Ｙ、、　１９８０．　ｐｐ３０１〜３２４　）。 最終免疫後４日日にマウスを層殺し、牌を取り出し、よ
くはぐした後、１５０メツシー２のステンレスメツシュ
に通し、４００Ｘ（ｌで遠心分離復、沈澱した細胞に０
．７４７％塩化アンモニ「りｌ＼を含むトリス・塩酸緩
衝液（０，０１７Ｍ　＋−リス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、ｐｌ−１７，６５）を加えて赤面法を除去
し、遠心（４００Ｘｇ）′ｃ稗細胞を集めた。 ＭＥＭを加λ、て）仝心弁ｍｌ　（，４００Ｘｇ　）を
行ない、細胞を新たなＭ　［Ｍに懸濁する操作を３回線
り返すことで洗浄し、最終的にＭＥＭに懸濁した。１２
６− ５ｐ２１０−Δｇ１／ｌは培養容器よりピペッティング
ではがし、遠沈管に移した。遠心分１１１１１（４００
ｘｇ　）後、集めた細胞にＭＥＭを加えて懸濁、遠心分
離（４００ｘｇ　）することで血清を除去した後、ＭＥ
Ｍに再懸濁した。上記牌細胞１０Ｘ１０”個とＳ　ｐ２
１０−Ａ　ａ１７１２ｘ　１０　　個を混合し、よくピ
ペッティングした後、ｊ更心分ｔａｉｌ　（４００ｘｇ
）　）　Ｌ、た。上清を除いた後、軽く遠沈管をたたく
ことで沈澱をほぐした。ＭＥＭに３０％（Ｖ／Ｖ）のポ
リエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　１０００）を加え
たものを３７℃に保温り、、その０．６ｍｌをほぐした
細胞に加えた。ゆるやかに撹拌後、５分間室温に置いた
。７Ｘｇで遠心を２分間行なった後、ＭＥＭをゆっくり
と５ｍｌ添加した。ゆるやかに撹拌後、４００Ｘ　（ｌ
で５分間室温で遠心した。上清を寸で、沈澱に　５ｍｌ
のＭＥＭを加え、同様に遠心分離し、上清を除去した。 沈澱した細胞に５１１１の次の培地を加え、ピペッティ
ングした。　ＪｆＸ地どしてｃＡ、　、　Ｉ）　−Ｍ　
ｒ：Ｍに、１０％（Ｖ／Ｖ）’Ｉ胎児血清、２ｍＭ（１
）　’ｊ　／ｌ／　タミ＞、５×１０　”　Ｍのβ−メ
ルカー１１−］タノール、６０　ｍ　ｇ　／　ｌ−、、
の硫酸力ナマ、イシンを加え、さらにグルー１−スを４
．５ｇ／Ｉ−どイｆるＪ、うに添加し／、７−ｂのを用
いた。 なお、このＩＲ地をｒ）　−Ｍ　ＦＥ　Ｍ　−「ＲＳと
略称する。。 上記１０ｍ１の細胞ｗＮＮ液液４０Ｉｎｌの１）−Ｍ　
［Ｎｑ　−ｒ丁ＢＳを加え、ぞの２５１ずつを２４１ｃ
ｍ　’培養フラスコ（］−ニングン１、Ｃ−２５１００
）に分注し、たてて３７°Ｃで、炭酸ガス１１％を含む
湿った雰囲気中て゛１晩培養した。、なお、１１１養は
双手同様の条件で行なった。翌日、１１￥くピペッティ
ングをした１ｐ１遠心管に移して、４００ｘｇｒ遠心分
離を行＜ｒっだ。主語を除去した後、１ｘ１０−９Ｍヒ
ポキリ〜ンチン、４×１０−７Ｍアミノプテリンおよび
１，６ｘｌＯ−“Ｍブミジンを含むＤ−ＭＦＭ−「ＢＳ
（以下、１−ＩＡ丁培地ど略す）　ＧＯｍｌに慝濁し、
その０．１ｍｌを９６ウエル培養用プレート（Ｆ　ａｌ
ｃｏｎ　３０７２）の各ウェルに入れ、１週間培養した
。その後、２５μｍのＨＴ培地を２日又は３日ごとに添
加した。１−「［培地としては１−ＩＡＴ培地からアミ
ノプテリンを除いたものを用いた。 Ｂ、近遜産４）ニハイブリドーマの選択Ｌ１３よび増殖
細胞融合後、２週間めに酵素結合固相免疫測定法で、各
ウェル上清中の８ＰＣ９３細胞に対する抗体産生の有無
を調べた。 ８ＰＣ９’３＃胞をプレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０７
２）に固定し、上記各つＴル中の培養上清４０μｍと室
温で２時間反応させた後、よ＜ＰＢＳで洗浄し、馬血清
