KR20140091064A - 표피 성장 인자 결실 돌연변이체 vⅲ 관련 장애를 치료하는 방법 - Google Patents

표피 성장 인자 결실 돌연변이체 vⅲ 관련 장애를 치료하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물에 컨주게이트된 EGFRvⅢ에 대한 항체를 포함하는, 항원 결합 단백질을 사용하여 표피 성장 인자 결실 돌연변이체 vⅢ (EGFRvⅢ) 관련 장애, 예컨대 교모세포종 또는 역형성 별아교세포 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 그와 같은 항체 및 그의 약물 컨주게이트의 진단 및 치료 제형이 또한 제공된다.

Description

표피 성장 인자 결실 돌연변이체 VⅢ 관련 장애를 치료하는 방법 {METHODS OF TREATING EPIDERMAL GROWTH FACTOR DELETION MUTANT VⅢ RELATED DISORDERS}
본원은 미국 가출원 제61/727,029호(2012년 11월 15일 출원), 및 미국 가출원 제61/560,731호(2011년 11월 16일 출원)를 우선권으로 주장하고, 이들은 본원에 참고로 포함되어 있다.
서열 목록에 대한 참조
본원은 전자 형태로 서열 목록과 함께 출원 중이다. 서열 목록은 A-1680-US-PSP_SEQ.txt(2011년 11월 16일 제작, 89 KB의 크기)라는 명칭의 파일로서 제공된다. 전자 형태의 서열 목록 내의 정보는 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
발명의 분야
본 발명은 약물에 컨주게이트된 EGFRvⅢ에 대한 항체를 포함하는, 항원 결합 단백질을 사용하여 표피 성장 인자 결실 돌연변이체 vⅢ (EGFRvⅢ) 관련 장애, 예컨대 교모세포종 또는 역형성 별아교세포 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 그와 같은 항체 및 그의 약물 컨주게이트의 진단 및 치료 제형이 또한 제공된다.
인간 및 동물 암의 더 나은 진단 및 치료를 돕는 종양 특이적 분자들이 지난 세기부터 발견되어왔다. 분자 구조 데이터에 기초한, 종양-특이적 물질들의 확실한 증거는, 바이러스로 유도된 암에 기초하며 바이러스 게놈에 의해 명시된 분자 구조와 관련된 암을 제외한 대부분의 유형의 인간 암에서 제공하기 어려웠다. 신규 분자 구조에 기초한 종양-특이적 분자의 예는 극소수였다. 악성 인간 신경아교종 및 표피 성장 인자 수용체 분자의 증폭 또는 변화와 잠재적으로 연관된 기타 종양, 예컨대 유방의 암종 및 다른 인간 암종의 경우, 독특한 서열을 갖는 구조적으로 변경된 분자가 명백하게 입증되지 않았다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 원종양유전자(proto-oncogene) c-erb B의 170 킬로달톤 막 당단백 생성물이다. EGFR 유전자의 서열은 공지되어 있다 (Ullrich 등 (1984). Human Epidermal Growth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of the Amplified Gene in A431 Epidermoid Carcinoma Cells. Nature 309:418-425). EGFR 유전자는 조류 적모구증 바이러스에서 처음 동정된 erb B 종양유전자의 세포성 동족체이다 (Downward 등 (1984). Close Similarity of Epidermal Growth Factor Receptor and v-erb B Oncogene Protein Sequence. Nature 307:521-527, Ullrich, 등 (1984)). 유전자 증폭에 의한 이 종양유전자의 활성화는 다양한 인간 종양에서 관찰되어 왔다 (Haley 등 (1987A). The Epidermal Growth Factor Receptor Gene in: Oncogenes, Genes, and Growth Factors Edited by: Guroff, G. 12th Edition. Chapter 2. pp. 40-76. Wiley, N.Y.), and in particular, those of glial origin (Libermann 등 (1985). Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin. Nature 313:144-147; Wong 등 (1987). Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6899-6903; Yamazaki 등 (1988). Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth Factor Receptor Gene (c-erbB) in Human Brain Tumors. Molecular and Cellular Biology 8:1816-1820; Malden 등, (1988). Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme. Cancer Research 4:2711-2714).
EGF-r은 많은 유형의 인간 고형 종양에서 과발현되는 것으로 입증되어 왔다. Mendelsohn Cancer Cells 7:359 (1989), Mendelsohn Cancer Biology 1:339-344 (1990), Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). 예를 들면, EGFR 과발현은 일부 폐, 유방, 결장, 위, 뇌, 방광, 두경부, 난소, 신장 및 전립선 암종에서 관찰되어 왔다. Modjtahedi and Dean Int'l J. Oncology 4:277-296 (1994). 표피 성장 인자 (EGF) 및 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파) 모두는 EGF-r에 결합하고 세포 증식 및 종양 성장을 야기하는 것으로 입증되어 왔다.
v-erb B 종양유전자와 정상적인 EGFR 유전자의 한 가지 주된 차이점은 상기 바이러스 종양유전자가 정상 수용체의 아미노-절단된 형태라는 점이고, 이들은 세포질외 도메인 대부분이 없지만 막통과 및 티로신 키나제 도메인을 보유한다 (Fung 등, (1984) Activation of the Cellular Oncogene c-erb B by LTR Insertion: Molecular Basis for Induction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus. Cell 33:357-368; Yamamoto 등, (1983). A New Avain Erythroblastosis Virus, AEV-H Carries erbB Gene Responsible for the Induction of Both Erythroblastosis and Sarcoma. Cell 34:225-232, Nilsen 등, (1985). c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis: Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor. Cell 41:719-726; Gammett 등, (1986). Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6053-6057). 이것은 표피 성장 인자 (EGF)에 결합할 수 없지만 여전히 다른 기질을 인산화시킬 수 있는 단백질을 초래하고 (Gilmore 등, (1985). Protein Phosphorlytion at Tyrosine is Induced by the v-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro. Cell 40:609-618; Kris 등, (1985). Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probe for the Kinase Activity of the Avian EGF Receptor and v-erB Protein. Cell 40:619-625), 키나제 도메인이 조절되지 않고 항시적으로 활성이기 때문에 v-erb B 단백질이 종양원성이라는 추측을 이끌어냈다 (Downward 등, 1984).
다양한 유전적 변이들이 바이러스 erb B 종양유전자에서 일어날 수 있는데, 예를 들면 상기 유전자의 카복시 말단에서 아미노산 치환 및 결실이 일어날 수 있다. 하지만, 이용가능한 증거는 상기 아미노 절단이 발암에 매우 중요하다는 것을 주장한다. 아미노 절단은 프로모터 삽입 또는 레트로바이러스 형질도입에 의해 발생하는 것을 포함하는, 모든 v-erb B 종양유전자의 특징이다 (Nilsen 등, (1985). c-erbB Activation in ALV-Induced Erythroblastosis: Novel RNA Processing and Promoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor. Cell 41:719-726; Gammett 등, (1986). Differences in Sequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Correlate with Differences in the Disease Potential of Viral erbB Genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6053-6057).
이에 반해, 카복시-말단 결실은 레트로바이러스 형질도입을 통해 발생하는 종양과만 연관되는 것으로 보이며 숙주 범위 및 종양 유형 특이성을 결정하는 것 같다 (Gammett 등, 1986; Raines 등, (1985). c-erbB Activation in Avian Leukosis Virus-Induced Erythroblastosis: Clustered Integration Sites and the Arrangement of Provirus in the c-erbB Alleles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2287-2291). 아미노-절단된 조류 c-erb B 유전자 또는 키메라 바이러스 종양유전자-인간 EGF 수용체를 이용한 형질감염 실험은 이 결실이 단독으로 형질전환 단백질을 만드는데 충분하다는 것을 보여준다 (Pelley 등, (1988). Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but not Sarcomagenic: Characterization of a Replication--Competent Retrovirus Containing the Activated c-erbB. Journal of Virology 62: 1840-1844; Wells 등, (1988). Genetic Determinants of Neoplastic Transformation by the Retroviral Oncogene v-erbB. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7597-7601).
EGFR 유전자의 증폭은 악성 인간 신경아교종의 대략 40%에서 발생하고 (Libermann 등, (1985) Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin. Nature 313:144-147; Wong 등, (1987). Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6899-6903), 수용체 유전자의 재배열은 유전자 증폭을 갖는 많은 종양에서 명백하다. 구조적 변경은 우선적으로 상기 유전자의 아미노 말단 절반에 영향을 미치는 것으로 보이지만 (Yamazaki 등, (1985). Amplification, Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin. Nature 313:144-147; Malden 등, (1988). Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme. Cancer Research 4:2711-2714), 재배열의 특성은 그때 임의의 종양에서 정확하게 규명되지 않았다.
크기 변형 EGFR 유전자 및 증폭이 몇 가지 인간 암에서 보고된 바 있다. (Humphrey 등, (1988). Amplification and Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Human Glioma Xenografts. Cancer Research 48:2231-2238; Bigner 등, (1988) J. Neuropathol. Exp. Neurol., 47:191-205; Wong 등, (1987). Increased Expression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is Invariably Associated with Gene Amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6899-6903; and Humphrey 등 Amplification and expression of the epidermal growth factor receptor gene in human glioma xenografts. Cancer Res. 48(8):2231-8 (1988)) There had been no determination, however, of the molecular basis for the altered EGFR molecules in cells.
1989년에, 비그너 및 보겔스타인 박사는 유형 Ⅲ 돌연변이체로서 공지된 EGF 수용체 돌연변이체 (델타-EGFr 또는 EGFRvⅢ로도 지칭됨)의 서열을 설명하였다. 이 작업은 미국 특허 제6,455,498호, 제6,127,126호, 제5,981,725호, 제5,814,317호, 제5,710,010호, 제5,401,828호, 및 제5,212,290호에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 참조로 본원에 포함되어 있다.
EGFR 변이체는 EGFR 유전자 증폭을 동반하는 유전자 재배열에 의해 야기된다. 8개의 EGFR의 주요 변이체가 알려져 있다: (i) EGFRvI은 EGFR의 세포외 도메인 과반수가 없고, (ii) EGFRvII는 EGFR의 세포외 도메인 내에 83 aa 인프레임 결실로 구성되며, (iii) EGFRvⅢ은 EGFR의 세포외 도메인 내에 267 aa 인프레임 결실로 구성되고, (iv) EGFRvIV는 EGFR의 세포질 도메인 내에 결실들을 함유하며, (v) EGFRvV는 EGFR의 세포질 도메인 내에 결실들을 함유하고, (vi) EGFR.TDM/2-7은 EGFR의 세포외 도메인 내에 엑손 2-7의 중복을 함유하며, (vii) EGFR.TDM/18-25는 EGFR의 티로신 키나제 도메인 내에 엑손 18-26의 중복을 함유하고, (viii) EGFR.TDM/18-26은 EGFR의 티로신 키나제 도메인 내에 엑손 18-26의 중복을 함유한다 (Kuan 등 EGF mutant receptor vⅢ as a molecular target in cancer therapy. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001)). 또한, 엑손 11 및 14의 접합부에 신규 히스티딘 잔기들을 도입하는 두 번째 결실을 갖는 두 번째로 더 드문 EGFRvⅢ 돌연변이체 (EGFRvⅢ/Δ12-13)가 존재한다 (Kuan 등 EGF mutant receptor vⅢ as a molecular target in cancer therapy. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001)).
EGFRvⅢ은 인간 암에서 표피 성장 인자 (EGF) 수용체의 가장 흔하게 발생하는 변이체이다 (Kuan 등 EGF mutant receptor vⅢ as a molecular target in cancer therapy. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001)). 유전자 증폭 과정 동안, 세포외 도메인에서 267개의 아미노산 결실이 발생하여 종양 특이적 모노클론 항체들이 지향될 수 있는 신규 접합을 만든다. 이러한 EGF 수용체의 변이체는 리간드 비의존적 방식으로 항시적 신호전달을 통해 종양 진행에 기여한다. EGFRvⅢ은 임의의 정상 조직에서 발현되는 것으로 알려져 있진 않다 (Wikstrand, CJ. 등 Monoclonal antibodies against EGFRvⅢ are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. Cancer Research 55(14): 3140-3148 (1995); Olapade-Olaopa, EO. 등 Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer. Br J Cancer. 82(1):186-94 (2000. 글리신 치환에 의한 267 개의 아미노산의 결실은 항체 표적이 가능한 독특한 접합을 만든다. 또한, 어떤 종양에서의 EGFRvⅢ의 발현 및 정상 조직에서 그의 발현 부족에 비추어 볼 때, EGFRvⅢ은 종양 치료에서 약물 표적화를 위한 이상적인 표적일 수 있다. 특히, EGFRvⅢ은 종양의 면역컨주게이트 요법을 위한 이상적인 후보인 것으로 보일 것이다 (예를 들면, 항 종양 제제 또는 독소에 컨주게이트된 항체) EGFRvⅢ을 과발현하는 암을 치료하는 또 다른 방법은 정상 EGFR을 절단하지 않는 변이체 수용체를 특이적으로 표적화하는 종양-특이적 리보자임의 사용을 포함하였다. 리보자임은 무흉선 누드 마우스에서 유방암 성장을 유의하게 억제하는 것으로 확인되었다 (Luo 등 Int. J. Cancer. 104(6):716-21 (2003)).
전체 EGFRvⅢ 단백질에 대한 일반적인 항체가 기술되어 왔다. 국제특허출원 제WO 01/62931호 및 문헌[Kuan 등 EGF mutant receptor vⅢ as a molecular target in cancer therapy. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001), Kuan 등 EGFRvⅢ as a promising target for antibody-based brain tumor therapy. Brain Tumor Pathol. 17(2):71-78 (2000), Kuan 등 Increased binding affinity enhances targeting of glioma xenografts by EGFRvⅢ-specific scFv. International Journal of Cancer. 88(6):962-969 (2000), Landry 등 Antibody recognition of a conformational epitope in a peptide antigen: Fv-peptide complex of an antibody fragment specific for the mutant EGF receptor, EGFRvⅢ. Journal of Molecular Biology. 308(5):883-893 (2001), Reist 등 Astatine-211 labeling of internalizing anti-EGFRvⅢ monoclonal antibody using N-succinimidyl 5-[211At]astato-3-pyridinecarboxylate. Nuclear Medicine and Biology. 26(4):405-411 (1999), Reist 등 In vitro and in vivo behavior of radiolabeled chimeric anti-EGFRvⅢ monoclonal antibody: comparison with its murine parent. Nuclear Medicine and Biology. 24(7):639-647 (1997), Wikstrand 등 Generation of anti-idiotypic reagents in the EGFRvⅢ tumor-associated antigen system. Cancer Immunology, Immunotherapy. 50(12):639-652 (2002), Wikstrand 등 Monoclonal antibodies against EGFRvⅢ are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas. Cancer Research. 55(14):3140-3148 (1995), Wikstrand 등 The class Ⅲ variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRVⅢ): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J.Neurovirol. 4(2):148-158 (1998), Wikstrand 등 The class Ⅲ variant of the epidermal growth factor receptor (EGFRvⅢ): characterization and utilization as an immunotherapeutic target. J.Neurovirol. 4(2):148-158 (1998), Jungbluth 등 A monoclonal antibody recognizing human cancers with amplification/overexpression of the human epidermal growth factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639-44 (2003), Mamot 등 Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-targeted Immunoliposomes Mediate Specific and Efficient Drug Delivery to EGFR- and EGFRvⅢ-overexpressing Tumor Cells. Cancer Research 63:3154-3161 (2003))]을 참조한다. 그러나, 이들 전술한 항체들 각각은 가변 및/또는 불변 영역 내에 쥣과 서열을 갖거나 함유한다. 그러한 쥣과 유도된 단백질의 존재는 항체의 빠른 소거를 야기하거나 환자에서 항체에 대한 면역 반응의 발생을 야기할 수 있다. 또한, 그러한 항체들은, 친화도 숙성 후에도, 대략 2.2 x 10-8 내지 1.5 x 10-9로 상대적으로 친화도가 낮다. (Kuan 등 EGF mutant receptor vⅢ as a molecular target in cancer therapy. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001)).
쥣과 또는 랫트 유도된 항체의 이용을 피하기 위해, 연구자들은 설치류가 완전한 인간 항체를 생산할 수 있도록 인간 항체 기능을 설치류 내에 도입하였다. 예를 들면, 문헌[Mendez 등 Functional transplant of megabase human immunoglobulin loci recapitulates human antibody response in mice. Nat Genet.15(2):146-56 (1997)]을 참조한다. 이 접근법은 야생형 EGFR에 대한 성공적인 항체의 생성과 관련하여 사용되어 왔다. 예를 들면, 문헌[Yang X 등 Development of ABX-EGF, a fully human anti-EGF receptor monoclonal antibody, for cancer therapy. Crit Rev Oncol Hemato 38(1):17-23 (2001); Yang X-D 등 Eradication of Established Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to the Epidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy. Cancer Research 59(6):1236-1243 (1999)]; 및 미국특허 제6,235,883호를 참조한다.
발명의 요약
일 구현예에서, 본 발명은 EGFRvⅢ 및 서열 L E E K K G N Y V V T D H C (서열번호: 56)를 포함하는 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 독소, 특히 DM1에 컨주게이트된, 단리된 인간 모노클론 항체를 포함하며, 여기서 상기 항체는 독소, 특정하게 DM1에 컨주게이트된다. 또 하나의 구현예에서, 본 발명은 L E E K K G N Y V V T D H C (서열번호: 56)를 포함하는 서열 내에 함유된 에피토프에 특이적으로 결합하는, 독소, 특정하게 DM1에 컨주게이트된 단리된 인간 모노클론 항체를 포함하고, 여기서 SPOT 분석에서 알라닌 스캐닝에 의해 결정된 바와 같이, 결합에 필요한 상기 잔기들은, EEK, KKNYV, LEK, EKNY 및 EEKGN으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 구현예는 VH3-33 유전자에 의해 인코딩된 중쇄 가변 영역 아미노 서열을 포함하는, 독소, 특정하게 DM1에 컨주게이트된, 단리된 인간 모노클론 항체를 포함한다. 상기 중쇄 가변 영역 아미노 서열은 JH4b 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열, 또는 D6-13 및 D3-9로 이루어진 군으로부터 선택된 D 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예는 A23(VK2) 유전자에 의해 인코딩된 경쇄 가변 영역 아미노 서열을 포함하는, 독소, 특정하게 DM1에 컨주게이트된, 단리된 인간 모노클론 항체를 포함한다. 상기 경쇄 가변 영역 아미노 서열은 JK1 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예는 독소, 특히 DM1에 컨주게이트된, EGFRvⅢ에 결합하며, (서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17)에서 확인된 바와 같이 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 및 333의 중쇄 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체, 또는 그의 단편을 포함한다. 상기 항체는 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.
상기 독소는 링커를 통해 항체와 연결될 수 있다. 상기 독소는 2차 항체를 통해 항체와 연결될 수 있다. 추가 구현예는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 및 항체를 인코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환된 세포를 포함한다. 상기 세포는, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 세포일 수 있다.
추가 구현예는 EGFRvⅢ을 발현하는 세포를 유효량의 항체 또는 단편으로 처리하는 것을 포함하는, EGFRvⅢ의 발현과 연관된 세포 증식을 억제하는 방법을 포함한다. 일 구현예에서, 항체는 독소, 특히 DM1에 컨주게이트되고, 항체 13.1.2 (서열번호: 138), 131 (서열번호: 2), 170 (서열번호: 4), 150 (서열번호: 5), 095 (서열번호: 7), 250 (서열번호: 9), 139 (서열번호: 10), 211 (서열번호: 12), 124 (서열번호: 13), 318 (서열번호: 15), 342 (서열번호: 16), 및 333 (서열번호: 17)의 중쇄 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 상기 방법은 생체내에서 수행될 수 있고, 상피 세포 증식, 예컨대 폐, 결장, 위, 신장, 전립선, 유방, 두경부 또는 난소 암종 또는 교모세포종을 포함하는 암으로부터 고통받는 인간과 같은 포유동물에게 수행될 수 있다.
추가 구현예는 표적화된 세포를 사멸시키는 방법을 포함한다. 이것은 표적화된 세포를 독소와 연결된 항체와 접촉시킴으로써 달성된다. 상기 항체는 펩타이드 LEEKKGNY (서열번호: 133)에 결합한다. 일 구현예에서, 상기 항체는 상기 펩타이드에 대해 1.3*10-9M보다 큰 결합 친화도를 갖는다. 일 구현예에서, 상기 독소는 DM1이다. 일 구현예에서, 상기 항체 독소 화합물은 상기 펩타이드가 없는 세포보다 표적화된 세포에 대해 10배 더 독성이다. 일 구현예에서, 항체는 항체 13.1.2 (서열번호: 138), 131 (서열번호: 2), 170 (서열번호: 4), 150 (서열번호: 5), 095 (서열번호: 7), 250 (서열번호: 9), 139 (서열번호: 10), 211 (서열번호: 12), 124 (서열번호: 13), 318 (서열번호: 15), 342 (서열번호: 16), 및 333 (서열번호: 17)의 중쇄 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 항체는 절단불가 링커를 통해 독소와 연결된다.
본 발명의 추가 구현예는 EGFRvⅢ에 결합하고 하기 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는, 독소, 특히 DM1에 컨주게이트된, 단리된 항체를 포함한다:
(a) 서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 및 333의 CDR1 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1;
(b) 서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 및 333의 CDR2 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2; 및
(c) 서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 및 333의 CDR3 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3. 일 구현예에서, 상기 컨주게이트된 항체는 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간, 또는 인간화 항체이다. 일 구현예에서, 상기 컨주게이트된 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 및/또는 치료제와 회합된다.
또한, EGFRvⅢ에 결합하고, 서열번호: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 및 32에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, 및 333의 경쇄 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 독소, 특히 DM1에 컨주게이트된, 단리된 항체, 또는 그의 단편이 포함된다. 상기 컨주게이트된 항체는 모노클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 그것은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 회합될 수 있다.
일 구현예에서, 서열번호: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 및 32에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, 및 333의 경쇄 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 또는 형질전환된 세포가 고려된다.
또 하나의 구현예는 EGFRvⅢ을 발현하는 세포를 상기 기재된 유효량의 컨주게이트 항체 또는 단편으로 처리하는 것을 포함하는, EGFRvⅢ의 발현과 연관된 세포 증식을 억제하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 생체내에서 그리고 상피 세포 증식, 예컨대 폐, 결장, 위, 신장, 전립선, 유방, 두경부 난소 암종 또는 교모세포종을 포함하는 암으로부터 고통받는 인간과 같은 포유동물에서 수행될 수 있다.
또 하나의 구현예는 EGFRvⅢ에 결합하고 하기 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 독소, 특히 DM1에 컨주게이트된 단리된 항체를 포함한다:
(a) 서열번호: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 및 32에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, 및 333의 CDR1 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1;
(b) 서열번호: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 및 32에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, 및 333의 CDR1 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2; 및
(c) 서열번호: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 및 32에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, 및 333의 CDR1 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3.
이전 단락에서 확인된 컨주게이트된 항체는 하기 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 중쇄 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다:
(a) 서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 및 333의 CDR1 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR1;
(b) 서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 및 333의 CDR2 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR2; 및
(c) 서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342 및 333의 CDR3 영역에 대한 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열로 이루어진 CDR3.
추가 구현예는 EGFRvⅢ을 발현하는 세포를 전술한 유효량의 컨주게이트된 항체 또는 단편으로 처리하는 것을 포함하는, EGFRvⅢ의 발현과 연관된 세포 증식을 억제하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 폐 암종, 유방 암종, 두경부 암, 난소, 결장, 위, 신장 또는 전립선 암종 또는 교모세포종과 같은 상피 세포 증식을 포함하는 암으로부터 고통받고 있는 인간과 같은, 포유동물에게 생체내에서 수행될 수 있다.
다른 구현예는 서열번호: 138, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 및 17에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 095, 250, 139, 211, 124, 318, 342, 및 333의 중쇄 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된, 중쇄 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자, 또는 서열번호: 140, 19, 20, 21, 29, 23, 25, 26, 28, 33, 31 및 32에서 확인된 바와 같이, 항체 13.1.2, 131, 170, 150, 123, 095, 139, 250, 211, 318, 342, 및 333의 경쇄 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열, 또는 이의 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
추가 구현예는 용기, 그 안에 포함된 조성물, 및 포장 삽입물 또는 상기 조성물이 EGFRvⅢ의 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 표시하는 라벨을 포함하는 제조 물품을 포함하며, 여기서 상기 조성물은 전술한 바와 같은 컨주게이트된 항체를 포함한다. 상기 암은 폐 암종, 유방 암종, 두경부 암, 전립선, 결장, 위 신장 또는 난소 암종 또는 교모세포종을 포함한다. 또한, 폐, 유방, 결장, 위, 신장, 두경부, 전립선 또는 난소 암종 또는 교모세포종을 검진하기 위해 포유동물 조직 또는 세포에서 EGFRvⅢ을 검출하기 위한 분석 키트가 포함되며, 상기 EGFRvⅢ은 상피 암에 의해 발현된 항원이고, 상기 키트는 상기 항원 단백질에 결합하는 항체, 및, 만약 존재하는 경우, 항원과 항체와의 반응을 표시하는 수단을 포함한다. 상기 항체는 표지된 모노클론 항체이거나 상기 항체는 표지되지 않은 1차 항체일 수 있고 반응을 표시하는 수단은 항-면역글로불린인 표지된 2차 항체를 포함한다. 항원에 결합하는 항체는 형광색소, 효소, 방사선핵종 및 방사선불투과성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 마커로 표지될 수 있다. 항원에 결합하는 항체는 2차 표지된 항체에 의해 검출될 수 있다. 항원에 결합하는 항체는 과-발현된 wtEGFR에 또한 결합할 수 있다. 상기 키트는 환자 선별을 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
추가 구현예는 신규 Gly 잔기를 함유하는 EGFRvⅢ의 에피토프를 특이적으로 인식하는, 독소, 특히 DM1에 컨주게이트된 항체를 포함한다.
또 하나의 구현예는 인지 서열 EEKKGNYVVT (서열번호: 57)에 결합하는, 독소, 특히 DM1에 컨주게이트된 항체, 또는 그의 변이체를 포함한다.
또 하나의 구현예에서, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트를 이를 필요로 하는 포유동물에게 적어도 0.1, 0.5, 1.0, 1,5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 또는 9.5 mg/kg 내지 11.0 mg/kg 이하의 용량으로 투여하는 것을 포함하는 종양을 갖는 포유동물을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서 상기 방법은 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트를 이를 필요로 하는 포유동물에게 적어도 0.5 내지 1 mg/kg, 0.1 내지 2 mg/kg, 2 내지 3 mg/kg, 3 내지 4 mg/kg, 4 내지 5 mg/kg, 5 내지 6 mg/kg, 6 내지 7 mg/kg, 7 내지 8 mg/kg, 8 내지 9 mg/kg, 9 내지 10 mg/kg, 1.5 내지 2.5 mg/kg, 2.5 내지 3.5 mg/kg, 3.5 내지 4.5 mg/kg, 4.5 내지 5.5 mg/kg 또는 5.5 내지 6.5 mg/kg의 용량으로 투여하는 것을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 본 발명의 투여 단계는 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트를 포유동물에게 정맥내 투여, 볼러스 주사에 의한 투여, 뇌내 투여 또는 지속 방출 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트는 매주 적어도 2회, 매주 적어도 1회, 2주마다 적어도 1회, 3주마다 적어도 1회 또는 4주마다 적어도 1회 투여된다.
본 발명의 방법에서, 포유동물, 특히 인간에서의 종양은 EGFRvⅢ을 발현한다. 본 발명의 이 측면의 특정한 구현예에서, 상기 종양은 폐 암종, 유방 암종, 결장 암종, 위 암종, 신장 암종, 두경부 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 교모세포종, 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 또는 신경교세포 성분을 포함하는 종양, 특히 교모세포종, 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 또는 신경교세포 성분을 포함하는 종양, 보다 상세하게는 교모세포종 또는 역형성 별아교세포종, 보다 상세하게는 재발성 교모세포종 또는 재발성 역형성 별아교세포종이다.
이 방법의 일 구현예에서, 포유동물의 종양은 희소돌기아교세포종, 희소돌기별아교세포종, 신경교육종, 혼합성 신경아교종, 모양세포성 별아교세포종, 다형성 황색별아교세포종, 뇌실막하 거대세포 별아교세포종, 별아교모세포종, 해면모세포종, 대뇌 교종증, 또는 신경절교종, 및 역형성 신경절교종을 포함하는 신경-아교세포 종양이다.
본 발명의 방법에서, 포유동물은 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 용량의 투여 후 3개월 넘게, 4개월 넘게, 5개월 넘게 또는 6개월 넘게 생존한다.
본 발명의 방법에서, 포유동물의 종양은 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 용량의 투여로부터 3개월 후, 4개월 후, 5개월 후 또는 6개월 후에 진행되지 않는다.
