WO2017142294A1 - EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2017142294A1
WO2017142294A1 PCT/KR2017/001623 KR2017001623W WO2017142294A1 WO 2017142294 A1 WO2017142294 A1 WO 2017142294A1 KR 2017001623 W KR2017001623 W KR 2017001623W WO 2017142294 A1 WO2017142294 A1 WO 2017142294A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
egfrviii
antigen
cancer
sequence
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/001623
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
남도현
박현규
Original Assignee
사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사회복지법인 삼성생명공익재단 filed Critical 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority to SG11201806597XA priority Critical patent/SG11201806597XA/en
Priority to US16/073,787 priority patent/US10669340B2/en
Priority to AU2017219386A priority patent/AU2017219386B2/en
Priority to CN201780016803.8A priority patent/CN109476738A/zh
Priority to CA3013584A priority patent/CA3013584C/en
Priority to JP2018542731A priority patent/JP6795603B2/ja
Priority to EP17753455.9A priority patent/EP3418303A4/en
Priority claimed from KR1020170020416A external-priority patent/KR101887977B1/ko
Publication of WO2017142294A1 publication Critical patent/WO2017142294A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention provides an antibody to EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III) or an antigen-binding fragment thereof, a nucleic acid encoding the same, a vector comprising the nucleic acid, a cell transformed with the vector, the antibody or an antigen-binding fragment thereof. It relates to a method, a composition for preventing or treating cancer, a composition for diagnosing cancer, and a kit for diagnosing cancer.
  • antigen expressed on the cell surface of human cancer refers to a wide range of targets that are overexpressed or mutated and selectively expressed relative to normal tissue.
  • the key problem is identifying the appropriate antigen for antibody-based therapies. These therapeutic agents mediate changes in antigen or receptor function (ie, as a stimulant or antagonist), regulate the immune system through Fc and T cell activation, and through the delivery of specific drugs that bind to antibodies targeting specific antigens. It is effective. Molecular techniques that can alter antibody pharmacokinetics, functional function, size and immune stimulation are emerging as key elements in the development of novel antibody-based therapies.
  • Evidence from clinical trials of therapeutic antibodies in cancer patients is based on optimized antibodies, including affinity and binding of the target antigen and antibodies, selection of antibody structure, therapeutic approaches (blocking signaling or immune function). It highlights the importance of approaches for choice.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • the sequence of the EGFR gene is known.
  • the EGFR gene is a cell homologue of the erbB tumor gene originally identified in avian erythroblastosis virus. Activation of these tumor genes by gene amplification has been observed in various human tumors.
  • EGFR is overexpressed against various types of human solid tumors. EGFR overexpression has been observed in some lung, breast, colon, stomach, brain, bladder, head and neck, ovary, kidney and prostate carcinomas. Epithelial growth factor (EGF) and transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) have been shown to bind to EGFR to induce cell proliferation and tumor growth. In addition, size variant EGFR genes and amplification have been reported in some human cancers.
  • EGF epithelial growth factor
  • TGF-alpha transforming growth factor-alpha
  • EGFR variants are caused by gene rearrangements accompanied by EGFR gene amplification.
  • EGFRvIII consists of 267 aa in-frame deletions in the extracellular domain of EGFR, (iv) EGFRvIV comprises a deletion in the cytoplasmic domain of EGFR, and (v) EGFRvV is EGFR A deletion in the cytoplasmic domain of (vi) EGFR.TDM / 2-7 comprises replication of exon 2-7 in the extracellular domain of EGFR, and (vii) EGFR.TDM / 18-25 is a cell of EGFR The exogenous domain includes replication of exon 18-26, and (viii) EGFR.TDM / 18-26 comprises replication of exon 18-26 to tyrosine kinase of EGFR. There is also a rare second EGFRvIII mutant (EGFRvIII / ⁇ 12-13) with a second deletion introducing a new histidine residue at the junction of exons 11 and 14.
  • EGFRvIII is a variant of epidermal growth factor (EGF) most commonly occurring in human cancers, expressed in about 30% of glioblastoma (GBM) patients, but not in normal tissues.
  • EGF epidermal growth factor
  • GBM glioblastoma
  • Mutations or rearrangements of genes that potentially induce tumor formation can be identified in many cancers. Results have been published that cancer-causing proteins can contribute to pathways associated with cancer stem cells. Evidence suggests that the product of these modified genes can be used to identify and potentially target cancer stem cells. Indeed, this approach is not an easy method because these major mutations exist throughout cancer cells and do not exist only in specific cancer cell subtypes. Thus mutant proteins generally dominate tumor growth without playing any direct role in cancer stem cells. In addition, most modified proteins are inside the cell.
  • Glioblastoma tumors are known to frequently express EGFRvIII, an EGFR variant expressed through gene rearrangement and amplification. Since tyrosine phosphorylation sites are always present in an activated form, they exhibit strong tumorigenicity. However, despite this modification, the expression of EGFRvIII is limited.
  • Cancer stem cells are defined as having high expression of EGFRvIII with CD133 and having high regeneration and tumor initiation ability of EGFRvIII + / CD133 + cells.
  • EGFRvIII + cells are associated with stem / progenitor markers while differentiation markers were found in EGFRvIII- cells. EGFRvIII expression was lost in normal cell culture but maintained in tumor protoplast cultures and also cell cultured cells express and regenerate EGFRvIII + / CD133 + simultaneously and have tumor initiation capacity.
  • anti-EGFRvIII antibodies are required that can bind to EGFRvIII with high affinity and inhibit the growth of cancer cells.
  • Antibody therapeutics such as cetuximab and the like that specifically bind to conventional EGFR have been developed.
  • these antibody therapies have a problem that the antigen specificity for EGFRvIII mutant cancer cells is very poor, and cancer cell growth inhibitory ability does not appear.
  • the inventors of the present application have tried to develop an anti-cancer therapeutic antibody that specifically binds to EGFRvIII.
  • the present inventors have developed an anti-EGFRvIII antibody that binds to EGFRvIII with high affinity using phage display technology, and confirmed that the antibody to such anti-EGFRvIII can significantly inhibit the migration of cancer cells. Completed.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a vector comprising the nucleic acid, a cell transformed with the vector, and a method of manufacturing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating cancer comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Still another object of the present invention is to provide a cancer diagnostic composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof and a kit for cancer diagnosis comprising the same.
  • the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that binds to Epidermal Growth Factor Receptor Variant III (EGFRvIII), wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof binds to an epitope of EGFRvIII having a sequence of SEQ ID NO: 1
  • EGFRvIII Epidermal Growth Factor Receptor Variant III
  • the present invention also provides a nucleic acid encoding a heavy chain variable region of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention also provides a vector comprising the nucleic acid.
  • the present invention also provides a cell transformed with the vector.
  • the present invention also provides a method for producing the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following steps: (a) culturing the cells; And (b) recovering the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cells.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating cancer, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a cancer diagnostic composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention further provides a kit for diagnosing cancer comprising the composition for diagnosing cancer.
  • Figure 1 shows the result of confirming the mutation and expression of EGFRvIII of patient-derived cells by RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) and western blot method.
  • FIG. 2 shows a process for phage display screening of EGFRvIII specific scFv antibody fragments.
  • FIG. 3 shows EGFRvIII antibody screening results and sequencing results using glioblastoma (GBM) patient cells.
  • Figure 4 shows the results confirming the binding capacity of the B4A3 antibody and Cetuximab EGFRvIII specific peptide.
  • Figure 5 shows the results confirming the binding capacity of the B4A3 antibody and Cetuximab EGFR recombinant protein.
  • Figure 6 shows the results confirming the binding capacity of the B4A3 antibody and Cetuximab EGFRvIII recombinant protein.
  • Figure 7 shows the results confirmed by SDS-PAGE EGFRvIII specific binding capacity of the B4A3 antibody and stained with the EGFR control antibody.
  • Figure 8 shows the results of performing western blot to confirm the expression pattern of EGFR and EGFRvIII.
  • Figure 9 shows the results of the FACS analysis to analyze the cell binding pattern of the anti-EGFRvIII scFv to EGFRvIII.
  • Figure 10 shows the results confirming the binding pattern of the B4A3 antibody (IgG1) in normal cells.
  • Figure 11 shows the results confirming the binding pattern of the B4A3 antibody (IgG1) in vIII352T1 expressing only EGFRvIII.
  • Figure 12 shows the result of confirming that the binding of the saponin conjugated antibody to the B4A3 antibody, EGFRvIII-specific antibody-saporin conjugated antibody complex effectively internalizes and induces cytotoxicity in EGFRvIII-expressing patient cells.
  • Figure 13 shows the results of quantification of the affinity of the B4A3 antibody.
  • FIG. 14 shows vectors for preparing recombinant EGFR and EGFRvIII for quantification of affinity for EGFR and EGFRvIII of B4A3 antibodies.
  • Figure 15 shows the results confirming the cancer cell growth inhibitory ability of B4A3 by In-vivo.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof against EGFRvIII, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof binds to an epitope of EGFRvIII having a sequence of SEQ ID NO: 1. It is about.
  • the present inventors have tried to develop an anti-cancer therapeutic antibody that binds to EGFRvIII, which is known to be expressed in various cancers. As a result, the present inventors prepared anti-EGFRvIII antibodies that bind to EGFRvIII with high affinity and internalize into cells using phage display technology, and confirmed that such anti-EGFRvIII antibodies can significantly inhibit the migration of cancer cells.
  • EGFRvIII herein refers to a mutant type of epidermal growth factor receptor recognized by MR1 scFv and characterized by 801 base pair in-frame deletions of 2-7 exons near the amino terminus. It is highly expressed in about 50-60% of glioblastoma and appears to be present in about 70-80% of breast and ovarian carcinoma and about 16% of non-small cell lung carcinoma. Mutant receptors are expressed on the cell surface and produce new tumor specific cell surface epitopes at the deletion junctions.
  • Epitope refers to a protein determinant to which an antibody can specifically bind.
  • Epitopes usually consist of a group of chemically active surface molecules, such as amino acids or sugar side chains, and generally have specific three dimensional structural characteristics as well as specific charge characteristics. Three-dimensional epitopes and non-stereo epitopes are distinguished in that the binding to the former is lost but not to the latter in the presence of a denatured solvent.
  • the present invention relates to an antibody or antigen binding fragment thereof that binds to an epitope of EGFRvIII having the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • antibody refers to an anti-EGFRvIII antibody that specifically binds to EGFRvIII.
  • the scope of the present invention includes not only complete antibody forms that specifically bind EGFRvIII, but also antigen binding fragments of such antibody molecules.
  • a complete antibody is a structure having two full length light chains and two full length heavy chains, each of which is linked by heavy and disulfide bonds.
  • the heavy chain constant region has gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) and epsilon ( ⁇ ) types and subclasses gamma 1 ( ⁇ 1), gamma 2 ( ⁇ 2), and gamma 3 ( ⁇ 3). ), Gamma 4 ( ⁇ 4), alpha 1 ( ⁇ 1) and alpha 2 ( ⁇ 2).
  • the constant regions of the light chains have kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ) types.