で１０００倍に希釈したベルオキシダーゼ結合抗マウス
免疫グロブリン抗体（Ｃａｐｐｅｌ　１−　ａｈ、Ｉ　
ｎｃ、。 アメリカ、カタログ番号３２１１−０２３１）　　１０
０μｍと２時間反応させ、その後、よ＜ＰＢＳで洗浄し
た。 クエン酸緩衝液（０，１Ｍ、　　Ｉ’１−１　／１．５
）に基質（ｏ−２９− ）■ニレンジアミン）を１ｎｌＱ／ｌ目３３にび３１％
過酸化水素水を０．４μｍ／１加えた溶液を２００７１
１入れ、３０分発色反応を行なわｉ！た。８ＰＣ９３細
胞と反応する抗体を含有する２ウエルにつきクローン化
を行なった。、クローン化は、限界希釈法を用い、以下
の通りに行なった。 抗体産生陽性の２ウエルのハイブリドーマ１００個をそ
れぞれＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に懸濁し、一方、−に記Ａ
、（４＞の融合に使用したと同様の方法で、ＢＡＬＢ／
ｃマウスより稗細胞１０２個をＤ−ＭＦＭ−ＦＢＳ中に
調整し、２種の細胞を混ぜ合せた。細胞密度５×１０　
　個／１となるようにＤ−ＭＥＩＶＩ−ＦＢＳを加え、
０．２１を９６ウエル培養プレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　
’３０７２）の各つ丁ルに入れ、培養した。培養開始１
４０後に、−上記の酵素結合同相免疫測定法でハイブリ
ドーマの抗体産生の有無を各ウェルにつぎ検討した。そ
の結果、表−１に示３０− した４株を含め、総計３８株のハイブリドーマが得１ろ
　れ　ｌこ　。 Ｃ０坑休の生産＝　（イン上１〜ロー培養による生産）
ハイブリドーマＰ−００１，Ｐ−００２，Ｐ−００３ま
たはＰ−００／ｌを、２０％生胎児血清、　２ｍＭグル
タミン。 １ｍＭピルビンＭ、　　４．５ｇ／Ｌ−のグルＤ−ス、
５ｘ１０−ゝＭのβ−メルカプ１〜エタノールおよび５
０ｍｇ／Ｌの硫酸カナマイシンを含むＤ　、、　Ｍ　Ｅ
　Ｍに、１×１０ゝ個／ｍｌにイ’＝るように懸濁さＵ
、この細胞懸濁液２５ｍ１を７５ｃｍ　２組織培養用フ
ラスコ（コーニング社、アメリカ）に分注し、３７℃″
ｃ５％炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器中で培養を行なっ
た。増殖がほぼ定常に達した４日目に、培養上清を採取
した。 この時の細胞数はいずれも約２×１０　　個／ｍｌであ
り、上清の抗体含量は各々３．１７１　／ｍｌ、　　２
．８μａ　／ｍｌ、　　２．８μＣＪ　／ｍｌ、　　２
．５μｇ／ｍｌであった。 （インビボ培養による生産）ニブリスタン（２，６゜１
０．１４−テトラメブルペンタデカン）　　０．５ｍｌ
を腹腔内に投与１斡１０１］から３００日目ＢＡＬＢ１
０マウスの腹腔内に、インヒト１］で増殖さけたハイブ
リドーマＰ−００１，Ｐ−００２，Ｐ−００３またはｐ
−００４を５×１０６個接種した。接種後２ないし３週
日に腹水を採取し、遠心分１ｓ１１　（１０００ｘｑ　
、　　４℃、１５分間）により腹水」ニ清を得た。各バ
イプリドーマにつぎ１０匹のマウスから約３０ｍ１の腹
水上清が得られ、その抗体含量は各々２．５ｍＭｍ１．
　２．Ｏｍｇ／ｍｌ、　　１，５１１１０／ｍｌ、　　
１．８ｍｏ／ｍｌであった。 これら４株の形状、大ぎさ、性状を表−１に示す。 なお、これら抗体を１群１０匹のＩＣＲマウスに２（］
／ｋＯ経口、４００ｍ（１／　ｋ（ｌ腹腔内または２０
０ｍ（１／　ｋｇ静脈内投すし、１４Ｆ１間観察したと
ころ、これら抗体による死亡は全く認められなかった。 表−１ ３３一 実施例２　ヒト前立腺癌１に対する抗体の特性−イン１
１〜口で継代されている次の細胞を用いた。 １ｎｔｅｓｔｉｎｅ　４０７　（ヒト胎児小腸細胞株）
