DE3413341A1

DE3413341A1 - Antikoerper fuer prostatakrebs beim menschen

Info

Publication number: DE3413341A1
Application number: DE19843413341
Authority: DE
Inventors: Tomoko Nagareyama Chiba Chiku; Takayoshi Tokio/Tokyo Fujii; Eiji Inoguchi; Yosuhiko Tokio/Tokyo Kobayashi; Kenichi Matsunaga; Kenichi Saito; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Yoshikumi; Makoto Yoshimura
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-04-08
Filing date: 1984-04-09
Publication date: 1984-11-22
Also published as: GB2139645A; FR2551085A1; SE8401946L; GB8408988D0; SE8401946D0

Description

Die Erfindung betrifft den Prostatakrebs beim Menschen (Human-Prostatakrebs), sie betrifft insbesondere einen für das Oberflächenantigen des Human-Prostatakrebses spezifischen Antikörper, der von einer fusionierten Zelle, nachstehend als "Hybrid(om)-Zelle" bezeichnet, zwischen einer Zelle, die diesen Antikörper bilden kann, und einer Zelle, die sich durch Subkultivierung in vitro ständig vermehren kann, gebildet werden kann.

Es gibt heute viele Menschen, die an Krebs leiden und eine große Anzahl von Personen sterben an Krebs, so daß Krebs ein höchst signifikantes soziales Problem darstellt. Trotz der großen Bemühungen vieler Forscher auf allen Gebieten der Wissenschaft wurde bis heute kein primäres Verfahren zur Behandlung von Krebs gefunden. In Japan wird die Hälfte oder mehr aller Todesfälle durch verschiedene Krebsarten, wie z.B. Magenkrebs, Lungenkrebs oder Leberkrebs, verursacht, wobei andere Arten von Krebs eine zunehmende Tendenz haben mit der Änderung der Lebensweise in Japan, wie z.B. der Rektalkrebs oder der maligne Tumor in Urin ausscheidenden Organen einschließlich des Prostatakrebses, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.

Die Methoden zur Behandlung dieser Krebsarten bestehen hauptsächlich in chirurgischen Operationen in Kombination niit der Radiotherapie, der Cheomotherapie und/oder der Immunotherapie. Diese Methoden sind jedoch bis zu einem gewissen Grade begrenzt bei der Behandlung des Anaphasen-Krebses oder des fortschreitenden Krebses. Eine frühe Diagnose und eine frühe Behandlung sind aber in jedem Falle wichtig. Aus diesem Grunde ist ein schnelles, sehr zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung und/oder Diagnose der Krebszelle und/oder des Krebsgewebes sehr erwünscht.

Es sind bereits viele umfangreiche Forschungsarbeiten über ein spezifisches Antigen für einen Krebs, das sich auf der Oberfläche der Krebszelle befindet, durchgeführt worden. Insbesondere wurde ein solches Oberflächenantigen in einer Studie, in der Tierversuche durchgeführt wurden, bestätigt. Dagegen sind ausreichende Versuche in bezug auf Humankrebs noch nicht durchgeführt worden. Nach den derzeitigen Erkenntnissen kann ein solches Oberflächenantigen eines Krebses beispielsweise umfassen (1) ein Antigen, das nur autolog vorliegt, (2) ein Antigen, das üblicherweise in den gleichen Arten von Tumoren vorliegt, oder (3) ein Antigen, das auch in Tumoren eines anderen Organs oder sogar in normalen Zellen sowie in den fraglichen Tumorzellen vorliegt.

Für die Analyse eines Antigens ist im allgemeinen ein immunologisches Verfahren nützlich, bei dem ein Antiserum der gleichen oder einer anderen Spezies verwendet wird. Zur Herstellung eines solchen Antiserums, das zur Erkennung der drei obengenannten Arten von Antigenen verwendet werden kann, muß ein Absorptionsverfahrens des Antiserums wiederholt werden. Eine Abnahme des Antikörpertiters ist unvermeidlich von einem solchen Verfahren begleitet und ein daraus resultierendes Antiserum kann in der Praxis nicht verwendet werden. Außerdem ist es, wenn ein gewünschtes Antiserum erhalten werden kann, nahezu unmöglich, das gleiche Antiserum mit der gleichen Spezifität zu reproduzieren. Unter diesen Umständen ist ein neuer Weg zur Identifizierung von mit Krebs verwandten

30 (zusammenhängenden) Antigenen und Krebs-spezifischen

Antigenen auf der Oberfläche einer Krebszelle erforderlich,

Ein solcher Weg wurdevon Köhler und Milstein im Jahre 1975 in "Nature", 2J>i5, 495 (1975), entwickelt, d.h. die sogenannte Zellfusionstechnik zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers. Die Zellfusionstechnik genügt den obengenannten Anforderungen und kürzlich wurde von Teilen (Teilmengen) von Human-Lymphozyten- und monoklona-

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len Antikörpern für das Oberflächenantigen von Human-Leukämiezellen oder Human-Melanomzellen berichtet.

Obgleich ein spezifischer monoklonaler Antikörper unter Anwendung einer solchen Zellfusionstechnik erhalten werden kann, ist die Antigenizität einer Krebszelle diffus (streuend) zwischen verschiedenen Krebszellen und deshalb ist derzeit die tatsächliche Herstellung eines ausgezeichneten Antikörpers mit der gewünschten Spezifität nicht vorhersehbar. Auch wurde in bezug auf Human-Krebszellen bis heute nur über wenige spezielle Krebszellen wie vorstehend angegeben berichtet. Insbesondere gibt es keinen Bericht über den Human-Prostatakrebs. Natürlich gibt es auch keinen Antikörper für den Prostatakrebs, der

15 derzeit verwendbar ist.

Es wurden nun große Anstrengungen unternommen, um ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers für das Oberflächenantigen einer Human-Prostata-Krebszelle zu entwickeln, was zu der vorliegenden Erfindung geführt hat, nach der ein solcher Antikörper mit einer hohen Spezifität, einem hohen Titer und einem geringen Gehalt an Kontaminanten (Verunreinigungen) erhalten werden kann aus einer Hybrid(om)-Zelle zwischen einer Zelle, die einen Antikörper für eine Human-Prostatakrebszelle bilden kann (nachstehend gelegentlich als "einen Anti-Prostatakrebs-Antikörper bildende Zelle" oder einfach als "Antikörperbildende Zelle" bezeichnet), und einer Zelle, die in einer in vitro-Subkultur unterhalten werden kann (nachstehend gelegentlich als "Subkultur-Zelle" bezeichnet). Es wurde auch gefunden, daß sich ein solcher Antikörper eignet für die Klassifizierung und/oder Identifizierung einer Human-Prostata-Krebszelle. Der Antikörper eignet sich auch für eine wirksame Behandlung des Prostatakrebses beim

35 Menschen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines für das Oberflächenantigen einer Human-

-ιοί prostatakrebszelle spezifischen Antikörpers zu entwickeln. Ziel der Erfindung ist es ferner, einen hochspezifischen Antiprostatakrebs-Antikörper sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung unter Anwendung einer Zellfusxonstechnik zu entwickeln. Ziel der Erfindung ist es außerdem, eine Hybridom) -Zelle zu schaffen, die einen solchen Antikörper bilden kann. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Klassifizierung und/oder Identifizierung der Human-Prostatakrebszelle mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers zu schaffen. Ziel der Erfindung ist es ferner, ein pharmazeutisches Mittel zur Behandlung des Prostatakrebses beim Menschen zu finden, das den erfindungsgemäßen Antikörper als wirksame Komponente (Wirkstoff) enthält. Ziel der Erfindung ist es schließlich, ein brauchbares Derivat eines solchen Antikörpers zu finden, das sich für die Klassifizierung und/oder Identifizierung der Human-Prostatakrebszellen und für die Behandlung des Human-Prostatakrebses eignet.

Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung und den weiter unten folgenden Beispielen hervor, in denen spezifische Ausführungsformen der Erfindung beschrieben sind, auf welche die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Anti-Prostatakrebs-Antikörpers umfaßt die Herstellung einer Hybrid(om)-Zelle (Hybridoma) aus einer einen Anti-Prostatakrebs-Antikörper bildenden Zelle und einer Subkulturzelle, insbesondere einer Myelomzelle (Myeloma), sowie die Abtrennung bzw. Gewinnung des von der Hy.brid(om)-Zelle abgesonderten Antikörpers.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend näher beschrieben.

1 A) Herstellung der Antikörper-bildenden Zelle

Erfindungsgemäß kann die Anti-Prostatakrebs-Antikörperbildende Zelle aus jeder beliebigen Tierspezies einschließlich des Menschen erhalten werden. Eine Immunisierung des Tieres ist nicht wesentlich, obgleich durch eine solche vorherige Immunisierung der Sammlungswirkungsgrad der gewünschten Hybrid(om)-Zelle deutlich verbessert werden kann.

