DE69532767T2

DE69532767T2 - Peptid umfassend eine Sequenz aus einer Fusionsverbindungsstelle in einem mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III

Info

Publication number: DE69532767T2
Application number: DE69532767T
Authority: DE
Inventors: Albert J. Wong; David K. Moscatello
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1994-11-28
Filing date: 1995-11-28
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2015-11-29
Also published as: JPH10509878A; US6224868B1; CA2206343A1; DE69532767D1; EP0796277B1; EP0796277A4; WO1996016988A1; ATE262586T1; EP0796277A1; JP2007297398A; CA2206343C; JP4620808B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Der Erfolg einer jeden Krebstherapie beruht auf ihrer Fähigkeit, Tumorzellen von normalen Zellen zu unterscheiden. Die meisten gegenwärtigen Chemotherapie- oder Radiotherapie-Behandlungsfolgen beruhen auf verschiedenen Wachstumsraten der Tumorzellen. In der Praxis waren solche Therapien sehr erfolgreich bei der Behandlung einiger Krebsarten, aber für viele andere Krebsarten sind die gegenwärtigen Behandlungen entweder nur schmerzlindernd oder auf lange Sicht uneffektiv. Der Fortschritt bei der Gehirntumortherapie war besonders schlecht, da die Überlebenskurve sich über 60 Jahre nicht deutlich geändert hat. Ein gewisser Fortschritt wurde unter Verwendung von biologisch basierten Modalitäten erreicht, wie beispielsweise das Verbessern des Immunsystems eines Patienten oder Therapien auf der Grundlage aktueller Forschung in der Molekularbiologie. Die Spezifität dieser therapeutischen Behandlungen gegen Krebszellen ist jedoch gering. Viele der auf biologischer Forschung basierenden Therapien konzentrieren sich auf die Definition tumorspezifischer Veränderungen.
Die Idee der Verwendung des eigenen Immunsystems eines Patienten, um einen Tumor zu zerstören, ist wahrscheinlich die älteste angewendete Krebstherapie auf biologischer Grundlage. Der Erfolg dieses Weges beruht auf der Identi fizierung eines Antigens, das sowohl eine humoral als auch zellulär vermittelte Reaktion hervorruft. Idealerweise sollte die Immunisierung ein tumorspezifisches Antigen verwenden, welches genau auf den Tumorzellen exprimiert wird, da das Immunsystem am wirksamsten ein Antigen erkennt, dem es vorher nie begegnet ist (Hellstrom, I. und Hellstrom K. E., Annals of New York Acad. Sci. 1993, 690, 24– 33). Die Identifizierung solcher Antigene war schwierig; ein Fortschritt wurde jedoch kürzlich erzielt bei der Isolierung von mutierten und umgelagerten Genen. Fast alle Veränderungen, die bis heute charakterisiert wurden, wie beispielsweise p53, Rb, und ras-Gene wirken auf intrazelluläre Proteine. Neue Daten zeigen, dass ein intrazelluläres Molekül durch zytolytische T-Lymphozyten noch erkannt wird; die relative Wirksamkeit des Tumorabtötens ist jedoch unbekannt.
Untersuchungen mit Gliom-Xenoplantaten haben jedoch gezeigt, dass sich Proteine, die vom verstärkten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF-Rezeptorgen) exprimiert werden, sich auf der Zelloberfläche befinden (Humphrey et al., Cancer Research 1988, 48, 2231–2238). Es wurde gezeigt, dass das EGF-Rezeptorgen in 40% der Glioblastom-Multiformtumoren verstärkt wird (Libermann et al., Nature 1985, 313(5998), 144–7; Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84(19), 6899–903). Dieser Rezeptor war in einer Vielzahl von Tumoren enthalten, einschließlich denen der Brust, der Haut und der Blase (Harris, A. L. Recent Results in Cancer Research 1989, 113, 70–77). In der Mehrzahl dieser Untersuchungen wurden erhöhte Levels an Rezeptornachrichten, Protein- oder EGF-Bindung nachgewiesen. Es wurde auch gezeigt, dass in Tumoren mit Verstärkung des EGF-Rezeptorgens das Gen häufig eine Deletion und/oder Veränderung erfahren hat (Libermann et al., Nature 1985, 313(5998), 144–7; Wong et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84(19), 6899–903).
Die cDNA-Sequenz, die dem normalen EGF-Rezeptor entspricht, wurde von Ullrich et al. in Nature 1984, 309, 418–425 beschrieben. Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 2965–2969 und Vogelstein und Bigner (PCT/US90/04489) charakterisierten die genetischen Veränderungen, die mit Umlagerungen oder Deletionen dieser Gene in fünf bösartigen Gliomen einhergehen. Sie fanden, dass mutierte EGF-Rezeptorproteine in Zellen vorhanden sind, die drei Typen von genetischer Deletion und/oder Umlagerung zeigen, was zu einem strukturell veränderten Rezeptor führt. Die erste Klasse von Deletionen, die identifiziert wurde, führt zu einer Lücke in der extrazytoplasmischen Domäne in der Nähe der Transmembrandomäne. Die zweite Klasse von Deletionen führt zur Eliminierung des distalen Teils der extrazytoplasmischen Domäne des EGF-Rezeptors. Die dritte Klasse ist charakterisiert durch eine Deletion des Hauptanteils der externen Domäne des EGF-Rezeptors, die im Wesentlichen nur den Transmembranteil und die intrazytoplasmische Domäne zurücklässt. Die DNA-Sequenzen, die Proteine kodieren, die jeder dieser mutierten Klasse entsprechen, wurden beschrieben. Vogelstein und Bigner schlagen vor, dass diese DNA-Sequenzen durch Transformation oder Transfektion in eine Wirtszelle eingeführt werden und unter Verwendung einer Vielzahl von Wirts-Nektorkombinationen exprimiert werden. Eine Anzahl an verwendbaren Expressionsvektoren wird beschrieben, einschließlich des lac-Systems, des trp-Systems, des tac-Systems, des Hauptoperators des trc-Systems und Promotor-Regionen der Phage Lambda, der Kontrollregion des fd-Hüllproteins, der glykolytischen Promotoren der Hefe, der Promotoren der Hefe-Säurephosphatase, der Promotoren der a-Paarungsfaktoren von Hefe und Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus, Retrovirus oder Simian-Virus abstammen, und anderen Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie die Expression der Gene prokariotischer oder eukariotischer Zellen und ihrer Virenkombinationen kontrollieren. Es wurden auch Beispiele für Expressionswirte beschrieben, die in der Erfindung verwendbar sind, welche eukaryontische und prokaryontische Wirte umfassen, beispielsweise Stämme von E. coli, einschließlich E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI sowie E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, einschließlich Bacillus subtilis, Streptomyces, Hefen und andere Pilze, tierische Zellen, wie beispielsweise COS-Zellen und CHO-Zellen, und menschliche Zellen und pflanzliche Zellen in Gewebekulturen. Vogelstein und Bigner schlagen vor, dass das Peptidprodukt der prokaryontischen oder eukaryontischen Wirte, die mit den DNA-Sequenzen transformiert wurden, zur Herstellung der Antikörper verwendet werden kann.
Es wurde gezeigt, dass die Rasterdeletion aus Nukleotid 275–1075 im EGF-Rezeptor (von Vogelstein und Bigner als Klasse I oder Typ I gekennzeichnet, nachstehend aber als Typ III bezeichnet) eine lokale Aminosäuresequenz an der Fusionsverbindungsstelle erzeugt, von der Polypeptidsequenzen in dem intakten EGF-Rezeptor entfernt liegen. (Humphrey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 4207–4211). Ein 14-Aminosäurepeptid, das die Verbindungsstelle überbrückt, wurde chemisch synthetisiert, an Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin ge koppelt und in Kaninchen als Immunogen verwendet. Der hervorgerufene Antikörper reagierte im ELISA spezifisch mit dem Fusionspeptid. Der Antifusionsantikörper wurde gereinigt, und es wurde gezeigt, dass er selektiv an den Gliom-Deletionsmutanten bindet. Es wurde vorgeschlagen, dass dieser Antipeptidantikörper ein idealer Kandidat für die Tumorabbildung und Immuntherapie ist.
WO 91 03489 beschreibt die Immunisierung von Tieren mit bestimmten mutierten EGFR-Peptiden zum Zwecke der Antikörperherstellung. Antikörper, die aus diesen Tieren isoliert wurden, wurden dann bei anderen Objekten als therapeutische oder diagnostische Mittel verwendet.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen Impfstoff zur Verfügung zu stellen, welcher die Tumorbildung inhibiert. Der Impfstoff umfasst ein Peptid mit ausreichender Gleichartigkeit gegenüber einer Fusionsverbindungsstelle, die in einem mutierten, menschlichen EGF-Rezeptor vorliegt, so dass eine Immunreaktion gegen diesen Mutanten hervorgerufen wird. Ein Verfahren zum Inhibieren der Bildung von Tumoren, die einen natürlich vorkommenden mutierten EGF-Rezeptor tragen, durch Verabreichung dieses Impfstoffs wird auch zur Verfügung gestellt.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Impfstoffs zum Induzieren der Rückbildung eines existierenden Tumors, welcher ein Peptid umfasst, das genügend Ähnlichkeit gegenüber einer Fusionsverbindungsstelle aufweist, die im mutierten menschlichen EGF-Rezeptor vorhanden ist, so dass eine Immunreaktion gegen diesen Mutanten hervorgerufen wird. Die Verabreichung dieses Impfstoffs stellt ein Verfahren zur Verfügung, das die Rückbildung eines existierenden Tumors induziert, der einen natürlich vorkommenden mutierten EGF-Rezeptor trägt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Peptids bereitgestellt, das eine Sequenz aus einer Fusionsverbindungsstelle in einem mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III umfasst, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, wobei das Peptid in einem Objekt eine zytotoxische T- Zellenreaktion gegen einen Tumor, der einen mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III trägt, hervorruft.
In einer bevorzugten Ausführungsform bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei der Krebs ausgewählt ist aus Glioblastom, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, Brustkrebs und Eierstockkrebs.
Vorzugsweise bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, der den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III trägt.
Vorzugsweise bewirkt das Medikament auch die Induzierung der Rückbildung eines existierenden Tumors, der den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III trägt.