　、Ｋ−５６２（ヒト白面病細胞株）、３ｒｉ７（ヒト
末梢面すンパ球株）および８ＰＣ９３（ヒト前立腺癌細
胞株）。 実施例１で得られた培養上清を用いて、−に記細胞との
反応性を酵素結合同相免疫測定法により調べた。表−２
に示す如＜　８ＰＣ９３に極めて特異的な抗体が得られ
た。 Ｂ、螢光抗体法による細胞染色 ハイブリドーマの１つＰ−００２が分泌する抗体を用い
て、８ＰＣ９３細胞を間接螢光抗体法で染色し１こ　。 ８ＰＣ９３細胞を無螢光のガラススライドに固定し、培
養上清！１ｏｌｚｌ　と３１℃、４５分濁った雰囲気中
で反応させた後、ＰＢＳに１％生血清アルブミン、３４
− １０　ｍＭ　　Ｉ−ＩＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）およ
び０．１％アジ化ナトリウムを添加した溶液に、３分か
ら５分処理することで洗浄を３回行なった。フルオレツ
ｔイン結合抗マウスＩ　Ｑ　Ｇ　（Ｍ　１ｌｅｓ　−Ｙ
ｅｄａｌｔｄ、、イスラエル、コード番号６５−１７１
　）を２０倍希釈した溶液５０μｍと、上記と同じ条件
でさらに４５分反応さゼた。洗浄も同様の手法で行なっ
た。乾燥させた後、炭酸緩衝・グリセリン液（０，０５
Ｍ’。 ｐＨ９，５，１０％グリセリンを含む）を重層し、カバ
ーグラスをのせ螢光顕微鏡（オリンパス、モデルＡ　ｌ
−１−ＲＦ　Ｌ　−Ｌ　Ｂ　）で検鏡した。その結果、
８ＰＣ９３細胞表面で強い螢光が観察された。なお、使
用したフルオレッセイン結合抗マウスＩΩＧは、あらか
じめ８ＰＣ９３細胞で６回吸収操作を行なった。 Ｃ０免疫グ「１ブリンクラスの」１定−１抗体の免疫グ
■ブリンクラスの同定を酵素結合固相免疫測定法で行な
った。ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗
体として、抗免疫グロブリン（１（１）、抗Ｔ（ＩＧ、
抗Ｉ（ＩＭ（いずれもｃａｐｐｃ＋　ｉ、ａｂ、　　Ｔ
ｎｃ、、アメリカ、カタログ番目３２１１−０２３１．
３２１１−００８１．３２１１−０２０１　）を用いた
。 検討した４種の抗体は、いずれも表−２に示したように
ＩＱＧｒあった。 ３５− 表−２ ３７− ３６− 実施例３　厘藤未Ｊ：る組部ｌ創匹」Ｌ（１）Ｉ制：　
　手術時に得られた前立腺癌を含む組織を用いた。常法
により、９５％アルコール固定後、パラフィン包埋し、
４μｍ切片標本を作製した。 （２）同定法：　ハイブリドーマｐ−００２により分泌
される抗体（腹水上清）を用いて螢光抗体法により同定
を行なった。上記組織標本上に抗体の１００倍希釈溶液
０．１１１１１を滴下し、室温で１時間反応させた。反
応終了後、ＰＢＳで充分に洗浄した。 次にフルＡレッセイン結合抗マウスＩ（］　Ｇ　（マイ
ルス社、アメリカ）の１００倍希釈液０．ｌ＋１を該組
織標本上に滴下し、室温で１時間反応させた。未反応の
フルオレツセイン結合抗マウスＩＯＧをＰＢＳで充分に
洗浄することにより除き、スライド上の組織標本の螢光
の有無を螢光顕微鏡（ＯＩｙｍｐｕｓ　　Ｖ　ａｎｏｘ
、オリンパス、日本）を用い３８− て観察した。その結果、前立腺癌組織部位に強い螢光が
観察され、正常組織部位では螢光がほとんど観察されな
かった。なお、非特異的結合を防ぐ目的で、フルオレッ
セイン結合抗マウスＩＯＧはあらかじめヒ１〜前立腺細
胞株８ＰＣ９３で吸収操作を行なった。 シダーＬ’　［ＦＲＬ： ４ｍｇの西洋ワ（〕−ビペルオキシダーピ（Ｓｉ（ｌｌ
ｌｌａＴｙｐｅ　ｖｒ、　Ｓ　ｉｇｍａ、アメリカ）を
１ｍ１（７）蒸溜水に溶解し、使用直前に作製した０、
１Ｍ　　Ｎａ　ＩＯ。 液を６０μｍ加えて室温で２０分間混和した。反応液を