Wenn eine solche Zelle von einem Menschen stammt, kann irgendeiner ausgewählt werden, der einen Prostatakrebs durchgemacht hat oder einen hohen Serumtiterwert für die Prostatakrebszelle hat. Alternativ kann eine solche Zelle aus einem lebenden Körper gewonnen werden, der mit einem Immunogen immunisiert worden ist. Bei dem Immunogen kann es sich um eine Krebszelle selbst, eine Zelle, die mit Glutaraldehyd, Mitomycin oder Wärme behandelt worden ist und sich daher nicht mehr vermehren kann, oder um das Oberflächenantigen, das durch eine geeignete Behandlung, beispielsweise mit einem Enzym, von einer Krebszelle abgetrennt und gereinigt worden ist, handeln.

Das bei der Immunisierung verwendete Immunogen kann mit einem Adjuvans, wie z.B. dem vollständigen oder unvollständigen Freund-Adjuvans, gemischt werden. Das Immunogen kann auf konventionellem Wege verabreicht werden, beispielsweise durch subkutane, intraperitoneale, intravenöse, intradermale und intramuskuläre Injektion. Eine subkutane oder intraperitoneale Injektion ist bevorzugt. Eine Immunisierung kann ausreichend sein, obgleich die Immunisierung auch in einem geeigneten Zeitabstand von beispielsweise 1 bis 5 Wochen mehrmals wiederholt werden kann. Nach der Messung des Antikörpertiters im Serum des immunisierten Tieres kann das Tier, dessen Titer ausreichend hoch ist, zur Gewinnung der Antikörper-bildenden Zelle verwendet werden, was zu einer Verbesserung des

Wirkungsgrades der nachfolgenden Verfahren führt. Die bevorzugte Zelle stammt aus dem Tier am 3. bis 5. Tag nach der letzten Immunisierung. Bei der Antikörper-bildenden Zelle handelt es sich um eine Plasmazelle oder eine Lymphzelle, die eine Vorlauferzelle derselben ist, und sie kann aus irgendeiner Stelle des Körpers, im allgemeinen aus der Milz, dem Lymphknoten, dem peripheren Blut oder irgendeiner Kombination davon stammen.

10 B) Zellfusion

Eine Zelle, die durch in vitro-Subkultivierung dauerhaft unterhalten werden kann, kann irgendeine geeignete Zelle sein, die mit der Antikörper-bildenden Zelle fusioniert werden kann unter Bildung einer Hybrid(om)-Zelle, die den gewünschten Antikörper bilden kann. Unter solchen Zellen bevorzugt ist eine Leukämiezelle, wie z.B. eine Myelomzelle (Myeloma). Eine solche Zelle kann von irgendeiner Spezies, wie z.B. vom Menschen, einer Ratte, einer Maus und dgl., stammen. Die Zelle, die einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) oder Thymidin-Kinase (TK) hat, ist bevorzugt, da diese Mutterzellen in einem selektiven Medium nicht wachsen können.

Ein Beispiel für eine bevorzugte Zellinie ist GM 1500-6TG-A12 oder RPMI8226, die aus dem Menschen stammt, oder P3-X63-Ag8, P3-NSI/1-Ag4-1, Sp2/0-Ag14, X63-Ag8.653 und dgl.,

Vorzugsweise werden eine Antikörper-bildende Zelle und eine Subkultur-Zelle, die beide aus der gleichen Spezies stammen, verwendet, obgleich dies vom Gesichtspunkt des Pusionswirkungsgrades, der Stabilität der Eigenschaften der fusionierten Zellen und der Möglichkeit ihrer in vivo-Kultivierung aus betrachtet nicht wesentlich ist. Insbesondere dann, wenn die Zellinie P3-X63-Ag8, P3-NSI/1-Ag4-1, Sp2/0-Ag14 oder X63-Ag8.653 als Subkultur-Zelle verwendet wird, kann eine Inzucht-BALB/c-Maus

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1 oder ihre Hybridmaus bevorzugt verwendet werden.

Für die Fusion kann ein Beschleuniger, wie z.B. Sendai-Virus (HVJ) und Polyethylenglykol verwendet werden, wobei insbesondere Polyethylenglykol 1000, 1540, 2000, 4000

oder 6000 bevorzugt verwendet werden kann. Die Zellfusion kann in einer Lösung durchgeführt werden, die etwa 33 bis etwa 55 % dieses Polyethylenglykols enthält. Außerdem kann Dimethylsulfoxid in der Lösung vorhanden sein. 10

C) Herstellung der Hybrid (om)-Zelle (Hybridoma)

In der Lösung nach der Fusion sind zusätzlich zu der fusionierten Zelle die restliche Antikörper-bildende Mutterzelle und die restliche Subkultur-Zelle vorhanden. Erstere kann während der nachfolgenden in vitro-Kultivierung nicht überleben, während letztere sich zusammen mit der gewünschten Hybrid(om)-Zelle vermehren kann. Es ist daher bevorzugt oder sogar erforderlich, die Subkultur-Zelle aus der die gemischten Zellen enthaltenden Lösung zu entfernen. Aus diesem Grunde wird die HGPRT- oder TK-Mangel-Zelle bevorzugt als Mutter-Subkulturzelle verwendet und die die Mutterzellen enthaltenden gemischten Zellen werden nach der Zellfusion in einem Hypoxanthin, Aminopterin und Tymidin enthaltenden Selektionsmedium kx'ltiviert, welches das selektive Wachstum nur der gewünschten Hybrid(om)-Zelle ermöglicht. Alternativ kann die Mutter-Subkulturzelle, wenn es sich dabei nicht um eine Zelle mit einem Mangel an HGPRT oder TK handelt, vor der Zellfusion mit Emetin und Aktinomycin D behandelt werden. Die Mutterzelle kann sich durch diese Behandlung nicht vermehren und deshalb kann die gewünschte Hybrid(om)-Zelle leicht von den gemischten Zellen selektiert werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Hybrid(om)-Zellen enthalten im allgemeinen zwei oder mehr Klone, wobei diese nicht die vollständig gleichen Eigenschaften haben können. Zur Auftrennung derselben in die einzelnen Klone kann ein

Klonen erforderlich sein und sogar erwünscht sein, wenn ein monoklonaler Antikörper gewünscht wird. Das Klonen ist auch wirksam vom Standpunkt der Verhinderung der Änderung der Population aus betrachtet, die häufig in einer Langzeit-Kultur eines Systems auftreten kann, in der eine Reihe von Klonen gemischt wird. Das Klonen kann durchgeführt werden durch Grenzverdünnungs-Kultivierung, Weichagar-Kultivierung oder Fibringel-Kultivierung. Ein fluoreszierender aktiver Zellsortierer kann auch zum Aussortieren der Zellen beim Klonen verwendet werden.

Das Klonen kann auch zur Abtrennung möglicher Varianten-Zellen angewendet werden, die während der Langzeitkultivierung auftreten, und zur Rückhaltung der Zellen mit den gleichen Eigenschaften wie die ursprüngliche Hybrid-

15 (om)-Zelle (Hybridoma).

Die erfindungsgemäße Hybrid(om)-Zelle kann in der logarithmischen Wachstumsphase für einen langen Zeitraum in der eingefrorenen Form von 1 bis 10 χ 10 pro ml, suspendiert in einem Rinderfötusserum, aufbewahrt werden, das 5 Vol./Vol.-% Dimethylsulfoxid enthält. Das Einfrierverfahren wird vorzugsweise mit einer Abkühlungsgeschwindigkeit von -1°C pro Minute durchgeführt. Die Lagerung der Hybrid(om)-Zelle erfolgt vorzugsweise bei -80⁰C oder

25 darunter.

Die eingefrorene, gelagerte Hybrid(om)-Zelle wird vorzugsweise so schnell wie möglich aufgetaut. Wenn die Zellen mit einem Medium gewaschen werden, um sofort nach dem Auflösen Dimethylsulfoxid zu entfernen, können die Zellen in einem konventionellen Medium so wie es vorliegt suspendiert und kultiviert werden. Wenn nur eine geringe Menge der Zellen nach dem Auftauen überlebt und wächst, sollten Milzzellen von der Maus und dgl. zugegeben werden.

D) Bildung und Gewinnung des Antikörpers

Zur Bildung eines Antikörpers wird die einen Anti-Prostata-

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krebs-Antikörper bildende Hybrid(om)-Zelle in vitro oder in vivo kultiviert.

In einer in vitro-Kultur kann eine geeignete Nährstoffbrühe für die erfindungsgemäße Hybrid(om)-Zelle verwendet werden, beispielsweise ein RPMH640-Medium, das 10 VoI./-VoI.-% Rinderfötusserum, 5 χ 10~⁵ M ß-Mercaptoethanol, 1 mM Natriumpyruvat und Antibiotika enthält, oder es kann ein nach Dulbecco modifiziertes Eagle-MEM-Medium (nachstehend als D-MEM-Medium bezeichnet), das 4,5 g/l Glucose enthält, anstelle des RPMI 1640-Medium verwendet werden. Eine geeignete anfängliche Zellkonzentration für die Vermehrung kann im allgemeinen 10 pro ml betragen, obgleich dies von jeder Hybrid(om)-Zelle abhängen kann, und die Zellkonzentration während der Kultivierung beträgt vorzugsweise bis zu 2 χ 10 pro ml.

