JPS59186922A - ヒト膀胱癌治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト膀胱癌に対重る抗体産生細胞とインビト
ロにおいて長期継代培養可能な細胞との間の融合細胞（
以下、ハイブリドーマと称す）より分泌される抗体、そ
の誘導体またはその限定分解物のヒト膀胱癌の治療剤と
しての使用およびそ、の方法に関する。

ここでいう抗体の誘導体とは、該抗体に抗癌剤を化学的
に結合させた生成物であり、抗体の限定分解物とは、該
抗体を化学的処理または酵素処理によって限定分解して
生ずる分解物であって、これら自身も本発明に包含され
る。

近年、癌はあらゆる疾患の中で死亡率の最も高い疾患に
なっており、社会的問題になっている。

その対策はあらゆる方面から検討されているが、未だ根
本的な解決法は見出されていない。日本に於いては、胃
癌、肺癌、肝癌が多く、癌ににる死亡者全体の５０％以
上を占めているが、一方において、近年、生活様式の変
化から従来は少なかった種類の癌も増加傾向にある。そ
の中で、膀胱癌などの泌尿器系悪性腫瘍は年々増加の一
途をたどっている代表的な例である。その治療法として
は千−術療法を主体とし、放射線療法、化学療法、免疫
療法などが施行されているが、末期病や進行路では限界
があり、従来と界なった治療方法が求めら５− れているのが現状である。本発明の抗体は膀胱癌の治療
に極めて有効な手段を提供するものである。

一般に、癌細胞表面に存在する癌関連抗原・癌特責抗原
については膨大な研究がなされており、特に実験動物を
用いた移植実験等でその存在が証明されているが、人癌
については充分な検討がなされていない。現在、層表面
にある抗原としては、■自家にのみ存在する抗原、■同
種の腫瘍に共通して存在する抗原、■＠臓器の腫瘍ある
いは正常細胞にも存在する抗原などが考えられている。

従来の同種又は異種抗血清を用いて上記の３秤を区別す
る抗体を作製するためには、吸収操作を繰り返す必要が
ある。しかし、この操作は抗体力価の低下を伴い、実用
に適さない。又、目的とする抗体が得られても、再現性
よく、同じ特異性をもつ抗体を得ることは不可能に近い
。

　６− １９７５年、Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎらによって始められた
細胞融合法によるモノクローナル抗体の作製は上記の３
種類の抗原を区別することが可能な新しい手法の１つで
ある。そして、ヒトリンパ球サブセットやヒト白血病、
ヒトメラノーマなどのヒト細胞表面抗原に対するモノク
ローナル抗体が得られたとの報告が近年なされている。

しかし、細胞融合法によるモノクローナル抗体作製の手
法を用いれば、一般的に特異抗体の作製は可能とされて
いるものの、細胞によってはその抗原性に変動があり、
果して、目的とする特異性の優れた抗体が得られるかど
うかは現在のところ予知できないとされている。癌細胞
に関しても上述のごく一部の、しかも特定の癌細胞につ
いての報告しかなく、膀胱癌に関しては報告もほとんど
なく、まして実用化されている抗体もない。

本発明者らは、ヒト膀胱癌の表面抗原についての研究を
重ねた結束、ヒト膀胱癌に対する抗体産生細胞とインビ
トロにおいて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリ
ドーマにより分泌される抗体にはヒト膀胱癌に対する極
めて特異性の優れた抗体が存在することを見出した。更
にそれを用いたヒト膀胱癌の治療法について検討を重ね
、本発明を完成するに至った。

本発明で用いる抗体は、単一の特異性を有する、また単
一の分子種からなる抗体である。またタンパク質当りの
力価は極めて高い。抗原に対する高度に特異的な反応性
のために、あらかじめ投与する宿主の正常組織との反応
性を調べて交叉反応しないものを選ぶことにより、宿主
組織に対する抗体の攻撃に由来する副作用をほとんどな
くすことができる。また、物質としての純度の高さの故
に、従来の自消療法にありがちであった夾雑物質に由来
するアレルギー反応等の出現頻度が低下する。

本発明に使用する抗体は、例えば以下の方法で製造でき
る。

Ａ、抗体産生細胞を調製する■程： ヒト膀胱癌細胞に対する抗体産生細胞は、ヒトを含めた
いずれの動物種から得てもよく、またあらかじめ免疫を
行なうことは必須ではないが、これを行なうことによっ
て目的とするハイブリドーマの採取効率を著しく上げる
ことができる。

ヒトの細胞を用いる場合には、膀胱癌の病歴のある者や
血清中の該細胞に対する抗体価が高い者を選ぶことがで
きる。癌細胞の免疫においては、癌細胞そのものまたは
グルタルアルデヒド処理やマイトマイシン処理により増
殖性を失わせた細胞を用いてもよく、また細胞より該表
面抗原を適当な方法で分離、精製したものを用いてもよ
い。また免疫に際し、フロイント完全または不完全アジ
ュバントのような助剤を免疫原に混入して用いることが
できる。免疫の際の免疫原投与法は、皮下注射、腹腔内
注射、静脈内注射、皮肉注射、筋肉的注射等いずれでも
よいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は
１回または適当な間隔、好ましくは１週乃至５週をおい
て繰り返し行なってもよい。免疫した動物の血清中の該
細胞に対する抗体価を測定し、抗体価が充分高くなった
動物を抗体産生細胞のソースとして用いれば、その後の
操作の効率を上げることができる。融合には、最終免疫
後３〜５日後の動物由来の抗体産生細胞を用いるのが好
ましい。該抗体産生細胞は形質細胞およびその前駆細胞
であるリンパ球であり、こ托は個体のいずれの部位から
得てもよいが、一般には牌、リンパ節、末梢血またはこ
れらの適宜の組み合わせから１９ることができる。

Ｂ、細胞融合の工程： もう一方の親細胞であるインビトロにおいて長期継代培
養可能な細胞は、抗体産生細胞と融合して目的にかなっ
たハイブリドーマを生ずるものであればいずれでもよい
が、その確率の高いのは骨髄腫等の白血病細胞である。

由来の種も、ヒト、ラット、マウス等いずれでもよい。

後述するように、融合後混在する親細胞を除くためには
ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ欠損株細胞またはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用
いるのが好ましい。例えば、ヒト由来のＧＭ　１５００
−６Ｔ　Ｇ　＝　Ａ　Ｉ−２，ＲＰ　Ｍ　Ｉ　８２２６
．マウス由来のＰ３−Ｘ６３Ａ！Ｊ８．　Ｐ３　／ＮＳ
　Ｉ　／１−Ａｇ４−１．５ｐ２１０−ＡＱ　１４．　
Ｘ６３−Ａａ８．６５３等を用いることができる。

上述の抗体産生細胞の由来する種と長期継代Ｊｇ養可能
な細胞の由来する種が同一であることは不可欠ではない
が、融合の効率、融合後の細胞の性質の安定性、生体内
で培養する際の簡便さなどの点から、一般には同一のも
のを用いる方が有利である場合が多い。特に長期継代培
養可能な細胞として、マウス由来のＰ３−Ｘｅ３Ａｇ８
．　Ｐ３　／ＮＳ　Ｉ／１−Ａｌ１１４−１．５１１２
１０−Ａ！１１１４またはＸ　６３−　Ａ　ｏ８．６５
３を用いる場合には、抗体産生細胞を得る動物として、
同系マウスであるＢΔｌ　Ｂ／ｃまたはその交雑マウス
を用いるのが有利である。融合に際しては、センダイウ
ィルス、ポリエチレングリコール等の融合促進剤を用い
るのがＪ：り、特にポリエチレングリコール１０００，
１５４０，２０００．４０００または６０００などを用
いるのが好ましい。これを約３０〜５５％含む溶液中で
融合を行なわせる。助剤として更に一ジメチルスルホキ
シドを添加してもよい。

