-
Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen
Antikörper, der spezifisch ein Synaptophysin erkennt.
-
Von Wiedenmann et al. wurde 1985 ("Cell", 41, 1017-1028) in
Rinderhirn ein Synaptophysin entdeckt. Bei dem Synaptophysin
handelt es sich um ein saures Glycoprotein, welches sich auf
der Membran eines synaptischen Bläschens findet und ein
Molekulargewicht von etwa 38 000 aufweist. Andererseits
wurde von Jahn et al. 1985 ("Proc. Natl. Acad. Sci. USA",
82, 4137-4141) in Rattenhirn ein P-38 entdeckt. Bei einer
Nucleotidsequenzanalyse des Synaptophysins und des P-38
zeigte es sich, daß es sich um identische Proteine handelt.
-
Da das Synaptophysin und das P-38 lokal in synaptischen
Bläschen vorhanden sind, dienen sie als Nachweismarker für
einen synaptische Bläschen festhaltenden neuroendokrinen
Tumor. Der neuroendokrine Tumor entsteht in endokrinen Organen
mit synaptischen Bläschen, z.B. in der Hypophyse und
Bauchspeicheldrüse. Der Tumor metastasiert jedoch auch zu anderen
als endokrinen Organen ohne synaptische Organe. Wird das
Synaptophysin in einem Organ ohne synaptische Bläschen
nachgewiesen, ist davon auszugehen, daß das betreffende Organ
den Tumor enthält und daß der Tumor aus dem genannten
endokrinen Organ metastasiert hat. Somit eignet sich der
erfindungsgemäße Synaptophysin-spezifische monoklonale Antikörper
zur Lokalisierung eines primären Herds des neuroendokrinen
Tumors.
-
Ein derzeit kommerziell erhältlicher monoklonaler Antikörper
für das Synaptophysin oder das P-38 ist ein zur
Immunglobulinklasse G gehörender monoklonaler Antikörper.
-
Da der übliche bekannte monoklonale Antikörper für das
Synaptophysin zu einer Immunglobulinklasse G gehört, stehen in
jedem Molekül lediglich zwei Bindungsstellen für Antigen und
Komplement zur Verfügung. Aus diesem Grunde benötigt man zu
einer quantitativen Analyse einer sehr geringen Menge Synap
tophysin in Geweben nach einem Komplementfixiertest eine
große Menge Antikörper, was unbequem ist.
-
Die Herstellung eines gegen Synaptophysin gerichteten
monoklonalen Antikörpers SY38 und eines gegen Synaptophysin
gerichteten polyklonalen Antikörpers, d.h. der Unterklasse des
gegen Synaptophysin gerichteten monoklonalen Antikörpers
SY38, bei dem es sich um IgG handelt, ist aus der EP-A-
0 431 567 bekannt.
-
Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern der Klasse IgM
und IgG selektierte Hybridome sind aus der WO-A-8304313
bekannt.
-
Zu der vorliegenden Erfindung kam es in Kenntnis der
geschilderten Situation. Die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung besteht darin, die Durchführung einer quantitativen
Analyse von Synaptophysin nach einem Komplementfixiertest
unter Verwendung einer geringen Menge Antikörper selbst bei
nur sehr geringer Menge an Synaptophysin in einem
biologischen Gewebe zu ermöglichen. Genauer gesagt, besteht die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitsstellung
eines Synaptophysin-spezifischen monoklonalen Antikörpers,
der zu einer Immunglobulinklasse M gehört.
-
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind das Hybridom
RB2-4 FERM BP-3944 und der durch das Hybridom RB2-4 FERM BP-
3944 produzierte monoklonale Antikörper. Ferner wird eine
den monoklonalen Antikörper enthaltende pharmazeutische
Zubereitung bereitgestellt.
-
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper wurde unter
Verwendung eines Rattenhirnextrakts als Immunogen gewonnen,
wobei der monoklonale Antikörper zur Immunglobulinklasse M
gehört und spezifische Reaktionsfähigkeit für ein
Synaptophysin oder P-38 aufweist.
-
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper besitzt eine
spezifische Reaktionsfähigkeit für ein von einem die
Nucleotidsequenz entsprechend der Sequenz Nr. 1 im
Sequenzprotokoll (worin A, C, G und T Adenin, Cytosin, Guanin bzw.
Thymin bedeuten) umfassenden Gen exprimiertes Protein.
-
Die Erfindung wird durch die folgende detaillierte
Beschreibung im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen noch
besser verständlich. In den Zeichnungen zeigen:
-
Fig. 1 eine Photographie des SDS-PAGE-Entwicklungsmusters
eines Rattenhirnhomogenats und der Spezifität
eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers
und
-
Fig. 2A und 2B Darstellungen einer Homologie zwischen
der erfindungsgemäß ermittelten und bestätigten
Nucleotidsequenz eines Rattensynaptophysingens und
der Nucleotidsequenz eines bekannten
Rattensynaptophysingens.
-
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden detailliert
beschrieben.
-
Zunächst wird die Herstellung eines erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörpers erläutert.
-
Der monoklonale Antikörper kann nach einer üblichen
monoklonalen Antikörpertechnik hergestellt werden. Hierbei wird
eine Antikörper produzierende Zelle, die aus einem mit
Rattenhirnextrakt immunisierten Säugetier gewonnen wurde, mit
einer geeigneten Tumorzelle (beispielsweise einem Myelom)
eines Tiers verschmolzen, um ein einen gewünschten
Antikörper produzierendes Hybridom herzustellen. Dieses Hybridom
wird geklont und gezüchtet, um einen erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper herzustellen.
-
Genauer gesagt, läßt sich ein erf indungsgemäßer monoklonaler
Antikörper wie folgt herstellen:
a) Gewinnung einer Antikörper produzierenden Zelle
-
Zur Gewinnung eines einen erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper produzierenden Hybridoms wird eine Säugetierzelle
unter Verwendung von Rattenhirnextrakt immunisiert.