In einer in vivo-Kultur wird die Hybridzelle auf einen lebenden Körper transplantiert und in fester Form oder in Form von Ascites wachsen gelassen. Eine Körperflüssigkeit, vorzugsweise Serum oder Ascites, wird aus dem lebenden Körper entnommen zur Abtrennung des von der Hybrid(om)-Zelle abgesonderten Antikörpers. Die dabei erhaltene rohe Lösung des Antikörpers kann als Kontaminanten (Verunreinigungen) verschiedene Substanzen enthalten, die aus dem lebenden Wirts-Körper stammen, wobei sie dennoch bemerkenserter ist als die Antikörper-Lösung, die in vitro erhalten wurde, wegen der höheren Konzentration des gewünschten Antikörpers. Wenn die Hybrid(om)-Zelle intraperitoneal transplantiert wird, kann vor der Transplantation, vorzugsweise 3 bis 9 Wochen vor der Transplantation, Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpenbadecan) intraperitoneal verabreicht werden. Durch diese Behandlung kann die Ausbeute an roher Antikörperlösung, wenn auch nicht wesentlich, erhöht werden.

Als Wirt wird vorzugsweise ein Tier der gleichen Spezies und der gleichen Zuchtlinie wie das Tier, aus dem die Mutterzelle (n) stammt, verwendet und in diesem Falle kann die Hybrid(om)-Zelle in dem Tier wachsen gelassen werden, auch

wenn es nicht spezifisch behandelt worden ist. Wenn die Serotypen der Gewebeverträglichkeit der Antigene zwischen der Hybrid(om)-Zelle und dem Wirt miteinander übereinstimmen, wird der Wirt notwendigerweise vorbehandelt, beispielsweise durch Verabreichung eines Antilymphozyten-Antikörpers oder durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen. Die Zellen beginnen 1 bis 3 Wochen nach der Transplantation zu wachsen.

Bei der in vitro- oder in vivo-Kultivierung der Hybridzellen zur Absonderung der Antikörper kann dem Medium oder dem Wirt eine radioaktive Substanz, z.B. durch ein Radioisotop markiertes Leucin und Lysin, verabreicht werden. Diese Behandlung kann einen Antikörper mit der

15 gleichen chemischen Struktur wie der nicht-markierte

Antikörper ergeben, der jedoch die radioaktive Substanz im Molekül enthält.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können so wie sie in der rohen Antikörperlösung vorliegen verwendet werden oder sie können nach irgendeinem konventionellen Verfahren für Immunoglobulin, beispielsweise durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung oder Ionenaustauschchromatographie oder durch Affinitätschromatographie mit Protein A oder einem Antigen, gereinigt werden. Diese gereinigten Antikörper können unabhängig voneinander (einzeln) oder in Form einer Mischung verwendet werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des Anti-Prostatakrebs-Antikörpers kann der Mangel, der den konventionellen Verfahren anhaftet, im wesentlichen beseitigt werden. Die erfindungsgemäße Hybrid(om)-Zelle kann subkultiviert und praktisch dauerhaft sowohl in vitro als auch in vivo vermehrt werden. Außerdem kann die Hybrid(om)-Zelle einen Antikörper für eine spezifische Antigendeterminante bilden. Der gebildete Antikörper kann daher eine monoklonale Spezifität besitzen, er ist ein Antikörper für das Oberflächenantigen einer Prostatakrebs-

zelle und besteht im wesent]ichen aus einer einzigen Molekülspezies. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Bildung der erforderlichen Menge an Antikörper je nach Bedarf unter Vermeidung einer Streuung zwischen den Chargen und erlaubt ferner die Herstellung einer den Antikörper enthaltenden Lösung mit einem hohen Titer. Außerdem ist bei dem Verfahren keine umständliche Absorption erforderlich, die bei dem konventionellen Verfahren unvermeidlich war. Andererseits kann nicht-gereinigtes Antigen, wie z.B. eine Prostatakrebszelle selbst, ohne Schwierigkeit in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und auch in einem solchen Falle kann der hochspezifische Antikörper erhalten werden. Eine derart hohe Reaktionsfähigkeit mit einem Antigen des Antikörpers erlaubt die schnelle Identifizierung einer Prostatakrebszelle mit hoher Zuverlässigkeit ohne konventionelle umständliche Verfahren. Da die Reinheit des Antikörpers hoch ist, treten darüber hinaus auch allergische Reaktionen als Folge von Kontaminanten (Verunreinigungen), <3ie unvermeidlich in dem konventionellen Präparat enthalten sind, selten auf, so daß er als Heilmittel für Prostatakrebs verwendet werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Klassifizierung und/- oder Identifizierung kann auf ein·Objekt aus einer beliebigen Quelle angewendet werden. So können beispielsweise klinische Materialien, wie z.B. Urin, Lymphknoten, Knochenmark oder ein anderes bioptisches Gewebe, verwendet werden, das aus einem Patienten stammt, der vom klinischen Standpunkt aus betrachtet möglicherweise an Prostatakrebs leidet.

Bei der Identifizierung wird ein den erfindungsgemäßen Antikörper enthaltendes Reagens mit einem Prostatakrebszellen enthaltenden Objekt in Kontakt gebracht. Zweckmäßig kann die Immunof luoreszenzmikroskopie, die Immunoelektroraikroskopie, der radioaktive Bindungsassay, der Enzymimmunoassay und dgl. angewendet werden. Bei der direkten

Imiminofluoreszenzmikroskopie kann der erfindungsgemäße Antikörper zweckmäßig nach der Markierung desselben mit einem Fluoreszenzfarbstoff, wie z.B. Fluorescein und Rhodamin, verwendet werden. Eine andere geeignete Form des erfindungsgemäßen Antikörpers kann eine solche sein, die mit einem Markierungsstoff, wie z.B. Ferritin, für eine Iiranunoelektromikroskopie markiert ist, eine solche, die mit einem Radioisotop, z.B. J und J markiert ist für einen radioaktiven Bindungsassay, oder eine solche, die mit einem Enzym, z.B. Peroxidase, und alkalischer Phosphatase, markiert ist, für einen Enzymimmunoassay. Natürlich kann auch eine indirekte Methode angewendet werden unter Verwendung eines sekundären Antikörpers oder seines Bindungsprodukts als Ersatz, so kann beispielsweise ein mit Biotin markierter Anti-Humanprostatakrebs-Antikörper zusammen mit Avidin als sekundärem Antikörper verwendet werden. Auch kann anstelle des Antikörpers selbst ein Teil des Antikörpers verwendet werden, der erhalten worden ist durch restriktive Spaltung mittels einer chemischen und/oder enzymatischen Behandlung, wie z.B. F (ab¹)-)- Diese verschiedenen Derivate und Restriktionsprodukte sind brauchbar für das erfindungsgemäße Verfahren der Klassifizierung und/oder Identifizierung und sie liegen daher ebenfalls innerhalb des Rahmens

25 der vorliegenden Erfindung.

Erforderlichenfalls können der Antikörper, seine Derivate und Restriktionsprodukte für die Verwendung miteinander gemischt werden. Außerdem kann das Reagens für die erfindungsgemäße Klassifizierung und/oder Identifizierung ferner noch einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, wie er (es) üblicherweise verwendet wird, enthalten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Heilmittel (Arzneimittel) für die Behandlung des Prostatakrebses.

Der Heilungsmechanisitius der erfindungsgemäßen Antikörper

kann so verstanden werden, daß er eine Komplementfixierungsreaktion und den Angriff von Makrophagen und/oder anderen Immunozyten auf die Krebszellen beschleunigt, wenn sich der verabreichte Antikörper mit dem Oberflächenantigen

5 der Krebszelle verbindet.

Der erfindungsgemäße Antikörper kann unabhängig als solcher oder in Form einer Mischung verabreicht werden. Wenn der Antikörper mit einem Antikrebsmittel, wie z.B.

Mitomycin und Doxorubicinhydrochlorid, oder einem Toxin, wie z.B. Ricin_;chemisch kombiniert wird, können weitere Vorteile erzielt werden. In diesem Falle kann der Mechanismus so verstanden werden, daß das Antikrebsmittel oder das Toxin die Krebszellen angreifen kann, wenn sich der verabreichte Antikörper mit dem Oberflächenantigen der Krebszelle verbindet, was zu einer geringeren Toxizität des Antikrebsmittels oder des Toxins als bei alleiniger Verwendung führt. Ein Teil des Antikörpers, der erhalten wurde durch restriktive Spaltung durch eine chemische oder Enzymbehandlung, wie z.B. Fiab')^' kann ebenfalls als erfindungsgemäßes Heilmittel (Arzneimittel) anstelle des Antikörpers selbst verwendet werden. In ^:diesem Falle kann die Möglichkeit vermieden werden, daß das Gewebe eines Wirtes durch eine Schädigung als Folge einer nichtspezifischen Komplementfixierungsreaktion und dgl. angegriffen werden kann. Diese Derivate (Kombinationsprodukte mit einem Antikrebsmittel oder einem Toxin) und Restriktionsprodukte können entweder einzeln (unabhängig voneinander) oder in Form einer Mischung derselben als erfindungsgemäßes Heilmittel (Arzneimittel) verwendet werden.

