DE3413340A1

DE3413340A1 - Antikoerper fuer harnblasenkrebs beim menschen

Info

Publication number: DE3413340A1
Application number: DE19843413340
Authority: DE
Inventors: Tomoko Nagareyama Chiba Chiku; Takayoshi Tokio/Tokyo Fujii; Eiji Inoguchi; Yasuhiko Tokio/Tokyo Kobayashi; Kenichi Matsunaga; Kenichi Saito; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Yoshikumi; Makoto Yoshimura
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-04-08
Filing date: 1984-04-09
Publication date: 1984-10-31
Also published as: FR2543971A1; SE8401945D0; GB2140030A; SE8401945L; GB8408987D0

Description

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-7-lBeschreibung

δ Die Erfindung betrifft den Harnblasenkrebs beim Menschen (Human-Harnblasenkrebs), sie betrifft insbesondere einen für den Blasenkrebs spezifischen Antikörper, der von einer fusionierten Zelle, nachstehend als "Hybrid(om)zelle" bezeichnet, zwischen einer Zelle, die diesen Antikörper bilden kann, und einer Zelle, die sich durch Subkultur in vitro ständig vermehren kann, gebildet werden kann.

Es gibt viele Menschen, die an Krebs leiden und eine große Anzahl von Personen sterben an Krebs, so daß Krebs ein höchst bedeutsames soziales Problem ist. Trotz der großen Bemühungen vieler Forscher auf allen Gebieten der Wissenschaft wurde bis heute kein primäres Verfahren zur Behandlung von Krebs gefunden. In Japan wird die Hälfte oder mehr aller Todesfälle durch verschiedene Krebsarten, wie z.B. Magenkrebs, Lungenkrebs oder Leberkrebs _t verursacht, wobei andere Arten von Krebs zunehmende Tendenz haben mit der Änderung der Lebensweise in Japan, wie z.B. der Rektalkrebs oder der maligne Tumor in Urin ausscheidenden Organen einschließlich des Harnblasenkrebses, der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.

Die Methoden zur Behandlung dieser Krebsarten bestehen hauptsächlich in chirurgischen Operationen in Kombination mit der Radiotherapie, Chemotherapie und/oder Immunotherapie. Diese Methoden sind jedoch bis zu einem gewissen Grade begrenzt bei der Behandlung des Anaphasen-Krebses oder des fortschreitenden Krebses. Eine frühe Diagnose und eine frühe Behandlung sind aber in jedem Falle wichtig, Aus diesem Grunde ist ein schnelles, sehr zuverlässiges Verfahren zur Identifizierung und/oder Diagnose der Krebszelle und/oder des Krebsgewebes sehr erwünscht.

-δι Es sind bereits viele umfangreiche Forschungsarbeiten über ein spezifisches Antigen für einen Krebs, das sich auf der Oberfläche der Krebszelle befindet, durchgeführt worden. Ein solches Oberflächenantigen wurde insbesondere in einer Studie, in der Tierversuche angewendet wurden, bestätigt. Dagegen sind ausreichende Versuche in bezug auf Humankrebs noch nicht durchgeführt worden. Nach den derzeitigen Erkenntnissen kann ein solches Oberflächenantigen eines Krebses beispielsweise umfassen (1) ein Antigen, das nur autolog vorliegt, (2) ein Antigen, das üblicherweise in den gleichen Arten von Tumoren vorliegt, oder (3) ein Antigen, das auch in Tumoren eines anderen Organs oder sogar in normalen Zellen sowie in den fraglichen Tumorzellen vorliegt.

Für die Analyse eines Antigens ist im allgemeinen ein immunologisches Verfahren nützlich, in dem ein Antiserum der gleichen oder einer anderen Spezies verwendet wird. Zur Herstellung eines solchen Antiserums, das zur Erkennung der drei obengenannten Arten von Antigenen verwendet werdenkann, muß ein Absorptionsverfahren des Antiserums wiederholt werden. Eine Abnahme des Antikörpertiters ist unvermeidlich von einem solchen Verfahren begleitet und ein daraus resultierendes Antiserum kann in der Praxis nicht verwendet werden. Außerdem ist es, wenn ein gewünschtes Antiserum erhalten werden kann, nahezu unmöglich, das gleiche Antiserum mit der gleichen Spezifität zu reproduzieren. Unter diesen Umständen ist ein neuer Weg zur Identifizierung von mit Krebs verwandten Antigenen und Krebsspezifischen Antigenen auf der Oberfläche einer Krebszelle erforderlich.

Ein solcher Weg wurde von Köhler und Milstein im Jahre 1975 in "Nature", 2^£, 495 (1975), entwickelt, d.h. die sogenannte Zellfusionstechnik zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers. Die Zellfusionstechnik genügt den obengenannten Anforderungen und kürzlich wurde von Teilen (Teilmengen) von Human-Lymphozyten- und monoklonalen Antikörpern für das

¹ Oberflächenantigen von Human-Leukämiezellen oder Human-Mel anomze 11 en berichtet.

Obgleich ein spezifischer monoklonaler Antikörper unter ^ Anwendung einer solchen Zellfusionstechnik erhalten werden kann, ist die Antigenizität einer Krebszelle im allgemeinen diffus zwischen verschiedenen Krebszellen und deshalb ist derzeit die tatsächliche Herstellung eines ausgezeichneten Antikörpers mit der gewünschten Spezifität nicht vorhersehbar. Auch wurde in bezug auf Human-Krebszellen bis heute nur über wenige, spezielle Krebszellen wie vorstehend angegeben berichtet. Insbesondere gibt es keinen Bericht über den Human-Harnblasenkrebs. Natürlich gibt es auch keinen Antikörper für den Blasenkrebs, der derzeit verwendbar ist.

Es wurden nun große Anstrengungen unternommen, um ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers für das Oberflächenantigen einer Human-Harnblasen-Krebszelle zu entwickeln, was zu der vorliegenden Erfindung geführt hat,nach der ein solcher Antikörper mit einer hohen Spezifität, einem hohen Titer und einem geringen Gehalt an Kontaminanten (Verunreinigungen) erhalten werden kann aus einer Hybridzelle zwischen einer Zelle, die einen Antikörper für eine Human-Blasenkrebszelle bilden kann (nachstehend manchmal als "einen Anti-Blasenkrebs-Antikörper bildende Zelle" oder einfach als "Antikörper-bildende Zelle" bezeichnet), und einer Zelle, die in einer in vitro-Subkultur unterhalten werden kann (nachstehend manchmal als "Subkultur-Zelle" bezeichnet). Es wurde auch gefunden, daß sich ein solcher Antikörper eignet für die Klassifizierung und/oder Identifizierung einer Human-Harnblasen-Krebszelle. Der Antikörper eignet sich auch für eine wirksame Behandlung des Harnblasenkrebses beim Menschen.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines für das Oberflächenantigen einer Human-

-ΙΟΙ Blasenkrebszelle spezifischen Antikörpers zu entwickeln. Ziel der Erfindung ist es ferner, einen hochspezifischen Antiblasenkrebs-Antikörper sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung unter Anwendung einer Zellfusionstechnik zu entwickeln. Ziel der Erfindung ist es außerdem, eine Hybridzelle (Hybridoma) zu schaffen, die einen solchen Antikörper bilden kann. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Klassifizierung und/- oder Identifizierung der Human-Harnblasenkrebszelle mit Hilfe des erfindungsgemäßen Antikörpers zu schaffen.

Ziel der Erfindung ist es schließlich, ein pharmazeutisches Mittel zur Behandlung des Blasenkrebses beim Menschen zu finden, das den erfindungsgemäßen Antikörper als wirksame Komponente (Wirkstoff) enthält. Ziel der Erfindung ist es außerdem, ein brauchbares Derivat eines solchen Antikörpers zu finden, das sich für die Klassifizierung und/oder Identifizierung der Human-Blasenkrebszellen und für die Behandlung des Human-Blasenkrebses eignet.

Weitere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung und den weiter unten folgenden Beispielen, in denen spezifische Ausführungsformen der Erfindung beschrieben sind, auf die die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist, hervor.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines Antiblasenkrebs-Antikörpers umfaßt die Herstellung einer Hybridomzelle (Hybridoma) aus einer einen Antiblasenkrebs-Antikörper bildenden Zelle und einer SubkulturzeHe, insbesondere einer Myelom-Zelle (Myeloma) sowie die Abtrennung bzw. Gewinnung des von der Hybridzelle (Hybridoma) abgesonderten Antikörpers.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend näher beschrieben.

A) Herstellung der Antikörper-bildenden Zelle

Erfindungsgemäß kann die Antiblasenkrebs-Antikörper-bildende Zelle aus jeder beliebigen Tierspezies einschließlich des Menschen erhalten werden. Eine Immunisierung des Tieres ist nicht wesentlich, obgleich durch eine solche vorherige Immunisierung der Sammlungswirkungsgrad der gewünschten Hybridzelle deutlich verbessert werden kann.

Wenn eine solche Zelle von einem Menschen stammt, kann irgendeiner ausgewählt werden, der einen Blasenkrebs durchgemacht hat oder einen hohen Serumtiterwert für die Blasenkrebszelle hat. Alternativ kann eine solche Zelle aus einem lebenden Körper gewonnen werden, der mit einem Immunogen immunisiert worden ist. Bei dem Immunogen kann es sich um eine Krebszelle selbst, eine Zelle, die mit Glutaraldehyd, Mitomycin oder Wärme behandelt worden ist und sich daher nicht mehr vermehren kann, oder um das Oberflächenantigen, das durch eine geeignete Behandlung, beispielsweise roit einem Enzym, von einer Krebszelle .abgetrennt und gereinigt worden ist, handeln.

Das bei der Immunisierung verwendete Immunogen kann mit einem Adjuvans, wie z.B. dem vollständigen oder unvollständigen Freund-Adjuvans, gemischt werden. Das Immunogen kann auf konventionellem Wege verabreicht werden, beispielsweise durch subkutane, intraperitoneale, intravenöse, intradermale und intramuskuläre Injektion. Eine subkutane oder intraperitoneale Injektion ist bevorzugt. Eine Immunisierung kann ausreichend sein, obgleich die Immunisierung auch in einem geeigneten Zeitabstand von beispielsweise 1 bis 5 Wochen mehrmals wiederholt werden kann. Nach der Messung des Antikörpertiters im Serum des immunisierten Tieres kann das Tier, dessen Titer ausreichend hoch ist, zur Gewinnung der Antikörper-bildenden Zelle verwendet werden, was zu einer Verbesserung des Wirkungsgrades der nachfolgenden Verfahren führt. Die bevorzugte Zelle stammt aus dem Tier am dritten bis fünften Tag nach der letzten

Immunisierung. Bei der Antikörper-bildenden Zelle handelt es sich um eine Plasmazelle oder Lymphzelle, die eine Vorläuferzelle derselben ist, und sie kann aus irgendeiner Stelle des Körpers, im allgemeinen aus der Milz, dem Lymphknoten, dem peripheren Blut oder irgendeiner Kombination davon stammen.

B) Zellfusion

Eine Zelle, die durch eine in vitro-Subkultur dauerhaft unterhalten werden kann, kann irgendeine geeignete Zelle sein, die mit der Antikörper-bildenden Zelle fusioniert werden kann unter Bildung einer Hybridzelle, die den gewünschten Antikörper bilden kann. Unter solchen Zellen bevorzugt ist eine Leukämie-Zelle, wie z.B. eine Myelomzelle. Eine solche Zelle kann von irgendeiner Spezies, wie z.B. vom Menschen, der Ratte, der Maus und dgl., stammen. Die Zelle, die einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) oder Thymidin-Kinase (TK) hat, ist bevorzugt, da diese Mutterzellen in einem selektiven Medium nicht wachsen können.

Ein Beispiel für eine bevorzugte Zellinie ist GM-1500-6TG-A1-2 oder RPMI8226, die aus dem Menschen stammt, oder P3-X63-25Ag8, P3/NSI/1-Ag4-1, Sp2/0-Ag14, X63-Ag8.653 und dgl., die aus der Maus stammt.