１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（１）ｌ−１４，４）に対
して　１晩透析した後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム液２０
μｍを加えた。直ちに、０．０１　Ｍ疾酸緩衝液（ｐｌ
−１９，５）　　１ｍｌに溶解させたハイブリドーマロ
ー００２分泌抗体（腹水上清を精製した抗体、タンパク
質含量にしＵｌｏｍ（１）を加え、室温で撹拌しながら
２時間反応さＥ！た。反応終了後、新しく調製したＮａ
Ｂ１−１．水溶液（４ｍｇを１０１１の蒸溜水に溶解し
たもの）　　０．１ｍｌを加え、２時間、４℃で放置し
、更にＰＢＳに対して１晩透析した。こうして得た■ 混合液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｑ−１００（ファルマシア
、スウェーデン）のカラムにかり、ＰＢＳで溶出して２
８０ｎＩｌｌの吸光と４０３ｎｍの吸光が一致する最初
の両分を採取した。この両分（酵素・抗体結合物）１ｍ
１にウサギ血清アルブミンを１０ｍｇ加えて溶解し、使
用時まで一７０℃で保存した。 あらかじめＰＢＳに対して透析して硫安を充分に除いた
アルカリホスファターゼＴＶＩｌｅＶＩ（Ｓｉｇｏ＋ａ
、　ＬＪ、　Ｓ、△　）　　５ｍ（ｌと１〕−００２分
泌抗体１７ｎ＋ｇとをＰＢＳに溶解して全ｆｉｚ　１ｍ
ｌとした。これに２０％グルタルアルデヒド溶液１０μ
ｍを加え、室温で２時間撹拌しながら反応させた。反応
終了後、反応液をトリス塩酸緩衝液（１）ｌ−１７，６
）で平衡化さ「た５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　　２００■（
ファルマシア、スウェーデン）カラムにか【プ、同緩衝
液で溶出させた。 ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅからＩ（ＪＧ流出位置までの高
分子画分を採取し、この両分に牛血清アルブミンを５％
（Ｗ／Ｖ）になるように加え、ミリポアフィルタ−（０
，２２μ、ミリボア）を通して除菌した後、使用時まで
４℃で遮光保存した。 上記（２）と同様の操作により、ハイブリドーマロー０
０２分泌抗体のβ−ガラクトシダーゼ標識抗体を得た。 この場合、β−ガラク１−シダーゼＳ　ｉｇｍａ　ｏｒ
ａｒｌｃ　　ＩＶ　（Ｓ　１ｏＩｎａ、アメリカ）を用
いた。 ４１− ２ｇ （４）バイブリド−７ｐ、−００２分泌抗体の　Ｉ標識
：１００ｍＣ１／ｍｌのＮａｐ（無担体、７マーシヤム
相、アメリカ）溶液１０μｍに、ハイブリドーマルー０
０２分泌抗体（腹水−上清を精製した抗体、タンパク質
含ｍとして１．Ｏｍ（＋／＋１１１）溶液５０μおよび
０．３０１１１（１／ＩＩのクロラミンＴを含む０．５
Ｍリン酸緩衝液（Ｉｌ＋−１７，２）　３０μｍを加え
て、よく混和し、１５秒後にし一ヂロシンを飽和させた
ＰＢＳ１００μｍを加え、直ちに混和した。得られた反
応液をアンバーライトＩＲＡ４００を詰めたカラムにか
番プ、１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳで溶出した。 溶出画分を採取し、４℃にて使用時まで保存した。 なお、得られた標識物の比放射桔性は１．０μＣｉ／ｍ
ａ抗体タンパク質であった。 ｉｏｍｏ／ｍ＋のハイブリドーマルー００２分泌抗体（
ｌ！２４２− 水上名−を精製した抗体）溶液１ｍｌに０．５Ｍ炭酸緩
衝液（ｒｌｌ−（９，３）　　０．１ｍｌを加え、更に
フルオレツセイン・イソヂオシアネート粉末０．１ｍｇ
を添加した。泡立てないように撹拌しながら、４℃で、