Ｃ，ハイブリドーマの樹立： 融合後の混合物中には、ハイブリドーマの仙、親細胞で
ある抗体産生細胞とインビトロで長期継代培養可能な細
胞等が残存している。前者は通常長期間のインビトロの
培養に耐えられないので問題はないが、後者は目的とす
るハイブリドーマと共に増殖する可能性があるのでこれ
を除くことが望ましい。このため後者として、ヒボキサ
ンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼまた
はチミジンキナーゼ欠損株細胞を用いて融合をさせた後
、ヒボキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含
む培地中で培養する。これによりハイブリドーマのみを
選択的に生育させることができる。親細胞としてヒボキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼま
たはチミジンキナーゼ欠損株細胞を用いない場合には、
融合に先だって該細胞をエメチンおよびアクチノマイシ
ンＤで処理して細胞の増殖性を失わせておくことにより
、ハイブリドーマを親細胞との混合物から選択してもよ
い。

このようにして得たハイブリドーマは、一般に１３− は２種類以上のクローンを含むことが多く完全に同一の
性質を有する細胞の集団ではない。個々のクローンを分
離したい場合には、クローン化を行なうことが必要であ
る。クローン化は、単一の特異性をもつ抗体を製造する
ためには勿論であるが、多種類のクローンが混在する系
において長期間培養を行なっている間にしばしば起こる
ポピユレーションの変化を防ぐ意味からも有効であり、
行なうことが望ましい。り日−ン化の方法としては、限
界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法を用いることが
できる。また螢光活性化細胞選別装置を用いてクローン
化の際の細胞の分離を行なうことも可、能である。また
、長期間培養の間に起こる変異株の出現に対し、時々ク
ローン化を行なうことで元の細胞の性質をもった細胞を
保存することができる。

以上のような製造方法に従って作製したヒト膀−１４− 抗癌に対する抗体を分泌するハイブリドーマの例として
、後述の実施例に示すようにＴ−００１，Ｔ−００２，
Ｔ−００３，Ｔ−００４，Ｔ−００５，Ｔ−００６，Ｔ
−００７゜Ｔ−００８，Ｔ−００９，Ｔ−０１０，Ｔ−
０１１またはＴ　−０１２が挙げられる。

本発明のハイブリドーマは、対数増殖期において、凍害
防御物質として５％＜Ｖ／Ｖ）のジメチルスルホキシド
を添加した牛胎児血清中に１０　〜１０　　個／ｍｌに
懸濁して凍結することで長期間保存することができる。

その場合、凍結時の冷却速度は−１℃／分であることが
望ましく、また保存は一８０℃以下で行なうのが好まし
い。

解凍はなるべく速かに行なうのがよく、融解後直ちに細
胞を培地で洗浄してジメチルスルホキシドをとり除けば
、そのまま通常の培地に懸濁して培養を再開することが
できる。但し解凍した時点での細胞の生存率が悪く、増
殖活性が著しく低い場合には、適宜マウス牌細胞などを
加える必要がある。

Ｄ、抗体の製造： 抗体の製造にあたっては、ヒト膀胱癌細胞に対する抗体
を産生ずるハイブリドーマを、インビトロまたは生体内
（インビボ）で培養する。インビトロの培養の場合には
、本発明のハイブリドーマ増殖のために適当な栄養培地
、たとえば１０％（Ｖ／Ｖ）の牛胎児血清、５Ｘ１０　
　Ｍのβ−メルカ１１へエタノール、１ＷＡＭのピルビ
ン酸ナトリウムおよび抗生物質を含有したＲ’　Ｐ　Ｍ
　Ｉ　１６４０培地を用いることができる。ＲＰＭ　ｌ
　１６４０培地に代えて、４．５０／Ｌのグルコースを
含むＤ　ｕ　ｌ　ｂｅｃｃｏ’ｓ　ｎｏｄ　ｉ　ｆ　ｉ
　ｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　　ＭＥＭ　（以下、ｒ）−ＭＥ
Ｍと略す）を用いてもよい。細胞を増殖させる時適当な
初期濃度は、各々のハイブリドーマによって異なるが一
般に約１０１個／１であり、培養中の細胞濃度は、２×
１０　個／１を越えないことが望ましい。

また、本発明のハイブリドーマを生体に移植して固型ま
たは腹水型で増殖させ、その生体より体液、望ましくは
血清または腹水を採取することにより該ハイブリドーマ
が分泌する抗体を製造することができる。この方法によ
って得られる粗製抗体液は不純物として宿主となった生
体由来の種々の物質を含むという欠点をもつ一方、生体
外（インビトロ）の培養によって得られる抗体液に比べ
て著しく高濃度の目的抗体を含むという点で優れている
。ハイブリドーマを腹腔に移植して増殖させる場合にお
いては、移植の前、好ましくは３〜９週間前にブリスタ
ン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）
を腹腔内に投与しておくことにより、粗製抗体液の収量
を高めることができるが、この処置は必須ではない。な
お、宿主として用いる生体は、移植するハイブリドーマ
の親細胞と同種同系の動物が望ましい。この場合には、
通常、特別の処置をしなくてもハイブリドーマはその生
体内で増殖するが、ハイブリドーマと宿主の１１１適合
性抗原型が一致しない場合、一般に宿主生体に抗リンパ
球抗体投与、Ｘ線照射等の処置をあらかじめ施しておく
ことが必要である。移植後、細胞が生長してくるまでに
通常１週間から３週間を要する。

ハイブリドーマを生体外または生体内で培養して抗体を
産生分泌させる時に、放射性同位元素標識のロイシンま
たはりジン゛等の放射活性物質を培地中に添加または宿
主に投与することにより、分子内部に放射活性物質を含
み、化学構造が非標識物と全く変わらない抗体を製造す
ることができる。

本発明の製造方法に従って製造したヒト膀胱癌に対する
抗体の例として、後記表−１に示すものが挙げられる。

その特巽性、免疫グロブリンクラスは後記表−１に示す
通りである。

本発明の抗体は、粗製抗体液のまま使用してもよいが、
硫酸アンモニウム分画法やイオン交換クロマトグラフィ
ーなど免疫グロブリン精製の常法に従って、或いは、ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　　Ａや抗原によるアフイニテイクロマト
グラフイー等により精製して用いることができる。

抗体は、そのまま投与してもよいが、抗体の代わりに抗
体を化学的又は酵素的処理によって限定分解して得た抗
体の部分たとえばＦ（ａｂ）２　　を用いることもでき
る。これにより補体結合反応等が非特異的に生じて宿主
の組織を障害する可能性を除くことができる。また、マ
イトマイシンや塩酸ドキソルビシンなどの制癌剤やリシ
ンなどの毒素を化学的に結合させた生成物を用いること
により更に高い効果が発揮される。その作用機序は、投
与された抗体が癌細胞表面の抗原と結合するに伴い、補
体結合反応や体内のマクロファージその他の免疫系細胞
の癌細胞に対する攻撃が促進されることによると考えら
れる。制癌剤や毒素と抗体との結合物を用いる場合、そ
の作用機序は、投与された結合物質がヒ１〜膀胱癌細胞
表面の抗原と結合するに伴い、制癌剤や毒素が癌細胞を
攻撃することによるものであり、この場合、制癌剤や毒
素単独投与時と比べ副作用は極めて低くなり、効果が増
強される。

本発明の抗体又は生成物の急性毒性を知るため３群のＩ
ＣＲマウス（１群１０匹）の第１群に経口投！うで２！
］／ｋ（１，第２１！Ｙに腹腔内投与で７１００１１１
０／　ｋ（１゜また第３群に静脈内投与で２０ＯｎｌＧ
／ｋｏをそれぞれ投与し、１４日間観察したが、死亡は
認められなかった。極めて安全なものであるといえる。

抗体及び生成物は、注射剤として皮下注射、筋肉的注射
、静脈内注射で、好ましくは皮下または筋肉内に投与す
ることができ、また経口投与によっても、その一部が抗
体としての構造を保持したまま腸管を通過して吸収され
ることが確認されているので、経口投与剤として投与す
ることも可能である。