Vorzugsweise werden eine Antikörper-bildende Zelle und eine Subkultur-Zelle, die beide aus der gleichen Spezies stammen, verwendet, obgleich dies vom Gesichtspunkt des Fusionswirkungsgrades, der Stabilität der Eigenschaften der fusionierten Zellen und der Möglichkeit ihrer in vivo-Kultivierung aus betrachtet nicht wesentlich ist. Insbesondere dann, wenn die Zellinie P3-X63-Ag8, P3/NSI/1-Ag4-1, Sp2/0-Ag14 oder X63-Ag8.653 als Subkultur-Zelle verwendet wird, kann eine Inzucht-BALB/c-Maus oder ihre Hybridmaus bevorzugt verwendet werden.

Für die Fusion kann ein Beschleuniger wie ein

Sendai-Virus (HVJ) und Polyethylen-

glykol verwendet werden, wobei insbesondere Polyethylenglykol 1000, 1540, 2000, 4000 oder 6000bevorzugt verwendet werden kann. Die Zellfusion kann in einer Lösung durchgeführt werden, die etwa 33 bis etwa 55 % dieses Polyethylenglykols enthält. Außerdem kann Dimethylsulfoxid in der Lösung vorhanden sein.

C) Selektion der Hybridzelle (Hybridoma)

In der Lösung nach der Fusion sind zusätzlich zu der fusionierten Zelle die restliche Antikörper-bildende Mutter-Zelle und die restliche Subkultur-Zelle vorhanden. Erstere kann während der nachfolgenden in vitro-Kultivierung nicht überleben, während letztere sich zusammen mit der gewünschten Hybrid-Zelle vermehren kann. Es ist daher bevorzugt oder sogar erforderlich, die Subkultur-Zelle aus der die gemischten Zellen enthaltenden Lösung zu entfernen. Aus diesem Grunde wird die HGPRT- oder TK-Mangel-Zelle bevorzugt als Mutter-Subkulturzelle verwendet und die die Mutterzellen enthaltenden gemischten Zellen werden nach der Zellfusion in einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Selektionsmedium kultiviert, welches das selektive Wachstum nur der gewünschten Hybridzelle ermöglicht. Alternativ kann die Mutter-Subkulturzelle, wenn es sich dabei nicht um eine Zelle mit einem Mangel an HGPRT oder TK handelt, vor der Zellfusion mit Emetin und Actinomycin D behandelt werden. Die Mutterzelle kann sich durch diese Behandlung nicht vermehren und deshalb kann die gewünschte Hybridzelle leicht von den gemischten Zellen selektiert werden.

Die auf diese Weise erhaltenen Hybridzellen enthalten im allgemeinen zwei oder mehr Klone, wobei diese nicht die vollständig gleichen Eigenschaften haben können. Zur Auftrennung derselben in die einzelnen Klone kann ein Klonen erforderlich sein und sogar erwünscht sein, wenn ein monoklonaler Antikörper gewünscht wird. Das Klonen ist

auch wirksam vom Standpunkt der Verhinderung der Änderung der Population aus betrachtet, die häufig in einer Langzeit-Kultur eines Systems auftreten kann, in der eine
Reihe von Klonen gemischt wird. Das Klonen kann durchge-& führt werden durch begrenzende Verdünnungskultivierung,
Weichagar-Kultivierung oder Fibringel-Kultivierung. Ein
fluoreszierender aktivierter Zellsortierer kann auch zum Aussortieren der Zellen beim Klonen verwendet werden.
Das Klonen kann auch zur Abtrennung möglicher Varianten-Zellen angewendet werden, die während der Langzeitkultivierung auftreten, und zur Rückhaltung der Zellen mit
den gleichen Eigenschaften wie die ursprüngliche Hybridzelle (Hybridoma).

Die erfindungsgemäße Hybridzelle kann in der logarithmischen Wachstumsphase für einen langen Zeitraum in der eingefrorenen Form von 1 bis 10 χ 10 pro ml, suspendiert in einem Rinderfötusserum,aufbewahrt werden, das 5 Vol./Vol.-%
Dimethylsulfoxid enthält. Das Einfrierverfahren wird vorzugsweise mit einer Abkühlungsgeschwindigkext von -1⁰C
pro min durchgeführt. Die Lagerung der Hybridzelle erfolgt vorzugsweise bei -8O⁰C oder darunter.

Die eingefrorene, gelagerte Hybridzelle wird vorzugsweise so schnell wie möglich aufgetaut. Wenn die Zellen mit einem Medium gewaschen werden, um sofort nach dem Auflösen Dimethylsulfoxid zu entfernen, können die Zellen in
einem konventionellen Medium so wie es vorliegt suspendiert und kultiviert werden. Wenn nur eine geringe Menge der Zellen nach dem Auftauen überlebt und wächst, sollten Milzzellen von der Maus und dgl. zugegeben werden.

D) Bildung und Gewinnung des Antikörpers

Zur Bildung eines Antikörpers wird die einen Antiblasenkrebs-Antikörper bildende Hybridzelle in vitro oder in
vivo kultiviert.

In einer in vitro-Kultur kann eine geeignete Nährstoffbrühe für die erfindungsgemäße Hybridzelle verwendet werden, beispielsweise ein RPMI 1640-Medium, das 10 Vol./Vol.-% Rinderfötus-Serum, 5 χ 10 M ß-Mercaptoethanol, 1 mM Natriumpyruvat und Antibiotika enthält, oder es kann ein nach Dulbecco modifiziertes Eagle-MEM-Medium (nachstehend als D-MEM-Medium bezeichnet), das 4,5 g/l Glucose enthält, anstelle des RPMI 1640-Mediums verwendet werden. Eine geeignete anfängliche Zellkonzentration für die Vermehrung kann im allgemeinen 10 pro ml betragen, obgleich dies von jeder Hybridzelle abhängen kann,und die Zellkonzentration während der Kultivierung beträgt vorzugsweise bis zu 2 χ 10⁶ pro ml.

In einer in vivo-Kultur wird die Hybridzelle auf einen lebenden Körper transplantiert und in fester Form oder in Form von Ascites wachsen gelassen. Eine Körperflüssigkeit, vorzugsweise Serum oder Ascites, wird aus dem lebenden Körper entnommen zur Abtrennung des von der Hybridzelle abgesonderten Antikörpers. Die dabei erhaltene rohe Lösung des Antikörpers kann als Kontaminanten (Verunreinigungen) verschiedene Substanzen enthalten, die aus dem lebenden Wirts-Körper stammen, wobei sie dennoch bemerkenswerter ist als die Antikörper-Lösung, die in vitro erhalten wurde, wegen der höheren Konzentration des gewünschten Antikörpers. Wenn die Hybridzelle intraperitoneal transplantiert wird, kann vor der Transplantation, vorzugsweise 3 bis 9 Wochen vor der Transplantation, Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan) intraperitoneal verabreicht werden. Durch diese Behandlung kann die Ausbeute an roher Antikörperlösung, wenn auch nicht wesentlich, erhöht werden. Als Wirt wird vorzugsweise ein Tier der gleichen Spezies und der gleichen Zuchtlinie wie das Tier, aus dem die Mutterzelle(n) stammt, verwendet und in diesem Falle kann die Hybridzelle in dem Tier wachsen gelassen werden, auch wenn es nicht spezifisch behandelt worden ist. Wenn die Serotypen der Gewebeverträglichkeit der Antigene zwischen der Hybridzelle und dem Wirt miteinander übereinstimmen, wird der Wirt notwendi-

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gerweise vorbehandelt, beispielsweise durch Verabreichung eines Antilymphozyten-Antikörpers oder durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen. Die Zellen beginnen 1 bis 3 Wochen

nach der Transplantation zu wachsen. 5

Bei der in vitro- oder in vivo-Kultivierung der Hybridzelle, zur Absonderung der Antikörper kann dem Medium oder dem Wirt eine radioaktive Substanz, wie z.B. durch ein Radioisotop markiertes Leucin und Lysin₍verabreicht werden Diese Behandlung kann einen Antikörper mit der gleichen chemischen Struktur wie der nicht-markierte Antikörper ergeben, der jedoch die radioaktive Substanz im Molekül enthält.

Die erfindungsgemäßen Antikörper können so wie sie in der rohen Antikörperlösung vorliegen, verwendet werden oder sie können nach irgendeinem konventionellen Verfahren für Immunoglobulin, beispielsweise durch Ammoniumsulfat-Fraktionierung oder Ionenaustauschchromatographie oder durch Affinitätschromatographie mit Protein A oder einem Antigen/ gereinigt werden. Diese gereinigten Antikörper können unabhängig voneinander oder in Form einer Mischung verwendet werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung des Antiblasenkrebs-Antikörpers kann der Mangel, der den konventionellen Verfahren anhaftet, im wesentlichen beseitigt werden. Die erfindungsgemäße Hybridzelle kann subkultiviert und praktisch dauerhaft sowohl in vitro als auch in vivo vermehrt werden. Außerdem kann die Hybridzelle einen Antikörper für eine spezifische Antigendeterminante bilden. Der gebildete Antikörper kann daher eine monoklonale Spezifität besitzen, er ist ein Antikörper für das Oberflächenantigen einer Harnblasenkrebszelle und besteht im wesentlichen aus einer einzigen Molekülspeζies. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Bildung der erforderlichen Menge an Antikörper je nach Bedarf unter Vermeidung einer Streuung zwischen den Chargen und erlaubt

ferner die Herstellung einer den Antikörper enthaltenden Lösung mit einem hohen Titer. Außerdem ist bei dem Verfahren keine umständliche Absorption erforderlich, die bei dem konventionellen Verfahren unvermeidlich war. Andererseits kann nicht-gereinigtesAntigen, wie z.B. eine Blasenkrebs-Zelle selbst,ohne Schwierigkeit in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden und auch in einem solchen Falle kann ein hochspezifischer Antikörper erhalten werden. Eine derart hohe Reaktionsfähigkeit mit einem Antigen des Antikörpers erlaubt die schnelle Identifizierung einer Blasenkrebszelle mit hoher Zuverlässigkeit ohne konventionelle umständliche Verfahren. Da die Reinheit des Antikörpers hoch ist, treten darüber hinaus auch allergische Reaktionen als Folge von Kontaminanten (Verunreinigungen), die unvermeidlich in dem konventionellen Präparat enthalten sind, selten auf, so daß er als Heilmittel für Blasenkrebs verwendet werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Klassifizierung und/oder Identifizierung kann auf ein Objekt aus einer beliebigen Quelle angewendet werden. So können beispielsweise klinische Materialien, wie z.B. Urin, Lymphozyten oder ein anderes bioptisches Gewebe,verwendet werden, das aus einem Patienten stammt, der vom klinischen Standpunkt aus betrachtet möglicherweise an Harnblasenkrebs leidet.

Bei der Identifizierung wird ein den erfindungsgemäßen Antikörper enthaltendes Reagens mit einem Blasenkrebszellen enthaltenden Objekt in Kontakt gebracht. Zweckmäßig kann die Immunofluoreszenzmikroskopie, die Immunoe lek tr cmikroskopie, der radioaktive Bindungsassay, der Enzymimmunoassay und dgl. angewendet werden. Bei der direkten Immunofluoreszenzmikroskopie kann der erfindungsgemäße Antikörper zweckmäßig nach der Markierung desselben mit einem Fluoreszenzfarbstoff, wie z.B. Fluorescein und Rhodamin, verwendet werden. Eine andere geeignete Form des erfindungsgemäßen Antikörpers kann eine solche sein, die mit einem Markierungsstoff, wie z.B. Ferritin, für eine Immunoelektromikrosko-

pie markiert ist, eine solche, die mit einem Radioisotop,

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wie z.B. J und J markiert ist für einen radioaktiven Bindungsassay, oder eine solche, die mit einem Enzym, wie z.B. Peroxidase, alkalischer Phosphatase und ß-Galactosidase, markiert ist, für einen Enzymimmunoassay. Natürlich kann auch eine indirekte Methode angewendet werden unter Verwendung eines sekundären Antikörpers oder seinem Bindungsprodukt als Ersatz, so kann beispielsweise ein mit Biotin markierter Antihumanblasenkrebsantikörper zusammen

I^ mit Avidin als sekundärem Antikörper verwendet werden.