In bevorzugten Ausführungsformen bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei das Peptid mindestens eine Aminosäuresequenz proximal zu und einschließlich der Aminosäure in Position 5 der Aminosäuresequenz des entsprechenden normalen, reifen EGF-Rezeptors des Objekts und nachfolgend ein Glycin, und eine Aminosäuresequenz distal zu und einschließlich der Aminosäure in Position 274 des entsprechenden normalen reifen EGF-Rezeptors des Objekts umfasst.
Vorzugsweise bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei das Peptid die Sequenzidentifizierungsnummer (SEQ ID-NR.: 1) umfasst.
Das Medikament bewirkt auch vorzugsweise die Inhibierung der Bildung und des Wachstums eines Tumors, wobei das Peptid mit einem Träger konjugiert ist.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei der Träger Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin, Rinderserumalbumin oder menschliches Serumalbumin ist.
Vorzugsweise bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei das Medikament weiterhin ein Adjuvans umfasst.
Vorzugsweise bewirkt das Medikament auch die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei das Adjuvans komplettes Freund-Adjuvans, inkomplettes Freund-Adjuvans, ein Mineralgel, eine oberflächenaktive Substanz, ein Pluronic-Polyol, ein Polyanion, ein Peptid oder eine Ölemulsion ist.
Vorzugsweise bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei das Mineralgel Aluminiumhydroxid umfasst.
Vorzugsweise bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei das oberflächenaktive Mittel Lysolecithin umfasst.
In bevorzugten Ausführungsformen bewirkt das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors, wobei das Objekt ein Mensch ist.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt DNA- und Peptidsequenzen von normalen und mutierten EGF-Rezeptoren vom Typ III. Die obere Sequenz zeigt die Nukleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuretranslation gemäß Ullrich et al. Nature 1984, 309, 418– 425 (SEQ ID-Nr.: 4 und SEQ ID-Nr.: 5). Die untere Sequenz zeigt die resultierende Deletion im EGF-Rezeptor vom Typ III und die entsprechende Aminosäuresequenz (SEQ ID-Nr.: 6).
Genaue Beschreibung der Erfindung
Der mutierte EGF-Rezeptor vom Typ III beinhaltet eine Deletion zwischen den Nukleotiden 275–1075 in der EGF-Rezeptor-cDNA. Diese Deletion führt zu einer Fusion von Sequenzen, die normalen Abstand hatten, und erzeugt eine mutierte cDNA-Sequenz, was zur Bildung einer neuen Peptidsequenz an dieser Fusionsverbindungsstelle führt (1). Dies ist der häufigste, natürlich vorkommende mutierte EGF-Rezeptor in menschlichen Tumoren, und es wurde berichtet, dass er zu 17% in Glioblastomtumoren und zu 25% in nicht-kleinzelligen Lungenkarzinomen vorkommt. Es wurde auch gefunden, dass dieser Rezeptor bei 67% der Brustkrebsfälle vorhanden ist. Unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern (mAb), die für den mutierten Rezeptor spezifisch sind, wurde nun bestätigt, dass dieser Rezeptor tumorspezifisch ist für Untereinheiten des Brustkarzinoms, des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms und der Gliome. Der Rezeptor wurde in keinem der untersuchten normalen Gewebe exprimiert, einschließlich Elementen des peripheren Nervensystems, des zentralen Nervensystems und des lymphatischen Systems. Dieser Rezeptor wurde auch in Eierstocktumoren gefunden.
Üblicherweise führt die Transfektion einer Zelllinie mit einem Säugetier-Expressionsvektor zu sehr hohen stabilen Niveaus der Proteinexpression. In der Vergangenheit standen Forscher, welche versuchten, diesen mutierten Rezeptor zu exprimieren, einem ungewöhnlichen Problem gegenüber, nämlich dass die Niveaus der Proteinexpression sehr niedrig und bei fortgesetzter Kultur auch instabil sind. Wie hier beschrieben, wurde eine Reihe von Zelllinien entwickelt, welche den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III überexprimieren. Eine einzigartige Eigenschaft dieser Zelllinien ist die, dass sie extrem hohe Mengen des mutierten Rezeptors exprimieren. Andere Forscher haben Gehalte an mutiertem Rezeptor erzielt, die ungefähr 20-mal kleiner sind als die, die mit den hier beschriebenen Zelllinien exprimiert werden. Außerdem war die Expression des mutierten Rezeptors, der aus diesen anderen Zelllinien erhalten wurde, nicht sehr stabil. Im Gegensatz dazu weisen die hier beschriebenen Zelllinien eine stabile Expression des mutierten Rezeptors auf. Der durch die hier beschriebenen Zelllinien exprimierte Rezeptor ist in Abwesenheit von zusätzlichem Wachstumsfaktor aktiv. Weiterhin wurde festgestellt, dass diese Zelllinien in Mäusen sehr aggressive Tumoren erzeugen.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung von Zelllinien beschrieben, welche den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III überexprimieren. Andere Untersuchungen an dieser Mutante wurden durch die Tatsache eingeschränkt, dass in den erhaltenen Klonen niedrige Mengen an mutiertem Rezeptor vorhanden waren. Somit ist es ein wichtiger Aspekt dieses Verfahrens, Klone zu erzeugen, welche Rezeptormengen exprimieren, die denen vergleichbar sind, die in primären Gliatumoren gefunden werden. Um diese Zelllinien zu erzeugen, wird ein Klon identifiziert, der den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III umfasst. Ein Plasmidkonstrukt der gesamten Länge des EGF-Rezeptors wird in einen Säugetier-Expressionsvektor, wie beispielsweise pLTR2, kloniert, welcher unter Verwendung des Promotors der langen Kanalwiederholungen (LTR, = Long Terminal Repeat) des Moloney-Rattenleukämievirus die Transkription bewirkt. Andere Säugetier-Expressionsvektoren, welche verwendbar sind, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, pCMV, pLSX, pSV40 und pMNTV. Mutierte EGF-Rezeptor-cDNA wird aus menschlichen Gliatumorzellen erhalten, die zwischen den Nukleotiden 275–1075 eine Deletion haben. Die Mutante kann aus ungefähr 17% der Patienten mit diesen Gliatumoren isoliert werden. Beispiele für spezielle Tumorzelllinien, die in diesen Verfahren verwendbar sind, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, menschlichen GBM-Tumor D270, D317 und D256. Die cDNA des mutierten EGF-Rezeptors vom Typ III wird dann in einen Phagenvektor kloniert. Beispiele für Phagenvektoren, welche verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, lambda-Zap II, lambda-gt10, lambda-gt11, lambda-ExLox, lambda-UniZap oder lambda-GEM. Ein cDNA-Fragment des EGF-Rezeptors, das die Sequenzen der Nukleotide 1 bis 274 oder der Nukleotide 1076–5532 enthält, wird dann verwendet, um die Mutanten zu identifizieren. Nach der Identifizierung wird das cDNA-Fragment, das die Änderung umfasst, mit dem verbleibenden Teil der normalen EGF-Rezeptor-cDNA fusioniert, um einen Klon zu erzeugen, der den mutierten EGF-Rezeptor exprimiert, aber sonst identisch mit dem Konstrukt ist, das den intakten, normalen EGF-Rezeptor exprimiert. Beispielsweise wird ein 25I-bp-SstI-DraI-Fragment, das die Fusionsverbindungsstelle des Klons enthält, mit einem 2,9-kb-DraI-XhoI-Fragment aus dem Plasmid pCO12 verknüpft.
NIH-3T3-Zellen können dann mit diesem Expressionsplasmid cotransfiziert werden. Andere Zelllinien, welche verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, BALB/3T3, RAT1, RAT2 und ROVGE 11. Das verwendete Expressionsplasmid kann pLTR-HC2 sein, welches den mutierten EGF-Rezeptor mit der 275–1075-Deletion enthält. Die Zellen werden auch mit einem Selektionsmarker transfiziert. Beispiele für Selektionsmarker, welche verwendbar sind, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, Neomycinresistenz, Hygromycinresistenz, Mycophenolsäureresistenz und Puromycinresistenz. Dieser Selektionsmarker kann ein Expressionsplasmid sein, welches ein Gen für Neomycinre sistenz kodiert, wie beispielsweise pKOneo. Um sicherzustellen, dass hohe Proteingehalte exprimiert werden, werden Verhältnisse des Expressionsplasmids zum Selektionsmarker von mindestens 20 : 1 verwendet. Auf Platten aufgebrachte Zellen werden unter Verwendung eines Calciumphosphatverfahrens, das Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt ist, transfiziert. Nach der Transfektion werden die Zellen trypsinisiert und in geeignete Selektionsmedien aufgespalten. "Geeignete Selektionsmedien" bedeutet Medien, die in der Lage sind, nur diejenigen Zellen zu unterstützen, welche den Selektionsmarker exprimieren. Wenn beispielsweise der Selektionsmarker ein Expressionsplasmid ist, welcher ein Gen für Neomycinresistenz kodiert, wie beispielsweise pKOneo, muss das Medium G418-Sulfat enthalten. Resistente Klone werden dann ausgewählt, und es wird ein Lysat zum Screening hergestellt, um die Menge an exprimiertem Rezeptor zu bestimmen. Diejenigen, die hohe Niveaus an Rezeptorexpression zeigen, werden dann subkloniert, um sicherzustellen, dass die Zellpopulationen rein sind.
Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden NIH-3T3-Fibroblasten cotransfiziert durch Calciumphosphat-Fällung mit dem pKOneo-Plasmid und entweder pLTR CO12, das die gesamte Länge des menschlichen EGF-Rezeptors kodiert, oder pLTR HC2, das den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III aus dem menschlichen GBM-Tumor kodiert. Nach G418-Selektion wurden Klone zur Expression des menschlichen EGF-Rezeptors durch Western-Blotting der Zelllysate ausgewählt. Es wurden Zellen identifiziert, die den Rezeptor bis zu einem vergleichbaren Niveau überexprimierten, wie er durch menschliche A431-Plattenepithelkarzinomzellen exprimiert wird. Eine Zelllinie, die den intakten menschlichen Rezeptor überexprimiert, nachstehend als CO12 20c2 bezeichnet, wurde identifiziert. Es wurden auch Zelllinien identifiziert, die den mutierten EGF-Rezeptor überexprimieren. Beispiele für diese Zelllinien umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, HC2 20d2, HC2 20d1, HC2 20d4, NM#3 HC2 20d2/c, HC2/NS1 und Derivate davon.