  • Antibodies of the invention include monoclonal antibodies, multispecific antibodies, human antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies, single chain Fvs (scFV), single chain antibodies, Fab fragments, F (ab ') fragments, disulfide-binding Fvs (sdFV) And anti-idiotype (anti-Id) antibodies, or epitope-binding fragments of the antibodies, and the like.
  • An antigen binding fragment or antibody fragment of an antibody means a fragment having an antigen binding function and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, Fv and the like.
  • Fab in the antibody fragment has a structure having a variable region of the light and heavy chains, a constant region of the light chain and the first constant region (CH1) of the heavy chain has one antigen binding site.
  • F (ab ') 2 antibodies are produced by disulfide bonds of cysteine residues in the hinge region of Fab'.
  • Double-chain Fv is a non-covalent bond in which a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked, and a single chain Fv (single-chain Fv, scFv) is generally a variable region of the heavy chain and the light chain through a peptide linker.
  • This covalent linkage or the C-terminus is directly linked to form a dimer-like structure such as a double-chain Fv.
  • Such antibody fragments can be obtained using proteolytic enzymes (e.g., restriction digestion of the entire antibody with papain yields Fab and cleavage with pepsin yields F (ab ') 2 fragments). It can also be produced by recombinant technology.
  • Fv fragments are antibody fragments containing complete antibody recognition and binding sites. This region consists of a dimer in which one heavy chain variable domain and one light chain variable domain are tightly and covalently associated, for example, with scFv.
  • Fab fragments contain the variable and constant domains of the light chain and the variable and first constant domains (CH1) of the heavy chain.
  • F (ab ') 2 antibody fragments generally comprise a pair of Fab fragments covalently linked near their carboxy termini by hinge cysteines between them.
  • Single-chain Fv or “scFv” antibody fragments comprise the VH and VL domains of an antibody, which domains are present in a single polypeptide chain.
  • the Fv polypeptide may further comprise a polypeptide linker between the VH domain and the VL domain that allows the scFv to form the desired structure for antigen binding.
  • the antibody according to the invention is in Fv form (eg scFv) or is in the form of a complete antibody.
  • the heavy chain constant region may be selected from any one isotype of gamma ( ⁇ ), mu ( ⁇ ), alpha ( ⁇ ), delta ( ⁇ ) or epsilon ( ⁇ ).
  • the constant region is gamma 1 (IgG1), gamma 3 (IgG3) or gamma 4 (IgG4).
  • the light chain constant region may be of kappa or lambda type.
  • the term “heavy chain” refers to a variable region domain VH comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen and a full length heavy chain comprising three constant region domains CH1, CH2 and CH3 And fragments thereof.
  • the term “light chain” as used herein refers to a full-length light chain and fragment thereof comprising a variable region domain VL and a constant region domain CL comprising an amino acid sequence having sufficient variable region sequence to confer specificity to the antigen. All means.
  • Said monoclonal antibody refers to the same except for possible naturally occurring mutations in which antibodies obtained from substantially homogeneous antibody populations, ie, individual antibodies in the population, may be present in trace amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against a single antigenic site.
  • Non-human (eg murine) antibodies of the “humanized” form are chimeric antibodies that contain minimal sequences derived from non-human immunoglobulins.
  • humanized antibodies are non-human species (donor antibodies) that retain the desired specificity, affinity, and capacity for residues from the hypervariable region of the recipient, for example mice, rats, rabbits, or non-humans.
  • donor antibodies non-human species
  • Human immunoglobulins (receptor antibodies) replaced with residues from the hypervariable regions of primates.
  • human antibody refers to a molecule derived from human immunoglobulin, in which all of the amino acid sequences constituting the antibody including complementarity determining regions and structural regions are composed of human immunoglobulins.
  • While the heavy and / or light chain portions are the same or homologous to the corresponding sequences in an antibody derived from a particular species or belonging to a particular antibody class or subclass, the remaining chain (s) are derived from another species or another antibody class or Included are "chimeric" antibodies (immunoglobulins) that are identical or homologous to the corresponding sequences in antibodies belonging to the subclass, as well as fragments of such antibodies that exhibit the desired biological activity.
  • antibody variable domain refers to the light and heavy chain portions of an antibody molecule comprising the amino acid sequences of complementarity determining regions (CDRs; ie CDR1, CDR2, and CDR3), and framework regions (FR). .
  • CDRs complementarity determining regions
  • FR framework regions
  • VH refers to the variable domain of the heavy chain.
  • VL refers to the variable domain of the light chain.
  • CDRs Complementarity determining regions
  • Each variable domain typically has three CDR regions identified as CDR1, CDR2 and CDR3.
  • FRs Framework regions
  • Each variable domain typically has four FRs identified as FR1, FR2, FR3 and FR4.
  • the present invention provides an antibody or antigen-binding fragment thereof comprising the following heavy chain CDRs and light chain CDRs: complementarity determining region H1 having the sequence of SEQ ID NO: 2, sequence A heavy chain variable region comprising a CDRH2 having a sequence of SEQ ID NO: 3, and a CDRH3 having a sequence of SEQ ID NO: 4; And a light chain variable region comprising CDRL1 having a sequence of SEQ ID NO: 5, CDRL2 having a sequence of SEQ ID NO: 6, and CDRL3 having a sequence of SEQ ID NO.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention may comprise a framework region (FR) having one or more sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 15, specifically SEQ ID NO:
  • a heavy chain variable region including a heavy chain framework region (FR) having one sequence selected from the group consisting of the sequences of 8 to SEQ ID NO: 11 may be included.
  • the heavy chain FR1 having the sequence of SEQ ID NO: 8 the heavy chain FR2 having the sequence of SEQ ID NO: 9, the heavy chain FR3 having the sequence of SEQ ID NO: 10, heavy chain FR4 having the sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention may include a light chain variable region comprising a light chain FR having one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 15.
  • the light chain FR1 having the sequence of SEQ ID NO: 12 the light chain FR2 having the sequence of SEQ ID NO: 13, the light chain FR3 having the sequence of SEQ ID NO: 14, and the light chain FR4 having the sequence of SEQ ID NO: 15 may be included.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the invention may comprise a heavy chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 16 and / or comprise a light chain variable region having the sequence of SEQ ID NO: 17.
  • Phase display is a technique for displaying variant polypeptides as phage proteins, such as fusion proteins with at least a portion of the envelope protein on the surface of fibrous phage particles.
  • the utility of phage display lies in the fact that a large library of randomized protein variants can be targeted to quickly and efficiently classify sequences that bind with high affinity with a target antigen. Displaying peptide and protein libraries on phage has been used to screen millions of polypeptides to identify polypeptides with specific binding properties.
  • Phage display technology provided a powerful tool for generating and selecting new proteins that bind specific ligands (eg antigens). Phage display technology can be used to generate large libraries of protein variants and to quickly sort sequences that bind with high affinity to target antigens.
  • Nucleic acids encoding variant polypeptides are fused with nucleic acid sequences encoding viral envelope proteins, eg, gene III protein or gene VIII protein.
  • Monovalent phage display systems have been developed in which a nucleic acid sequence encoding a protein or polypeptide is fused with a nucleic acid sequence encoding a portion of a gene III protein. In monovalent phage display systems, gene fusions are expressed at low levels and wild type Gene III proteins are also expressed to maintain particle infectivity.
  • Phage display technology has several advantages over conventional hybridoma and recombinant methods for preparing antibodies with the desired characteristics. This technique allows the production of large antibody libraries with various sequences in a short time without the use of animals. The preparation of hybridomas or the production of humanized antibodies may require months of preparation. In addition, since no immunity is required at all, phage antibody libraries can produce antibodies against antigens that are toxic or low antigenic. Phage antibody libraries can also be used to generate and identify novel therapeutic antibodies.
  • Techniques for generating human antibodies from immunized, non-immunized human, germline sequences, or na ⁇ ve B cell Ig repertory using immunized phage display libraries can be used.
  • Various lymphoid tissues can be used to prepare na ⁇ ve or non-immune antigen binding libraries.
  • the ability to identify and isolate high affinity antibodies from phage display libraries is important for the isolation of novel therapeutic antibodies. Separation of high affinity antibodies from the library may depend on the size of the library, the efficiency of production in bacterial cells, and the diversity of the library.
  • the size of the library is reduced by inefficient folding of the antibody or antigen binding protein and inefficient production due to the presence of stop codons. Expression in bacterial cells can be inhibited if the antibody or antigen binding domain is not properly folded. Expression can be improved by alternating mutations at the surface of the variable / constant interface or at selected CDR residues.
  • the sequence of the backbone region is one element to provide proper folding when generating antibody phage libraries in bacterial cells.
  • CDR3 regions have been found to often participate in antigen binding.
  • the CDR3 regions on the heavy chains vary considerably in size, sequence, and structural conformation, and thus can be used to prepare a variety of libraries.
  • diversity can be generated by randomizing the CDR regions of the variable heavy and light chains using all 20 amino acids at each position.
  • the use of all twenty amino acids can result in highly variable variant antibody sequences and increase the chance of identifying new antibodies.
  • Antibodies or antibody fragments of the present invention may include not only the sequences of the anti-EGFRvIII antibodies of the invention described herein, but also biological equivalents thereof, within the scope of specific recognition of EGFRvIII.
  • further changes can be made to the amino acid sequence of the antibody to further improve the binding affinity and / or other biological properties of the antibody.
  • Such modifications include, for example, deletions, insertions and / or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody.
  • Such amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have a similar shape.
  • arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically equivalent functions.
  • each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); Leucine (+3.8); Phenylalanine (+2.8); Cysteine / cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); Tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); And arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in conferring the interactive biological function of proteins. It is well known that substitution with amino acids having similar hydrophobicity indexes can retain similar biological activity. When introducing mutations with reference to the hydrophobicity index, substitutions are made between amino acids which exhibit a hydrophobicity index difference of preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, even more preferably within ⁇ 0.5.
  • the antibody or nucleic acid molecule encoding the same of the present invention is interpreted to include a sequence that exhibits substantial identity with the sequence described in SEQ ID NO.
  • the above substantial identity is at least 61% when the sequence of the present invention is aligned as closely as possible with any other sequence, and the aligned sequence is analyzed using algorithms commonly used in the art.