Auch kann anstelle des Antikörpers selbst ein Teil des Antikörpers verwendet werden, der erhalten worden ist durch restriktive Spaltung mittels einer chemischen und/oder enzymatischen Behandlung, wie z.B. F (ab¹)-?· Diese verschiedenen Derivate und Restriktionsprodukte sind brauchbar für das erfindungsgemäße Verfahren der Klassifizierung und/oder Identifizierung und sie liegen daher ebenfalls innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.

Erforderlichenfalls können der Antikörper, seine Derivate und Restriktionsprodukte für die Verwendung miteinander gemischt werden. Außerdem kann das Reagens für die erfindungsgemäße Klassifizierung und/oder Identifizierung ferner noch einen Träger oder ein Verdünnungsmittel, wie

•^ er (es) üblicherweise verwendet wird, enthalten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Heilmittel für die Behandlung des Harnblasenkrebses.

Der Heilungsmechanismus der erfindungsgemäßen Antikörper kann so verstanden werden, daß er eine Komplementfixierungsreaktion und den Angriff von Makrophagen und/oder anderen Immunozyten auf die Krebszellen beschleunigt ,wenn sich der verabreichte Antikörper mit dem Oberflächenantigen der Krebszelle verbindet.

Der erfindungsgemäße Antikörper kann unabhängig als solcher oder in Form einer Mischung verabreicht werden. Wenn der

Antikörper mit einem Antikrebsmittel, wie z.B. Mitomycin und Doxorubicinhydrochlorid, oder einem Toxin, wie z.B. Riein, chemisch kombiniert ist, können weitere Vorteile erzielt werden. In diesem Falle kann der Mechanismus so verstanden werden, daß das Antikrebsmittel oder das Toxin die Krebszellen angreifen kann, wenn sich der verabreichte Antikörper mit dem Oberflächenantigen der Krebszelle verbindet, was zu einer geringeren Toxizität des Antikrebsmittels oder des Toxins als bei alleiniger Verwendung führt. Ein Teil des Antikörpers, der erhalten wurde durch restriktive Spaltung durch eine chemische oder Enzymbehandlung, wie z.B. F(ab')₂' kann ebenfalls als erfindungsgemäßes Heilungsmittel anstelle des Antikörpers selbst verwendet werden. In diesem Falle kann die Möglichkeit vermieden werden, daß das Gewebe eines Wirtes durch eine Schädigung als Folge einer nicht-spezifischen Komplementfixierungsreaktion und dgl. angegriffen werden kann. Diese Derivate (Kombinationsprodukte mit einem Antikrebsmittel oder einem Toxin) und Restriktionsprodukte können entweder einzeln (unabhängig) oder in Form einer Mischung derselben als erfindungsgemäßes Heilmittel verwendet werden.

Zur Beurteilung der akuten Toxizität der Antikörper, seiner Derivate oder Restriktionsprodukte wurde das erfindungsgemäße Heilmittel an drei Gruppen (von jeweils 10 Tieren) ICR-Mäuse verabreicht; an die erste in einer Menge von 2 g/kg per-oral, an die zweite in einer Menge von 4 00 mg/kg intraperitoneal und an die dritte in einer Menge von 200 mg/kg intravenös, und innerhalb eines Zeitraums von 14 Tagen wurde kein Todesfall beobachtet. Das erfindungsgemäße Heilmittel kann daher als sicheres Heilmittel für Human-Harnblasenkrebs angesehen werden.

Das erfindungsgemäße Heilmittel kann subkutan, intramuskulär oder intravenös, vorzugsweise durch subkutane oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden. Das Heilmittel kann per—oral verabreicht werden, da ein Teil des verabreichten Mittels durch den Intestinaltrakt absorbiert

werden kann, während die Struktur als Antikörper beibehalten wird, was durch die vorliegende Erfindung bestätigt wurde.

Ein Präparat für die Injektion kann beispielsweise hergestellt werden durch Auflösen oder Suspendieren von 10 mg des Antikörpers oder seines Derivats zusammen mit 50 mg Mannit in destilliertem Wasser auf 10 ml, Sterilisieren auf irgendeine konventionelle Weise, Aufteilen in Ampullen zu jeweils 2 ml und Gefriertrocknen. Das erhaltene Produkt wird bei seiner Verwendung in einer Kochsalzlösung aufgelöst oder suspendiert. Ein Injektionspräparat kann zusätzlich zu dem Antikörper einen Träger, ein Verdünnungsmittel, einen Puffer, einen Stabilisator, ein isotonisches Mittel und dgl. enthalten, wobei diese Agentien dem Fachmann bekannt sind. Das injizierbare Präparat kann in jeder beliebigen Form einer subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Injektion hergestellt werden. Ein oral verabreichbares Mittel kann nach irgendeinem konventionellen Verfahren zu einem enterischen Arzneimittel verarbeitet werden. Die Dosierungsrate des erfindungsgemäßen Heilmittels hängt hauptsächlich von den Symptomen ab und sie beträgt im allgemeinen 0,001 mg bis 10 g pro Tag pro kg Körpergewicht beim Tier, wie z.B. der Maus, und 0,01 bis 3000 mg pro Tag pro kg Körpergewicht beim Menschen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1: Herstellung eines Antikörpers für eine Human-Harnblasenkrebszelle
A) Immunisierung und Zellfusion

1) Herstellung der Immunogenzelle: Eine Human-Harnblasen-Ubergangsepithel-Krebszellen-Linie T24 (2 χ 10 ), die in vitro für einen langen Zeitraum subkultiviert worden war, wurde bei 37°C in einer feuchten Umgebung, die 5 % CC^ enthielt, in einem Eagle-MEM-Earle-Salzmedium (nachstehend als MEM-Medium bezeichnet), das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rin-

derserum und Kanamycinsulfat (Endkonzentration 60 mg/1) enthielt, in einer 100 mm-Kulturschale (Falcon 300 3, Becton-Dickinson, USA) inkubiert. Nach 3-tägiger Kultivierung wurden die Zellen mit einer Gummifahne abgeschiefert und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugieren entfernt. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren mit einer mit Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) gewaschen und in PBS suspendiert. Aus einer Kultur-

schale erhielt man etwa 2x10 Zellen.

2) Myelom-Kultur: Eine Maus-Myelomzellen-Linie Sp2/0-Ag14 (10⁵/ml) wurde in D-MEM kultiviert, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum, 1 inM Brenztraubensäure, 2 mM Glutamin und 60 mg/1 Kanamycinsulfat enthielt, durch eine Subkultur alle 3 Tage. Am Tage vor der anschließenden Zellfusion wurden die Zellen auf eine Zellkonzentration von 2,5 χ

10⁵ pro ml

kultiviert.

10 pro ml eingestellt und in dem obengenannten Medium

3) Immunisierung mit T24-Zellen: T24-Zellen (5 χ 10 bis 10 χ 10 ), die in dem obigen Abschnitt (1) erhalten worden waren und in 0,4 ml PBS suspendiert waren, wurden intraperitoneal in weibliche BALB/c-Mäuse (NIHON CHARLES LIVER, Japan, 9 Wochen alt) etwa 4 mal jeden Monat injiziert zur Durchführung der Immunisierung.

4) Zellfusion: Die Zellfusion wurde nach dem Verfahren von Köhler und Milstein (Immunoassay; Clinical Laboratory Techniques for the 1980's ed. von R.M. Nakamura et al., E.S. Alan R. Liss, Inc., N.Y., 1980, Seiten 301 - 324) durchgeführt.

Am vierten Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, um die Milz zu entnehmen. Die Milz wurde gut geöffnet (freigelegt), durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenweite von 0,10 mm (150 mesh) passiert, bei 400 χ g zentrifugiert und zu den ausgefallenen Zellen wurde ein Tris-HCl-Puffer (0,017 M Tris(hydroxy-

methyl)aminomethan, pH 7,65), der 0,74 7 % Ammoniumchlorid enthielt, zugegeben, um Erythrocyten zu entfernen, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren (400 χ g) gesammelt. Nach der Zugabe von MEM zu den Zellen wurde das Zentrifugieren bei 400 χ g durchgeführt und die Zellen wurden in frischem MEM wieder suspendiert. Nach dreimaliger Wiederholung dieses Waschvorganges wurden die Zellen schließlich in MEM suspendiert.

Sp2/0-Ag14-Zellen wurden durch Pipettieren aus dem Kultivierungsgefäß abgeschiefert und in ein Zentrifugenglas überführt. Nach dem Zentrifugieren (400 χ g) wurden die gesammelten Zellen in MEM suspendiert, zentrifugiert (400 χ g), um Serum zu entfernen, und in MEM erneut suspendiert.

Die Milzzellen (5 χ 10⁷) und Sp2/0-Ag14-Zellen (10⁷) wurden miteinander gemischt, gut pipettiert und zentrifugiert (400 χ g). Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Niederschlag durch mildes Punktieren des Zentrifugenglases freigelegt. Den aufgelockerten Zellen wurden 0,3 ml einer Lösung von 30 Vol./Vol.-% Polyethylenglykol (PEG 1000) in MEM, das bei 37⁰C gehalten wurde, zugegeben. Nach vorsichtigem Rühren wurde die Lösung 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Zentrifugieren wurde 2 min lang bei 7 χ g durchgeführt und es wurden 5 ml MEM allmählich zugegeben. Nach vorsichtigem Rühren wurde das Zentrifugieren 5 min bei Raumtemperatur durchgeführt (400 χ g). Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, es wurden 5 ml MEM zu dem Niederschlag zugegeben, es wurde auf ähnliche Weise wie oben angegeben zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen.

Zu den ausgefallenen Zellen wurden 5 ml D-MEM-Medium, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum, 2 mM Glutamin, 5 χ 10 M ß-Mercaptoethanol, 60 mg/1 Kanamycinsulfat und außerdem 4,5 g/l Glucose enthielt (nachstehend als D-MEM-FBS-Medium bezeichnet) zugegeben. Nach dem Pipettieren wurden 20 ml D-MEM-FBS zu der resultierenden Zellsuspension (5 ml) zugegeben. Jeweils 25 ml der Suspension wurden in einen 25 cm²-

Kulturkolben (C-25 100, Corning, USA) inokuliert und unter Stehenlassen in einer feuchten Umgebung, die 5 % CO₂ enthielt, bei 37°C über Nacht inkubiert, wobei in den nachfolgenden Verfahrensstufen immer die gleichen Inkubierungsbedingungen angewendet wurden.

Am nächsten Tage nach der Inokulierung wurde die Kultur nach leichtem Pipettieren in ein Zentrifugenglas überführt und bei 400 χ g zentrifugiert. Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Zellpellet in 35 ml

-4 D-MEM-FBS suspendiert, das 1 χ 10 M Hypoxanthin, 4 χ 10 M Aminopterin und 1,6 χ 10~ M Thymidin enthielt (HAT-Medium). Die Suspension (0,1 ml) wurde in jedes Loch einer 96 Loch-Platte (Falcon 3072, Becton-Dickinson, USA) eingeführt und eine Woche lang kultiviert. Nach 1-wöchiger Kultivierung in einem HAT-Medium wurden alle zwei oder drei Tage 25 μΐ HT-Medium (HAT-Medium ohne Aminopterin) zugegeben.

B) Selektion und Wachstum der Antikörper-bildenden Hybri-

dom-Zellen

Zur überprüfung der Bildung von Antikörpern für T24-Zellen in der überstehenden Flüssigkeit jedes Loches (Bohrung) in der zweiten Woche nach der Zellfusion wurde ein Festphasen-Enzym-Immunoassay angewendet.