본 발명의 방법에서, 포유동물은 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 투여 전의 포유동물의 순환 종양 세포 수준과 비교하여 감소된 순환 종양 세포 수준을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 포유동물은 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 투여 전의 포유동물의 종양 특유의 엑소좀 수준과 비교하여 감소된 종양 특유의 엑소좀 수준을 포함한다. 본 발명의 방법에서, 포유동물의 종양 크기는 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 용량의 투여 전 종양 크기와 비교하여 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 투여 후에 감소된다.
본 발명의 방법에서, 포유동물의 종양 크기는, 맥도날드(Macdonald) 또는 RANO 기준에 의해 평가된 바와 같이, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 투여 전의 포유동물의 종양 크기와 비교하여, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 감소된다.
본 발명의 방법에서, 포유동물은, 맥도날드 기준에 의해 평가된 바와 같이, 완전한 또는 부분적인 반응을 나타낸다. 본 발명의 방법에서, 포유동물은, 맥도날드 기준 또는 RANO 기준에 의해 평가되는 바와 같이, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 투여로부터 진행되지 않는 6개월의 생존을 나타낸다.
본 발명의 이러한 측면에서, 상기 방법은 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 1차 투여 전 포유동물에서 검출가능한 겉보기 확산 계수와 비교하여 포유동물에서 확산-강조 MRI (DWI)로부터 증가된 겉보기 확산 계수를 야기한다.
본 발명의 방법에서, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 항체는 항체 131 또는 항체 13.1.2, 특히 항체 131이다. 본 발명의 방법의 일 구현예에서, 항-EGFRvⅢ 항체 약물 컨주게이트의 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트는 도 8a, 8b 및 8d에 도시된 Ab 131-DM1이고, 도 8b에 도시된 중쇄 가변 도메인 및 도 8d에 도시된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
본 발명의 구현예에서, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트는 도 8a, 8b 및 8d에 도시된 Ab 131-DM1이고, 도 8b에 도시된 전장 중쇄 및 도 8d에 도시된 전장 경쇄를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 항-EGFRvⅢ 항체가 컨주게이트된 약물은 방사선활성 동위원소, 화학요법제, 독소 또는 그의 단편 또는 변이체, 특히 적어도 1 내지 10, 적어도 1 내지 5, 또는 적어도 3 내지 5개의 메이탄시노이드 DM1이다.
본 발명의 방법에서, 약물은 절단불가 링커 그룹, 특히 티오에테르 링커 그룹, 보다 상세하게는 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC)를 통해 항-EGFRvⅢ 항체에 컨주게이트된다. 상기 컨주게이트된 형태에서, 절단불가 링커는 MCC이다.
본 방법의 특정 구현예에서, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-EGFRvⅢ 항체 및 MCC 링커에 의해 3 내지 5개의 메이탄시노이드에 컨주게이트된 항-EGFRvⅢ 항체가 전술한 바와 같은 종양을 갖는 포유동물을 치료하는데 사용된다.
본 발명의 방법에서, 투여 단계는 종양을 갖는 포유동물을 수술하거나, 종양을 갖는 포유동물에게 방사선요법을 적용하거나, 일차 셋팅에서 전뇌 방사선 요법을 적용하거나, 반복 셋팅에서 초점 방사선 치료를 적용하거나, 일차 및 반복 셋팅에서 테모졸로마이드를 투여하거나, 베바시주맙과 같은 항-혈관성 화합물을 투여하거나, PCV, 프로카바진, 로무스틴 [CCNU], 빈크리스틴을 투여하거나, 글라이아델 웨이퍼 (BCNU로 함침된 폴리페프로산)를 이식하거나, 티로신 키나제 억제제를 투여하거나, 방사선-감작제를 투여하거나, 백신 기반 요법을 실시하거나, 항체 약물 컨주게이트를 투여하거나, 일차 또는 반복 셋팅에서 이중특이적 T-세포 연관체를 투여하거나 표적화된 약물을 투여하는 처치 이전, 이러한 처치와 동시에 또는 이러한 처치 이후에 수행된다.
본 발명의 이러한 방법의 대안적인 구현예에서, 포유동물은 이전에 베바시주맙을 포함하는 항-혈관형성 화합물로 처리되지 않았다. 이 대안적인 구현예에서, 본 발명의 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트로 처리하기에 앞서 항-혈관형성 화합물로 처리되지 않은 포유동물은 이전에 상기 항-혈관형성 화합물로 처리된 포유동물에 비해 더욱 양성 반응을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트, 예컨대 Ab 131-DM1와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료적 분자는, 또 하나의 항-EGFRvⅢ 치료적 분자, 예컨대 항-EGFRvⅢ 백신 예컨대 린도페피무트(Rindopepimut), 항-EGFRvⅢ 항체, 또 하나의 항-EGFRvⅢ 항체 약물 컨주게이트, 또는 항-EGFRvⅢ 이중특이적 T-세포 연관체이다.
본 발명의 구현예에서, Ab 131-DM1과 같은 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료 분자는, 항-EGFR 치료 분자, 예컨대 파니투무맙, 세툭시맙, 다른 항-EGFR 항체, 항-EGFR 백신, 항-EGFR 항체 약물 컨주게이트 또는 항-EGFR 이중특이적 T-세포 연관체이다.
본 발명의 구현예에서, Ab 131-DM1과 같은 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료 분자는, 실툭시맙과 같은 항-인터루킨-6 항체와 같은 항-인터루킨-6 치료 분자, 토실리주맙과 같은 항-인터루킨-6 수용체 항체, 항-인터루킨-6 또는 항-인터루킨-6 수용체 항체 약물 컨주게이트, 또는 항-인터루킨-6 또는 항-인터루킨-6 수용체 이중특이적 T-세포 연관체이다.
본 발명의 구현예에서, Ab 131-DM1과 같은 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료 분자는, 항-인터루킨-8 치료 분자, 예컨대 항-인터루킨-8 항체, 항-인터루킨-8 수용체 항체, 예컨대, 항-인터루킨-8 또는 항-인터루킨-8 수용체 항체 약물 컨주게이트, 또는 항-인터루킨-8 또는 항-인터루킨-8 수용체 이중특이적 T-세포 연관체이다.
본 발명의 구현예에서, Ab 131-DM1과 같은 본 발명의 항-EGFRvⅢ 항체 약물 컨주게이트는 하나 이상의 항-EGFRvⅢ, 항-EGFR, 항-인터루킨-6, 항-인터루킨 6 수용체, 항-인터루킨-8 또는 항-인터류킨-8 수용체 치료적 분자가 포유동물에게 투여되기 전, 함께 또는 이후에 투여된다.
본 발명의 구현예에서, 상기 포유동물은 인간이다.
도 1은 267 아미노산 결실 및 G 치환을 나타내는 야생형 EGFR 및 EGFRvⅢ 사이의 정렬이다.
도 2는 EGFRvⅢ PEP3 14-머 펩타이드의 설계의 도표이다. 도 2a에, EGFR의 N-말단 서열과 동일한 아미노산 LEEKK (서열번호: 58) (1-5), 그 다음 독특한 글라이신 잔기, 그 다음 EGFR에서의 잔기 273 내지 280과 동일한 아미노산을 갖는 아미노산을 갖는, EGFRvⅢ의 N-말단 서열이 나타나 있다. 도 2b는 EGFRvⅢ (6-272)에서 결실된 EGFR의 아미노산을 나타낸다.
도 3a-l은 본 발명의 항체의 서열을 제공한다. 제공된 각 항체의 경우, 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 두 가지 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대해 제공된다. 따라서, 4개의 서열들이 열거된 모든 항체에 대해 제공된다.
도 4는 13.1.2 항체 중쇄 영역을 특정한 생식 계열 중쇄 영역과 비교한 표이다. "-"는 하이브리도마 중쇄 영역의 아미노산 잔기가 상기 특정한 위치에 대해 생식 계열과 동일하다는 것을 가리킨다. 생식계열로부터의 편차가 적절한 아미노산 잔기에 의해 표시되어 있다.
도 5는 13.1.2 항체 경쇄 영역을 특정한 생식 계열 경쇄 영역과 비교한 표이다. "-"는 하이브리도마 경쇄 영역의 아미노산 잔기가 상기 특정한 위치에 대해 생식 계열과 동일하다는 것을 가리킨다. 생식계열로부터의 편차가 적절한 아미노산 잔기에 의해 표시되어 있다.
도 6은 다양한 하이브리도마 유도된 항체 중쇄 영역을 특정한 생식 계열 중쇄 영역과 비교한 표이다. "-"는 하이브리도마 중쇄 영역의 아미노산 잔기가 상기 특정한 위치에 대해 생식 계열과 동일하다는 것을 가리킨다. 생식계열로부터의 편차가 적절한 아미노산 잔기에 의해 표시되어 있다.
도 7은 다양한 하이브리도마 유래의 항체 경쇄 영역을 특정한 생식 계열 경쇄 영역과 비교한 표이다. "-"는 하이브리도마 경쇄 영역의 아미노산 잔기가 상기 특정한 위치에 대해 생식 계열과 동일하다는 것을 가리킨다. 생식계열로부터의 편차가 적절한 아미노산 잔기에 의해 표시되어 있다.
도 8a는 Ab 131-DM1 컨주게이트의 구조를 도시한 도식이다. 도 8b는 Ab 131-DMI 컨주게이트의 항체 중쇄의 아미노산 서열을 제공하며, 가변 도메인은 음영처리되어 있고 첫 번째 아미노산으로부터 아미노산 123까지 진행되는 반면, 도 8c는 항체 중쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 도 8d는 Ab 131-DMI 컨주게이트의 항체 경쇄의 아미노산 서열을 제공하며, 가변 도메인은 음영처리되어 있고 첫 번째 아미노산으로부터 아미노산 113까지 진행되는 반면, 도 8e는 항체 경쇄를 인코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
도 9는 항-EGFRvⅢ 항체 131 (검정 파선), Ab 131-DM1 컨주게이트 (검정선), 항-EGFR 항체 (회색점 점선)의 결합 특이성을 도시한 그래프이다.
도 10은 독소 (DM1) 등가물 (좌측 패널) 또는 Ab 131-DM1 컨주게이트 등가물 (우측 패널)의 기함수로서 U251vⅢ 세포 성장 억제를 도시한 2개의 그래프이다.
도 11은 비히클, 5.3 mg/kg의 AB 131-DM1 컨주게이트, 17.8 mg/kg의 AB 131-DM1 컨주게이트, 또는 대조군 컨주게이트를 이용한 치료의 함수로서 D317 피하 이종이식편에서 검출된 포스포-히스톤 H3(+) 세포의 수 (수직 축)를 도시한 그래프이다.
도 12는 대조군 컨주게이트 또는 1.7 mg/kg, 5.6 mg/kg 또는 17 mg/kg의 Ab 131-DM1 컨주게이트의 1회량으로 처리된 U251vⅢ 이종이식편에서 시간의 함수로서의 종양 용적 (수직 축)을 도시한 그래프이다.
도 13은 비히클, 대조군 컨주게이트, 항-EGFRvⅢ 항체 131 또는 Ab 131-DM1 컨주게이트로 처리된 D317 피하 이종이식편에서 시간의 함수로서의 종양 용적 (수직 축)을 도시한 그래프이다.
도 14는 비히클, 대조군 컨주게이트 또는 7.3 mg/kg, 14.6 mg/kg 또는 22 mg/kg에서의 Ab 131-DM1 컨주게이트의 1회량으로 처리된 D317 피하 이종이식편에서 종양 용적 (수직 축)을 도시한 그래프이다.
바람직한 구현예의 상세한 설명
상기에서 논의된 바와 같이, EGFRvⅢ은 접합부에서 글리신의 단일 아미노산 치환으로 EGFr의 세포외 도메인 내의 267 아미노산이 결실된, EGFR의 결실 돌연변이체이다. 이들 특징은 도 1에서 야생형 EGFR 및 EGFRvⅢ 사이의 서열 정렬에 나타나 있다. 상기 결실의 접합부에서의 글리신의 아미노산 치환을 고려할 때, 야생형 EGFR에 존재하지 않고 EGFRvⅢ에 존재하는 신규 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 이론적으로 가능해졌다. 따라서, 도 2에 나타난 바와 같이, PEP3으로 불리는 면역화 및 스크리닝을 위한 펩타이드가 설계되었다 (Kuan 등 EGF mutant receptor vⅢ as a molecular target in cancer therapy. Endocr Relat Cancer. 8(2):83-96 (2001)). 상기 14-머 펩타이드는 EGFRvⅢ 및 야생형 EGFR에 공통된 5개의 n-말단 아미노산, 독특한 글리신 접합 부위, 및 야생형 EGFR (잔기 273-280에 해당함) 및 EGFRvⅢ (잔기 7-14에 해당함) 사이에 보전된 서열에 함유된 8개의 아미노산 잔기를 갖는다. 또한, EGFRvⅢ을 인코딩하는 유전자로 형질감염된 교모세포종 세포 및 세포들 (B300.19 세포)은 면역화 및 스크리닝을 위해 또한 이용되었다 (종종 B300.19/EGFRvⅢ 형질감염체로서 본원에 지칭됨).
EGFRvⅢ에 대한 인간 항체를 생성하기 위해, 형질전환 XenoMouse® 마우스가 교모세포종 세포/EGFRvⅢ, B300.19/EGFRvⅢ 세포, 및 야생형 EGFR과 비교하여 EGFRvⅢ에 있는 신규 세포외 도메인 내의 접합 영역에 대한 펩타이드 (PEP3)의 조합을 이용하여 면역화되었다. 면역화된 마우스로부터 B 세포가 분리되었고, 이는 하이브리도마를 생산한 다음 EGFRvⅢ에 결합하는 것을 스크리닝하는데 사용되거나 XenoMaxTM/SLAMTM 기술을 이용하여 EGFRvⅢ에 결합하는 것을 스크리닝하는데 직접 사용되었다 (Babcook 등 A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined specificities. Proc Natl Acad Sci U S A.93(15):7843-8 (1996), and U.S. Patent No. 5,627,052). EGFRvⅢ에 결합한 것으로 확인된 항체들을 EGFRvⅢ의 특이적 인식을 확인하는 일련의 분석으로 스크리닝하였다. 이 과정을 통해, EGFRvⅢ에 결합되고 EGFRvⅢ에 특이적인 인간 모노클론 항체 패널이 셩성되었고, 단리되었으며, 규명되었다. 차후의 에피토프 맵핑은 독특하지만 중복되는 특이성을 입증하였다. 모든 항체들을 대상으로 세포독성 약물을 세포에 전달하기 위해 세포에 의해 내재화되는 이들의 능력을 시험관내에서 추가로 평가하였다. 효율적인 약물 전달을 나타내는 항체들은 세포독성 약물과 직접 컨주게이트되었고, 시험관내 및 생체내에서 EGFRvⅢ을 발현하는 종양 세포를 사멸하는 이들의 능력을 조사하였다. 이들 연구는 종양이 특정 유전자 병변을 갖는 환자에서 암을 치료하기 위한 차세대 항체 약물 컨주게이트의 토대를 제공한다.
전술한 공정을 통해, 완전한 인간 항-EGFRvⅢ 항체 패널들이 생성되었다. 하이브리도마 접근법을 이용하여, PEP3과의 결합에 대해 ELISA 상에서 양성이었던 항체 13.1, 13.2, 13.3, 및 13.4를 포함하는 몇 개의 항체들이 야생형 EGFR과의 제한된 교차 반응성을 가지고 생성되었다. 이들 중에서, 항체 13.1 (및 특히 그 서브클론 13.1.2)을 추가 연구 및 개발을 위해 선택하였다. XenoMax 접근법을 이용하여, pep3 올리고뉴클레오타이드와 결합하는데 매우 특이적이었고 야생형 EGFR과 제한된 교차-반응성을 가지고 있던, 항체 131, 139, 250, 및 095를 포함하는 항체 패널이 생성되었다. 이들 중에서, 131 항체가 매우 흥미로운 특성을 갖는다. 각각의 항체에 대한 서열이 도 4-7 (서열번호: 1-33 및 141-144)에 나타나 있다. 다양한 항체의 서열 및 결합능이 비교되었고, 그 결과가 도 4-10에 나타나 있다. 도 9A-9L, 및 도 10A-10D에서 볼 수 있는 바와 같이, 항체 131, 139, 및 13.1.2는 ABX-EGF와 비교하여 EGFRvⅢ 발현 세포 (H1477)에 대해 모두 우수한 선택성을 나타내었다. 상기 결과 중 일부가 도 9M-9P에 그래프 형태로 나타나 있으며, 이는 적어도 두 가지 항체, 13.1.2 및 131이 단지 EGFRvⅢ 세포와 비교하여 EGFRvⅢ 발현 세포에 대해 우수한 특이성을 나타내었다는 것을 입증한다. 추가적으로, 현재의 구현예의 항체에 대한 몇 가지 가능한 유용성을 조사하였고, 그 결과가 도 11-16에 나타나 있다. 마지막으로, 예측된 구조 모델에 기초하여, 변경된 결합 특성을 갖는 항체를 수득하기 위해 항체의 변이체를 제조하였다.
또한, 본 발명의 항체들은 동일하거나 유사한 에피토프에 결합하는 다른 항체들을 스크리닝하는데 매우 유용하다. 본 발명의 항체들은 형성된 항원-항체 복합체의 특성에 대해 동일하거나 개선된 효과를 가질 것으로 예상되는 다른 항체들을 설명하기 위한 교차 경쟁 연구에 이용될 수 있다.
EGFRvⅢ에 대해 매우 높은 친화도를 가졌던 131 항체 및 13.1.2 각각은 세포에 의해 잘 내재화되었고, 독소에 컨주게이트되는 경우 세포 사멸에서 매우 효과적인 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 두 항체들은, XenoMouse 마우스의 상이한 면역화에서 생성되었고 상이한 기술을 이용함에도 불구하고, 매우 유사한 생식계열 유전자로부터 유래되었다. 하지만, 에피토프 맵핑 작업에 기초하여, 각 항체들은 EGFRvⅢ 분자 상에 약간 상이한 에피토프에 결합하고 결합에 필수적인 EGFRvⅢ 상에 약간 상이한 잔기를 갖는 것으로 보인다. 이들 결과는 생식계열 유전자 이용이 EGFRvⅢ를 표적화하는 항체 치료제의 생성하는데 중요하다는 것과, 작은 변화가 이들의 구조적 발견에 기초한 항체 및 다른 치료제의 추가 설계를 가능하게 하는 방식으로 항체의 결합 및 효과를 변형시킬 수 있다는 것을 보여준다.
13.1.2 및 131 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 이들과 결합하는 경쟁하는 항체들이 매우 바람직하다. 하기에서 더 상세히 논의된 바와 같이, SPOTs 어레이 상의 알라닌 스캐닝을 통해, 어떤 항체들의 결합을 위한 중요한 잔기가 설명되어 왔다. 따라서, 매우 중요한 결합 잔기를 공유하는 항체들이 또한 매우 바람직하다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어들은 본 기술분야에서 당해분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어들은 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어들은 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 및 단백질 및 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 이의 기술은 널리 공지되어 있고 본 기술분야에서 통상적으로 사용되고 있다. 표준 기술은 재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성, 및 조직 배양 및 형질전환 (예를 들면, 전기천공, 리포펙션)을 위해 사용된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조자의 설명서에 따라 또는 본 기술분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 수행된다. 전술한 기술 및 절차들은 일반적으로 본 기술분야에 널리 공지된 종래의 방법에 따라 그리고 본명세서 전반에 인용되고 논의된 다양한 일반적인 문헌 및 더 구체적인 문헌에 기술된 대로 일반적으로 수행된다. 예를 들면, 본원에 참고로 통합되어 있는 문헌[Sambrook 등 Molecular Cloning : A Laboratory Manual (제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)]을 참조한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의료 화학 및 약제학적 화학과 관련하여 사용된 명명법, 및 이의 실험실 절차 및 기술은 널리 공지되어 있고 본 기술분야에서 통상적으로 사용되고 있다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 조제, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 사용된다.
용어 "맥도날드 기준"은 문헌[Macdonald DR, Cascino TL, Schold SC Jr, Cairncross JG. Response criteria for phase IIstudies of supratentorial malignant glioma. J Clin Oncol. 1990;8:1277-1280]에 제시된 기준을 의미할 것이다.
용어 "RANO 기준"는 문헌[Wen PY, Macdonald DR, Reardon DA, and 등 Updated Response Assessment Criteria for High-Grade Gliomas: Response Assessment in Neuro-Oncology Working Group. J ClinOncol. 2010; 28: 1963-1972]에 제시된 기준을 의미할 것이다.
용어 "완전한 반응 (CR)"는 적어도 4주 떨어진 연속적인 MRI 이미지화 스캔 상에서 모든 증진 종양의 외관, 스테로이드를 끊고 신경학상으로 안정하거나 개선된 것을 의미할 것이다.
용어 "증진 병변"은 정확한 반복된 측정을 위해 크기 (최대 단면적을 갖는 병변) 및 적합성에 기초하여 선택된 병변을 의미할 것이다.
용어 "부분 반응 (PR)"는 적어도 4 주 떨어진 연속적인 MRI 스캔 상에서 증진 종양의 크기의 ≥50% 감소, 스테로이드 안정하거나 감소되고 신경학상으로 안정하거나 개선된 것을 의미할 것이다.
용어 "무진행 생존 (PFS)"는 Ab-131-DM1의 첫 투여 일자로부터 원인에 관계없이 질환 진행 (MRI 스캔 일자) 또는 사망의 방사선학적 증거 일자까지의 일자의 수로서 정의된다.
용어 "양성 반응"은 항-EGFRvⅢ 항체 컨주게이트의 첫 투여 전의 포유동물에서의 이들 파라미터와 비교하여 종양 크기 감소, 증가된 겉보기 확산 계수, 감소된 순환 종양 세포, 종양과 연관된 감소된 순환 엑솜을 의미할 것이다. 그것은 또한 맥도날드 또는 Rano 기준에 의해 측정된 바와 같이 무진행 생존, 완전한 반응, 및 부분적 반응을 의미한다. 그것은 또한 증가된 생존을 의미한다.
용어 BiTE 또는 이중특이적 T-세포 연관체는 상이한 항체들의 2개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는 융합 단백질을 의미하고 지칭할 것이며, 여기서 하나의 scFv는 CD3 수용체를 통해 T 세포에 결합하고 다른 scFv는 종양 세포 상에서 발현된 분자에 결합한다. 이중특이적 T-세포 억제제가 USSN 제735,2641호, 제7,820,166호, 제8,076,450호, 제8101,722호, 및 제8,236,308호에 기재되어 왔다.
용어 "겉보기 확산 계수"는 문헌[Chenevert, T. L. 등Diffudion Magnet Resonance Imaging: an Early Surrogate Marker of Therapeutic Efficacy in Brain Tumors.Journal of the National Cancer Institute, Vol. 92, No. 24, December 20, 2000]에 제시된 의미를 가질 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원, 또는 이의 일부 조합의 폴리뉴클레오타이드를 의미할 것이고, 그 기원에 의해 (1) "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 회합되지 않거나, 여기서 상기 "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 자연상에서 발견되며, (2) "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 자연상에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) "단리된 폴리뉴클레오타이드"는 더 큰 서열의 일부로서 자연상에서 발생하지 않는다.
본원에서 지칭된 용어 "단리된 단백질"는 cDNA, 재조합 RNA, 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합의 단백질을 의미하고, 그 기원, 또는 유래의 공급원에 의해, (1) "단리된 단백질"는 자연상에서 발견된 단백질과 회합되지 않거나, (2) "단리된 단백질"는 동일한 공급원 유래의 다른 단백질이 없거나, 예를 들면 쥣과 단백질이 없거나, (3) "단리된 단백질"는 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) "단리된 단백질"는 자연상에서 발생하지 않는다.
용어 "폴리펩타이드"는 폴리펩타이드 서열의 천연 단백질, 단편, 또는 유사체를 지칭하기 위해 일반 용어로서 본원에 사용된다. 그러므로, 천연 단백질, 단편, 및 유사체들은 폴리펩타이드 속의 종이다. 본 발명에 따른 바람직한 폴리펩타이드는 인간 중쇄 면역글로불린 분자 및 인간 카파 경쇄 면역글로불린 분자를 포함할 뿐만 아니라, 카파 경쇄 면역글로불린 분자 또는 람다 경쇄 면역글로불린 분자와 같은, 경쇄 면역글로불린 분자를 갖는 경쇄 면역글로불린 분자를 갖는 중쇄 면역글로불린 분자를 포함하는 조합에 의해 형성된 항체 분자, 및 그 반대, 뿐만 아니라 이의 단편 및 유사체를 포함한다
대상에게 적용될 때 본원에서 사용되는 용어 "자연 발생"는 대상이 자연상에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들면, 자연상의 공급원으로부터 분리될 수 있는 유기체 (바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 실험실 등에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 자연 발생이다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 성분들의 위치가 이들이 그들의 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하는 관계에 있다는 것을 지칭한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 대조군 서열과 양립할 수 있는 코딩 서열의 발현이 달성될 수 있는 방식으로 결찰된다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "제어 서열"은 이들이 결찰되는 코딩 서열의 발현 및 가공에 영향을 미치는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 그러한 대조군 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라 다르며; 원핵생물에서, 그러한 제어 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종료 서열을 포함하고; 진핵생물에서, 일반적으로, 그러한 제어 서열은 프로모터 및 전사 종료 서열을 포함한다. 용어 "제어 서열"은 발현 및 가공을 위해 필수적으로 존재하는 모든 성분들을 최소한 포함하는 것으로 의도되고, 또한 그 존재가 이로운 추가 성분, 예를 들면, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에 지칭된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 적어도 10개의 염기 길이의 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드의 폴리머 형태 또는 하나의 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태를 의미한다 상기 용어는 DNA의 단일 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본원에서 언급된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 자연 발생 뉴클레오타이드, 및 자연 발생, 및 비-자연 발생 올리고뉴클레오타이드 연결에 의해 함께 연결된 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 200개 염기 이하의 길이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서브셋이다. 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드는 10 내지 60개 염기 길이 및 가장 바람직하게는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 내지 40개 염기 길이이다. 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들면 유전자 돌연변이체를 제작하는데 사용하기 위해 이중 가닥일 수 있지만, 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 프로브의 경우 일반적으로 단일 가닥이다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 중 하나일 수 있다.
본원에서 언급된 바와 같이, 용어 "자연 발생 뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에서 언급된 바와 같이, 용어 "변형된 뉴클레오타이드"는, 변형된 또는 치환된 당 그룹 등을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에 언급된 용어 "올리고뉴클레오타이드 연결"는, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오타이드 연결을 포함한다. 예를 들면, 그 개시내용이 참조로 본원에 통합되어 있는, 문헌[LaPlanche 등 Nucl . Acids Res . 14:9081 (1986); Stec 등 J. Am . Chem . Soc . 106:6077 (1984); Stein 등 Nucl . Acids Res . 16:3209 (1988); Zon 등 Anti - Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon 등 Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec 등 U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)]을 참조한다. 올리고뉴클레오타이드는, 원하는 경우, 검출용 표지(label)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 언급된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 상이하지만, 단백질의 활성이 해롭게 변경되지 않은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 또는 분자이다. 에피토프의 변이체가 존재할 수 있다. 항체의 변이체가 존재할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 에피토프에 결합하는 단백질 변이체의 능력은 해롭게 변경되지 않는다. 일 구현예에서, 단백질 변이체는 야생형 mAb의 능력의 10-500%로 결합할 수 있다. 예를 들면, 단백질 변이체는 야생형 mAb의 능력의 10%, 50%, 110%, 500%, 또는 500% 초과로 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 10-500% 사이의 결합 능력의 범위가 포함된다. 결합 능력은 에피토프에 대한 변이체의 ka, kd, 또는 KD를 비제한적으로 포함하는 많은 방식으로 반영될 수 있다. 하나의 바람직한 구현예에서, 에피토프는 본 명세서에서 기재된 것이다.
일 구현예에서, 변이체 항체는 5개의 아미노산 또는 그 미만의 치환, 결실 또는 부가에 의해 야생형 서열과 상이할 수 있다. 그러한 변이체는 상기 개시된 폴리펩타이드 서열 중 하나를 변형시키고, 예를 들면, 본원에 기재된 대표적인 절차를 이용하여 상기 변형된 폴리펩타이드의 결합 특성을 평가함으로써 일반적으로 확인될 수 있다. 또 하나의 구현예에서, 폴리펩타이드 변이체는 상기 확인된 폴리펩타이드에 대해 바람직하게는 적어도 약 70%, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다. 바람직하게는, 변이체는 보존적 치환 및/또는 변형에서만 상이하다. 변이체 단백질은 본 명세서에 기재된 단백질 구조에 구조적으로 유사한 것 및 기능적으로 동등한 것을 포함한다. 또 하나의 구현예에서, 변이체의 파라토프가 명세서에 기재된 파라토프와 유사한 한, 만약 그것이 본 명세서에 기재된 단백질과 기능적으로 동등하다면, 상기 단백질은 변이체이다. 일 구현예에서, 도 17에 기재된 파라토프와 유사한 형상을 갖는 임의의 물질은 변이체이다. 일 구현예에서, 도 18에 기재된 파라토프와 유사한 형상을 갖는 임의의 물질은 변이체이다. 일 구현예에서, 도 19A 및 19B에 기재된 상호작용 표면과 유사한 형상을 갖는 임의의 물질은 변이체이다.