  • a sequence that shows homology more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • BLAST The NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) is accessible from NBCI and the like and can be used in conjunction with sequence analysis programs such as blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx on the Internet.
  • BLSAT is accessible at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Sequence homology comparisons using this program can be found at www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the nucleic acid encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be isolated to recombinantly produce the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the nucleic acid is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (amplification of DNA) or for further expression. Based on this, the present invention relates to a vector comprising the nucleic acid in another aspect.
  • Nucleic acid is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides that are the basic building blocks of nucleic acids include natural nucleotides as well as analogs with modified sugar or base sites. .
  • the sequences of nucleic acids encoding heavy and light chain variable regions of the invention can be modified. Such modifications include addition, deletion, or non-conservative or conservative substitutions of nucleotides.
  • the nucleic acid encoding the variable region of the antibody or antigen-binding site thereof according to the invention may have a sequence of SEQ ID NO: 18 or SEQ ID NO: 19, wherein the nucleic acid encoding the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 18 and the nucleic acid encoding the light chain variable region may be SEQ ID NO: 19.
  • Nucleic acids of the invention are also construed to include nucleotide sequences that exhibit substantial identity to the nucleotide sequence. Substantial identity is at least 80% homology when aligning the nucleotide sequence of the present invention with any other sequence as closely as possible and analyzing the aligned sequence using algorithms commonly used in the art. Preferably a nucleotide sequence that exhibits at least 90% homology, most preferably at least 95% homology.
  • the DNA encoding the antibody is readily isolated or synthesized using conventional procedures (e.g., by using oligonucleotide probes capable of specifically binding to the DNA encoding the heavy and light chains of the antibody).
  • Many vectors are available.
  • Vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: signal sequence, origin of replication, one or more marker genes, enhancer elements, promoters, and transcription termination sequences.
  • the term "vector” refers to a plasmid vector as a means for expressing a gene of interest in a host cell; Cosmid vector; Viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retrovirus vectors, and adeno-associated virus vectors, and the like.
  • the nucleic acid encoding the antibody in the vector is operably linked with a promoter.
  • “Operatively linked” means a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the regulatory sequence is the other nucleic acid. To control transcription and / or translation of the sequence.
  • a nucleic acid expression control sequence eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites
  • promoters capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL ⁇ promoter, pR ⁇ promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • ribosome binding sites for initiation of translation e.g., amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell e.g., a metallothionine promoter, a ⁇ -actin promoter, a human heroglobin promoter and a human muscle creatine promoter
  • a mammal Promoters derived from animal viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus (CMV) promoter, tk promoter of HSV, mouse breast tumor virus (MMTV) promoter, LTR promoter of HIV
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell e.g., a metallothionine promoter, a ⁇ -actin promoter, a human heroglobin promoter and a human muscle creatine promoter
  • a mammal Promoters derived from animal viruses e.g., adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter
  • the vector may be fused with other sequences to facilitate purification of the antibody expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA).
  • Such vectors include antibiotic resistance genes commonly used in the art as selectable markers and include, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neomycin and tetracycline. There is a resistance gene.
  • the present invention relates to a cell transformed with the above-mentioned vector.
  • the cells used to produce the antibodies of the invention can be prokaryote, yeast or higher eukaryote cells, but are not limited thereto.
  • Bacillus strains such as Escherichia coli, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (e.g. Pseudomonas putida), Proteus Prokaryotic host cells such as Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • Pseudomonas e.g. Pseudomonas putida
  • Proteus Prokaryotic host cells such as Proteus mirabilis and Staphylococcus (eg, Staphylocus carnosus) can be used.
  • examples of useful host cell lines are COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO / -DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2 / 0, NS-0 , U20S, or HT1080, but is not limited thereto.
  • the present invention (a) culturing the cells; And (b) recovering the antibody or antigen-binding fragment thereof from the cultured cells.
  • the cells can be cultured in various media. It can be used as a culture medium without limitation among commercial media. All other necessary supplements known to those skilled in the art may be included at appropriate concentrations. Culture conditions, such as temperature, pH, and the like, are already in use with host cells selected for expression, which will be apparent to those skilled in the art.
  • the recovery of the antibody or antigen-binding fragment thereof can be removed by, for example, centrifugation or ultrafiltration, and the resultant can be purified using, for example, affinity chromatography or the like. Further other purification techniques such as anion or cation exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, hydroxylapatite chromatography and the like can be used.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cancer, which comprises the antibody as an active ingredient.
  • the present invention includes, for example, (a) a pharmaceutically effective amount of an antibody against EGFRvIII or an antigen binding fragment thereof according to the present invention; And (b) it may be a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating cancer comprising administering to a patient an effective amount necessary for an antibody against EGFRvIII or an antigen-binding fragment thereof.
  • composition uses the above-described anti-EGFRvIII antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient, the common content between the two is omitted.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can bind to EGFRvIII with high affinity to inhibit the migration of cancer cells overexpressing EGFRvIII, and thus can be used for the prevention and treatment of cancer.
  • Prevention means any action that inhibits or delays the progression of cancer by administration of a composition according to the invention
  • treatment means the inhibition of cancer development, the reduction of cancer or the elimination of cancer.
  • Cancer overexpressing EGFRvIII refers to a cancer having a significantly higher level of EGFRvIII on the cancer cell surface compared to non-cancerous cells of the same tissue type.
  • Cancer which is a disease applied to the composition is a cancer that overexpresses EGFRvIII, for example glioblastoma, astrocytoma, glioma, neuroblastoma, testicular cancer, colon cancer, melanoma, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, Ovarian cancer, prostate cancer and squamous cell carcinoma.
  • EGFRvIII for example glioblastoma, astrocytoma, glioma, neuroblastoma, testicular cancer, colon cancer, melanoma, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, lung cancer, Ovarian cancer, prostate cancer and squamous cell carcinoma.
  • the invention is a composition for inhibiting metastasis or invasion of cancer cells comprising an antibody to EGFRvIII or an antigen binding fragment thereof according to the invention.
  • the present invention also relates to a method for inhibiting metastasis or invasion of cancer cells by treating an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate , Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components.
  • composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration and rectal administration Or the like.
  • oral compositions should be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • Suitable dosages of the compositions according to the invention vary depending on factors such as the method of formulation, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of the patient, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction sensitivity, and usually The skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0001-100 mg / kg.
  • pharmaceutically effective amount as used herein means an amount sufficient to prevent or treat cancer.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, suppositories, powders, granules, tablets, or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • the present invention is a composition for diagnosing cancer comprising an antibody against EGFRvIII according to the present invention.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing cancer by treating an antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention.
  • Cancer can be diagnosed by measuring the level of EGFRvIII expression in a sample via an antibody against EGFRvIII according to the invention.
  • Expression levels can be measured according to conventional immunoassay methods, radioimmunoassay using the antibody to EGFRvIII, radioimmunoprecipitation, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA), capture-ELISA , Inhibition or hardwood analysis, sandwich analysis, flow cytometry, immunofluorescence staining and immunoaffinity purification, but is not limited thereto.
  • cancer By analyzing the final signal intensity by the immunoassay process, cancer can be diagnosed. That is, if the protein of the marker of the present invention is expressed high in a biological sample and the signal is stronger than that of the normal biological sample (eg, normal gastric tissue, blood, plasma or serum), the cancer is diagnosed.
  • the normal biological sample eg, normal gastric tissue, blood, plasma or serum
  • the present invention relates to a cancer diagnostic kit comprising the cancer diagnostic composition.
  • the kit according to the present invention comprises an antibody against EGFRvIII according to the present invention, and can diagnose cancer by analyzing a signal indicated by the reaction between the sample and the antibody.
  • the signal may include, but is not limited to, an enzyme bound to the antibody, for example, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase, luciferase or cytochrome P450.
  • the substrate for the enzyme is bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol) as the substrate.
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • naphthol-AS-B1-phosphate naphthol
  • Chloronaphthol aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin when color development reaction substrates such as -AS-B1-phosphate) and enhanced chemifluorescence (ECF) are used, and horse radish peroxidase is used (Bis-N-methylacridinium nitrate), resorphin benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyr ocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine, glucose oxidase and t-NBT (nitroblue tetrazolium)
  • kits according to the invention may comprise a label which generates a detectable signal, said label comprising a chemical (eg biotin), an enzyme (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish). Peroxidase and cytochrome P450), radioactive materials (eg C14, I125, P32 and S35), fluorescent materials (eg fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent and fluorescence resonance energy transfer (FRET) It may include, but is not limited thereto.
  • a chemical eg biotin
  • an enzyme alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish
  • Peroxidase and cytochrome P450 cytochrome P450
  • radioactive materials eg C14, I125, P32 and S35
  • fluorescent materials eg fluorescein
  • luminescent materials eg fluorescein
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • Measurement of the activity or signal of an enzyme used for cancer diagnosis can be carried out according to various methods known in the art. This allows for quantitative or quantitative analysis of EGFRvIII expression.
  • the target antigen protein is adsorbed onto an immunotube, and only the antibody having high binding capacity to the recombinant protein is selected using the biopanning technique.
  • recombinant proteins do not cause conformational changes in the structure