T24-Zellen, die auf einer Platte (Falcon 3072) fixiert waren, wurden mit 40 μΐ der überstehenden Flüssigkeit in jedem Loch (jeder Bohrung) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, mit PBS gründlich gewaschen, 2 Stunden lang mit 100 μΐ Peroxidase-gebundenem Antimaus-Immunoglobulin-Antikörper (Katalog-Nr. 3211-0231, Cappel Lab.,Inc., USA), der mit Pferdeserum auf das 1000-fache verdünnt war, reagieren gelassen und mit PBS gründlich gewaschen. 200 μΐ Citratpuffer (0,1 M, pH 4,5), der 1 mg/ ml eines Substrats (o-Phenylendiamin) und 0,4 μΐ/ml 31 %iges wäßriges Wasserstoffperoxid enthielt, wurden zugegeben und 30 min lang reagieren gelassen zum Färben.

In drei Bohrungen (Löchern), welche die mit T24-Zellen reagierenden Antikörper enthielten, wurde unter Anwendung des Grenzverdünnungsverfahrens das Klonen wie folgt durchgeführt:

100 Hybridomazellen aus jeder der drei Bohrungen (Löcher) mit einer positiven Antikörperbildung wurden in D-MEM-FBS suspendiert und mit Milzzellen, die aus einer BALB/c-Maus auf die gleiche Weise wie bei der Zellfusion angegeben ge-

wonnen waren, gemischt und in D-MEM-FBS eingestellt (10 Zellen). Die Zellkonzentration wurde auf 5x10 pro ml eingestellt durch Zugabe von D-MEM-FBS und die Zellmischung wurde in jede Bohrung ,einer 96 Loch-Platte (Falcon 3072) jeweils in einer Menge von 0,2 ml inokuliert und kultiviert. Am 13. Tage nach Beginn der Kultivierung wurde die Antikörperbildung in jeder Bohrung untersucht unter Anwendung des obengenannten Festphasen-Enzym-Immunoassays. Es wurden 33 Antikörper-bildende Hybridomzellen einschließlich der in der folgenden Tabelle I angegebenen sechs Hybridomzellen erhalten.

Beispiel 2· Eigenschaften des Antikörpers für die Humanblasenkrebszelle

A) Vergleich der Reaktivität mit anderen Zellen Der in Beispiel 1 beschriebene Festphasen-Enzym-Immunoassay wurde angewendet zur überprüfung der Reaktivitäten der überstehenden Flüssigkeiten, die in Beispiel 1 erhalten worden waren, mit anderen Zellen, die in vitro subkultiviert wurden; Intestine 407 (Fötus-Human-Intestin-Zellinie), Du 145 (Human-Prostatakrebs-Zellinie) und 253 J (Human-Nierenbecken-Krebszellenlinie) sowie T24 (Human-Harnblasen-Krebszellenlinie). Wie aus der folgenden Tabelle I ersichtlich, reagierten die von den anderen Hybridom-Zellen als T-002 abgesonderten Antikörper stark mit T24 und sie reagierten leicht oder schwach mit den übrigen Zellen, während der von,der Hybridom-ZeHe T-002 abgesondere Antikörper mit T24 reagierte, mit Fötus-Intestin-Zellen schwach reagierte und mit den übrigen Zellen nicht reagierte.

B) Färbung der Zellen nach der Fluoreszenz-Antikörper-

Methode

T24-Zellen wurden unter Anwendung der indirekten Fluoreszenz-Antikörper-Methode gefärbt unter Verwendung des von der Hybridom-Zelle T-OO3 abgesonderten Antikörpers. T24-Zellen wurden auf einem Glasplättchen ohne Fluoreszenz . fixiert, 45 min lang unter feuchten Bedingungen bei 37°C mit der überstehenden Flüssigkeit (50 μΐ) reagieren gelassen und gewaschen durch 3- bis 5-minütiges Behandeln mit einer PBS-Lösung, die 1 % Rinderserumalbumin, 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) und 0,1 % Natriumazid enthielt, wobei dieser Waschvorgang 3 mal wiederholt wurde. Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen weitere 4 5 min lang mit 50 μΐ einer auf das 20-fache verdünnten Lösung von Fluorescein-gebundenem Antimaus-IgG (Miles-Yeda Ltd., Israel, Code Nr. 65-171) durchgeführt und der Waschvorgang wurde auf die gleiche Weise wie oben angegeben durchgeführt. Nach dem Trocknen wurde mit einer Carbonat-gepufferten Glycerinlösung (0,05 M, pH 9,5, 10 % Glycerin) überschichtet und es wurde ein Deckglas aufgelegt, bevor durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan, Modell AH-RFL-LB) das Ganze betrachtet wurde. Auf der Oberfläche der T24-Zelle wurde eine starke Fluoreszenz festgestellt. Der Fluorescein-gebundene Antimaus-IgG wurde verwendet, nachdem er einer 6-maligen Absorption mit T24-Zellen unterworfen worden war.

C) Identifikation der Immunoglobulin-Klassen Die Klassen der Immunoglobuline der von den Hybridom-Zellen T-OO1 bis T-006 abgesonderten Antikörper wurden nach dem Festphasen-Enzym-Immunoassay unter Verwendung von Anti-Immunoglobulin (Ig), Anti-IgG und Anti-IgM (Cappel Lab. Inc., USA, Katalog Nr. 3211-0231, 3211-0081, 3211-0201) als Peroxidase-gebundener Antimaus-Immunoglobulin-Antikörper identifiziert. Wie aus der folgenden Tabelle I zu ersehen, waren alle geprüften Antikörper IgG.

Beispiel 3: Herstellung von Antikörpern für eine Human-Blasenkrebszelle
A) Immunisierung und Zellfusion

1) Herstellung der Immunogen-Zelle: Die Human-Harnblasen-Übergangsepithel-Krebszellenlinie T24 (2 χ 10⁵), die für einen langen Zeitraum in vitro subkultiviert worden war, wurde bei 37⁰C in feuchter Umgebung, die 5 % Kohlendioxid 'enthielt, in einem MEM-Medium, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum und Kanamycinsulfat (Endkonzentration 60 mg/1) enthielt, in einer 100 mm-Kulturschale (Falcon 3003, Becton-Dickinson, USA) inkubiert. Nach 3-tägiger Kultivierung wurden die Zellen mittels einer Gummifahne abgeschiefert und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugieren entfernt. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren mit PBS (pH 7,2) gewaschen und in PBS suspendiert. Aus einer Kulturschale erhielt man etwa 2 χ 10 Zellen.

2) Myelom-Kultur: Eine Maus-Myelom-Zellenlinie Sp2/0-Ag14 (10 pro ml) wurde in D-MEM, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum, 1 mM Brenztraubensäure, 2 mM Glutamin und 60 mg/1 Kanamycinsulfat enthielt, durch Subkultivierung alle 3 Tage kultiviert. Die Zellen wurden auf eine Zellkonzentration von 2,5 χ 10 pro ml am Tag vor der nachfolgenden Zellfusion eingestellt und in dem obengenannten Medium kultiviert.

3) Immunisierung mit T24-Zellen: Die in dem obigen Abschnitt (1) erhaltenen T24-Zellen (5 χ 10⁶ bis 10 χ 10⁶) , die in 0,4 ml PBS suspendiert waren, wurden in weibliche BALB/c-Mäuse (NIHON CHARLES LIVER, Japan, 9 Wochen alt) 4 mal etwa jeden Monat intraperitoneal injiziert zur Durchführung der Immunisierung.

4) Zellfusion: Die Zellfusion wurde nach dem Verfahren von Köhler und Milstein durchgeführt.

Am 4. Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, um die Milz zu entnehmen. Die Milz wurde gut

freigelegt, durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenweite von 0,10 mm (150 mesh) passiert, bei 400 χ g zentrifugiert und zu den ausgefallenen Zellen wurde ein Tris-HCl-Puffer (pH 7,65), der 0,747 % Ammoniumchlorid enthielt, zugegeben, um Erythrozyten zu entfernen, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren (400 χ g) gesammelt. Nach der Zugabe von MEM zu den Zellen wurde das Zentrifugieren bei 400 χ g durchgeführt und die Zellen wurden in frischem MEM wieder suspendiert. Nach 3-maligem Wiederholt len dieses Waschvorganges wurden die Zellen schließlich in MEM suspendiert.

Sp2/0-Ag14-Zellen wurden aus dem Kulturgefäß durch Pipettieren abgeschiefert und in ein Zentrifugenglas überführt. ¹^ Nach dem Zentrifugieren (400 χ g) wurden die gesammelten Zellen in MEM suspendiert, zentrifugiert (400 χ g), um Serum zu entfernen, und in MEM erneut suspendiert.

Die Milzzellen (2 χ 10⁸) und die Sp2/0-Ag14-Zellen (4 χ 10⁷) wurden miteinander gemischt, gut pipettiert und zentrifugiert (400 χ g). Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Niederschlag durch vorsichtiges Ausgießen des Zentrifugenglases freigelegt. Den freigelegten (aufgelockerten) Zellen wurden 1,2 ml einer Lösung von 30 Vol./Vol.-% Polyethylenglykol (PEG 1000) in MEM, das bei 37°C gehalten wurde, zugegeben. Nach vorsichtigem Rühren wurde die Lösung 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Zentrifugieren wurde 2 min lang bei 7 χ g durchgeführt und es wurden allmählich 20 ml MEM zugegeben. Nach vorsichtigem Rühren wurde das Zentrifugieren 5 min lang bei Raumtemperatur durchgeführt (400 χ g). Die überstehende Flüssigkeit wurde dann verworfen, es wurden 20 ml MEM zu dem Niederschlag zugegeben, es wurde auf ähnliche Weise zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen.

Zu den ausgefallenen Zellen wurden 15 ml D-MEM-FBS-Medium zugegeben. Nach dem Pipettieren wurden 90 ml D-MEM-FBS

zu der resultierenden Zellsuspension (15 ml) zugegeben. Es wurden jeweils etwa 2 5 ml der Zellsuspension in einen 25 cm²-Kulturkolben (Corning, USA, C-25100) inokuliert und unter Stehenlassen in feuchter Umgebung, die 5 % CO₂ enthielt, bei 37°C über Nacht inkubiert, wobei in den nachfolgenden Verfahrensschritten die gleichen Inkubationsbedingungen angewendet wurden.

Am nächsten Tag wurde die Kultur schwach pipettiert, in ein Zentrifugenglas überführt und bei 400 χ g zentrifugiert. Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde das Zellpellet in 100 ml HAT-Medium suspendiert. Jeweils 0,1 ml der Zellsuspension wurden in jedes Loch einer 96 Loch-Kulturplatte (Falcon 3072,Becton-Dickinson, USA) inokuliert und eine Woche lang kultiviert. Nach der Kultivierung in dem HAT-Medium für eine weitere Woche wurden 25 μΐ HT-Medium alle zwei oder drei Tage zugegeben.

B) Selektion und Wachstum der Antikörper-bildenden Hybri-

dom-Zellen

Zur Überprüfung der Bildung von Antikörpern für T24-Zellen [in der überstehenden Flüssigkeit jeder Bohrung (Loches) in der zweiten Woche nach der Zellfusion wurde ein Pestphasen-Enzym-Immunoassay angewendet.

T24-Zellen, die auf einer Platte (Falcon 3072) fixiert waren, wurden mit 40 μΐ der überstehenden Flüssigkeit in jeder Bohrung (Loch) 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, gründlich mit PBS gewaschen, 2 Stunden lang mit 100 μΐ Peroxidase-gebundenem Antimaus-Immunoglobulin-Antikörper (Cappel Lab. Inc., USA, Katalog Nr. 3211-0231) reagieren gelassen, der mit Pferdeserum auf das 1000-fache verdünnt war, und mit PBS gründlich gewaschen. Es wurden 200 μΐ Citratpuffer (0,1 M, pH 4,5), der 1 mg/ml o-Phenylendiamin und 0,4 μΐ/ml wäßriges Wasserstoffperoxid enthielt, zugegeben und 30 min lang reagieren gelassen, um zu färben.