Zur Beurteilung der akuten Toxizität der Antikörper, seiner Derivate oder Restriktionsprodukte wurde das erfindungsgemäße Heilmittel an drei Gruppen (von jeweils 10 Tieren) ICR-Mäuse verabreicht; an die erste in einer Menge von 2 g/kg peroral, an die zweite in einer Menge von 400 mg/kg intraperitoneal und an die dritte in einer

* Menge von 200 mg/kg intravenös, und innerhalb eines Zeitraums von 14 Tagen wurde kein Todesfall festgestellt. Das erfindungsgemäße Heilmittel kann daher als sicheres Heilmittel (Arzneimittel) für Human-Prostatakrebs angese-

5 hen werden.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann subkutan, intramuskulär oder intravenös, vorzugsweise durch subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden. Das Heilmittel (Arzneimittel) kann peroral verabreicht werden, da ein Teil des verabreichten Mittels durch den Intestinaltrakt absorbiert werden kann, während die Struktur als Antikörper beibehalten wird, was durch die vorliegende Erfindung bestätigt wurde.

Ein injizierbares Präparat kann beispielsweise herge-• stellt werden durch Auflösen oder Suspendieren von ■ 10 mg des Antikörpers oder seines Derivats zusammen mit 50 mg Mannit in destilliertem Wasser auf 10 ml, Sterilisieren auf irgendeine konventionelle Weise, Aufteilen in Ampullen zu jeweils 2 ml und Gefriertrocknen. Das erhaltene Produkt wird bei seiner Verwendung in einer Kochsalzlösung aufgelöst oder suspendiert. Ein Injektionspräparat kann zusätzlich zu dem Antikörper einen Träger, ein Verdünnungsmittel, einen Puffer, einen Stabilisator, ein isotonisches Agens und dgl. enthalten, wobei diese Agentien dem Fachmann bekannt sind. Das injizierbare Präparat kann in jeder beliebigen Form einer subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Injektion hergestellt werden. Ein oral verabreichbares Mittel kann nach irgendeinem konventionellen Verfahren zu einem enterischen Arzneimittel verarbeitet werden. Die Dosierungsrate des erfindungsgemäßen Heilmittels hängt hauptsächlich von den Symptomen ab und sie beträgt im allgemeinen 0,001 mg bis 10 g pro Tag pro kg Körpergewicht beim Tier, beispielsweise bei der Maus, und 0,01 bis 3000 mg pro Tag pro kg Körpergewicht beim Menschen.

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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1; Herstellung eines Antikörpers für eine Human-Prostatakrebszelle

A) Immunisierung und Zellfusion

1) Herstellung der Immunogenzelle: Eine Human-Prostatakrebszellinie 8PC93 (2 χ 10⁵ Zellen), die in vitro für einen langen Zeitraum subkultiviert worden war, wurde bei 37°C in einer feuchten Umgebung, die 5 % CO₂ enthielt, in einem Eagle-MEM-Earle-Salzmedium (nachstehend als MEM-Medium bezeichnet), das 10 Vol/Vol.-% Fötus-Rinderserum und Kanamycinsulfat (Endkonzentration 60 mg/1) enthielt, in einer 100 mm-Kulturschale (Falcon 300 3, Becton-Dickinson, USA) inkubiert. Nach 3-tägiger Kultivierung wurden die Zellen mit einer Gummifahne abgeschiefert und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugieren entfernt. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren mit einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS,

P^ 7,2) gewaschen und in PBS suspendiert. Aus einer Kulturschale erhielt man 2 χ 10⁶ Zellen.

2) Myelom-Kultur: Eine Maus-Myelomzellen-Linie Sp2/0-Ag14 (10⁵/ml) wurde in D-ΜΞΜ kultiviert, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum, 1 mM Brenztraubensäure, 2 mM Glutamin und 60 mg/1 Kanamycinsulfat enthielt, durch eine Subkultur alle 3 Tage. Am Tage vor der anschließenden Zellfusion wurden die Zellen auf eine Zellkonzentration von 2,5 χ 10⁵ pro ml e

30 Medium kultiviert.

2,5 χ 10 pro ml eingestellt und in dem obengenannten

3) Immunisierung mit 8PC9 3-Zellen: 8PC93-Zellen (10⁷ Zellen) , die in dem obigen Abschnitt (1) erhalten'worden waren und in 0,4 ml PBS suspendiert waren, wurden in weibliche BALB/c-Mäuse (NIHON CHARLES LIVER, Japan, 9 Wochen alt) zweimal mit einem Zeitabstand von etwa 3 Wochen intraperitoneal injiziert zur Durchführung der Immunisierung.

4) Zellfusion: Die Zellfusion wurde nach dem Verfahren von Köhler und Milstein (Immunoassay; Clinical Laboratory Techniques for the 1980's ed. von R.M. Nakamura et al., E.S. Alan R. Liss, Inc., N.Y., 1980, Seiten 301-324)

5 durchgeführt.

Am 4. Tage nach der letzten Immunisierung wurden die

Mäuse getötet, um die Milz zu entnehmen. Die Milz

wurde gut geöffnet (freigelegt), durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenweite von 0,10 mm (150 mesh) passiert, bei 400 χ g zentrifugiert und zu den ausgefallenen Zellen wurde ein Tris-HCl-Puffer (0,017 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pH 7,65), der 0,747 % Ammoniumchlorid enthielt, zugegeben, um Erythrocyten zu entfernen, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren (400 χ g) gesammelt. Nach der Zugabe von MEM zu den Zellen wurde das Zentrifugieren bei 400 χ g durchgeführt und die Zellen wurden in frischem MEM wieder suspendiert. Nach 3-maliger Wiederholung dieses Waschvorganges wurden die Zellen schließlich in MEM suspendiert.

Sp2/0-Ag14-Zellen wurden durch Pipettieren aus dein Kultivierungsgefäß abgeschiefert und in ein Zentrifugenglas überführt. Nach dem Zentrifugieren (400 χ g) wurden die gesammelten Zellen in MEM suspendiert, zentrifugiert (400 χ g), um Serum zu entfernen, und in MEM erneut suspendiert.

Die Milzzellen (10 χ 10⁷) und Sp2/0-Ag14 (2 χ 10⁷) wurden miteinander gemischt, gut pipettiert und zentrifugiert (400 x g). Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Niederschlag durch mildes Punktieren des Zentrifugenglases freigelegt. Den freigelegten Zellen wurden 0,6 ml einer Lösung von 30 Vol./Vol.-% Polyethylenglykol (PEG 1000) in MEM, das bei 37°C gehalten wurde, zugegeben. Nach vorsichtigem Rühren wurde die Lösung 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Zentrifugieren wurde 2 min lang bei 7 χ g durchge-

führt und es wurden 5 ml MEM allmählich zugegeben. Nach vorsichtigem Rühren wurde das Zentrifugieren 5 min lang bei Raumtemperatur durchgeführt (400 χ g). Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, es wurden 5 ml MEM zu dem Niederschlag zugegeben, es wurde auf ähnliche Weise wie oben angegeben zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen.

Zu den ausgefallenen Zellen wurden 5 ml D-MEM-Medium, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum, 2 mM Glutamin, 5 χ 10~ M ß-Mercaptoethanol, 60 mg/1 Kanamycinsulfat und außerdem 4,5 g/l Glucose enthielt (nachstehend als D-MEM-FBS-Medium bezeichnet)_/ zugegeben. Nach dem Pipettieren wurden 40 ml D-MEM-FBS zu der resultierenden Zeilsuspension (10 ml) zugegeben. Jeweils 25 ml der Suspension wurden in einen 2 5 cm²-Kulturkolben (C-2 5100, Corning, USA) inokuliert und unter Stehenlassen in einer feuchten Umgebung, die 5 % CO₂ enthielt, bei 37⁰C über Nacht inkubiert, wobei in den nachfolgenden Verfahrensstufen immer die gleichen Inkubierungsbedingungen angewendet wurden.

Am nächsten Tag nach der Inokulierung wurde die Kultur nach leichtem Pipettieren in ein Zentrifugenglas überführt und bei 400 χ g zentrifugiert. Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Zellpellet in

-4 60 ml D-MEM-FBS suspendiert, das 1x10 M Hypoxanthin,

-7 -5

4 χ 10 M Aminopterin und 1,6 χ 10 M Thymidin enthielt (HAT-Medium). Die Suspension (0,1 ml) wurde in jedes Loch einer 96 Loch-Platte (Falcon 3072, Becton-Dickinson, USA) eingeführt und 1 Woche lang kultiviert. Nach 1-wöchiger Kultivierung in einem HAT-Mediuirt wurden alle 2 oder 3 Tage 25 μΐ HT-Medium (HAT-Medium ohne Aminopterin) zugegeben.