  • antibodies are selected using proteins expressed on the cell surface where the conformational changes occur in the structure, an antibody that recognizes the change of the antigen may be developed.
  • an antibody and an antibody that specifically recognize EGFRvIII were selected by a cell panning technique using glioblastoma patient-derived cells with EGFRvIII.
  • the Glioblastoma Multiforme patient-derived cells (437, 448, 464, 626) were sold at the Brain Avatar Tissue Bank of Samsung Medical Center, Institute for Refractory Cancer Research. Received the experiment. Before proceeding with the cell panning technique, mutation and expression levels of EGFRvIII of the patient-derived cells were confirmed by RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) and western blot method.
  • EGFRvIII specific scFv antibody fragments were identified via phage display screening using synthetic scFv phage libraries.
  • the phage display screening process is shown in FIG. 2.
  • scFv phage library samples were collected in 400 mL of each culture medium (SB / ampicillin /) to recover phagemid vectors containing various human antibody genes introduced into E. coli host ER2537. 2% glucose) and incubated for about 2 hours.
  • Host cells incubated with an absorbance of 0.5 at OD 600 were centrifuged at 5,000 g for 20 minutes to remove supernatant, suspended in 400 mL of secondary culture medium (SB / ampicillin), and then 10 12 pfu (plaque forming unit).
  • Helper phage (VCSM13) was added and cultured for 1 hour.
  • kanamycin antibiotics antibiotic genes introduced into the helper phage
  • PEG 8000 polyethylene glycol 8000
  • the pellet was precipitated by centrifugation at 15000g, 4 ° C. for 30 minutes and suspended in 1 mL of PBS, and then centrifuged at 10000g, 4 ° C. to obtain only the supernatant to recover the phage library.
  • Each sample was diluted and counted in LB / ampicillin solid culture medium again after infection with host cells (ER2537) to count phage recovered from each sublibrary.
  • Phage display screening was performed through repeated round panning.
  • the counted sub-library was assembled to a level of about 1.0 ⁇ 10 13 pfu, treated with 626 glioblastoma-derived cells knocked down by EGFRvIII antigen, bound for 1 hour at 4 ° C., and bound to 626 patient cells knocked down by EGFRvIII antigen. Only the supernatant not recovered.
  • This step removes phages that bind to cell membrane proteins other than EGFRvIII in the antibody phage library to prevent nonspecific binding other than EGFRvIII. After collecting only the supernatant, it was treated with 626 (EGFRvIII +) patient-derived cells and bound at 4 ° C. for 1 hour.
  • Cells were washed 5 times using cold complete medium to remove nonspecific binding and then transferred to 37 ° C. for 30 minutes to induce receptor mediated internalization of antigen-antibody complexes.
  • the cells were washed with cold PBS and the final washes with 0.1 M Glycine buffer (pH 2.0) to remove uninternalized phage particles bound to the cell surface.
  • Neutralization was performed using 2M Tris buffer (pH 8.0), and 0.5 ml of 100 mM TEA (Triethylamine) was added thereto to stand for 10 minutes to lyse cells, and neutralized with 1 mL of 2M Tris buffer (pH 8.0).
  • Phage particle amplification was performed by taking 50 ⁇ L of the previous round phage solution stored for subsequent panning cycles. Phage particles recovered by adding helper phage (VCSM13) after incubation in host cells were prepared by PEG precipitation using PEG 8000, and the next round panning was performed in the same manner as the previous round panning. Panning was performed up to four times for 626 (EGFRvIII +) patient-derived cells, and phage display screening results are shown in FIG. 3 and Table 1.
  • FIG. 3 and Table 1 Phage particle amplification was performed by taking 50 ⁇ L of the previous round phage solution stored for subsequent panning cycles. Phage particles recovered by adding helper phage (VCSM13) after incubation in host cells were prepared by PEG precipitation using PEG 8000, and the next round panning was performed in the same manner as the previous round panning. Panning was performed up to four times for 626 (EGFRvIII +) patient-derived cells, and phage display screening results are shown in FIG. 3 and Table 1.
  • Cell recovery was measured by the ratio of phage particles recovered after cell internalization by binding to 626 cells at each round and phage particles put into cell panning. As the number of patient-derived cell panning cycles increased, the number of recovered phage particles (Output) increased compared to the phage particles (Input) put into 626 cells, thereby confirming the enrichment tendency of target-specific binders. After a total of four cell pannings for 626 patient cells, phage particles recovered in the final round (four rounds) were identified as colonies on LB / ampicillin plates via infection with host cells (ER2537).
  • EGFRvIII protein and BSA were coated on 96 well plates at a concentration of 1 ⁇ g / mL, blocked with 3% skim milk powder, and then 25 ⁇ L of the recovered periplasm site was taken to obtain EGFRvIII and BSA coated plates. After addition to the well was bound for 1 hour. After 3-4 times of washing using TBST, HRP conjugated anti-HA antibody (12013819001, Roche Life Science) was combined for 1 hour, and then washed and induced color reaction (TMB substrate) again after OD 450nm The value was measured at.
  • TMB substrate induced color reaction
  • An scFv candidate group showing binding ability to EGFRvIII was selected by dividing the value of O.D 450 nm obtained by treating any scFv-pIII on a plate coated with EGFRvIII antigen by the value of O.D 450 nm obtained by treating a plate coated with BSA antigen.
  • the protein fragment (TOP10F ') was used to express the B4A3 antibody fragment.
  • B4A3 scFv protein was prepared by His-tag purification using Ni-NTA bead.
  • Cetuximab also known as EGFR antibody, was used as a comparative antibody for the binding pattern. Cetuximab binds to both EGFR and EGFRvIII proteins because it binds to domain III (L2) of the EGFR protein, which is also present in the EGFRvIII protein. In case of Cetuximab, it binds to both EGFR recombinant protein and EGFRvIII recombinant protein but does not bind to LEEKKGNYVVTDHC sequence having EGFRvIII but not EGFR. This is because Cetuximab has an epitope of the L2 domain (aa 310-480) of EGFR. In this domain, EGFR and EGFRvIII are common.
  • L2 domain aa 310-480
  • the B4A3 antibody binds to the EGFRvIII recombinant protein and LEEKKGNYVVTDHC sequence that only EGFRvIII has, but hardly binds to the EGFR recombinant protein.
  • the B4A3 antibody fragment was identified as having epitope LEEKKGNYVVTDHC (SEQ ID NO: 1), amino acids 1-14 of the N-terminal side of the EGFRvIII protein.
  • the ELISA method was used to determine the binding capacity according to the concentration of B4A3, an anti-EGFRvIII scFv, against EGFRvIII specific peptides and EGFRvIII recombinant proteins. Based on the results of the three repeated ELISAs, the non-linear regression method was used to determine the approximate target affinity of the B4A3 scFv protein to the EGFRvIII peptide and the EGFRvIII recombinant protein. As a result, it was confirmed that B4A3 scFv showed an approximate target binding capacity of 0.2715 nM on EGFRvIII specific peptide and 2.347 nM on EGFRvIII recombinant protein, respectively.
  • NT352T1, 626, 780 Glioblastoma Multiforme patient-derived cells
  • EGFRvIII overexpression vector was introduced to make cells expressing only EGFRvIII as cells without EGFR and EGFRvIII to make vIII352T1 cells and continued to be used in subsequent experiments.
  • each patient-derived cells were lysed and western blot was performed using 30 ⁇ g of protein lysate. The results are shown in FIG. 8.
  • EGFR Rabbit mAb (# 4267, Cell Signaling Technology, Inc.)
  • the secondary antibody were Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (# 7074, Cell Signaling Technology, Inc.).
  • Table 4 shows the results of EGFR and EGFRvIII expression patterns of patient cells.
  • NT352T1 patient cells have little expression of EGFR and EGFRvIII.
  • vIII352T1 expressing EGFRvIII in NT352T1 patient cells only EGFRvIII protein is expressed and EGFR is not expressed.
  • 626 patient cells have both EGFRvIII and EGFR, and 780 patient cells have only EGFR-expressing patient cells and do not have EGFRvIII mutations.
  • NT352T1 (EGFR-/ EGFRvIII-), vIII352T1 (EGFR-/ EGFRvIII +), 780 (EGFR + / EGFRvIII-) patient cells were cultured in culture medium (NBA), 5 ⁇ 10 5 cells were prepared in each tube. . After fixed with 4% paraformaldehyde (paraformaldehyde), and then centrifuged and washed once with FACS assay solution. The prepared cells were treated with 1 ⁇ g of B4A3 scFv, an anti-EGFRvIII scFv, and then treated to bind the antibody fragments to the cells through overnight culture at 4 ° C.
  • NBA culture medium
  • paraformaldehyde paraformaldehyde
  • B4A3 EGFRvIII antibody Specificity of the B4A3 EGFRvIII antibody was verified using normal cells expressing EGFR and vIII352T1 cells expressing EGFRvIII.
  • the B4A3 antibody used in the FACS experiment was converted to B4A3 human IgG1 form.
  • Epidermal cells which are normal cells expressing only EGFR [Primary Epidermal Keratinocytes; Normal, Human, Adult (ATCC ® PCS-200-011 TM)] was purchased from ATCC.
  • FACS experiment was conducted in the same manner as mentioned above, the primary antibody was used Cetuximab, B4A3 IgG, the secondary antibody was Alexa Fluor 488 Goat Anti-Human IgG (H + L) Antibody (Life Technologies) It was.
  • B4A3 antibody specifically binds to vIII352T1 expressing only EGFRvIII (FIG. 11), and at the same time, showed a minimal binding pattern compared to cetuximab, a control antibody, in normal cells (FIG. 10). Based on the minimal binding capacity to normal cells, B4A3 antibodies are expected to show minimal toxicity to normal cells.
  • Cytotoxicity experiments were carried out through the binding of saporin to B4A3 antibody to verify that the B4A3 antibody specifically binds to EGFRvIII / EGFR of target cells and can be applied as an intracellular capability and as an Antibody-Drug Conjugates.
  • the binding of saponin, a toxic substance to B4A3 antibody was performed using a ZAP antibody internalization kit (Advanced Targeting Systems, Inc.).
  • the toxic substance saporin provided by the ZAP antibody internalization kit is bound to anti-human IgG-IgG, and is bound to a human IgG B4A3 antibody in the form of a secondary antibody.
  • NT352T1 patient cells without EGFRvIII expression and vIII352T1 patient cells expressed with EGFRvIII were dispensed at a volume of 90 ⁇ l at 5000 / well in 96 well cell culture plates.
  • B4A3 human IgG / saporin conjugated anti-human IgG-IgG conjugate was treated with 10 ⁇ l in cell culture medium, and B4A3 antibody was diluted 1/10 from the highest concentration of 10 nM and subjected to three repeated experiments at 8 concentrations.
  • the experiment was performed by adding the saponin alone group and the saporin conjugated anti-human IgG-IgG treated group as a control group, and after 72 hours of treatment with the complex and saporin, cell growth was performed.
  • the analysis was performed using the EZ-Cytox kit (WST based Cell Viability / Cytotoxicity Assay Kit), and after incubation in a 37 ° C. CO 2 incubator for 2 hours after treatment with the color reagent, the OD value was analyzed at 450 nm.
  • Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences) based on Surface Plasmon Resonance (SPR) was used to quantify the affinity of B4A3 antibodies for EGFR and EGFRvIII.
  • the EGFRvIII recombinant protein an antigen used to determine the affinity of an antibody, was prepared by itself, and was added to the extracellular domain amino acid sequence of EGFR based on the EGFR (Entry: P00533) sequence at www.uniprot.org. After removing amino acids 30 to 297, glycine amino acids were added between the sites where 29 and 298 meet, and the Fc tag (IgG1 CH2, Pro110-Lys330 of CH3 domain) was added to the c-terminus (SEQ ID NO: 20, FIG.
  • the Biacore T200 is equipped with a Series S Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences, BR100530) and an Amine Coupling Kit (GE Healthcare Life Sciences, BR100050) and a Human Fab Capture Kit (GE Healthcare Life Sciences, 28-9583-25).
  • the Human Fab Capture Antibody was fixed to the surface of the sensor chip.
  • B4A3 antibody was diluted to 10 ug / mL in HBS-EP + (GE Healthcare Life Sciences, BR100669) and proceeded for 30 seconds at 30 ⁇ l / min, followed by stabilization, and EGFRvIII antigen was HBS-EP + (GE Healthcare).
  • Dilution in Life Sciences, BR100669) was carried out in each cycle to each concentration up to 256nM by increasing the concentration from 0.25nM to 2 times.
  • Antigen dosing was performed by diluting HBS-EP + for 30 seconds after binding to 30ul / min, and dissociating HBS-EP + solution for 30 seconds at 30ul / min.
  • Glycine 2.0 regeneration buffer (GE Healthcare Life Sciences, BR100355) was used to remove the antibodies and antigens used in the previous step and the next analysis was performed.