Das Klonen wurde in drei Bohrungen (Löchern) durchgeführt, welche die mit T24-Zellen reagierenden Antikörper enthielten, unter Anwendung des Grenzverdünnungsverfahrens. 100 Hybridomzellen aus jeder der drei Bohrungen mit einer positiven Antikörperbildung wurden in D-MEM-FBS suspendiert und mit Milzzellen, die von einer BALB/c-Maus auf die gleiche Weise wie bei der Zellfusion angegeben gewonnen worden

waren, und in D-MEM-FBS eingestellt (10 Zellen). Die Zellkonzentration wurde auf 5x10 pro ml eingestellt durch Zugabe von D-MEM-FBS. Jeweils 0,2 ml der Zellmischung wurde in jedes Loch (Bohrung) der 96 Loch-Kulturplatte (Falcon 3072) inokuliert und kultiviert. Am 14. Tage nach Beginn der Kultivierung wurde die Antikörperbildung in jedem Loch unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Festphasen-Enzym-Immunoassays untersucht. Dabei wurden insgesamt 16 Hybridom-Zellen einschließlich T-009 bis T-012, wie sie in der folgenden Tabelle I angegeben sind, erhalten.

Beispiel 4: Eigenschaften des Antikörpers für Human-Blasenkrebszellen

A) Vergleich der Reaktivität mit anderen Zellen

Der in Beispiel 1 beschriebene Festphasen-Enzym-Immunoassay wurde verwendet zur Prüfung der Reaktivitäten der überstehenden Flüssigkeiten, die in Beispiel 3 erhalten worden waren, mit anderen, in vitro subkultivierten Zellen; Intestine 407 (Fötus-Human-Intestin-Zellinie), K-562 (Human-Leukämiezellinie) und 253 J (Human-Nierenbecken-Krebszellenlinie) sowie T24 (Human-Harnblasen-Krebszellenlinie).Wie aus der nachstehenden Tabelle I ersichtlich, war der von der Hybridom-Zelle T-O10 abgesonderte Antikörper hoch-spezifisch, d.h. er reagierte stark mit T24, während der mit den übrigen Zellen kaum reagierte. Die anderen Hybridom-Zellen wiesen ähnliche Eigenschaften auf.

B) Färbung der Zellen nach der Fluoreszenz-Antikörper-Methode

T24-Zellen wurden unter Anwendung der indirekten Fluores-

j zenz-Antikörper-Methode unter Verwendung des von der Hybridom-Zelle T-O10 abgesonderten Antikörpers gefärbt. T24-Zellen wurden auf einem Glasplättchen ohne Fluoreszenz fixiert, mit der überstehenden Flüssigkeit (50 μΐ) 45 min lang bei 37°C in feuchter Umgebung reagieren gelassen und gewaschen durch 3- bis 5-minütiges Behandeln mit PPS, das 1 % Rinderserumalbumin, 10 mM HEPES und 0,1 % Natriumazid enthielt, wobei dieser Waschvorgang 3-mal wiederholt wurde. Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen

jQ weitere 45 min lang mit 50 μΐ der auf das 20-fache verdünnten Lösung von Fluorescein-gebundenem Antimaus-IgG (Miles-Yeda Ltd., Israel, Code-Nr. 65-171) durchgeführt und der Waschvorgang wurde auf die gleiche Weise wie oben angegeben durchgeführt. Nach dem schwachen Trocknen wurde das

,c Ganze mit einem Carbonatpuffer (0,05 M, pH 9,5), der 10 % Glycerin enthielt, überschichtet und es wurde ein Deckglas aufgelegt für die Betrachtung unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan, Modell AH-RFL-LB). Auf der Oberfläche der T24-Zelle wurde eine starke Fluoreszenz

„j-, beobachtet. Der Fluorescein-gebundene Antimaus-IgG wurde verwendet, nachdem er 6-mal einerAbsorption mit der T24-Zelle unterworfen worden war.

C) Identifizierung der Immunoglobulin-Klassen Die Klassen der Immunoglobuline der von den Hybridom-Zellen T-009 bis T-O12 abgesonderten Antikörper wurden identifiziert unter Anwendung des Festphasen-Enzym-Immunoassays unter Verwendung von Antiimmunoglobulin (Ig), Anti-IgG und Anti-IgM (Cappel Lab. Inc., USA, Katalog Nr. _on 3211-0231, 3211-0081, 3211-0201) als Peroxidase-gebundener Antimaus-Immunoglobulin-Antikörper. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I angegeben.

Beispiel 5: Herstellung eines Antikörpers für Human-Blasenkrebszellen

A) Immunisierung und Zellfusion

1) Herstellung der Immunogen-Zelle: Eine Harnblasen-Ubergangsepithel-Krebszellenlinie T24 (2 χ 10 ), die in vitro für einen langen Zeitraum subkultiviert worden war, wurde in feuchter Umgebung, die 5 % Kohlendioxid enthielt, bei. 37°C in einem MEM-Medium, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum und Kanamycinsulfat (Endkonzentration 60 mg/1) enthielt, in einer 100 mm-Kulturschale (Falcon 3003, Becton-Dickinson, USA) inkubiert. Nach 3-tägiger Kultivierung wurden die Zellen mit einer Gummifahne abgeschiefert und die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugieren entfernt. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugieren mit PBS (pH 7,2) gewaschen und in PBS suspendiert. Aus einer Kulturschale erhielt man etwa 2 χ 10 Zellen.

2) Myelom-Kultur; Eine Maus-Myelom-Zllinie Sp2/0-Ag14 (10 pro ml) wurde in D-MEM, das 10 Vol./Vol.-% Fötus-Rinderserum, 1 mM Brenztraubensäure, 2 mM Glutamin und 60 mg/1 Kanamycinsulfat enthielt, kultiviert durch Subkultivierung alle drei Tage. Die Zellen wurden auf eine Zellkonzentration von 2,5 χ 10 pro ml am Tage vor der nachfolgenden Zellfusion eingestellt und in dem obengenannten Medium kultiviert.

3) Immunisierung mit T24-Zellen: Die in dem obigen Abschnitt (1) erhaltenen T24-Zellen (5 χ 10⁶ bis 10 χ 10⁶),,die in 0,4 ml PBS suspendiert waren, wurden in weibliche BALB/c-Mäuse (NIHON CHARLES LIVER, Japan, 9 Wochen alt) etwa 4-mal pro Monat intraperitoneal injiziert zur Durchführung der Immunisierung.

Am vierten Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse getötet, um die Milz zu entnehmen. Die Milz wurde

gut freigelegt, durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl mit einer Maschenweite von 0,10 mm (150 mesh) passiert, bei 400 χ g zentrifugiert und es wurde ein Tris-HCl-Puffer (pH 7,65), der 0,747 % Ammoniumchlorid enthielt, zu den ausgefallenen Zellen zugegeben, um Erythrozyten zu entfernen, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren (400 χ g) gesammelt. Nach der Zugabe von MEM zu den Zellen wurde das Zentrifugieren bei 400 χ g durchgeführt und die Zellen wurden in frischem MEM wieder suspendiert. Nach 3-maliger Wiederholung dieses Waschvorganges wurden die Zellen schließlich in MEM suspendiert.

Sp2/0-Ag14-Zellen wurden durch Pipettieren aus dem Kulturbehälter abgeschiefert und in ein Zentrifugenglas überführt. Nach dem Zentrifugieren (400 χ g) wurden die gesammelten Zellen in MEM suspendiert, zentrifugiert (400 χ g) um Serum zu entfernen, und erneut in MEM suspendiert.

Die Milzzellen (8,5 χ 10⁷) und die Sp2/0-Ag14-Zellen (1,7 χ 10 ) wurden miteinander gemischt, gut pipettiert und zentrifugiert (400 χ g). Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde der Niederschlag durch vorsichtiges Ausgießen des Zentrifugenglases freigelegt. Den freigelegten Zellen wurden 0,6 ml einer Lösung von 30 Vol./Vol.-% Polyethylenglykol (PEG 1000) in MEM, das bei 37°C gehalten wurde, zugegeben. Nach dem vorsichtigen Rühren wurde die Lösung 5 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Es wurde 2 min lang mit 7 χ g zentrifugiert und es wurden langsam 5 ml MEM zugegeben. Nach dem vorsichtigen Rühren wurde das Zentrifugieren 5 min lang bei Raumtemperatur durchgeführt (400 χ g). Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, es wurden 5 ml MEM zu dem Niederschlag zugegeben, es wurde auf ähnliche Weise zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen.

Zu den ausgefallenen Zellen wurden 5 ml D-MEM-FBS-Medium zugegeben. Nach dem Pipettieren wurden 30 ml D-MEM-FBS zu

der resultierenden Zellsuspension (5 ml) zugegeben. Jeweils 25 ml der Suspension wurden in einem 25 cm²-Kulturkolben (Corning, USA, C-25100) inokuliert und unter Stehenlassen in einer 5 % CO₂ enthaltenden feuchten Umge-

bung bei 37⁰C über Nacht inkubiert, wobei diese Inkubationsbedingungen auch in den nachfolgenden Behandlungsstufen angewendet wurden.

Am nächsten Tag wurde die Kultur leicht pi.pott.tert, in ein Zentrifugenglas überführt und bei 4 00 χ g zentrifugiert. Nach dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit wurde das Pellet in 35 ml HAT-Medium suspendiert. Jeweils 1 ml der Suspension wurde in jedes Loch einer 24 Loch-Kulturplatte (Nunc 143 982, Nunc, Dänemark) inokuliert und 1 Woche lang kultiviert. In jedes Loch wurden 0,25 ml HT-Medium alle zwei oder drei Tage gegeben.

B) Selektion und Wachstum des Antikörper-bildenden Hybridom s
Zur Prüfung der Bildung von Antikörpern für T24-Zellen in der überstehenden Flüssigkeit jedes Loches am 15. Tage nach der Zellfusion wurde ein Festphasen-Enzym-Immunoassay angewendet.

T24-Zellen, die auf einer Platte (Falcon 3072) fixiert waren, wurden mit 40 μΐ der überstehenden Flüssigkeit in jedem Loch 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, mit PBS gründlich gewaschen, 2 Stunden lang mit 100 μΐ Peroxidase-gebundenem Antimaus-Immunoglobulin-Antikörper (Cappel Lab. Inc., USA, Katalog Nr. 3211-0231), der mit Pferdeserum auf das 1000-fache verdünnt war, reagieren gelassen und mit PBS gründlich gewaschen. Es wurden 200 μΐ Citratpuffer (0,1 M, pH 4,5), der 1 mg/ml o-Phenylendiamin als ein Substrat und 0,4 μΐ/ml wäßriges Wasserstoffperoxid enthielt, zugegeben und 30 min lang reagieren gelassen zum Färben.

Das Klonen wurde in zwei Löchern durchgeführt, welche die

mit T24-Zellen reagierenden Antikörper enthielten unter Verwendung einer Grenzverdünnungskultur. 100 Hybridom-Zellen aus jedem der beiden Löcher mit positiver Antikörperbildung wurden in D-MEM-FBS suspendiert und mit MiIzzellen,' die aus einer BALB/c-Maus auf die gleiche Weise wie für die Zellfusion angegeben gewonnen wurden, gemischt und in D-MEM-FBS eingestellt (10 Zellen). Die Zellenkonzentration wurde auf 5 χ 10 pro ml eingestellt durch Zugabe von D-MEM-FBS. Jeweils 0,2 ml der Zellmischung wurden in jedes Loch einer 96 Loch-Kulturplatte (Falcon 3072, Becton-Dickinson, USA) inokuliert und kultiviert. Am 12. Tag nach Beginn der Kultivierung wurde die Antikörperprüfung in jedem Loch geprüft unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Festphasen-Enzym-Immunoassays.