注射剤の製剤方法としては、例えば、抗体そのもの、マ
イトマイシンまたは塩酸ドキソルビシン結合抗体１０ｍ
ｇとマンニトール５０ｍｇを蒸溜水に溶解させて１０ｍ
１とし、常法で除菌した後、２ｎ＋ｌずつを注射用小瓶
に分注し、そのまま凍結乾燥して注射剤とする。この場
合、使用に際しては生理食塩水に溶解または懸濁させて
注射液とする。この仙、注射剤の製剤には、本発明抗体
、その誘導体またはその限定分解物の他に、担体、希釈
剤、緩衝剤、安定化剤、等服剤等を添加してもよく、常
法によって皮下注射剤、筋肉注射剤および静脈内注射剤
とすることができる。経口投与剤としては常法に２１− より腸溶剤の形で用いることができ、投与量は、主とし
て症状に左右されるが、マウスなどの動物で０．００１
ｍｇ〜１０（］　／ｋ（３７日、ヒ１へでは０．０１〜
３０００ｍｏ／人／日である。

本発明の方法を適用できる癌種はヒト膀胱癌であればい
ずれでもよく、また、本発明の方法に使用できる抗体も
、ヒト膀胱癌に対する抗体産生細胞とインビトロにおい
て長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマより
分泌される抗体で、ヒト膀胱癌と反応する抗体であれば
いずれでもよく、例えば後記表−１に示すようなハイブ
リドーマによって分泌される抗体が例示できる。

また、本発明の抗体および／または生成物は混合して使
用することもできる。

以下、具体的な実施例を述べる。

２２− （１）免疫原として用いる細胞の調製 長期インビトロ継代培養ヒト膀胱移行上皮癌細ダ 胞Ｔ２４２Ｘ１０　　個を１００ｍｍ　＠養血（Ｆ　ａ
ｌｃｏｎ　３００３゜Ｂ　ｅｃｔｏｎ−Ｄ　１ｃｋｉｎ
ｓｏｎ社、アメリカ）にイーグルスＭ　Ｅ　Ｍ　７−／
Ｌ／塩（以下ＭＥＭと略）に、１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児
血清、抗生物質硫酸カナマイシン（最終濃度６０ｍｏ／
　Ｌ　）を添加した培地で、３７℃、５％炭酸ガスを含
む湿った雰囲気中で培養した。

３日後、細胞をポリスマンで剥離し、培養上清を遠心分
離で除き、さらに、リン酸緩衝生理食塩水（ｒ）Ｈ７，
２、以下ＰＢＳと略）で遠心分離洗浄後、ＰＢＳに懸濁
させた。約２×１０　　個の細胞が１枚の培養皿より得
られた。

（２）骨髄腫細胞の培養 マウス骨髄腫細胞５１１２１０−ＡＱ１４１０　　個／
＋１１１をＤ−ＭＦＭに牛胎児血清１０％（Ｖ／Ｖ）、
ピルビン１１ｍＭ、グルタミン２ｍＭ、硫酸カナマイシ
ン６０ｍｃＪ／　Ｌを添加した培地で培養し、３０ごと
に継代した。Ｓ　１１２１０−Ａ　（１１４は、細胞融
合を行なう前日に２，５ｘ　１０　　個／１に細胞濃度
を調整し、上記の培地で培養した。

（３）Ｔ２４細胞による免疫 雌性ＢＡＬ１３／ｃマウス（ロ本チャールズリバー社、
９週令）に０．４ｍｌのＰＢＳに懸濁した上記（１）の
Ｔ２４細胞（５Ｘ１０　〜１０Ｘ１０　　個）を４回、
約１ケ月おぎに腹腔内に注射することで免疫した。

（４）細胞の融合 細胞の融合をに′６旧ｅｒおよびＭ　１ｌｓｔｅｉｎの
方法に準じて実施した（　Ｉ　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ
　：　Ｃｌ１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　１９８０’ｓ　ｅｄ
。

ｂｙ　　Ｎａｋａｍｕｒａ　Ｒ，Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、
　Ｆ、　Ｓ、　ＡｌａｎＲ，ｔ　ｉｓｓ、　Ｉ　ｎｃ、
　Ｎ　、　Ｙ、、　１９８０．　ｐｐ３０１〜３２４　
）。

最終免疫後４０目にマウスを層殺し、牌を取り出し、よ
くほぐした後、１５０メツシユのステンレスメツシュに
通し、４００ｘ　ｇで遠心分離後、沈澱した細胞に０゜
７４７％塩化アンモニウムを含む１〜リス・塩酸緩衝液
（０，０１７Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、　　ｐＨ７，６５）を加えて赤血球を除去し、遠心
分離（４００ｘｇ　）で細胞を集めた。ＭＥＭを加えて
遠心分＠　（４００ｘｇ）を行ない、又、細胞を新たな
ＭＥＭに懸濁する操作を３回繰り返すことで洗浄し、最
終的にＭＦＭに懸濁した。Ｓ　ｐ２／　０−Ａ　０１４
は培養容器より、ピペッティングではがし、遠沈管に移
した。遠心分離（４００Ｘ（１）後、集めた細胞にＭＥ
Ｍを加えて懸濁、遠心分Ｉｌｔ　（４００ＸＯ）するこ
とで血清を除去した後、ＭＥＭに再懸濁した。上記牌細
胞５ｘ１０７個と５ｐ２１０−Ａｏ１４１０　　個を混
゛合し、よくピペッティングした後、遠心分離（４００
ｘａ　）　シた。上清を除いた後、沈澱を軽く遠沈管を
たたくことで２５− はぐした。ＭＥＭ中に３０％（Ｖ／Ｖ）のポリ二丁チレ
ングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　１０００）を加えた溶液を
３７℃に保温し、その０．３ｍｌをほぐした細胞に加え
た。

ゆるやかに撹拌後、５分間室温で放置した。７×Ｑで遠
心を２分間行なった後、ＭＦＭをゆっくりと５１添加し
た。ゆるやかに撹拌後、４００ｘ　ｇで５分間室温で遠
心分離した。上清をすて、沈澱に５ｍｌのＭＥＭを加え
、同様に遠心分離し、上清を除去した。沈澱した細胞に
５１の次の培地を加え、ピペッティングした。培地とし
ては、Ｄ−ＭＦＭに１０％（Ｖ／Ｖ）牛脂児自消、２Ｉ
ｌ１Ｍノクルタミン、ｇ ５Ｘ１０　　Ｍのβ−メルカプトＴタノール、６０＋１
１（１／Ｌの硫酸カナマイシンを加え、さらにグルコー
スを４．５り／Ｌとなるように添加したものを用いた。

なお、この培地をＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳと略す。上記５ｍ
ｌの細胞懸濁液に２０１のＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳを加え、
その２５１ずつを２５ｃｍ　　培養フラスコ（Ｃ２６− −２５１００，コーニング社、アメリカ）に分注し、た
てて３７℃で炭酸ガス５％を含む湿った雰囲気中で１晩
培養した。なお、培養は以下同様の条件で行った。翌日
、軽くピペッティングをした後、遠心管に移して、４０
０Ｘ　ｇで遠心分離した。上清を除去した後、１ｘ１０
　　Ｍヒポキサンチン、４Ｘ１０−７→ Ｍアミノプテリンおよび１．６Ｘ　１０　　Ｍチミジン
を含むＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ　（）ＩＡＴ培地）　３５ｍ
１ニ懸濁し、その０．１１を９６ウエル培養プレート（
Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０７２．　Ｂ　ｅｃｔｏｎ−Ｄ　１
ｃｋｉｎｓｏｎ社、アメリカ）の各ウェルに入れ、１週
間培養した。ＨＡＴ培地中で１週間培養した後、２５μ
ｍのＨＴ培地を２日又は３日ごとに添加した。１−ＩＴ
培地としてはＨＡ　Ｔ培地からアミノプテリンを除いた
ものを用いた。