６時間反応さけた。反応終了後、直ちに３　ｅｐｈａｄ
ｅｘＧ−２５■（ファルマシア、スウェーデン）カラム
にか（プ、未反応の低分子物質を除去し、高分子画分の
目的とするフルオレッセイン標識抗体を得た。 使用時まで４℃で遮光保存した。 １０ｍｇ／ｍｌのハイブリドーマＰ−００２分泌抗体（
腹水−ト消を精製した抗体）溶液ＩＩ＋に０．５Ｍ炭酸
緩衝液（ｐＨ９，３）　　０．１ｍｌを加え、ざらにテ
トラメチルローダミン・イソヂオシアネート粉末０．２
ｍｇを添加した。泡立てないように撹拌しながら４℃で
２００時間反応せた。反応終了後、直ちに■ ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２！ｉ　　（ファルマシア、ス
ウｆ−デン）のカラムにかけて、未反応の低分子物質を
除去し、高分子画分の１］的とりるブトラメチルローダ
ミン標識抗体を得た。使用時まで４℃で遮光保存した。 （７）ハイブリドーマｐ−−００２ｑ泌抗体のビオチン
標識： ２４４ｍｇ（１ｍＭ　）のｄ−ビオチン（和光紬薬）と
１７３ｍ（１（１，５ｎ＋　Ｍ）のＮ−ヒドロキシザク
シンイミド（Ｅ　ａｓｔｍａｎ　　Ｋ　ｏｄａｋ、アメ
リカ）をラメヂルスルホキシド（和光紬薬）８ｍ１と１
，２−ラメＩ・キシｌタン（半月化学）５ｍ１の混合液
に溶解し、この溶液に２０６ｍｇ　（１ｍＭ　）のＮ、
Ｎ’　−ジシクロへキシルカルボジイミド（関東化学）
を０．５ｍｌの１．２−ラメ１へキシエタンに溶解させ
た溶液を加え、４℃にて１晩反応さＶ　ｔ＝　ｏ生じた
沈澱を濾過して除さ、濾液を得た。ｉｌ！液中の溶媒を
減圧）量線により除ぎ、残存した油状物質をジク［１０
メタン（和光紬薬）１０ｍ１に溶解し４℃に冷却した。 ４℃に冷却した０、ＩＭ　　Ｎａ　ＨＣＯ３溶液１０ｍ
１をこれに加え、よく振盪混和した。生成したジクロロ
メタン層をとり除き０．１Ｍ　Ｎ　ａ　ｌ−Ｉ　Ｃ０，
１０ｍ１を、次イテ４℃に冷却した蒸溜水１０ｍ１を加
え、同じ操作を繰り返した後、生成したジクロロメタン
層に無水硫酸すトリウム粉末（小泉化学）を加え、脱水
処理した。 粉末を濾別した後、ｎ−ヘキサンを濁りが生じるまで徐
々に加えた。この溶液を一２０℃に冷却し、析出した結
晶をデシケータ−中に入れ、溶媒を除去して乾燥させ、
ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルを得
た。 このビオチン−Ｎ−ヒドロキシ４ツクシンイミドをジメ
チルスルホ４：シドに溶解させ、１ｍＭｍ１の濃度に調
整後、この溶液６０μｍどハイブリドーマＰ−００２分
泌抗体（腹水」二清を精製した抗体、タンパク質含吊ど
して　１１ｎＯ／ｍｌ）溶液１ｍｌを混和して、４５− 室温Ｃ４肋間反応さＥ！た。反応終了後、ＰＢＳに対し
て４℃、３［１間透析した。透析外液は３回交換した。 透析終了後の透析ヂコーブ内液をビオチン標識抗体とし
て４℃で使用時まで保存した。 実施例５　標識抗体による前立腺癌の同定（１）１！！
！Ｌ（＊：　　手術時に得られた前立腺癌を含む組織を
用いた。すなわち、人き２＼が５Ｘ　５Ｘ　２ｍｍ以下
の生組織を、ＰＬＰ固定液（０，０１ＭＮａＩＱ　　、
　　０．０７５Ｍリジン、３％バラホルムアルデヒドを
含む０．０３７５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液。 ｒ）Ｈ６，２）中で４℃、６時間、振盪しながら固定さ
せた。次に、１０％ショ糖を含むＰＢＳで４℃、−晩、
１５％ショ糖を含むＰＢＳで４℃、６時間、２０％ショ
糖を含むＰＢＳで４℃、６時間、２０％ショ糖と１０％
グリセリンを含むＰＢＳで４°Ｃ１１時間処即すること