B) Selektion und Wachstum der Antikörper-bildenden

Hybrid(om)-Zellen

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Zur Überprüfung der Bildung von Antikörpern für 8 PC93-Zellen in der überstehenden Flüssigkeit jedes Loches in der zweiten Woche nach der Zellfusion wurde ein Festphasen-Enzym- Immunoassay angewendet. 5

8 PC93-Zellen, die auf einer Platte (Falcon 3072) fixiert waren, wurden mit 40 μΐ der überstehenden Flüssigkeit in jedem Loch 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, mit PBS gründlich gewaschen, 2 Stunden lang mit 100 μΐ Peroxidase-gebundenem Antimaus-Immunoglobulin-Antikörper (Katalog-Nr. 3211-0231, Cappel Lab., Inc., USA), der mit Pferdeserum auf das 1000-fache verdünnt war, reagieren gelassen und mit PBS gründlich gewaschen. 200 μΐ Citratpuffer (0,1 M, pH 4,5), der 1 mg/ml eines Substrats (o-Phenylendiamin) und 0,4 μΐ/ml 31 %iges wäßriges Wasserstoffperoxid enthielt, wurden zugegeben und 30 min lang reagieren gelassen zum Färben.

In zwei Löchern (Vertiefungen), welche die mit 8PC93-Zellen reagierenden Antikörper enthielten, wurde unter Anwendung des Grenzverdünnungsverfahrens das Klonen wie folgt durchgeführt:

100 Hybridomzellen aus jedem der zwei Löcher (vertiefungen) mit einer positiven Antikörperbildung wurden in D-MEM-FBS suspendiert und mit Milζzellen, die aus einer PALB/c-Maus auf die gleiche Weise wie bei der Zellfusion angegeben gewonnen worden waren, gemischt und in D-MEM-FBS eingestellt (10⁸ Zellen). Die Zellkonzentration wurde auf 5 χ 10 pro ml eingestellt durch Zugabe von D-MEM-FBS und die Zellmischung wurde in jedes Loch (Vertiefung) einer 96 Loch-Platte (Falcon 3072) jeweils in einer Menge von 0,2 ml inokuliert und kultiviert. Am 14. Tage nach Beginn der Kultivierung wurde die Antikörperbildung in jedem Loch (Vertiefung) untersucht unter Anwendung des obengenannten Festphasen-Enzym-Immunoassays. Es wurden 38 Antikörper-bildende Hybridomzellen einschließlich der in der folgenden Tabelle I

1 angegebenen vier Hybridomzellen erhalten.

C) Antikörper-Bildung

(in vitro-Kultur); Die Hybridomzellen P-001, P-002, P-003 oder P-OO4 wurden in D-MEM, das 20 % Fötus-Rinderserum, 2 mM Glutamin, 1 mM Brenztraubensäure, 4,5 g/l Glucose, 5 χ 10 ß-Mercaptoethanol und 50 mg/1 Kanamycinsulfat enthielt, in einer Zellkonzentration von 1 χ 10 pro ml suspendiert. Die resultierende Suspension (25 ml) wurde in einen 75 cm²-Kolben für eine Gewebekultur (Corning, USA) inokuliert und bei 37°C in einem 5 % C0₂~lnkubator inkubiert. Am 4. Tag wurde die überstehende Flüssigkeit in dem stationären Wachstumszustand aus dem Kolben gesammelt. Die Anzahl der gewaschsenen Zellen betrug etwa 2 χ 10 pro ml bei jeder Hybridomzelle und die Antikörpergehalte der überstehenden Flüssigkeiten betrugen 3,1 (P-001), 2,8 (p-002), 2,8 (P-003) bzw. 2,5 μg/ml (P-004).

(in vivo-Kultur): Am 10. bis 30. Tag nach der intraperitonelaen Injektion von 0,5 ml Pristan wurden 5 χ 10 jeder Hybridomzelle P-001 bis P-004, die in vitro wachsen gelassen worden waren, intraperitoneal in die BALB/c-Mäuse inokuliert. Nach 2 oder 3 Wochen wurden die Ascites gesammelt und 15 min lang bei 4°C mit 1000 χ g zentrifugiert zur Gewinnung der ascitischen überstehenden Flüssigkeit in einer Menge von etwa 30 ml in jeder Hybridomzelle aus 10 Mäusen. Die Antikörpergehalte der überstehenden Flüssigkeiten betrugen 2,5 (P-001), 2,0 (P-002), 1,5

30 (P-003) bzw. 1,8 mg/ml (P-004).

Diese Antikörper wurden an ICR-Mäuse (10 Tiere in jeder Gruppe) in einer Menge von 2 g/kg peroral, 400 mg/kg intraperitoneal oder 200 mg/kg intravenös verabreicht und die Mäuse wurden 14 Tage lang beobachtet. Es wurde überhaupt kein Todesfall als Folge des Antikörpers festgestellt.

-26- 34Ί3341

Andererseits waren die Formen der Hybridom-Zellen P-OO1 bis P-004 etwa kugelförmig, ihre Dimensionen betrugen 10 bis 20 lim, wobei fast alle etwa 15 μΐη groß waren, und die Hybridomzellen schwammen und wiesen eine gerin-

5 ge Adhäsion gegenüber der Gefäßwand auf.

Beispiel 2: Eigenschaften des Antikörpers für die Human-Prostatakrebs-Zelle

A) Vergleich der Reaktivität mit anderen Zellen

Der in Beispiel 1 beschriebene Festphasen-Enzym-Immunoassay wurde angewendet zur überprüfung der Reaktivitäten der überstehenden Flüssigkeiten, die in Beispiel 1 erhalten worden waren, mit anderen Zellen, die in vitro subkultiviert wurden; Intestine 407 (Fötus-Human-Intestin-Zellinie), K-562 (Human-Leukämie-Zellinie) und Bri 7 (Human-Peripherblut-Lymphozytenzellinie) sowie .8PC93 (Human-Protatakrebszellinie). Wie aus der nachfolgenden Tabelle I ersichtlich, waren die Antikörper, die von den Hybridomzellen abgesondert worden waren, gegenüber 8PC93

20 hochspezifisch.

B) Färbung der Zellen nach der Fluoreszenz-Antikörper-

Methode

8PC93-Zellen wurden unter Anwendung der indirekten Fluores· zenz-Antikörper-Methode gefärbt unter Verwendung des von der Hybridomzelle P-002 abgesonderten Antikörpers. 8PC93-Zellen wurden auf einem Glasplättchen ohne Fluoreszenz fixiert, 45 min lang unter feuchten Bedingungen bei 37⁰C mit der überstehenden Flüssigkeit (50 μΐ) reagieren gelassen und gewaschen durch 3- bis 5-minütiges Behandeln mit einer PBS-Lösung, die 1 % Rinderserumalbumin, 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) und 0,1 % Natriumazid enthielt, wobei dieser Waschvorgang 3-mal wiederholt wurde. Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen weitere 4 5 min lang mit 50 μΐ einer auf das 20-fache verdünnten Lösung von Fluorescein-gebundenem Antimaus-IgG (Miles-Yeda Ltd., Israel, Code Nr. 65-171) durchgeführt und der Waschvorgang wurde auf die

3 4Ί 3 341

gleiche Weise wie oben angegeben durchgeführt. Nach dem Trocknen wurde mit einer Carbonat-gepufferten Glycerinlösung (0,05 M, pH 9,5, 10 % Glycerin) überschichtet und es wurde ein Deckglas aufgelegt, bevor das Ganze durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan, Modell AH-RFL-LB) betrachtet wurde. Auf der Oberfläche der 8PC93-Zelle wurde eine starke Fluoreszenz festgestellt. Der Fluorescein· gebundene Antimaus-IgG wurde verwendet, nachdem er einer 6-maligen Absorption mit 8PC93-Zellen unterworfen worden war.

C) Identifizierung der Immunoglobulin-Klassen

Die Klassen der Immunoglobuline der von den Hybridomzellen P-OO1 bis P-004 abgesonderten Antikörper wurden nach dem Festphasen-Enzym-Immunoassay unter Verwendung von Anti-Immunoglobulin (Ig), Anti-IgG und Anti-IgM (Cappel Lab. Inc., USA, Katalog Nr. 3211-0231, 3211-0081, 3211-0201) als Peroxidase-gebundenerAntimaus-Immunoglobulin-Antikörper identifiziert. Wie aus der folgenden Tabelle I zu ersehen, waren alle geprüften Antikörper IgG.

Tabelle I

Hybridom - Zelle	Spezifität	Imniunoglobulin- Klasse
P-OOl P-002 P-003 P-004	Human Human- Human- Human-Peri- Prostata- Fötus- Leukämie- phefblut- Krebszelle Intestine-Zel- Zelle Lymphzelle , 8PC93 Ie 1-407 K-562 " Bri 7	IgG IgG IgG IgG
+++ + + ₊₊ _ ++ - + ++ -

+: positiv

-: negativ

Beispiel 3: Identifizierung von Prostatakrebs durch den Antikörper

1) Objekt: Ein bei einer chirurgischen Operation erhaltenes, Prostatakrebs enthaltendes Gewebe wurde mit 95 % Alkohol fixiert und in Paraffin eingebettet zur Herstellung eines 4 um großen Probestückes.

2) Identifizierung: Die Identifizierungen wurden durchgeführt unter Anwendung der Fluoreszenz-Antikörper-Methode unter Verwendung von Antikörpern (ascitische überstehende Flüssigkeit), die von der Hybridomzelle P-002 abgesondert wurden.