Ｂ、抗体産生ハイブリドーマの選択および増殖軸１ｍ融
合後、２週間めに酵素結合固相免疫測定法で、各つＴル
上清中のＴ２４細胞に対する抗体産生を調べた。

Ｔ２４細胞をプレーｔ−（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０７２）
に固定し、上記各ウェル中の培養上清４０μｍと室温で
２時間反応させた後、よ＜ＰＢＳで洗浄し、馬面清で１
０００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫
グロブリン抗体（カタログ番号３２１１−０２３１゜Ｃ
ａｐｐｅｌ　　Ｌ　ａｂ、　　Ｉ　ｎｃ、、アメリカ）
１００μ＋と　２時間反応させた後、よ＜ＰＢＳで洗浄
した。クエン酸緩衝液（０，１Ｍ、　　Ｉ）Ｈ４，５）
に基質（０−フェニレンジアミン）を１ｍｏ／ｍｌ、　
３１％過酸化水素水を０．４μｍ／１加えた溶液を２０
０μｍ人れ、３０分発色反応を行なわせた。

Ｔ２４細胞と反応する抗体を含有する３ウエルにつきク
ローン化を行なった。りＯ−ン化は、限界希釈法を用い
、以下の通りに行なった。

抗体産生陽性の３ウエルからハイブリドーマ１００個を
それぞれＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に懸濁し、一方、融合に
使用したと同様の方法でＢＡＬＢ／Ｃマウス稗臓より牌
細胞１０　　個をＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に調整し、２つ
を混ぜ合せた。細胞密度５×１０　　個／１となるよう
にＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳを加え、０．２ｍｌを９６ウエル
培養プレート（ＦａＩｃｏｎ３０７２　）の各ウェルに
入れ、培養した。培養開始１３日後に前述の酵素結合固
相免疫測定法でハイブリドーマの抗体産生の有無を各ウ
ェルにつき検討した。その結果、後記衣−１にある６株
（Ｔ　−００１乃至Ｔ−００６）を含め、総計３３株の
バイブリドーマが得られた。

インビトロで継代されている次の細胞を用いた。

Ｉ　ｎｔｅｓＨｎｅ　４０７　（ヒト胎児小腸細胞株）
、［）ｕ１４５（ヒト前立腺癌細胞株）、２５３Ｊ　（
ヒト腎孟２９− 癌細胞株）およびＴ２４（ヒト膀胱癌細胞株）。

実施例１で得られた培養上清を用いて上記細胞との反応
性を実施例１のように、酵素結合固相免疫測定法により
調べた。後記衣−１に示す如くＴ−００２以外のハイブ
リドーマにより分泌される抗体はＴ２４と強く反応し、
他細胞とは胎児小腸細胞株を含め、ややあるいは弱く反
応することが認められた。Ｔ−００２に関しては、Ｔ２
４と反応し、胎児小腸細胞株とは弱く、伯細胞とは反応
しないことが認められた。

Ｂ、螢光抗体法によるｌＩｌ胞染色 ハイブリドーマの１つＴ−００３が分泌する抗体を用い
てＴ２４細胞を間接螢光抗体法で染色した。Ｔ２４１１
１胞を無螢光のガラススライドに固定し、培養上清５０
μｍと３７℃、４５分湿った雰囲気中で反応させ、ＰＢ
Ｓに１％牛而自消ルブミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳ　（Ｎ
−２−ヒドロキシエチルビペラジンーー　３０− Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、０．１％アジ化ナトリ
ウムを添加した溶液に３分から５分処理することで洗浄
を３回行なった。フルオレツセイン結合抗マウスＩ　ａ
　Ｇ　（Ｍ　１ｌｅｓ−Ｙｅｄａ　Ｌ　ｔｄ、、イスラ
エル。

コード番号６５ｉ７１）を２０倍希釈した溶液５０μｍ
で上記と同じ条件でさらに４５分反応させた。その後、
洗浄を上記と同様の手法で行なった。乾燥させた後、炭
酸緩衝・グリセリン液（０，０５Ｍ、　　Ｉ）ｌ−ＩＱ
、５．１０％グリセリンを含む）を重層し、カバーグラ
スをのせ螢光顕微鏡（オリンパス、モデルハト１−　Ｒ
Ｆ　Ｌ　−Ｌ　Ｂ　）で検鏡した。その結果、Ｔ２４２
４細胞で強い螢光が観察された。なお、使用したフルオ
レッセイン結合抗マウスＩｏＧは、あらかじめＴ２４細
胞で６回吸収操作を行なった。

Ｃ０免疫グロブリンクラスの同定 ハイブリドーマＴ−００１乃至７−００６が分泌する抗
体の免疫グロブリンクラスの同定を酵素結合固相免疫測
定法で行なった。ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グ
ロブリン抗体として、抗免疫グロブリン（１（１）、抗
１（ＩＧ、抗ＩｇＭ（いずれもＣａｐｐｅｌ　Ｌ　ａｂ
、　　ｌ　ｎｃ、、アメリカ、カタログ番号３２１１−
０２３１．３２１１−００８１．３２１１−０２０１　
）を用いた。検討した６秤の抗体は、いずれも後記表−
１に示したようにＩＯＧであった。

長期インビトロ継代培養ヒト膀胱移行上皮癌細胞Ｔ２４
２Ｘ１０　　個を１００１１１Ｉ１１＠養冊（Ｆ　ａｌ
ｃｏｎ　３００３゜３　ｅｃｔｏｎ−［）　１ｃｋｉｎ
ｓｏｎ社、アメリカ）に、ＭＥＭに１０％（Ｖ／Ｖ　）
生胎児面清、抗生物質硫酸カナマイシン（最終濃度６０
ｍｏ／　Ｌ　）を添加した培地で、３７℃、５％炭酸ガ
スを含む湿った雰囲気中で培養した。３日後、細胞をポ
リスマンで剥離し、培養上清を遠心分離で除き、さらに
、ＰＢＳ（ｐｉ−１７，２）で遠心分離洗浄後、ＰＢＳ
に懸濁させた。

約２×１０　　個の細胞が１枚の培養皿より得られた。

（２）骨髄腫細胞の培養 マウス骨髄腫細胞５ｐ２１０−Ａｏ１４１０　　個／ｍ
ｌをＤ−ＭＥＭに牛脂充血７ｍ１０％（Ｖ／Ｖ）、ピル
ビン１％９１ｎ＋Ｍ、グルタミン２ｍＭ　、硫酸カナマ
イシン６０１１１（］／Ｉ−を添加した培地で培養し、
３日ごとに継代した。Ｓ　Ｉ）２／　Ｏ−Ａ　ｇ１４は
、細胞融合を行なう前日に２，５ｘ　１０　　個／１に
細ｔｍ濃度を調整し、上記の培地で培養した。

（３）Ｔ２４１１１１胞による免疫 画性ＢＡＬＢ／Ｃマウス（日本チャールズリバー社、９
週令）を０．４ｍｌのＰＢＳに懸濁した上記（１）のＴ
　２４１１［１胞（５ｘ１０　〜ＩＯＸ　１０　　個）
で４回、約１ケ月おきに腹腔内に注射することで免疫し
た。