  • Affinity quantification for EGFR was performed in the same manner as this method, and the affinity of the antibody for antigen was quantified using Biaevaluation software (GE Healthcare Life Sciences).
  • the B4A3 antibody hardly binds to EGFR recombinant protein through Sensorgram, and the binding constant to EGFRvIII recombinant protein is found to be 5.661 ⁇ 10 4 (1 / Ms), and the dissociation constant is 2.480 ⁇ 10 -4 (1 / s). Based on this, the affinity of the B4A3 antibody was confirmed to bind to EGFRvIII with an affinity of 4.38 nM (FIG. 13).
  • NS07-464T in GBM patient derived cells was used to confirm the in-vivo efficacy of EGFR and EGFRvIII of the B4A3 antibody.
  • NS07-464T is a GBM patient derived cell in which EGFR has overexpression / amplification and EGFRvIII mutation.
  • NS07-464T was selected as EGFRvIII mutant cells based on the genetic data analyzed by Samsung Medical Center, Inc., and received from the Biobank of Samsung Medical Center, Inc., and was commissioned by RT-PCR and western blot. Expression was confirmed (FIG. 2).
  • Human IgG (Sigma, I4506), Cetuximab (Merck), B4A3 antibody
  • NS07-464T patient cells made a subcutaneous xenograft model (subcutaneous xenograft model) when the tumor size of about 265mm 3 is formed twice weekly 10mg each A total of four doses were administered at / kg.
  • the mice per group were 5 human IgG, 5 Cetuximab groups and 4 B4A3 treatment groups.
  • Time from the time when the antibody began to administration is the 13 days, Human IgG group process was formed to a 1426.5 mm 3 tumors, Cetuximab, 13 il Me 1228.5 mm in three sizes this was the control group compared to tumor formation inhibitory ability is formed tumors 14% were confirmed.
  • B4A3 antibody formed tumors of 699.5 mm 3 , and the tumor formation inhibitory activity was 51% compared to the control group. This demonstrates the excellent anticancer efficacy in patient-derived cells with the EGFRvIII mutation of B4A3.
  • the present invention provides an anti-EGFRvIII antibody and a pharmaceutical use thereof that bind to EGFRvIII expressed on the surface of cancer cells and then internalize into cells.
  • the antibodies of the present invention inhibit the invasion and metastasis of cancer cells expressing EGFRvIII.
  • the antibody of the present invention can be used for the treatment or diagnosis of cancer, and since EGFRvIII is a molecule that is overexpressed on the surface of cancer cells, the antibody of the present invention can selectively target only cancer cells with minimal effect on normal cells. Can be.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이의 암 예방 또는 치료용 조성물, 암 진단용 조성물 및 암 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 27.02.2017]　EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도
본 발명은 EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물, 암 진단용 조성물 및 암 진단용 키트에 관한 것이다.
암 치료를 위한 단일클론 항체의 사용은 상당한 성공을 거두고 있다. 항체 약물 결합체들은 림프종과 고형암 치료를 위해 강력하고 새로운 치료의 옵션이 되었으며, 최근 들어 면역 조절 항체들도 임상에서 상당한 성공을 거두고 있다. 치료 항체들의 개발은 암 혈청학, 단백질 엔지니어링 기술과 그 작용, 저항성의 기작들 및 면역 시스템과 암 세포들 간의 상호 작용에 대한 깊은 이해를 바탕으로 한다.
인간 암의 세포 표면에서 발현되는 항원의 정의는 정상 조직에 비해 과다 발현되거나 돌연변이 및 선택적으로 발현되는 광범위한 목표물들을 의미한다. 핵심적인 문제는 항체를 기반으로 한 치료법들에 적절한 항원을 동정하는 것이다. 이러한 치료제들은 항원이나 수용체 기능 (즉 자극제로서나 길항제로서의 기능)의 변화를 매개하고 Fc 과 T 세포 활성화를 통해 면역 시스템을 조절하며 특정한 항원을 목표로 하는 항체에 결합되는 특정한 약물의 전달을 통해 그 효능을 발휘한다. 항체 약동학 (pharmacokinetics), 작용 기능, 사이즈와 면역 자극성을 변화시킬 수 있는 분자 기술들은 새로운 항체를 기반으로 한 치료법들의 개발에서 핵심적인 요소로 등장하고 있다. 암 환자들을 대상으로 한 치료 항체들의 임상 시도에서 얻은 증거들은 목표 항원과 항체들의 친화성 및 결합성, 항체 구조의 선택, 치료적 접근법 (신호전달 차단이나 면역 작용 기능)을 포함하는 최적화된 항체들의 선택을 위한 접근법들의 중요성을 강조하고 있다.
이와 관련하여 상피 성장 인자 수용체(EGFR)를 항원으로 하는 항체에 대한 연구가 진행되고 있다. EGFR은 원형-종양 유전자(proto-oncogene) c-erb B의 170 킬로달톤 막 지단백질 산물이다. EGFR 유전자의 서열은 알려져 있다. EGFR 유전자는 원래 조류 적아세포증(avian erythroblastosis) 바이러스에서 동정된 erbB 종양 유전자의 세포 동족체(homolog)이다. 유전자 증폭에 의한 상기 종양 유전자의 활성화는 다양한 인간 종양에서 관찰되었다.
EGFR은 다양한 유형의 인간 고형 종양에 대해 과발현된다. EGFR 과발현은 일부 폐, 유방, 결장, 위, 뇌, 방광, 두경부, 난소, 신장 및 전립선 암종에서 관찰되었다. 상피 성장 인자(EGF) 및 형질전환 성장 인자-알파(TGF-알파)는 EGFR에 결합하여 세포 증식 및 종양 성장을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 크기 변이체 EGFR 유전자 및 증폭이 몇몇 인간 암에서 보고되기도 하였다.
EGFR 변이체는 EGFR 유전자 증폭에 의해 수반되는 유전자 재배열에 의해 유발된다. 다음과 같이 알려져 있는 8개의 주요 EGFR 변이체들이 있다: (i) EGFRvI은 EGFR의 세포외 도메인의 대부분이 결여되어 있으며, (ii) EGFRvII는 EGFR의 세포외 도메인에서 83 aa 인-프레임(in-frame) 결실로 구성되어 있으며, (iii) EGFRvIII은 EGFR의 세포외 도메인에서 267 aa 인-프레임 결실로 구성되어 있으며, (iv) EGFRvIV는 EGFR의 세포질 도메인에 결실을 포함하며, (v) EGFRvV는 EGFR의 세포질 도메인에 결실을 포함하며, (vi) EGFR.TDM/2-7은 EGFR의 세포외 도메인에 엑손 2-7의 복제를 포함하며, (vii) EGFR.TDM/18-25는 EGFR의 세포외 도메인에 엑손 18-26의 복제를 포함하며, (viii) EGFR.TDM/18-26는 EGFR의 티로신 키나아제에 엑손 18-26의 복제를 포함한다. 또한, 엑손 11 및 14의 접합부에서 신규한 히스티딘 잔기를 도입하는 제 2 결실을 갖는 희귀한 제 2의 EGFRvⅢ 돌연변이체(EGFRvIII/Δ12-13)가 있다.
EGFRvIII는 인간 암에서 가장 통상적으로 발생하는 상피 성장 인자(EGF)의 변이체로, 교모세포종(GBM) 환자 중 약 30%의 환자에서 발현되며, 정상조직에서는 발현되지 않는다. 이러한 EGFR 수용체의 변이체는 리간드 독립적인 방식으로 구조적 신호화(signaling)를 통해 종양 진행에 기여한다.
종양 형성을 잠재적으로 유도하는 유전자들의 돌연변이나 재배열은 많은 암들에서 동정될 수 있다. 암 발생 단백질들이 암 줄기 세포들과 연관된 경로들에 기여할 수 있다는 결과들이 발표된 바 있다. 이렇게 변형된 유전자들의 생산물은 암 줄기 세포들을 동정하고 잠재적으로 목표화하는데 사용될 수 있다는 증거들을 제시하고 있다. 실제로 이러한 주된 돌연변이들은 암 세포들 전체에 걸쳐 존재하고 특정한 암세포 아형에만 존재하지 않기 때문에 이러한 접근법은 용이한 방법이 아니다. 따라서 돌연변이 단백질들은 암 줄기 세포들에서 어떠한 직접적인 역할을 하지 않고 종양 성장을 일반적으로 잠재화시킨다. 추가적으로 대부분의 변형된 단백질들은 세포 내부에 존재한다.
돌연변이 단백질들과 암 줄기 세포 간의 상관관계는 명확하지 않다. 교아세포 종양들은 유전자 재배열과 증폭을 통해 발현되는 EGFR 변형체인 EGFRvIII를 자주 발현한다고 알려져 있다. 항상 티로신 인산화 사이트가 활성화된 형태로 존재하기 때문에 강한 종양형성(tumorigenicity) 특성을 보인다. 그러나, 이러한 변형에도 불구하고 EGFRvIII의 발현은 제한적이다. 암 줄기 세포는 EGFRvIII이 CD133과 함께 높게 발현되어 있고 EGFRvIII+/CD133+ 세포를 높은 재생과 종양 개시 능력을 가지는 것으로 정의된다. EGFRvIII+ 세포는 줄기/전구체 마커들과 함께 연관되어 있는 반면 분화 마커들은 EGFRvIII- 세포들에서 발견되었다. EGFRvIII 발현은 정상적인 세포 배양에서 손실되었지만 종양 원형체 배양에서는 유지되었으며 또한 세포 배양된 세포들은 EGFRvIII+/CD133+를 동시에 발현하고 재생되며 종양 개시 능력을 가진다.
EGFRvIII을 과발현하는 암을 치료하기 위하여, EGFRvIII에 높은 친화력으로 결합하여 암세포의 성장을 저해할 수 있는 항-EGFRvIII 항체가 요구된다.
종래 EGFR에 특이적으로 결합하는 세툭시맙 (Cetuximab) 등과 같은 항체 치료제들이 개발되었다. 그러나, 이러한 항체 치료제들은 EGFRvIII 돌연변이 암세포들에 대한 항원 특이성이 매우 떨어지고, 암세포 성장 억제능이 나타나지 않는 문제점이 있어 왔다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항암 치료용 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 EGFRvIII에 높은 친화력으로 결합하는 항-EGFRvIII 항체를 개발하고, 이러한 항-EGFRvIII에 항체가 암세포의 이동을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 EGFRvIII에 대한 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 서열을 가지는 EGFRvIII의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 더욱이, 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
도 1은 환자 유래세포들의 EGFRvIII의 돌연변이 및 발현 정도를 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)과 western blot법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 EGFRvIII 특이적인 scFv 항체 단편을 파지 디스플레이 스크리닝하는 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 교모세포종 (GBM) 환자 세포를 이용한 EGFRvIII 항체 선별 결과 및 서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 B4A3 항체와 Cetuximab의 EGFRvIII 특이적 펩타이드에 대한 결합능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 B4A3 항체와 Cetuximab의 EGFR 재조합 단백질에 대한 결합능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 B4A3 항체와 Cetuximab의 EGFRvIII 재조합 단백질에 대한 결합능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 B4A3 항체와 EGFR 대조군 항체로 염색하여 B4A3 항체의 EGFRvIII 특이적 결합능을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 EGFR 및 EGFRvIII의 발현 패턴의 확인하기 위해 western blot을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 항 EGFRvIII scFv의 EGFRvIII에 대한 세포 결합양상을 분석하기 위해 FACS 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 정상세포에서 B4A3 항체(IgG1)의 결합 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 EGFRvIII 만을 발현하는 vIII352T1에서 B4A3 항체(IgG1)의 결합 양상을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 B4A3 항체에 사포린 접합 항체를 결합하여, EGFRvIII 특이적 항체-사포린 접합 항체 복합체가 EGFRvIII 발현 환자세포에 효과적으로 세포내재화 함과 동시에 세포독성을 유도함을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 B4A3 항체의 친화도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 B4A3항체의 EGFR 및 EGFRvIII에 대한 친화도 정량을 위해 재조합 EGFR 및 EGFRvIII을 제조하기 위한 벡터를 나타낸 것이다.
도 15는 B4A3의 암세포 성장억제능을 In-vivo로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, EGFRvIII에 대한 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 서열을 가지는 EGFRvIII의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 발명자들은 다양한 암에서 발현되는 것으로 알려진 EGFRvIII에 결합하는 항암 치료용 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 EGFRvIII에 높은 친화력으로 결합하고 세포 내로 내재화하는 항-EGFRvIII 항체를 제조하고, 이러한 항-EGFRvIII 항체가 암세포의 이동을 현저히 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
본 명세서의 "EGFRvIII"는 MR1 scFv에 의해 인식되고 아미노 말단 부근 2-7 엑손의 801 염기쌍 인프레임 결실에 의해 특징되는 표피성장인자 수용체의 돌연변이형을 의미한다. 약 50∼60%의 글리오블라스토마(glioblastoma)에서 고발현되고, 약 70∼80%의 유방 및 난소 암종 및 약 16%의 비소세포 폐 암종에서 존재하는 것으로 나타난다. 돌연변이 수용체는 세포표면에서 발현되고, 결실 접합부에서 새로운 종양 특이 세포 표면 에피토프(epitope)를 생성한다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다. 본 발명은 서열번호 1의 서열을 가지는 EGFRvIII의 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 항-EGFRvIII 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 EGFRvIII에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메 인과 1개의 경쇄 가변 도메인이, 예를 들어 scFv로 단단하게 사실상 공유적으로 연합된 이량체로 이루어진다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 그들 사이에 힌지 시스테인에 의해 그들의 카복시 말단 근처에 공유적으로 연결되는 한 쌍의 Fab 단편을 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재한다. Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
하나의 실시예에서, 본 발명은 다음의 중쇄 CDR(complementarity determining region) 및 경쇄 CDR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다: 서열번호 2의 서열을 가지는 CDR(complementarity determining region)H1, 서열번호 3의 서열을 가지는 CDRH2, 및 서열번호 4의 서열을 가지는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 서열번호 5의 서열을 가지는 CDRL1, 서열번호 6의 서열을 가지는 CDRL2, 및 서열번호 7의 서열을 가지는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 8 내지 서열번호 15의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 가지는 골격 영역 (FR)을 포함할 수 있으며, 구체적으로 서열번호 8 내지 서열번호 11의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나의 서열을 가지는 중쇄 골격 영역 (FR)을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
이 때, 서열번호 8의 서열을 가지는 중쇄 FR1, 서열번호 9의 서열을 가지는 중쇄 FR2, 서열번호 10의 서열을 가지는 중쇄 FR3, 서열번호 11의 서열을 가지는 중쇄 FR4를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 12 내지 서열번호 15의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나의 서열을 가지는 경쇄 FR을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
이 때, 서열번호 12의 서열을 가지는 경쇄 FR1, 서열번호 13의 서열을 가지는 경쇄 FR2, 서열번호 14의 서열을 가지는 경쇄 FR3, 서열번호 15의 서열을 가지는 경쇄 FR4를 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 16의 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함 및/또는 서열번호 17의 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 EGFRvIII을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-EGFRvIII 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유 할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부위 중 가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 18 또는 서열번호 19의 서열을 가질 수 있고, 이 때 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산은 서열번호 18일 수 있으며, 경쇄 가변영역을 코딩하는 코딩하는 핵산은 서열번호 19일 수 있다.
본 발명의 핵산은 상기 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-EGFRvIII 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 EGFRvIII에 높은 친화도로 결합하여 EGFRvIII을 과발현하는 암세포의 이동을 억제할 수 있으므로, 암의 예방 및 치료에 사용 가능하다.
"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암의 발전의 억제, 암의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.
"EGFRvIII을 과발현하는 암"은 동일한 조직 유형의 비-암성 세포와 비교하여 유의적으로 더 높은 수준으로 EGFRvIII을 암 세포표면에 갖고 있는 암을 의미한다.
상기 조성물에 적용되는 질환인 암은 EGFRvIII을 과발현하는 암이고, 예를 들어 교모세포종, 성상세포종, 신경교종, 신경아세포종, 고환암, 대장암, 흑색종, 췌장암, 폐암, 유방암, 식도암, 허파암, 난소암, 전립선암 및 편평상피암 등일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하기 위한 조성물이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하여 암세포의 전이 또는 침윤을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체를 포함하는 암 진단용 조성물이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 처리하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체를 통해 샘플에서의 EGFRvIII 발현 수준을 측정함으로써 암을 진단할 수 있다. 발현 수준은 통상적인 면역분석 방법에 따라 측정할 수 있으며, 상기 EGFRvIII에 대한 항체를 이용한 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 면역조직화학염색, ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 통해 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 암을 진단할 수 있다. 즉, 생물학적 시료에서 본 발명의 마커의 단백질이 고발현 되어 시그널이 정상 생물학적 시료(예컨대, 정상 위조직, 혈액, 혈장 또는 혈청) 보다 강하게 나오는 경우에는 암으로 진단된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 EGFRvIII에 대한 항체를 포함하고, 시료와 항체가 반응함으로써 나타내는 시그널을 분석하여, 암을 진단할 수 있다. 이 때, 상기 시그널은 항체에 결합된 효소 예를 들어 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 또는 사이토크롬 P450을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 이 때 효소에 대한 기질은 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF (enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR (p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB (tetramethylbenzidine), ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민 (OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT (nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS (phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 키트는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 포함할 수 있으며, 상기 레이블은 화학물질 (예컨대, 바이오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암 진단을 위해 사용되는 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이를 통해 EGFRvIII 발현을 정성적 또는 정량적으로 분석할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. EGFRvIII의 발현 확인
일반적으로 파지디스플레이 기법으로 항체를 선별하기 위해서는 표적항원단백질을 면역튜브(Immunotube)에 흡착시킨 후, 재조합단백질에 결합능이 우수한 항체만을 바이오패닝기법을 사용하여 선별한다. 다만, 재조합단백질은 구조 내 형태변화 (conformational change) 현상이 일어나지 않기 때문에 구조 내 형태 변화 현상이 일어나는 세포표면에 발현된 단백질을 이용하여 항체를 선별을 한다면, 항원의 형태 변화를 인지하는 항체를 개발할 수 있다. 이에, 본 발명에서는 EGFRvIII를 가진 교모세포종 환자유래세포를 이용한 세포패닝기법으로 EGFRvIII를 특이적으로 인지하는 항체 및 항체를 선별하였다.