일 구현예에서, 만약 핵산 서열이 엄격한 조건 하에서 야생형 서열에 선택적으로 혼성화될 수 있는 경우, 항체는 변이체이다. 일 구현예에서, 적합한 보통의 엄격한 조건은 5xSSC; 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8:0)의 용액에서 미리 세척하는 것; 밤새 50℃-65℃, 5xSSC에서 혼성화하거나, 교차-종 상동성의 경우, 0.5xSSC로 45℃에서 혼성화하는 것; 그 다음 0.1% SDS를 함유하는 2x, 0.5x 및 0.2xSSC의 각각으로 65℃에서 20분간 2회 세척하는 것을 포함한다. 상기 혼성화 DNA 서열들 역시 코드 축퇴성으로 인해 혼성화 DNA 서열에 의해 인코딩된 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 마찬가지로, 본 발명의 범위에 속한다. 본원에 언급된 용어 "선택적으로 혼성화하다"는 검출가능하게 그리고 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 이의 단편은 비특이적 핵산에 대한 검출가능한 결합의 상당한 양을 최소화하는 혼성화 및 세척 조건 하에서 핵산 가닥에 선택적으로 혼성화한다. 높은 엄격성 조건들이 본 기술분야에서 공지되고 본원에서 논의된 바와 같이 선택적 혼성화 조건을 달성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 및 단편 및 관심있는 핵산 서열 사이의 핵산 서열 상동성은 적어도 80%, 및 더욱 전형적으로는 적어도 85%, 90%, 95%, 99%, 및 100%의 바람직하게 증가하는 상동성을 갖는다. 두 아미노산 서열은, 만약 그들 서열 사이에 부분적인 또는 완전한 동일성이 존재하는 경우 상동성이다. 예를 들면, 85% 상동성은 두 서열이 최대 매칭을 위해 정렬될 때 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미한다. 갭 (매치될 두 서열 중 어느 하나에서)이 매칭을 최대화할 때 허용되고, 5 이하의 갭 길이가 바람직하고 2 이하가 더욱 바람직하다. 대안적으로 그리고 바람직하게는, 두 단백질 서열 (또는 적어도 30개 아미노산 길이의 이들로부터 유도된 폴리펩타이드 서열)은, 이들이 돌연변이 데이타 매트릭스 및 6 이상의 갭 패널티를 갖는 프로그램 ALIGN을 이용하여 5가 넘는 정렬 스코어를 갖는 경우, 이 용어가 본원에서 사용된 바와 같이, 상동성이다. 문헌[Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 to this volume, pp. 1-10]을 참조한다. 두 서열 또는 이의 일부는 만약 그의 아미노산이 ALIGN 프로그램을 이용하여 최적으로 정렬될 때 50% 이상 동일한 경우, 더 바람직하게는 상동성이다. 용어 "대응되다"는 폴리뉴클레오타이드 서열이 참조 폴리뉴클레오타이드 서열의 모두 또는 일부에 상동성 (즉, 동일하나, 엄격히 진화적으로 관련되지 않음)이라는 것을 의미하거나, 폴리펩타이드 서열이 참조 폴리펩타이드 서열과 동일하다는 것을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 대조적으로, 용어 "상보적인"는 상보적 서열이 참조 폴리뉴클레오타이드 서열의 모두 또는 일부에 상동성이라는 것을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 "TATAC"는 참조 서열 "TATAC"에 대응되고 참조 서열 "GTATA"에 상보적이다.
하기 용어들은 2 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 서열 관련성을 기술하기 위해 사용된다: "참조 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율", 및 "실질적인 동일성". "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기초로서 사용되는 정의된 서열이고; 참조 서열은, 예를 들면, 서열 목록으로 제시된 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 세그먼트로서 더 큰 서열의 서브셋일 수 있거나 완전한 cDNA 또는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 참조 서열은 적어도 18개 뉴클레오타이드 또는 6개 아미노산 길이, 빈번하게 적어도 24개 뉴클레오타이드 또는 8개 아미노산 길이, 및 종종 적어도 48개 뉴클레오타이드 또는 16개 아미노산 길이이다. 두 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 각각은 (1) 두 분자 사이에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 일부)을 포함할 수 있고, (2) 두 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이에서 분기하는 서열을 추가로 포함할 수 있으므로, 두 (또는 그 이상) 분자 간의 서열 비교는 "비교 윈도우"에 대해 두 분자의 서열들을 비교하여 서열 유사성의 로컬 영역을 확인하고 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비교 윈도우"는 적어도 18개 인접 뉴클레오타이드 위치 또는 6개 아미노산의 개념상 세그먼트를 지칭하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 적어도 18개 인접 뉴클레오타이드 또는 6개 아미노산 서열의 참조 서열과 비교될 수 있고 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)고 비교하여 20 퍼센트 이하의 부가, 결실, 치환, 등 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열들의 최적 정렬은 문헌[Smith and Waterman Adv . Appl . Math . 2:482 (1981)]의 로컬 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch J. Mol . Biol. 48:443 (1970), by the search for similarity method of Pearson and Lipman Proc . Natl . Acad . Sci . (U.S.A.) 85:2444 (1988)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 이들 알고리즘들의 컴퓨터를 이용한 구현에 의해 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, or MacVector software packages), 또는 점검에 의해 수행될 수 있고, 다양한 방법들에 의해 생성된 최상 정렬 (즉, 비교 윈도우에 대한 가장 높은 백분율의 상동성을 야기하는 정렬)이 선택된다.
용어 "서열 동일성"은 두 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 비교 윈도우에 대해 동일하다 (즉, 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 잔기-대-잔기 기초로)는 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성의 백분율"는 비교 윈도우에 대해 두 개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하고, 매치된 위치의 수를 얻기 위해, 동일한 핵산 염기 (예를 들면, A, T, C, G, U, 또는 I) 또는 잔기가 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 낳는 결정하고, 매치된 위치의 수를 비교 원도우 (즉, 윈도우 크기)에서의 위치의 총 수로 나누고, 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 생성함으로써 계산된다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어들 "실질적인 동일성"은, 적어도 18개 뉴클레오타이드 (6개 아미노산) 위치의 비교 윈도우에 대해, 빈번하게 적어도 24-48개 뉴클레오타이드 (8-16개 아미노산) 위치의 윈도우에 대해 참조 서열과 비교하여, 적어도 85 퍼센트 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 내지 95 퍼센트 서열 동일성, 보다 일반적으로 적어도 99 퍼센트 서열 동일성을 갖고, 상기 서열 동일성의 백분율은 참조 서열을 비교 윈도우에 대해 참조 서열의 20 퍼센트 이하인 결실 또는 부가를 포함할 수 있는 서열에 비교함으로써 계산된다 참조 서열은 더 큰 서열의 서브셋일 수 있다. 야생형 단백질 또는 핵산에 실질적인 동일성을 갖는 아미노산 또는 핵산들이 야생형 단백질 또는 핵산의 변이체의 예이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 20개의 종래의 아미노산 및 그의 약어는 종래의 용법을 따른다. 본원에 참고로 통합되어 있는, 문헌[Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))]을 참조한다. 20개의 종래의 아미노산의 입체이성질체 (예를 들면, D-아미노산), 비천연 아미노산, 예컨대 α-, α-2치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산, 및 다른 통상적이지 않은 아미노산이 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 위한 적합한 성분일 수 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예는 하기를 포함한다: 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산 (예를 들면, 4-하이드록시프롤린)을 포함한다. 본원에 사용된 폴리펩타이드 표기법에서, 표준 용법 및 관습에 따라, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고 우측 방향은 카복시-말단 방향이다.
유사하게, 달리 명시되지 않으면, 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고, 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로서 지칭된다. 초기 RNA 전사체의 5' 내지 3' 부가의 방향은 전사 방향으로서 지칭되고; RNA로서 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 5' 말단에 대해 5'인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "상류 서열"로서 지칭되며; RNA로서 동일한 서열을 갖고 RNA 전사체의 3' 말단에 대해 3'인 DNA 가닥 상의 서열 영역은 "하류 서열"로서 지칭된다.
폴리펩타이드에 적용된 바와 같이, 용어 "실질적인 동일성"은, 두 펩타이드 서열들이, 디폴트 갭 중량을 이용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이, 최적으로 정렬될 때, 적어도 80 퍼센트 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 90 퍼센트 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 95 퍼센트 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 99 퍼센트 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치들은 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 상호교환성을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아마이드-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산의 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은 하기와 같다: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산, 및 아스파라긴-글루타민이다. 실질적인 동일성을 갖는 폴리펩타이드들이 변이체일 수 있다.
변이체 단백질은 또한 미미한 변화를 갖는 단백질을 포함한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열 내의 미미한 변화는, 아미노산 서열 내의 상기 변화가 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 및 가장 바람직하게는 99%를 유지하는 경우, 본 발명에 의해 포함되는 것으로 고려된다. 특히, 보존적 아미노산 교체가 고려된다.
보존적 교체는 그의 측쇄에서 관련된 아미노산들의 패밀리 내에서 발생하는 것이다. 유전적으로 인코딩된 아미노산은 일반적으로 하기 패밀리로 분류된다: (1) 산성=아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성=라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성=알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 무전하 극성=글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 더욱 바람직한 패밀리는 하기와 같다: 세린 및 트레오닌은 지방족-하이드록시 패밀리이고; 아스파라긴 및 글루타민은 아마이드-함유 패밀리이며; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신은 지방족 패밀리이고; 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 방향족 패밀리이다. 예를 들면, 이소류신 또는 발린을 이용한 류신의 단리된 교체, 글루타메이트를 이용한 아스파르테이트의 단리된 교체, 세린을 이용한 트레오닌의 단리된 교체, 또는 구조적으로 관련된 아미노산을 이용한 아미노산의 유사한 교체가, 특히 상기 교체가 뼈대 부위 내에 아미노산을 포함하지 않는 경우, 생성되는 분자의 결합 또는 특성에 큰 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 펩타이드를 초래하는지 여부는 폴리펩타이드 유도체의 비활성을 분석함으로써 쉽게 결정될 수 있다. 분석이 본원에 상세히 기재되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체는 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에 존재한다. 구조 및 기능적인 도메인은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 데이타를 공공 또는 전매 서열 데이터베이스에 비교하여 확인될 수 있다. 바람직하게는, 컴퓨터를 이용한 비교 방법이 공지된 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 존재하는 서열 모티프 또는 예상된 단백질 형태 도메인을 확인하는데 사용된다. 공지된 3차원 구조 내로 폴딩되는 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다. Bowie 등 Science 253:164 (1991). 따라서, 전술한 예들은 본 기술분야의 숙련자가 본원에 기재된 항체에 따른 구조적 및 기능적 도메인을 정의하는데 사용될 수 있는 서열 모티프 및 구조 형태를 인식할 수 있음을 입증한다.
바람직한 아미노산 치환은: (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체를 형성하기 위해 결합 친화도를 변경하고, (4) 결합 친화도를 변경하고, (4) 그와 같은 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적인 특성을 부여하거나 변형시키는 것이다. 유사체는 자연 발생 펩타이드 서열 이외의 서열의 다양한 돌연변이단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 또는 다중 아미노산 치환 (바람직하게는 보존적 아미노산 치환)이 자연 발생 서열에서 (바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩타이드의 일부에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다 (예를 들면, 교체 아미노산은 모 서열에 존재하는 나선을 파괴하거나, 모 서열의 특징인 2차 구조의 다른 유형을 붕괴시키는 경향이 없어야 한다). 그 분야에서 인식된 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조의 예가 본원에 참고로 통합되어 있는 문헌[Proteins , Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton et at. Nature 354:105 (1991)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드 단편"은 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실을 갖는 폴리펩타이드를 지칭하지만, 여기서 남아있는 아미노산 서열은, 예를 들면, 전장 cDNA 서열로부터 추론된 자연 발생 서열에서 대응되는 위치와 동일하다. 단편들은 전형적으로 적어도 5, 6, 8 또는 10개 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 14개 아미노산 길이, 더 바람직하게는 적어도 20개 아미노산 길이, 보통 적어도 50개 아미노산 길이, 및 더욱 더 바람직하게는 적어도 70개 아미노산 길이이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유사체"는 추론된 아미노산 서열의 일부와 실질적인 동일성을 갖는 적어도 25개 아미노산의 세그먼트로 이루어진 폴리펩타이드를 지칭한다. 유사체는 전형적으로 적어도 20개 아미노산 길이, 바람직하게는 적어도 50개 아미노산 길이 또는 그 이상이고, 종종 전장 자연 발생 폴리펩타이드만큼 길 수 있다. 두 단편 및 유사체는 변이체의 형태이다.
펩타이드 유사체는 주형 펩타이드의 것과 유사한 특성을 갖는 비-펩타이드 약물로서 약제학적 산업에서 일반적으로 사용된다. 이들 유형의 비-펩타이드 화합물들은 "펩타이드 모방체(peptide mimetics)" 또는 "펩타이드모사체(peptidomimetics)"로 불린다. 본원에 참고로 통합되어 있는 문헌[Fauchere, J. Adv. Drug Res . 15:29 (1986); Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans 등 J. Med . Chem . 30:1229 (1987)]을 참조한다. 그러한 화합물들은 종종 컴퓨터를 이용한 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩타이드에 구조적으로 유사한 펩타이드 모방체가 동등한 치료적 또는 예방적 효과를 낳기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 펩타이드모사체는 패러다임 폴리펩타이드 (즉, 생화학적 특성 또는 약리적 활성을 갖는 폴리펩타이드), 예컨대 인간 항체에 구조적으로 유사하지만, 본 기술분야에 잘 알려진 방법에 의해, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 연결에 의해 임의로 대체된 하나 이상의 펩타이드 연결을 갖는다: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH--(시스 및 트랜스), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, 및 -CH2SO--. 공통 서열 중 하나 이상의 아미노산의 동일한 유형의 D-아미노산으로의 체계적인 치환 (예를 들면, L-라이신 대신에 D-라이신)이 보다 안정한 펩타이드를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변화를 포함하는 제약된 펩타이드가 본 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들면, 펩타이드를 고리화하는 분자내 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가함으로써, 생성될 수 있다 (참고로 본원에 통합된, Rizo and Gierasch Ann . Rev . Biochem . 61:387 (1992)). 펩타이드 모방체 및 펩타이드모사체 둘 모두는 변이체의 형태이다.
"항체" 또는 "항체 펩타이드(들)"은 온전한 항체, 또는 특이적 결합에 대해 온전한 항체와 결합하는 이의 결합 단편을 지칭한다. 결합 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산된다. 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 및 단일-사슬 항체를 포함한다. "이중특이적" 또는 "이작용기" 항체 이외의 항체는 그 결합 부위들 각각이 동일한 것으로 이해된다. 과잉의 항체가 반수용체에 결합된 수용체의 양을 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80%, 및 보다 일반적으로 약 85%보다 크게 감소시키는 경우 (시험관내 경쟁적 결합 분석에서 측정된 바와 같음), 항체는 반수용체에 대한 수용체의 부착을 실질적으로 억제한다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있거나 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정부위를 포함한다. 에피토프 결정부위는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹들로 구성되며 일반적으로 특이적 3차원 구조 특징들, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 에피토프는 "선형"거나 "입체형태"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자 (예컨대 항체) 간의 상호작용의 모든 지점들은 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 존재한다. 입체형태 에피토프에서, 상호작용의 지점들은 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기들을 가로질러 존재한다. 항체는 해리 상수가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤ 100 nM 및 더 바람직하게는 ≤ 10 nM, 및 더욱 더 바람직하게는 ≤ 1nM일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 여겨진다. 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들면, 본 발명에 기재된 기술을 이용하여 상기 에피토프에 대한 항체를 생성하는 것이 가능하다. 대안적으로, 발견 공정 동안, 항체의 생성 및 규명화가 바람직한 에피토프에 관한 정보를 설명할 수 있다. 이 정보로부터, 이후에 동일한 에피토프에 결합하기 위한 항체를 경쟁적으로 스크리닝하는 것이 가능하다. 이를 달성하는 접근법은 서로 경쟁적으로 결합하는 항체들, 예를 들면, 항원에 결합하는 것을 경쟁하는 항체들을 확인하는 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다. 그의 교차-경쟁에 기초하여 "바이닝(binning)" 항체를 위한 고효율 공정이 국제 특허 출원 제WO 03/48731호에 기재되어 있다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 실제로 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 것은 에피토프일 수 있다. 에피토프는 항체가 결합하는 상기 잔기들을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 에피토프는 EGFRvⅢ 에피토프이다. 일 구현예에서, 에피토프는 서열 LEEKKGNYVVTD (서열번호: 59)를 포함한다. 일 구현예에서, 에피토프는 서열 EEKKGNYVVT (서열번호: 57)를 포함한다. 일 구현예에서, 에피토프는 서열 EKNY (서열번호: 60)를 포함한다. 일 구현예에서, 에피토프는 서열 EEKGN (서열번호: 61)을 포함한다. 당해분야의 숙련가는 이들이 단일 펩타이드 상에서 이 순서로 실제 조립될 필요가 없고, 오히려 이들은 파라토프와 상호작용하는 에피토프를 형성하는 잔기들이라는 것을 인식할 것이다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 분자의 형상을 창출하는 잔기 또는 측쇄에 의해 점거된 공간은 에피토프가 무엇인지를 결정하는 것을 도움을 준다. 마찬가지로, 에피토프와 연관된 임의의 작용기, 반데르발스 상호작용, 측쇄의 이동도 정도, 등은 모두 에피토프 실제로 무엇인지를 결정할 수 있다. 따라서 에피토프는 또한 에너지 상호작용을 포함할 수 있다.
용어 "파라토프"는 에피토프에 결합하는 것을 결정하는 결합 영역의 일반적인 구조를 기술하는 것을의미한다. 이 구조는 결합 영역이 에피토프에 결합할 수 있는지 여부 및 방식에 영향을 미친다. 파라토프는 항원 결정부위에 결합하기 위해, 항체 또는 이의 단편을 담당하는 항체의 항원성 부위를 지칭할 수 있다. 파라토프는 또한 항체의 아이디오토프, 및 에피토프에 결합하는 상보적 결정 영역 (CDR) 영역을 지칭한다. 일 구현예에서, 파라토프는 도 17에서 L1 10, L2 30, L3 50, H1 20, H2 40, 및 H3 60인 항체의 영역이다. 일 구현예에서, 파라토프는 L1, L2, L3, H1, H2, 및 H3에 대한 실시예 16에서의 CDR 서열을 포함하는 항체의 영역이다. 일 구현예에서, 파라토프는 도 18에서 L1 110, L2 130, L3 150, H1 120, H2 140, 및 H3 160인 항체의 영역이다. 일 구현예에서, 파라토프는 L1, L2, L3, H1, H2, 및 H3에 대한 실시예 18에서의 CDR 서열을 포함하는 항체의 영역이다. 일 구현예에서, 파라토프는 실시예 18에서 열거된 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 파라토프는 도 19A 및 도 19B에 나타난 바와 같이, 에피토프와 상호작용하는 잔기를 포함한다. 단일 흑색 구조는 펩타이드 구조이다. 일 구현예에서, 파라토프는 13.1.2 mAb의 잔기 Tyr172Arg를 포함한다. 일 구현예에서, 13.1.2 mAb의 파라토프는 Tyr 172Arg, Arg101Glu, Leu99Asn, Leu99His, Arg101Asp, Leu217Gln, Leu99Thr, Leu217Asn, Arg101Gln, 및 Asn35Gly로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 잔기를 포함한다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 임의의 항체, 또는 그의 변이체의 파라토프는, 본원에 제시된 방식으로 결정될 수 있다. 잔기는, 이들이 결합 에너지의 10%에 기여하는 것으로 예상되면 "중요한" 것으로 간주된다. 일 구현예에서, 잔기는 이들이 결합 에너지의 2%에 기여하는 것으로 예상되면 "중요한" 것으로 간주된다. 일 구현예에서, 잔기는 이들이 결합 에너지의 50%에 기여하는 것으로 예상되면 "중요한" 것으로 간주된다. 일 구현예에서, 잔기는 이들이 에피토프의 표면, 또는 파라토프의 표면과 상호작용하는 것으로 예상되면 "중요한" 것으로 간주된다. 일 구현예에서, 잔기는, 잔기를 변화시키는 것이 결합 손실을 초래하지 않으면 "중요한" 것으로 간주된다.
용어들 "특이적으로" 또는 "우선적으로" 결합하는, 또는 유사한 어구는 항체가 상기 에피토프에 배타적으로 결합한다는 것을 가리키는 것을 의미하지는 않는다. 오히려, 항체가 항체가 노출된 적어도 하나의 다른 물질에 결합하는 것보다 더 높은 정도로, 항체, 또는 그의 변이체가 상기 에피토프에 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 특이적으로 결합하는 항체는 그것이 EGFR 단백질에 결합할 것보다 더 큰 친화도로 (보다 단단히, 또는 더 낮은 KD) EGFRvⅢ 단백질에 결합할 것이다. 예를 들면, 특이적으로 결합하는 항체는 1, 1-2, 2-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-50, 50-70, 70-90, 90-120, 120-150, 150-200, 200-300, 300-500, 500-1000 퍼센트 또는 이상까지 적어도 최소한 증가에 의해 더욱 단단히 결합할 것이다.
아미노산의 약어, 수, 아미노산, 예를 들면, Leu217Gln은 첫번째 아미노산으로부터 두번째 아미노산까지, 번호가 매겨진 아미노산에서의 돌연변이를 가리킨다. 따라서, Tyr172Arg는 야생형 단백질이 위치 172에서 티로신을 갖는 반면, 돌연변이체가 위치 172에서 아르기닌을 갖는다는 것을 의미할 것이다.
용어 "제제"는 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대분자, 또는 생물학적 물질로부터 만들어진 추출물을 가리키기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용될 때 "포유동물"은 포유동물로 간주되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
효소 파파인을 이용한 항체의 절단은, 항원-결합 활성을 갖지 않지만 결정화하는 능력을 갖는, "Fab" 단편, 및 "Fc" 단편으로서도 알려진, 2개의 동일한 항원-결합 단편을 야기한다. 효소 펩신을 이용한 항체의 절단은, F(ab')2 단편을 야기하고 여기서 항체 분자의 2개의 팔은 연결된 채로 있고 2-항원 결합 부위를 포함한다. F(ab')2 단편은 항원을 교차결합하는 능력을 갖는다.
본원에서 사용될 때 "Fv"는 항원-인지 및 항원-결합 부위 모두를 보유하는 항체의 최소 단편을 지칭한다. 이들 단편은 또한 항체의 변이체로 간주될 수 있다.
본원에서 사용될 때 "Fab"는 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 지칭한다.
용어 "mAb"는 모노클론 항체를 지칭한다.
항체 서열을 생성한 XenoMax 방법의 설명이 하기와 같이 부호로 처리된다: "AB"-항체를 지칭함, "EGFRvⅢ"- 항체의 결합 특이성을 지칭함, "X"-XenoMouse 마우스 유도된 것을 지칭함, "G1"-IgG1 아이소타입을 지칭함 또는 "G2"- IgG2 아이소타입을 지칭함, 마지막 3개의 숫자는 항체가 유도된 단일 세포수를 지칭함, 예를 들면: AB- EGFRvⅢ -XG1-095는 IgG1 아이소타입 및 세포 수 95의 XenoMouse 마우스로부터의 EGFRvⅢ에 결합 특이성을 갖는 항체일 것이다.
용어 "SC"는 단일 세포를 지칭하고 특정한 XenoMax 방법 유도 항체는 SC 다음으로 3개의 숫자, 또는 단지 3개의 숫자로서 지칭될 수 있고, 이는 항체가 본원에서 유도된 단일 세포수를 지칭한다.
하이브리도마 유도된 항체 서열의 설명은 하기와 같이 부호로 처리된다: "AB"- 항체를 지칭함, "EGFRvⅢ" 항체의 결합 특이성을 지칭함, "X"는 XenoMouse 마우스 유도된 것을 지칭함, "G1"- IgG1 아이소타입을 지칭함 또는 "G2"는 IgG2 아이소타입을 지칭함, "K"는 카파를 지칭함, "L"는 람다를 지칭함. 마지막 3개의 숫자는 항체가 유도된 클론을 지칭하고, 예를 들면: AB-EGFRvⅢ-XG1K-13.1.2와 같다.
본원에서 사용된 바와 같이 "표지" 또는 "표지된"은 폴리펩타이드에 검출가능한 모이어티, 예를 들면, 방사선 표지, 형광 표지, 효소 표지 화학발광 표지 된 또는 바이오티닐 그룹의 부가를 지칭한다. 방사선동위원소 또는 방사선핵종은 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I를 포함할 수 있고, 형광 표지 은 로다민, 란타나이드 포스포르 또는 FITC를 포함할 수 있으며 효소 표지 은 홀스래디쉬 페록시다아제, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, 알칼리 포스파타제를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "약제학적 제제 또는 약물"은 환자에게 적절히 투여되는 경우 원하는 치료적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 본원에서 다른 화학 용어들은 문헌[The McGraw - Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)), (참고로 본원에 통합됨)]에서 예시된 바와 같이, 본 기술분야에서의 종래의 용법에 따라 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"는 대상체 종이 존재하는 두드러진 종이라는 것을 의미하고 (즉, 몰 기준으로, 그것이 조성물 내의 임의의 다른 개별적인 종보다 더 풍부함), 및 바람직하게는 실질적으로 정제된 분획이 상기 대상체 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50 퍼센트(몰 기준으로)를 포함하는 조성물이라는 것을 의미한다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물 내에 존재하는 모든 거대분자 종의 약 80퍼센트를 초과, 더 바람직하게는 약 85%, 90%, 95%, 99%, 및 99.9%를 초과하여 포함할 것이다. 가장 바람직하게는, 대상체 종은 필수적인 동질성 (오염물질 종이 종래의 검출 방법에 의해 조성물 내에서 검출될 수 없음)까지 정제되고, 여기서 상기 조성물은 단일 거대분자 종으로 본질적으로 이루어진다.
용어 "환자"는 인간 및 수의적 대상체를 포함한다.
용어 "SLAM® 기술"는 "선택된 림프구 항체 방법"를 지칭한다 (Babcook 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA , i93:7843-7848 (1996), and Schrader, 미국 특허 제5,627,052호, 이 둘 모두는 그의 전체가 참조로써 통합되어 있음).
용어 "XenoMaxTM"는 XenoMouse® 마우스 (하기 기재된 바와 같음)를 이용한 SLAM 기술의 사용을 지칭한다.
항체 구조
기본적인 항체 구조 단위는 테트라머를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 테트라머는 두 개의 동일한 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인지를 담당하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카복시-말단 부분은 주로 효과 또는 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로서 분류되고, IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE 각각으로서 항체의 아이소타입을 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에, 가변 및 불변 영역은 약 12 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 제2판 Raven Press, N.Y. (1989)) (전체가 모든 목적을 위해 참조로써 통합됨)]을 참조한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다.
따라서, 온전한 항체는 두 개의 결합 부위를 갖는다. 이작용기 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 상기 두 결합 부위는 동일하다.
사슬 모두는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 뼈대 영역 (FR), 또한 소위 상보성 결정 영역 또는 CDR의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 뼈대 영역에 의해 정렬되고, 이는 특이적 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 한다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 배정은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), or Chothia & Lesk J. Mol . Biol . 196:901-917 (1987); Chothia 등 Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.
이중특이적 또는 이작용기 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 두개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함하는 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Songsivilai & Lachmann Clin . Exp . Immunol . 79: 315-321 (1990), Kostelny 등 J. Immunol . 148:1547-1553 (1992)]을 참고한다. 이중특이적 항체의 생산은 종래의 항체의 생산과 비교하여 상대적으로 노동 집중적인 공정일 수 있으며 수율 및 순도의 정도는 이중특이적 항체의 경우 일반적으로 더 낮다. 이중특이적 항체는 단일 결합 부위를 갖는 단편 (예를 들면, Fab, Fab', 및 Fv)의 형태로 존재하지 않는다.