により洗浄を行った。洗浄後、処理し、ドライアイス・
エタノール中で凍結し、ク４６− ライオスタットを用いて、１０ｚｚｍの凍結切片を作製
　し　Ｉご　。 （２）同定法：　牛血清アルブミンを塗布したスライド
グラス−にに上記凍結切片を載せて、乾燥さけた。次に
、４℃に保ったＰＢＳで５分間、３回洗浄し、０．００
５Ｍ過ヨウ素酸と１０分間室温で反応さけた。４℃に保
ったＰＢＳで３回洗浄の後、１０％馬面漬を含むＰ　Ｒ
Ｓで１０分間室温で処理した。 実Ｍｌｔ例４で得たペルオキシダーゼ、アルカリボスフ
１ターじ、フルオレッセイン、ローダミンまたはビオチ
ンで標識したハイブリドーマＰ−００２分泌抗体の１ｏ
４Ｆ＜希釈溶液を、毛細管ピペットにて切片上にのせて
、４５分間、室温で反応させた。反応終了後、４℃に保
ったＰＢＳで５回洗浄した。 以下、下記の方法により同定を行った。 （イ）螢光抗体法：　フルオレッセインおよびローダミ
ン結合抗体の場合は、上記標本をグリセリンで封入し、
螢光顕微５ｎ　（Ｏｌｙｍｐｕｓ　　Ｖａｎｏｘ、　７
リンパス）を用いて螢光の有無を観察した。 ビオチン結合抗体の場合は、フルオレッセイン結合アビ
ジン（フナコシ薬品）５μｇ／ｍｌを上記標本上に滴下
し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで
５回洗浄し、グリセリンで封入し、標本の螢光の有無を
螢光顕微鏡（ＯＩｙｍｐｕｓｖａｎｏｘ、オリンパス）
を用いて観察した。 これらの結果を表−３に示す。 （ｆｉｌ　）　酊素免ＩＬ宏ヨ法−：　　ペルオキシダ
ーゼ結合抗体の場合は、基質溶液として　１％Ｈ，Ｌ０
．０．０２…１／１および３．３′−ジアミノベンジジ
ン−Ｉ　Ｃ１０，５１＋１（１／ｍｌを含む０．ＩＭ　
ｌ−リス・塩酸緩衝液（ｊｕｌｌ　７．６）を用い、室
温で１０分間反応させた後、４℃に保ったＰＢＳで３回
、蒸溜水で１回洗浄した。１％メチルグリーンを含むべ
［１ナール・酢酸緩衝液（ｐｌ〜ｌ　ＬＯ）て゛後染色
した後、常法によりエタノール脱水、キジロール透徹を
行い、バルーリームで封入し、顕微鏡を用いて着色（褐
色）の有無を観察した。 アルカリホスファターゼ結合抗体の場合、基質溶液と【
ッて０．３９　Ｍ硫酸マグネシウム、０．２％クエン酸
鉛、０．６％β−グリセロリン酸および４％ショ糖を含
む０．２Ｍ　ｔ−リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）　　
［使用前に濾別］を用い、室温で１０分間反応させた後
、４℃に保ったＰＢＳで３回、蒸溜水で１回洗浄した。 次に、１％黄色硫化アンモニウム溶液中にて室温で５分
間反応後、ＰＢＳで充分に洗浄し、グリレリン封入を行
い、顕微鏡を用いて着色（黒褐色）の有無を観察した。 これらの結果を表−３に示す。 −４９− 表−３ ５０− 実施例６　抗体を用いた癌細胞造影 ヒト前立腺癌ｍ　Ｉｌ’、！Ｉ株８ＰＣ９３をｉｘ　ｉ
ｏ７個、１群３匹の雌性、８週令のＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ
／ｎｕマウス右大腿部皮下に移植しＩＣ０移植後３０日
目、腫瘍サイズがＩｃｍ’以上に達した時点で、実施例
４で調製した　■で標識したハイブリドーマＰ−００２
分泌抗体、または対照として１２ゝ■標識マウスＩ（Ｉ
Ｇを静注した。前者の投与量は３５μＣｉ／匹、後者は
１０μＣｉ／匹である。静注後９６時間目にガンマカメ
ラを用いて全身シンチグラフィーを行った。 その結果、１１ゝＩ標識抗体投与群では対照群に比し全