Zelllinien, die den mutierten EGF-Rezeptor überexprimierten, wuchsen in weichem Agar in Abwesenheit von EGF. Die Koloniebildung wurde durch Zugabe von EGF nicht verstärkt. Im Gegensatz dazu wuchsen Klone, die viel kleinere Gehalte an mutiertem EGF-Rezeptor produzierten, wie beispielsweise HC2 20c1, kaum ohne zugegebenes EGF, und obwohl die Koloniebildung durch EGF ver stärkt wurde, zeigte dieser Klon eine viel geringere Klonierungseffizienz als Klone, welche den mutierten EGF-Rezeptor überexprimieren.
Es wurde auch festgestellt, dass Zelllinien, die den mutierten EGF-Rezeptor überexprimieren, endogene Rezeptoraktivierung aufweisen. Wenn die transfizierten Klone anfänglich durch Immun-Blotting mit einem Antikörper, der für den menschlichen EGF-Rezeptor spezifisch ist, analysiert wurden, variierte die Menge des von den verschiedenen Klonen produzierten Rezeptors beträchtlich, wobei einige Klone mehr Rezeptor produzierten. Immun-Blottinganalyse der gleiche Lysate (hergestellt aus Zellen, welche nicht mit EGF behandelt waren) mit einem monoklonalen Antikörper, der für die aktivierte Form des menschlichen EGF-Rezeptors spezifisch ist, zeigte, dass einige der Lysate aktivierte EGF-Rezeptoren enthielten; Aktivierung war jedoch nur in denjenigen Lysaten nachweisbar, welche einen erheblichen Anteil an EGF-Rezeptoren enthielten. Die HC2 20d2-Lysate zeigten einen vergleichbaren Gehalt an aktiviertem EGF-Rezeptor wie A431-Zellen, welche mit EGF behandelt worden waren.
Unter Verwendung eines Antikörpers gegen den EGF-Rezeptor wurde an diesen Zelllinien eine immunozytochemische Untersuchung durchgeführt. Der HC2 20d2-Klon verfärbte sich intensiver als CO12 20c2 und hatte die Morphologie einer transformierten Zelllinie. HC2 20c1, der viel weniger des mutierten Proteins exprimiert als HC2 20d2, verfärbt sich mit diesem Antikörper sehr schwach und gleicht in seiner Morphologie mehr den normalen 3T3-Zellen. Beim Färben mit dem Antikörper für den aktivierten menschlichen EGF-Rezeptor reagierten in der Kultur viele HC2 20d2-Zellen, die nicht mit EGF behandelt waren, positiv, während sich sehr wenige CO12 20c2-Zellen mit dem Antikörper verfärbten. Sehr wenige Zellen des HC2 20c1-Klons zeigten irgendeine Reaktion gegen den antiaktivierten menschlichen EGF-Rezeptorantikörper, und diejenigen, die es taten, reagierten schwach. Behandlung von CO12 20c2-Klonen, die normal im menschlichen EGF-Rezeptor exprimieren, mit EGF (20 ng/ml) über nur 5 Minuten führte zu einem Anstieg in der Intensität und Zahl der Zellen, die sich mit anti-aktiviertem EGF-Rezeptorantikörper verfärbten. Innerhalb einer Stunde waren nahezu alle Zellen in Kulturen von CO12 20c2 positiv hinsichtlich des aktivierten EGF-Rezeptors, und die Zellen durchliefen morphologische Veränderungen. Im Gegensatz dazu verfärbten sich die hier beschriebenen Zelllinien mit anti-aktiviertem Antikörper ohne Zugabe von EGF.
Offensichtlich ist ein Großteil des mutierten EGF-Rezeptors intrazellulär. Immunozytochemisches Färben Formalin-fixierter Zellen ohne Behandlung mit Triton X-100 führte zu einer relativ schwachen Oberflächenfärbung der verschiedenen transfizierten Klone. Die Beobachtung von Präparaten, die nach Triton X-100-Behandlung gefärbt wurden, zeigte eine dunkle, offensichtlich intrazelluläre Ansammlung des mutierten EGF-Rezeptors, besonders offensichtlich im Klon HC2 20d2. Färbung mit dem Antikörper gegen die aktivierte Form des EGF-Rezeptors zeigte auch eine perinukleare "Kappe" des aktivierten Rezeptors in vielen Zellen dieses Klons. Um die Lage der EGF-Rezeptoren in transfizierten Klonen, die den normalen oder mutierten EGF-Rezeptor exprimieren, quantitativ zu vergleichen, wurden die Zellen fixiert, mit oder ohne Behandlung mit Triton X-100 mit einem Antikörper gegen die EGF-bindende Domäne des EGF-Rezeptors inkubiert und mit einem sekundären ¹²⁵I-Antikörper markiert. Die Messung der in Lösung gegangenen Radioaktivität zeigte, dass sich 52 bis 60% der EGF-Rezeptoren an der Oberfläche der Zellen in den transfizierten Klonen befinden, im Vergleich zu etwa 70% in menschlichen A431-Plattenepithelkarzinomzellen. Diese Analyse zeigte auch, dass die HC2 20d2- und CO12 20c2-Klone EGF-Rezeptordichten in der gleichen Größenordnung haben wie A431-Zellen. A431- und CO12 20c2-Klone bindeten vergleichbare Mengen an ¹²⁵I-EGF. Im Gegensatz dazu konnten HC2 20d2-Zellen, welche nach dem Western-Blotting und der Immunozytochemie die höchsten Gehalte an EGF-Rezeptoren exprimierten, das ¹²⁵I-EGF in diesem Assay nicht signifikant binden.
Es wurde festgestellt, dass sich in Klonen, die den mutierten EGF-Rezeptor überexprimierten, die Signaltransduktion veränderte. Western-Blotting-Analyse der zellulären Proteine, die Phosphotyrosin enthielten, ergab einen weiteren Hinweis auf die endogene Aktivierung des mutierten EGF-Rezeptors in den HC2 20d2-Klonen. Selbst nach 48 Stunden in Serum-freiem Medium ist der EGF-Rezeptor in diesen Zellen phosphoryliert, während unter diesen Bedingungen in CO12 20c2- oder A431-Zellen sehr wenig Phosphotyrosin nachweisbar ist. Während Inkubation mit EGF vor der Zelllyse zu einem raschen Anstieg der Phosphorylierung des EGF-Rezeptors sowie vielen anderen Proteinen sowohl in CO12 20c2- als auch A431-Zellen führt, sieht man wenig oder keine Veränderung in den Tyrosin-Phasphoproteinen im HC2 20d2. Weiterhin erkennt man einen Unterschied im gesamten Satz der Tyrosin-phosphorylierten Proteine im HC2 20d2 im Vergleich zu CO12 20c2. Obwohl die Proteine, die in den HC2 20d2-Zellen phosphoryliert sind, auch in den EGF-stimulierten CO12 20c2-Zellen vorhanden sind, scheinen speziell in Ersteren weniger Banden vorhanden zu sein als in Letzteren. Neben dem EGF-Rezeptor selbst befinden sich die Haupt-Phosphorproteine, die in beiden Klonen vorhanden sind, in drei Hauptbanden mit scheinbaren Molmassen von ca. 55–66 kDa, 33–37 kDa und 22–26 kDa. Die gleichen Proteine werden auch in EGF-stimulierten A431-Zellen Tyrosin-phosphoryliert. Dieser Unterschied in den Phosphorylierungsmustern beruht nicht allein auf der Langzeitstimulierung durch den mutierten EGF-Rezeptor, da eine vergleichbare Stimulierung durch den normalen EGF-Rezeptor mittels Zugabe von EGF in A431- oder CO12 20c2-Zellen nicht zum gleichen Muster führt. Unter Verwendung einer Affinitätssäule, die für den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III spezifisch ist, wurde gezeigt, dass Proteine in den Tyrosin-phosphorylierten Banden von ca. 35 und 55–66 kDa, die man in den gesamten HC2 20d2-Lysaten sieht, sogar in Abwesenheit von EGF-Stimulierung an diese Rezeptoren binden, was nahelegt, dass diese Proteine an der Signaltransduktion aus den EGF-Rezeptoren beteiligt sind, und dass diese Zelllinien eine ausgezeichnete Quelle zur Reinigung dieser Proteine darstellen.