먼저, 삼성서울병원 난치암사업단(Samsung medical center, Institute for Refractory Cancer Research)의 뇌조직은행(Brain Avatar Tissue Bank)에서 교모세포종(Glioblastoma Multiforme) 환자유래세포(437, 448, 464, 626)들을 분양받아 실험을 진행하였다. 세포패닝기법을 진행하기에 앞서 분양받은 환자 유래세포들의 EGFRvIII의 돌연변이 및 발현 정도를 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)과 western blot법으로 확인하였다.
그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 따르면, 626환자세포의 경우 RNA 및 단백질 상태로 EGFRvIII의 발현이 가장 높음을 확인하였다.
실시예 2. EGFRvIII 항체 선별 결과 및 서열 분석
항체 선별과 관련하여, 합성 scFv 파지 라이브러리를 이용하여 EGFRvIII 특이적인 scFv 항체 단편을 파지 디스플레이 스크리닝을 통해 동정하였다. 파지 디스플레이 스크리닝 과정은 도 2와 같다.
상세하게, 대장균 숙주 ER2537 내에 도입되어 있는 다양한 인간항체 유전자가 삽입되어 있는 파지미드(phagemid) 벡터를 파지로 회수해내기 위해 4개의 하위 합성 scFv 파지 라이브러리 샘플을 각 400mL 의 배양배지(SB/ampicillin/2% glucose) 내에 첨가하여 약 2시간 동안 배양하였다. OD600에서 흡광도가 0.5까지 배양된 숙주 세포들은 5,000g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거 후 400 mL 의 2차 배양배지(SB/ampicillin) 내에 부유시킨 다음, 1012 pfu(plaque forming unit)의 helper 파지(VCSM13)를 첨가하여 1시간 재배양하였다. 이후 kanamycin 항생제(helper 파지 내 도입된 항생제 유전자)를 70 μg/mL 농도로 첨가한 후, 30℃, 220rpm에서 밤샘 배양을 통해 파지 라이브러리가 숙주 세포 외로 만들어질 수 있도록 하였다. 이후 배양물을 원심분리 시킨 상층액에 PEG 8000(polyethylene glycol 8000)을 첨가하여 4℃에서 2시간 교반하여 파지 입자와 PEG 8000이 잘 섞이게 하였다. 15000g, 4℃로 30분 동안 원심분리를 하여 침전된 펠렛을 PBS 1 mL로 부유 시킨 후 10000g, 4℃에서 원심분리하여 상층액만 획득하여 파지 라이브러리를 회수하였다. 각 하위 라이브러리로부터 회수된 파지를 계수하기 위해 각 샘플을 희석한 다음 다시 숙주세포(ER2537)에 감염시켜 LB/ampicillin 고체배양배지에서 계수하였다.
파지 디스플레이 스크리닝은 반복 회차 패닝을 통해 실시하였다. 계수된 하위 라이브러리를 약 1.0×1013 pfu 수준이 되도록 취합한 후, EGFRvIII 항원을 knockdown시킨 626 교모세포종 환자유래세포에 처리하여 4℃에서 1시간 결합 시키고, EGFRvIII 항원이 knockdown된 626 환자세포에는 결합하지 않는 상층액만을 회수하였다. 이는 항체 파지 라이브러리에서 EGFRvIII를 제외한 다른 세포 막단백질에 결합하는 파지들을 제거하여 EGFRvIII 외 비특이적인 결합을 방지하는 단계다. 상층액만을 회수한 뒤, 이를 626(EGFRvIII +) 환자유래세포에 처리하여 4℃에 1시간 동안 결합시켰다. 차가운 완전배지를 이용하여 5번 세포를 세척하여 비특이적인 결합을 제거한 후, 37℃로 옮겨 30분 동안 배양하여 항원-항체 복합체의 수용체 매개 세포내재화(Internalization)를 유도하였다. 차가운 PBS를 이용하여 세포를 세척하고, 0.1M Glycine 버퍼(pH 2.0)를 이용하여 최종 세척을 해서 세포표면에 결합중인 세포 내재화되지 않은 파지입자들을 제거하였다. 2M Tris 버퍼(pH 8.0)를 이용하여 중화를 진행하고, 100 mM TEA(Triethylamine) 0.5 ml을 첨가하여 10분 간 정치하여 세포를 용해시키고, 2M Tris 버퍼(pH 8.0) 1mL로 중화시켰다. 미리 ER2537 대장균을 OD600 = 0.5~0.8으로 준비를 해 둔 뒤, ER2537 대장균 배양액 8.5 mL에 중화된 회수 파지 용액 1.5 mL을 혼합하여, 37℃ 120rpm에서 1시간 동안 배양하여 ER2537 대장균에 회수한 파지를 감염시키고 이를 LB/ampicillin 고체배지에서 계수하였다. 잔여 회수용액은 15cm LB/ampicillin 고체배지에 도말하여 배양 후, 5 mL의 SB 배양배지(50% glycerol)를 첨가하여 콜로니들을 회수 및 보관(-80℃)하였다.
계속되는 패닝 회차를 위해 보관된 전 회차 파지 용액 중 50 μL 를 취해 파지 입자 증폭 작업을 수행하였다. 숙주세포에 배양 후 helper 파지(VCSM13)를 첨가하여 회수된 파지 입자들은 PEG 8000을 이용한 PEG 침전을 통해 준비되었고, 이를 이용하여 다음 회차 패닝을 전 회차 패닝과 동일한 방법으로 진행하였다. 패닝은 626(EGFRvIII +) 환자유래세포에 대하여 총 4 회차까지 진행되었으며, 파지 디스플레이 스크리닝 결과를 도 3 및 표 1에 나타내었다.
회차 Input(cfu/mL) Output(cfu/mL) Recovery rate(Output/Input)
1 1E+13 4.85E+4 4.85E-9
2 1.13E+13 8.96E+4 7.93E-9
3 9.32E+12 2.43E+5 2.61E-8
4 6.97E+12 1.08E+6 1.55E-7
세포 패닝 각 회차별로 626세포에 결합하여 세포 내재화 후 회수된 파지 입자들과 세포패닝에 넣어준 파지 입자의 비율을 통해 회수율을 측정하였다. 환자 유래 세포 패닝 회차가 증가할수록 626세포에 넣어준 파지 입자(Input) 대비 회수되는 파지 입자(Output)들이 증가함을 확인하였으며, 이를 통해 Target-specific binder들의 enrichment 경향을 확인하였다. 626 환자세포에 대한 총 4회의 세포패닝이 종료된 후, 최종 회차(4라운드)에서 회수된 파지 입자들은 숙주세포(ER2537)에 감염을 통해 LB/ampicillin 플레이트에 콜로니로 확인되었다.
이 콜로니들을 취하여 200 μL SB/ampicillin 배양배지가 담긴 96 well 플레이트에 well별로 각각의 콜로니를 접종 후 배양하였다(37℃, ~3시간). 이후 scFv-pIII 단백질의 발현 유도를 위해 각 well에 최종농도 1 mM의 IPTG를 처리하고 30℃ 에서 밤샘 배양하였다. 이후 배양 플레이트는 원심분리 및 상층액 제거 후 각 well 내 배양세포의 periplasm 부위를 회수하기 위하여 40 μL의 4℃로 유지해두었던 TES 용액(20% w/v sucrose, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 처리하여 4℃에서 30분 동안 정치하고, 이후 0.2X TES 용액 60 μL를 처리하여 30분 동안 정치하였다. 최종적으로 플레이트를 원심분리한 후 상층액만을 회수하여 scFv-pIII 단백질을 소규모로 생산하였다.
한편, EGFRvIII 단백질 및 BSA를 1 μg/mL의 농도로 96 well 플레이트에 코팅을 하고 3% 탈지분유를 이용하여 블로킹 한 후, 회수된 periplasm 부위 중 25 μL를 취하여 EGFRvIII와 BSA가 코팅된 플레이트의 각 well에 첨가 후 1시간 동안 결합시켰다. 이후 TBST를 이용, 3~4회 세척 과정을 거친 다음, HRP가 결합된 항 HA 항체(12013819001, Roche Life Science)를 1시간 결합시킨 후 다시 세척 및 발색반응(TMB substrate)을 유도한 후 O.D 450nm에서 그 값을 측정하였다. 임의의 scFv-pIII를 EGFRvIII 항원이 코팅된 플레이트에 처리하여 얻은 O.D 450nm의 값을 BSA 항원이 코팅된 플레이트에 처리하여 얻은 O.D 450nm의 값으로 나누어 EGFRvIII에 대한 결합능을 보이는 scFv 후보군을 선별하였다.
752개에 콜로니를 분석하여 24개의 클론(결합능 배수>3)들이 EGFRvIII에 결합하는 양상을 보였으며, B3H1, B4A3 두 클론이 다른 항체 클론들에 비해 강하게 결합을 하며, B4A3은 그 중 가장 높은 결합능을 보였다. EGFRvIII 항원에 특이적으로 높은 결합능을 보이는 B4A3 클론을 선별 완료하고, B4A3 클론의 아미노산 서열을 표 2에 나타내었다.
중쇄 경쇄
CDR1 GFTFSNYY(서열번호 2) SSNIGNNY(서열번호 5)
CDR2 TSPNGGSK(서열번호 3) SDS(서열번호 6)
CDR3 AKGRRKLRATRFDY(서열번호 4) ATWDASLSAYV(서열번호 7)
실시예 3. B4A3 항체의 EGFRvIII에 대한 특이성 및 Epitope 확인
scFv 항체 단편 단독의 결합력 및 기능을 확인하기 위해 단백질 발현 균주(TOP10F')를 이용하여 B4A3 항체단편을 발현하였다. B4A3 scFv 단백질은 Ni-NTA bead를 이용한 His-tag 정제과정을 거쳐서 준비되었다.
생산된 scFv 단백질을 이용하여, EGFRvIII에 대한 특이성을 확인하기 위해 EGFRvIII 돌연변이에서만 특이적으로 가지는 펩타이드(LEEKKGNYVVTDHC), EGFRvIII 재조합단백질, EGFR 재조합단백질에 대한 결합양상을 ELISA를 통해 확인하였다. 그 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다.
결합 양상에 대한 비교항체로 EGFR항체로 알려진 Cetuximab을 사용하였다. Cetuximab은 EGFR 단백질과 EGFRvIII 단백질 모두에 결합하는데, 이는 EGFR단백질의 domain III(L2)에 결합하고, 이 부분은 EGFRvIII 단백질에도 존재하는 부위이기 때문이다. Cetuximab의 경우 EGFR 재조합 단백질과 EGFRvIII 재조합 단백질에는 모두 결합하지만 EGFR에는 없고 EGFRvIII만 특이적으로 가지는 LEEKKGNYVVTDHC서열에는 결합하지 않음을 확인하였다. 이는 Cetuximab이 EGFR의 L2 domain(aa 310-480)을 epitope로 가지기 때문이고, 이 domain의 경우 EGFR과 EGFRvIII가 공통적으로 가지는 영역이다. 하지만 B4A3 항체의 경우 EGFRvIII 재조합 단백질과 EGFRvIII만이 특이적으로 가지는 LEEKKGNYVVTDHC서열에 결합을 하지만 EGFR 재조합 단백질에는 거의 결합하지 않음을 확인하였다. 이를 통해 B4A3 항체 단편은 EGFRvIII 단백질의 N말단 쪽 1-14번 아미노산인 LEEKKGNYVVTDHC (서열변호 1)를 epitope로 가지는 것으로 확인하였다.
추가로 ELISA법을 이용하여 EGFRvIII 특이적 펩타이드 및 EGFRvIII 재조합 단백질에 대한 항 EGFRvIII scFv인 B4A3의 농도에 따른 결합능을 측정하였다. 3반복으로 진행된 앞선 ELISA결과를 토대로 프리즘(Prism) 프로그램을 이용, 비선형회귀분석 방법을 이용하여, B4A3 scFv 단백질의 EGFRvIII 펩타이드 및 EGFRvIII 재조합 단백질에 대한 대략적인 표적 결합능(apparent affinity)을 확인하였다. 그 결과, B4A3 scFv는 EGFRvIII 특이적 펩타이드에는 평균적으로 각각 0.2715 nM, EGFRvIII 재조합 단백질에는 2.347 nM의 대략적인 표적 결합능을 보였음을 확인하였다.
분석항체 항원 Ka Kd KD(nM)
B4A3 scFv EGFRvIII peptide(LEEKKGNYVVTDHC) 3.541e+006 0.0009613 0.2715
rhEGFRvIII protein 2.739e+006 0.006430 2.347
B4A3항체단편(scFv)가 EGFRvIII를 특이적으로 인지를 할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 Western blot을 수행하였다. EGFRvIII 돌연변이를 가지고 있는 교모세포종 환자세포인 626을 용해시켜 626환자세포의 단백질만을 확보하였다.
626 환자 세포의 단백질 30 μg를 SDS-PAGE 젤에 로딩 후 PVDF 막으로 옮긴 뒤, 1차 항체로 B4A3 항체 클론과 EGFR 대조군 항체(#4267, Cell Signaling Technology, Inc.)로 염색하여 EGFRvIII에 특이적으로 결합함을 확인하였다 (도 7).
실시예 4. EGFRvIII 과발현 세포를 이용한 항-EGFRvIII scFv 결합능 확인
삼성서울병원 난치암사업단(Samsung medical center, Institute for Refractory Cancer Research)의 뇌조직은행(Brain Avatar Tissue Bank)에서 교모세포종(Glioblastoma Multiforme) 환자유래세포(NT352T1, 626, 780)들을 분양을 받아 실험을 진행하였다. NT352T1의 경우 EGFR 및 EGFRvIII가 없는 세포로서 EGFRvIII만을 발현하는 세포를 제작하기 위해 EGFRvIII 과발현 벡터를 도입하여 vIII352T1세포를 만들었으며, 후속 실험에 계속 사용하였다. EGFR 및 EGFRvIII의 발현 패턴의 확인하기 위해 각각의 환자 유래 세포들을 용해시킨 후 30μg의 단백질 용해물을 이용하여 western blot을 수행하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 1차 항체로 EGFR Rabbit mAb(#4267, Cell Signaling Technology, Inc.), 2차 항체는 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody(#7074, Cell Signaling Technology, Inc.)를 사용하였다. 환자 세포들의 EGFR, EGFRvIII expression pattern 확인 결과를 표 4에 나타내었다.
환자 세포들의 EGFR, EGFRvIII expression pattern 확인 결과
Cells EGFRvIII EGFR
NT352T1 - -
vIII352T1 ＋ -
626 ＋ ＋
780 - ＋
교모세포종 유래 환자세포를 이용하여 항 EGFRvIII scFv의 EGFRvIII에 대한 세포 결합 양상을 분석하기 위해 FACS 분석을 수행하였다. NT352T1 환자 세포의 경우 EGFR과 EGFRvIII의 발현이 거의 없다. NT352T1 환자 세포에 EGFRvIII를 발현시킨 vIII352T1의 경우 EGFRvIII 단백질만 발현이 되고 EGFR은 발현되지 않는다. 626 환자 세포는 EGFRvIII와 EGFR을 모두 가지고 있으며, 780 환자 세포의 경우 EGFR만 발현하는 환자세포로 EGFRvIII 돌연변이를 가지고 있지 않다. NT352T1(EGFR -/EGFRvIII -), vIII352T1(EGFR -/EGFRvIII +), 780(EGFR +/EGFRvIII -) 환자세포들을 배양배지(NBA)에서 배양 후 5×105 수의 세포를 각 튜브 내 준비하였다. 이후 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 고정시킨 다음, 원심분리 후 FACS 분석 용액으로 1회 세척하였다. 준비된 세포에 항 EGFRvIII scFv인 B4A3 scFv를 1 μg 처리한 다음 4℃ 에서 밤샘 배양을 통해 세포에 해당 항체 단편이 결합하도록 처치하였다. 이후 FACS 용액으로 비특이 결합된 scFv 단백질을 2회 세척해낸 후 형광(PE, phycoerythrin)이 결합된 항 HA 항체(sc-805 PE, Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 1시간 동안 결합시켰다. 다시 FACS 용액으로 세척 후 FACS 용액 500 μL을 추가하여 FACS 분석을 실시하였다. 결과적으로, 도 9를 참조하면, 항 EGFRvIII scFv인 B4A3 scFv는 EGFRvIII만 가지고 있는 vIII352T1 환자세포에 특이적인 세포결합능을 보임을 확인하였다. EGFR과 EGFRvIII를 모두 가지지 않는 NT352T1 환자세포와 EGFR만 가지는 780환자세포에는 결합하지 않음을 확인하였다. 이를 통해 동정된 EGFRvIII scFv 항체 단편은 실제 세포막에 존재하는 EGFRvIII 세포외 부위에 대한 특이성이 있음을 확인하였다.
실시예 5. 항-EGFRvIII scFv 특이성 확인
EGFR를 발현하는 정상세포와 EGFRvIII를 발현하는 vIII352T1세포를 이용하여 B4A3 EGFRvIII 항체의 특이성을 검증하였다. FACS실험에 사용된 B4A3 항체는 B4A3 human IgG1 형태로 변환하여 사용하였다. EGFR만을 발현하는 정상세포인 Epidermal cell[Primary Epidermal Keratinocytes; Normal, Human, Adult (ATCC® PCS-200-011™)]은 ATCC사에서 구매하여 사용하였다. FACS 실험은 위에 언급한 방법과 동일한 방법으로 진행되었으며, 1차 항체는 Cetuximab, B4A3 IgG를 사용하였고, 2차 항체는 Alexa Fluor 488 Goat Anti-Human IgG (H+L) Antibody(Life Technologies)를 사용하였다. 위의 결과를 토대로 B4A3 항체(IgG1)는 EGFRvIII 만을 발현하는 vIII352T1에 특이적으로 결합함 (도 11)과 동시에 정상세포에서는 대조항체인 cetuximab 대비 최소화된 결합양상을 보였다 (도 10). 정상세포에 최소화된 결합능을 토대로 B4A3항체는 정상세포에 최소화된 독성을 보일 것으로 보인다.
실시예 6. 약물 결합한 EGFRvIII 항체의 세포독성
B4A3항체가 표적세포의 EGFRvIII/EGFR에 특이적으로 결합하여 세포내재능 및 Antibody-Drug Conjugates로 적용 가능성을 검증하기 위해 B4A3항체에 사포린 (Saporin) 결합을 통해서 세포독성 실험을 수행하였다. B4A3항체에 독성물질인 사포린의 결합은 ZAP 항체 내재화 키트 (ZAP antibody internalization kit: Advanced Targeting Systems, Inc.)를 이용하여 수행하였다. ZAP 항체 내재화 키트에서 제공하는 독성물질 사포린은 항-인간 IgG-IgG에 결합된 형태로, 인간 IgG인 B4A3항체에 2차항체의 형태로 결합되게 된다. 사포린은 단독으로 세포내로 들어갈 수 없으며, 표적항원인 EGFRvIII에 B4A3 인간 IgG/사포린 접합 항-인간 IgG-IgG의 복합체가 결합하여, 세포내재화 되고, 사포린은 세포내에 방출되어 리보솜을 비활성화 시키는 형태로 세포독성을 유도한다. 사포린 접합 항-인간 IgG-IgG는 환자유래세포 등을 포함한 일반적인 세포들 표면에 결합이 되지 않기 때문에 그 자체로는 세포독성이 발생하지 않는다. 실험은 키트 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행되었다. 상세하게, 96 well 세포 배양 플레이트에 EGFRvIII의 발현이 없는 NT352T1 환자세포와 EGFRvIII의 발현된 vIII352T1 환자세포를 5000개/well로 90μl 부피로 분주 하였다. 다음날, B4A3 인간 IgG/사포린 접합 항-인간 IgG-IgG 결합체는 세포배양배지에 10μl로 처리하였으며, B4A3항체는 최고농도 10nM에서부터 1/10씩 희석하여 8개의 농도로 3반복 실험을 진행하였다. 항체 특이적인 세포독성인지 확인하기 위해 사포린 단독 처리군 및 사포린 접합 항-인간 IgG-IgG 처리군을 대조군으로 추가하여 실험을 진행하였으며, 복합체 및 사포린 등을 처리한 후 72시간 뒤에 세포성장을 분석하였다. 분석은 EZ-Cytox kit(WST based Cell Viability/Cytotoxicity Assay Kit)를 이용하여 진행하였으며, 발색시약 처리 후 2시간 37℃ CO2 배양기에서 배양한 후, 450nm에서 OD값을 분석하였다. 그 결과, 표적항원인 EGFRvIII를 발현하지 않는 NT352T1에서는 세포독성이 나오지 않음을 확인하였고, vIII352T1 환자세포에서는 사포린 단독 처리군 및 사포린 접합 항-인간 IgG 처리군에서는 세포독성이 나타나지 않았지만, B4A3 IgG/ 사포린 접합 항-인간 IgG-IgG 처리군에서는 세포독성이 확인되었다 (도 12). 이를 통해 B4A3 항체의 ADC (Antibody-Drug Conjugates)로 적용 가능성을 확인하였다.
실시예 7. B4A3 항체의 EGFR 및 EGFRvIII에 대한 친화도 정량
B4A3항체의 EGFR 및 EGFRvIII에 대한 친화도를 정량하기 위해 SPR(Surface Plasmon Resonance) 기반의 Biacore T200(GE Healthcare Life Sciences)을 이용하였다. 항체의 친화도 결정에 사용한 항원인 EGFRvIII 재조합 단백질은 자체적으로 제조하였으며, www.uniprot.org에 EGFR(Entry: P00533)서열을 기반으로 문헌을 참고하여 EGFR의 세포 외 영역(Extracellular domain) 아미노산 서열에 30번에서 297번까지 아미노산을 제거한 후 29번과 298번이 만나는 부위 사이에 글리신 아미노산을 첨가하고, c-말단에 Fc 택(IgG1 CH2, CH3 도메인의 Pro110-Lys330)을 첨가한 벡터(서열번호 20, 도 14)를 만들어 동물세포(Expi293, Gibco)를 이용해 생산/정제하여 사용하였다. EGFR 재조합 단백질은 Recombinant Human EGFR/ErbB1 Fc Chimera Protein (R&D systems, 344-ER)을 사용하였다.
상세하게 Biacore T200에 Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare Life Sciences, BR100530)를 장착하고 Amine Coupling Kit(GE Healthcare Life Sciences, BR100050)과 Human Fab Capture Kit(GE Healthcare Life Sciences, 28-9583-25)를 이용해 제조사에서 제공하는 매뉴얼대로 수행하여, Human Fab Capture Antibody를 Sensor Chip 표면에 고정하였다. 친화도를 정량하기 위해 B4A3항체를 HBS-EP+(GE Healthcare Life Sciences, BR100669)에 10ug/mL로 희석하여 30μl/min으로 120초 투입 진행 후, 안정화를 시키고, EGFRvIII 항원을 HBS-EP+(GE Healthcare Life Sciences, BR100669)에 희석하여 0.25nM부터 2배씩 농도를 올려 256nM까지 서로 각각의 사이클로 분석을 수행하였다. 항원 투입은 HBS-EP+에 농도에 맞게 희석 후 30ul/min으로 180초 결합시키고, HBS-EP+ 용액을 30ul/min으로 360초 흘려주어 해리시켰다. 각 농도 별 분석이 종료될 때 마다 Glycine 2.0 regeneration buffer (GE Healthcare Life Sciences, BR100355)를 이용하여 직전 단계에서 사용된 항체와 항원은 제거하고 다음 분석을 수행하였다. 이 방법과 동일하게 EGFR에 대한 친화도 정량이 수행되었으며, Biaevaluation software(GE Healthcare Life Sciences)를 이용하여 항원에 대한 항체의 친화도는 정량되었다.
B4A3항체는 EGFR 재조합 단백질에는 거의 결합하지 않음을 Sensorgram을 통해 확인할 수 있고, EGFRvIII 재조합 단백질에 결합상수는 5.661×104 (1/Ms)인 것으로 확인되었으며, 해리상수는 2.480×10-4(1/s)로 분석되었다. 이를 토대로 B4A3 항체의 친화도는 4.38nM의 친화력으로 EGFRvIII에 결합함을 확인하였다 (도 13).
실시예 8. B4A3 항체의 In-vivo 모델 효능 평가
B4A3 항체의 EGFR 및 EGFRvIII에 대한 In-vivo 효능 확인을 위해 GBM 환자 유래세포 중 NS07-464T을 사용하였다. NS07-464T는 EGFR이 과발현/증폭과 동시에 EGFRvIII 돌연변이를 가지고 있는 GBM 환자 유래세포이다. 삼성서울병원 난치암사업단에서 분석을 한 유전자데이터를 기반으로 EGFRvIII 돌연변이 세포로 NS07-464T를 선별하였고, 삼성서울병원 난치암사업단 바이오뱅크에서 분양을 받아, RT-PCR과 western blot법을 통해 EGFRvIII의 발현을 확인하였다(도 2). NS07-464T 환자세포를 이용하여 피하 이종이식 모델(subcutaneous xenograft model)을 만들어 약 265mm3의 종양크기가 형성되었을 때 Human IgG(Sigma, I4506), Cetuximab(Merck), B4A3항체는 각각 주2회 10mg/kg로 총 4회 투여 되었다. 그룹 당 마우스는 Human IgG, Cetuximab 그룹은 각각 5마리, B4A3 처리 그룹은 4마리이다. 항체를 투여하기 시작한 시점부터 13일이 되었을 때, Human IgG를 처리한 그룹은 1426.5 mm3의 종양을 형성하였으며, Cetuximab은 13일 째 1228.5 mm3 크기의 종양이 형성 되었고 대조그룹 대비 종양형성억제능은 14%로 확인 되었다. B4A3항체는 투여 13일 째 699.5 mm3의 종양이 형성되었고 대조그룹 대비 종양 형성 억제능은 51%로 확인 되었다. 이를 통해 B4A3의 EGFRvIII 돌연변이를 가진 환자유래세포에서의 탁월한 항암 효능을 검증하였다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 암세포의 표면에 발현된 EGFRvIII에 결합한 후 세포 내로 내재화되는 항-EGFRvIII 항체 및 이의 의약용도를 제공한다.
(ii) 본 발명의 항체는 EGFRvIII을 발현하는 암세포의 침윤과 전이를 억제한다.
(iii) 본 발명의 항체는 암의 치료 또는 진단에 이용될 수 있으며, EGFRvIII은 암세포의 표면에 과발현되는 분자이므로 본 발명의 항체를 사용하면 정상세포에는 최소한의 영향을 주면서 암세포만을 선택적으로 타겟팅할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (14)