항체의 일반적인 구조 측면 외에, 파라토프 및 에피토프 사이의 보다 특이적 상호작용은 구조 접근법을 통해 조사될 수 있다. 일 구현예에서, CDR의 구조는 항체가 에피토프에 결합할 수 있는 파라토프를 통해, 파라토프를 형성한다. 그와 같은 파라토프의 구조는 수많은 방법으로 결정될 수 있다. 전통적 구조 시험 접근법, 예컨대 NMR 또는 x-선 결정학이 사용될 수 있다. 이들 접근법은 파라토프 단독의 구조를 결정할 수 있거나, 또는 반면에 그것이 에피토프에 결합된다. 대안적으로, 분자 모델은 인실리코에서 생성될 수 있다. 구조는 상업적 패키지, 예컨대 Accelrys (San Diego, CA)로부터의 InsightII 모델링 패키지의 지원을 받아, 상동성 모델링을 통해 생성될 수 있다. 요약하면, 공지된 구조의 단백질의 데이타베이스, 예컨대 단백질 데이타 은행에 대해 검색하기 위해 조사될 항체의 서열을 사용할 수 있다. 공지된 구조를 갖는 상동성 단백질을 확인한 이후에, 이들 상동성 단백질이 모델링 주형으로서 사용된다. 가능한 주형 각각은 정렬될 수 있으며, 따라서 상기 주형 사이의 서열 정렬에 기초하여 구조를 생성한다. 공지되지 않은 구조를 갖는 항체의 서열은 이후 이들 템플레이트와 함께 정렬되어 공지되지 않은 구조를 갖는 항체를 위한 분자 모델을 생성할 수 있다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 그러한 구조를 인실리코에서 생성하기 위한 많은 대안적인 방법이 존재하며, 이들 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Hardman 등, issued U.S. Pat. No. 5,958,708 employing QUANTA (Polygen Corp., Waltham, Mass.) and CHARM (Brooks, B. R., Bruccoleri, R. E., Olafson, B. D., States, D. J., Swaminathan, S. and Karplus, M., 1983, J. Comp. Chem,. 4:187)]에 기재된 것과 유사한 공정이 사용될 수 있다 (전체가 참조로서 본원에 통합됨).
파라토프의 형상은 가능한 파라토프가 에피토프에 결합할 것인지 여부 및 얼마나 잘 결합할 것인지를 결정하는데 중요할 뿐만 아니라, 에피토프 및 파라토프 사이의 상호작용 자체는 변이체 항체의 설계에 커다란 정보의 공급원이다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식된 바와 같이, 이 상호작용이 연구될 수 있는 다양한 방법이 존재한다. 한 가지 방법은 아마 상기에서 기재된 바와 같이 생성된 구조 모델을 사용한 다음, 무엇보다도, 파라토프 및 그의 에피토프 사이의 형태적 및 배향적 공간에 대한 Monte Carlo 조사를 수행할 수 있는, 도킹 모듈을 갖는, InsightII (Accelrys, San Diego, CA)와 같은 프로그램을 사용하는 것이다. 상기 결과는 에피토프가 파라토프와 상호작용하는 장소 및 방법을 추정할 수 있다는 것이다. 일 구현예에서, 에피토프의 단지 단편, 또는 변이체가 관련된 상호작용을 결정하는 것을 돕는데 사용된다. 일 구현예에서, 전체 에피토프가 파라토프 및 에피토프 사이의 상호작용의 모델링에 사용된다. 당해분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 이들 두 가지 상이한 접근법은 다른 이점 및 단점을 갖는다. 예를 들면, 단지 에피토프의 단편을 이용하는 것은 상당한 양의 시간을 소요하지 않고, 각 측쇄의 가능한 변화의 보다 상세한 시험을 허용한다. 다른 한편으로, 전체 단백질 대신에, 에피토프의 단편만 또는 단순히 에피토프를 이용함으로써, 에피토프 단편의 특징이 전체 에피토프에 대한 특징과 동일하지 않으므로, 아마 컴퓨터를 이용한 모델링 동안 오해할 위험성을 증가시킬 수 있다. 일 구현예에서, 상기 결과들을 교차점검하기 위해, 두 접근법이 제한된 범위까지 사용된다. 바람직한 구현예에서, 에피토프의 변이체가 사용되는 경우, 에피토프의 변이체가 에피토프의 가장 중요한 잔기를 포함하도록 최적화될 것이다. 가장 중요한 잔기들의 동일성은, 예를 들면 본명세서의 실시예 4 및 14에서 기재된 바와 같이, 임의의 수의 방법으로 결정될 수 있다.
이들 생성된 구조의 이용을 통해, 잔기가 에피토프 및 파라토프 사이의 상호작용에서 가장 중요하다는 것을 결정할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 항체의 결합 특징을 변경하기 위해 변화될 잔기를 쉽게 선택할 수 있다. 예를 들면, 파라토프 내의 어떤 잔기의 측쇄가 에피토프의 결합을 입체적으로 방해하는 것이 도킹 모델로부터 명확할 수 있으며, 따라서 이들 잔기들을 더 작은 측쇄를 갖는 잔기들로 변화시키는 것이 유리할 수 있다. 당업자는 이것을 많은 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 당업자는 단지 두 모델을 보고 작용기 및 부근에 기초하여 상호작용을 추정할 수 있다. 대안적으로, 당업자는 더 호의적인 에너지 상호작용을 얻기 위해, 상기에서 기재된 바와 같이, 반복된 쌍의 에피토프 및 파라토프를 수행할 수 있다. 당업자는 상기 항체가 에피토프에 결합할 수 있는 대안적인 방법을 결정하기 위해, 항체의 다양한 변이체에 대한 이들 상호작용을 결정할 수 있다. 또한 당업자는 원하는 특정한 특징을 갖는 항체를 얻기 위해 항체의 구조를 어떻게 변화시킬지 여부를 결정하는 다양한 모델을 조합할 수 있다.
상기에서 결정된 모델은 다양한 기술을 통해 시험될 수 있다. 예를 들면, 상호작용 에너지는 변이체 중 어떤 것이 더 조사되는지 여부를 결정하기 위해 상기 논의된 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 에피토프 및 변이체 파라토프의 상호작용 에너지를 조사하기 위해 쿨롱 및 반데르발스 상호작용이 사용된다. 또한 항체 구조 내의 예상된 변화가 실제로 결합 특징에서 원하는 변화를 야기하는지 살펴보기 위해 부위 지정 돌연변이유발가 사용된다. 대안적으로, 모델이 정확한지 여부를 입증하기 위해 또는 파라토프 및 에피토프 사이에 존재할 수 있는 일반적인 결합 대상을 결정하기 위해, 에피토프에 변화가 이뤄질 수 있다.
단백질 구조 내의 무슨 변화가 항체의 특히 원하는 특징을 야기할 것인지를 결정하기 위해 구조를 모델링하는 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 단백질 구조 내의 무슨 변화가 원하는 특징을 야기하지 않을지를 결정하는데 사용될 수 있다.
당해분야의 숙련가에 의해 인식될 바와 같이, 이들 모델은 항체 및 본 구현예의 그의 변이체를 만드는데 필요한 지침을 제공하는 반면, 아마 시험관내 연구를 통해, 인실리코 모델이 일상적인 시험을 수행하는 것이 여전히 바람직할 수 있다. 또한, 당해분야의 숙련가에게 명확할 바와 같이, 임의의 변형은 또한 항체의 활성에 추가적 부작용을 가질 수 있다. 예를 들면, 더 큰 결합을 야기할 것으로 예상되는 임의의 변경은 더 큰 결합을 유도할 수 있는 반면, 그것은 또한 항체의 활성을 감소시키거나 변화시키는 다른 구조를 야기할 수 있다. 이것이 사실인지 여부의 결정은 본 기술분야에서 일상적이며 많은 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 활성은 실시예 21에서와 같이, ELISA 시험을 통해 시험될 수 있다. 대안적으로, 샘플은 표면 플라즈몬 공명 장치의 사용을 통해 시험될 수 있다.
항체 결합, 및 우수한 결합을 위한 변이체 항체
일 구현예에서, 상기 기재된 모델은 그 에피토프에 대한 항체의 결합 능력을 증가시키는데 사용된다. 항체는 에피토프에 보다 쉽게 결합할 수 있고, 따라서 더 높은 결합 상수 (ka)를 갖는다. 대안적으로, 항체는 에피토프로부터 더 느리게 해리될 수 있고, 따라서 더 낮은 해리 상수 (kd)를 갖거나, 또는 에피토프-파라토프 상호작용의 KD는 값이 더 작을 수 있고, 따라서 에피토프 및 파라토프 사이의 결합의 정도를 더 크게 할 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체 항체는 반대의 특징으로 결합하도록 설계된다. 즉, 항체는 단단히 또는 아마 빠르게 결합하지 않는다.
다른 구현예에서, 변이체 항체는 야생형 항체와 그의 KD가 상이하지 않지만, 변이체 항체는 특정한 에피토프에 대해 더 특이적이다. 이것은 상기 설계된 항체의 파라토프가 다른 에피토프에 결합하는 더 낮은 위험성을 갖는다는 것을 의미할 수 있다. 항체는 변경된 다른 특징을 가질 수 있다. 예를 들면, 변이체는 비특이적 항체 결합에 대해 더 면역일 수 있거나 항체가 높은 농도로 존재할 때도 용액 중에 용매화된 상태로 남을 수 있다. 그러한 변이체는 상기 논의된 항체에 존재할 수 있다. 예를 들면, 하기 조사된 더 높은 농도의 일부 변이체 항체들이 Biacore 실험에서 더 느린 결합 성분을 야기한 반면, 13.1.2 mAb의 경우, 어떤 변이체들은, 예를 들어 동일한 농도 L217N-2.1에서, 이러한 더 느린 성분을 나타내지 않았다.
상기 결정된 모델에 의해 예상된 변이체가 생성된 다음, 이들이 실제로 원하는 특징으로 결합하는지 여부를 결정하기 위해 시험될 수 있다. 에피토프와 더 큰 총 상호작용 에너지를 갖는 돌연변이체가 추가 시험을 위해 선택될 수 있다. 상호작용 에너지는 수많은 방법으로 결정될 수 있고, 이들 중 하나가 상기에 기재되어 있다.
이들 변이체는 수많은 방법으로 시험될 수 있다. 예시적인 선택은 include and are not limited to KinExA (예컨대, 전체가 참조로 본원에 통합되어있는, Lackie, 특허공보 제5,372,783호(1994년 12월 13일))(Sapidyne Instruments Inc., ID, Boise), 표면 플라즈몬 공명 (SPR)(예컨대, BIACORETM Biacore, Inc., Pistcataway, N.J.), 흐름정지 형광, 공명 거울, 및 형광 극성화를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 많은 이들 선택은 데이터를 기록할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 이론적 곡선에 데이터를 핏팅하기 위한 즉각적인 수단을 제공함으로써 ka, kd, 및 KD, 뿐만 아니라 다른 특성을 결정할 수 있다. 이들 곡선을 수득한 데이터에 핏팅하는 것이 일부 변화를 위한 가능성이 없다는 것을 유념하는 것이 중요하다. 이 때문에, 관련된 회합, 해리, 및 평형 상수들은 이들 곡선 핏팅 기전을 통해서 뿐만 아니라 각 다른 것과 직접적으로 비교하여, 그리고 당해분야의 숙련가의 지식에 비추어 살펴볼 수 있다.
인간 항체 및 항체의 인간화
인간 항체는 쥣과 또는 랫트 가변 및/또는 불변 영역을 갖는 항체와 연관된 일부 문제를 회피한다. 그와 같은 쥣과 또는 랫트 유도된 단백질의 존재는 항체의 신속한 소거를 야기할 수 있거나 환자에 의한 항체에 대한 면역 반응의 발생을 야기할 수 있다. 쥣과 또는 랫트 유도된 항체의 이용을 피하기 위해, 설치류가 완전한 인간 항체를 생산하도록 설치류 내로 인간 항체 기능을 도입함으로써 완전한 인간 항체가 생성될 수 있다.
YAC에서 메가염기-크기의 인간 좌위를 클론하고 재구축하며 마우스 생식계열 내로 이들을 도입하는 능력은 매우 크거나 조잡하게 맵핑된 좌위의 기능적인 성분을 설명할 뿐만 아니라 인간 질환의 유용한 모델을 생성하는 강력한 접근법을 제공한다. 더욱이, 마우스 좌위를 그의 인간 대응물로 치환하는 상기 기술의 이용은 발달 동안 인간 유전자 생성물의 발현 및 조절, 다른 시스템과의 그의 통신, 및 질환 유도 및 진행에서의 그의 관여 내로 독특한 통찰력을 제공할 수 있다.
그와 같은 전략의 중요한 실제적인 적용은 마우스 체액성 면역계의 "인간화"다. 상기 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 마우스 내로의 인간 면역글로불린 (Ig) 좌위의 도입은 계획된 발현의 근원적인 기전 및 항체의 어셈블리 뿐만 아니라 B-세포 발달에서의 그의 역할을 연구할 기회를 제공한다. 더욱이, 그러한 전략은 인간 질환에서의 항체 치료의 가능성을 충족시키기 위한 중요한 단계인, 완전한 인간 모노클론 항체 (mAb)의 생산을 위한 이상적인 공급원을 제공할 수 있다. 완전한 인간 항체는 마우스 또는 마우스-유도된 mAb에 고유한 면역원성 및 알러지성 반응을 최소화하고, 이에 따라 투여된 항체의 효능 및 안정성을 증가시킬 것으로 기대된다. 완전한 인간 항체의 사용은 반복된 항체 투여를 필요로 하는, 만성 및 재발성 인간 질환, 예컨대 염증, 자가면역, 및 암의 치료에서 실질적인 이점을 제공할 것으로 기대될 수 있다.
이 목표를 위한 한 가지 접근법은 그러한 마우스가 마우스 항체의 부재시 인간 항체의 거대한 레포토리를 생산할 것을 기대하면서 인간 Ig 좌위의 거대한 단편으로 마우스 항체 생산에서 결핍된 마우스 균주를 조작하는 것이었다. 거대한 인간 Ig 단편은 거대한 가변 유전자 다양성 뿐만 아니라 항체 생산 및 발현의 적절한 조절을 저장할 것이다. 항체 다양성을 위한 마우스 기계 및 인간 단백질에 대한 면역논리적 내성의 선택 및 결핍을 개발함으로써, 이들 마우스 균주에서의 재생산된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 포함하는, 관심있는 임의의 항원에 대해 높은 친화도 항체를 생산할 것이다. 하이브리도마 기술을 이용하여, 원하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 mAb는 쉽게 생산되고 선택될 수 있다. 이 일반적인 전략은 1994년에 공개된 바와 같이, 첫번째 XenoMouse 마우스 계통의 본 발명자의 생성과 관련하여 입증되었다. (Green 등 Nature Genetics 7:13-21 (1994)을 참조한다) 상기 XenoMouse 계통은 인간 중쇄 장소 및 카파 경쇄 장소, 각각, 코어 가변 및 불변 영역 서열을 함유한, 인간 중쇄 장소 및 카파 경쇄 장소의 245 kb 및 190 kb-크기의 생식계열 배치 단편을 함유하는 효모 인공 염색체 (YAC)를 이용하여 조작되었다. Id. YAC를 함유하는 인간 Ig는 둘 모두 재배열을 위한 마우스 시스템 및 항체의 발현과 상화적인 것으로 판명되었고 불활성화된 마우스 Ig 유전자를 치환할 수 있었다. 이것은 B-세포 발달을 유도하고, 완전한 인간 항체의 성인-유사 인간 레퍼토리를 생산하고, 항원-특이적 인간 mAb를 생성하는 그의 능력에 의해 입증되었다. 이들 결과는 또한 더 큰 수의 V 유전자, 추가적 조절 요소, 및 인간 Ig 불변 영역을 함유하는 인간 Ig 좌위의 더 큰 부분의 도입이 감염 및 면역화에 대한 인간 체액성 반응의 특징인 실질적으로 완전한 레퍼토리를 요약할 수 있다고 제안하였다. Green 등의 연구는 최근에 인간 중쇄 좌위 및 카파 경쇄 좌위, 각각의 메가염기 크기의, 생식계열 배치 YAC 단편의 도입을 통한 대략 80%가 넘는 인간 항체 레퍼토리의 도입까지 확장되었다. 그의 개시내용은 참조로 본원에 포함되어 있는, 문헌{Mendez 등 Nature Genetics 15:146-156 (1997)} 및 미국 특허출원 제 08/759,620호 (1996년 12월 3일 출원)를 참조한다.
마우스의 생산은 더 논의되며 미국 특허출원 07/466,008 (1990년 1월 12일 출원), 07/610,515 (1990년 11월 8일 출원), 07/919,297 (1992년 7월 24일 출원), 07/922,649 (1992년 7월 30일 출원), 08/031,801 (1993년 3월 15일 출원), 08/112,848 (1993년 8월 27일 출원), 08/234,145 (1994년 4월 28일 출원), 08/376,279 (1995년 1월 20일 출원), 08/430, 938 (1995년 4월 27일 출원), 08/464,584 (1995년 6월 5일 출원), 08/464,582 (1995년 6월 5일 출원), 08/463,191 (1995년 6월 5일 출원), 08/462,837 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,853 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,857 (1995년 6월 5일 출원), 08/486,859 (1995년 6월 5일 출원), 08/462,513 (1995년 6월 5일 출원), 08/724,752 (1996년 10월 2일 출원), 및 08/759,620 (1996년 12월 3일 출원) 및 미국 특허 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, 및 5,939,598 및 일본 특허 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, and 3 068 507 B2에 기술되어 있다. 또한 하기를 참조한다: Mendez 등 Nature Genetics 15:146-156 (1997) and Green and Jakobovits J. Exp . Med . 188:483-495 (1998). 또한 하기를 참조한다: 1996년 6월 12일에 등록공개된 유럽 특허 EP 0 463 151 B1, 1994년 2월 3일에 공개된 국제 특허 출원 WO 94/02602, 1996년 10월 31일에 공개된 국제 특허 출원 WO 96/34096, 1998년 6월 11일에 공개된 WO 98/24893, 2000년 12월 21일에 공개된 WO 00/76310, WO 03/47336. 상기 인용된 특허, 출원, 및 참조문헌 각각의 개시내용은 그의 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
대안적인 접근법에서, GenPharm International, Inc를 포함하는 그 외의 것이 "미니로커스" 접근법을 이용하였다. 미니로커스 접근법에서, 외인성 Ig 장소는 Ig 장소로부터의 피스 (개별적인 유전자)의 포함을 통해 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, mu 불변 영역, 및 제2 불변 영역 (바람직하게는 감마 불변 영역)이 동물 내로 삽입하기 위한 구성체 내로 형성된다. 이 접근법은 미국 특허 5,545,807 (Surani 등) 및 미국 특허 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, 및 6,255,458 (각각 Lonberg 및 Kay), 미국 특허 5,591,669 및 6,023.010 (Krimpenfort 및 Berns), 미국 특허 5,612,205, 5,721,367, 및 5,789,215 (Berns 등), 및 미국 특허 5,643,763 (Choi 및 Dunn), 및 GenPharm 국제 미국 특허 출원 07/574,748 (1990년 8월 29일 출원), 07/575,962 (1990년 8월 31일 출원), 07/810,279 (1991년 12월 17일 출원), 07/853,408 (1992년 3월 18일 출원), 07/904,068 (1992년 6월 23일 출원), 07/990,860 (1992년 12월 16일 출원), 08/053,131 (1993년 4월 26일 출원), 08/096,762 (1993년 7월 22일 출원), 08/155,301 (1993년 11월 18일 출원), 08/161,739 (1993년 12월 3일 출원), 08/165,699 (1993년 12월 10일 출원), 08/209,741 (1994년 3월 9일 출원)에 기재되어 있으며, 그의 개시내용은 참조로 본원에 포함되어 있다. 또한 하기를 참조한다: 유럽 특허 번호 0 546 073 B1, 국제 특허 출원 번호 WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, 및 WO 98/24884 및 미국 특허 5,981,175 (그의 개시내용은 그의 전체가 참조로 본원에 포함되어 있음). 추가로 하기를 참조한다: Taylor 등, 1992, Chen 등, 1993, Tuaillon 등, 1993, Choi 등, 1993, Lonberg 등, (1994), Taylor 등, (1994), and Tuaillon 등, (1995), Fishwild 등, (1996) (그의 개시내용은 그의 전체가 참조로 본원에 포함되어 있음).
Kirin은 또한 미세세포 융합을 통해, 염색체의 거대한 피스, 또는 전체 염색체가 도입된 마우스로부터의 인간 항체의 발생을 입증하였다. 유럽 특허 출원 773 288 및 843 961호를 참조하며, 그의 개시내용은 참조로 본원에 포함되어 있다. Xenerex Biosciences는 인간 항체의 잠재적 생성을 위한 기술을 개발하고 있다. 이 기술에서, SCID 마우스는 인간 림프 세포, 예를 들면, B 및/또는 T 세포를 이용하여 재구성된다. 이후 마우스는 항원으로 면역화되고 항원에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다. 미국 특허 5,476,996, 5,698,767, 및 5,958,765를 참조한다.인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응은 키메라 또는 그렇지 않은 경우 인간화 항체를 제조하는 산업을 이끌어왔다. 키메라 항체가 인간 불변 영역 및 쥣과 가변 영역을 가지긴 하지만, 어떤 인간 항-키메라 항체 (HACA) 반응은, 특정하게 항체의 만성 또는 다중-용량 이용에서, 관찰될 것으로 기대된다. 따라서, HAMA 또는 HACA 반응의 걱정 및 효과를 무산시키기 위해 EGFRvⅢ에 대한 완전한 인간 항체를 제공하는 것이 바람직할 것이다.
컨주게이트된 항체 치료제
본원에서 논의된 바와 같이, EGFRvⅢ 항체의 기능은 그의 작동 방식의 적어도 일부에 중요한 것으로 보인다. 기능은, 예로써, EGFRvⅢ와 작동하는 EGFRvⅢ 항체의 활성을 의미한다. 따라서, 어떤 측면에서, 항체가 보체를 조작하고 세포독성 림프구를 동원하고 이에 따라 CDC 및 ADCC에 참여할 수 있는 것이 EGFRvⅢ에 대한 치료적 후보로서 항체의 발생과 관련하여 바람직할 수 있다. 비제한적으로, 쥣과 IgM, 쥣과 IgG2a, 쥣과 IgG2b, 쥣과 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1, 인간 IgG3, 및 인간 IgA를 포함하는, 동일할 수 있는 항체의 수많은 아이소타입이 존재한다. 또한, 효과기 세포 예컨대 자연 사멸 (NK) 세포 상의 Fc 수용체의 관여를 통해, 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 활성화시킬 수 있는 것이 EGFRvⅢ에 대한 치료적 후보로서 항체의 발생과 관련하여 바람직할 수 있다. 비제한적으로, 쥣과 IgG2a, 쥣과 IgG2b, 쥣과 IgG3, 인간 IgG1, 및 인간 IgG3을 포함하는, ADCC할 수 있는 항체의 수많은 아이소타입이 존재한다. 생성된 항체가 초기에 그러한 아이소타입을 가질 필요는 없지만, 오히려, 생성된 항체가 임의의 아이소타입을 가질 수 있고 항체가 이후에 당해기술에 공지된 종래의 기술을 이용하여 아이소타입으로 전환될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 그러한 기술은 그 중에서도 직접적인 재조합 기술 (예를 들면, 미국 특허 4,816,397을 참조한다) 및 세포-세포 융합 기술 (예를 들면, 미국 특허 5,916,771 및 6,207,418을 참조한다)의 사용을 포함한다
세포-세포 융합 기술에서, 임의의 원하는 아이소타입을 갖는 중쇄를 갖는 골수종 또는 다른 세포주가 제조되고 경쇄를 갖는 또 하나의 골수종 또는 다른 세포주가 제조된다. 그러한 세포는 그 후에, 융합되고 온전한 항체를 발현하는 세포주가 분리될 수 있다.
예로써, 본원에 논의된 임의의 항-EGFRvⅢ 항체는 인간 항-EGFRvⅢ IgG1 항체이다. 그러한 항체가 EGFRvⅢ 분자에 대한 원하는 결합을 보유하면, 그것은 쉽게 아이소타입으로 바뀌어 여전히 동일한 가변 영역(항체의 특이성 및 그 친화도 중 일부를 정의함)을 가지면서 인간 IgM, 인간 IgG3, 또는 인간 IgGA를 생성할 수 있다. IgG1을 포함하는 그러한 분자는, 만약 IgG1 또는 IgG3 불변 영역을 포함하는 경우, 이후에, 보체를 고정시키고 CDC에 참여할 수 있고, 그러한 분자는 또한 세포독성 림프구를 동원함으로써 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)에 참여할 수 있을 것이다.
따라서, 상기에서 논의된 바와 같은 원하는 "구조" 속성을 만족하는 항체 후보가 생성되기 때문에, 이들은 일반적으로 아이소타입 변경을 통해 적어도 어느 하나의 원하는 "기능적인" 속성이 제공될 수 있다.
다른 치료제의 설계 및 생성
EGFRvⅢ과 관련하여 본원에서 생산되고 규명되는 항체의 활성에 기초하여, 항체 모이어티를 벗어나는 다른 치료적 양상의 설계가 용이해진다. 그러한 양상은, 비제한적으로, 진전된 항체 치료제, 예컨대 이중특이적 항체, 면역독소, 및 방사선표지된 치료제, 펩타이드 치료제의 생성, 유전자 치료, 특정하게 세포내 항체, 안티센스 치료제, 및 소분자를 포함한다.
진전된 항체 치료제의 발생과 관련하여, 세포독성 림프구의 보체 고착 및 동원이 바람직한 속성인 경우, 예를 들어, 이중특이적, 면역독소, 또는 방사선라벨의 사용을 통해 세포 사멸을 향상시킬 수 있다.
예를 들면, 이중특이적 항체와 관련하여, (i) 하나는 EGFRvⅢ에 대한 특이성을 갖고 또 다른 하나는 서로 컨주게이트된 제2 분자에 대해 특이성을 갖는 두 항체, (ii) EGFRvⅢ에 특이적인 하나의 사슬 및 제2 분자에 특이적인 제2 사슬을 갖는 단일 항체, 또는 (iii) EGFRvⅢ 및 다른 분자에 대해 특이성을 갖는 단일 사슬 항체를 포함하는 이중특이적 항체가 생성될 수 있다. 그러한 이중특이적 항체는 예를 들면, (i) 및 (ii)와 관련하여, 널리 공지된 기술, 예를 들어, 전술한 문헌[Fanger 등 Immunol Methods 4:72-81 (1994) and Wright and Harris], 및 (iii)과 관련하여 예를 들어, 문헌[Traunecker 등 Int . J. Cancer ( Suppl .) 7:51-52 (1992)]을 이용하여 생성될 수 있다. 각각의 경우, 비제한적으로, CD16 또는 CD64 (예를 들어, Deo 등 18:127 (1997)) CD3 (Micromet's BiTE technology 참조) 또는 CD89 (예를 들어, Valerius 등 Blood 90:4485-4492 (1997) 참조)를 포함하는, Fc 사슬 활성화 수용체에 대해 제2 특이성이 만들어질 수 있다. 상기에 따라 제조된 이중특이적 항체는 EGFRvⅢ를 발현하는 세포, 및 본 발명의 EGFRvⅢ 항체가 효과적인 세포를 사멸할 것 같다.
면역독소와 관련하여, 항체는 당해기술에 공지되어 있는 기술을 이용하여 면역독소로서 작용하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)]을 참조한다. 또한 미국 특허 5,194,594를 참조한다. 방사선표지된 항체의 제조와 관련하여, 그러한 변형된 항체는 당해기술에 공지되어 있는 기술을 이용하여 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Junghans 등 in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))]을 참조한다. 또한 미국 특허 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, 및 5,697,902를 참조한다. 각각의 면역독소 및 방사선표지된 분자는 EGFRvⅢ을 발현하는 세포, 및 특정하게 본원에 기재된 항체가 효과적인 세포들을 사멸할 것 같다.
항체는 더 빠르게 결합하거나, 에피토프로부터 더 서서히 해리되도록 설계될 수 있고, 및 따라서 항체 자체가 치료제로 설계될 수 있다. 항체의 변경된 특징은, 예를 들면, 환자에게 치료제의 투여시에 사용될 수 있다.
치료적 면역컨주게이트
인식될 바와 같이, 약물, 독소, 또는 다른 분자에 컨주게이트된 항체 (본원에서 면역컨주게이트, 면역독소 또는 항체 약물 컨주게이트 ("ADC")로 상호교환적으로 지칭됨)는 특이적 결합 분자, 예컨대 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자를 발현하는 세포의 표적화된 사멸에 크게 유용하다. 상기에서 논의된 바와 같이, EGFRvⅢ은 임의의 정상 조직 상에서 발현되는 것으로 공지되어 있지 않다. 게다가, EGFRvⅢ은 수많은 인간 종양에서 유의한 발현을 나타낸다. 따라서, EGFRvⅢ은 면역독소를 이용한 표적화를 위한 매우 매력적인 분자이다.
모노클론 항체-약물 컨주게이트를 이용하여 종양 세포의 시도된 특이적 표적화에 관한 많은 보고들이 있었다 (Sela 등 in Immunoconjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose 등, in Targeted Drugs 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener 등, in Antibody Mediated Delivery Systems 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz 등, in Antibody Mediated Delivery Systems 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol 등, in Antibody Mediated Delivery Systems 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988). 세포독성 약물, 예컨대 메토트렉세이트, 다우노루비신, 독소루비신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 멜팔란, 미토마이신 C, 및 클로르암부실이 다양한 쥣과 모노클론 항체에 컨주게이트되었다. 일부 경우에서, 약물 분자가 중재자 담체 분자 예컨대 혈청 알부민을 통해 항체 분자에 연결되었다 (Garnett 등 Cancer Res. 46:2407-2412 (1986); Ohkawa 등 Cancer Immumol. Immunother. 23:81-86 (1986); Endo 등 Cancer Res. 47:1076-1080 (1980)), dextran (Hurwitz 등 Appl. Biochem. 2:25-35 (1980); Manabi 등 Biochem. Pharmacol. 34:289-291 (1985); Dillman 등 Cancer Res. 46:4886-4891 (1986); Shoval 등 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8276-8280 (1988)), or polyglutamic acid (Tsukada 등 J. Natl. Canc. Inst. 73:721-729 (1984); Kato 등 J. Med. Chem. 27:1602-1607 (1984); Tsukada 등 Br. J. Cancer 52:111-116 (1985)).