0,1 ml der 100-fachen Verdünnung der obengenannten Antikörper-Lösung wurden zu der Gewebeprobe zugegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem gründlichen Waschen mit PBS wurden 0,1 ml des 100-fach verdünnten Fluorescein-gebundenen Antimaus-IgG (Miles, USA) zugegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Entfernung von nicht-umgesetztem Fluorescein-gebundenem Antimaus-IgG durch Waschen mit PBS wurde in einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus Vanox, Olympus, Japan) bei jeder Objekt-Gewebeprobe des Glasplättchens eine Fluoreszenz festgestellt. Bei normalem Gewebe wurde fast keine Fluoreszenz beobachtet, während bei dem Prostatakrebsgewebe eine starke Fluoreszenz festgestellt wurde. Um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern, war der Fluorescein-gebundene Antimaus-IgG vorher durch Absorption mit einer Human-Prostatakrebs-

30 zellinie 8PC93 behandelt worden.

Beispiel 4

1) Peroxidase-Markierung eines von der Hybridomzelle

P-002 abgesonderten Antikörpers

4 mg Meerrettich-Peroxidase (Sigma-Typ VI, Sigma, USA) wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und es wurden 60 μΐ einer unmittelbar vor der Verwendung hergestellten 0,1 M NaJO^-Lösung zugegeben und 20 min lang bei

_₃₀.

Raumtemperatur damit gemischt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht gegen 1 mM Natriumacetatpuffer (pH 4,4) dialysiert und es wurden 20 μΐ einer 0,2 M Natriumcarbonatlösung zugegeben. Bald danach wurde der von der Hybridom-Zelle P-002 abgesonderte Antikörper (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit, Proteingehalt 10 mg), gelöst in 1 ml 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5), zugegeben und 2 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer frisch hergestellten wäßrigen NaBH.-Lösung (4 mg NaBH,, gelöst in 1 ml destilliertem Wasser) zugegeben, 2 Stunden lang bei 4⁰C stehen gelassen und über Nacht gegen PBS dialysiert.

Die resultierende gemischte Lösung wurde auf eine Sephadex G-IOO^ (Pharmacia, Schweden)-Kolonne aufgegeben, mit PBS eluiert und die erste Fraktion mit Extinktionen bei 280 nm und 403 nm, die einander entsprachen, wurde gesammelt. Zu 1 ml der Fraktion (Enzym-Antikörper-Bindungsprodukt) wurden 10 mg Kaninchenserum-Albumin zugegeben, um sie aufzulösen, und bis zur Verwendung bei -70⁰C aufbewahrt.

2) Alkalische Phosphatase-Markierung des von der Hybridomzelle P-002 abgesonderten Antikörpers

25 5 mg alkalische Phosphatase vom Typ VII (Sigma, USA),

die vorher gegen PBS dialysiert worden war, um Ammoniumsulfat vollständig zu entfernen, und 17 mg Antikörper, abgesondert von der Hybridomzelle P-002, wurden in PBS bis auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden 10 μΐ einer 20 %igen Glutaraldehydlösung zugegeben und es wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf eine Sephadex G-20 (/^-Kolonne (Pharmacia, Schweden), die mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) äguilibriert worden war, aufgegeben und mit dem gleichen Puffer eluiert. Es wurde eine Fraktion mit einem hohen Molekulargewicht aus dem Ablaufvolumen bis zu dem igG-Elutionspunkt gesammelt, es wurde Rinderserum-Albumin in einer

Menge bis zu 5 Gew./Vol.-% zugegeben, durch Passieren durch ein Milliporenf ilter (0,22 μΐη, Millipore, USA) sterilisiert und bis zur Verwendung bei 4⁰C im Dunkeln aufbewahrt.

3) ß-Galactosidase-Markierung des von der Hybridomzelle P-002 abgesonderten Antikörpers

Der von der Hybridomzelle P-002 abgesondere Antikörper wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren (2) mit ß-Galactosidase markiert. Bei der verwendeten ß-Galactosidase handelte es sich um eine solche der Sigma-Qualität IV (Sigma, USA).

■ 125

4) J-Markierung des von der Hybridomzelle P-002 ab-

gesonderten Antikörpers

125 Zu 10 μΐ einer Lösung von 100 mCi/ml Na J (trägerfrei, Amershan, USA) wurden 50 μΐ der von der Hybridomzelle P-002 abgesonderten Antikörperlösung (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit, Proteingehalt 1,0 mg/ml) und 30 μΐ eines 0,5 M Phosphatpuffers (pH 7,2), der 0,30 mg/ml Chloramin T enthielt, zugegeben und gut damit gemischt. Nach 15 Sekunden wurden 10 μΐ PBS, gesättigt mit L-Tyrosin,zugegeben und sofort damit gemischt. Die resultierende Mischung wurde an einer mit Amberlite IRA 400 gefüllten Kolonne Chromatographiert und mit PBS, das 1 % Rinderserum-Albumin enthielt, eluiert. Die eluierte Fraktion wurde gesammelt und bis zur Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt. Die spezifische Aktivität des markierten Produkts betrug 1,0 μϋϊ pro mg Antikörper Protein.

5) Fluorescein-Markierung des von der Hybridomzelle P-002 abgesonderten Antikörpers

Zu 1 ml Lösung des Antikörpers, der von der Hybridomzelle P—002 abgesondert wurde (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit) in einer Konzentration von 10 mg/ml wurden 0,1 ml 0,5 M Carbonatpuffer (pH 9,3) zugegc?ben, außerdem wurden 0,1 mg Fluorescein-Isothiocyanat-Pulver zugegeben und 6 Stunden lang bei 4⁰C ohne Blasenbildung

gerührt. Unmittelbar nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf eine Sephadex G-2Er^-KoIOmIe (Pharmacia, Schweden) aufgegeben zur Entfernung der nicht-umgesetzten Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, und es wurde die gewünschte Fraktion mit hohem Molekulargewicht erhalten. Das erhaltene Produkt wurde bis zur Verwendung bei 4⁰C im Dunkeln aufbewahrt.

6) Tetramethylrhodamin-Markierung des von der Hybridomzel-

'Ie P-002 abgesonderten Antikörpers

Zu 1 ml einer Lösung des von der Hybridomzelle P-002 abgesonderten Antikörpers (10 mg/miy (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit) wurden 0,1 ml 0,5 M Carbonatpuffer (pH 9,3) zugegeben und außerdem wurden 0,2 mg Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat-Pulver zugegeben und ohne Blasenbildung 20 Stunden lang bei 4 ⁰C gerührt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung sofort auf eine Sephadex G-25 -Kolonne (Pharmacia, Schweden) aufgegeben, um die nicht-umgesetzten Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, und es wurde die gewünschte Fraktion mit hohem Molekulargewicht erhalten. Das Produkt wurde bis zur Verwendung bei 4⁰C im Dunkeln aufbewahrt.

25 7) Biotin-Markierung des von der Hybridomzelle P-002

abgesonderten Antikörpers

1 mM d-Biotin (244 mg) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) und 1,5 mM N-Hydroxysuccinimid (173 mg) (Eastman Kodak, USA) wurden in einer Mischung aus 8 ml Dimethylsulfoxid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) und 5 ml 1,2-Dimethoxyethan (Nakarei Chemical/ Japan) gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde eine Lösung von 206 mg (1 mM) N/N'-Dicyclohexylcarbodiimid (Kanto Chemical, Japan) in 0,5 ml 1,2-Dimethoxyethan

35 zugegeben und bei 4⁰C über Nacht reagieren gelassen.

Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert, wobei man ein Filtrat erhielt. Das Lösungsmittel in dem Filtrat

—j j—

wurde unter Vakuum entfernt und das zurückbleibende ölige Material wurde in 10 ml Dichlormethan (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) gelöst und auf 4°C abgekühlt. Es wurden 10 ml 0,1 M NaHCO₃-Lösung (4⁰C) zugegeben und zum guten Mischen geschüttelt. Die resultierende Dichlormethan-Phase wurde entfernt, es wurden 10 ml 0,1 M NaHCO₃ und dann 10 ml destilliertes Wasser (4⁰C) zugegeben und diese Verfahren wurden erneut wiederholt. Die resultierende Dichlormethan-Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat-Pulver (Koizumi Chemical, Japan) versetzt zur Dehydrati sierung. Das Pulver wurde abfiltriert und η-Hexan wurde dem Filtrat allmählich zugegeben, bis es trübe war. Die Lösung wurde auf -20⁰C abgekühlt, die ausgefallenen Kristalle wurden in einen Exsikkator überführt, um das Lösungsmittel zu entfernen und zu trocknen. Dabei wurde das Produkt, Biotin-N-hydroxysuccinimidester, erhalten.

Das Biotin-N-hydroxysuccinimid wurde in Dimethylsulfoxid gelöst und die Konzentration wurde auf 1 mg/ml eingestellt. Die Lösung (60 μΐ) wurde mit 1 ml Lösung des von der Hybridomzelle P-002 abgesonderten Antikörpers (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit, Proteingehalt 1 mg/ml) gemischt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die Lösung gegen PBS bei 4⁰C 3 Tage lang dialysiert.