  1. EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 서열을 가지는 EGFRvIII의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 서열을 가지는 CDR(complementarity determining region)H1, 서열번호 3의 서열을 가지는 CDRH2, 및 서열번호 4의 서열을 가지는 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 5의 서열을 가지는 CDRL1, 서열번호 6의 서열을 가지는 CDRL2, 및 서열번호 7의 서열을 가지는 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제 1항에 있어서, 서열번호 8 내지 서열번호 15의 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 서열을 가지는 골격 영역 (FR)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제 1항에 있어서, 서열번호 16의 서열을 가지는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제 1항에 있어서, 서열번호 17의 서열을 가지는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 18 또는 서열번호 19의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 핵산.
  8. 제6항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  9. 제8항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  10. 다음 단계를 포함하는 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제9항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  11. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 암은 폐암, 대장암, 위암, 신장암, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
  14. 제 13항의 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
PCT/KR2017/001623 2016-02-15 2017-02-15 EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도 WO2017142294A1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SG11201806597XA SG11201806597XA (en) 2016-02-15 2017-02-15 ANTIBODY AGAINST EGFRvIII AND USE THEREOF
US16/073,787 US10669340B2 (en) 2016-02-15 2017-02-15 Antibody against EGFRvIII and use thereof
AU2017219386A AU2017219386B2 (en) 2016-02-15 2017-02-15 Antibody against EGFRvIII and use thereof
CN201780016803.8A CN109476738A (zh) 2016-02-15 2017-02-15 抗EGFRvIII的抗体及其用途
CA3013584A CA3013584C (en) 2016-02-15 2017-02-15 Antibody against egfrviii and use thereof
JP2018542731A JP6795603B2 (ja) 2016-02-15 2017-02-15 ＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｖａｒｉａｎｔ ＩＩＩ）に対する抗体およびその用途
EP17753455.9A EP3418303A4 (en) 2016-02-15 2017-02-15 ANTI-EGFRVIII ANTIBODIES AND CORRESPONDING USE