-
Als Säugetiere zur Gewinnung einer einen erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper produzierenden Zelle können übliche
Labor(versuchs)tiere, wie Mäuse, Ratten, Kaninchen und
Meerschweinchen, verwendet werden, bevorzugt werden jedoch Mäuse
verwendet.
-
Zur Immunisierung eines Säugetiers kann ein
Rattenhirnextrakt als Immunogen beispielsweise intraperitoneal oder
subkutan in eine Maus injiziert werden. Die Dosis pro Injektion
beträgt vorzugsweise 0,2 ml/Maus des Immunogens. Dieses wird
zur Injektion als Mischung mit einer äquivalenten Menge
eines Adjuvans benutzt. Diese Injektion wird jede Woche oder
alle zwei Wochen wiederholt und mehrmals durchgeführt. Die
endgültige Immunisierung erfolgt durch intravenöse oder
intraperitoneale Injektion von 0,2 - 0,4 ml/Maus des
Immunogens ohne Vermischen desselben mit dem Adjuvans. 3 bis 4
Tage nach der endgültigen Immunisierungsinjektion wird die
Milz der Maus herausgeschnitten, wobei dann Antikörper
produzierende Zellen erhalten werden.
b) Herstellung einer Tumorzelle
-
Eine mit der Antikörper produzierenden Zelle zu
verschmelzende Tumorzelle wird wie folgt hergestellt:
-
Erfindungsgemäß wird als Tumorzelle im allgemeinen eine
Myelomzelle verwendet. Die Herkunft der Tumorzelle ist nicht
auf eine spezielle Herkunft beschränkt. Vielmehr kann jede
von einem Säugetier, z.B. einer Maus, einer Ratte, einem
Kaninchen oder vom Menschen herrührende Zellinie verwendet
werden. Von diesen wird vorzugsweise eine Mäusezellinie
verwendet. Im allgemeinen wird eine Tumorzellinie mit einem
geeigneten Selektionsmarker, z.B. einem
Hypoxanthin-Guanin-Pphosphoribosyltransferasemangel (HGPRT&supmin;) oder
Thymidinkinasemangel (TK&supmin;) verwendet. Beispiele für diese Zellinie sind
P3-X63-Ag8, P3-X63-Ag8-U1 und SP20-Ag8-6.5.3. Sämtliche
dieser Tumorzellen sind 8-Azaguanin-resistente Zellinien und
können nicht in einem HAT-Medium (mit Hypoxanthin,
Aminopterin und Thymidin) wachsen gelassen werden.
c) Zeilverschmelzung
-
Die Antikörper produzierende Zelle wird mit der Tumorzelle
verschmolzen.
-
Als Medium bei der Zeilverschmelzung kann ein durch Zusatz
von 10% CS (Kaibserum), 5% FCS (fötales Kaibserum) + 5% CS
oder 10% FCS zu einem allgemein benutzten essentiellen
Medium, wie Eagle'schem essentiellem Minimalmedium (MEM),
einem Dulbecco'schen modifizierten Eagle-MEM oder Rosewell
Park Memorial Institute (RPMI) 1640, gewonnenes Medium
verwendet werden. Zur Subzüchtung von Mutterzellen kann eine
beliebige Kombination aus Serum und dem genannten
essentiellen Medium verwendet werden. Wenn jedoch ein Hybridom
hergestellt werden soll, wird ein 10% FCS enthaltendes Medium
bevorzugt.
-
Die Zellverschmelzung erfolgt durch Vermischen der beiden
Mutterzellen, d.h. der Tumorzellen (beispielsweise
Myelomzellen) und der immunisierten Splenocyten (d.h. der
Antikörper produzierenden Zellen), im Verhältnis 1/5 bis 1/20 in
Gegenwart eines Verschmelzungsbeschleunigers. Beispiele für
den Verschmelzungsbeschleuniger sind ein HVJ
(hämagglutinierendes Virus aus Japan) und Polyethylenglykol (PEG). Als
Verschmelzungsbeschleuniger werden 30% - 50% PEG 1500
besonders bevorzugt.
d) HAT-Hybridomselektion
-
Ein Hybridom wird in dem HAT-Medium selektiert. Die im
Rahmen des Verfahrens c) erhaltenen verschmolzenen Zellen
werden in geeigneter Weise mit beispielsweise RPMI1640 mit 20%
FCS verdünnt und auf einer Mikrokulturplatte (normalerweise
einer Platte mit 96 oder 24 Ausnehmungen) in einer
Konzentration von etwa 10&sup4; bis 10&sup6;/100 µl/Ausnehmung ausgesät.
Dann wird in jede Ausnehmung das HAT-Selektionsmedium
eingetragen. Die Züchtung erfolgt unter Austausch des Mediums
durch neues Medium im allgemeinen täglich oder alle zwei
Tage.
-
Wenn eine 8-Azaguanin-resistente Zellinie als Tumorzellen
verwendet wird, sterben nichtverschmolzene Myelomzellen und
verschmolzene Myelom-Myelom-Zellen in dem HAT-Medium
innerhalb von etwa 7 Tagen ab. Auch Splenocyten können in-vitro
nicht über zwei Wochen hinaus wachsen, da es sich um normale
Zellen mit vorgegebener Lebensdauer handelt. Folglich werden
sämtliche Zellen, die 7 bis 10 Tage nach Züchtungsbeginn
(noch) wachsen, als verschmolzene Milz-Myelom-Zellen
angesehen.
e) Hybridomscreening
-
Die nach den Maßnahmen d) selektierten Hybridome werden
gescreent. Die Hybridomklone, die einen gewünschten Antikörper
sezernieren, werden nach einem bekannten Verfahren, z.B.
einem ELISA-Test (enzymverknüpfter Immunosorptionstest) oder
einer Immunblottingmethode unter Verwendung eines
Kulturüberstands jeder Ausnehmung, in der Hybridome gewachsen
sind, "gepflückt".
f) Klonung
-
Ein durch Screenen gewonnenes gewünschtes Hybridom wird
geklont. Zwei oder mehrere Arten von Hybridomen, die
unterschiedliche Antikörper produzieren, können in jeder
Ausnehmung gezüchtet werden. Aus diesem Grunde kann die Klonung
unter Benutzung einer Grenzwert-Verdünnungsanalyse zur
Gewinnung einzelner Hybridomklone, die den gewünschten
monoklonalen Antikörper produzieren, durchgeführt werden.
g) Gewinnung von monoklonalem Antikörper
-
Das im Rahmen des Verfahrens f) gewonnene Hybridom wird zur
Bildung des gewünschten monoklonalen Antikörpers gezüchtet.