그와 같은 면역컨주게이트의 제조를 위해 다수의 링커 기술이 이용되어 왔고 두 가지 절단가능 및 절단불가 링커가 조사되어 왔다. 대개의 경우, 약물의 총 세포독성 포텐셜은 단지 관찰될 수 있으나, 만약 약물 분자가 표적 부위에서 비변형된 형태로 컨주게이트로부터 방출될 수 있다.
항체-약물 컨주게이트의 제조를 위해 이용되어 온 절단가능한 링커 중 하나는 상이한 세포내 구획 예컨대 수용체 매개된 세포내이입 및 용해소체 동안 접하게 된 엔도솜의 산성 환경의 이점을 이용하는 시스-아코니트산에 기초한 산-불안정한 링커이다. Shen 및 Ryser는 거대분자 캐리어와 다우노루비신의 컨주게이트의 제조를 위해 이 방법을 도입하였다 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981)). Yang 및 Reisfeld는 다우노루비신을 항-흑색종 항체에 컨주게이트하는 동일한 기술을 사용하였다 (J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988)). 최근에, Dillman 등은 또한 항-T 세포 항체와의 다우노루비신의 컨주게이트를 제조하기 위해 유사한 방식으로 산-불안정한 링커를 사용하였다 (Cancer Res. 48:6097-6102 (1988)).
Trouet 등에 의해 개발된 대안적인 접근법은 펩타이드 서페이서 팔을 통해 다우노루비신을 항체에 연결하는 것과 관련되었다 (Proc. Natl. Acad. Sci. 79:626-629 (1982)). 이것은 자유 약물이 용해소체 펩티다아제의 작용에 의해 그러한 컨주게이트로부터 방출될 수 있다는 전제 하에 수행되었다.
그러나, 시험관내 세포독성 시험은 항체-약물 컨주게이트가 자유 비컨주게이트된 약물만큼 동일한 세포독성 효능을 거의 달성할 수 없다는 것을 밝혀내었다. 이것은 약물 분자가 항테로부터 방출되는 기전이 매우 비효율적이라는 것을 제안하였다. 면역독소의 영역에서, 모노클론 항체 및 촉매적으로 활성인 단백질 독소 사이에 디설파이드 다리를 통해 형성된 컨주게이트는 다른 링커를 함유하는 컨주게이트보다 더 세포독성인 것으로 나타났다. 문헌[Lambert 등 J. Biol. Chem. 260:12035-12041 (1985); Lambert 등 in Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie 등 Cancer Res. 48:2610-2617 (1988)]을 참조한다. 이것은 항체 분자 및 독소 사이의 디설파이드 결합의 효율적인 절단에 기여하는 글루타티온의 높은 세포내 농도에 기인하였다. 이것에도 불구하고, 약물 및 거대분자 사이에 컨주게이트의 제조를 위해 디설파이드 다리를 사용하는 예는 단지 몇몇만 보고되어 있다. Shen 등은 메토트렉세이트의 머캅토에틸아마이드 유도체로의 전환 이후에 디설파이드 결합을 통해 폴리-D-라이신과 컨주게이트하는 것을 기술하였다 (J. Biol. Chem. 260:10905-10908 (1985)). 또한, 보고는 항체와의 트리설파이드-함유 독성 약물 칼리케아마이신과의 컨주게이트의 제조를 기술하였다 (Menendez 등 Fourth International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, San Diego, Abstract 81 (1989)). 또 하나의 보고는 항체와의 트리설파이드-함유 독성 약물 칼리케아마이신과의 컨주게이트의 제조를 기술하였다 (Hinman 등, 53 Cancer Res. 3336-3342 (1993)).
디설파이드 연결된 항체-약물 컨주게이트가 부족한 한 가지 이유는 디설파이드 다리를 통해 약물을 항체에 연결하는데 쉽게 사용될 수 있는 황 원자 함유 모이어티를 갖는 세포독성 약물을 이용할 수 없기 때문이다. 더욱이, 현존하는 약물의 화학적 변형은 그의 세포독성 포텐셜을 소멸하지 않고는 어렵다.
현존하는 항체-약물 컨주게이트의 또 하나의 주요 결점은 상기 약물이 제한된 수의 표적화된 항원 및 메토트렉세이트, 다우노루비신 및 빈크리스틴과 같은 암세포 성장 저해 약물의 상대적으로 보통인 세포독성으로 인해, 충분한 농도의 약물을 표적 부위에 전달할 수 없다는 것이다. 유의한 세포독성을 달성하기 위해, 다수의 약물 분자를 항체에 직접적으로 또는 폴리머 캐리어 분자를 통해 연결하는 것이 필요해진다. 그러나 그렇게 심하게 변형된 항체는 종종 표적 항원에 대해 손상된 결합 및 혈류로부터 빠른 생체내 소거능을 나타낸다.
메이탄시노이드는 크게 세포독성 약물이다. 마이탄신은 동아프리카 관목 Maytenus serrata로부터 Kupchan 등에 의해 처음 분리되었고 메토트렉세이트, 다우노루비신, 및 빈크리스틴과 같은 종래의 암 화학요법제보다 100 내지 1000배 더 강한 세포 독성이 있는 것으로 나타났다 (미국 특허 3,896,111). 이후, 일부 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 메이탄시놀의 C-3 에스테르를 생산하는 것으로 발견되었다 (미국 특허 4,151,042) 메이탄시놀의 합성 C-3 에스테르 및 메이탄시놀의 유사체가 또한 보고되었다 (Kupchan 등 J. Med. Chem. 21:31-37 (1978); Higashide 등 Nature 270:721-722 (1977); Kawai 등 Chem. Pharm. Bull. 32:3441-3451 (1984)). C-3 에스테르가 제조된 메이탄시놀의 유사체의 예는 방향족 고리 상에 (예를 들면 데클로로) 또는 C-9, C-14 (예를 들면 하이드록실레이트화된 메틸 그룹), C-15, C-18, C-20 및 C-4,5에 변형을 갖는 메이탄시놀이다.
자연 발생 및 합성 C-3 에스테르는 두 그룹으로 분류될 수 있다:
(a) 간단한 카복실산을 갖는 C-3 에스테르 (미국 특허 4,248,870; 4,265,814; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,317,821; 4,322,348; 및 4,331,598), 및
(b) N-메틸-L-알라닌의 유도체를 갖는 C-3 에스테르 (미국 특허 4,137,230; 4,260,608; 5,208,020; 및 Chem. Pharm. Bull. 12:3441 (1984)).
그룹 (b)의 에스테르는 그룹 (a)의 에스테르보다 훨씬 더 세포독성인 것으로 확인되었다.
마이탄신은 유사분열 억제제이다. 마이탄신을 이용한 생체내 L1210 세포의 치료는 세포의 67%가 유사분열을 축적하는 것을 야기하였다고 보고하였다. 미처리된 대조군 세포는 3.2 내지 5.8% 범위의 유사분열 지수를 나타내는 것으로 보고되었다 (Sieber 등 43 Comparative Leukemia Research 1975, Bibl. Haemat. 495-500 (1976)). 바다 성게 알 및 조개 알을 이용한 실험은 마이탄신이 미세소관 단백질, 튜불린의 중합의 억제를 통해 미세소관의 형성을 매개함으로써 유사분열을 억제한다는 것을 제안하였다 (Remillard 등 Science 189:1002-1005 (1975)).
시험관내, P388, L1210, 및 LY5178 쥣과 백혈병 세포 현탁액은 10-3 내지 10-1.mu.g/.mu.l의 용량에서 마이탄신에 의해 억제되는 것으로 나타났고, P388 라인이 가장 민감하였다. 마이탄신은 또한 인간 비인두 암종 세포의 시험관내 성장의 활성 억제제인 것으로 나타났고, 인간 급성 림프모구 백혈병 라인 CEM은 10-7 mg/ml 정도의 낮은 농도에 의해 억제되는 것으로 보고되었다 (Wolpert-DeFillippes 등 Biochem. Pharmacol. 24:1735-1738 (1975)).
생체내에서, 마이탄신은 또한 활성인 것으로 나타났다. P388 림프구성 백혈병 시스템에서의 종양 성장은 높은 치료 지수를 제안한 50- 내지 100-배 복용량 범위에 걸쳐 억제된 것으로 나타났고; 또한 유의미한 억제 활성은 L1210 마우스 백혈병 시스템, 인간 루이스 폐 암종 시스템 및 인간 B-16 멜라닌암종 시스템을 이용하여 입증될 수 있다 (Kupchan, Ped. Proc. 33:2288-2295 (1974)).
메이탄시노이드의 세포 결합제 (예컨대 항체)와의 컨주게이션의 현 방법은 두 반응 단계를 포함한다. 세포 결합제, 예를 들면 항체는, 디티오피리딜 그룹을 항체 내로 도입하는 교차-결합 시약 예컨대 N-석신이미딜 피리딜디티오프로피오네이트 (SPDP)를 이용하여 1차적으로 변형된다 (Carlsson 등 Biochem. J. 173:723-737 (1978); 미국 특허 5,208,020). 제2 단계에서, 개시 시약으로서, 티올 그룹을 갖는 반응성 메이탄시노이드, 예컨대 DM1 (공식적으로 N2' -탈아세틸-N2' -(3-머캅토-1-옥소프로필으로 명명됨)-마이탄신이 변형된 항체에 첨가되어, 변형된 항체에서 티오피리딜 그룹의 치환, 및 디설파이드-연결된 세포독성 메이탄시노이드/항체 컨주게이트의 생산을 야기한다 (미국 특허 5,208,020) 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC) 링커를 이용한 또 하나의 방법이 USSN 11/927,217 특허 출원 (공보 번호 US 2008/0114153)에 기재되어 있다. 메이탄시노이드의 컨주게이션을 위한 1단계 공정이 미국 특허 6,441,163에 기재되어 있다. 메이탄시노이드-기반 면역독소 기술은 Immunogen Corporation (Cambridge, MA)으로부터 이용가능하다.
또 하나의 중요한 독소 기술은 아우리스타틴 독소에 기초한다. 아우리스타틴은 강력한 세포 성장 억제 물질로서, 인도양 군소(sea hare) 돌라벨라로부터 수득된 돌라스타틴 10으로부터 유도된다. 미국 특허 4,816,444 및 4,978,744를 참조한다. 다른 돌라스타틴과 관련하여, 또한 하기를 참조한다: 미국 특허 4,414,205 (돌라스타틴-1, 2, 및 3), 5,076,973 (돌라스타틴-3), 4,486,414 (돌라스타틴-A 및 B),; 4,986,988 (돌라스타틴-13), 5,138,036 (돌라스타틴-14), 및 4,879,278 (돌라스타틴-15) 애리조나 대학의 Dr. Pettit 및 동료에 의해 분리 및 합성된, 다양한 아우리스타틴 유도체가 시험되었고 세포에 크게 독성인 것으로 나타났다. 문헌[Pettit 등 Antineoplastic agents 337. Synthesis of dolastatin 10 structural modifications. Anticancer Drug Des. 10(7):529-44 (1995), Woyke 등 In vitro activities and postantifungal effects of the potent dolastatin 10 structural modification auristatin PHE. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45:3580-3584 (2001), Pettit 등 Specific activities of dolastatin 10 and peptide derivatives against Cryptococcus neoformans. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42:2961-2965 (1998), WoykeThree-dimensional visualization of microtubules during the Cryptococcus neoformans cell cycle and the effects of auristatin PHE on microtubule integrity and nuclear localization. Submitted, Antimicrobial Agents and Chemotherapy]을 참조한다.
최근에, 항체 상의 적하로서 전달될 때 상당히 효과적인 것을 보이는 추가적인 아우리스타틴 유도체가 개발되었다. 예를 들면 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE)는 종양 특이적 항체에 컨주게이트될 때 종양 세포에 대한 강력한 독소로서 나타났다. Doronina 등 Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (available online), Francisco 등 cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003) May 8 [Epub ahead of print]. Epub 2003 Apr 24 (available online). 아우리스타틴 분자의 독성 외에도, 연구는 펩타이드-연결된 컨주게이트가 더 안정하고, 따라서, 완충액 및 혈장에서 다른 링커 기술보다 정상 조직에 대해 더 특이적이고 독성이 적다는 것을 보여주었다. Doronina 등 Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (available online), Francisco 등 cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003) May 8 [Epub ahead of print]. Epub 2003 Apr 24 (available online). 그러한 링커는 분기된 펩타이드 설계에 기초하며, 예를 들면, mAb-발린-시트룰린-MMAE 및 mAb-페닐알라닌-라이신-MMAE 컨주게이트를 포함한다. Doronina 등 Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nature Biotechnology. (2003) (available online), Francisco 등 cAC10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. Blood. (2003) May 8 [Epub ahead of print]. Epub 2003 Apr 24 (available online). 그러한 설계 및 컨주게이션 기술은, 예를 들면, 문헌[King 등 Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared with branched peptide linkers: inhibition of aggregation by methoxytriethyleneglycol chains. J Med Chem. 45(19):4336-43 (2002) and Dubowchik 등 Cathepsin B-sensitive dipeptide prodrugs. 2. Models of anticancer drugs paclitaxel (Taxol), mitomycin C and doxorubicin. Bioorg Med Chem Lett. 8(23):3347-52 (1998)]에 기재되어 있다. 전술한 것에 기초한 아우리스타틴 E-기반 면역독소 기술은 Seattle Genetics Corporation (Seattle, WA)으로부터 이용가능하다.
천연 공급원-추출물로부터 수득된 다수의 신규 미세소관 효과 화합물, 및 면역컨주게이트의 발생을 위한 독소로서 잠재성을 갖는 것으로 보이는 반합성 및 합성 유사체가 존재한다. (웹사이트 newmedinc "dot" com 참조). 그러한 분자 및 이들을 이용하는 약물 생성물의 예는 콜히친-부위 바인더 (큐라신), 콤브레타스타틴 (AVE806, 콤브레타스타틴 A-4 전구약물 (CA4P), Oxi-4503), 크립토파이신 (LY355703), 디스코데르몰라이드, 돌라스타틴 및 유사체 (아우리스타틴 PHE, 돌라스타틴 10, ILX-651, 사임플로스타틴 1, TZT-1027), 에포틸론 (BMS-247550, BMS-310705, EPO906, KOS-862, ZK-EPO), 엘류테로빈, FR182877, 할리콘드린 B (E7389), 할리마이드 (NPI-2352 및 NPI-2358), 헤미아스테를린 (HTI-286), 라울리말라이드, 메이탄시노이드 ("DM1")(비바투주맙 메르탄신, 칸투주맙 메르탄신, huN901-DM1/BB-10901TAP, MLN591DM1, My9-6-DM1, 트라스투주맙-DM1), PC-SPES, 펠로루사이드 A, 레스베라트롤, S-알릴머캅토시스테인 (SAMC), 스폰지스타틴, 비틸레부아마이드, 분자 Motor-키네신 (SB-715992), 설계된 콜히친-부위 바인더 (A-289099, A-293620/A-318315, ABT-751/E7010, D-24851/D-64131, ZD6126), 다른 신규 스핀들 독 (2-메톡시트라디올 (2-ME2), 벤즈이미다졸 카바메이트 (ANG 600 시리즈, 메벤다졸), CP248/CP461, HMN-214, R440, SDX-103, T67/T607)를 포함한다. 게다가, 추가적인 해양 유도된 독소가 문헌[Mayer, A.M.S. Marine Pharmacology in 1998: Antitumor and Cytotoxic Compounds. The Pharmacologist. 41(4):159-164 (1999)]에서 검토된다.
치료적 투여 및 제형
장기적인 작용 지속시간은 대안적인 비경구 경로, 예컨대 정맥내, 피하 또는 근육내 주사에 의해 덜 빈번하고 더 편리한 투여 계획을 가능하게 할 것이다.
생체내 투여를 위해 사용되는 경우, 본원에 기재된 컨주게이트된 항체 제형, 특정하게 Ab 131-DM1 컨주게이트는 멸균되어야 한다. 이것은, 예를 들면, 동결건조 및 재구성 이전에 또는 이후에, 멸균한 여과막을 통한 여과로 쉽게 달성된다. 컨주게이트된 항체는 보통 때는 동결건조된 형태로 또는 용액으로 보관될 것이다. 치료적 항체 조성물은 일반적으로 멸균한 접근 포트, 예를 들면, 제형의 회수를 허용하는 어댑터, 예컨대 피하 주사 바늘에 의해 뚫릴수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알을 갖는 용기 내에 놓여 진다.
항체 투여의 경로는 공지된 방법, 예를 들면, 정맥내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안구내, 동맥내, 척추강내, 흡입 또는 병소내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기에 언급된 지속적인 방출 시스템과 조화를 이룬다. 항체는 바람직하게는 주입 또는 볼러스 주사에 의해 연속적으로 투여된다. 일 구현예에서 Ab 131-DM1 컨주게이트는 정맥내로 투여된다. 또 하나의 구현예에서 Ab 131-DM1 컨주게이트는 종양에 주사로 투여된다. 또 하나의 구현예에서 Ab 131-DM1 컨주게이트는 저장기, 데포(depot) 제형 또는 이식된 디바이스를 통해 종양에 직접 연속적으로 투여된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 컨주게이트된 항체, 예컨대 Ab 131-DM1 컨주게이트의 특정한 복용 요법이 제공된다. 주어진 환자를 위한 항체 제형의 복용량은 중증도 및 질환의 유형, 체중, 성별, 다이어트, 투여의 시간 및 경로, 다른 약물요법 및 다른 관련된 임상 인자를 포함하는 약물의 작용을 변형하는 것으로 알려진 다양한 인자를 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다.
전형적으로, 임상의는 복용량이 원하는 효과를 달성하는데 도달할 때까지 항체를 투여할 것이다. 이 치료의 진행은 종래의 분석 및 방사선학적 이미지화 예컨대 MRI를 포함하는 본원에 기재된 분석에 의해 쉽게 관찰된다.
본원에 기재된 바와 같이, 컨주게이트된 항체, 예컨대 Ab 131-DM1 컨주게이트는, 약제학적으로 허용가능한 담체와 혼합되어 제조될 수 있다. 치료적 조성물은 정맥내로 투여되거나 코 또는 폐를 통해, 바람직하게는 액체 또는 분말 에어로졸 (동결건조된)로서 투여될 수 있다. 조성물은 필요한 경우 비경구로 또는 피하로 투여된다. 전신 투여되는 경우, 치료적 조성물은 멸균되고, 발열물질이 없어야 하고, pH, 예컨대 4 내지 약 6의 pH, 등장성, 및 안정성을 고려하여 비경구로 허용가능한 용액이어야 한다. 이들 조건은 당해분야의 숙련가에게 알려져 있다.
간단히 말해서, 본 화합물의 복용량 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 컨주게이트된 항체, 예컨대 Ab 131-DM1 컨주게이트를 생리적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정제와 혼합함으로써 저장 또는 투여를 위해 제조된다. 그러한 물질은 복용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충액, 예컨대 보레이트, 석시네이트 바이카보네이트, 나트륨 포스페이트 ("NaOAC"), 트리스-HCl, 트리스 완충액, 시트레이트, 포스페이트 완충액, 포스페이트-완충 식염수 (즉, PBS 완충액), 아세테이트 및 다른 유기산 염; 항산화제 예컨대 아스코르브산; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 펩타이드 예컨대 폴리아르기닌, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 예컨대 폴리비닐피롤리디논; 아미노산 예컨대 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 또는 아르기닌; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 셀룰로오스 또는 그의 유도체, 글루코스, 수크로오스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 반대이온 예컨대 나트륨 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 80을 포함하는 TWEEN, PLURONICS, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사팔 또는 폴리에틸렌글리콜을 포함한다. 그러한 복용량 제형은 1 mg/ml 내지 160 mg/ml 범위의, 화합물, 예컨대 Ab 131-DM1의 농도를 포함할 수 있다.
주사용 멸균 조성물은 문헌[ Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)]에 기재된 바와 같이 종래의 약제학적 실시에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들면, 비히클 예컨대 물 또는 참깨, 땅콩, 또는 목화씨유와 같은 자연 발생 식물유 또는 에틸 올레이트 등과 같은 합성 지방 비히클 중의 활성 화합물의 용해 또는 현탁액이 필요할 수 있다. 완충액, 보존제, 항산화제 등이 허용된 약제학적 실시에 따라 포함될 수 있다.
지속된-방출 제제의 적합한 예는 컨주게이트된 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 형상화된 물품, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속된-방출 매트릭스의 예는 문헌[Langer 등, J. Biomed Mater . Res ., (1981) 15:167-277 and Langer, Chem . Tech ., (1982) 12:98-105에 기재된 바와 같은 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (미국 특허 3,773,919, EP 58,481), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman 등, 바이오폴리머, (1983) 22:547-556), 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트 (Langer 등, 전술됨), 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머 예컨대 LUPRON DepotTM (락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구형체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산 (EP 133,988)을 포함한다.
폴리머, 예컨대 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산이 100 일 이상 분자의 방출을 가능하게 하는 반면, 어떤 하이드로겔은 단시간 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 체내에 장시간 유지되는 경우, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과 변성되거나 응집되어, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화를 야기한다. 연루된 기전에 따라 단백질 안정화를 위해 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들면, 응집 기전이 디설파이드 교환을 통해 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되는 경우, 안정화는 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조하고, 적절한 첨가물을 사용하여 수분 함량을 제어하고, 특이적 폴리머 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
지속된-방출된 조성물은 또한 현탁액 중에 결정을 유지할 수 있는 적합한 제형에 현탁된 항체의 결정의 제제를 포함한다. 이들 제제는 피하로 또는 복강내로 주입될 경우 지연 방출 효과를 낳을 수 있다. 다른 조성물은 또한 리포좀에 갇힌 항체를 포함한다. 그러한 항체를 함유하는 리포좀은 하기 공지된 방법에 의해 제조된다: 미국 특허 DE 3,218,121; 엡슈타인 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1985) 82:3688-3692; Hwang 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, (1980) 77:4030-4034; EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; 142,641; 일본 특허 출원 83-118008; 미국 특허 4,485,045 and 4,544,545; 및 EP 102,324.
본원에서 조성물 및 방법에 따른 치료적 독립체의 투여는 적당한 담체, 부형제, 및 개선된 이송, 전달, 내성, 등을 제공하기 위해 제형 내로 혼입되는 다른 제제와 함께 투여될 것으로 인식될 것이다. 다수의 적절한 제형은 모든 약제학적 화학자에게 공지된 처방서에서 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), 특히Chapter 87 by Block, Lawrence. 이들 제형은, 예를 들면, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포 (예컨대 LipofectinTM)를 함유하는 지질 (양이온성 또는 음이온성), DNA 컨주게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스 (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 세미-고체 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반-고체 혼합물을 포함한다. 임의의 전술한 혼합물은, 상기 제형 내의 활성 성분이 제형에 의해 불활성화되지 않고 상기제형이 생리적으로 상화적이고 투여의 경로를 견디는 한, 치료 및 본 발명에 따른 치료에 적절할 수 있다. 또한 Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol . Pharmacol . 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int . J. Pharm . 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts." J Pharm Sci .89(8):967-78 (2000), Powell 등 "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol . 52:238-311 (1998), 약제학적 화학자에게 잘 알려진 제형, 부형제, 담체에 관련된 부가정보를 위해본원에서의 인용문헌을 참조한다.
본 발명의 치료적 독립체, 예컨대 Ab 131-DM1은 또한 병용 요법으로 사용될 수 있다. 병용 요법은 포유동물을 수술하거나, 포유동물에게 방사선요법을 적용하거나, 일차 셋팅에서 전뇌 방사선 요법을 적용하거나, 반복 셋팅에서 초점 방사선 치료를 적용하거나, 일차 및 반복 셋팅에서 테모졸로마이드를 투여하거나, 베바시주맙을 투여하거나, 이리노테칸을 투여하거나, PCV, 프로카바진, 로무스틴 [CCNU], 빈크리스틴을 투여하거나, 글라이아델 웨이퍼 (BCNU로 함침된 폴리페프로산)를 이식하거나, 티로신 키나제 억제제를 투여하거나, 방사선-감작제를 투여하거나, 백신 기반 요법을 실시하거나, 항체 약물 컨주게이트를 투여하거나, 일차 또는 반복 셋팅에서 BiTE를 투여하거나 표적화된 약물을 투여하는 처치 이전, 이러한 처치와 동시에 또는 이러한 처치 이후에 본 발명의 치료적 분자, 예컨대 Ab 131-DM1을 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트, 예컨대 Ab 131-DM1와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료적 분자는, 또 하나의 항-EGFRvⅢ 치료적 분자, 예컨대 항-EGFRvⅢ 백신 예컨대 린도페피무트(Rindopepimut), 항-EGFRvⅢ 항체, 또 하나의 항-EGFRvⅢ 항체 약물 컨주게이트, 또는 항-EGFRvⅢ 이중특이적 T-세포 연관체이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트, 예컨대 Ab 131-DM1와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료적 분자는, 파니투무맙, 세툭시맙, 다른 항-EGFR 항체, 항-EGFR 백신, 항-EGFR 항체 약물 컨주게이트 또는 항-EGFR 이중특이적 T-세포 연관체와 같은 항-EGFR 치료적 분자이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트, 예컨대 Ab 131-DM1와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료적 분자는, 항-인터루킨-6 치료적 분자, 예컨대 항-인터루킨-6 항체 예컨대 실툭시맙, 항-인터루킨-6 수용체 항체 예컨대 토실리주맙, 항-인터루킨-6 또는 항-인터루킨-6 수용체 항체 약물 컨주게이트, 또는 항-인터루킨-6 또는 항-인터루킨-6 수용체 이중특이적 T-세포 연관체이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EGFRvⅢ 약물 컨주게이트, 예컨대 Ab 131-DM1와 병용되어 포유동물에게 투여되는 치료적 분자는, 항-인터루킨-8 치료적 분자, 예컨대 항-인터루킨-8 항체, 항-인터루킨-8 수용체 항체 예컨대, 항-인터루킨-8 또는 항-인터루킨-8 수용체 항체 약물 컨주게이트, 또는 항-인터루킨-8 또는 항-인터루킨-8 수용체 이중특이적 T-세포 연관체이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항-EGFRvⅢ 항체 약물 컨주게이트, 예컨대 Ab 131-DM1은 더 많은 항-EGFRvⅢ, 항-EGFR, 항-인터루킨-6, 항-인터루킨 6 수용체, 항-인터루킨-8 또는 항-인터류킨-8 수용체 치료적 분자가 포유동물에 투여되기 전, 이와 함께 또는 이후에 투여된다.
그러한 병용 요법은 EGFRvⅢ을 발현하는 종양, 폐 암종, 유방 암종, 결장 암종, 위 암종, 신장 암종, 두경부 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 교모세포종, 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 또는 신경교세포 성분을 포함하는 종양, 특히 교모세포종, 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 반복되는 교모세포종, 반복되는 역형성 별아교세포종.,희소돌기아교세포종, 희소돌기별아교세포종, 신경교육종, 혼합성 신경아교종, 모양세포성 별아교세포종, 다형성 황색별아교세포종, 뇌실막하 거대세포 별아교세포종, 별아교모세포종, 해면모세포종, 대뇌 교종증, 또는 신경절교종 또는 역형성 신경절교종을 포함하는 신경-아교세포 종양을 치료하는데 유용하다.
컨주게이트된 항체의 제조
본원에 기재된 바와 같이, 컨주게이트된 항체는, 하기 기재된 바와 같이 그리고 전체가 참조로 본원에 통합되어 있는 US 7,628,986에 기재된 바와 같이, XenoMouse® 기술을 이용하여 제조되었다 이후, 상기 마우스는, 인간 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있고 쥣과 면역글로불린 분자 및 항체의 생산이 결핍된다. 이를 달성하기 위해 이용된 기술이 본원에 개시된 특허, 출원, 및 참조문헌에 개시되어 있다. 그러나, 특히, 마우스의 형질전환 생산 및 항체의 하나의 구현예가, 그 개시내용이 참조로써 본원에 통합되어 있는 미국 특허 출원 08/759,620 (1996년 12월 3일 출원) 및 국제 특허 출원 WO 98/24893 (1998년 6월 11일 공개) 및 WO 00/76310 (2000년 12월 21일 공개)에 개시되어 있다. 또한 그의 개시내용이 참조로 본원에 통합되어 있는 문헌[Mendez 등 Nature Genetics :146-156 (1997)]을 참조한다.