Zelllinien, die niedrige Gehalte an mutiertem Rezeptor exprimieren, haben keine hohen Niveaus an EGF-Rezeptoraktivität und bilden auch keine Tumore, wenn sie in Mäuse injiziert werden. Wegen ihrer einzigartigen Eigenschaften sind die hier beschriebenen Klone und Zelllinien, die diese Klone enthalten, in einer ganzen Reihe verschiedener Anwendungen nützlich. Insbesondere können diese Zelllinien oder Tumore, die in Mäusen aus diesen Zelllinien gebildet wurden, verwendet werden, um Verbindungen zu untersuchen, welche den EGF-Rezeptor ohne Zugabe von EGF inhibieren. Andere Zelllinien erfordern die Zugabe von EGF, um solche Untersuchungen durchzuführen, was solche Experimente teurer und umständlicher macht. Somit stellen die hier beschriebenen Zelllinien ein kostengünstiges und bequemes Verfahren zum Screening von Verbindungen zur Verfügung, die potentiell mit dem EGF-Rezeptor wechselwirken. Kultivierte Zellen können in der Testverbindung behandelt werden und dann auf morphologische Anzeichen für die Reversion des transformierten Phänotyps, abnehmendes Zellwachstum, eine Abnahme des Phosphotyrosingehalts der behandelten Zellen oder eine Abnahme der Kinaseaktivität des mutierten Rezeptors untersucht wer den. Weiterhin sind die Tumore, die durch diese Zelllinien in Mäusen gebildet werden, ein nützliches Modell zur Evaluierung von Tumorimpfstoffen, monoklonalen Antikörpern oder Antisense-Verbindungen, die gegen den mutierten Rezeptor gerichtet sind. Mäuse, die durch Injektion dieser Zelllinie Tumore haben, sind nützlich bei der Herstellung und Evaluierung von Wirkstoffen, die an der Immunreaktion gegen diesen Tumor beteiligt sind. Die Mäuse können mit einem Testwirkstoff behandelt werden, und dann können die hier beschriebenen Zelllinien injiziert werden, um zu sehen, ob die Mittel die Tumorbildung verhindern oder das Tumorwachstum verlangsamen. Alternativ können den Mäusen erst die hier beschriebenen Zelllinien injiziert werden, und dann können sie mit einem Testwirkstoff behandelt werden, um zu sehen, ob dieser Wirkstoff die Rückbildung der Tumorgröße oder die Verlängerung der Lebensdauer bewirkt. Da der Rezeptor in diesen Zelllinien konstant aktiv ist, können sie auch verwendet werden, um Proteine und/oder Gene zu untersuchen, die am biochemischen Weg dieses Rezeptors und der Entstehung von Tumoren beteiligt sind. Die hier beschriebenen Zelllinien können auch zur Identifizierung und als Quelle von Proteinen und entsprechenden cDNA-Klonen verwendet werden, die am Signaltransduktionsweg des EGF-Rezeptors und an der Tumorentstehung beteiligt sind. Tyrosin-phosphorylierte Proteine, die aus diesen Zelllinien hergestellt werden, können mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Sequenzen dieser Proteine werden dann durch Protein-Mikrosequenzierungstechniken bestimmt, um die Nukleinsäureinformation zu erhalten. Diese Information wird verwendet, um cDNA-Klone zu erhalten. cDNA-Klone, die an der Tumorentstehung beteiligt sind, werden erhalten durch Subtraktions-cDNA-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung von cDNA aus Mutterzellen zur Subtraktion von cDNA, die aus den hier beschriebenen Zellen abstammt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Impfstoff zur Verfügung gestellt, der eine Peptidsequenz aus der Fusionsverbindungsstelle umfasst, die im mutierten menschlichen EGF-Rezeptor vorliegt. Das Peptid im erfindungsgemäßen Impfstoff muss eine hinreichende Ähnlichkeit mit Teilen der Sequenzen aus den zwei ursprünglich voneinander entfernten Teilen des normalen EGF-Rezeptors aufweisen, um eine Immunreaktion gegen den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III hervorzurufen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst dieses Peptid mindestens eine Aminosäuresequenz proximal zu und einschließlich der Amino säure in Position 5 der Aminosäuresequenz des normalen EGF-Rezeptors, wobei es sich um Lysin handelt, gefolgt von einem Glycin und einer Aminosäuresequenz distal zu und einschließlich der Aminosäure in Position 274 des normalen EGF-Rezeptors, bei der es sich um Asparagin handelt (Ullrich et al., Nature 1984, 309, 418–425). In einer noch bevorzugteren Ausführungsform umfasst dieser Impfstoff die Peptidsequenz LEEKKGNYWTDHC (SEQ ID-NR.: 1). Wie Fachleuten auf dem Gebiet nach dieser Veröffentlichung offensichtlich sein wird, können in der vorliegenden Erfindung auch ähnliche Peptide mit Modifikationen hinsichtlich der Länge oder der Sequenz verwendet werden, die in der Lage sind, eine Immunreaktion hervorzurufen. Es ist bevorzugt, dass das Peptid im Impfstoff mit einem Träger konjugiert ist, beispielsweise mit Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin (KLH), Rinderserumalbumin oder menschlichem Serumalbumin. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann auch ein Adjuvans umfassen. Die im Impfstoff verwendbaren Adjuvantien sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt, und somit kann die Auswahl eines geeigneten Adjuvans durch einen Fachmann auf dem Gebiet nach dieser Veröffentlichung routinemäßig durchgeführt werden. Beispiele eines verwendbaren Adjuvans umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, komplettes und inkomplettes Freund-Adjuvans, Mineralgele, wie beispielsweise Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie beispielsweise Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide und Ölemulsionen.
Frühere Forscher haben festgestellt, dass viele Impfstoffe auf der Basis von Peptidsequenzen nur sehr schlecht die Bildung von Tumoren verhinderten, und dass alle diese Peptidimpfstoffe nicht die Rückbildung von bestehenden Tumoren bewirken konnten. Im Gegensatz dazu wurde nun festgestellt, dass die Immunisierung mit dem Peptidimpfstoff der vorliegenden Erfindung vor der Bildung von Tumoren schützt. Mäuse wurden entweder mit dem Peptidimpfstoff oder einem Kontrollimpfstoff in komplettem Freund-Adjuvans und anschließend zwei Wochen später in inkomplettem Freund-Adjuvans geimpft. Nach weiteren zwei Wochen injizierte man den Tieren 10⁷ NM#3 HC2 20d2/c-Zellen. Vier von sechzehn Mäusen, die den Peptidimpfstoff erhalten hatten, entwickelten Tumore, und in zwei dieser Mäuse erreichte der Tumor eine solche Größe, dass sie getötet werden mussten. Im Gegensatz dazu entwickelten 13 der 15 Mäuse, die den Kontrollimpfstoff erhalten hatten, Tumore, und in 9 Mäusen erreichte der Tumor eine solche Größe, dass sie getötet werden mussten. Somit führte die vorherige Impfung mit dem Peptidimpfstoff der vorliegenden Erfindung zu einer signifikanten Abnahme beim Gesamtvorkommen der Tumorbildung und wirkte sich auch auf die endgültige Tumorgröße aus. Einige der Tiere, die den Peptidimpfstoff erhalten hatten, wurden in Zeiträumen von sechs Monaten bis einem Jahr später erneut mit 10⁷ HC2 20d2/c-Zellen behandelt. Es wurde keine Tumorbildung festgestellt.
Es wurde auch festgestellt, dass der Peptidimpfstoff die Abstoßung von bestehenden Tumoren verstärkt. Bei sechzig Mäusen wurden 10⁷ NM#3 HC2 20d2/c-Zellen subkutan (s.c.) injiziert. Vier Tage später wurde bei der Hälfte der Mäuse der Peptidimpfstoff der vorliegenden Erfindung in komplettem Freund-Adjuvans injiziert. Die andere Hälfte erhielt nur einen Träger und komplettes Freund-Adjuvans. Während die Tumore in beiden Reihen über etwa zwei Wochen fortschreitend wuchsen, zeigten die Mäuse, die mit dem Peptidimpfstoff geimpft waren, verstärkte Tumorabstoßung ab dem Zeitpunkt der Impfung im Vergleich mit den Kontrollmäusen. Die Impfung hatte auch einen Einfluss auf die endgültige Tumorgröße, da Tiere, die den Peptidimpfstoff erhielten, kleinere Tumorvolumina hatten. In der Kontrollimpfungsgruppe mussten dreizehn Tiere getötet werden, während es in der peptidgeimpften Gruppe 8 Tiere waren. Dagegen zeigten fünf der Tiere aus der Gruppe, die den Peptidimpfstoff erhalten hatten, eine vollständige Rückbildung des ursprünglichen Tumors, aber ungefähr 40 bis 50 Tage später entwickelten sie einen zweiten Tumor. Diese rezidivierenden Tumore wurden mittels Western-Blot-Analyse hinsichtlich der Expression der EGFR-Mutante vom Typ III untersucht. Nur bei einem der Sekundärtumore zeigte sich ein Hinweis auf die Expression der EGFR-Mutante vom Typ III. Zum Vergleich wurden fünf Tumore aus kontrollgeimpften Mäusen, die getötet worden waren, auch hinsichtlich der Expression der EGFR-Mutante vom Typ III getestet; nur in einem dieser Tumore wurde dieses Protein nicht exprimiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Immunsystem in Mäusen, die den Peptidimpfstoff erhalten hatten, erfolgreich alle Zellen ausgerottet hatte, die den mutierten Rezeptor exprimieren, und dass der nachfolgende Tumor aus Zellvarianten in der ursprünglichen Tumormasse entstand.
CTL-Assays zeigten, dass Lymphozyten, die aus Tieren isoliert wurden, welche mit dem Peptidimpfstoff der vorliegenden Erfindung immunisiert worden waren, eine spezifische Auflösung von HC2-Zellen, aber nicht von CO12-Zellen oder NIH 3T3-Zellen zeigten, wodurch gezeigt wurde, dass es eine CTL-Aktivität gab, die spezifisch gegen den mutierten Rezeptor gerichtet war. Lymphozyten aus kontrollgeimpften Mäusen zeigten keine spezifische Lyse irgendeiner dieser Zielzellen.
Die hier beschriebenen Zelllinien können als Immunogen zur Züchtung von Antikörpern verwendet werden. Das Injizieren dieser Zellen rief eine Antikörperreaktion hervor, die spezifisch für den mutierten Rezeptor war, und Antikörper von höherer Affinität ergab, als wenn sie vom Peptid allein hervorgerufen wurde. Impfung mit dem synthetischen 14-Aminosäurepeptid, das die Verbindungsstelle überbrückt, rief in Mäusen und Makaken keine Anti-EGF-Typ III-Aktivität hervor (Wikstrand et al. J. Neuroimmunol. 1993, 46, 165–174). Die Erzeugung von monoklonalen Ratten-Anti-EGFR-Antikörpern vom Typ III mit hoher Affinität wurde jedoch erreicht durch Immunisierung mit dem EGFR-Typ III-Molekül, entweder als Komponente der intakten Zelloberfläche oder von Mikrosomenpräparaten aus den Zelllinien der vorliegenden Erfindung. Zur Erzeugung dieser Antikörper können verschiedene aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden. Solche Antikörper umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Rekombinationsantikörper, einkettige Antikörper, Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek. Die Zellen können mit einem Adjuvans vermischt werden und in verschiedene Wirtstiere injiziert werden, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf, Kaninchen, Mäuse, Ratten, Ziegen und Pferde.
Peptide, Proteine oder Fragmente davon, die von diesen Zelllinien erzeugt werden, und zu spezifischer Immunaktivität fähig sind, können auch verwendet werden, um Antikörper dagegen zu züchten. Diese Peptide, Proteine oder Fragmente davon können mit einem immunogenen Träger konjugiert werden. Auch Adjuvantien können zusammen mit dem Peptid oder Protein verabreicht werden, um die immunologische Reaktion des Wirtstieres zu verstärken.
Adjuvantien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, komplettes und inkomplettes Freund-Adjuvans, Mineralgele, wie beispielsweise Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie beispielsweise Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide und Ölemulsionen.