-
Dieses Hybridom kann in vitro oder in vivo gezüchtet werden.
Wird es in-vitro gezüchtet, kann das hierbei verwendete
Kulturmedium aus dem zuvor genannten, durch Zusatz von CS oder
FCS zu dem normalen Medium gewonnenen Medium bestehen. Nach
3- bis 5-tägiger Züchtung des Hybridoms in diesem Medium
kann der gewünschte Antikörper aus dem Überstand des Mediums
gewonnen werden. Wird es in-vivo gezüchtet, wird einem Tier
derselben Art, aus der auch das Myelom herkommt,
intraperitoneal ein Mineralöl wie Pristan
(2,6,10,14-Tetramethylpentadecan)
injiziert. Nach Ablauf mindestens einer Woche
wird das Hybridom intraperitoneal injiziert. Nach 7 bis 14
Tagen wird das angestaute Bauchwasser gesammelt, um den
gewünschten Antikörper zu gewinnen.
-
Nun wird ein Gen, welches durch den erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper erkanntes Synaptophysin exprimiert,
beschrieben.
-
Das Gen läßt sich nach folgenden Maßnahmen gewinnen. Eine
aus Rattenhirn unter Verwendung eines λgt11-Vektors
erstellte cDNA-Bibliothek wird in geeignete Wirtzellen
transfiziert, wobei das Synaptophysingen exprimiert wird. Ein
durch die Wirtzellen produziertes Protein wird unter
Verwendung eines Antikörpers mit spezifischer Bindung an das
Rattensynaptophysin gescreent, wobei ein Vektor selektiert
wird, in welchem ein gewünschtes cDNA-Fragment insertiert
ist. Der selektierte Vektor wird zur Gewinnung des
Synaptophysingens amplifiziert.
-
Genauer gesagt, läßt sich das Gen, welches das durch den
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper erkannte
Synaptophysin exprimiert, nach folgenden Maßnahmen herstellen:
h) Screening
-
Wirtzellen (beispielsweise E.coli) werden in einem
geeigneten Medium gezüchtet. In die Wirtzellen wird eine
Rattenhirn-cDNA-Bibliothek, die in den von dontech Inc.
erhältlichen λgt11-Vektor insertiert worden ist, transfiziert. Die
Transfektion der cDNA-Bibliothek kann derart erfolgen, daß
beispielsweise E.coli in einem geeigneten Medium, z.B. LBM-
Medium, gezüchtet und dann die E.coli-Suspension mit der
Suspension des Phagenvektors mit insertierter cDNA in einer
Menge von 5 x 10&sup4; pfu Phagenvektorsuspension auf 1 µl
E.coli-Suspension infiziert wird. Das erhaltene Gemisch wird
auf einer Agarplatte ausgestrichen und darauf zur Bildung
von Plaques gezüchtet. Eine IPIG-getränkte N.C.
(Membranfilter) wird auf die gebildeten Plaques gelegt und
danach inkubiert. Ein durch die Expression der in den Vektor
insertierten cDNA produziertes Protein wird auf die
Nitrocellulosemembran übertragen.
-
Der gegen Synaptophysin gerichtete monoklonale Antikörper
wird mit dem Protein auf der Nitrocellulosemembran zur
Reaktion gebracht. Danach erfolgt eine Reaktion mit einem
markierten Antikörper mit der Fähigkeit zu einer spezifischen
Bindung mit diesem gegen Synaptophysin gerichteten
Antikörper. Nach der Reaktion wird eine zum Nachweis des
Antikörpermarkers erforderliche Behandlung durchgeführt, um einen
Fleck aufzufinden, in dem der Marker vorhanden ist. Durch
Suchen nach der diesem Fleck entsprechenden Plaque kann man
einen ein gewünschtes Genfragment für Rattensynaptophysin
enthaltenden Vektor gewinnen.
i) Amplifikation des Vektors mit Rattensynaptophysingen
-
Das nach dem Verfahren h) gescreente Synaptophysingen wird
amplifiziert.
-
Der Vektor, von dem bestätigt wurde, daß er ein
Rattensynaptophysingenfragment enthält, läßt sich durch Züchten der mit
dem Vektor transfizierten Wirtzelle nach einer
Plattenlysat(ansatz)-Methode oder einer Flüssigkulturmethode
amplifizieren.
j) Herstellung eines Rattensynaptophysingens
-
Aus dem amplifizierten Vektor wird ein Zielgen hergestellt.
-
Aus den Wirtzellen wird lediglich eine Phage mit einem
Rattensynaptophysingenfragment gewonnen. Die gewonnene Phage
wird mit Hilfe von Chloroform lysiert. Danach werden
Proteine
beispielsweise mit Phenol entfernt. Nach Entfernung
der Proteine erhält man eine ein
Rattensynaptophysingenfragment enthaltende DNA durch Fällung mit Ethanol.
-
Wie zuvor ausgeführt, kann der erfindungsgemäße monoklonale
Antikörper spezifisch an Synaptophysin gebunden werden.
Somit eignet sich eine den erfindungsgemäßen monoklonalen
Antikörper und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder
ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel enthaltende
pharmazeutische Zubereitung zur Diagnose eines
neuroendokrinen Tumors aufgrund der Anwesenheit von Synaptophysin als
Marker.