例で腫瘍部位への著明な放射能の集積がみられた。 ５１− 第１頁の続き ０発　明　者　藤井孝美 東京都足立区東和５−１１−２１ ０発　明　者　吉汲親雄 国立市東２−１９−４６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　抗ヒ１〜前立腺癌抗体産生細胞とインビトロに
   おいて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマ
   により分泌される抗体の一種またはそれ以上を含有づる
   ヒト前立腺癌の分類および同定用試薬。 （２）　担体または希釈剤を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の試薬。 （３）　該ヒ１〜前立腺癌がヒト前立腺癌細胞株８ＰＣ
   ９３であることを特徴とする特許請求の範囲第１項また
   は第２項に記載の試薬。 （４）　該抗体がヒト前立腺癌細胞株８ＰＣ９３に対す
   る抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃
   至第３項のいずれかに記載の試薬。 　１　− （５）　該抗体がハイブリドーマｒ）−００１，Ｐ−０
   ０２゜ｐ−００３またはＰ−００４により分泌される抗
   体であることを特徴とする特に’ｌ請求の範囲第１項乃
   至第４項のいずれかに記載の試薬。 （６）　ヒ１−または動物の前ｖＬ腺癌の同定用である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項のい
   ずれかに記載の試薬。 （７）　抗ヒ１〜前立腺癌抗体産生細胞とインビトロに
   おいて長ＩＵｊ継代培養可能な細胞との間のハイブリド
   ーマにより分泌される抗体の誘導体または限定分解物か
   ら成る物質。 （８）　該抗体に放射活性物質、螢光色素、酵素、電子
   顕微鏡観察のための７−カーまたはそれらをニー次的に
   結合さけるための構造を含む基を化学的に結合さゼたこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第・１項に記載の物質。 （９）　該抗体を化学的処理または酵素処理によ２− って限定分解したことを特徴とする特許請求の範囲第７
   項に記載の物質。 （１０）　　放射活性物質が１２ｒ、であることを特徴
   とする特許請求の範囲第８項に記載の物質。 （１１）　　ｆｆｌ光色素がフルオレッセインまたはロ
   ーダミンであることを特徴とする特許請求の範囲第８項
   に記載の物質。 （１２）　　酵素がペルオキシダーゼまたはアルカリフ
   ォスファタ−１であることを特徴とする特許請求の範囲
   第８項に記載の物質。 （１３）　　放射活性物質、螢光色素、酵素または電子
   顕微鏡観察のためのマーカーを二次的に結合させるため
   の構造がビオチンであることを特徴とする特許請求の範
   囲第８項に記載の物質。 （１４）　　該ヒト前立腺癌がヒト面立腺癌細胞株８Ｐ
   Ｃ９３であることを特徴とする特許請求の範囲第７項乃
   至第１３項のいずれかに記載の物質。 （１５〉　　該抗体がヒトｎｊ１立腺癌細胞株８ＰＣ９
   ３に対する抗体であることを特徴とする特許請求の範囲
   第７１ｎＴ１Ｊ至第１４頂のいり”れかに記載の物質。 （１Ｇ）　　該抗体がバー１’　フＩＪ　ト−？　Ｐ−
   ００１，Ｐ　−００２゜Ｐ−００３またはＰ２Ｏ３によ
   り分泌される抗体であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１５項に記載の物質。 （１７）　　抗ヒト＋）ｒｔ立腺癌抗体産（１細胞とイ
   ンごトロにおいて長期継代培養可能な細胞との間のハイ