Monoklonale Antikörper, die gegen die Zelllinien oder Peptide oder Proteine gezüchtet werden, die von den Zelllinien der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, können unter Verwendung irgendeiner Technik hergestellt werden, die die Erzeugung von Antikörpern durch kontinuierliche Zelllinienkultur ermöglicht. Beispielsweise wurden die monoklonalen Antikörper L8A4, Y10 und N10 hergestellt durch Impfen von BaIb/c-Mäusen mit einer Kombination aus HC2 20d2-Zellen und dem synthetischen 14-Aminosäurepeptid; mit HC2 20d2-Zellen, mikrosomalen HC2 20d2-Membranen und dem 14-Aminosäurepeptid; bzw. mikrosomalen HC2 20d2-Membranen und dem synthetischen 14-Aminosäurepeptid. Solche Techniken sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf, die Hybridomtechnik, ursprünglich beschrieben von Kohler und Milstein, Nature 1975, 256, 495–497, die Menschen-B-Zellen-Hybridomtechnik, beschrieben von Kosbor et al., Immunology Today 1983, 4, 72, und die EBV-Hybridomtechnik, beschrieben von Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96.
Antikörper, die gegen die Zelllinien oder Peptide oder Proteine, die von diesen Zelllinien exprimiert werden, gezüchtet werden, können dann verwendet werden, um biologische Proben hinsichtlich des Vorkommens und der subzellulären Verteilung ähnlicher Proteine zu untersuchen. Unter Verwendung der monoklonalen Antikörper L8A4 und Y10 wurde gezeigt, dass die Verbreitung von EGFR-Typ III-Expression in Gliomen noch höher ist als ursprünglich angenommen. EGFR-Typ III war auch in Brustkarzinom und nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom leicht nachweisbar. Dieser mutierte Rezeptor wurde auch in Eierstocktumoren identifiziert.
Die hier beschriebenen monoklonalen Antikörper können auch als Medikamente verwendet werden. Bei Gliatumoren gab es verschiedene klinische Versuche, Antikörper gegen den EGF-Rezeptor, der mit Radionukliden oder Toxinen konjugiert war, zu verwenden, um ein Abtöten der Tumorzellen zu bewirken (Brady et al., Intl. J. Rad. Onc., Biol. Phys. 1992, 22(1), 225–30, Masui et al., Cancer Research 1989, 49(13), 3482–8; Mendelsohn, J., Sem. Can. Biol. 1990, 1(5), 339–44; Mendelsohn, J., J. Steroid Biochem. & Mol. Biol. 1990, 37(6), 889– 92; Sawamura, Y. und DeTribolet, N., J. Neurosurgical Sci. 1990, 34(34), 265– 78). Dieser Ansatz nutzt die Tatsache aus, daß Gliatumoren sehr hohe Proteingehalte exprimieren; es gibt jedoch außerhalb des Gehirns verschiedene Organe, insbesondere die Leber, die vergleichbare Mengen an Proteinen exprimieren. Wie hier beschrieben, bleibt somit die Spezifität dieser Antikörper ein Problem, doch werden Antikörper gegen das mutierte Epitop gezüchtet, wodurch Spezifität und eine verringerte systemische Toxizität zur Verfügung gestellt werden.
Die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Internalisierung der monoklonalen Antikörper L8A4, N10 und Y10 wurde untersucht. Alle drei monoklonalen Antikörper wurden durch HC2 20d2-Zellen internalisiert. Die Geschwindigkeit und der Prozentsatz der monoklonalen Antikörper, die in die Zellen eindringen, sind für L8A4 und Y10 leicht unterschiedlich im Vergleich zu N10. Weniger mAb H10 geht von der Zelloberfläche verloren, und ein geringerer Prozentsatz der überstehenden Lösung der Zellkultur ist TCA-löslich, was darauf hinweist, dass ein Anteil des intakten N10 vor der Internalisierung und dem Abbau von den Zellen dissoziiert. In vivo-Bioverteilungsuntersuchungen zeigten, dass sich zwei dieser mAbs, nämlich L8A4 und H10, spezifisch auf EGFR-exprimierende Tumor-Xenotransplantate konzentrieren, die in nackten Mäusen gebildet waren. Somit wird angenommen, dass Antikörper, die gegen die hier beschriebenen Zelllinien gezüchtet wurden, als effektive Abgabemittel für chemotherapeutische Mittel dienen können, die zur Behandlung von Krebs nützlich sind.
Es werden hier auch Antisense-Oligonukleotide beschrieben, die gegen den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III gerichtet sind. Die Antisense-Oligonukleotide können Sequenzen aus den ursprünglich voneinander entfernten Teilen der normalen EGF-Rezeptor-cDNA enthalten. Dies würde Antisense-Nukleotidsequenzen proximal zu und einschließlich dem Nukleotid 274 umfassen, wie beschrieben von Ullrich et al., Nature 1984, 309, 418–425, verbunden mit AntisenseNukleotidsequenzen distal zu und einschließlich dem Nukleotid 1076. Dies kann die Sequenz 5'-CATAATTACCTTTCTTTT-3' (SEQ ID-NR.: 2) umfassen. Wie Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein wird, können auch ähnliche Sequenzen verwendet werden, die Modifikationen oder Längenvariationen enthalten, aber es ist ein essentielles Merkmal, dass die Sequenz 5'-TACCTT-3' enthalten muss. Es wurde festgestellt, dass diese Antisense-Oligonukleotide den mutierten Rezeptor herunterregulieren. Die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, um virale Replikationen zu inhibieren, wurde von vielen Forschern als Mittel verwendet, um die Expression einer großen Vielzahl von viralen und endogenen Transkripten selektiv auszuschalten. Man versteht heute wesentlich besser, wie Antisense wirkt und welche Verfahren diese Oligonukleotide noch effektiver machen. Antisensemittel aus DNA oder RNA werden vielfach verwendet. Antisense-DNA ver wendet Oligodesoxynukleotide, in denen das typische Oligomer eine Länge von 14 bis 21 Nukleotiden hat. Eine effektive Inhibierung wurde zwischen 1 und 50 μM beobachtet. Die Verwendung von Säugetier-Expressionsvektoren, um Antisense-RNA-Sequenzen zu exprimieren, kann auch eingesetzt werden, wenn Abbau oder schneller Schwund ein Problem ist, da das Antisense-Transkript konstant und endogen produziert wird. Antisense-Oligodesoxynukleotide gegen den grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor wurden von Morrison verwendet, um das Wachstum der menschlichen Gliom-Zelllinie SNB-19 spezifisch zu inhibieren (Morrison, J. Biol. Chem. 1991, 266(2), 728–34). Eine 50 μM-Konzentration an Antisense-Primer führte zu einer 80%-igen Inhibierung des Wachstums. Antisense-RNA gegen den EGF-Rezeptor wurde von zwei verschiedenen Laboratorien erfolgreich verwendet, um das Wachstum der Plattenepithelzelllinien NA und KB zu inhibieren (Moroni et al., J. Biol. Chem. 1992, 267, 2714–2723; Yamada et al., Exp. Cell Res. 1989, 184, 90–98). Beide Gruppen konnten zeigen, dass eine Verringerung der Proteinmenge mit einer Abnahme der Wachstumseigenschaften dieser Zellen korrelierte. Es wurde auch gezeigt, dass Antisense-RNA gegen das EGF-I-Gen nicht nur die Menge an Protein reduzierte, sondern auch die Immunogenität eines bereits bestehenden Tumors verstärkte (Trojan et al., Science 1993, 259, 94–97).
Wie hier beschrieben, wurden Oligonukleotide, die gegen den mutierten Rezeptor gerichtet sind, durch Standard-B-Cyanethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert und durch Ethanolfällung gereinigt. Andere Synthesemethoden, die für Fachleute auf dem Gebiet Routine sind, können auch verwendet werden. Beispielsweise wurde ein Antisense-Oligomer mit der Sequenz 5'-CATAATTACCTTTCTTTT-3' (SEQ ID-NR.: 2) synthetisiert. Ein Sense-Oligomer mit der Sequenz 5'-AAAAGAAGGTAATTATG-3' (SEQ ID-NR.: 3) wurde ebenfalls synthetisiert. Die hier beschriebenen Zellen, welche den mutierten EGF-Rezeptor überexprimieren, wurden mit jeweils 2,5, 10 oder 40 μM Sense- oder Antisense-Oligonukleotid behandelt. Frisches Oligomer wurde täglich über insgesamt vier Tage zugegeben. Die Zellen wurden dann lysiert, auf SDS-PAGE laufengelassen und auf Nitrocellulose transferiert. Der Blot wurde mit einem Antikörper gegen den mutierten Rezeptor inkubiert. Es wurde festgestellt, dass in den mit Antisense behandelten Zellen der mutierte Rezeptor vorzugsweise heruntergeregelt wurde, was bei der 40 μM-Dosis besonders deutlich ist. Somit können diese Antisense- Wirkstoffe verwendet werden, um die Expression dieses mutierten Rezeptors zu verringern.
Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele sollen die Erfindung weiter veranschaulichen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Konstruktion von Expressionvektoren
Eine vollständig sequenzierte EGF-Rezeptor-cDNA mit voller Länge wurde als Basis für die Erzeugung von mutierten Rezeptoren verwendet. Das Plasmidkonstrukt pCO12, welches die normale menschliche EGF-Rezeptor-cDNA enthält, wurde aus NCl erhalten und entspricht der Sequenz der cDNA, die von Ullrich et al., Nature 1984, 309, 418–425, bestimmt wurde. Die EGF-Rezeptor-cDNA wurde in den Säugetier-Expressionsvektor pLTR-2 kloniert, welcher unter Verwendung des Promotors der langen Terminalwiederholungen (LTR, = Long Terminal Repeat) des Moloney-Rattenleukämievirus die Transkription bewirkt. Dieses Konstrukt wurde pLTR2-CO12 genannt. Um ein Konstrukt, das den mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III exprimiert, zu erhalten, wurde ein Teil der Typ III-EGF-Rezeptor-cDNA aus einer cDNA-Bibliothek kloniert, die aus einem menschlichen Glioblastomtumor, D270, hergestellt wurde, der diese spezielle Mutante überexprimiert. Ein 25I bp Sst I-Dra I-Fragment, das die anormale Fusionsverbindungsstelle umfasst, wurde mit einem 2,9-kb DraI-XhoI-Fragment aus pCO12 verbunden. Dieses Konstrukt, genannt pLTR2-HC2, würde den mutierten EGF-Rezeptor exprimieren, war aber sonst identisch mit dem Konstrukt, das den normalen EGF-Rezeptor exprimiert.