-
Um die Diagnose zu ermöglichen, muß der erfindungsgemäße mo
noklonale Antikörper markiert werden. Es kann jeder Marker
verwendet werden, so lange er nur nach Einführung in einen
Körper nachgewiesen werden kann. Zweckmäßigerweise sollte
jedoch als Marker ein Radioisotop verwendet werden, da
derzeit eine nach einer Szintigraphiemethode durchgeführte
abbildende Diagnose, über die später noch berichtet werden
wird, recht populär ist. In Abhängigkeit von der
Halbwertszeit, der Strahlungsart, der gewünschten Diagnose u.dgl.
kann als Marker jedes Radioisotop verwendet werden, obwohl
zweckmäßigerweise ein Radioisotop zum Einsatz gelangt,
welches in dem gewünschten inneren Organ wahrscheinlich
gespeichert wird. Spezielle Beispiele für als Marker verwendete
Radioisotope sind &sup9;&sup9;mTc, ¹¹¹In, ¹²³I, ¹³¹I, ²&sup0;¹Ti, &sup7;&sup5;Se,
¹&sup6;&sup9;Yb und &sup6;&sup7;Ga.
-
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zubereitung kann jede Art Träger oder Verdünnungsmittel, der
bzw. das aus pharmazeutischen Gesichtspunkten akzeptabel ist
und somit allgemein zum Einsatz gelangt, verwendet werden.
Es ist auch möglich, mehrere Träger oder Verdünnungsmittel
gemeinsam zu verwenden. Zweckmäßigerweise bedient man sich
einer sterilen und wäßrigen isotonischen Suspension oder
Lösung einschließlich beispielsweise einer physiologischen
Kochsalzlösung und einer phosphatgepufferten physiologischen
Kochsalzlösung.
-
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann
nichtral, z.B. subkutan, intramuskulär, intravenös oder
intraperitoneal, verabreicht werden.
-
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann in
einer Menge von 1 - 100 mg/kg, zweckmäßigerweise 1 - 10
mg/kg Säugetierkörpergewicht verabreicht werden. Allerdings
hängt die Verabreichungsmenge vom Alter und Gewicht des
Patienten, dem Verabreichungsweg u.dgl. ab.
-
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann nach
einer Standardmethode hergestellt werden.
-
Im folgenden wird kurz die mit der erfindungsgemäßen
pharmazeutischen Zubereitung durchgeführte Diagnosemethode
beschrieben.
-
Derzeit wird für die Diagnose zumeist eine szintigraphische
Methode benutzt. Bei der szintigraphischen Methode wird
einem Körper ein Gamma-Strahlen abstrahlendes Isotop
verabreicht. Eine gegebene Zeit später (nach der Verabreichung)
wird die Radioaktivitätsverteilung eines gewünschten Organs
oder des gesamten Körpers mit einem Scintiscanner oder einer
Scintikamera gemessen. Die hierbei gemessene
Radioaktivitätsverteilung wird mit Hilfe eines elektronischen Computers
auf einem Schirm als bildliche Darstellung wiedergegeben.
Selbstverständlich dient die bildliche Darstellung zur
Diagnose zum Nachweis eines erkrankten Teils eines Organs, d.h.
eines Bereichs hoher oder niedriger Isotopenkonzentration.
-
Genauer gesagt wird eine gegebene Zeit nach Verabreichung
einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zubereitung eine
bildliche Darstellung eines Organs mit einem erkrankten Teil
(eines Organs, das ursprünglich keine synaptischen Bläschen
aufweist) auf einem Schirm abgebildet. Auf diese Weise wird
eine Diagnose möglich, ob es sich bei dem erkrankten Teil um
einen neuroendokrinen Tumor handelt oder nicht.
-
Wenn der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper verwendet
wird, kann von den auf beispielsweise Nitrocellulose
übertragenen, in einer ELISA-Platte adsorbierten oder in einem
Gewebepräparat, z.B. einem Gewebeschnitt, enthaltenen
Proteinen auf einfache Weise lediglich Synaptophysin
nachgewiesen werden. Als Testmethode seien beispielsweise ein
indirekter Enzymimmunotest oder eine indirekte
Fluoreszenzantikörpertechnik in Kombination mit einem mit einem Enzym oder
einem fluoreszierenden Farbstoff markierten Anti-Maus-IgM-
Antikörper genannt.
-
Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper gehört einer
Immunglobulinklasse M an und besitzt 10 Bindungsstellen für
Antigen oder Komplement in einem Molekül. Wird mit Hilfe des
erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers ein
Komplementfixiertest durchgeführt, lassen sich im Vergleich zu einer
Analyse unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers der
üblichen IgG-Klasse bei geringerer Antikörpermenge eine
höhere Empfindlichkeit erreichen und eine sehr geringe Menge
Rattensynaptophysin quantitativ bestimmen.
-
Man kann unter Verwendung einer den erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper enthaltenden pharmazeutischen
Zubereitung auch diagnostizieren, ob der neuroendokrine Tumor
metastatisch ist oder nicht. Weiterhin läßt sich im Falle der
Verwendung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zubereitung ein erkrankter Teil unter Verwendung einer
Szintillationsabtastmethode
und eines elektronischen Computers
leichter feststellen als im Falle einer üblichen Diagnose mit
Röntgenstrahlen.
-
Im folgenden werden erfindungsgemäße Beispiele im einzelnen
beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen
Rattenhirnproteine
(1) Immunogenherstellung
-
Sofern nicht anders angegeben, werden bei der folgenden
Herstellung die einzelnen Schritte bei 0 - 4ºC durchgeführt.
Ein 0,5 mM Proteaseinhibitor PMSF wurde in Wasser und - im
Bedarfsfall - Lösungen eingetragen.