Dafür wurde die Dialyseflüssigkeit 3-mal ausgetauscht. Das Dialysat (Lösung in dem Dialyseröhrchen) wurde bis zur Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt.

Beispiel 5: Identifizierung von Human-Prostatakrebs durch markierte Antikörper

1) Objekt: Gewebe, die Human-Prostatakrebs enthielten, wurden in chirurgischen Operationen erhalten. Die rohen Gewebe mit Dimensionen von 5 mm χ 5 mm χ 2 mm oder weniger wurden fixiert, während sie 6 Stunden lang bei 4°C in einer PLP-Fixierflüssigkext (0,0375 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,2, enthaltend 0,01 M NaJO-, 0,075 M Lysin und 3 % Paraformaldehyd) geschüttelt wurden.

Die fixierten Gewebe wurden gewaschen, indem man sie nacheinander behandelte mit PBS₇ das 10 % Saccharose enthielt (4⁰C, über Nacht), mit PBS, das 15 % Saccharose enthielt (4⁰C, 6 Stunden), mit PBS, das 20 % Saccharose enthielt (4⁰C, 6 Stunden) und dann mit PBS, das 20 % Saccharose und 10 % Glycerin enthielt (4⁰C, 1 Stunde). Nach dem Waschen wurde das Gewebe eingebettet, in Trockeneis/-Ethanol eingefroren und einem Kryostaten ausgesetzt zur Herstellung einer gefrorenen Probe von 10 μΐη.

2) Identifizierungsverfahren: Die eingefrorene Probe wurde auf ein mit Rinderserum-Albumin beschichtetes ■Objektträgerglas gelegt und getrocknet. Nach 3-maligem 5-minütigem Waschen mit PBS bei 4⁰C wurde die Probe mit 0,005 M Periodsäure 10 min lang bei Raumtemperatur umgesetzt.

Nach 3-maligem Waschen mit PBS, das bei 4⁰C gehalten wurde, wurde die Probe 10 min lang bei Raumtemperatur mit PBS, das 10 % Pferdeserum enthielt, behandelt. Auf die Probe wurde mittels einer Kapillarpipette eine 10-fach verdünnte Lösung des Antikörpers von P-002, markiert mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase, Fluorescein, Rhodamin oder Biotin, hergestellt in Beispiel 4, aufgebracht und 45 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen und dann 5-mal mit PBS, das bei 4⁰C gehalten wurde, gewaschen.

Die erhaltene Probe wurde auf die nachstehend beschriebene Weise identifiziert:

a) Fluoreszenz-Antikörper-Methode: Bei den mit Fluorescein und Rhodamin markierten Antikörpern wurde die Probe in Glycerin eingeschlossen und durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus Vanox, Olympus, Japan) betrachtet.

Bei dem mit Biotin markierten Antikörper wurde ein Tropfen von 5 μg/ml Fluorescein-gebundenem Avidin (Funakoshi Yakuhin, Japan) auf die Probe aufgegeben und 1 Stunde lang bei 37°C reagieren gelassen. Nach 5-maligem Waschen mit PBS wurde die umgesetzte Probe in Glycerin einge-

schlossen und durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus
Vanox, Olympus, Japan) betrachtet.

b) Enzym-Immunoassay; Bei dem mit Peroxidase markierten Antikörper wurde die Probe mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer
(pH 7,6), der 0,02 ml/ml 1 %iges H₃O₂ und 0,5 mg/ml
3,3-Diaminobenzidin-HCl enthielt, 10 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde
die umgesetzte Probe 3-mal mit PBS von 4°C und 1-mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach der Nachfärbung

mit einem Veronal-Acetatpuffer (pH 4,0), der 1 % Methylgrün enthielt, wurde die Probe durch Ethanol dehydratisiert, durch Xylol dialysiert, in Balsam eingeschlossen und die Farbe (Braun) wurde durch ein Mikroskop betrach-

15 tet.

Bei dem mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörper wurde die Probe mit 0,2 M Tris- HCl-Puffer (pH 8,5, unmittelbar vor der Verwendung abfiltriert), der 0,39

M Magnesiumsulfat, 0,2 % Bleicitrat, 0,6 % ß-Glycerophosphorsäure und 4 % Saccharose enthielt, 10 min
lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der
Reaktion wurde die umgesetzte Probe 3-mal mit PBS, das
bei 4°C gehalten wurde, und dann 1-mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurde die Probe in einer 1 %igen gelben Ammoniumsulfidlösung 5 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, gründlich mit PBS gewaschen,
in Glycerin eingeschlossen und die Farbe (Schwarzbraun) wurde durch ein Mikroskop betrachtet.

30

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

-36-Tabelle II

3-4ΪΤ341

Msthode	Markierung des Antikörpers	Reaktivität	Normalgewabe
Fluoreszenz- Antlkörper- Msthode	Fluorescein	Krebsgewebe	-
Enzym immuno assay	Rhodamin	+	-
Biotin	+	-
Peroxidase	+	-
AlkalischePhosphatase	+1	- ■
+2

20

positive Fluoreszenz
braune Farbe

schwarzbraune Farbe
negativ

25 30 35

Beispiel 6: Bildliche Darstellung der Krebszelle durch den Antikörper

Eine Human-Prostatakrebszellinie 8PC93 (1x10 Zellen) wurde subkutan auf den rechten Schenkel von weiblichen BALB/c nu/nu-Mäusen eines Alters von 8 Wochen (3 Tiere in jeder Gruppe) transplantiert. Nach 30 Tagen betrug die

125

Größe des Tumors 1 cm² oder mehr und ein mit J markierter Antikörper, der von der Hybridomzelle P-002 ausgesondert worden war, hergestellt wie in Beispiel 4, wurde in einer Dosismenge von 35 μθΐ pro Maus oder ein mit

J markierter Maus-IgG wurde zum Vergleich in einer Dosismenge von 10 uCi pro Maus intravenös injiziert. Nach 96 Stunden wurde mittels einer Gamma-Kamera eine Szintigraphie des gesamten Körpers durchgeführt.

—j / —

Es wurde eine bemerkenswerte Anreicherung der Radioaktivität auf dem Tumor bei allen Tieren beobachtet, denen

125

der mit J markierte erfindungsgemäße Antikörper verabreicht worden war, während eine geringere Anreicherung bei den Kontrolltieren beobachtet wurde.

Beispiel 7; Mitomycin- oder Doxorubicinhydrochlorid- Markierung des Antikörpers

Nach der Einstellung auf 10,4 mg/ml unter Zugabe von destilliertem Wasser zu dem Antikörper (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit) aus der Hybridomzelle P-O01, P-002, P-OO3 oder P-O04 wurden 13,0 mg Mitomycin zugegeben und dann wurde Chlorwasserstoffsäure unter Rühren zugegeben, um den pH-Wert der Lösung auf 4,75 einzustellen, und gleichzeitig wurden 3,7 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid zugegeben. Nach 10,30 oder 60 min langer Reaktion wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml Acetatpuffer (pH 4,70) gestoppt. Die Reaktionsmischung wurde dann gegen

20 5 1 destilliertes Wasser 72 Stunden lang bei 4⁰C

dialysiert, wobei die Dialyselösung 3-mal ausgetauscht wurde. Nach dem Einengen wurde das Dialysat auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer

/JJv

Höhe von 55 cm, die mit Sephadex Q-2*r* (Pharmacia, Schweden) gefüllt war, aufgegeben, um die niedermolekularen Substanzen vollständig zu entfernen. Die resultierende Lösung wurde bei -20⁰C gefrorgetrocknet, wobei man das Mitomycin-Antikörper-Bindungsprodukt erhielt. Die Bindungsmengen des Mitomycins in den Produkten pro mg Antikörper sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Die Bindungsprodukte von Doxorubicinhvdrochlorid mit den Antikörpern wurden auf die gleiche Weise wie oben angegeben erhalten. Die Bindungsmengen des Doxorubicinhydrochlorids in den Produkten pro mg des Antikörpers sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Andererseits wurden diese Bindungsprodukte des Antikrebs-

mittels (60 min-Reaktion) mit dem Antikörper an ICR-Mäuse (10 Tiere in jeder Gruppe) in einer Dosismenge von 400 mg/kg peroral, 100 mg/kg intraperitoneal oder 50 mg/kg intravenös verabreicht. Innerhalb von 14 Tagen wurde kein Todesfall festgestellt.