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2016-0017118 2016-02-15
KR20160017118 2016-02-15
KR1020170020416A KR101887977B1 (ko) 2016-02-15 2017-02-15 EGFRvIII (Epidermal Growth Factor Receptor Variant III)에 대한 항체 및 이의 용도
KR10-2017-0020416 2017-02-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017142294A1 true WO2017142294A1 (ko) 2017-08-24

Family

ID=59626147

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/001623 WO2017142294A1 (ko) 2016-02-15 2017-02-15 EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2017142294A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114044826A (zh) * 2021-10-12 2022-02-15 南京融捷康生物科技有限公司 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003523771A (ja) * 2000-02-25 2003-08-12 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ， アズ レプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 改善された細胞傷害性および収率を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ、それに基づく免疫毒素、ならびにその使用方法
US20050222059A1 (en) * 2002-02-25 2005-10-06 Tang Careen K Egfrviii specific monoclonal antibody and egfrviii ribozymes and use to detect, treat or prevent egfrviii associated cancer
JP2007297398A (ja) * 1994-11-28 2007-11-15 Univ Thomas Jefferson 突然変異上皮成長因子受容体を標的とする試薬および方法
KR20120098932A (ko) * 2003-06-27 2012-09-05 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그 용도
KR20140091064A (ko) * 2011-11-16 2014-07-18 암젠 인크 표피 성장 인자 결실 돌연변이체 vⅲ 관련 장애를 치료하는 방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007297398A (ja) * 1994-11-28 2007-11-15 Univ Thomas Jefferson 突然変異上皮成長因子受容体を標的とする試薬および方法
JP2003523771A (ja) * 2000-02-25 2003-08-12 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ， アズ レプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー オブ ザ デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 改善された細胞傷害性および収率を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩｓｃＦｖ、それに基づく免疫毒素、ならびにその使用方法
US20050222059A1 (en) * 2002-02-25 2005-10-06 Tang Careen K Egfrviii specific monoclonal antibody and egfrviii ribozymes and use to detect, treat or prevent egfrviii associated cancer
KR20120098932A (ko) * 2003-06-27 2012-09-05 암젠 프레몬트 인코포레이티드 상피 성장 인자 수용체의 결실 돌연변이체 지향 항체 및 그 용도
KR20140091064A (ko) * 2011-11-16 2014-07-18 암젠 인크 표피 성장 인자 결실 돌연변이체 vⅲ 관련 장애를 치료하는 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3418303A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114044826A (zh) * 2021-10-12 2022-02-15 南京融捷康生物科技有限公司 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用
CN114044826B (zh) * 2021-10-12 2023-11-17 南京融捷康生物科技有限公司 针对EGFRvIII的单域抗体及其衍生蛋白和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2020111913A1 (en) Anti-4-1bb antibody and use thereof
WO2019098682A1 (ko) 항-her2 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
KR102048477B1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2015005632A1 (ko) Dll4와 vegf에 특이적으로 결합하는 신규 이중표적 단백질 및 이의 용도
WO2016013870A1 (ko) 완전한 이뮤노글로불린 형태의 항체를 세포막을 투과하여 세포질에 위치시키는 방법 및 그의 이용
WO2019132533A1 (ko) 항-pd-l1 항체 및 이의 용도
WO2021107566A1 (ko) C-kit에 대한 항체 및 이의 용도
US10047154B2 (en) Angiopoietin-2 specific antibodies and uses thereof
CN112752580A (zh) 抗klrg1抗体
WO2016089126A1 (ko) 뉴로필린 1(Neuropilin 1)에 대한 항체 및 이의 용도
JP2022542574A (ja) 抗ｈｅｒ２／抗４－１ｂｂ二重特異性抗体及びその使用
WO2017074013A1 (ko) 인간 및 마우스 sema3a에 교차결합하는 항체 및 그의 용도
WO2017142294A1 (ko) EGFRvIII에 대한 항체 및 이의 용도
AU2017219386B2 (en) Antibody against EGFRvIII and use thereof
WO2016084993A1 (ko) 신규 EGFRvIII 항체 및 이를 포함하는 조성물
WO2022216014A1 (ko) 항-cntn4 항체 및 그의 용도
WO2022025585A1 (ko) 항-lilrb1 항체 및 그의 용도
WO2017179862A1 (ko) 안정성이 개선된 ｈｅｒ２에 특이적으로 결합하는 항체
KR102119783B1 (ko) 인간 상피 성장 인자 수용체 변이체 ⅲ에 결합하는 항체 및 그의 항체 단편
WO2017209553A2 (ko) 환자 유래 세포를 이용한 항체 스크리닝 방법
WO2023043156A1 (ko) 항-vegfr2(kdr) 개량 항체 및 이의 용도
WO2023234748A1 (ko) 항-tigit 항체 및 이의 용도
WO2022244908A1 (ko) 항-bcam 항체 또는 그의 항원 결합 단편
WO2023136648A1 (ko) 항-vegfr2(kdr) 개량 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
WO2021118246A1 (en) Anti-bcma/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17753455

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11201806597X

Country of ref document: SG

Ref document number: 3013584

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018542731

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017753455

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017753455

Country of ref document: EP

Effective date: 20180917

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017219386

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20170215

Kind code of ref document: A