-
Nach Zugabe des dreifachen Volumens der Pufferlösung A (0,32
mM Saccharose, 20 mM Triszitronensäure-Pufferlösung) zu
Rattenhirn wurde letzteres homogenisiert. Das Homogenat als
solches kann als Immunogen verwendet werden. In Beispiel 1
wurde jedoch das nach dem Filtrieren des Homogenats durch
ein Nylonsieb (Maschenweite: 133 µm und 77 µm) erhaltene
filtrierte Homogenat auf ein gleiches Volumen Pufferlösung A
geschichtet und 10 min lang bei 1000 g zentrifugiert. Nach
dem Zentrifugieren wurde der Überstand gesammelt. Dieser
Überstand wurde 30 min lang bei 10 000 g zentrifugiert. Der
hierbei erhaltene Niederschlag wurde gesammelt (der als
Niederschlag erhaltene Extrakt wird im folgenden als
"P2-Fraktion" bezeichnet). Der beim zweiten Zentrifugieren erhaltene
Überstand wurde 150 min lang bei 100 000 g weiter
zentrifugiert, um einen weiteren Niederschlag zu gewinnen (der als
dieser Niederschlag erhaltene Extrakt wird im folgenden als
"P3-Fraktion" bezeichnet). Diese Fraktionen dienen einzeln
oder in Mischung in einem zur Gewinnung eines Immunogens
geeigneten Verhältnis als Immunogen.
(2) Immunisierung eines Tiers
-
Das gemäß (1) erhaltene Immunogen und ein komplettes
Freundsches Adjuvans in gleichen Volumina wurden in 1-ml-
Spritzen aufgezogen. Die Spritzen wurden mit Nadeln
versehen, um das Immunogen und das komplette Freundsche
Adjuvans zu rühren, bis das Immunogen mit dem Hilfsmittel
emulgiert war. Diese Emulsion wurde dann zur Durchführung
einer Immunisierung intraperitoneal in eine Maus injiziert.
Das heißt, es wurde folgendes Experiment durchgeführt:
-
Grundsätzlich folgte die zweite Immunisierung 2 Wochen nach
der ersten Immunisierung. Ein Booster erfolgte 2 Wochen nach
der zweiten Immunisierung, um diese zu vervollständigen. Die
Zellverschmelzung bzw. -fusion wurde 3 Tage nach dem Booster
durchgeführt. Wenn die Anzahl der Tage eingestellt werden
mußte, wurde der Booster verzögert, um die Zahl der Tage
anzupassen. Der Antikörpertiter wurde derart getestet, daß aus
der Schwanzvene der Maus 2 - 7 Tage nach der Immunisierung
Blut entnommen und unter Verwendung von dessen Serum ein
Immunblotting (welches später noch näher beschrieben werden
wird) durchgeführt wurde.
(3) Zellverschmelzung bzw. -fusion
-
Die durch die Maßnahmen (2) immunisierte Maus wurde durch
Ausrenken ihrer zervikalen Wirbel zur Entnahme ihrer Milz
getötet. Die Milz wurde in eine 6-cm-Schale, in der sich
ml RPMI befanden, gelegt. Extrafett wurde daraus entfernt.
Die Milz wurde in zwei 6-cm-Schalen, die jeweils 5 ml des
RPMI enthielten, gewaschen. Dann wurde die Milz auf einem
abgekanteten, 5 cm quadratischen Netz aus nichtrostendem
Stahl mit einer Pinzette gerieben, um Zellen abzutrennen.
Die einzeln abgetrennten Zellen wurden in ein
Zentrifugenröhrchen überführt und zweimal durch Zentrifugieren mit 10
ml des RPMI gewaschen. Zu den gefällten Zellen wurde 0,17 M
NH&sub4;Cl zugesetzt, um die Zellen in Eis 5 min lang zu
hämolysieren. Nach der Hämolyse wurden die Zellen mit 5 ml RPMI
versetzt, dann 5 min lang bei 1600 min&supmin;¹ zentrifugiert. Die
gefällten Zellen wurden mit RPMI gewaschen und auf ein
Volumen von 20 ml gebracht, wobei eine Splenocytensuspension
erhalten wurde.
-
Andererseits wurde ein Myelom in logarithmischer
Wachstumsphase in einer Menge entsprechend 2 bis 4 Schalen durch 5-
minütiges Zentrifugieren bei 1200 min&supmin;¹ gesammelt. Das
gesammelte Myelom wurde zweimal mit serumfreiem RPMI gewaschen
und dann zur Zubereitung einer Myelomsuspension endgültig in
ml des RPMI suspendiert. Die Anzahl der in der
Splenocytensuspension und in der Myelomsuspension enthaltenen
Zellen wurde gezählt. Die Myelomsuspension wurde in einer
solchen Menge zu der Splenocytensuspension zugegeben, daß das
Verhältnis Myelomzahl/Splenocytenzahl 1/5 bis 1/20 betrug.
Das erhaltene Gemisch wurde 5 min lang zentrifugiert. Nach
Entfernen des Überstands wurden die Splenocyten und das
Myelom suspendiert. Die gesamten 0,3 ml 50%igen
Polyethylenglykols 1500 (in 75 mM Hepes) wurden rasch zu den Zellen
zugegeben. Die Zellsuspension wurde augenblicklich gründlich
gerührt. Unter fortgesetztem Rühren wurde die Suspension mit
dem RPMI versetzt. Die erhaltene Suspension wurde 5 min lang
bei 1 000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Der Niederschlag wurden mit
50 ml eines HAT-Mediums (ein RPMI-FCS mit Hypoxanthin in
einer Endkonzentration von 1 x 10&supmin;&sup7; M, Aminopterin in einer
Endkonzentration von 4 x 10&supmin;&sup4; M und Thymidin in einer
Endkonzentration von 16 x 10&supmin;&sup4; M) versetzt. Dann wurde die
erhaltene Suspension in zwei 24 Ausnehmungen aufweisende
Platten in einer Menge von 500 µl/Ausnehmung und etwa drei 96
Ausnehmungen aufweisende Platten in einer Menge von 100
µl/Ausnehmung ausgesät. Nach 4 bis 5 Tagen wurde das HAT-Medium
zu den 24 Ausnehmungen aufweisenden Platten in einer Menge
von etwa 1 ml/Ausnehmung und zu den 96 Ausnehmungen
aufweisenden Platten in einer Menge von etwa 100 µl/Ausnehmung
zugegeben. Hierbei zeigte es sich, daß innerhalb von etwa
1 Woche in nahezu sämtlichen Ausnehmungen Hybridome
gewachsen waren. Die Hybridome wurden weiter gezüchtet. Ihre
Überstände dienten zum Screening nach der Immunblottingmethode.