３３− （４）細胞の融合 細胞の融合をに′６ｈｌｅｒおよびＭ　１ｌｓｔｃｉｎ
の方法に準じて実施した。

最終免疫後４日日にマウスを層殺し、牌を取り出し、よ
くほぐした後、１５０メツシユのステンレスメツシュに
通し、４００Ｘ　（＋で遠心分ｉｌｌ後、沈澱した細胞
に０．７４７％塩化アンモニウムを含むトリス・塩酸Ｉ
ｌ衝液（０，０１７Ｍ　トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン、　　ＤＨ７，６５）を加えて赤血球を除去
し、遠心分＊　（４００Ｘ（１）で細胞を集めた。ＭＥ
Ｍを加えて遠心分＠　（４００Ｘ！Ｉ＋　）を行ない、
又、細胞を新たなＭＥＭに懸濁する操作を３回繰り返す
ことで洗浄し、最終的にＭＥＭに懸濁した。Ｓ　ｐ２／
　０−Ａ　（１１４は培養容器より、ピペッティングで
はがし、遠沈管に移した。遠心分離（４００ＸＯ’）後
、集めた細胞にＭＦＭを加えて懸濁、遠心分離（４００
Ｘｇ　）することで血清を除去−リ　Ａ　− した棲、ＭＥＭに再懸濁した。上記碑細胞２Ｘ１０”７ 個と５Ｄ２１０−Ａ（Ｊ１４　４Ｘ１０　　個を混合し
、よくピペッティングした後、遠心分１１　（４００Ｘ
（＋　）　Ｌ／た。

上清を除いた後、軽く遠沈管をたたくことで沈澱をほぐ
した。ＭＥＭ中に３０％（Ｖ／Ｖ）のポリエチレングリ
コール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　１０００）を加えたものを３７℃
に保温し、その１．２１をほぐした細胞に加えた。ゆる
やかに撹拌後、５分間室温に置いた。７×りで遠心を２
分間行なった後、ＭＦＭをゆっくりと２０ｍ１添加した
。ゆるやかに撹拌後、４００ｘ　ｇで５分間室温で遠心
分離した。上清をすて、沈澱に２０ｍ１のＭＥＭを加え
、同様に遠心分離し、上清を除去した。沈澱した細胞に
１５ｍ１の次の培地を加え、ピペッティングした。培地
としては、Ｄ−ＭＥＭに１０％（Ｖ／Ｖ）牛胎児血清、
２ｍＭ（１）クーｔｔターダ ミン、５ｘｌＯＭのβ−メルカプトエタノール、６０ｍ
ａ／　Ｌの硫酸カナマイシンを加え、さらにグルコース
を４．５（＋／Ｌとなるように添加したもの（Ｄ−ＭＥ
Ｍ−ＦＩ３Ｓ）を用いた。−ト記１５ｍ１ノ細胞懸濁液
ニ９０ｍ１のＤ−Ｍ　Ｅ　Ｍ　−Ｆ　１３　Ｓを加え、
その約２５ｍ１ずつを２５ｃｍ　　培養フラスコ（コー
ニング社、アメリカ、　Ｃ−２５１００）に分注し、た
てて３７℃で炭酸ガス５％を含む湿った雰囲気中で１晩
培養した。なお、培養は以下同様の条件で行なった。

翌日、軽くごベツティングをした後、遠心管に移して、
４００Ｘ　Ｑで遠心分離した。」−清を除去した−４ 後、１ｘｌＯＭヒポキサンチン、４Ｘ１０　　Ｍアミｇ ノプテリンおよび１，６Ｘ　１０　　Ｍチミジンを含む
Ｄ−ＭＥＭ−ＦＢＳ　（＋−ＩＡＴ培地）　　１００ｎ
＋ｌｋ−懸濁し、その０．１ｍｌを９６ウー［ル培養プ
レート（Ｆ　ａｌｃｏｎ３０７２、　［３ｅｃｔｏｎ−
［）　１ｃｋｉｎｓｏｎ社、アメリカ）の各ウェルに入
れ、１週間培養した。その後、ＨＡ　Ｔ培地中で１週間
培養した後、２５μｍのｌ−Ｉ　Ｔ培地を２０又は３日
ごとに添加した。ト１１−培地としては１−１ＡＴ培地
からアミノプテリンを除いたものを用いた。

Ｂ、抗体産生ハイブリドーマの選択および増殖細胞融合
後、２週間めに酵素結合固相免疫測定法で、各ウェル上
清中のＴ２４細胞に対する抗体産生の有無を調べた。

Ｔ２４細胞をプレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０７２）に
固定し、上記各ウェル中の培養上清４０μｍと室温で２
時間反応させた後、よ＜ｐｓｓで洗浄し、馬血清で１０
００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グ
ロブリン抗体（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、　　Ｉｎｃ、、
アメリカ、カタログ番号３２１１−０２３１）　　１０
０μｍと２時間反応させた接、よ＜ＰＢＳで洗浄した。

クエン酸緩衝液（０，ＩＭ、　　ｐＨ４，５）に基質（
０−フェニレンジアミン）を１１１１０／１１１１．３
１％過酸化水素水を０．４μｍ／１加えた溶液を２００
μｍ入れ、３０分発色反応を行なわせた。Ｔ２４細胞と
反応する抗体を含有する３ウエルにつきクローン化を行
なった。

クローン化は、限界希釈法を用い、以下の通りに行なっ
た。

抗体産生陽性の３ウエルからハイブリドーマ１００個を
それぞれＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に懸濁し、一方、融合に
使用したと同様の方法でＢＡＩＢ／Ｃマウス牌臓より牌
細胞１０　　個をＤ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ−ＦＢＳ中に調整し
、２つを混ぜ合せた。細胞密度５×１０′個／ｍｌとな
るようにＤ−ＭＦＭ−ＦＢＳを加え、０．２１を９６ウ
エル培養プレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ３０７２）の各ウェ
ルに入れ、培養した。培養開始１４日後に前述の酵素結
合固相免疫測定法でハイブリドーマの抗体産生の有無を
各ウェルにつき検討した。その結果、後記表−１にある
４株（Ｔ　−００９乃至Ｔ−０１２＞を含め、総計１６
株のハイブリドーマが得られた。

実施例４　ヒト膀胱癌に対する抗体の特性Ａ、（ｌ！！
細胞との反す性の比較 インビトロで継代されている次の細胞を用いた。

Ｉ　ｎｔｅｓｔｉｎｅ　４０７　（ヒｌ〜胎児小腸細胞
株）　、Ｋ−５６２（ヒト白血病細胞株）、２５３Ｊ　
（ヒト腎孟癌細胞株）およびＴ０ｎ（ヒト膀胱癌細胞株
）。

実施例３で得られた培養上清を用いて上記細胞との反応
性を実施例１のように、酵素結合固相免疫測定法で調べ
た。後記表−１に示す如＜Ｔ−０１０は極めて高い特異
性を示し、Ｔ０ｎには強く反応するものの、伯細胞には
ほとんど反応を示さなかった。他の３株も特異性は低い
が同様の傾向を示した。

Ｂ、螢光抗体法による細胞染色 ハイブリドーマの１つＴ−０１０の分泌抗体を用いてＴ
２４細胞を間接螢光抗体法で染色した。Ｔ２４細胞を無
螢光のガラススライドに固定し、培養上清５０μｍと３
７℃、４５分湿った雰囲気中で反応させ、ＰＢＳに１％
牛面清アルブミン、１０ｍＭ　　ＨＥ　ＰＥＳ　（Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｘ）−２−エタンス
ルホン酸）、０．１％アジ化ナトリウムを添加した溶液
に３分から５分処理することで洗浄を３回行なった。フ
ルオレツレイン結合抗マウスｒ　ａ　Ｇ　（Ｍ　１ｌｅ
ｓ−Ｙｅｄａ　ｌ−ｔｄ、、イスラエル、コード番号６
５−１７１　）を２０倍希釈した溶液５０μｍで上記と
同じ条件でさらに４５分反応させた。その後、洗浄を上
記と同様の手払で行なった。軽く乾燥させ、炭酸緩衝・
グリセリン液（０，０５Ｍ、　　ｒ）ｌ−１９，５，１
０％グリセリンを含む）をｍ　Ｆし、カバーグラスをの
せ螢光顕微鏡（オリンパス、モデルＡＨ−ＲＦＬ−ＬＢ
）で検鏡した。その結果、Ｔ２４２４細胞で強い螢光が
観察された。なお、使用したフルオレツレイン結合抗マ
ウスＮＩＧは、あらかじめＴ２４細胞で６回吸収操作を
行なった。