Beispiel 2: Transfektion und Ableitung von Zelllinien, die hohe Gehalte an mutiertem EGF-Rezeptor exprimieren
NIH-3T3-Zellen wurden aus dem ATCC erhalten. Die NIH-3T3-Zelllinie wurde in DMEM mit 10% Kalbsserum gehalten. NIH-3T3-Zellen wurden mit 1 × 10⁶ Zellen/100 mm auf Platten aufgetragen. Am nächsten Tag wurde das Medium ausgetauscht, und 3 Stunden später wurden die Zellen unter Verwendung einer modifizierten Version des Standard-Calciumphosphat-Transfektionsverfahrens transfiziert. Die Zellen wurden mit pLTR C12, pLTR-HC2 oder dem pLTR2-Vektor allein plus dem pKOneo (2 μg) in Verhältnissen von 10 : 1 und 20 : 1 (Gew./Gew.) cotransfiziert. Am nächsten Tag wurde das Medium ersetzt, und 2 Tage später wurden die Zellen auf jeder Platte trypsinisiert und in 10%-igem Kalbsserummedium, das 350 μg/ml G418-Sulfat (komplettes Medium) (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD) 1 : 5 aufgespalten. Innerhalb von 2 Wochen zeigten sich einzelne G418-resistente Kolonien. Diese wurden gesammelt und erst in 25 cm²-Kolben und dann in 75 cm²-Kolben ausgebreitet. Wenn genügend Zellen vorhanden waren, wurden die Subklone zunächst, wie oben beschrieben, mittels Western-Blot hinsichtlich der Proteingehalte analysiert. Sofortiges Screening der Proteinmengen war die effizienteste Methode, um Subklone mit dem gewünschten Gehalt an Proteinexpression zu erhalten, und war entscheidend für die Ableitung von Klonen mit hohen Expressionsniveaus. Insgesamt wurden 32 CO12- und 34 HC2-Klone mittels Western-Blotting untersucht. Wenn geeignete Klone gefunden waren, wurden sie ausgebreitet und dann mittels Southern-Blot analysiert, um die Genomintegration festzustellen. Vier HC2-Klone erzeugten nachweisbare Gehalte an mutiertem EGF-Rezeptor. Um sicherzustellen, dass die Zelllinien hohe einheitliche Expressionsniveaus hatten, wurde jede Zelllinie, wie in Beispiel 4 beschrieben, in weichem Agar als Kultur angesetzt.
Beispiel 3: Western-Blotting und Immunnachweis von menschlichen EGF-Rezeptoren und Tyrosin-phosphorylierten Proteinen
Zellen wurden in PBS/TDS-Puffer (10 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 1% Triton X-100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat, 0,2% Natriumazid und 0,004% Natriumfluorid), welcher 1 mM Natriumorthovanadat enthielt, bei pH 7,25 lysiert. Die Proteinkonzentrationen wurden nach dem Bradford-Farbstoffbindungsverfahren (BioRad, Hercules, CA) bestimmt. Die Lysate wurden mit gleichen Volumina 2 × Probenpuffer, der 6% SDS und 10% β-Mercaptoethanol enthielt, vermischt, 3 Minuten lang gekocht und auf 7,5% SDS-PAGE-Gelen mit 3,5% Polyacrylamidzuleitungen in einem diskontinuierlichen Puffersystem elektrophoretisch getrennt. Die Proteine wurden mit einer halbtrocken Übertragungsapparatur auf Nitrocellulosemembranen übertragen, und die Membranen wurden in Blotto/TTBS blockiert. Die Membranen wurden zwei Stunden lang in Blotto/TTBS mit primärem Antikörper inkubiert. Antikörper gegen intrazelluläre Epitope des menschlichen EGF-Rezeptors (Klon Z025) oder die aktivierte Form des menschlichen EGF-Rezeptors (Klon Z026) stammten von Zy med Immunochemicals (San Francisco, CA), und wurden in Konzentrationen von 0,5 μg/ml verwendet; Antikörper gegen Phosphotyrosin (Kon 4G10) stammten von Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY), und wurden in einer Konzentration von 1 μg/ml verwendet. Nach dem Waschen mit TTBS wurden die Blots 1 Stunde lang mit ¹²⁵I-Schafs-Antimaus-Ig F(ab')₂ (Amersham, Arlington Heigths, IL) bei 0,3 μCi/ml inkubiert und bei –80°C 1 bis 3 Tage lang ausgesetzt.
Beispiel 4: Klonieren von Zelllinien in weichem Agar, um die HC2 20d2-Serie von Zelllinien zu erhalten, die hohe Gehalte an mutiertem EGF-Rezeptor exprimieren
Kulturen in weichem Agar wurden unter Verwendung von Agarose mit niedriger Geliertemperatur (Typ VII, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) hergestellt. Unterlagen, die komplettes Medium mit 10% Kalbsserum plus 0,6% Agarose enthielten, wurden verteilt (2 ml/35 mm Schale) und bei Raumtemperatur gelieren gelassen. Zellen aus Kulturen, die noch nicht zusammengeflossen waren, wurden trypsinisiert und mit 5000 Zellen/Schale in 1 ml komplettem Medium mit 0,3% Agarose mit oder ohne 20 ng/ml EGF auf Platten verteilt. Nach 7 bzw. 14 Tagen wurden die Kulturen aufgefüllt und am 21. Tag gezählt. Kolonien, die größer als 60 μm im Durchmesser waren, wurden gezählt.
Nach der Auswahl der Zelllinien zeigte eine immunozytochemische Analyse, dass das Expressionsniveau in einer gegebenen Zelllinie von einer Zelle zur anderen erheblich variieren konnte. Daher wurden verschiedene Zelllinien weiter subkloniert, um möglichst eine Serie zu erhalten, die gleichmäßig hohe Gehalte an mutiertem Rezeptor exprimierte. Wie beschrieben, wurden Zellen auf Platten aus weichem Agar verteilt, und große Kolonien, die sich in Abwesenheit von EGF bildeten, wurden entnommen und in Monolayer-Kulturen vergrößert. Die Zellen wurden dann mittels Western-Blotting und Immunochemie auf Expression des mutierten Rezeptors analysiert. Dies führte zur Auswahl mehrerer Subklone nach dieser Methode, welche verschiedene Gehalte an mutiertem EGF-Rezeptor exprimierten. Die mit HC2 20d2/b und HC2 20d2/c bezeichneten Subklone exprimierten ähnliche, sehr hohe Gehalte des mutierten EGF-Rezeptors, die denen glichen, die in einigen menschlichen Glioblastomtumoren beobachtet wurden. Diese neuen Zelllinien wurden vergrößert, und eingefrorene Vorräte wurden bei niedrigem Durchgang hergestellt. Dies war insofern wesentlich, als das Expressionsniveau des mutierten Rezeptors in vitro allmählich abnahm, obwohl wesentliche Expression über zehn 1 : 100-Durchgänge beibehalten wird.
Beispiel 5: Tumorbildende Wirkung in athymischen Mäusen
HC2 20d2/c-Zellen wurden auf ihre tumorbildende Wirkung in sechs Wochen alten, nackten Mäusen (BALB/c nu/nu, weiblich) getestet. 1 × 10⁶ Zellen in 0,25 ml PBS wurden subkutan in die Hinterlende von sechs Mäusen injiziert. Die Mäuse wurden alle zwei Wochen abgetastet und 2 Monate lang beobachtet. In den meisten Tieren waren innerhalb einer Woche Tumore nachweisbar, und alle Tiere mussten aufgrund der rasch wachsenden Tumore nach zwei Monaten getötet werden. Alle Tumore exprimierten weiterhin hohe Gehalte an mutiertem EGF-Rezeptor, und G418-resistente Zelllinien wurden leicht aus den herausgeschnittenen Tumoren erhalten. Eine solche Zelllinie, als NM#3 HC2 20d2/c bezeichnet, wurde für alle nachfolgenden Untersuchungen zur Tumorbildung verwendet.
Beispiel 6: Tumorbildung in NIN-Swiss-Mäusen
Nach der Feststellung, dass HC2 20d2/c-Zellen in athymischen Mäusen tumorbildend waren, wurde ihre Tumorbildungseigenschaft in syngenen Mäusen mit normaler Immunfunktion untersucht. NIH-Swiss-Mäuse wurden, wie oben beschrieben, mit 10⁴, 10⁵, 10⁶ oder 10⁷ Zellen injiziert; für jede Dosis 2 Tiere. Die Tiere, die 10⁶ oder 10⁷ Zellen erhalten hatten, entwickelten innerhalb einer Woche Tumore, und diese wuchsen fortgesetzt über mehrere Wochen, bevor sie sich in 3 der 4 Tiere in diesem Experiment zurückbildeten. Der Tumor in einem der Tiere mit der 10⁷-Dosis wuchs fortgesetzt weiter, bis es nötig war, das Tier zu töten. Aus diesem Tumor wurde eine G418-resistente Zelllinie erhalten, und diese Zellen, als HC2/NS1 bezeichnet, exprimierten fortlaufend einen hohen Gehalt an mutiertem, menschlichem EGF-Rezeptor.
Beispiel 7: Peptidimpfstoff
Das Peptid, welches die neuartige Sequenz an der Fusionsverbindungsstelle, die im mutierten menschlichen EGF-Rezeptor vorliegt, umfasst (LEEKKGNYVVTDHC (SEC ID-NR.: 1)), wurde nach Standardmethoden synthetisiert; der carboxyterminierte Cysteinrest war enthalten, um die Konjugation des Peptids an die Träger Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin (KLH) und Rinderserumalbumin (BSA) unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagens Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) zu erleichtern. Diese Konjugate werden als "KLH-LEEK" und "BSA-LEEK" bezeichnet; das Erstere wurde für alle Impfungen verwendet, und das Letztere für das Titrieren der Serum-Antikörper. Für anfängliche Impfungen wurden Mäuse (weibliche NIH-Swiss) subkutan mit 0,1 ml einer Emulsion aus gleichen Teilen komplettem Freund-Adjuvans und KLH-LEEK bei 100 μg/ml in PBS injiziert. Bei nachfolgenden Injektionen wurde inkomplettes Freund-Adjuvans verwendet.