Es wurden insgesamt 10 Hybridomzellen einschließlich T-007 und T-008, wie in der folgenden Tabelle I angegeben, erhalten.

Beispiel 6: Eigenschaften des Antikörpers für die Human-

kl^senkrebszelle

A) Vergleich der Reaktivität mit anderen Zellen Der in Beispiel 1 beschriebene Festphasen-Enzym-Immunoassay wurde angewendet zur Überprüfung der Reaktivitäten der überstehenden Flüssigkeiten, die in Beispiel 5 erhalten worden waren, mit anderen Zellen, die in vitro subkultiviert worden waren; Intestine 407 (Fötus-Human-Intestin-Zellinie), Du 145 (Human-Prostatakrebs-Zellinie) und 253 J (Human-Nierenbecken-Krebszellenlinie) sowie T24 (Human-Harnblasen-Krebszellenlinie). Wie aus der Tabel-

g0 le I ersichtlich, reagierte der von der Hybridomzelle T-007 abgesonderte Antikörper stark mit T24 und ergab eine geringe oder verhältnismäßig hohe Reaktionsfähigkeit mit anderen Zellen. Der von T-008 abgesonderte Antikörper reagierte stark mit T24 und er reagierte nicht mit Intestine 407 und auch nicht mit 253 J.

B) Färbung von Zellen nach der Fluoreszenz-Antikörper-Methode

T24-Zellen wurden nach der indirekten Fluoreszenz-Antikörper-Methode unter Verwendung des von der Hybridom-Zelle
T-008 abgesonderten Antikörpers gefärbt. T24-Zellen wurden auf einem Glasplättchen ohne Fluoreszenz fixiert, mit
der überstehenden Flüssigkeit (50 μ1)45 min lang in feuchter Umgebung bei 37⁰C reagieren gelassen und gewaschen durch 3- biG 5-iaanütige Behandlung mit PBS, das 1 % Rinderserumalbumin, 10 mM HEPES und 0,1 % Natriumazid enthielt, wobei dieser Waschvorgang dreimal wiederholt wurde. Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen weitere 45 min lang
mit 50 μΐ einer auf das 20-fache verdünnten Lösung von
Fluorescein-gebundenem Antimaus-IgG (Miles-Yeda Ltd.,
Israel, Code Nr. 65-171) durchgeführt und der Waschvorgang wurde auf die gleiche Weise wie oben angegeben durchge-

führt. Nach dem schwachen Trocknen wurde das Ganze mit einem Carbonatpuffer (0,05 M, pH 9,5), der 10 % Glycerin
enthielt, überschichtet und es wurde ein Deckglas aufgelegt für die Betrachtung durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan, Modell AH-RFL-LB). Auf der Oberfläche der T24-Zelle wurde eine starke Fluoreszenz festgestellt. Das

Fluorescein-gebundene Antimaus-IgG wurde verwendet, nachdem es einer 6-maligen Absorption mit T24-Zellen unterworfen
worden war.

C) Identifizierung der Immunoglobulin-Klassen

Die Klassen der Immunoglobuline der von den Hybridom-Zellen T-OO7 und T-008 abgesonderten Antikörper wurden unter Anwendung des Festphasen-Enzym-Immunoassays unter Verwendung von Antiimmunoglobulin (Ig), Anti-IgG und Anti-

IgM (Cappel Lab. Inc., USA, Katalog Nr. 3211-0231,

3211-0081, 3211-0201) als Peroxidase-gebundener Antimaus-Immunoglobulin-Antikörper identifiziert. Die Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle I angegeben.

OH

-36-Tabelle I

Hybridom- Zelle	Human- Blasen- krebs- Zelle T-24	Spezifität	-	Human- Human- Nierenbek- Leukämie kenkrebs- Zelle Zelle 253-J K-562	Immünoglo- bulin Klasse
T-001	_{+ + +}	Human-Fö- Human- tus-Inte- Prostata- stine- krebs- Zelle Zelle 1-407 Du-145	-	-	IgG
T-002	+ +		+	-	IgG!
T-003	_{+ + +}	I	⁺	+	IgG
T-004	+ + +	+ _{+ +}		-	IgG
T-005	_{+ + +}		++	IgG
T-006	+ + +	+ + +	-	IgG
T-007	+++ +	+ +	+ + +	IgG
T-008.	+ + + +		-	IgG
T-009	_{+ + + +}	++	+ . +	IgM -
T-010	+ + +	+	IgG
T-011	+ + + +	+ +	IgG
T-012	+ + + +	+ +	IgG

+ : positiv - : negativ

Beispiel 7: Herstellung der Antikörper (in vitro-Kultur): Hybridom-ZeIlen T-001, T-002, T-003, T-004, T-005, T-006, T-007, T-008, T-009, T-010, T-O11 oder T-012 wurden in D-MEM, das 20 % Fötus-Rinderserum, 2 mM Glutamin,

—5 1 mM Brenztraubensäure, 4,5 g/l Glucose, 5 χ 10 Mß-Mercap-5 toethanol und 50 mg/1 Kanamycinsulfat enthielt, in einer Zellkonzentration von 1. 10 pro ml suspendiert. Die resultierende Suspension (25 ml) wurde in einen 75 cm²-Kolben für die Gewebekultur (Corning, USA) inokuliert und in einem 5 % C0₂-lnkubator bei 37°C inkubiert. Am 4. Tage wurde die überstehende Flüssig-

keit in dem stationären Wachstumszustand aus dem Kolben gesammelt. Die Anzahl der gewachsenen Zellen betrug etwa 2 χ 10⁶ pro ml bei jedem Hybridoma und die Antikörpergehalte der überstehenden Flüssigkeiten betrugen 1,9 (T-001), 3,3 (T-002), 2,3 (T-003), 2,6 (T-004), 2,7 (T-005) , 2,1 (T-006), 3,3 (T-007), 2,0 (T-008), 2,1 (T-009), 3,1 (T-010), 4,0 (T-011) bzw. 2,3 μg/ml (T-012).

(in vivo-Kultur): Am 10. bis zum 30. Tag nach der intraperitonealen Injektion von 0,5 ml Pristan wurden jeweils 5 χ Hybridom-Zellen T-OO1 bis T-012, die in vitro gewachsen waren, intraperitoneal auf BALB/c-Mäuse inokuliert. Nach zwei oder drei Wochen wurden die Ascites gesammelt und bei 1000 χ g und 4°C 15 min lang zentrifugiert, wobei man die ascitische überstehende Flüssigkeit in einer Menge von etwa 30 ml bei jeder Hybridom-Zelle aus 10 Mäusen erhielt. Die Antikörpergehalte der überstehenden Flüssigkeiten betrugen 1,1 (T-001), 1,3 (T-002), 2,6 (T-003), 2,3 (T-004), 2,1 (T-005), 1,7 (T-006), 2,0 (T-007),,3,1 (T-008), 2,0 (T-009), 1,4 (T-010), 2,2 (T-011) bzw. 3,0 mg/ml (T-012).

Diese Antikörper wurden an ICR-Mäuse (10 Tiere in jeder Gruppe) in einer Menge von 2 g/kg per—oral, in einer Menge von 400 mg/kg intraperitoneal oder in einer Menge von 200 mg/kg intravenös verabreicht und die Mäuse wurden 14 Tage lang beobachtet. Es wurde überhaupt kein Todesfall, der auf den Antikörper zurückzuführen war, festgestellt.

Andererseits waren die Formen der Hy.bridom-Zellen T-001 bis T-012 etwa kugelförmig, ihre Dimensionen betrugen 10 bis 2 0 μΐη, wobei fast alle etwa 15 μπι groß waren, und die Hybridom-Zellen schwammen und wiesen eine geringe Adhäsion gegenüber der Gefäßwand auf.

Beispiel 8: Identifizierung von Human-Blasenkrebs durch den Antikörper

1) Objekt: Ein Gewebe, das Human-Harnblasen-Krebszellen enthielt, das in einer chirurgischen Operation erhalten

worden war, wurde mit 95 %igem Alkohol fixiert und in Paraffin eingebettet zur Herstellung eines Probenstückes von 4 μΐη.

2) Identifizierung: Die Identifizierungen wurden unter Anwendung einer Fluoreszenz-Antikörper-Methode unter Verwendung von Antikörpern (ascitische überstehende Flüssigkeit), die von der Hybridom-Zelle T-003 abgesondert wurden, durchgeführt.
10

0,1 ml der 100-fachen Verdünnung der obengenannten Antikörper-Lösung wurden zu der Gewebeprobe zugegeben und 1 " Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem gründlichen Waschen mit PBS wurden 0,1 ml des 100-fach verdünnten Fluorescein-gebundenen Antimaus-IgG (Miles, USA) zugegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Entfernung von nicht-umgesetztem Fluoresceingebundenem Antimaus-IgG durch Waschen mit PBS wurde in einem Fluorszenzmikroskop (Olympus Vanox, Olympus, Japan) eine Fluoreszenz bei jeder Objekt-Gewebeprobe des Glasplättchens festgestellt. Es wurde nahezu keine Fluoreszenz bei normalem Gewebe beobachtet, während eine starke Fluoreszenz bei dem Blasenkrebsgewebe festgestellt wurde. Um eine nicht-spezifische Bindung zu verhindern, war der Fluorescein-gebundene Antimaus-IgG vorher durch Absorption mit einer Human-Blasenkrebszellinie T24 behandelt worden.

Beispiel 9

1) Peroxidase-Markierung eines von der Hybridom-Zelle T-006

abgesonderten Antikörpers

4 mg Meerrettich-Peroxidase (Sigma-Typ VI, Sigma, USA) wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst und es wurden 60 μΐ einer unmittelbar vor der Verwendung hergestellte 0,1 M NaJO₄-Lösung zugegeben und 20 min lang bei Raumtemperatur damit gemischt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht gegen 1 mM Natriumacetat-Puffer (pH 4,4) dialysiert und es wurden 20 μΐ einer 0,2 M Natriumcarbonatlösung zugegeben. Bald danach wurde der von der Hybridom-Zelle

T-006 abgesonderte Antikörper (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit, Proteingehalt 10 mg), gelöst in 1 ml 0,01 M Carbonatpuffer (pH 9,5), zugegeben und 2 Stunden lang unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten. Nach der Reaktion wurden 0,1 ml einer frisch hergestellten wäßrigen NaBH₄-Lösung (4 mg NaBH₄, gelöst in 1 ml destilliertem Wasser) zugegeben, 2 Stunden lang bei 4⁰C stehen gelassen und über Nacht gegen PBS dialysiert.

Die resultierende gemischte Lösung wurde auf eine

Sephadex G-IOCr^ (Pharmacia, Schweden)-Kolonne aufgegeben, mit PBS eluiert und die erste Fraktion mit Extiktionen bei 280 nm und 403 nm, die einander entsprachen, wurde gesammelt. Zu 1 ml der Fraktion (Enzym-Antikörper-Bindungsprodukt) wurden 10 mg Kaninchenserum-Albumin zugegeben, um sie aufzulösen, und bis zur Verwendung bei -7O⁰C aufbewahrt.

2) Alkalische Phosphatase-Markierung des von der Hybri-

dom-Zelle T-006 abgesonderten Antikörpers ·

5 mg alkalische Phosphatase vom Typ VII (Sigma, USA), die vorher gegen PBS dialysiert worden war, um Ammoniumsulfat vollständig zu entfernen, und 17 mg Antikörper, abgesondert von der Hybridom-Zelle T-006, wurden in PBS bis auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurden 10 μΐ einer 20 %igen Glutaraldehydlösung zugegeben und es wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf eine Sephadex G-200^ -Kolonne (Pharmacia, Schweden), die mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) äguilibriert worden war, aufgegeben und mit dem gleichen Puffer eluiert. Es wurde eine Fraktion mit einem hohen Molekulargewicht aus dem Ablaufvolumen bis zu dem IgG-Elutionspunkt gesammelt, es wurde Rinderserum-Albumin in einer Menge bis zu 5 Gew./Vol.-% zugegeben, durch Passieren durch ein Milliporenfilter (0,22 pm, Millipore, USA) sterilisiert und bis zur Verwendung bei 4⁰C im Dunkeln aufbewahrt.

mtl IUVtU

3) ß-Galactosidase-Markierung des von der Hybridom-Zelle T-006 abgesonderten Antikörpers

Der von der Hybridom-Zelle T-006 abgesonderte Antikörper wurde nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren (2) mit ß-Galactosidase markiert. Bei der verwendeten ß-Galactosidase handelte es sich um eine solche der Sigma-Qualität IV (Sigma, USA).