Ｃ０免疫グロブリンクラスの同定 ハイブリドーマＴ−００９乃至Ｔ−０１２が分泌する抗
体の免疫グロブリンクラスの同定を酵素結合固相免疫測
定法で行なった。ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グ
ロブリン抗体として、抗免疫グロブリン（Ｉｏ）、抗１
（ＩＧ、抗１（ｌ　Ｍ　（いずれもＣａｐｐｅｌ　Ｌ　
ａｂ、　　ｌ　ｎｃ、、アメリカ、カタログ番号３２１
１−０２３１．３２１１−００８１．３２１１−０２０
１　）を用いた。

検討した４種の抗体のうち３種は、後記表−１にあるよ
うにＪｏＧで、あと１種（Ｔ−００９分泌抗体）は［Ｍ
であった。

長期インビトロ継代培養ヒト膀胱移行上皮癌細胞Ｔ２４
２ｘ１０’個を、１００ｍｍ培養皿（Ｆ　ａｌｃｏｎ３
００３、　Ｒｅｃｔｏｎ−ｏ　１ｃｋｉｎｓｏｎ社、ア
メリカ）に１０％（Ｖ／Ｖ）牛脂児血清、抗生物質硫酸
カナマイシン（最終濃度６０ｍｏ／　Ｌ　）を添加した
ＭＥＭ培地で、３７℃、５％炭酸ガスを含む湿った雰囲
気中で培養した。３日後、細胞をポリスマンで剥離し、
培養上清を遠心分離で除き、さらに、ＰＢＳ（Ｉｌｌ−
１７，２）で遠心分離洗浄後、ＰＢＳに懸濁させた。

約２×１０　　個の細胞が１枚の培養器Ｊ：り得られた
。

（２）骨髄肝細胞の培養 マウス骨髄肝細胞５１１２１０−△（１１／Ｉ　１０　
　個／ｍｌをＤ−ＭＥＭに牛脂児血清１０％（■／Ｖ）
、ピルビンｉ！２１１１１Ｍ１グルタミン２１１１Ｍ　
、硫酸カナマイシン６０ｍ（Ｊ／　Ｌを添加した培地で
培養し、３日ごとに継代した。Ｓ　１１２／　Ｏ−Ａ　
Ｃ１４は、細胞融合を行なう前日に２，５Ｘ　１０ゞ個
／１に細胞濃度を調整し、上記の培地で培養した。

（３）Ｔ２４細胞による免疫 雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールズリバー社、９
週令）を０．４ｍｌのＰ１３Ｓに懸濁した上記（１）の
Ｔ２４細胞（５Ｘ１０　〜ＩＯＸ　１０　　個）で４回
、約１ケ月おきに腹腔内に注射することで免疫した。

（４）＄１１１胞の融合 細胞の融合を）（′６ｈｌｅｒおよびＭ　１ｌｓｔｅｉ
ｎの方法に準じて実施した。

最終免疫後４日日にマウスを層殺し、牌を取り出し、よ
くほぐした［９．１５０メツシコのステンレスメツシュ
に通し、４００Ｘ　Ｑで遠心分離後、沈澱した細胞に０
．７４７％塩化アンモニウムを含むトリス・塩酸ＩＩＩ
液（０，０１７Ｍ　ｔ−リス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、　　ｐｌ−１７，６５）を加えて赤血球を除
去し、遠心分離（４００ｘｏ　）でｍ胞を集めた。ＭＥ
Ｍを加えて遠心分Ｉｆｆ　（４００Ｘｇ　）を行ない、
又、細胞を新たなＭＥＭに懸濁する操作を３回繰り返す
ことで洗浄し、最終的にＭＥＭに懸濁した。Ｓ　ｐ２／
　Ｏ−Ａ　ａｔ４は培養容器より、ビペツテ４３− インクではがし、遠沈管に移した。遠心分離（４００Ｘ
（＋　）後、集めた細胞にＭＥＭを加えて懸濁、遠心分
ＩＩ　（４００ＸＱ　）　’？ｊることで血清を除去し
た後、ＭＥＭに再懸濁した。上記稗細胞８．５×１０７
個と５ｐ２１０−Δｇ１４　１．７ｘｌＯ７個を混合し
、よくピペッティングした後、遠心分１ｉｆｔ　（４０
０ｘｇ　）した。上清を除いた後、沈澱を軽く遠沈管を
たたくことでほぐした。ＭＥＭ中に３０％（Ｖ／Ｖ）の
ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ　１０００）を加
えたものを３１℃に保温し、その０．６１をほぐした細
胞に加えた。ゆるやかに撹拌後、５分間室温に置いた。

１×０で遠心を２分間した後、ＭＥＭをゆっくりと５１
添加した。ゆるやかに撹拌後、４００×Ｑで５分間室温
で遠心分離した。土浦をすて、沈澱に５１のＭＥＭを加
え、同様に遠心分離し、上清を除去した。沈澱した細胞
に５１の次の培地を加え、ピペッティングした。培地と
しては、Ｄ−４４− ＭＥＭに１０％（Ｖ／Ｖ　）牛胎児血清、２ｍＭ　（Ｄ
グルタミン、５Ｘ１０　　Ｍのβ−メルカプトエタノー
ル、６０ｍｏ／　Ｌの硫酸カナマイシンを加え、さらに
グルコースを４．５０／Ｌとなるように添加したもの（
Ｄ−ＭＥＭ−ＦＢＳ）を用いた。上記５ｍｌの細胞懸濁
液に３０ｍ１のＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳを加え、その２５ｍ
１ずつを２５ｃｍ　　培養フラスコ（コーニング社。

アメリカ、　Ｃ−２５１００）に分注し、たてて３７℃
で炭酸ガス５％を含む湿った雰囲気中で１晩培養した。

なお、培養は以下同様の条件で行な・った。翌日、軽く
ピペッティングをした後、遠心管に移して、４００ｘ　
ｇで遠心分離した。上清を除去した後、１４−７ ×１０　Ｍヒポキサンチン、４ｘｌＯＭアミノプテリン
および１．６ｘ　１０　　Ｍチミジンを含むＤ−ＭＥＭ
−ＦＢＳ　（ＨＡＴ培地）３５１に懸濁し、その１ｍ１
を２４ウエル培養プレート（Ｎ　ｕｎｃ　１４３９８２
゜Ｎ　ｕｎｃ社、デンマーク）の各ウェルに入れ、１週
４５− 間培養した。その優、０．２５ｍ１のＨＴ培地を２日又
は３日ごとに添加した。１−（Ｔ培地としてはト１Δ丁
培地からアミノプテリンを除いたものを用いた。

Ｂ、抗体産生ハイブリドーマの選択および増殖細胞融合
後、１５日目の上清を用いて酵素結合固相免疫測定法で
、各つＩルの７２４細胞に対する抗体産生の有無を調べ
た。

Ｔ２４細胞をプレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ　３０７２）に
固定し、上記各ウェル中の培養上清４０μｍと室温で２
時間反応させた後、よ＜ＰＢＳで洗浄し、馬血清で１０
００倍に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グ
ロブリン抗体（Ｃａｐｐｅｌ　Ｌａｂ、　　Ｉｎｃ、、
７メリカ、カタログ番号３２１１−０２３１）　　１０
０μｍと２時間反応させた後、よ＜ＰＢＳで洗浄した。

クエン酸緩衝液（０，ＩＭ、　　１）ｌ−１４，５）に
基質（０−フエ二一レンジアミン）を１＋ｎｏ／ｎ＋Ｉ
、　３１％過酸化水素水を０．４μｍ／１加えた溶液を
２００μｍ人れ、３０分発−４６− 色反応を行なわぜた。Ｔ２４細胞と反応する抗体を含有
する２ウエルにつきクローン化を行なった。