(4) Selektion und Klonen des Hybridoms
-
Das nach den Maßnahmen (1) hergestellte Immunogen wurde
derart verdünnt, daß die Gesamtmenge an Proteinen einige
mg/ml betrug. Die erhaltene verdünnte Lösung diente als
Antigenlösung. Nach Durchführung der SDS-PAGE des Antigens
wurden die Proteine durch Elektrophorese gemäß der von
Towbin et al. (1979) vorgeschlagenen Methode auf eine
Nitrocellulosemembran übertragen. Die Nitrocellulosemembran wurde
mit einem geeigneten Blockiermittel, z.B. Block Ace (von
Dainippon-Pharrnaceutical Co. erhältlich) 1 h bis über Nacht
blockiert. Die blockierte Nitrocellulosemembran wurde
zusammen mit dem Kulturüberstand als primärer Antikörper zum
Screening inkubiert. Danach wurde die Nitrocellulosemembran
jeweils dreimal 15 min lang mit TBS gewaschen. Dann wurde
die Nitrocellulosemembran inkubiert und mit einem
Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Ziege-Antimaus-Antikörper
zur Reaktion gebracht. Die umgesetzte Nitrocellulosemembran
wurde dreimal jeweils 15 min lang mit TBS gewaschen. Eine
durch Zusatz des 1/100-fachen Volumens von 1% CoCl&sub2; 6H&sub2;O,
des 1/100-fachen Volumens von 1% (NH&sub4;)&sub2;Ni(SO&sub4;)&sub2; 6H&sub2;O und des
1/500-fachen Volumens einer Wasserstoffperoxidlösung zu 100
µg/ml Diaminobenzidintetrahydrochlorid in 50 mM Tris-HCl
(pH-Wert: 7,5) erhaltene Farbentwicklungslösung wurde zum
Nachweis eines Produkts einer Farbentwicklungsreaktion
verwendet. Nach Durchführung einer akzeptablen Färbung wurde
die Nitrocellulosemembran in destilliertem Wasser gewaschen
und getrocknet. Als Ergebnis der zuvor erwähnten
Suchoperation wurden Ausnehmungen, aus denen Kulturüberstände mit
hoher
Aktivität entnommen worden waren, selektiert. Die
Hybridome dieser Ausnehmungen wurden durch die
Grenzwert-Verdünnungsanalyse unter Verwendung von Mausthymozyten als
Futterzellen geklont, wobei ein Klon erhalten wurde. Das hierbei
erhaltene Hybridom RB2-4 wurde bei dem Fermentation Research
Institute, the Agency of Industrial Science and Technology,
1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter
der Hinterlegungsnr. FERM BP-3944 hinterlegt. Das Hybridom
wurde zur Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers
gezüchtet. Dieser monoklonale Antikörper wurde mit RB2-4
bezeichnet.
-
Unter Verwendung eines von Amersham, Inc. erhältlichen Sub-
Isotypisierungsbestecks wurde eine Untersuchung
durchgeführt. Es zeigte sich, daß die Unterklasse dieses
Antikörpers IgM war.
Beispiel 2
Untersuchung der Reaktionsspezifität von RB2-4
-
Die Reaktionsspezifität von RB2-4 wurde entsprechend
Beispiel 1 durch Immunblotting geprüft. Das
Untersuchungsergebnis ist in Fig. 1 dargestellt.
-
Fig. 1 ist eine Photographie des Entwicklungsmusters des
zuvor beschriebenen Hirnhomogenats aufgrund von SDS-PAGE und
der Bindungsstelle von RB2-4 aufgrund von Immunblotting. In
Fig. 1 bezeichnen Bezugszahl 1 ein Fleckenmuster eines
Molekulargewichtmarkers mit Hilfe eines CBB; 2 ein Fleckenmuster
eines Rattenhirnhomogenats aufgrund der CBB und 3 das
Immunblottingergebnis des Rattenhirnhomogenats unter Verwendung
von RB2-4. Wie aus Fig 1 hervorgeht, geht RB2-4 eine
Reaktion mit einer Bande eines einzigen Proteins eines
Molekulargewichts von etwa 40 kD ein.
Beispiel 3
Isolierung eines Rattensynaptophysingens
(1) Plaque-Screening unter Verwendung des monoklonalen
Antikörpers RB2-4
-
E.coli (Y1090) (ΔlacU169proA+Δ1on
araD139strAsupF[trpc22::Tn10] (pMC9*) ,mcrA-,mcrB+) wurde
über Nacht unter Verwendung eines LBM-Mediums (mit 0,2%
Maltose und 50 mg/l Ampicillin) gezüchtet. Eine aus einem
Rattenhirn unter Verwendung eines λgt11-Vektors konstruierte
cDNA-Bibliothek (von Clontech Inc.) wurde auf etwa 4 x 10&sup5;
pfu verdünnt. Diese verdünnte Suspension wurde mit 0,6 ml
einer bei der beschriebenen Züchtung erhaltenen
E.coli-Suspension gemischt. Das Gemisch wurde 20 min lang bei
Raumtemperatur inkubiert. Andererseits wurde eine Spitzenagarose
(beispielsweise LBM-Agarose) in einem Autoklaven behandelt
und in erschmolzenem Zustand bei 55ºC inkubiert. Die
behandelte Spitzenagarose wurde mit dem zuvor erhaltenen Gemisch
vereinigt. Das erhaltene Gemisch wurde rasch gerührt. Dann
wurde das Gemisch auf einem zuvor auf einer Platte
verstrichenen Bodenagar (beispielsweise 0,8% LMB-Agar) verteilt.