   ブリドーマにより分泌される抗体の誘導体または限定分
   解物の一種またはそれ以上を含有するヒト前立腺癌の分
   類および同定用試薬。 （１８）　　担体まｌこは希釈剤を含有することを特徴
   とする特許請求の範囲第１７項に記載の試薬。 （１９）　　該誘導体が該抗体に放射活性物質、螢光色
   素、酵素、電子顕微鏡観察のためのマーカーまたはそれ
   らを二次的に結合させるための構造を含む基を化学的に
   結合さμたものであることを特徴とする特許請求の範囲
   第１７項または第１８項に記載の試薬。 （２０）　　該限定分解物が、該抗体を化学的処理また
   は酵素処理によって限定分解したものであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１１項または第１８項に記載の
   試薬。 （２１）　　放射活性物質が１２ゝ■であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１９項に記載の試薬。 （２２）　　螢光色素がフルＡ１ノッセインまたはロー
   ダミンであることを特徴とする特許請求の範囲第１９項
   に記載の試薬。 （２３）　　酵素がペルオキシダーゼまたはアルカリフ
   ォスファターゼであることを特徴とする特許請求の範囲
   第１９項に記載の試薬。 （２４）　　放射活性物質、螢光色素、酵素ま１＝は電
   子顕微鏡観察のためのマーカーを二次的に結合さ５− じるための構造がビオチンであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１９項に記載の試薬。 （２５）　　該ヒト前１’／腺癌がヒト前）“ｔ−１１
   ！１１局細胞株８１）Ｃ９３であることを特徴とする特
   許請求の範囲第１７項乃至第２４項のいずれかに記載の
   試薬。 （２６）　　該抗体がヒ］−前立腺癌細胞株８ＰＣ９３
   に対する抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第
   １７項乃至第２５項のいずれかに記載の試薬。 （２７）　　該抗体がハイブリドーマ［〕−００１，Ｐ
   −００２゜Ｐ−００３またはＰ−００４により分泌され
   る抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第２６項
   に記載の試薬。 （２８）　　ヒトまたは動物の前立腺癌の同定用である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１７項乃至第２１項
   のいずれかに記載の試薬。 （２９）　　特許請求の範囲第１項乃至第６項および第
   １７項乃至第２８項のいづ゛れかに記載の試薬を用い６
   − ること１．ｓ　＋う２にるヒ１〜前立腺癌の分類および
   同定法。 （３０）　　ヒト前立腺癌細胞を含む検体と該試薬を接
   触さ［！、ぞ−の際に起こる抗原抗体反応を利用づるこ
   とを特徴とする特６′１請求のＣ１５囲第２９項に記載
   の方法、。 （３１）　　該ヒ１〜前立腺癌がヒト前立腺癌細胞株８
   ＰＣ９３て゛あることを特徴とする特ｒ［請求の範囲第
   ２　！］　１１Ｊまたは第３０項に記載の方法。 （３２）　　ヒ］へまたは動物の前立腺癌を同定するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２９項乃至第３１項の
   いずれかに記載の方法。 （３３）　　ヒ１−：または動物Ｊ：り採取１ノだ検体
   またはそれを培養して得た検体を用いることを特徴とす
   る特Ｂ’ｆ請求の範囲第３２項に記載の方法。