クローン化は、限界希釈法を用い、以下の通りに行なっ
た。

抗体産生陽性の２ウエルからハイブリドーマ１００個を
それぞれＤ−ＭＥＩＶＩ−ＦＢＳ中に懸濁し、一方、融
合に使用したと同様の方法でＢＡＬＢ／Ｃマウスより牌
細胞１０　　個をＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳ中に調整し、２種
細胞を混ぜ合せた。細胞密度５×１０６個／ｍ＋となる
ようにＤ−ＭＥＭ−ＦＢＳを加え、０．２１を９６ウエ
／Ｌ／培養プレート（Ｆ　ａｌｃｏｎ３０７２、３　ｅ
ｃｔｏｎ−□　１ｃｋｉｎｓｏｎ社、アメリカ）の各ウ
ェルに入れ、培養した。培養開始１２日後に前述の酵素
結合同相免疫測定法でハイブリドーマの抗体産生の有無
を各ウェルにつき検討した。その結果、後記表−１にあ
る２株（Ｔ−００７およびＴ−００８＞を含め、総計１
０株のハイブリドーマが得られた。

実施例６　ヒト膀胱癌細胞に対゛する抗体の特性インビ
トロで継代されている次の細胞を用いた。

Ｉ　ｎｔｅｓｔｉｎｅ　４０７　（ｅ　を−胎児小腸細
胞株）、ＤＬ１１４５（ヒト前立腺癌細胞株）、２５３
Ｊ　（ヒト腎孟病細胞株）およびＴ２４（ヒト膀胱癌細
胞株）。

実施例５で得られた培養上清を用いて上記細胞との反応
性を実施例１のように、酵素結合固相免疫測定法で調べ
た。後記表−１に示す如＜Ｔ−００７分泌抗体はＴ２４
と強く反応し、他細胞とは胎児小腸細胞株（１−４０７
）を含め、やや、あるいは比較的反応することが認めら
れた。Ｔ−００８に関してはＴ２４と強く反応し、前立
腺癌細胞株（Ｄｕ　１４５　）とやや反応し、他細胞と
は反応しないことが認められた。

Ｂ、螢光抗体法による細胞染色 ハイブリドーマの１つＴ−ｏｏｓ分泌抗体を用いてＴ２
４細胞を間接螢光抗体法で染色した。Ｔ２４細胞を無螢
光のガラススライドに固定し、培養上清５０μｍと３７
℃、４５分個っだ雰囲気中で反応させ、ＰＢＳニ１％牛
１１１１清アルブミン、１０ｍＭ　　ＨＥ　Ｐ　ＥＳ　
（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ／−２−エ
タンスルホン酸）、０．１％アジ化ナトリウムを添加し
た溶液に３分から５分スライドを処理することで洗浄を
３回行なった。フルオレツレイン結合抗マウスＩ　ａ　
Ｇ　（Ｍ　１ｌｅｓ　−Ｙ　ｅｄａ　Ｌ　ｔｄ、、イス
ラエル、コード番号６５−１７１）を２０倍希釈した溶
液５０μｍで上記と同じ条件でさらに４５分反応させた
。

その後、洗浄を上記と同様の手法で行なった。軽く乾燥
させ、炭酸緩衝・グリセリン液（０，０５Ｍ。

ｐｌ−１９，５，１０％グリセリンを含む）を重層し、
カバーグラスをのせ螢光顕微鏡（オリンパス、モデルＡ
Ｈ−ＲＦＬ−ＬＢ）で検鏡した。その結果、Ｔ２４Ｉｗ
ｌ２４℃で強い螢光が観察された。なお、使用したフル
オレツレイン結合抗マウスＩ（ＩＧは、あらかじめＴ２
４細胞で６回吸収操作を行なった。

Ｃ３免疫グロブリンクラスの同定 ハイブリドーマＴ−００７およびＴ−００８が分泌する
抗体の免疫グロブリンクラスの同定を酵素結合固相免疫
測定法で行なった。ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫
グロブリン抗体として、抗免疫グロブリン（１ｇ）、抗
ＴｇＧ、抗ｒｏＭ（いずれもＣａｐｐｅｌ　ｌ　ａｂ、
　　ｒ　ｎｃ、、アメリカ、カタログ番号３２１１−０
２３１．３２１１−００８１．３２１１−０２０１　）
を用いた。

検討した２種の抗体は、いずれも表−１に示すようにＩ
（ＪＧであった。

表−１ 実施例７　抗体の生産 （インごトロ培養による生産）：ハイブリドーマＴ−０
０１，Ｔ−００２，Ｔ−００３，Ｔ−００４，Ｔ−００
５，Ｔ−００６，Ｔ−００７，Ｔ−００８，Ｔ−００９
，Ｔ−０１０，Ｔ−０１１またはＴ−０１２を２０％牛
脂児血清、　２ｍＭグルタミン。

１ｍＭピルビン酸、４．５０／Ｌのグルコース、５×−
ダ １０　　Ｍのβ−メルカプトＴタノールおよび５０ｍｏ
／Ｌの硫酸カナマイシンを含むＤ−ＭＥＭにｌＸｌ０’
個／１になるように懸濁させ、この細胞懸濁液２５ｍ１
を７５ｃｍ　　１１織培養要フラスコ（コーニング社。

アメリカ）に分注し、３７℃で５％炭酸ガスを含む炭酸
ガス培養器中で培養を行なった。増殖がほぼ定常に達し
た４日日に、培養上清を採取した。この時の細胞数はい
ずれも約２×１０　　個／ｍｌであり、上清の抗体含量
は各々　１．９　　μ（Ｊ　／１１１＋、　　３．３μ
９／ｍｌ、　　２，３ｕＱ　／ｍｌ、　　２．６　　ｕ
ｏ　／ｍｌ、　　２，７μｇ／’ｍｌ、　　２．１μｇ
／ｍｌ、　　３．３μ＜１　／ｎ＋ｌ、　　２．０μｇ
／ｍｌ、　　２．１ｕＱ　　／ｍｌ、　　３．１μｏ　
　／ｍｌ、　　４，０ｕｃｉ　　／ｍｌ。

２．３μｏ　／ｍｌであった。

（インビボ培養による生産）ニブリスタン（２，６゜１
０．１４−テトラメチルペンタデカン）　　０．５ｍｌ
を腹腔内に投与後１０日から３００ｕＱＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に、インご１〜口で増殖させたハイブリド
ーマＴ−００１，Ｔ−００２，Ｔ−００３，Ｔ−００４
，Ｔ−００５゜Ｔ−００６，Ｔ−００７，Ｔ−００８，
Ｔ−００９，Ｔ−０１０，Ｔ−０１１またはＴ−０１２
を５×１０　　個接種した。接種後、２ないし３週目に
腹水を採取し、遠心分１（ｉｏｏ。

×Ｑ、４℃、１５分間）により腹水上清を得た。各ハイ
ブリドーマにつき１０匹のマウスから約３０ｍ　ｌの腹
水上清が得られ、その抗体含量は各々１．１ｍｇ／ｍｌ
、　　１．３ｍｇ／ｍｌ、　　２．６ｍｏ／１．　２．
３ｍａ／ｍｌ、　　２．１１１１ｏ／ｍｌ、　　１．７
ｍｏ／ｍｌ、　　２．０ｍＭｍ１．　３．１ｍＭｍ１゜
２．０ｍｇ／ｍｌ、　　１．４１１１０／１１１＋、　
　２．２ｍ（Ｊ／１．　３．Ｏｍｇ／ｍ１であった。

５３− なお、これら抗体を１群１０匹のＩＣＲマウスに２０／
　ｋｇ経口、　　４００１１１Ｍ　ｋ（］腹腔内または
２００＋１１０／　ｋＯ静脈内投与し、１４日間生死を
観察したところ、これら抗体による死亡は全く認められ
なかった。