Nach Verfestigung der Spitzenagarose wurde der feste Körper
3,5 h lang bei 42ºC inkubiert, um eine Plaque zu bilden. Auf
die Plaque wurde eine Nitrocellulosemembran gelegt und 3,5 h
lang bei 37ºC inkubiert. Hierbei wurde die in E.coli
transfizierte cDNA exprimiert. Die Nitrocellulosemembran war
zuvor in 10 mM IPTG (Isopropylthiogalactopyranosid) getaucht
und getrocknet worden. Danach wurde die
Nitrocellulosemembran mit TBS gewaschen und diente zum anschließenden
Screening mittels einer Antigen-Antikörper-Reaktion.
-
Das Screening unter Verwendung von RB2-4 wurde wie folgt
durchgeführt: Die Nitrocellulosemembran wurde unter
Verwendung von TBS mit 3% Gelatine bei Raumtemperatur 1 h lang bis
über Nacht blockiert. Nachdem die blockierte
Nitrocellulosemembran
mit dem beim Screening verwendeten monoklonalen
Antikörper (primären Antikörper) zur Reaktion gebracht worden
war, wurde die Nitrocellulosemembran dreimal jeweils 15 min
lang mit TBS gewaschen. Danach wurde die
Nitrocellulosemembran mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten
Ziege-Antimaus-Antikörper (sekundären Antikörper) reagieren
gelassen. Anschließend wurde die Nitrocellulosemembran
dreimal jeweils 15 min lang mit TBS gewaschen. Eine durch Zusatz
des 1/100-fachen Volumens von 1% CoCl&sub2; 6H&sub2;O, des
1/100-fachen Volumens von 1% (NH&sub4;)&sub2;Ni(SO&sub4;)&sub2; 6H&sub2;O und des
1/500-fachen Volumens einer Wasserstoffperoxidlösung zu 100 µg/ml
Diaminobenzidintetrahydrochloid in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert:
7,5) zubereitete Farbentwicklungslösung diente zum Nachweis
eines Produkts einer Farbentwicklungsreaktion. Nach
Durchführung einer akzeptablen Färbung wurde nach einer Plaque
entspreöhend dem Farbfleck gesucht, um eine Phage mit dem
gewünschten Genfragment zu gewinnen.
(2) Proliferation der Phage mit dem Rattensynaptophysingen
und seinem komplementären Strang
-
Die durch die Maßnahmen (1) erhaltene Phage mit dem
Rattensynaptophysingen und seinem komplementären Strang wurde nach
den Maßnahmen der Plattenlysatmethode wachsen gelassen bzw.
fortgepflanzt. E.coli (Y1088
(ΔlacU169supEsupFhsdR-hsdM+metBtrpRtonA21[proc::Tn5]
(pMC9), mcrA-mcrB+) wurde über Nacht unter Verwendung von
LBM-Medium (mit 0,2% Maltose und 50 mg/ml Ampicillin)
gezüchtet. Ein Zusatz von 0,1 ml SM-Pufferlösung mit 10&sup5; bis
10&sup6; pfu der Phage wurde zu der E.coli-Suspension zugegeben,
worauf das Ganze 10 min lang bei Raumtemperatur inkubiert
wurde. Andererseits wurde eine Spitzenagarose
(beispielsweise LBM-Agarose) in einem Autoklaven behandelt und in
aufgeschmolzenem Zustand bei 55ºC inkubiert. Die behandelte
Spitzenagarose wurde mit dem zuvor zubereiteten Gemisch
gemischt. Das erhaltene Gemisch wurde rasch gerührt. Dann
wurde das erhaltene Gemisch auf zuvor auf einer Platte
verteiltem Bodenagar (beispielsweise LMB-Agar) ausgestrichen.
Nach Festigung der Spitzenagarose wurde der feste Körper in
einen Vinylbeutel gelegt und (darin) 6 - 7 h lang bei 37ºC
kultiviert. Nach der Lyse des E.coli wurden zu dem festen
Körper 5 ml SM-Pufferlösung und einige Tropfen Chloroform
zugegeben. Der feste Körper wurde über Nacht bei 4ºC in
horizontaler Haltung dergestalt, daß die SM-Pufferltisung
seine Oberfläche vollständig bedeckte, inkubiert. Hierbei
wurde eine Phagensuspension, in der eine Phage mit dem
Rattensynaptophysingen und seinem komplementären Strang
suspendiert waren, erhalten.