125

4) J-Markierung des von der Hybridom-Zelle T-006 abge-

sonderten Antikörpers

125 Zu 10 μΐ einer Lösung von 100 mCi/ml Na J (trägerfrei/ Amersham, USA) wurden 50 μΐ der von der Hybridom-Zelle T-006 abgesonderten Antikörperlösung (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit, Proteingehalt 1,0 mg/ml) und 30 μΐ eines 0,5 M Phosphatpuffers (pH 7,2), der 0,30 mg/ml Chloramin T enthielt, zugegeben und gut damit gemischt. Nach 15 Sekunden wurden 100 μΐ PBS, gesättigt mit L-Tyrosin,zugegeben und sofort damit gemischt. Die resultierende Mischung wurde an einer mit Amberlite IRA 400 ge-

2Q füllten Kolonne chromatographiert und mit PBS, das 1 % Rinderserum-Albumin enthielt, eluiert. Die eluierte Fraktion wurde gesammelt und bis zur Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt. Die spezifische Aktivität des markierten Produkts betrug 1,0 \xCx pro mg Antikörperprotein.

5) Fluorescein-Markierung des von der Hybridom-Zelle T-006

abgesonderten Antikörpers

Zu 1 ml Lösung des Antikörpers, der von der Hybridom-Zelle T-006 abgesondert wurde (gereinigte ascitische überstehende on Flüssigkeit) in einer Konzentration von 10 mg/ml wurden 0,1 ml 0,5 M Carbonatpuffer (pH 9,3) zugegeben, außerdem wurden 0,1 mg Fluorescein-Isothiocyanat-Pulver zugegeben und 6 Stunden lang bei 4⁰C ohne Blasenbildung gerührt. Unmittelbar nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung

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or auf eine Sephadex σ-2 5^-Κο1οηηθ (Pharmacia, Schweden) aufgegeben zur Entfernung der nicht-umgesetzten Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, und es wurde die gewünschte Fraktion mit hohem Molekulargewicht erhalten. Das erhaltene

Produkt wurde bis zur Verwendung bei 4⁰C im Dunkeln aufbewahrt .

6) Tetramethylrhodamin-Markierung des von der Hybridom-Zelle T-006 abgesonderten Antikörpers

Zu 1 ml einer Lösung des von der Hybridom-Zelle T-006 abgesonderten Antikörpers (10 mg/ml) (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit) wurden 0,1 ml 0,5 M Carbonatpuffer (pH 9,3) zugegeben und außerdem wurden 0,2 mg Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat-Pulver zugegeben und ohne Blasenbildung 20 Stunden lang bei 4⁰C gerührt. Nach der Reaktion wurde die Reaktionsmischung sofort auf eine Sephadex 0-2S⁰ -Kolonne (Pharmacia, Schweden) aufgegeben, um die nicht-umgesetzten Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen, und es wurde die gewünschte Fraktion mit hohem Molekulargewicht erhalten. Das Produkt wurde bis zur Verwendung bei 4⁰C im Dunkeln aufbewahrt.

7) Biotin-Markierung des von der Hybridom-Zelle T-006 abgesonderten Antikörpers

1 mM d-Biotin (244 mg) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) und 1,5 mM N-Hydroxysuccinimid (173 mg) (Eastman Kodak, USA) wurden in einer Mischung aus 8 ml Dimethylsulfoxid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) und 5 ml 1,2-Dimethoxyethan (Nakarai Chemical, Japan) gelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde eine Lösung von 206 mg (1 mM) N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid (Kanto Chemical, Japan) in 0,5 ml 1,2-Dimethoxyethan zugegeben und bei 4⁰C über Nacht reagieren gelassen. Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert, wobei man ein Filtrat erhielt. Das Lösungsmittel in dem Filtrat wurde unter Vakuum entfernt und das zurückbleibende ölige Material wurde in 10 ml Dichlormethan (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan) gelöst und auf 4°C abgekühlt. Es wurden 10 ml 0,1 M NaHCO-j-Lösung (4⁰C) zugegeben und zum guten Mischen geschüttelt. Die resultierende Dichlormethan-Phase wurde entfernt, es wurden 10 ml 0,1 M NaHCO₃ und dann 10 ml destilliertes Wasser (4°C) zugegeben und diese Verfahren

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wurden erneut wiederholt. Die resultierende Dichlormethan-Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat-Pulver (Koizumi Chemical, Japan) versetzt zur Dehydratisierung. Das Pulver wurde abfiltriert und η-Hexan wurde dem Filtrat allmählich zugegeben, bis es trübe war. Die Lösung wurde auf -20⁰C abgekühlt, die ausgefallenen Kristalle wurden in einen Exsikkator überführt, um das Lösungsmittel zu entfernen und zu trocknen. Dabei wurde das Produkt, Biotin-N-hydroxysuccinimidester, erhalten.
10

Das Biotin-N-hydroxysuccinimid wurde in Dimethylsulfoxid gelöst und die Konzentration wurde auf 1 mg/ml eingestellt. Die Lösung (60 μΐ) wurde mit 1 ml Lösung des von der Hybridom-Zelle T-006 abgesonderten Antikörpers (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit, Proteingehalt 1 mg/ml) gemischt und 4 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die Lösung gegen PBS bei 4⁰C 3 Tage lang dialysiert. Dafür wurde die Dialyseflüssigkeit 3-mal ausgetauscht. Das Dialysat (Lösung in dem Dialyseröhrchen) wurde bis zur Verwendung bei 4⁰C aufbewahrt .

Beispiel 10: Identifizierung von Human-Blasenkrebs durch markierte Antikörper

1) Objekt: Gewebe, die Human-Harnblasenkrebs enthielten, wurden in chirurgischen Operationen erhalten. Die rohen Gewebe mit Dimensionen von 5 mm χ 5 mm χ 2mm oder weniger wurden fixiert, während sie 6 Stunden lang bei 4°C in einer PLP-Fixierf lüssigkeit (0,0375m Natriumphosphatpuffer, pH 6,2, enthaltend 0,01 M NaJO₄, 0,075 M Lysin und 3 % Paraformaldehyd) geschüttelt wurden. Die fixierten Gewebe wurden gewaschen, indem man sie nacheinander behandelte·, mit PBS, das 10 % Saccharose enthielt (4⁰C, über Nacht), mit PBS, das 15 % Saccharose enthielt (4°C, 6 Stunden), mit PBS, das 20 % Saccharose enthielt (4°C, 6 Stunden) und dann mit PBS, das 20 % Saccharose und 10 % Glycerin enthielt (4⁰C, 1 Stunde). Nach dem Waschen wurde das Gewebe eingebettet, in Trockeneis/Ethanol eingefroren und

einem Kryostaten ausgesetzt zur Herstellung einer gefrorenen Probe von 10 μπι.

2) Identifizierungsverfahren: Die eingefrorene Probe wurde auf ein mit Rinderserum-Albumin beschichtetes Objektträgerglas gelegt und getrocknet. Nach 3-maligem 5-minütigem Waschen mit PBS bei 4°C wurde die Probe mit 0,005 M Perjodsäure 10 min lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach 3-maligem Waschen mit PBS, das bei 4⁰C gehalten wurde, wurde die Probe 10 min lang bei Raumtemperatur mit PBS, das 10 % Pferdeserum enthielt, behandelt. Auf die Probe wurde mittels einer Kapillarpipette eine 10-fach verdünnte Lösung des Antikörpers von T-006, markiert mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase, Fluorescein, Rhodamin oder Biotin, hergestellt in Beispiel 9, aufgebracht und 45 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen und dann 5-mal mit PBS, das bei 4⁰C gehalten wurde, gewaschen.

Die erhaltene Probe wurde auf die nachstehend beschriebene Weise identifiziert:

a) Fluoreszeηζ-Antikörper-Methode: Bei den mit Fluorescein und Rhodamin markierten Antikörpern wurde die Probe in Glycerin eingeschlossen und durch ein Fluoreszenzmikroskop (Olympus Vanox, Olympus, Japan) betrachtet.

Bei dem mit Biotin markierten Antikörper wurde ein Tropfen von 5 μg/ml Fluorescein-gebundenem Avidin (Funakoshi Yakuhin, Japan) auf die Probe aufgegeben und 1 Stunde lang bei 37°C reagieren gelassen. Nach 5-maligem Waschen mit PBS wurde die umgesetzte Probe in Glycerin eingeschlossen und durch ein Fluoreszenzmikroskop (Oylmpus Vanox, Olympus, Japan) betrachtet.

b) Enzym-Immunoassay: Bei dem mit Peroxidase markierten Antikörper wurde die Probe mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), der 0,02 ml/ml 1 %iges H₂O₃ und 0,5 mg/ml 3,3-Diaminobenzidin-HCl enthielt, 10 min lang bei Raumtempera-

tür reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die umgesetzte Probe 3-mal mit PBS von 4⁰C und 1-mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach der Nachfärbung mit einem Veronal-Acetatpuffer (pH 4,0), der 1 % Methylgrün enthielt, wurde die Probe durch Ethanol dehydratisiert, durch Xylol dialysiert, in Balsam eingeschlossen und die Farbe (Braun) wurde durch ein Mikroskop betrachtet.

Bei dem mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörper wurde die Probe mit 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5, unmittelbar vor der Verwendung abfiltriert), der 0,39 M Magnesiumsulfat, 0,2 % Bleicitrat, 0,6 % ß-Glycerophosphorsäure und 4 % Saccharose enthielt, 10 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die umgesetzte Probe 3-mal mit PBS, das bei 4⁰C gehalten wurde, und dann 1-mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurde die Probe in einer 1 %igen gelben Ammoniumsulfidlösung 5 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen, gründlich mit PBS gewaschen, in Glycerin eingeschlossen ^un(ä die Farbe (Schwarzbraun) wurde durch ein Mikroskop betrachtet.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben. 25

-45-Tabelle II

Methode

Markierung des Antikörpers

Reaktivität

Krebsgewebe Normalgewebe

Fluoreszenz-

Antikörper-

Methode

Fluorescein

Rhodamin-

Biotin

Enzym Immunoassay

Peroxidase

alkalische Phosphatase

+1 +2

+: positive Fluoreszenz +1: braune Farbe +2: schwarz-braune Farbe -: negativ

Beispiel 11: Bildliche Darstellung der Krebszelle durch den Antikörper

Eine Human-Harnblasenkrebszellinie T24 (1 χ 10 Zellen) wurde subkutan auf den rechten Schenkel von weiblichen BALB/c nu/nu-Mäusen eines Alters von 8 Wochen (3 Tiere in jeder Gruppe) transplantiert. Nach 30 Tagen betrug die

125

Größe des Tumors 1 cm² oder mehr und ein mit J markierter Antikörper, der von der Hjrbridom-Zelle T-006 ausgesondert worden war, hergestellt wie in Beispiel 9, wurde in

125 einer Dosismenge von 35 μ<Ζϋ pro Maus oder ein mit J markierter Maus-IgG wurde zum Vergleich in einer Dosismenge von 10 iiCl pro Maus intravenös injiziert. Nach 96 Stunden wurde mittels einer Gamma-Kamera eine Szintigraphie des gesamten Körpers durchgeführt.

«/Τ Iv/v/tU

Es wurde eine bemerkenswerte Anreicherung der Radioaktivität auf dem Tumor bei allen Tieren beobachtet, denen der

125
mit J markierte erfindungsgemäße Antikörper verabreicht worden war, während eine geringere Anreicherung bei den Kontrolltieren beobachtet wurde.