又、ハイブリドーマの形態、大きさ、性状を表−２に示
す。

−巨　Ａ　− 表−２ 実施例８　抗体とマイトマイシンまたは塩Ｍ　ｌ’　＝
ｔ”ハイブリドーマＴ−００２，Ｔ−００８，またはＴ
　−０１０から得られた抗体（腹水上清を精製した抗体
）を蒸溜水にて１０．４１１１（＋／ＩＩＩに調整し、
これに１３．Ｏｍｇのマイトマイシンを加え、撹拌下に
塩酸で溶液のｐ＋−＋を４．７５に調節しつつ、３．７
ｍｇの１−Ｉチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル
）−カルボジイミド塩酸塩を加えて１０．３０または６
０分間反応させ、酢酸緩衝液（ｐＨ４，７０）　　２ｍ
ｌを添加することにより反応を停止させた。次いで、反
応液を４℃で７２時間、ＳＬの蒸溜水に対して透析した
。なお、透析外液は３回交換した。透析内液を濃縮した
後に、３ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（ファルマシア、ス
ウェーデン）を充填した直径１．５ｃｍ、高さ５５ｃｍ
のカラムを通して反応液中の低分子物質を完全に除去し
、得られた溶液を一２０℃で凍結乾燥し、マイトマイシ
ンと抗体の結合物を得た。なお、抗体１ｍｇ当りのマイ
トマイシンの結合量は表−３に示す通りである。

上記の操作に準じて、抗体とｔｅｌドキソルビシンとを
反応せしめて、結合物を得た。抗体１ｍｇ当りの塩酸ド
キソルビシンの結合量は表−３に示す通りであった。

なお、これら抗体と抗癌剤との結合物（６０分間反応物
）を１群１０匹のＴ　ＣＲＶウスに４００ｍｇ／　ｋｇ
経口、　　１００ｍ（＋／　ｋｇ腹腔内または５０ｍｇ
／　ｋ（ｌ静脈内投与し、１４日間生死を観察したとこ
ろ、これら薬剤投与による死亡は全く認められなかった
。

表−３ −岡− 実施例９　抗体のインビトロ抗腫瘍効果インビトロで継
代されているヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４を用い、抗体およ
び実施例８で得た制癌剤と抗体との結合物質の抗腫瘍活
性を調べた。すなわち、１０％の牛胎児血清を添加した
Ｅａｇｌｅｓ　　ＭＥＭで上記細胞を５×１０＋個／ｎ
＋Ｉの濃度に調整し、５１ずつシャーレに分注し、３７
℃で５％炭酸ガスを含んだ炭酸ガス培養器中で２４時間
培養を行なった。その後、ハイブリドーマＴ−００８由
来抗体又はバイプリドーマＴ−００８由来抗体とマイト
マイシンとの結合物（反応時間６０分間）を加え、さら
に培養を行なった。薬剤添加後、２４時間目に１−　［
Ｕ−”Ｃｌロイシン（Ｒ２Ｏ社、アメリカ、比放射活性
３４２ｍＣ１７ｍ　ｍｏｌｅ）　　１μｃｉ　／ｍｌを
加え、更に２時間培養を行なった。培養終了後、培地を
除き、細胞′を０℃に冷却したＰＢＳ　（ｐＨ７，２）
で３回洗浄し、５％トリクロル酢酸溶液で処理し、洗浄
細胞を濾紙に移して乾燥させた。そして、液体シンチレ
ーションカウンター（パラカード社。

アメリカ）を用いて、細胞内蛋白質に取り込まれた放射
活性を測定した。

その結果、第１図に見られるように、マイトマイシンと
抗体との結合物添加により、放射活性取り込みの５０％
阻害濃度が対照に比して減少した。

実施例１０　　抗体のインビボ抗腫瘍効果１群１０匹の
雌ｆｆＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕｖウスにヒト膀胱癌細
胞株Ｔ２４を６ｘ　１０’個／匹、腹腔内移植し、５時
間後及び７２時間後にハイブリドーマＴ−〇〇８由来抗
体またはハイブリドーマＴ−００８由来抗体とマイト−
マイシンとの結合物（６０分間反応物質、マイトマイシ
ンとして５０μｇ／ｌ）を４５０μＯ／匹（マイトマイ
シン換算２０μｑ／匹）腹腔内投与し、６０日間生存率
を観察することにより、投与薬−剤の抗腫瘍活性を調べ
た。

その結果、第２図に見られるように、マイトマイシンと
抗体との結合物投与により５０％生存日数の延長がみら
れた。また、抗体単独投与でも延命傾向がみられた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例９のマイトマイシン−抗体の結合物に
よるインビトロ殺細胞効果を示す図であり、第２図は、
実施例１０のマイトマイシン−抗体の結合物によるイン
ビボ抗ｍｓ効果を示す図である。 ６１− メ　　　第１図 ＝ ７１ドア丁シン　（、ｕｃｙｍｌ） ｖＬ株（ｍ９／而） 国立車乗２−１９−４６ −１８３−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　抗ヒト膀胱癌抗体産生細胞とインビトロにおい
   て長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマによ
   り分泌される抗体の一種またはそれ以上を含有するヒト
   膀胱癌治療用薬剤。 （２）　担体または希釈剤を含有することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の薬剤。 （３）　該ヒト膀胱癌がヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に
   記載の薬剤。 （４）　該抗体がハイブリドーマＴ−００１，Ｔ−００
   ２゜Ｔ−００３，Ｔ−００４，Ｔ−００５，Ｔ−００６
   ，Ｔ−００７，Ｔ−００８，Ｔ−００９，Ｔ−０１０，
   Ｔ−０１１またはＴ−０１２により分泌される抗体であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の薬剤
   。 （５）　ヒトまたは動物用であることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の薬剤。 （６）　抗ヒト膀胱癌抗体産生細胞とインビトロにおい
   て長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマによ
   り分泌される抗体に抗癌剤を化学的に結合させた物質。 （７）　該抗癌剤がマイトマイシンまたは塩酸ドキソル
   ビシンであることを特徴とする特許請求の範囲第６項に
   記載の物質。 （８）　該ヒト膀胱癌がヒト膀胱癌細胞株−「２４であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第６項または第１項
   に記載の物質。 （９）　該抗体がバイブリド−ｖＴ−００１，’ｒ−０
   ０２゜Ｔ−００３，Ｔ−００４，Ｔ−００５’、　Ｔｍ
   ２Ｏ３，Ｔ−００７，Ｔ−００８，Ｔ’−００９，Ｔ−
   ０１０，Ｔ−０１１マタｔ、ｔＴ−０１２ニヨり分泌さ
   れる抗体であることを特徴とする特許請求の範囲第８項
   に記載の物質。 （１０）　　抗ヒト膀胱癌抗体産生細胞とインビトロに
   おいて長期継代培養可能な細胞との間のハイブリドーマ
   により分泌される抗体に抗癌剤を化学的に結合させた物
   質の一種またはそれ以上を含有するヒト膀胱癌治療用薬
   剤。 （１１）　　担体または希釈剤を含有することを特徴と
   する特許請求の範囲第１０項に記載の薬剤。 （１２）　　該抗癌剤がマイトマイシンまたは塩酸ドキ
   ソルビシンであることを特徴とする特許請求の範囲第１
   ０項または第１１項に記載の薬剤。 〈１３）　　該ヒト膀胱癌がヒト膀胱癌細胞株Ｔ２４で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１０項乃至第１
   ２項のいずれかに記載の薬剤。 （１４）　　該抗体がハイブリドーマＴ−００１，Ｔ−
   ００２゜Ｔ−００３，Ｔ−００４，Ｔ−００５，Ｔ−０
   ０６，Ｔ−００７，Ｔ−００８，Ｔ−００９，Ｔ−０１
   ０，Ｔ−０１１またはＴ−０１２により分泌される抗体
   であることを特徴とする特ｎ請求の範囲第１３項に記載
   の薬剤。 （１５）　　ヒ１−または動物用であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１０項乃至第１４項のいずれかに記
   載の薬剤。 （１６）　　特許請求の範囲第１項乃至第５項および第
   １０項乃至第１５項のいずれかに記載の薬剤を用いるこ
   とからなるヒト膀胱癌の治療法。