	Tabelle	i	III	4	30	8	(μ g/mg)	60	10
		i Antikörper		3 4	min	8 7		min	11 10
			4	8		10
Antucreosimttei	ι	Bindungsverhältnis	4	9		11
	von j P-OOl- stammend		4 3	OO 00		10 10
		10	4	9		10
		min
Mitomycin


D.oxorubicin- hydrochlorid	P-002 P-003 "	: in vitro-Antitumoreffekt des Antikörpers
	P-004 "
Beispiel 8	P-OOl-
	P-002 " P-003
P-004

Zur Prüfung des Antitumoreffekts des Antikörpers oder des Bindungsprodukts mit dem Antikrebsmittel, hergestellt in Beispiel 7, wurde eine in vitro subkultivierte Human-Prostatakrebszellinie 8PC93 verwendet. Die Zellen wurden

mit Eagle-MEM, das 10 % Fötus-Rinderserum enthielt,

4 auf eine Zellkonzentration von 5 χ 10 pro ml eingestellt, in einer Menge von jeweils 5 ml in eine Petrischale gegeben und 24 Stunden lang in einem 5 % C0₂~lnkubator bei 37°C inkubiert. Der Antikörper aus der Hybridomzelle

P-004 oder der an Mitomycin gebundene Antikörper aus der Hybridomzelie P-004 (60 min-Reaktionsprodukt) wurde in die Schale gegeben und weiter kultiviert. 24 Stunden nach der Zugabe des Arzneimittels wurden 1 μ Ci/ml L-/Ü- C7Leucin (RCC, USA, spezifische Radioaktivität 342 mCi/itiM) zu der Reaktionsmischung zugegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Nach dem Kultivieren wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden 3-mal mit PBS (pH 7,2) gewaschen, auf 0⁰C abgekühlt, mit einer 5 %igen Trichloressigsaurelosung behandelt und die gewaschenen Zellen wurden auf ein Filterpapier überführt und getrocknet. Es wurde die in das Zellprotein eingeführte Radioaktivität mittels eines Flüssig-Szintillationszählers (Packard, USA) gemessen.

Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 dargestellt. In der Fig. 1 repräsentiert die Ordinate die eingearbeitete

1 4
Menge an Radioaktivität ( C-Leucin) als Prozentsatz von 100 der durch die nicht-behandelte Kontrolle eingearbeiteten Menge.

Wie aus der Fig. 1 ersichtlich, nahm die Konzentration, die eine 50 %-Inhibierung der Einarbeitung der Radioaktivität anzeigt, durch das Bindungsprodukt zwischen Antikörper und Mitomycin ab im Vergleich zur Kontrolle.

Beispiel 9: in vivo-Antitumoreffekt des Antigens

Eine Human-Prostatakrebszellinie 8PC93 (6 χ 10 Zellen pro Tier) wurde intraperitoneal in weibliche BALB/c nu/nu-Mäuse (10 Tiere in jeder Gruppe) transplantiert. Nach 5 und 72 Stunden wurde der von der Hybriäomzelle P-004 abgesonderte Antikörper oder das Bindungsprodukt zwischen dem von P-004 abgesonderten Antikörper und Mitomycin (60 min-Reaktionsprodukt, 50 μg/mlMitomycin) intraperitoneal den Mäusen injiziert in einer Dosismenge von 500 \iq pro Maus (20 \iq Mitomycin pro Maus) und die Überlebensrate wurde 60 Tage lang festge-

_₄₀_ 34Ί3-3Α1

stellt, um die Antitumor-Aktivität des verabreichten Arzneimittels zu bestimmen.

Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt. In der
5 Fig. 2 repräsentiert die Ordinate die Überlebensrate

(%) und die Abszisse repräsentiert die Anzahl der Tage nach der Transplantation der Tumorzellen.

Wie aus der Fig. 2 ersichtlich, wurde die Anzahl der 10 Tage, an denen 50 % der Tiere überlebten, durch das

Mitomycin-Antigen-Bindungsprodukt verlängert. Außerdem wurde auch eine Verlängerung der Lebensdauer durch die Verabreichung des Antigens allein festgestellt.

Claims

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Kl !«M.W !ΜΊ-Λ'! VPP Χ;Μ

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K 21249

Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha

9-11 Horidonio-cho 1-chome, Nihonbashi,
Chuo-ku, Tokyo, Ja'pan

Antikörper für Prostatakrebs beim Menschen
Patentansprüche

MJ Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch ist für das Oberflächenantigen der Human-Prostata-Krebszelle, dadurch gekennzeichnet , daß
eine Hybridzelle (Hybridoma) zwischen einer Zelle, die den
Antikörper bilden kann, und einer Zelle, die durch in vitro Subkultivierung permanent unterhalten werden kann, gebildet wird und daß der von der Hybridzelle abgesonderte Antikörper gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zelle, die den Antikörper bilden kann, um

eine Milzzelle, um eine Lymphknotenzelle, um eine Peripherblutleukozytenzelle oder eine Mischung davon haiidelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle aus einer Maus stammt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Maus um eine BALB/c-Maus oder um eine

1 Hybridmaus davon handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zelle, die durch in vitro-Subkultivierung permanent unterhalten werden kann, um eine Myelomzelle handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle, die durch in vitro-Subkultivierung permanent unterhalten werden kann, einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase oder Thymidinkinase hat.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle aus einer Maus stammt.
8. Verfahren nach-Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle aus der Zellinie P3-X63-Ag8, P3-NSI/1-Ag4-1, Sp2/0-Ag14 oder X63-Ag8.653 stammt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle, die den Antikörper bilden kann, aus einem mit der Human-Prostatakrebszelle immunisierten Tier stammt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle in Gegenwart von Polyethylenglykol hergestellt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle in einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Medium für die Selektion kultiviert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle geklont wird zur Herstellung eines einzelnen Klons.
] 13. Verfahren mich Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Klonen durchgeführt wird durch Grenzverdünnungskultivierung, WoichaqarkuHivi.erunq oder Fibringel kulti Vierung.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle in vitro kultiviert wird zur Absonderung des Antikörpers.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle auf ein Tier transplantiert und in vivo kultiviert wird und daß der abgesonderte Antikörper von der Körperflüssigkeit des Tieres abgetrennt wird.
16. Verfahren nach /Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Körperflüssigkeit urn Serum oder Ascites handelt.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Tier um eine Maus handelt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,

daß die Maus eine BÄLB/c-Maus oder eine HybrJdrnaus davon ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Human-Prostatakrebszelle um die Human-Prostatakrebszellinie 8PC93 handelt.
20. Hybrid(om)-Zelle, die einen Antikörper bildet, der spezifisch ist für das Oberflächenantigen einer Huraan-Prostata-Krebszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Zelle, die den Antikörper bilden kann, und einer Zelle, die durch in vitro-Subkultivierung permanent un-

35 terhalten werden kann, gebildet ist.
21. Hybrid(om)-Zelle nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um P-001, P-002, P-003 oder

1 P-004 handelt.
22. Antikörper, der spezifisch ist für das Oberflächenantigen der Human-Prostata-Krebszelle, dadurch gekennzeichnet, daß er nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellt ist.
23. Antikörper nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybrid(om)-Zelle P-001, P-002, P-003 oder

10 P-004 abgesondert worden ist.
24. Reagens zur Klassifizierung und/oder Identifizierung des Human-Prostatakrebses, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehr Antikörper gemäß Anspruch 22 enthält.
25. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,

daß es außerdem einen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält.
26. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Human-Prostatakrebs um eine Human-Prostatakrebs-Zellinie 8PC93 handelt.
27. Reagens nach Anspruch 24„zur Identifizierung des Prostatakrebses beim Menschen oder beim Tier.
28. Derivat oder Restriktionsprodukt des Antikörpers gemäß Anspruch 22.
29. Derivat nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine radioaktive Substanz, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Enzym, ein Markierungsmittel für die Elektronenmikroskopie oder eine Restgruppe, die eine Struktur für eine sekundäre Kombination davon enthält, chemisch

35 an den Antikörper gebunden ist.
30. Restriktionsprodukt nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es durch restriktive Spaltung des Antikörpers durch eine chemische oder Enzymbehandlung

erhalten wurde.
31. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet,

1 25 daß es sich bei der radioaktiven Substanz um J handelt,
32. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzfarbstoff um Fluorescein oder Rhodamin handelt.
33. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um Peroxidase oder alkalische Phosphatase (Alkaliphosphatase) handelt.
34. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktur Biotin ist.
35. Reagens zur Klassifizierung und/oder Identifizierung von Human-Prostatakrebs, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehr Derivate oder Restriktionsprodukte gemäß

20 Anspruch 28 enthält.
36. Reagens nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält.
37. Verfahren zur Klassifizierung und/oder Identifizierung von Human-Prostatakrebs, dadurch gekennzeichnet, daß es durchgeführt wird unter Verwendung des Reagens gemäß Anspruch 24 oder 35.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß ein Objekt, das die Human-Prostata-Krebszelle enthält, mit dem Reagens in Kontakt gebracht wird und daß die Antigen-Antikörper-Reaktion angewendet wird.
39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Objekt von einem Menschen oder einem Tier stammt.
40. Pharmazeutisches Mittel in einer Dosierungseinheitsform für die Behandlung des Human-Prostatakrebses, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehr Antikörper gemäß Anspruch 22 enthält.
41. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält.
⁴²· Bindungsprodukt des Antikörpers gemäß Anspruch mit einem Antikrebsmittel.
43. Produkt nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antikrebsmittel um Mitomycin oder

15 Doxorubicinhydrochlorid handelt.
44. Pharmazeutisches Mittel für die Behandlung des Uuinan-Proiitatakrebsos, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehr Bindungsprodukte gemäß Anspruch 42 enthält.
45. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 40 oder 44,

dadurch gekennzeichnet, daß es in Form eines injizierbaren Präparats vorliegt.