Beispiel 8: Assay der zytotoxischen T-Lymphozyten
Aus getöteten Tieren wurde die Milz entnommen, mit PBS gespült und nach Standardmethoden auseinandergenommen. Nach dem Waschen wurden die Zellen in RPMI 1640, das 10% FBS, 5,5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol, 0,1 mM Eagle's MEM nichtessentielle Aminosäuren (NEAA), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 100 μg/ml Kanamycin plus 2 μg/ml Concanavalin A oder LEEK-Peptid enthielt, auf Platten verteilt. Vor ihrer Verwendung in Assays der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) wurden die Milzzellen 3 bis 4 Tage lang bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Die Assays wurden nach Standardverfahren durchgeführt, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, oder nach folgender Modifikation: Zielzellen (NM#3 HC2 20d2/c als spezifische Ziele; CO12 20c2/b, ein NIH-3T3-transfizierter Klon, der den normalen menschlichen EGF-Rezeptor überexprimiert, wurde als unspezifisches Kontrollziel verwendet) wurden mit 200000 Zellen/16 mm-Vertiefung in Falcon-Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen verteilt, und vor ihrer Verwendung 3 Tage lang inkubiert. Die Zielzellen wurden in situ eine Stunde lang mit-100 μCi/1 × 10⁷ Zellen ⁵¹Cr markiert, 3 × gewaschen, und die Effektorzellen wurden in verschiedenen Verhältnissen in jeweils drei Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 4 bis 5 Stunden lang inkubiert, und Aliquots wurden in einem Gammazähler quantitativ gemessen, um das Ausmaß der spezifischen Lyse zu bestimmen.
Beispiel 9: Antisense-Oligonukleotide gegen den mutierten Rezeptor
Die Sequenz des verwendeten Antisense-Oligomers war 5'-CATAAA-TTACCTTTCTTTT-3' (SEQ ID-NR.: 2). Die Sequenz des verwendeten Sense-Oligomers war 5'-/λAAAGAAAGGTAATTATG-3' (SEQ ID-NR.: 3). Die Oligonukleotide wurden mittels standardmäßiger B-Cyanethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert und mittels Ethanolfällung gereinigt.
1 × 10⁵ HC2 20d2/c-Zellen wurden in 35 mm²-Vertiefungen als Kulturen angesetzt, und 24 Stunden später wurden die Zellen mit 2, 5, 10 oder 40 μM Sense- bzw. Antisense-Oligonukleotid behandelt. Über insgesamt vier Tage wurde täglich frisches Oligomer zugesetzt. Die Zellen wurden dann lysiert, auf SDS-PAGE laufengelassen und auf Nitrocellulose transferiert. Der Blot wurde dann mit einem Antikörper gegen den mutierten Rezeptor inkubiert. Dies zeigt, dass es ein bevorzugtes Herunterregeln des mutierten Rezeptors in den mit Antisense behandelten Zellen gab, was besonders bei der 40 μM-Dosis offensichtlich ist.
Beispiel 10: Herstellung und. Charakterisierung von monoklonalen Antikör pern gegen den mutierten Rezeptor
Pep 3, ein 14-Aminosäurepeptid, das der vorhergesagten Aminosäuresequenz an der Fusionsverbindungsstelle entspricht, wurde synthetisiert, gereinigt und an Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin von Anaspec Inc. (San Jose, CA) gebunden. Ein 10-Aminosäurepeptid mit nicht verwandter Struktur, Pep 1, diente als negative Kontrollprobe.
Die Zelllinie HC2 20d2 wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch Transfektion von NIH 3T3-Zellen erhalten.
Um mikrosomale Membranfraktionen herzustellen, wurden 10 Gramm HC2 20d2-Zellen oder A431-Xenotransplantate von athymischen Mäusen in 20 mM Tris-Puffer, pH 7,4, der 0,3 M Saccharose und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, bei 4°C homogenisiert. Die Homogenisate wurden 20 Minuten lang bei 15000 × g zentrifugiert. Die überstehenden Lösungen wurden dann 30 Minuten lang bei 150000 × g zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde solange mittels Ultrazentrifugieren gewaschen, bis die überstehende Lösung frei von Protein war. Das endgültige Pellet wurde in 1 ml 115 mM Phosphatpufter pro Gramm homogenisiertem Gewebe resuspendiert und bei –135°C gelagert.
Wie in der folgenden Tabelle gezeigt, wurden bei vier kombinierten Immunisierungsprotokollen die folgenden Immunogene verwendet: Pep 3, konjugiert mit Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin in einer 1 : 1-Emulsion in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit komplettem Freund-Adjuvans (Difco, Detroit, MI), inkomplettem Freund-Adjuvans oder in DPBS allein; Collagenase-disaggregierte D-270MG-Xenotransplantatzellen (D-270 MG-X); kultivierte HC2 20d2-Zellen, die mit 0,02% EDTA-DPBS gesammelt waren; und Präparate von mikrosomalen Membranen aus HC2 20d2-Xenotransplantatzellen. Weibliche BALB/c-Mäuse, die zum Zeitpunkt der Immunisierung 8 bis 15 Wochen alt waren, wurden verwendet. Vor der Fusion waren im Allgemeinen reziproke 50%-Endpunkttiter oberhalb von 5000 gegenüber Pep 3 und dem Rezeptortarget erforderlich.
Tabelle: Anti-EGFR-Typ III-mAbs
Fusionen wurden mit der nicht Immunoglobulin absondernden Kearney-Variante von P3X63/Ag8, 653 nach Standardverfahren durchgeführt, wie von Wikstrand et al. J. Neuroimmunol. 1982, 3, 4362, beschrieben. Die überstehenden Lösungen wurden auf positives Pep 3 und D-270 MG-X oder HC2 20d2 und auf fehlende Reaktivität gegenüber nicht-transfizierten NIH 3T3-Zellen und A431-(normales) EGFR untersucht. Die im Protokoll 4 erhaltenen Hybride wurden an fänglich auf HC2 20d2-Extraktpräparat hinsichtlich positiven Ergebnissen und auf A431-Extraktpräparat zur Bestimmung der Spezifität untersucht.
Antikörpertiter gegen die auf Platten gezüchteten Peptide wurden mittels ELISA und RIA bestimmt. Ein Capture-ELISA-Assay unter sequentieller Verwendung von Schafs-Anti-EGFR-Intrazellulärdomänen-Antiserum (Life Technologies, Grand Island, NY) als Capture-Reagens, Antigenextrakt, überstehenden Lösungen von zukünftigem Anti-EGFR Typ III und Schafs-Antimaus-IgG Fc wurde verwendet, um die Hybridome aus Protokoll 4 zu untersuchen. Ein RIA wurde verwendet, um die Reaktivität gegen Zelllinien, die EGFR vom Typ III exprimieren, zu bestimmen. Eine modifizierte Scatchard-Analyse wurde verwendet, um die Bindungsaffinität von lodogen-katalysiert iodierten mAbs zu messen, beginnend mit seriell verdünntem, radiomarkiertem Antikörper bei 10 μg/ml gegen HC2 20d2- und NIH 3T3-Zellen. Die Daten wurden mit Hilfe des Gleichgewichts-Bindungsdaten-Analyseprogramms (Biomedical Computing Technology Information Center, Nashville, TN) analysiert. Die Ermittlung rückgewonnener Zellen am Ende des Verfahrens ermöglichte die Berechnung der Anzahl von EGFR-Typ III-Stellen pro Zelle. Iodierte Anti-EGFR-Typ III-mAbs wurden auch mittels Konkurrenz-Bindungsassay analysiert: 50 ng eines jeden iodierten mAb wurden in den isotypen Kontrollproben bis zum 1000-fachen Überschuss (50 μg/ml) mit Aceton-fixierten HC2 20d2-Zellen zur Reaktion gebracht. Nach 2-stündigem Inkubieren bei 37°C wurden die Platten gewaschen und die gebundenen ¹²⁵I-Zähler pro Vertiefung wurden bestimmt.
Beispiel 11: Immunohistochemische und RT-PCR-Analyse von normalen und neoplastischen menschlichen Geweben
Gereinigte mAbs wurden gegen Aceton-fixierte HC2 20d2-, NIH 3T3- und A431-Monolayer oder Aceton-fixierte, gefrorene, Abschnitte von D-256 MG- und D-245 MG-Gliom-Xenotransplantaten in athymischen Ratten gescreent. Es wurde festgestellt, dass die mAbs L8A4 und Y10 die optimalsten Reagenzien für die Immunohistochemie waren. Sie wurden in ein Antikörperfeld eingebracht, das aus affinitätsgereinigtem Pep 3-Kaninchenantiserum, mAb 528 und mAb 3B4 (allgemeine positive Kontrollprobe für menschliches Gewebe) bestand. Mab 528 wurde in die histochemische Analyse mit einbezogen, da es mit einem Epitop reagiert, das häufig in der extrazellulären Domäne sowohl des Wildtyp-EGFR als auch des EGFR vom Typ III vorkommt. Die immunohistochemische Analyse wurde an Aceton-fixierten (–70°C, 30 Sekunden) 5 bis 8 μm-Gewebeabschnitten aus normalem oder Tumorgewebe auf Labtek-Objektträgern nach Verfahren durchgeführt, die von Humphrey et al. Cancer Res. 1988, 48, 2231–2238, beschrieben wurden. Die untersuchten Gewebe umfassen 11 Fälle von Brustkarzinom, 31 Fälle von Gliom und ein Feld mit 35 Proben aus normalen Geweben.