그와 같은 기술의 이용을 통해, 다양한 항원에 대한 완전한 인간 모노클론 항체가 생산될 수 있다. 일 구현예에서, XenoMouse® 계통의 마우스는 관심있는 항원 (예를 들면 EGFRvⅢ)으로 면역화되고, 림프 세포는 항체를 발현하는 마우스로부터 회복되고(예컨대 B-세포), 상기 세포는 불멸 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 골수-유형 세포주와 융합되고, 상기 하이브리도마 세포주는 관심있는 항원에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 확인하기 위해 스크리닝되고 선택된다. EGFRvⅢ에 특이적인 항체를 생산하는 다중 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 방법이 본원에 제공된다. 게다가, 그와 같은 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 포함하는, 상기 세포주에 의해 생산된 항체의 특성화가 본원에 제공된다.
대안적으로, 하이브리도마를 생성하기 위해 골수 세포에 융합되는 것 대신에, 면역화된 XenoMouse® 계통의 마우스로부터 분리된, 회복된 세포에 의해 생산된 항체가, 초기 항원, 바람직하게는 EGFRvⅢ 단백질에 대한 반응성을 위해 더 스크리닝된다. 그러한 스크리닝은 전장 EGFRvⅢ를 안정적으로 발현하는 NR6 M 세포에 시험관내에서 결합하는, EGFRvⅢ 단백질을 이용한 ELISA 및 NR6 M 세포에서 항체에 의한 EGFRvⅢ 수용체의 내면화를 포함한다. 관심있는 항체를 분비하는 단일 B 세포가 이후에 EGFRvⅢ-특이적 용혈성 플라크 분석을 이용하여 분리된다 (Babcook 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , i93:7843-7848 (1996)). 용해를 위해 표적화된 세포는 EGFRvⅢ 항원으로 코팅된 양 적혈구 혈액 세포 (SRBC)이다. 관심있는 면역글로불린 및 보체를 분비하는 B 세포 배양물의 존재시, 플라크의 형성은 표적 세포의 특이적 EGFRvⅢ-매개된 용해를 가리킨다. 플라크 중심 내의 단일 항원-특이적 형질 세포가 분리될 수 있고 항체의 특이성을 인코딩하는 유전적 정보가 단일 형질 세포로부터 분리될 수 있다. 역-전사효소 PCR을 이용하여, 분비된 항체의 가변 영역을 인코딩하는 DNA가 클로닝될 수 있다. 그러한 클로닝된 DNA는 이후에 적당한 발현 벡터, 바람직하게는 벡터 카세트 예컨대 pcDNA, 더 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 불변 도메인을 함유하는 상기 pcDNA 벡터 내로 추가 삽입될 수 있다. 생성된 벡터는 이후에 숙주세포, 바람직하게는 CHO 세포 내로 형질감염되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절한 변형된 종래의 영양소 배지에서 배양될 수 있다. 본원에서, 본 발명자들은 EGFRvⅢ에 특이적인 항체를 생산하는 다중 단일 형질 세포의 분리를 기술한다. 게다가, 항- EGFRvⅢ 항체의 특이성을 인코딩하는 유전적 물질은 분리되고, 이후 숙주세포 내로 형질감염되는 적당한 발현 벡터로 도입된다.
XenoMouse 마우스로부터의 B 세포는 항체 디스플레이 라이브러리가 생성될 수 있는 유전적 물질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 그러한 라이브러리는 본 기술분야에서의 통상적인 기술을 이용하여 리보솜 디스플레이를 통해 박테리오파아지, 효모 또는 시험관내에서 제조될 수 있다. 고도면역화된 XenoMouse 마우스는 고-친화도, 항원-반응성 항체가 분리될 수 있는 풍부한 공급원일 수 있다. 따라서, EGFRvⅢ에 대해 고도면역화된 XenoMouse 마우스가 EGFRvⅢ에 대한 고-친화도 항체가 분리될 수 있는 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다. 그러한 라이브러리는 천연 디스플레이 항원에 대한 특이성을 확인하기 위해, pep3 올리고펩타이드 및 EGFRvⅢ을 발현하는 세포에 대하여 스크리닝하는 그 결과로 유래된 항체에 해대 스크리닝될 수 있다. 완전한 IgG 항체는 이후에 재조합 DNA 기술을 이용하여 발현될 수 있다. 예를 들면, WO 99/53049를 참조한다.
예를 들면, 본 발명의 컨주게이트된 항체 중 항체는 형질감염된 세포로부터 생산될 수 있다. 세포 (일시적인 발현을 위한 293 세포 및 안정한 발현을 위한 CHO 세포)는 본원의 도 8에 도시된 Ab 131-DM1 컨주게이트의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염될 수 있다. 형질감염된 세포로부터의 조절된 배지는 세포 및 세포 잔해를 제거함으로써 회복될 수 있다. 정화된 조절된 배지는 단백질 A-세파로오스 칼럼 상에 로딩될 수 있다. 임의로, 상기 배지는 먼저 농축된 다음 단백질 A 세파로오스 칼럼 상에 로딩될 수 있다. 비-특이적 결합 광범위한 PBS 세척에 의해 제거될 수 있다. 단백질 A 칼럼 상의 결합된 항체 단백질은 단백질 A 칼럼으로부터의 표준 산성 항체 용출에 의해 회복될 수 있다 (50 mM 시트레이트, pH 3.0). 단백질 A 세파로오스 풀 내의 응집된 항체 단백질은 크기 배제 크로마토그래피 또는 양이온 교환기 수지 예컨대 SP-세파로오스 수지 상의 결합 이온 교환 크로마토그래피에 의해 제거될 수 있다. 항체는 과잉 칼럼 용적의 완충액으로 용출될 수 있다.
일반적으로, 상기-언급된 세포주에 의해 생산된 항체는 인간 카파 경쇄를 갖는 완전한 인간 IgG1 또는 IgG2 중쇄를 가지고 있었다. 일 구현예에서, 항체는 고체상 및 용액상 중 어느 하나에 의해 측정될 때, 전형적으로 약 10-9 내지 약 10-13 M의 kd를 갖는, 높은 친화도를 가지고 있었다. 다른 구현예에서, 항체는 약 10-6 내지 약 10-8 M의 더 낮은 친화도를 가지고 있었다.
당해분야의 숙련가에 의해 인식된 바와 같이, 본 구현예에 따른 항체는 하이브리도마 세포주 이외의 세포주에서 발현될 수 있다. 특정한 항체를 인코딩하는 서열이 적당한 포유동물 숙주세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 형질전환은 미국 특허 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, 및 4,959,455 (특허들이 본원에 참고로 통합되어 있음)에 예시된 바와 같이, 예를 들면 폴리뉴클레오타이드를 바이러스 (또는 바이러스 벡터 내로)에서 패키징하고 형질도입하는 숙주세포를 바이러스 (또는 벡터)로 또는 본 기술분야에 공지된 형질감염 절차에 의해 형질도입하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의할 수 있다. 사용된 형질전환 절차는 형질전환될 숙주에 좌우된다. 이종 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포 내로 도입하는 방법은 본 기술분야에 널리 알려져 있고, 이는 덱스트란-매개된 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀에서 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 및 DNA의 핵 내로의 직접적인 미세주입을 포함한다.
발현을 위한 숙주로서 이용가능한 포유동물 세포주는 본 기술분야에 널리 알려져 있고, 이는 비제한적으로 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포 암종 세포 (예를 들면, Hep G2), 및 수많은 다른 세포주를 포함하는, 미국 종균 협회 (ATCC)로부터 이용가능한 많은 불멸화된 세포주를 포함한다. 특히 선호하는 세포주는 어떤 세포주가 높은 발현 수준을 갖고 Ab 131-DM1 컨주게이트와 같은 항시적 EGFRvⅢ 결합 특성을 갖는 항체를 생산하는지 여부를 결정함으로써 선택된다.
실시예
수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는, 하기 실시예는 단지 예시하기 위한 것이고 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
EGFRvⅢ-특이적 항체를 생성하는 전략은 초기에 XenoMouse 마우스를 항원의 조합 (펩타이드, 다양한 가용성 단백질, 항원-발현 세포)으로 면역화한 다음, 하이브리도마를 생산하는 융합을 통해서와 같이 항체 생산 세포를 분리하거나, XenoMaxTM/SLAMTM 기술을 통해 B 세포를 분리하는 것을 포함하였다. 항체를 생산하는 세포를 ELISA에 의해 특이성을 1차 스크리닝하고, FMAT 및/또는 FACS에 의해 세포 표면 결합을 2차 스크리닝하였다. 이후, 약물 전달에 유용할 항체를 확인하기 위해 내면화 분석을 수행하였다. 항체의 친화도를 측정하였다. 에피토프 맵핑을 위해 임의의 항체를 선택하였다. 또한, 암 치료를 위한 상기 항체의 효능을 분석하는 시험관내 및 생체내 시험에 대해 임의의 항체를 선택하였다.
실시예 1
항원 제조
A. EGFRv Ⅲ PEP3 - KLH 항원 제조
실시예 2와 관련하여, 14-머 인간 EGFRvⅢ PEP3 (L E E K K G N Y V V T D H C (서열번호: 56)) 펩타이드를 R&D 시스템에 의해 주문 합성하였다. 그리고 나서, PEP3 펩타이드를 하기와 같이 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH)에 컨주게이트하였다: EGFRvⅢ PEP3 (200 mcg) (R&D)를 50 mcg의 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH; Pierce, Rockford, IL)과 혼합하고 증류수를 사용하여 165 mcl의 최종 용적으로 맞추었다. 250 mcl의 컨주게이션 완충액 (0.1M MES, 0.9M NaCl, pH 4.7)을 부가하고 25 mcl의 10 mg/ml 모액의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이마이드 하이드로클로라이드 (EDC, Pierce, Rockford, Il)를 부가하여 EGFRvⅢ PEP3 및 KLH를 가교결합하였다. 컨주게이트를 실온에서 2시간 동안 배양하고 미반응된 EDC를 PBS pH 7.4를 이용한 1 kDa 필터 (원심 필터; 밀리포어, Bedford, MA)를 통해 원심분리하여 제거하였다.
실시예 3과 관련하여, 14-머 인간 EGFRvⅢ PEP3 (L E E K K G N Y V V T D H C (서열번호: 56)) 펩타이드를 주문 합성하였다. PEP3 펩타이드를 이후 하기와 같이 KLH에 컨주게이트하였다: 인간 EGFRvⅢ PEP3 (200 mcg)를 50 mcg의 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 (KLH; Pierce, Rockford, IL)과 혼합하고 증류수를 이용하여 165 mcl의 최종 용적으로 맞추었다. 250 mcl의 컨주게이션 완충액 (0.1M MES, 0.9M NaCl, pH 4.7)을 부가하고 25 mcl의 10 mg/ml 모액의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이마이드 하이드로클로라이드 (EDC, Pierce, Rockford, Il)를 부가하여 EGFRvⅢ PEP3 및 KLH를 가교결합하였다. 컨주게이트를 실온에서 2시간 동안 배양하고 미반응된 EDC를 PBS pH 7.4를 이용한 1 kDa 필터 (원심 필터; 밀리포어, Bedford, MA)를 통해 원심분리하여 제거하였다.
B. B300.19/ EGFRv Ⅲ 형질감염체
B300.19/EGFRvⅢ 형질감염체를 제조하기 위해, 야생형 EGFR을 A431 세포로부터 초기에 클로닝하고 EGFR 유전자를 결실의 접합에서 생성된 글리신 잔기를 인코딩하는 코돈으로 잔기 6-273을 인코딩하는 코돈을 결실시키기 위해 EGFRvⅢ을 코딩하도록 변형시켰다. 상기 결실은 결실 후 수득한 코돈이 GGT (글리신)가 되도록, 결실 GTT (발린) 및 CGT (아르기닌) 주위의 코돈 내에서 발생한다. (Wikstrand 등 J Neurovirol. 4(2):148-58 (1998))
1. 야생형 EGFR 구성체 의 클로닝:
PolyA+mRNA를 Micro-fast RNA 키트 (Invitrogen, Burlington, ON)를 이용하여 A431 (ATCC) 세포로부터 추출하였다. 총 cDNA를 무작위 pdN6 프라이머 및 M-MuLV 역전사효소 (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.)를 이용하여 polyA+ mRNA로부터 합성하였다. 2.3kb PCR 생성물을 Pfu DNA 폴리머라제를 이용하여 하기 프라이머로 A431 cDNA로부터 증폭시켰다:
센스 5'-GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3'; (서열번호: 62)
안티-센스 5'-CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3' (서열번호: 63)
Pfu DNA 폴리머라제를 사용하여.
PCR 산물을 XhoI로 절단하고, 겔 정제하고 XhoI로 선형화된 플라스미드 pWBFNP (참고 국제 특허 출원 번호 WO 99/45031, 그의 개시내용은 참조로 본원에 포함되어 있음)로 라이게이션하여 플라스미드 Wt-EGFR/pWBFNP를 생성하였다.
2. EGFRvⅢ 구성체 의 생성:
PCR 생성물을 프라이머 쌍 C13659/C29538 및 C29539/C14288 (BioSource International)을 이용하여 플라스미드 Wt-EGFR/pWBFNP 주형으로부터 증폭시켰고, 여기서 상기 C29538 및 C29539는 T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제로 인산화되었다 (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.):
C13659: 5'-CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3'(센스) (서열번호: 64);
C29538: 5'-CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3'(안티센스) (서열번호: 65);
C29539: 5'-GTAATTATGTGGTGACAGATC-3'(센스) (서열번호: 66);
C14288:5'-CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3'(안티센스) (서열번호: 67).
EGFR 세포외 도메인의 아미노산 6 내지 273을 인코딩하는 서열 내에 결실을 도입하기 위해 이들을 라이게이션하고 발현 벡터 pWBDHFR2 내로 서브클로닝하였다 (참고 국제 특허 출원 번호 WO 99/45031, 그의 개시내용은 참조로 본원에 포함되어 있음).
상기 결실의 5' 말단을 대표하는 232 bp 단편을 Pfu 폴리머라제 (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.)로 증폭된 Wt-EGFR/pWBFNP 주형으로부터 프라이머 쌍 C13659/C29538을 이용하여 생성하였다. PCR 생성물을 EcoR1 (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.)로 절단하고 겔 정제하였다. 상기 결실의 3' 말단을 대표하는 1273 bp 단편을 Pfu 폴리머라제로 증폭된 Wt-EGFR/pWBFNP 주형으로부터 프라이머 쌍 C29539/C14288을 이용하여 생성하였다. PCR 생성물을 Xho1 (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.)로 절단하고 겔 정제하였다. 단편을 T4 DNA 리가제를 이용하여 EcoR1/Xho1 절단된 pWBDHFR2 (NEB, New England Biolabs, Beverly, Mass.) 내로 라이게이션하여 구성체 EGFRvⅢ/pWBDHFR을 생성하였다.
EGFR의 세포내 도메인을 하기와 같이 수득한 구성체 내로 도입하였다: 1566bp DraⅢ/XhoI 단편을 플라스미드 Wt-EGFR/pWBFNP로부터 분리하고 DraⅢ/XhoI 절단된 EGFRvⅢ/pWBDHFR 내로 라이게이션하여 EGFRvⅢ-FL/pWBDHFR을 생성하였다.
3. EGFRvⅢ - FL / pWBDHFR 를 이용한 B300.19 세포의 형질감염:
700 μl DMEM/HI 배지에서의 형질감염마다 B300.19 세포 (8x106)를 사용하였다. 20 μg EGFRvⅢ-FL/pWBDHFR 및 2 μg CMV-Puro 플라스미드 DNA를 첨가하였다. 세포를 Bio-Rad 유전자 펄서를 이용하여 300 볼트/960uF에서 전기천공하였다. 전기천공 후, 세포를 얼음 위에서 10분간 냉각하고, 이후에 10 ml 비-선택 배지 (DMEM/HI 글루코스, 10% FBS, 50 μM BME, 2mM L-글루타민, 100 단위 페니실린-G/ml, 100 units MCG 스트렙토마이신/ml)을 첨가하였다. 세포를 37 ℃ 7.5% CO2에서 48시간 동안 배양하였다.
배양 후, 세포를 96 웰 플레이트에서 2x104, 0.4x104, 및 0.08x104 세포/ 웰로 선택 배지 (DMEM/HI 글루코스, 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 50 μM BME, 100 단위 페니실린-G/ml, 100 units MCG 스트렙토마이신/ml, 2ug/ml 퓨로마이신)에 나누고 14일 동안 선택 배지에서 선택하여 안정한 클론을 생성하였다. Puro 내성 클론을 E752 mAb (문헌[Yang 등, Crit Rev Oncol Hematol., 38(1):17-23 (2001)]에 기재된 항-EGFR 항체)로 염색한 다음, 염소 항-인간 IgG PE를 FACS Vantage (Becton Dickinson) 상에서 분석하였다.
C. EGFRv Ⅲ- RbFc 발현 구성체의 제작.
EGFRvⅢ 토끼 Fc 융합 단백질을 생성하기 위해, 본 발명자들은 먼저 토끼 Fc를 인코딩하는 DNA를 함유하는 벡터를 구성하였다. 이것을 EGFRvⅢ을 인코딩하는 DNA와 라이게이션하였다. 이 접근법은 하기에 더 상세히 기재되어 있다:
1. RbFc / pcDNA3 .1 Hygro 의 제작:
프라이머 1322/867 (하기)을 사용하여 토끼 IgG의 힌지-CH2-CH3 도메인을 인코딩하는 721bp 단편을 증폭시켰다.
#1322 (센스): 5'-GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3' (서열번호: 68)
#867 (안티센스): 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3' (서열번호: 69)
수득한 PCR 생성물을 KpnI 및 NotI로 절단하고, 겔 정제하고, KpnI/NotI 절단된 pcDNA3.1(+)/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON) 내로 라이게이션하여 플라스미드 RbFc/pcDNA3.1 Hygro를 생성하였다.
2. EGFRvⅢ - RbFc / pCEP4 의 제작:
프라이머 1290/1293 (하기)을 사용하여 Pfu 폴리머라제를 이용하여 EGFRvⅢ-FL/pWBDHFR 플라스미드 주형으로부터 1165bp 생성물을 증폭시켰다.
#1290 (센스): 5'-CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3' (서열번호: 70)
#1293 (안티센스): 5'-CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3' (서열번호: 71)
PCR 생성물을 NheI 및 KpnI으로 절단하고, 겔 정제하고, NheI/KpnI 절단된 RbFc/pcDNA3.1 Hygro 내로 라이게이션하여 플라스미드 EGFRvⅢ-RbFc/pcDNA3.1Hygro를 생성하였다.
2170 bp SnaBI/XhoI 단편을 EGFRvⅢ-RbFc/pcDNA3.1Hygro로부터 분리하고 SnaBI/XhoI 절단된 pCEP4 (Invitrogen, Burlington, ON) 내로 서브클로닝하여 플라스미드 EGFRvⅢ-RbFc/pCEP4를 생성하였다.
3. 293F EGFRvⅢ - RbFc 안정한 세포주의 생성:
플라스미드 EGFRvⅢ-RbFc/pCEP4를 하기와 같이 칼슘 포스페이트 형질감염에 의해 293F 세포 (Gibco, Grand Island, NY) 내로 도입하였다: 형질감염 1일 전, 1x106 293F 세포를 젤라틴 코팅된 100mm 조직 배양 패트리디쉬 상에 도말하고 5% CO2, 37 ℃에서 배양하였다. 세포에 형질감염 2-3시간 전에 10ml의 신선한 비-선택적 배지 (DMEM/F12, 10% FBS, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린 G, 100U/ml MCG 스트렙토마이신)를 공급하였다. 형질감염 시약을 하기와 같이 마이크로원심분리기 튜브에서 제조하였다: 10μg의 DNA (EGFRvⅢ-RbFc/pCEP4)를 62μl의 2M 칼슘 포스페이트 및 탈이온수와 혼합하여 최종 용적 500μl를 만들었다. 또 하나의 튜브 피펫 내에, 500μl의 2XHBS를 뽑아내어 형질감염 시약을 옮기는 사용한다.
튜브 피펫 내의 용액을 세포에 한 방울씩 첨가하면서, 형질감염이 수행될 때까지 5% CO2 배양기에 세포를 남겨둥므오써 적절한 pH를 유지시켰다. 형질감염 15-20시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 10ml의 신선한 293F 비-선택적 배지를 공급하였다. 형질감염 48-72시간 후 발현 세포를 트립신으로 수확하고, 세포를 14일간 293F 선택적 배지 (DMEM/F12, 10% FBS, 2mM L-글루타민, 100U/ml 페니실린 G, 100U/ml MCG 스트렙토마이신, 250ug/ml 하이그로마이신) 중에서 96 웰 플레이트에 0.08x104 세포/웰로 도말하였다.
하이그로마이신 내성 클론을 1ug/ml의 포획 항체로서 항-EGFR 항체 E763 (US 특허 번호 6,235,883)을 이용하고 1:100 희석으로 염소 항-토끼 IgG HRPO (CalTag)를 이용하여 검출하는 ELISA에 의해 스크리닝하였다.
D. 말레이마이드 컨주게이션을 통한 EGFRv Ⅲ PEP3 의 OVA 에 대한 컨주게이션
항체의 적정을 위해 사용된 EGFRvⅢ 펩타이드-OVA (실시예 3)를 하기와 같이 생산하였다:
207 μg의 EGFRvⅢ PEP3를 Pierce사의 전-계체된 DTT (#20291)를 이용하여 환원시켰다. 7.7mg의 전-계체된 DTT 1 바이알을 100 μl의 탈이온화된 물을 이용하여 용해시켰다. DTT 스톡을 EGFRvⅢ PEP3에 첨가하였다. 반응 부피를 PBS pH 7.4를 사용하여 600 μL로 맞추었다. 상기 반응을 실온에서 30분간 회전시켰다.
G10 칼럼을 5 그램의 G10 세파덱스 비드를 칭량하고 40 mL의 PBS를 첨가하고, 혼합하고 실온에서 10분간 방치한 다음, 1000 rpm에서 10분간 비드를 원심분리함으로써 제조하였다. 상청액을 제거하고 추가적 20 mL의 PBS를 첨가하였다. 비드를 1000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 충분한 PBS 첨가하여 G10 세파덱스 비드의 50% 슬러리를 만들었다. 5 mL의 50% 슬러리 혼합물을 5mL 스핀 칼럼에 첨가하고 상기 칼럼을 14mL 폴리프로필렌 튜브 내에 두었다. 칼럼을 1000 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 또 다른 3 mL의 PBS를 첨가하고, 칼럼을 1000 rpm에서 3분간 다시 원심분리하였다. 폴리프로필렌 튜브를 새 튜브로 바꾸었고, 칼럼은 이제 사용될 준비가 되었다.
DTT를 상기 환원된 펩타이드로부터 제거하였다. 펩타이드를 환원시키기 위한 30분 반응시간 후, 300 μl의 환원된 펩타이드를 칼럼마다 첨가하였다. 칼럼을 1000rpm에서 3분간 원심분리하였다. 추가적인 250 μl의 PBS를 각 칼럼에 첨가하고, 1000 rpm에서 3분간 다시 원심분리하였다. 환원된 펩타이드를 14 mL 폴리프로필렌 튜브에서 수집하였다.
환원된 펩타이드를 말레이마이드 활성화된 OVA에 컨주게이트하고 에펜도르프 튜브에서 수집하였다. 2 mg의 말레이마이드 활성화된 OVA를 말레이마이드 컨주게이션 완충액를 이용하여 용해시켜(Pierce: 77126, Rockford IL) 10 mg/mL 스톡을 만들었다. 414 μg의 the 말레이마이드 활성화된 OVA를 에펜도르프 튜브 내의 환원된 펩타이드에 첨가하였다. 500 μl의 말레이마이드 컨주게이션 완충액을 상기 반응에 첨가하였다. 상기 반응을 실온에서 2시간 동안 배양시킨 한 다음 2mg의 시스테인을 첨가하여 존재할 지 모르는 임의의 활성 말레이마이드 그룹을 소거하였다. 시스테인을 실온에서 추가 30분간 반응시켰다. 그리고 나서, 컨주게이트를 1X PBS pH 7.4를 이용하여 10K 원심 칼럼으로 3회 세척하였다. 이는 OVA 및 자유 시스테인에 컨주게이트하지 않은 임의의 자유 펩타이드를 제거하였다. 겔 로딩 팁을 이용하여 원심 칼럼으로부터 컨주게이트를 제거하고 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 마지막으로, 컨주게이트를 1X PBS pH 7.4를 이용하여 원하는 농도에 맞추었다. 생산된 컨주게이트는 생산된 14.5:1 (펩타이드:OVA)의 몰비를 가지고 있었다.
실시예 2
하이브리도마 생성을 통한 항- EGFRv Ⅲ 항체의 생산
감마-1 불변 영역을 갖는 항체를 생산하는 8마리의 XenoMouse 마우스 (XenoMouse G1 mice)를 0일째에 면역화시키고 이 프로토콜을 위해 11, 21, 32, 44 및 54일에 증강시키고 58일째에 융합을 수행하였다. 모든 면역화는 모든 주사의 경우 꼬리 하단에서의 피하 투여 및 복강내 투여를 통해 수행하였다. 완전한 프로인트 아쥬반트 (CFA) (Sigma, St. Louis, MO)와 1:1 v/v 혼합된 발열물질이 없는 DPBS 중에 현탁된 1.5 x 107 B300.19/EGFRvⅢ 형질감염된 세포 (실시예 1A)를 이용하여 0일째 면역화를 수행하였다. 불완전한 프로인트 아쥬반트 (IFA) (Sigma, St. Louis, MO)와 1:1 v/v 혼합된 DPBS에서 1.5 x 107 B300.19/EGFRvⅢ 형질감염된 세포를 이용하여 11, 21, 및 32일째 증강을 수행하였다. IFA와 1:1 v/v 혼합된 DPBS에서 5 μg의 PEP3 (EGFRvⅢ 펩타이드) - KLH 컨주게이트 (실시예 1)를 이용하여 44일째 증강을 수행하고 54일째에, 아쥬반트 없는 DPBS에서 5ug PEP3 (EGFRvⅢ 펩타이드) - KLH 컨주게이트를 이용하여 최종 증강을 수행하였다.
58일째에, 마우스를 안락사시킨 다음, 서혜 및 요추 림프절을 회수하였다. 조직 그라인더를 이용하여 림프절을 기계적 파손시켜 림프구를 방출시킨 다음 CD90 음성 선택에 의해 T 세포를 감손시켰다. 세척된 풍부한 B 세포 및 ATCC, cat. # CRL 1580 (Kearney 등, J. Immunol. 123:1548-1550 (1979))로부터 구입한 비-분비성 골수종 P3X63Ag8.653 세포를 1:1의 비율로 혼합함으로써 융합을 수행하였다. 상기 세포 혼합물을 800 g에서 원심분리하여 부드럽게 펠렛화하였다. 상청액을 완전히 제거한 후, 세포를 2분 이하로 2-4 mL의 프로나아제 용액 (CalBiochem, cat. # 53702; PBS 중 0.5 mg/ml)으로 처리하였다. 그리고 나서, 3-5 mL의 FBS를 첨가하여 효소 활성을 정지시키고 현탁액을 전기 세포 융합 용액, ECFS (0.3M 수크로오스, Sigma, Cat# S7903, 0.1mM 마그네슘 아세테이트, Sigma, Cat# M2545, 0.1 mM 칼슘 아세테이트, Sigma, Cat# C4705 (St. Louis, MO))를 이용하여 40 ml 총 부피로 조정하였다.
원심분리 후 상청액을 제거하고 세포를 40 ml ECFS에서 재현탁시켜 세척하였다. 이 세척 단계를 반복하고, 세포를 2x106 세포/ml의 농도까지 ECFS에 다시 재현탁시켰다. 융합 발전기(모델 ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA)를 사용하여 전기-세포 융합을 수행하였다. 사용된 융합 챔버 크기는 2.0 ml였고, 하기 기기 셋팅을 이용하였다: 정렬 조건: 전압: 50 v, 시간: 50 s, 막 브레이킹: 전압: 3000 v, 시간: 30 μ초, 후-융합 유지 시간: 3 s. 융합 후, 세포를 37 ℃ 및 공기 중에 10% CO2에서 배양하기 위해, HAT를 함유하고, L-글루타민, pen/strep, OPI (옥살로아세테이트, 피루베이트, 소 인슐린) (Sigma, St. Louis, MO) 및 IL-6 (Boehringer Mannheim)가 보충된, DMEM (JRH Biosciences), 15% FCS (Hyclone)에 재현탁시켰다.
세포를 4x104 세포/웰로 편평한 바닥 96-웰 조직 배양판에 도말하였다. 배양물을 HT (하이포잔틴 및 티미딘) 보강 배지로 옮기기 전 2주간 HAT (하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘) 보강 배지에 유지시켰다. HAT 배지에서의 생존에 의해 하이브리도마를 선발하고 상청액을 대상으로 ELISA에 의해 항원 반응성을 스크리닝하였다. ELISA 포맷은 항원 코팅된 플레이트 (EGFRvⅢ 펩타이드-OVA 코팅된 플레이트 및 카운터 스크린으로서 야생형 EGFr 펩타이드-OVA 코팅된 플레이트) 상에서 상청액을 배양하고 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP) 라벨링된 마우스 항-인간 IgG (참고 표 2.1)를 이용하여 EGFRvⅢ-특이적 결합을 검출하는 것을 수반하였다.