Beispiel 12: Mitomycin- oder Doxorubicinhydrochlorid- Markierung des Antikörpers

Nach der Einstellung auf 10,4 mg/ml unter Zugabe von destilliertem Wasser zu dem Antikörper (gereinigte ascitische überstehende Flüssigkeit) aus der Hybridom-Zelle T-002, T-008 oder T-O10 wurden 13,0 mg Mitomycin zugegeben und dann wurde Chlorwasserstoffsäure unter Rühren zugegeben, um den pH-Wert der Lösung auf 4,75 einzustellen, und gleichzeitig wurden 3,7 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid zugegeben. Nach 10, 30 oder 60 Minuten langer Reaktion wurde die Reaktion durch Zugabe von 2 ml Acetatpuffer (pH 4,70) gestoppt. Die Reaktionsmischung wurde dann gegen 5 1 destilliertes Wasser 72 Stunden lang bei 4⁰C dialysiert, wobei die Dialyselösung 3-mal ausgetauscht-wurde. Nach dem Einengen wurde das Dialysat auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 55 cm, die mit Sephadex ΰ-25^ (Pharmacia, Schweden) gefüllt war, aufgegeben, um die niedermolekularen Substanzen vollständig zu entfernen. Die resultierende Lösung wurde bei -20⁰C friergetrocknet, wobei man das Mitomycin-Antikörper-Bindungsprodukt erhielt. Die Bindungsmengen des Mitomycins in den Produkten pro mg Antikörper sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Die Bindungsprodukte von Doxorubicinhydrochlorid mit den Antikörpern wurden auf die gleiche Weise wie oben angegeben erhalten. Die Bindungsmengen des Doxorubicinhydrochlorids in den Produkten pro mg des Antikörpers sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Andererseits wurden diese Bindungsprodukte des Antikrebsmittels mit dem Antikörper an ICR-Mäuse (10 Tiere in jeder

341334U

Gruppe) in einer Dosismenge von 400 mg/kg per-oral, 100 mg/kg intraperitoneal oder 50 mg/kg intravenös verabreicht. Innerhalb von 14 Tagen wurde kein Todesfall festgestellt.

Tabelle III

Antikrebsmittel

Antikörper Bindunqsverhältnis

10 min

30 min

60 min

Mitomycin

von T-OO2- stammend T-008 T-010

4	8	9
4	7	10
4	7	11
4	7	10
4	7	10

D.oxorubicinhydrochlorid

T-0Q2 T-008 T-010

Beispiel 13: in vitro-Antitumoreffekt des Antikörpers Zur Prüfung des Antitumoreffekts des Antikörpers oder des Bindungsprodukts mit dem Antikrebsmittel, hergestellt in Beispiel 12, wurde eine in vitro subkultivierte Human-Harnblasen-Krebszellinie T-24 verwendet. Die

Zellen wurden mit Eagle-MEM, das 10 % Fötus-Rinderserum

4 enthielt, auf eine Zellkonzentration von 5x10 pro ml eingestellt, in einer Menge von jeweils 5 ml in eine Petrischale gegeben und 24 Stunden lang in einem 5 % CO₂-Inkubator bei 37°C inkubiert. Der Antikörper aus der Hybridom-Zelle T-008 oder der an Mitomycin gebundene Antikörper aus der Hybridom-Zelle T-008 (60 min-Reaktionsprodukt) wurde in die Schale gegeben und weiter kultiviert. 24 Stunden nach der Zugabe des Arzneimittels wurden 1 μ Ci/ml L-/&- C7leucin (RCC, USA, spezifische Readioaktivität 342 mCi/m mol) zu der Reaktions-

mischung zugegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Nach dem Kultivieren wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen wurden 3-mal mit PBS (pH 7,2) gewaschen, auf O⁰C abgekühlt, mit einer 5 %igen Trxchloressigsaurelösung behandelt und die gewaschenen Zellen wurden auf ein Filterpapier überführt und getrocknet. Es wurde die in das Zellprotein eingeführte Radioaktivität mittels eines Flüssig-Szintillationszählers (Packard, USA) gemessen.

Die Ergebnisse sind in der Fig. 1 dargestellt. In der Fig. 1 repräsentiert die Ordinate die eingearbeitete

14
Menge an Radioaktivität ( C-Leucin) als Prozentsatz von 100 der durch die nicht-behandelte Kontrolle eingearbeiteten Menge.

Wie aus der Fig. 1 ersichtlich, nahm die Konzentration, die eine 50 %-Inhibierung der Einarbeitung der Radioaktivität anzeigt, durch das Bindungsprodukt zwischen Antikörper und Mitomycin ab im Vergleich zur Kontrolle.

Beispiel 14: in vivo-Antitumoreffekt des Antigens Eine Human-Harnblasen-Krebszellinie T24 (6x10 Zellen pro Tier) wurde intraperitoneal in weibliche BALB/c nu/nu-Mäuse (10 Tiere in jeder Gruppe) transplantiert.

Nach 5 und 72 Stunden wurde der von der Hy.bridom-Zelle T-008 abgesonderte Antikörper oder das Bindungsprodukt zwischen dem von T-008 abgesonderten Antikörper und Mitomycin (60 min-Reaktionsprodukt, 50 μg/ml Mitomycin) intraperitoneal den Mäusen injiziert in einer Dosismen-9^{e von} 450 μg pro Maus (20 μg Mitomycin pro Maus) und die Uberlebensrate wurde 60 Tage lang festgestellt, um die Antitumor-Aktivität des verabreichten Arzneimittels zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt. In der Fig. 2 repräsentiert die Ordinate die Uberlebensrate (%) und die Abszisse repräsentiert die Anzahl der Tage nach der Transplantation der Tumorzellen.

Wie aus der Fig. 2 ersichtlich, wurde die Anzahl der Tage, an denen 50 % der Tiere überlebten, durch das Mitomycin-Antigen-Bindungsprodukt verlängert. Außerdem wurde auch eine Verlängerung der Lebensdauer durch die Verabreichung des Antigens allein festgestellt.

ι -^5Q;

- Leerseite -

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch ist für das Oberflächenantigen der Human-Harnblasen-Krebszelle, dadurch gekennzeichnet , daß eine Hybridzelle (Hybridoma) zwischen einer Zelle, die den Antikörper bilden kann, und einer Zelle, die permanent durch eine in vitro-Subkultur unterhalten werden kann, gebildet wird und daß der von der Hybridzelle abgesonderte Antikörper gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zelle, die den Antikörper bilden kann, um eine Milzzelle, um eine Lymphknotenzelle, um eine Peripherblutleukozytenzelle oder eine Mischung davon handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 5 die Zelle aus einer Maus stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Maus um eine BALB/c-Maus oder um eine Hybridmaus davon handelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Zelle, die durch eine in vitro-Subkultur permanent unterhalten werden kann, um eine Myelomzelle handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle, die permanent durch eine in vitro-Subkultur unterhalten werden kann, einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase oder Thymidinkinase hat.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle aus einer Maus stammt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle aus der Zellinie P3-X63-Ag8, P3/NSI/1-Ag4-1, Sp2/0-Ag14 oder X63-Ag8.653 stammt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle, die den Antikörper bilden kann, aus einem mit der Human-Harnblasenkrebszelle immunisierten Tier stammt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle in Gegenwart von Polyethylenglykol hergestellt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle in einem Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltenden Medium für die Selektion kultiviert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle geklont wird zur Herstellung eines einzelnen Klons.

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13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Klonen durchgeführt wird durch Anwendung des beschränkten Verdünnungsverfahrens, des Weichagarverfahrens oder des Fibringelverfahrens.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle in vitro kultiviert wird zur Absonderung des Antikörpers.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridzelle auf ein Tier transplantiert und in vivo kultiviert wird und daß der abgesonderte Antikörper von der Körperflüssigkeit des Tieres abgetrennt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Körperflüssigkeit um Serum oder Ascites handelt.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Tier um eine Maus handelt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Maus eine BALB/c-Maus oder eine Hybridmaus davon ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Human-Harnblasenkrebs um eine Human-Harnblasen-Übergangsepithel-Krebszellen-Linie T24 handelt.

20. Hybridzelle, die einen Antikörper bildet, der spezifisch ist für das Oberflächenantigen einer Human-Harnblasen-Krebszelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Zelle, die den Antikörper bilden kann, und einer Zelle, die permanent durch eine in vitro-Subkultur unterhalten werden kann, gebildet ist.

21. Hybridzelle T-001, T-002, T-003, T-004, T-005, T-006,

-4-T-007, T-008, T-009, T-OIO, T-O11 oder T-012.

22. Antikörper, der spezifisch ist für das Oberflächenantigen der Human-Harnblasen-Krebszelle, dadurch gekennzeichnet, daß er nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellt ist.

23- Antikörper nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß er von der Hybridzelle T-OO1, T-002, T-003, T-004, T-005, T-006, T-007, T-008, T-009, T-010, T-O11 oder T-012 abgesondert worden ist.

24. Reagens zur Klassifizierung und/oder Identifizierung des Harnblasenkrebses beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehr Antikörper gemäß Anspruch enthält.

25. Reagens nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält.

26. Reagens nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Human-Harnblasenkrebs um eine Human-Harnblasen-Ubergangsepithel-Krebszellen-Linie T24 handelt.

27. Reagens zur Identifizierung des Harnblasenkrebses beim Menschen oder beim Tier.

28. Derivat oder Restriktionsprodukt des Antikörpers gemäß Anspruch 22.

29. Derivat nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine radioaktive Substanz, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Enzym, ein Markierungsmittel für die Elektronenmikroskopie oder eine Restgruppe, die eine Struktur für eine sekundäre Kombination davon enthält, chemisch an den Antikörper gebunden ist.

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30. Restriktionsprodukt nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es erhalten wurde durch restriktive Spaltung des Antikörpers durch eine chemische oder Enzymbehandlung.

31. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet,

125

daß es sich bei der radioaktiven Substanz um J handelt.

32. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzfarbstoff um Fluorescein oder Rhodamin handelt.

33. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um Peroxidase oder alkalische Phosphatase (Alkaliphosphatase) handelt.

34. Derivat nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Struktur Biotin ist.

35. Reagens zur Klassifizierung und/oder Identifizierung von Human-Harnblasenkrebs, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehr Derivate oder Restriktionsprodukte gemäß Anspruch 28 enthält.

36. Reagens nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Träger oder ein Verdünngnsmittel enthält.

37. Verfahren zur Klassifizierung und/oder Identifizierung von Human-Harnblasenkrebs, dadurch gekennzeichnet, daß es durchgeführt wird unter Verwendung des Reagens gemäß Anspruch 24 oder 35.

38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß ein Objekt bzw. Teil, das die Human-Harnblasen-Krebszelle enthält, mit dem Reagens in Kontakt gebracht wird und daß die Antigen-Antikörper-Reaktion angewendet wird.

-δ-39. Verfahren nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, daß das Objekt bzw. Teil von einem Menschen oder einem Tier stammt.

40. Pharmazeutisches Mittel in einer Dosierungseinheitsform für die Behandlung des Human-Harnblasenkrebses, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehr Antikörper gemäß Anspruch 22 enthält.

41. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Träger oder ein Verdünnungsmittel enthält.

42. Bindungsprodukt des Antikörpers gemäß Anspruch 22 ■..-..·. mit einem Antikrebsmittel.

43. Produkt nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, ääR es säloh hei dem Antikrebamittel um Mitomycin oder Doxorubicinhydrochlorid handelt.

44. Pharmazeutisehes Mittel £ür die Behandlung des Human-Harnblasenkrebses, dadurch gekennzeichnet, daß es ein oder mehr Bindungsprodukte gemäß Anspruch 42 enthält.

2b

45. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 40 oder 44, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer injizierbaren Form vorliegt.