(3) Herstellung des Rattensynaptophysingens und seines
komplementären Strangs
-
5 µg/ml RNaseA und 5 µg/ml DNaseI wurden zu der gemäß (2)
erhaltenen Phagensuspension mit dem Rattensynaptophysingen
und seinem komplementären Strang zugegeben. Die erhaltene
Suspension wurde 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Nach dem
Vermischen eines gleichen Volumens Polyethylenglycol PEG
600-2M NaCl-Lösung mit der erhaltenen Suspension wurde das
Ganze 1 h lang bei 0ºC inkubiert. Das erhaltene Gemisch
wurde bei 4ºC und 300 min&supmin;¹ 20 min lang zentrifugiert. Der
Überstand wurde völlig entfernt. Der erhaltene Niederschlag
wurde in 0,5 ml SM-Pufferlösung suspendiert. Die erhaltene
Suspension wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und
(darin) 2 min lang bei 8000 min&supmin;¹ zentrifugiert. Der
erhaltene Überstand wurde in ein weiteres Eppendorf-Röhrchen
überführt. Dieser Überstand wurde mit so viel EDTA und SDS
versetzt, daß die Endkonzentration an EDTA bzw. SDS 10 mM
bzw. 1% betrug. Dann wurde das Gemisch 15 min lang bei 65ºC
inkubiert. Anschließend wurden eine einmalige
Phenolextraktion, eine zweimalige Phenol-Chloroform-Extraktion und eine
einmalige Chloroformextraktion durchgeführt. Bei der
Phenolextraktion bzw. Phenol-Chloroform-Extraktion wurde mit TE
(Tris-EDTA-Pufferlösung) gesättigtes Phenol verwendet. 50 µl
3M Natriumacetat und 1 ml Ethanol wurde zu der bei diesen
Extraktionsmaßnahmen erhaltenen wäßrigen Schicht zugegeben,
worauf das Gemisch 15 min lang bei -80ºC inkubiert und dann
5 min lang bei 15 000 min&supmin;¹ zentrifugiert wurde. Nach dem
Zentrifugieren wurde der Überstand entfernt. Der erhaltene
Rückstand wurde mit gekühltem 70%igem Ethanol gewaschen und
dann getrocknet. Das getrocknete Produkt wurde in 50 µl TE
gelöst, wobei eine Phagen-DNA mit dem Rattensynaptophysingen
und seinem komplementären Strang erhalten wurde.
-
Das Rattensynaptophysingen und sein komplementärer Strang
konnten aus der Phagen-DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen
(beispielsweise EcoRI) herausgenommen werden.
-
Darüber hinaus wurden lediglich das Rattensynaptophysingen
und sein komplementärer Strang aus der beispielsweise mit
EcoRI nach folgenden Verfahrensmaßnahmen verdauten Phagen-
DNA gewonnen werden. Die mit EcoRI verdaute Phagen-DNA wurde
unter Verwendung eines l%igen Agarosegels mit niedrigem
Schmelzpunkt in einem Puffersystem mit Ethidiumbromid und
TAE (EDTA-Tris-Essigsäure-Pufferlösung) einer Elektrophorese
unterworfen. Nach dieser Elektrophorese wurde eine Zielbande
von 0,8 kbp unter Belichtung mit UV-Licht mit Hilfe einer
Durchleuchtungsvorrichtung ausgeschnitten. Die Zielbande
wurde in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Ein die Zielbande
enthaltendes Gel wurde bei 65ºC aufgeschmolzen und mit
destilliertem Wasser versetzt. Das erhaltene Gemisch wurde
nach und nach abgekühlt. Nach zweimaliger Phenolextraktion
und einmaliger Phenol-Chloroform-Extraktion wurde die DNA
durch Ethanolfällung gewonnen. Bei diesen Extraktionen wurde
mit TE gesättigtes Phenol verwendet.
-
Wurde die Nucleotidsequenz der DNA durch die Didesoxymethode
bestimmt, zeigte es sich, daß die DNA eine Nucleotidsequenz
entsprechend der Sequenz Nr. 1 im Sequenzprotokoll umfaßte.
Die Sequenz Nr. 1 entspricht der Nucleotidsequenz des
erfindungsgemäß erhaltenen Rattensynaptophysingens. Seine Sequenz
wurde in Richtung auf den 5'-Terminus dargestellt. In der
Sequenz bedeuten A, C, G und T Adenin, Cytosin, Guanin bzw.
Thymin.
-
Die Sequenz Nr. 2 im Sequenzprotokoll entspricht der
Nucleotidsequenz des bekannten Rattensynaptophysingens. In diesem
Sequenzprotokoll wurde die Nucleotidsequenz von Nr. 721 bis
Nr. 1501 vom 5'-Terminus zum 3'-Terminus dargestellt. Die
durch die Sequenz Nr. 1 gemäß der vorliegenden Erfindung
dargestellte Nucleotidsequenz entspricht den Basen Nr.726
bis 1486 des bekannten Synaptophysingens.
-
Die Homologie zwischen der Nucleotidsequenz des
erfindungsgemäß erhaltenen Rattensynaptophysingens und der
Nucleotidsequenz des bekannten Rattensynaptophysingens ist in den
Fig. 2A bis 2B dargestellt. Die obere Reihe entspricht der
Nucleotidsequenz des erfindungsgemäß erhaltenen
Rattensynaptophysingens, die untere Reihe entspricht der
Nucleotidsequenz des bekannten Rattensynaptophysingens. Ein Sternchen *
bezeichnet eine identische Base zwischen diesen
Basesequenzen. A, C, G und T bedeuten Adenin, Cytosin, Guanin bzw.
Thymin. Eine Markierung "-" repräsentiert eine Stelle, an
der ein Nucleotid deletiert war. Wird das erfindungsgemäße
Gen mit dem bekannten Gen verglichen, sind sie mit Ausnahme
der folgenden drei Basen identisch.
-
Der
Vergleich zeigt, daß diese beiden DNA-Sequenzen
miteinander nahezu identisch sind. Das heißt, daß die
erfindungsgemäß hergestellte DNA ein Rattensynaptophysingen
ist.
-
Wie zuvor beschrieben, wird erfindungsgemäß ein monoklonaler
Antikörper mit spezifischer Bindung an das
Rattensynaptophysin bereitgestellt. Unter Verwendung dieses monoklonalen
Antikörpers läßt sich ohne Schwierigkeiten unter auf eine
Nitrocellulosemembran übertragenen Proteinen das
Rattensynaptophysin allein nach einem indirekten Enzymimmuntest oder
einer indirekten Fluoreszenzantikörpertechnik analysieren.
-
Da darüber hinaus das Synaptophysin als guter Nachweismarker
für neuroendokrine Tumore dienen kann, kann man (damit)
neuroendokrine Tumore auffinden bzw. nachweisen. Folglich
dürfte sich der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper zu
Diagnosezwecken in der Klinik und auf medizinischen Gebieten
eignen.