표 2.1
Figure pct00001
관찰될 바와 같이, 적어도 4개의 항원 특이적 하이브리도마가 검출되었다: 13.1, 13.2, 13.3, 및 13.4. ELISA 검정 EGFRvⅢ 특이성에서 양성이었던 이들 하이브로도마들은 EGFRvⅢ을 발현하는 안정적으로 형질감염된 300.19 세포 대 300.19 형질감염되지 않은 모 세포에 대한 FACS에 의해 확인되었다.
제한된 희석 플레이팅을 이용하여 선택된 항원-양성 웰들에 대해 클로닝을 수행하였다. 플레이트에 대해 단일 콜로니 성장의 존재를 시각적으로 검사한 다음, 하고 및 상청액 from 단일 콜로니 웰들로부터의 상청액을 상기 기재된 바와 같이 항원-특이적 ELISA 및 FACS 확인에 의해 스크리닝하였다. 루미넥스 기기를 이용한 다중x ELISA에 의해 인간 감마 및 카파 사슬의 순도를 확인하기 위해 반응성이 높은 클론을 분석하였다. ELISA 및 FACS 분석에서의 EGFRvⅢ 특이성에 기초하여, 클론 13.1.2가 추가 스크리닝 및 분석을 위한 가장 유망한 후보로서 선택되었다. 13.1.2 항체의 중쇄 및 경쇄의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열이 도 3l에 나타나 있고 중쇄 및 경쇄 핵산의 경우 서열번호: 137 및 139이고 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 경우 138이고 140이다. 또한, 13.1.2 중쇄 및 경쇄 서열과 이들이 유래된 생식계열 서열과의 비교가 도 4 및 5에 나타나 있다.
실시예 3
XenoMax 기술의 사용을 통한 항체 생성
XenoMouse 동물의 면역화
감마-1 불변 영역을 갖는 항체를 생산하는 XenoMouse 마우스 (XenoMouse G1 mice), 감마-2 불변 영역을 갖는 항체를 생산하는 XenoMouse 마우스 (XenoMouse XMG2 mice), 및 감마-4 불변 영역을 갖는 항체를 생산하는 XenoMouse 마우스 (XenoMouse G4 mice)를 순차적으로 면역화함으로써 인간 EGFRvⅢ에 대한 인간 모노클론 항체를 개발하였다.
XenoMax 기술을 통해 mAb를 생성하기 위해, XenoMouse G1 및 XMG2 마우스의 집단을 EGFRvⅢ PEP3 (실시예 1A) 및 EGFRvⅢ-발현 300.19 세포 (실시예 1B) 또는 박테리아에서 발현된 EGFRvⅢ 단백질의 세포외 도메인 (EGFRvⅢ-ECD) (Dr. Bigner, Duke University) 및 EGFRvⅢ-발현 300.19 세포 또는 EGFRvⅢ-토끼 Fc 융합 단백질 (EGFRvⅢ-RbFc) (실시예 1C) 및 EGFRvⅢ-발현 300.19 세포 또는 풋 패드 (FP)만을 통해서 EGFRvⅢ-RbFc, 또는 피하 주사 및 복막내 (BIP)에 의한 꼬리의 하단을 통해 면역화시켰다.
발바닥 면역화를 위해, 초기 면역화는 마우스마다 10 X 106 EGFRvⅢ-발현 300.19 세포를 이용하거나 상기 세포없이 그리고 Titermax 금 (Sigma, Oakville, ON)과 1:1 v/v 혼합된 10 μg의 EGFRvⅢ PEP3 또는 EGFRvⅢ-ECD 또는 EGFRvⅢ-RbFc를 이용하거나 없이 수행하였다. 초기 면역화에서 사용된 면역원의 양의 절반을 이용하여 이후 증강을 수행하였다. 하기 표 3.1에 나타난 바와 같이 마우스마다 밤새 흡수된 명반 (Sigma, Oakville, ON)과 혼합된 면역원을 취함으로써 처음 4번의 증강을 수행되었다. 이것 이후에, 표 3.1에 나타난 바와 같이 Titermax gold에서의 각각의 면역원을 이용한 1번의 주사, 명반을 이용한 1번의 주사 및 다음으로 PBS 중의 면역원의 최종 증강을 수행하였다. 특히, 동물을 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 및 24일에 면역화하였다. 19일째에 동물을 채혈하여 혈청을 얻고 수확 선택을 위해 역가를 결정하였다. 동물을 28일째에 수확하였다.
표 3.1
발바닥 면역화 계획
Figure pct00002
발바닥 면역화에 대해 기재된 바와 같이, 각 면역원을 이용한 초기 BIP 면역화를 마우스마다 완전한 프루이드 아쥬반트 (CFA, Sigma, Oakville, ON)와 1:1 v/v 혼합하였다. 마우스마다 불완전한 프루이드 아쥬반트 (IFA, Sigma, Oakville, ON)와 1:1 v/v 혼합된 각각의 면역원을 이용하여 차후 증강을 먼저 수행한 다음, 마우스마다 PBS에서 최종 증강을 수행하였다. 동물을 하기 표 3.2에서 나타난 바와 같이 0, 14, 28, 42, 56일, 및 75일 (최종 증강)에 면역화시켰다. 동물을 63일째에 채혈하여 혈청을 얻고 수확 선택을 위한 역가를 결정하였다. 동물을 78일에 수확하였다.
표 3.2
Bip 면역화 계획
Figure pct00003
역가 결정에 의한 수확을 위한 동물의 선발
항-hEGFRvⅢ 항체 역가를 ELISA에 의해 결정하였다. EGFRvⅢ-RbFc (2.5 μg/ml) 또는 대조군 RbFc (2 μg/ml) 또는 EGFRvⅢ펩타이드-OVA (2 μg/ml) (실시예 1) 또는 대조군 OVA (4 μg/ml)를 Costar Labcoat Universal Binding 폴리스티렌 96-웰 플레이트 (Corning, Acton, MA) 상에서 4도에서 밤새 코팅하였다. 결합하지 않은 항원을 함유하는 용액을 제거하고 플레이트를 4분간 (4000 마이크로줄) UV 광 (365nm)으로 처리하였다. 플레이트를 dH2O로 5회 세척하였다. EGFRvⅢ 면역화된 XenoMouse® 동물, 또는 미처리 XenoMouse® 동물의 혈청을, 1:100 초기 희석으로부터 2반복으로 1:2 희석으로 2% 우유/PBS에서 적정하였다. 마지막 웰은 블랭크로 남겨두었다. 플레이트를 dH2O로 5회 세척하였다. 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP, Pierce, Rockford, IL) 컨주게이트된 항체를 실온에서 1시간 동안 1 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 플레이트를 dH2O로 5회 세척하였다. TMB 색원체 기질 (Gaithersburg, MD)을 30분간 첨가하여 플레이트를 현상하고 1 M 인산을 첨가하여 ELISA를 정지시켰다. 450 nm에서의 광학 밀도로부터 개별적인 XenoMouse® 동물의 특이적 역가를 결정하였고, 이는 표 3.3 및 3.4에 나타나 있다. 상기 역가는 혈청의 상호 희석을 나타내며 따라서 수치가 더 높을수록 hEGFRvⅢ에 대한 체액성 면역 반응이 더 크다.
피하 주사 및 복막내에 의해 꼬리의 하단을 통해 면역화된 마우스의 경우, 역가는 플레이트가 EGFRvⅢ-RbFc (2.0 μg/ml) 또는 대조군 RbFc (2.5 μg/ml)로 코팅된 것을 제외하고 상기와 같이 정확하게 결정되었다.
표 3.3
Figure pct00004
Figure pct00005
표 3.3으로부터의 그룹 5의 XenoMouse 동물 및 그룹 6의 XenoMouse 동물 0743-5 모두를 혈청학에 기초한 XenoMax 수확을 위해 선택하였다.
표 3.4
Figure pct00006
Figure pct00007
XenoMouse 동물 (0695-1, 0695-3 및 0695-4)을 표 3.4 내의 혈청학 데이터에 기초하여 수확을 위해 선택하였다.
B 세포의 선택.
상기-논의된 동물로부터의 B-세포를 수확하고 배양하였다. EGFRvⅢ-펩타이드 특이적 항체를 분비하는 것을 문헌[Babcook 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 93:7843-7848 (1996)]에 기재된 대로 분리하였다. ELISA를 사용하여 일차 EGFRvⅢ-펩타이드-OVA -특이적 웰을 확인하였다. 약 5백만 개의 B-세포를 500 또는 150 또는 50 세포/웰로 24596 웰 플레이트에서 XenoMouse 동물로부터 배양하고, EGFRvⅢ-펩타이드-OVA 상에서 스크리닝하여 항원-특이적 웰을 확인하였다. 약 515 웰들이 백그라운드 대비 유의한 OD를 나타내었고, 이들의 대표적인 샘플이 표 3.5에 나타나 있다.
표 3.5
Figure pct00008
OD > 0.5의 EGFRvⅢ-펩타이드-OVA-Elisa 양성 웰들 중 244웰을 EGFRvⅢ-펩타이드-OVA 및 OVA 상에서 다시 스크리닝하여 이들이 EGFRvⅢ-펩타이드 특이적인지를 확인하였다. 이들 결과의 대표적인 예가 표 3.6에 나타나 있다.
표 3.6
Figure pct00009
제한된 항원 검정 및 분석
제한된 항원 분석은 모든 다른 항원-특이적 항체와 비교하여 B-세포 배양물 상청액 내에 존재하는 항원-특이적 항체의 친화도를 순위매기는 방법이다. 매우 낮은 코팅의 항원의 존재시, 최고 친화도 항체만이 평형시 임의의 검출가능 수준까지 결합할 것이다. (참고, 예를 들면, 국제 특허 출원 번호 WO 03/48730)
EGFRvⅢ 펩타이드-OVA를 96-웰 Elis플레이트 상에서 40 C에서 밤새 3가지 농도; 7.5 ng/ml, 1.5 ng/ml 및 0.03 ng/ml에서 플레이트에 코팅하였다. 각 플레이트를 dH2O로 5회 세척한 다음, 0.05% 나트륨 아자이드를 갖는 PBS 중에 50ul의 1% 우유를 플레이트에 첨가하고, 그 다음 4 μl의 B 세포 상청액을 각 웰에 첨가하였다. 진탕기 사에서 실온에서 18시간 후, 플레이트를 dH2O로 다시 5회 세척하였다. 각 웰에 1 μg/ml의 50ul의 Gt 항-인간 (Fc)-HRP를 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 dH2O로 다시 5회 세척하고 50 μl의 TMB 기질을 각 웰에 첨가하였다. 각 웰에 50ul의 1M 인산을 첨가하여 반응을 중지시키고 상기 플레이트를 파장 450nm에서 판독하고 이 결과가 표 3.7에 나타나 있다.
표 3.7
Figure pct00010
제한된 항원 분석으로부터 생성된 결과들을 고 항원 검정에서 수득된 총 OD와 비교하였다. 제한된 항원 검정에서 수득된 OD 대 고 항원 검정에서 수득된 OD의 비율을 취함으로써 친화도의 상대적 순위를 수행하였다. 더 높은 비율을 갖는 항체가 가장 높은 친화도를 가질 것이다. 표 3.7은 제한된 항원 검정 OD (0.03 ng/ml의 최저 항원 도말 농도의 경우) 대 높은 항원 검정 OD에 기초하여 순위를 매긴 B-세포 배양물 상청액의 샘플을 보여준다.
FMAT 에 의한 원상태 세포 결합 검정
EGFRvⅢ 펩타이드-OVA-Elisa 양성 웰 상청액을 대상으로 NR6 세포 (NR6 M 세포) 상에서 안정되게 발현된 EGFRvⅢ의 원상태 형태에 결합하는 그의 능력을 분석하였다 (참고, Batra 등 Epidermal growth factor ligand-independent, unregulated, cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvⅢ gene. Cell Growth Differ. 6(10):1251-9 (1995)). NR 6 M 세포를 8000 세포/웰로 시딩하고 96 웰 FMAT 플레이트에서 밤새 배양하였다. 그리고 나서, 웰에 15 μl를 남기고 배지를 제거하였다. 15 μl B-세포 배양물 상청액을 첨가하고 1 μg/ml 최종 농도의 15 μl 항-인간 IgG Fc Cy5를 웰에 첨가하였다. 그리고 나서, 4 ℃에서 2 시간 동안 배양되게 하였다. 세포를 150 μl PBS로 세척하고, 고정한 다음 FMAT 상에서 판독하였다. 결과를 총 형광 세기로서 표시하였다 (표 3.8). 인간 항-EGFRvⅢ mAb 13.1.2를 1 μg/ml 최종 농도에서 출발하는 양성 대조군으로서 사용하였고 음성 대조군은 동일한 농도에서 PK 16.3.1이었다. 시험된 244개 샘플 중 134개가 NR6M 세포에 결합하였고, 이 중 62개가 8000을 초과하는 총 형광을 가지고 있었다. 이들 134 바인더 중 6개가 허위양성이었다.
Wt 수용체에 결합한 것으로 인한 결합을 제거하기 위해, 동일한 유형의 원상태 결합 검정을 NR6 Wt 세포 (EGF 수용체를 발현하는 NR6 세포) 상에서 수행하였다 (Batra 등 Epidermal growth factor ligand-independent, unregulated, cell-transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvⅢ gene. Cell Growth Differ. 6(10):1251-9 (1995)) (표 3.8). ABX-EGF를 양성 대조군으로서 사용하였고 동일한 농도의 PK 16.3.1을 음성 대조군 항체로서 사용하였다. 134 NR6 M 바인더 중 3개가 NR6 Wt 세포에 강하여 결합하고 있었다. Elisa에서 EGFRvⅢ 펩타이드에 결합된 244 웰 중 190개가 세포 상의 천연형에 또한 결합하였다. 예가 표 3.8에 제시되어 있다.
표 3.8
Figure pct00011
표 3.8에서, 웰 187A4로부터의 상청액이 Wt 바인더로서 확인되고 141C6은 NR6 M 세포 결합에 대해 허위 양성이었다. 웰들 129H6 및 183E11은 원상태 결합이 없는 강한 펩타이드 바인더이다.
내재화 검정
상위 60 원상태 결합 B 세포 배양물 상청액을 대상으로 수용체를 내재화하는 능력을 추가로 검정하였다. NR6 M 세포를 96 웰 FMAT 플레이트 내로 8000 세포/웰로 시딩하고 밤새 배양하였다. 배지를 제거하고 30 μl 배지의 총 부피로 10-15 μl B-세포 배양물 상청액을 반복하여 첨가하였다. 다음으로, 15 μl의 2차 항체 (1.5 μg/ml 최종 농도의 SS Alexa 647 항-인간 IgG Fab)를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 얼음 상에서 배양하였다. 배양 배지의 효과를 살펴보기 위하여 무관한 B-세포 배양물 상청액을 사용하였다. 인간 항-EGFRvⅢ mAb 13.2.1을 1 μg/ml (최종 농도)에서 출발하는 양성 대조군으로서 사용하였고 음성 대조군은 동일한 농도의 PK 16.3.1 (인간 항-KLH IgG2 항체)이었다. 배양 후, 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 50 μl 배지를 모든 웰에 첨가하고, 둘 중 하나를 37 ℃에서 30분간 배양하면서 다른 것은 얼음에 남겨두었다. 배양 후, 배지를 제거하고, 100ul의 차가운 50 mM 글루타티온을 첨가하여 37 ℃에서 배양된 세트에 첨가하고, 100 μl의 차가운 배지를 다른 세트에 첨가하였고, 이후 두 세트는 얼음 위에서 1시간 동안 두었다. 그리고 나서 세포를 100 μl 차가운 PBS로 세척한 다음 1% 파라포름알데하이드로 고정시키고 FMAT에서 판독하였다. 결과를 글루타티온 X 100의 부재시 글루타티온/ 총 형광의 존재시 총 형광으로서 계산된, % 내면화된 것으로서 표시하였다. 대표적인 정보가 표 3.9에 제시되어 있다.
표 3.9
Figure pct00012
EGFRvⅢ-특이적 용혈 플라크 검정
수많은 특수 시약이 이 검정을 수행하는데 필요하다. 이들 시약은 하기와 같이 제조된다.
1. 양 적혈구 세포 ( SRBC )의 바이오틴화 ( SRBC ). SRBC를 25% 스톡으로서 RPMI 배지에서 보관하였다. 1.0 mL의 SRBC를 새로운 에펜도르프 튜브에 분취함으로써 250 μl SRBC 충전-세포 펠렛을 수득하였다. SRBC를 마이크로원심분리기에서 8000 rpm (6800 rcf)에서의 충격 스핀으로 펠렛화하고, 상청액을 빼내고, 펠렛을 pH 8.6의 1.0 ml PBS에 재현탁하고, 원심분리를 반복하였다. 상기 세척 주기를 2회 반복한 다음, SRBC 펠렛을 15-ml 팔콘 튜브로 옮기고 PBS pH 8.6으로 5 ml로 만들었다. 별도의 50 ml 팔콘 튜브에서, 45 mL의 PBS pH 8.6에 2.5 mg의 설포-NHS 바이오틴을 첨가하였다. 바이오틴이 완전히 용해되면, 5 mL의 SRBC를 첨가하고, 튜브를 RT에서 1시간 동안 회전시켰다. SRBC를 3000rpm에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 빼내었다. 바이오틴화된 SRBC를 에펜도르프 튜브로 옮기고 PBS pH 7.4를 이용하는 것을 제외하고 상기와 같이 3회 세척한 다음, 15 ml 팔콘 튜브 (5% B-SRBC stock)에서 면역 세포 배지 (RPMI 1640)로 최대 5 ml을 만들었다. 스톡을 필요할 때까지 4 ℃에서 보관하였다.
2. B- SRBC 의 스트렙타비딘 ( SA ) 코팅. 1 mL의 5% B-SRBC 스톡을 새로운 에펜도르프 튜브 내로 옮겼다. B-SRBC 세포를 상기와 같이 3회 세척하고 pH 7.4의 1.0 mL의 PBS에 재현탁시켜 최종 농도 5% (v/v)를 얻었다. 10 μl의 10 mg/ml 스트렙타비딘 (CalBiochem, San Diego, CA) 스톡 용액을 첨가하고, 튜브를 혼합하고 RT에서 20분간 회전시켰다. 상기 세척 단계를 반복하고, SA-SRBC를 1ml PBS pH 7.4 (5% (v/v))에 재현탁하였다.
3. SA - SRBC 의 EGFRvⅢ 코팅. SA-SRBC를 10 μg/ml의 바이오틴화된-EGFRvⅢ펩타이드-OVA로 코팅하고, 혼합하고, RT에서 20분간 회전시켰다. SRBC를 상기와 같이 pH 7.4의 1.0 mL의 PBS로 2회 세척하였다. EGFRvⅢ-코팅된 SRBC를 최종 농도 5% (v/v)로 RPMI (+10%FCS)에 재현탁하였다.
4. 면역형광 ( IF )에 의한 EGFRvⅢ펩타이드 - SRBC 의 품질의 결정. 10 μl의 5% SA-SRBC 및 10 μl의 5% EGFRvⅢ 펩타이드-코팅된 SRBC를 40ul의 PBS를 함유하는 별도의 새로운 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 각각 첨가하였다. 대조군 인간 항-EGFRvⅢ 항체를 45 μg/ml의 SRBC의 각 샘플에 첨가하였다. 튜브를 RT에서 25분간 회전시킨 다음, 세포를 100 μl의 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 50 μl의 PBS에 재현탁하고 Alexa488 (분자 프로브, Eugene, OR)에 컨주게이트된 40 mcg/mL Gt-항 인간 IgG Fc 항체와 함께 배양하였다. 튜브를 RT에서 25분간 회전시킨 다음, 100 μl PBS로 세척하고 세포를 10 μl PBS에 재현탁하였다. 10 μl의 염색된 세포를 깨끗한 유리 마이크로범위 슬라이드 상에 스포팅하고, 유리 커버슬립으로 덮고, 형광 하에서 관찰하고, 0-4의 임의의 등급으로 스코어를 매겼다.
5. 혈장 세포의 제조. 관심있는 면역글로불린을 분비하는 B 세포 클론을 함유하고 것으로 다양한 검정에 의해 앞서 확인된 단일 미세배양 웰의 내용물을 수확하였다. 100-1000 μl 피펫맨을 이용하여, 37C RPMI (10% FCS)를 첨가하여 웰의 내용물을 회수하였다. 세포를 피펫팅에 의해 재현탁시킨 다음, 새로운 1.5 ml 에펜도르프 튜브(최종 부피 약 500-700 μl)로 옮겼다. 세포를 마이크로원심분리기에서 2500 rpm (660 rcf)에서 실온에서 1분간 원심분리한 다음, 튜브를 180도 회전시키고 2500 rpm에서 1분간 다시 회전시켰다. 냉동 배지를 빼내고, 면역 세포를 100 μl RPMI (10% FCS)에 재현탁시킨 다음, 원심분리하였다. RPMI (10% FCS)를 이용한 이 세척을 반복하고, 세포를 60 μl RPMI (10% FCS)에 재현탁하여 사용준비가 될 때까지 얼음에 보관하였다.
6. 혈장 세포의 미세조작. 유리 슬라이드 (2 x 3 inch)를 실리콘 모서리를 이용하여 미리 준비하고 RT에서 밤새 경화시켰다. 사용 전, 슬라이드를 유리 표면 위를 고르게 닦은 대략 5ul의 시그마코트 (Sigma, Oakville, ON)로 처리하고, 건조시킨 다음, 격렬하게 닦았다. 60 μl 세포 샘플에 EGFRvⅢ펩타이드-코팅된 SRBC (5% v/v stock), RPMI (10% FCS)에서 제조된 4x 기니아 피그 보체 (Sigma, Oakville, ON) 스톡, 및 4x 향상 혈청 스톡 (10% FCS를 갖는 RPMI 중에 1:150)의 60 μl 각각을 첨가하였다. 상기 혼합물을 준비된 슬라이드 상에 스포팅(10-15 μl)하고 스폿을 희석되지 않은 파라핀 오일로 덮었다. 슬라이드를 최소 45분 동안 37 ℃에서 배양하였다. EGFRvⅢ-특이적 혈장 세포를 플라크로부터 확인하고 미세조작 (참고 표 3.10)에 의해 레스큐하였다.
표 3.10
Figure pct00013
재조합 항-EGFRvⅢ 항체의 단일 세포 PCR, 클로닝, 발현, 정제 및 특성규명.
가변 영역을 인코딩하는 유전자를 단일 미세조작된 혈장 세포 상에서의 RT-PCR에 의해 레스큐하였다. mRNA를 추출하고, 역전사효소 PCR을 수행하여 cDNA를 생성하였다. 가변 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA를 폴리머라제 사슬 반응을 이용하여 특이적으로 증폭시켰다. 인간 가변 중쇄 영역을 IgG1 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이 벡터는 pcDNA3.1+/Hygro (Invitrogen, Burlington, ON)의 다중 클로닝 부위 내로 인간 IgG1의 불변 도메인을 클로닝하여 생성되었다. 인간 가변 경쇄 영역을 IgK 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 이들 벡터는 pcDNA3.1+/Neo (Invitrogen, Burlington, ON)의 다중 클로닝 부위 내로 인간 IgK의 불변 도메인을 클로닝하여 생성되었다. 그리고 나서, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 60 mm 디쉬의 70% 컨플루언트 인간 배아 신장 293 세포 내로 공동-리포펙션하고 형질감염된 세포가 본래의 혈장 세포와 동일한 특이성을 갖는 재조합 항체를 24-72시간 동안 발현하게 하였다. HEK 293 세포로부터 상청액 (3 mL)을 수확하고 인간 IgG를 특이적으로 검출하는 샌드위치 ELISA로 입증하였다 (표 3.11). ELISA를 이용하여 EGFRvⅢ에 대한 재조합 항체의 결합을 통해 특이성을 평가하였다 (표 3.11).
표 3.11
Figure pct00014
분비 ELISA 시험을 하기와 같이 수행하였다. Ab 분비의 경우, 2 μg/mL의 염소 항-인간 IgG H+L 및 항원 결합의 경우, 1.5 μg/ml of EGFRvⅢ-Rab Ig Fc 융합 단백질을 Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96 웰 플레이트 상에 코팅하고 4도에서 밤새 유지시켰다. 플레이트를 dH2O로 5회 세척하였다. 재조합 항체를 희석되지 않은 미니리포펙션 상청액으로부터의 7 웰들에 대해 1:2로 적정하였다. 플레이트를 dH2O로 5회 세척하였다. 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 HRP-컨주게이트된 항체를 실온에서 1시간 동안 1μg/ml Rb 항 Hu Fc를 이용하여 검출된 분비 플레이트 및 결합 플레이트를 위해 1 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 플레이트를 dH2O로 5회 세척하였다. 30분간 TMB를 첨가하여 플레이트를 현상시키고 1 M 인산을 첨가하여 ELISA를 중지시켰다. 각 ELISA 플레이트를 분석하여 450 nm에서 각 웰의 광학 밀도를 결정하였다.
시퀀싱 및 서열 분석
클로닝된 중쇄 및 경쇄 cDNA를 두 방향으로 시퀀싱하고 분석하여 항체의 생식계열 서열 도출을 결정하고 생식계열 서열로부터의 변화를 확인하였다. 상기 서열들이 도 3a-3k 및 (서열번호: 34-55)에 제공되어 있다. 각각의 중쇄 및 경쇄 서열 및 이들의 유도된 생식계열 서열의 비교가 도 4-7에 제공되어 있다. 또한, 하이브리도마 유도된 13.1.2 항체의 서열을 도 4 및 5에서의 그 생식계열 서열과 비교하였다.
본원에서의 논의로부터 인식될 바와 같이, 각각의 131 항체 및 13.1.2 항체는 EGFRvⅢ에 대해 매우 높은 친화도를 갖고, 세포에 의해 잘 내면화되고, 독소에 컨주게이트되는 경우 세포 사멸에 상당히 효과적인 것으로 보인다. 흥미롭게도, 각각의 항체는, XenoMouse 마우스의 상이한 면역화에서 생성되고, 상이한 기술을 이용함에도 불구하고, 각각 매우 유사한 생식계열 유전자들로부터 유도된다. 그러나, 에피토프 맵핑 작업 (본원에 기재됨)에 기초하여, 각각의 항체는 EGFRvⅢ 분자 상의 약간 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 보이고 결합에 필수적인 EGFRvⅢ 상에 약간 상이한 잔기를 갖는다. 이들 결과는 생식계열 유전자 이용이 EGFRvⅢ를 표적하는 항체 치료제의 생성에 중요하다는 것과 작은 변화가 항체 및 이들 구조 조사결과에 기초한 다른 치료제의 추가 설계를 허용하는 방식으로 항체의 결합 및 효과를 변형시킬 수 있다는 것을 보여준다.
항- EGFRv Ⅲ mAb 의 원상태 EGFRv Ⅲ에 대한 결합이 세포 상에서 발현된다
본 실시예에서, NR6 M 세포에 대한 항-EGFRvⅢ 항체의 결합을 측정하였다. 특이적으로, XenoMax 유도된 IgG1 재조합 항체의 정량화되지 않은 상청액을 대상으로 NR6 M 및 NR6 WT 세포에 결합하는 그의 능력을 분석하였다. 세포를 10000 / 웰로 시딩하고 FMAT 96 웰 플레이트에서 37 C에서 밤새 배양하였다. 배지를 제거하고, 40 μl 미니 리포 상청액 (타이트레이트화된 down)을 첨가하고, 세포를 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 인간 13.1.2 EGFRvⅢ 항체 및 ABX EGF (E7.6.3, 미국 특허 번호 6,235,883) 항체를 양성 대조군으로서 첨가하였다. PK 16.3.1 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 차가운 PBS로 세척하고, 2차 항체 (SS Alexa 항인간 IgG Fc)를 1 μg/ml, 40 μl/웰로 부가하고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 그리고 나서, 세포를 차가운 PBS로 세척하고 고정하고 FMAT에 의해 판독하였다. 모든 항체를 대상으로 NR6 WT 세포에 대한 반대 스크리닝에 의한 결합에 대한 특이성을 시험하였다.
재조합 항- EGFRv Ⅲ 항체의 정제.
대규모 생산을 위해, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터 (2.5 μg의 각 사슬/디쉬)를 HEK 293 세포로 70% 컨플루언트인 10 개의 100 mm 디쉬 내로 리포펙션하였다. 형질감염된 세포를 37℃에서 4일간 배양하고, 상청액 (6 mL)을 수확하고, 6 mL의 신선한 배지로 대체하였다. 7일에, 상청액을 제거하고 초기 수확 (10 플레이트로부터 총 120 mL)으로 모았다. 각 항체를 단백질-A 세파로오스 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 친화성 크로마토그래피 (1 mL)를 이용하여 상청액으로부터 정제하였다. 500 mcl의 0.1 M 글리신 pH 2.5를 이용하여 단백질-A 칼럼으로부터 항체를 용출시켰다. 용출물을 PBS, pH 7.4에서 투석하고 필터-멸균하였다. 항체를 비-환원성 SDS-PAGE에 의해 분석하여 순도 및 수율을 평가하였다. 농도를 또한 OD 250에서 UV 분석에 의해 측정하였다.