Aus 10 Abschnitten der 11 Brustkarzinomproben wurde die RNA isoliert und unter Verwendung von RT-PCR auf EGFR-Typ III-Expression analysiert. Aus 2 × 20 μm-Abschnitten einer jeden Probe wurde die RNA unter Verwendung der Guanidiniumisothiocyanat-Säurephenol-Methode, wie beschrieben bei Chomczynski, P. und Sacchi, N. Anal. Biochem. 1987, 162, 156–159, gereinigt. Drei Mikrogramm Gesamt-RNA wurden mit 100 ng Random-Hexamerprimer (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) und RNasin (Promega, Madison, WI) vereinigt; die Lösung wurde 10 Minuten lang auf 68°C erhitzt und dann auf Eis gestellt. Dithiothreitol 0,1 M), dNTPs (jeweils 10 mM), Superscript-Reverse-Transkriptase (GIBCO-BRL), 5X-Superscript-Puffer und Wasser wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 15 Minuten lang auf 37°C und dann 60 Minuten lang auf 43°C erwärmt. Die cDNA-Synthesereaktion wurde durch Erhitzen auf 98°C beendet, und das Gemisch wurde bei –80°C gelagert. Unter Verwendung von 2 μl cDNA in einem Gesamt-Reaktionsgemischvolumen von 75 μl, das 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Promega); Taq-Puffer, der 1,5 mM Mg²⁺ enthielt, 0,6 μM EGFR-Forward-Primer und 0,6 μm EGFR-Reverse-Primer; und 200 μM Desoxynucleotidtriphosphate enthielt, wurde eine PCR durchgeführt. Es wurde eine Heißstarttechnik angewendet. Vierzig Verstärkungszyklen wurden durchgeführt [95°C über 80 Sekunden, 54°C über 1 Minute und 72°C über 2 Minuten] und die Endelongation wurde über 10 Minuten durchgeführt. Mit der Reaktion ließ man eine negative Kontrollprobe ohne Templat laufen. Die Produkte wurden analysiert durch Elektrophorese auf 2,0%-Agarosegelen in Triacetat-EDTA-Puffer (0,02 M Tris-Acetat – 0,001 M EDTA) unter Verwendung von 100 bp-Markern (GIBCO-BRL) als Größenstandard, gefolgt von Anfärben mittels Ethidiumbromid. Primer für die PCR von Wildtyp-EGFR oder Varianten waren Forward-5'-GGGGAATTCGCGATGCGACCCTCCGGG-3' (SEQ ID-NR.: 7) und Reverse-5'-GGGAAGCTTTCCGTTACACACTTTGCG-3' (SEQ ID-NR.: 8). Achtzehn Basen in jedem Primer waren komplementär zu den Nukleotidsequenzen für menschliches EGFR. Jeder Primer enthielt auch eine künstlich eingeführte Restriktionsstelle an seinem 5'-Ende, um das Klonieren der erhaltenen PCR-Produkte in einen pBluescript-Vektor (Stratagene, La Jolla, CA) zur Sequenzanalyse zu erleichtern. Wenn diese Primer verwendet werden, betragen die Größen der erwarteten normalen und EGFR-Typ III-Produkte 1037 bzw. 236 bp. Produkte, die einer PCR-Verstärkung von EGFR-Typ III mRNA entsprechen, waren in 3 von 3 Brustkarzinomgeweben vorhanden, die immunohistochemisch gegenüber L8A4 mAb reaktiv waren. In fünf weiteren Brustkarzinomen, von denen gezeigt worden war, dass sie keine immunohistochemische Reaktivität mit mAb L8A4 hatten, wurden darüber hinaus Banden nachgewiesen, die dem EGFR-Typ III entsprechen.
Beispiel 12: Radioassay für die mAb-Internalisierung
Radiomarkierte Anti-EGFR-Typ III-mAbs wurden 1 Stunde lang bei 4°C mit HC2 20d2-Zellen in Antikörperüberschuss (2,5 μg/10⁶ Zellen, bestimmt mittels analytischer Durchflusszytometrie) inkubiert. Ungebundenes mAb wurde durch Waschen mit kaltem, 1%-igem BSA-PBS abgetrennt, und die Zelldichte wurde in Zinc Option-Kulturmedium, das 10% FCS enthielt, wieder auf 2 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt. Die Zellen wurden gleichmäßig in 500 μl-Proben aufgeteilt, und die Kulturtemperatur wurde auf 37°C eingestellt. Die Proben wurden nach 0, 1, 2, 4, 8 und 20 Stunden nach folgendem Verfahren verarbeitet: Aus den Zellen wurden Pellets hergestellt, und die überstehenden Lösungen der Kulturen wurden abgetrennt und zum Zählen aufbewahrt. Zwei Waschvorgänge mit jeweils 600 μl Zinc Option (pH 2,0) wurden durchgeführt, unterbrochen durch 15-minütige Inkubationen bei 4°C. Aus den Zellen wurden Pellets hergestellt, und die Säurewaschlösungen wurden vereinigt und zusammen mit den Zellpellets und den überstehenden Lösungen der Zellkulturen in einem γ-Zähler gezählt. Die Zähler in der überstehenden Lösung der ursprünglichen Zellkultur wurden auch hinsichtlich der Löslichkeit in 12,5%-iger Trichloressigsäure untersucht.
Beispiel 13: Bioverteilungsuntersuchungen
Immunolokalisierungsuntersuchungen mit paarweiser Markierung wurden durchgeführt in Mäusen, die subkutane HC2 20d2-Xenotransplantate trugen. Athymische Mäuse, die 7 Tage alte Xenotransplantate trugen (Größe ungefähr 150–250 mm³) wurden nach Tumorvolumen stichprobenartig ausgewählt (berech net unter Verwendung der Formel L × W² × ½, wobei L und W die längsten Längs- und Diagonaldurchmesser des Tumors darstellen, gemessen mit Meßschiebern). Mittels Schwanzveneninjektion wurde den Mäusen 2,5 μg L8A4 oder H10 injiziert, markiert mit ¹²⁵I unter Verwendung von Tyramincellobiose (TCB), jeweils gepaart mit einer gleichen Menge an ¹³¹I-markiertem, Isotyp-passendem Kontroll-mAb von irrelevanter Spezifität, P3X63Ag8. Gruppen von jeweils 5 Mäusen wurden 4, 12, 24, 48, 72, 120 und 168 Stunden nach der mAb-Injektion getötet. Blutproben wurden durch Auftrennen der unteren Hohlvene erhalten. Anschließend wurde eine vollständige Sektion durchgeführt, und Gewebe, einschließlich Milz, Leber, Lunge, Herz, Schilddrüse, Magen, Dünndarm und Dickdarm, Blase, Knochen, Haut, Muskeln und Gehirn wurden zusätzlich zum Tumor isoliert. Alle Gewebe, einschließlich Blut, wurden in tarierten Röhrchen abgewogen und unter Verwendung eines Zweikanal-γ-Zählers auf ¹²⁵I- und ¹³¹I-Aktivität untersucht. Die Daten wurden hinsichtlich des Überlappens von ¹³³I- und ¹²⁵I-Signalen und des Zerfalls der Radioisotope korrigiert. Unter Verwendung von Injektionsdosis-Standards wurden Werte für injizierte Dosis/Gramm Gewebe in Prozent erhalten.
Die Spezifität der mAb-Aufnahme im Gewebe wurde bestimmt durch Berechnen des Lokalisierungsindex, ausgedrückt als cpm L8A4 oder H10 pro Gramm, geteilt durch cpm P3X63Ag8 pro Gramm im Gewebe, normalisiert auf das gleiche cpm-Verhältnis im Blut. Der maximale Tumor-Lokalisierungsindex (L8A4, 3,1 ± 0,5; H10, 3,0 + 0,9) tritt bei beiden monoklonalen Antikörpern zwischen den Tagen 2 und 7 auf und ist über diesen Zeitraum relativ konstant. Während des Experiments lagen die Lokalisierungsindizes für normales Gewebe zwischen 1,0 und 1,5 bei beiden mAbs. Milz- und Leberwerte waren geringfügig höher, aber niedriger als 2,0 am Tag 7 für mAb L8A4.
Geschätzte Strahlungsdosen für Tumor-Xenotransplantate und normale Gewebe nach einer hypothetischen 500 μCi-Injektion von ¹²⁵I-markiertem mAb wurden bestimmt. Die Prozentwerte injizierter Dosis/Gramm Gewebe für jedes Gewebe wurden in μCi/Gramm umgewandelt, und die Gesamtaktivität, die sich über das 7-Tage-Experiment in den Geweben angesammelt hatte, wurde bestimmt, indem die Fläche unter den μCi/Gramm-Kurven mittels Trapezintegration berechnet wurde. Die μCi-Stunde/Gramm-Werte wurden dann mit der Gleichgewichtskonstanten der absorbierten Dosis für die jeweilige ¹³¹I-Strahlung multipliziert.
SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung eines Peptids, umfassend eine Sequenz aus einer Fusionsverbindungsstelle in einem mutierten EDF-Rezeptor vom Typ III, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, wobei das Peptid in einem Objekt eine zytotoxische T-Zellen-Reaktion gegen einen Tumor, der einen mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III trägt, auslöst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin der Krebs ausgewählt ist aus Glioblastom, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, Brustkrebs und Eierstockkrebs.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, der einen mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III trägt.
Verwendung nach den Ansprüchen 1 oder 2, worin das Medikament die Rückbildung eines vorhandenen Tumors bewirkt, der einen mutierten EGF-Rezeptor vom Typ III trägt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt und worin das Peptid mindestens eine Aminosäuresequenz proximal zu und einschließlich der Aminosäure in Position 5 der Aminosäuresequenz des entsprechenden normalen, reifen EGF-Rezeptors des Objekts, und nachfolgend ein Glycin und eine Aminosäuresequenz distal zu und einschließlich der Aminosäure in Position 274 des entsprechenden normalen, reifen EGF-Rezeptors des Objekts umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin das Peptid die Sequenzidentifizierungsnummer (SEQ ID Nr.) 1 umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin das Peptid mit einem Träger konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 7, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin der Träger Schlüsselloch-Napfschneckenhämocyanin, Rinderserumalbumin oder menschliches Serumalbumin ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin das Medikament weiterhin ein Adjuvans umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin das Adjuvans ein komplettes Freund-Adjuvans, ein inkomplettes Freund-Adjuvans, ein Mineralgel, eine oberflächenaktive Substanz, ein Pluronic-Polyol, ein Polyanion, ein Peptid oder eine Ölemulsion ist.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin das Mineralgel Aluminiumhydroxid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 10, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin das oberflächenaktive Mittel Lysolecithin umfasst.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Medikament die Inhibierung der Bildung oder des Wachstums eines Tumors bewirkt, und worin das Objekt ein Mensch ist.