재조합 항- EGFRvⅢ mAb 에 의한 EGFRvⅢ 수용체의 내재화
XenoMax 유도된 IgG1 재조합 항체를, 이전에 기재된 바와 같이, 발현하고, 정제하고 정량화하였다. 항체를 대상으로 NR6 M 세포 내에 EGFRvⅢ 수용체를 내재화하는 그 능력을 추가로 분석하였다. 250,000 NR6 M 세포를 삼반복하여 96 웰 v-바닥 플레이트에서 얼음상에서 0.25 μg/ml의 일차 항체 (SC95, SC131, SC133, SC139, SC150, SC170, SC211, SC230, SC250 및 대조군으로서 인간 13.1.2)와 함께 7분간 배양하였다. 세포를 차가운 PBS 중의 10% FCS로 세척하고 3 μg/ml Fab의 2차 항체 (SS Alexa 항인간 IgG Fab)를 첨가하고 얼음 위에서 7분간 배양하였다. 세포를 차가운 PBS 중의 10% FCS로 1회 세척한 다음, 차가운 배지에 재현탁하였다. 다음으로, 상기 삼반복의 2세트를 37 ℃에서 배양하고 잔존 세트를 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 이후, 4 ℃에서 배양된 세포 및 37 ℃에서 배양된 세포의 한 세트를 얼음 위에서 글루타티온 (이전에 언급됨)으로 1시간 동안 처리하였다. 그리고 나서, 세포를 세척하고 100 μl의 차가운 PBS 중의 1% FCS에 재현탁하고 FACS에 의해 분석하였다. % 내재화를 FACS 분석으로부터 수득된 기하학적 평균으로부터 계산하였다 [(글루타티온을 갖는 37 ℃에서의 평균 -글루타티온을 갖는 4 ℃에서의 평균) / (글루타티온 없이 37 ℃에서의 평균 -글루타티온 없이 4 ℃에서의 평균)]. NA는 FACS 분석이 수행되었지만 데이터가 표 3.12에 제공되지 않았음을 의미한다.
표 3.12
Figure pct00015
13.1.2는 이전에 EGFRvⅢ 에피토프에 대해 지향된 하이브리도마 생성 (실시예 2)을 통해 생성된 항체이며 이는 이 실험에서 양성 대조군으로서 사용되었다. 표 3.12에서의 이들 결과는 효율적으로 내면화된 것(70-80%) 및 내면화되지 않은 것 (22% 이하)의 두 서브셋의 존재를 입증한다.
실시예 4
항체 131- DM1 컨주게이션
131 항체의 정제
포유동물 세포 배양물 2936-E 세포에서 일시적으로 발현된 131 항체 (도 8b의 중쇄 및 도 8d의 경쇄를 포함)를 25 mM Tris, 150 mM 나트륨 클로라이드, pH 7.4로 평형화된 MabSelect SuRe 칼럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 이후, 결합된 131 항체를 갖는 항체를 3 세척 단계로 세척하였다: 첫 번째 평형 버퍼 세척 후 25mM Tris, 500 mM L-아르기닌, pH 7.5 세척 및 평형 완충액으로 최종 세척. 131 항체를 100 mM 나트륨 아세테이트, pH 3.5로 용출시켰다. 항체를 함유하는 분획을 모아 1M Tris, pH 8.0으로 5.0의 최종 pH로 조정하였다. 이후, 항체를 컨주게이션 완충액 (2 mM EDTA, 50 mM 나트륨 클로라이드, 50 mM 칼륨 포스페이트, pH 6.5) 내로 투석하였다.
SMCC 를 이용한 131 항체의 변형
정제된 131 항체를 아민 반응성 링커 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC) (Thermo Scientific)로 변형시켜 티올 반응성 말레이마이드 그룹을 도입하였다. 항체를 12 몰 당량의 SMCC로 처리하고 실온에서 90분간 배양하고, 상기 반응 혼합물을 세파덱스 G-25 미세 수지를 함유하는 HiPrep 26/10 탈염 칼럼 (GE Healthcare)으로 탈염시켰다.
SMCC 의 컨주게이션을 DM1 을 갖는 131 항체와 연결하였다
SMCC 변형된 131 항체를 최종 반응 혼합물 중의 3% DMA (v/v)로 조정된, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 35 mM 나트륨 시트레이트, pH 5.0으로 완충된 말레이마이드 그룹당 1.7 몰당량의 DM1 (Immunogen)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 최대 20시간 동안 배양하였다. 상기 반응 혼합물을 20 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM 나트륨 클로라이드, pH 6.5로 평형화된 수퍼덱스 200 겔 여과 칼럼 (GE Healthcare) 상에 로딩하였다. 분획을 수집하고, 단량체성 항체 함유 분획을 모으고 검정하였다. 항체 당 연결된 DM1 분자의 몰비를 252 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였고, 및 상이한 컨주게이션 롯트의 경우 항체 당 3.0-3.5 DM1 분자 내인 것으로 확인되었다.
실시예 5
항체 131- DM1 결합 특이성
EGFR 양성, EGFRvⅢ 음성 A431 세포 및 EGFRvⅢ 양성 U87vⅢ 세포를 분리하고 계수하였다. 1x106 세포를 각 튜브에 첨가하고 세척하였다. FACS 세척 완충액 (PBS, 2% 우태혈청, 0.02% 나트륨 아자이드)을 세포에 첨가한 다음 1800 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상청액을 버려 세포를 세척하였다. 세포를 또한 EGFRvⅢ 또는 대조군 IgG1 항체에 결합하는 일차 항체 항-EGFRvⅢ 항체 (131 항체), 항체 131-DM1 컨주게이트, 항-야생형 EGFR 항체와 4 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 세척한 다음 4 ℃에서 1시간 동안 2차 항체 항-인간 IgG 항체 Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA)와 함께 배양하였다. 세포를 세척하고 FACS 세척 완충액에 재현탁하고 FACS Calibur 흐름 세포분석기를 이용하여 분석하였다.
도 9에서 입증된 바와 같이, 항-EGFRvⅢ 항체 (흑색 단속선), Ab 131-DM1 컨주게이트 (단일 검정색 선), 항-EGFR 항체 (회색 점선)는 모두 EGFRvⅢ 발현 세포에 결합한다. 항-EGFRvⅢ 항체나 Ab 131-DM1은 항-EGFR 항체와 달리, EGFR (야생형) 과발현 세포에 결합하지 않는다.
실시예 6
항체 131- DM1 내면화
U251vⅢ 세포를 200 μl의 성장 배지 (10% FBS를 함유하는 DMEM)와 함께 10,000 세포/웰로 96-웰 플레이트에 도말하고 37 ℃, 5% CO2에서 3일간 배양하여 검정 일에 90% 세포 밀집도에 도달하게 하였다. 5 μg/mL 세포에 Ab 131-DM1 컨주게이트를 4C에서 20분간 첨가하였다. 항-인간 IgG Fab' Alexa 488 (Nanoprobes, Yaphank, NY) 및 Hoechst 33342 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 4 ℃에서 20분간 검정 배지에서 세포에 첨가하였다. 세포를 검정 배지로 2회 세척한 다음 37 ℃에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 세포를 BD cytofix/cytoperm 키트 (BD biosciences, San Diego, CA)를 이용하여 고정 및 투과시키고, 가볍게 세포를 BD 세척 완충액으로 1회 세척한 다음 Fix/perm 용액을 첨가하였다. 세포를 0.5 μg/mL의 항-EEA1 항체 (BD Biosciences, San Diego, CA)와 RT에서 20분간 배양하였다. 세포를 BD 세척 완충액으로 세척하고 항-마우스 Alexa 568 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 세포에 첨가하였다. 세포를 RT에서 20분간 배양한 다음, BD 완충 용액의 2가지 세척 단계를 거쳤다. 공동-국재화를 위한 세포 이미지를 Openlab 이미지 분석 소프트웨어를 갖는 Hamamutsu 디지털 카메라에 연결된 Leica 형광 마이크로범위로 촬영하였다 (Improvision Inc, Lexington, MA).
0시간에 Ab 131-DM1 컨주게이트 결합된 EGFRvⅢ 수용체가 U251vⅢ 세포 표면 상에서 시각화된다. 1.5 시간 배양 후, Ab 131-DM1 컨주게이트가 세포 표면으로부터 세포질 내로 내재화되었고 엔도솜에 동일장소에 배치되었다.
실시예 7
Ab 131- DM1 컨주게이트는 U251v Ⅲ 세포 성장을 억제한다
U251 및 U251vⅢ 세포를 100 μL의 성장 배지 (10% FBS를 함유하는 DMEM)와 함께 500 세포/웰로 96-웰 조직 배양판에 시딩하고 37 ℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 배양 후, Ab, 대조군 컨주게이트, 또는 배지 단독의 용량 적정을 세포에 첨가하였다. 세포를 세포성 ATP 수준의 측정에 앞서 37 ℃, 5% CO2에서 4일간 연속 배양하였다. CellTiter-Glo (Pr오메가 Corp., Madison, WI) 완충액 및 기질을 대략 60분간 실온 (RT)에 평형화하였다. 플레이트를 37℃ 배양기로부터 제거하고 RT에서 30분간 배양하였다. CellTiter-Glo 완충액을 CellTiter-Glo 기질과 혼합하여 CellTiter-Glo 시약을 생성하였다. CellTiter-Glo 시약을 CellTiter-Glo 시약 대 배지의 1:1 비율로 두 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 진탕기 위에 두고 2분 동안 서서히 흔들었다. 플레이트를 발광을 측정하기 전에 10분간 배양하였다. 발광을 웰당 0.1 초의 판독 시간으로 Wallac Envision 2103 다표지 판독기 (Perkin Elmer, Waltham, MA)을 이용하여 측정하였다. 통계적 분석을 Prism 4.01 (GraphPad, San Diego, CA)을 이용하여 수행하였다. 발광 결과를 Y-축 상에 도식하고 nM DM1 등가물의 농도의 log를 X-축에 도식하였다. IC50 값을 로그 형질전환된 농도 데이터의 비선형 퇴화 분석 (에스자형 곡선 피트)을 이용하여 용량 반응 곡선으로부터 결정하였다.
도 10에서 입증된 바와 같이, EGFRvⅢ 발현 U251vⅢ 세포에서, Ab 131-DM1은 0.068 nM DM1 등가물, 또는 3.0 ng/mL Ab 131-DM1의 IC50로 유의한 세포 성장 억제을 야기하였다. 대조군 컨주게이트에 대해 세포 성장 억제가 관찰되지 않았다.
실시예 8
Ab 131- DM1 컨주게이트는 D317 이종이식편에서 포스포 - 히스톤 H3 수준을 증가시켰다
D317 인간 교모세포종 이종이식편 (계대 213)을 갖는 동물을 안락사시키고 멸균 조건 하에서 종양을 제거하였다. 종양을 13 게이지 임플란트 투관침에 맞게 유사한 크기의 단편으로 절단하였다. 종양을 계대 번호 214를 위해 미처리 CB-17/SCID 마우스의 옆구리 내로 이식하였다. 종양 측정: 길이 및 폭을 전자 디지털 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 종양 용적 (mm3) = [(W2 X L)/2], 상기 식에서 폭 (W)은 2회 측정에서 더 작은 것으로 정의되고 길이 (L)은 2회 측정에서 더 큰 것으로 정의된다. 이식 후 14일에 종양 용적을 측정하였고, 종양 용적은 42마리 동물에서 258 내지 875 mm3의 범위였다. 동물을 이후 치료 개시를 위해 각각 6마리의 그룹으로 무작위분류하였다. 치료를 14일째에 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 동물에게 비히클, 5.3 및 16.7 mg/kg (80 및 250 ug DM1/kg, 각각)의 Ab131-DM1, 또는 17.8 mg/kg (250 ug DM1/kg)의 대조군 컨주게이트 중 하나를 투여하였다. 동물에게 그룹 체중을 이용하여 10 mL/kg의 용적으로 투여하였다. 투여 처리후 40시간에 발생한 안락사에 앞서 종양 및 동물 중량을 측정하였다.
투여 40시간 후, 동물을 안락사시켜 각 동물로부터 종양을 수집하고, 종양을 10% 중성 완충 포르말린에 고정시키고, 일상적으로 처리하고 파라핀 블록에 포매하였다. 포스포히스톤H3 면역조직화학을 위해, 각 종양의 4-6 마이크론 섹션을 충전된 유리 슬라이드 상에 두고, 탈파라핀화하고, Decloaker 압력 기기 (Biocare)에서 Diva 용액 (Biocare # DV2004G1)을 이용하여 항원 회수 하기에 앞서 재수화하였다. 섹션을 1 ug/ml의 항-포스포히스톤H3 항체 (밀리포어/Upstate #06-570)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하고, 항-토끼 Envision (Dako K4003) 및 DAB (Dako 3468)를 이용하여 결합을 시각화한 다음, 헤마톡실린으로 반대염색하였다. 슬라이드를 Aperio ScanScope XT를 이용하여 디지털 방식으로 스캐닝하고 각 섹션 내의 생존가능 종양을 이미지범위 소프트웨어를 이용하여 치료군을 모르는 위원회가 보증하는 수의적 병리학자에 의해 수득한 이미지에 대해 수작업으로 개괄하였다. 생존가능 종양 면적 내의 포스포히스톤 H3 양성 세포의 수를 IHC 핵 알고리즘을 이용하여 정량화하고 생존가능 종양 면적의 mm2 당 양성 세포의 수로서 표현하였다.
치료 그룹에서 mm2 당 포스포-히스톤 H3 양성 세포의 평균 수를 윈도우용 GraphPad Prism 버전 5.04 (GraphPad Software, SanDiego, CA)를 이용한 Mann-Whitney 시험을 이용하여 대조군 그룹에서 관찰된 수와 비교하였다.
도 11에서 입증된 바와 같이, Ab 131-DM1을 이용한 치료는 비히클 또는 대조군 컨주게이트 처리된 동물과 비교하여 양성 포스포-히스톤 H3 세포 수의 유의한 증가를 야기하였다.
실시예 9
이종이식편 모델에서의 Ab 131- DM1 컨주게이트
하기 실시예 46A, 46B 및 46C에서, 종양의 길이 및 폭을 전자 디지털 캘리퍼스를 이용하여 측정하였다. 종양 용적 (mm3)을 [(W2 X L)/2] (폭 (W)은 2회 측정에서 더 작은 것으로 정의되고 길이 (L)은 2회 측정에서 더 큰 것으로 정의됨)으로서 계산하였다. 동물에게 그룹 체중을 이용하여 10 mL/kg의 용적으로 투여하였다. 종양 용적 및 동물 중량을 매주 2회 또는 3회 측정하였다. 동물을 종양 부하 접근된 10%의 체중으로서 안락사시켰다. 종양 용적을 평균 플러스 또는 마이너스 표준 오차로서 표현하였고 시간의 함수로서 도식화하였다. 성장 곡선 사이에 관찰된 차이의 통계적 유의성을 던넷 조정된 사후 다중 비교를 이용하여 로그 변환된 용적 데이터의 공분산의 반복된 수단 분석에 의해 평가하였다. 상기 분석은 기준선 로그 종양 용적, 일자, 일자-치료 상호작용의 모델 효과와 혼합된 SAS 과정; 일자가 반복된 값이고, 동물이 대상이고 Toeplitz 공분산 구조였던 반복된 진술; 및 대조군을 다른 치료군들과 비교하는 던넷 분석을 하는 lsmeans 진술을 이용하여 수행하였다. 더 큰 용적이 더 큰 공분산을 가지는 경향이 있기 때문에, 상기 데이터를 로그 변환하였고, 기준선 로그 종양 용적을 가능한 전-치료 종양 용적 차이를 설명하는 모델에서 공변인(covariate)으로서 포함시켰다. 모든 통계적 계산을 SAS v9.1과 접속된 JMP 소프트웨어 v7.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC)를 통해 수행하였다.
실시예 9A: U251v Ⅲ 이종이식편 모델에서의 Ab 131- DM1 컨주게이트
U251vⅢ 피하 이종이식편에서의 Ab 131의 효능을 결정하기 위해, U251vⅢ 세포를 이식을 위한 충분한 생존가능 세포가 수득될 때까지 시험관내에서 확장시켰다. 세포를 우태혈청이 없는 DMEM에 재현탁하고 BD 성장 인자 감소된 매트리겔 (BD Biosciences, San Diego, CA)와 1:1로 혼합하여 100x106 세포/mL의 최종 농도에 도달하게 하였다. CD-1 nu/nu 마우스의 옆구리에 100 μL의 세포/매트리겔 용액, 또는 10x106 세포를 이식하였다. 18일째에 종양 용적을 측정하였고, 종양 용적은 60 동물에서 172 내지 476 mm3 범위였다. 이들 60마리의 동물을 이후 치료 개시에 앞서 각 10마리의 동물의 그룹으로 무작위분류하였다. 대조군 컨주게이트, 컨주게이트되지 않은 131 항체, 및 Ab 131-DM1을 이용한 치료를 이식 후 18일에 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다.
동물에게 첫 번째 집단에서 단일 IV 용량의 14.4 mg/kg 대조군 컨주게이트, 또 하나의 집단에서 1.7 mg/kg Ab 131-DM1, 또 하나의 집단에서 5.6 mg/kg Ab 131-DM1및 17 mg/kg Ab 131-DM1 in 또 하나의 집단에서 17 mg/kg Ab 131-DM1을 투여하였다. 종양 용적을 상기에서 기재된 바와 같이 매주 2회 측정하였다. 도 12에서 입증된 바와 같이, 5.6 또는 17 mg/kg의 Ab 131-DM1을 이용한 치료는 비히클 또는 대조군 컨주게이트 처리된 동물과 비교하여 종양 성장의 유의한 지연을 야기하였다. 5.6 및 17 mg/kg의 Ab 131-DM1에서 종양 퇴화가 관찰되었고 17 mg/kg 용량에서 완전환 퇴화가 관찰되었다. 체중 감소에 대한 효과가 임의의 동물에서 관찰되지 않았다.
실시예 9B: D317 이종이식편 모델에서 Ab 131- DM1 컨주게이트
D317 종양 단편을 CB-17/SCID 마우스에서 연속 계대하였다. D317 인간 교모세포종 이종이식편을 갖는 동물을 안락사시키고, 멸균 조건 하에서 종양을 제거하였다. 종양을 13 게이지 임플란트 투관침에 맞게 유사한 크기의 단편으로 절단하였다. 종양을 미처리 CB-17/SCID 마우스의 옆구리 내로 이식하였다. 이식 후 종양 용적을 측정하였고, 11일째에 42 동물에서 106 내지 373 mm3 범위였다. 42마리의 동물을 이후 치료 개시를 위해 각각 7마리의 6개의 그룹으로 무작위분류하였다. 치료를 이식후 11일 및 18일째에 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 동물에게 비히클, 20.5 mg/kg의 항-EGFRvⅢ 항체 131, 4.9, 9.8 또는 20.5 mg/kg (60, 120, 및 250 μg DM1/kg, 각각)의 Ab 131-DM1 컨주게이트 또는 17.8 mg/kg (250 μg DM1/kg)의 대조군 컨주게이트를 투여하였다. 15일째에, 비히클 그룹 내의 1마리의 동물, 131 항체 그룹 내의 두 마리의 동물, 대조군 컨주게이트 그룹 내의 3마리의 동물, Ab 131-DM1의 9.8 mg/kg 용량 그룹 내의 1마리의 동물, 및 Ab 131-DM1의 4.9 mg/kg 용량 그룹 내의 두 마리의 동물을 큰 종양 용적으로 인해 안락사시켰다. 18일째에, 남은 모든 마우스에게 비히클, 대조군 컨주게이트, 131 항체를 투여하였고, Ab 131-DM1의 4.9 mg/kg 용량 그룹을 큰 종양 용적으로 인해 안락사시켰다. Ab 131-DM1의 9.8 mg/kg 용량 그룹 내의 두 마리의 동물들을 큰 종양 크기로 인해 안락사시켰다. 18일째에, AB 131-DM1의 9.8 mg/kg 용량 그룹 내의 남아있는 4마리의 마우스 및 20.5 mg/kg AB 131-DM1 그룹 내의 모든 7마리의 마우스에게 제2 용량을 정맥내로 투여하였다. 마우스 체중 및 종양 용적을 29일째에 끝나는 연구 내내 모니터링하였다.
도 13에 입증된 바와 같이, 20.5 mg/kg의 Ab 131-DM1 컨주게이트를 이용한 치료는 비히클 처리된 동물과 비교하여 유의한 종양 성장 지연을 야기한 반면, 131 항체 및 대조군 컨주게이트는 효과가 없었다.
실시예 9C: D317 이종이식편 모델에서 Ab 131- DM1 컨주게이트를 이용한 용량 반응 실험
D317 세포를 우태혈청이 없는 DMEM에 재현탁하고 BD 성장 인자 감소된 매트리겔 (BD Biosciences, San Diego, CA)와 1:1로 혼합하여 1x106 세포/mL의 최종 농도에 도달하게 하였다. CB-17/SCID 마우스의 옆구리에 200 μL의 세포/매트리겔 용액, 또는 0.2x106 세포를 이식하였다. 이식 9일 후, 종양 용적을 측정하고, 137-313 mm3의 범위를 갖는 50마리의 동물을 무작위분류하고 처리하였다. 마우스에게 이식 후 9일째에 비히클, 26.8 mg/kg (375 ug DM1/kg)의 대조군 컨주게이트, 또는 7.3, 14.6, 또는 22 mg/kg (125, 250, 또는 375 ug DM1/kg, 각각)의 Ab 131-DM1 컨주게이트의 단일 정맥내 주사를 투여하였다.
도 14에서 입증된 바와 같이, 치료 with 모든 용량에서의 Ab 131-DM1의 치료는 종양 성장의 유의한 지연을 야기하였고, 22 mg/kg에서 퇴화가 관찰되었다. 대조군 컨주게이트는 효과가 없었다.
실시예 9D: Ab 131- DM1 컨주게이트 처리된 D317 이종이식편 모델에서의 MRI 겉보기 확산 계수
본 연구에서, 교모세포종의 동소이식 모델에서의 Ab 131-DM1 치료의 결과로서 종양 조직에서의 구조 변화의 초기 판독으로서 자기 공명 영상 (MRI) 겉보기 확산 계수 (ADC)를 시험하였다.
CB17 SCID 마우스에게 0 일째에 오른쪽 반구 내로 뇌정위적 주사를 통해 D317 인간 교모세포종 세포 (100,000 세포/마우스)를 이식하였다. 7일에, 마우스를 MRI로 시각화하고, 종양 용적에 기초하여 5개의 치료 그룹으로 무작위분류하였다. 마우스를 비히클, 6.5, 11, 또는 22 mg/kg Ab 131-DM1 i.v. 2회/주, 또는 테모졸로마이드 10 mg/kg p.o. 주마다 매일 5 일 (N=8/그룹)로 처리하였다. 그리고 나서 14일 및 21일에 마우스를 MRI로 시각화하였다. 모든 마우스에서의 종양 용적을 전체 종양 용적을 커버하는 다중-슬라이스 T2-칭량된 RARE (완화 증대를 갖는 신속한 취득) 이미지 내의 고도강렬한 영역을 수작업으로 추적함으로써 평가하였다. 비히클 및 22 mg/kg Ab 131-DM1-처리된 그룹에서의 각 종양에 대한 평균 MRI 겉보기 확산 계수를 전체 종양 부피 대비 수작업을 추적된 영역을 이용하여, 확산-강조 스핀 에코우 이미지 (b = 100,300,700,1000, and 1200 s/mm2)로부터 계산하였다.
14일에 그룹 간에 종양 용적에 유의한 차이가 없음에도 불구하고, 종양 용적에 대한 Ab 131-DM1의 용량-의존적 효과가 21일에 관찰되었다. 21일에, 비히클 대비 테모졸로마이드 및 Ab 131-DM1 처리된 그룹 (22 및 11 mg/kg)에서 성장이 억제되었다(p<0.0001). 평균 MRI ADC 값은 14일 (23%, p<0.01 vs 비히클) 및 21일 (32%, p<0.0001 vs 비히클)에 Ab 131-DM1 (22 mg/kg)을 이용한 치료 후 유의하게 더 높은 반면, 임의의 시점에서 비히클 그룹의 MRI ADC에서 유의한 변화가 일어나지 않았다.
Ab 131-DM1은 마우스 뇌 내로 동소이식으로 주입된 D317 세포의 용량-의존적 성장 억제를 나타낸다. Ab 131-DM1 치료 후 종양 겉보기 확산 계수의 증가는 종양 성장의 측정가능한 억제에 선행하며, 이는 치료적 효능을 위한 조기 바이오마커로서 MRI ADC를 지지한다. 상기 데이타는 또한 종양 용적 감소보다 치료적 효능을 위한 조기 바이오마커로서의 MRI ADC를 지지한다.
실시예 10: 재발성 악성 신경아교종 발현 돌연변이체 표피 성장 인자 수용체 변이체 Ⅲ ( EGFRvⅢ 를 갖는 대상에서 AB 131- DM1 의 안전성, 내성, 약동학 및 약역학을 평가하는 1상 최초 인체대상 연구
오픈-라벨에서, 단일제 Ab 131-DM1의 순차적인 용량 탐구 연구는 재발성 GBM 및/또는 AA를 갖는 대상에서 3주마다 1회(Q3W) 정맥내(IV)로 투여된다. 본 연구에 등록된 적격한 대상은 연구 1일째에 시작하여 60분 주입으로서 Ab 131-DM1 IV Q3W를 받을 것이다. 처음 두 용량의 Ab 131-DM1 후 그리고 용량 제한적인 독성을 평가하기 위한 28일 윈도우의 성공적인 완료시, 대상은 5주 동안 MRI로 그의 종양의 방사선학적 평가를 겪을 것이다. Ab 131-DM1 (Q3W)의 복용은 예를 들면, 맥도날드 기준 당 진행성 질환 (PD)의 방사선그래픽 증거가 존재하지 않는 한, 7주에 재개될 수 있고, 대상은 상기 연구 약물에 비내성이 되거나, 임상 진행의 징후 및 증상이 주요한 조사자에 의해 결정된 바와 같이 분명하다. MRI에 의한 차후의 종양 평가는 9주 및 그 후 8주마다 일어날 것이다.
등록은 종양 조직에서 EGFRvⅢ 발현의 증거를 나타내는 환자에 제한될 것이다. 또한, 맥도날드 기준에 의해 측정가능한 질환 진행을 확인하는 MRI에 의한 방사선학적 평가가 연구로 진입하는데 또한 필요하다.
적응성 용량 탐구 연구에서 사용될 것이고(실제적인 연속적 재평가 방법을 이용하여 [CRM] [Zhou, 2002]), 이는, 만약 실현가능한 경우, 최대 용인된 용량 (MTD)을 결정하고 AB 131-DM1의 안전성, 내성, PK 및 PD를 평가하는 것을 목표로 한다. MTD는 용량 제한 독성 (DLT)의 가능성이 25% 이하일 때의 최대 용량으로서 정의된다.
안전한 용량 단계적 확대를 보증하기 위해, 임의의 시점에서의 최대 용량 증가가 ≤ 2x 현 용량일 것이다. 용량 탐구에서 사용하기 위한 전-명시된 명목 용량은 0.5, 1.0, 2.0, 3.0,4.0 및 5.0 mg/kg의 AB 131-DM1 (IV; Q3W)이다. 중간 용량 (0.5 mg/kg의 다중) 및 대안적인 용량 빈도가 필요한 경우 또한 사용될 수 있다.
복용 요법의 효능은 맥도날드 기준을 이용하여 방사선학적으로 평가될 수 있다 (참고, Macdonald DR, Cascino TL, Schold SC Jr, Cairncross JG. (See, Macdonald DR, Cascino TL, Schold SC Jr, Cairncross JG. Response criteria for phase II studies of supratentorial malignant glioma. J Clin Oncol. 1990;8:1277-1280).or the Response Assessment in Neuro-Oncology (RANO) Criteria (See, Wen PY, Macdonald DR, Reardon DA, 등 Updated Response Assessment Criteria forHigh-Grade Gliomas: Response Assessment in Neuro-Oncology Working Group. J ClinOncol. 2010; 28: 1963-1972).
참조에 의한 포함
특허, 특허출원, 문서, 교과서 등을 포함하는, 본원에 인용된 모든 문헌들, 및 이들이 인용되지 않은 정도까지, 거기에 언급된 문헌들은 전체가 참조로써 본원에 통합된다.
등가물
이전의 설명 및 예는 본 발명의 임의의 바람직한 구현예를 상세히 열거하고 본 발명자들에 의해 고려된 최적예를 기술한다. 그러나, 전술한 것이 본문에 얼마나 상세히 나타나 있다고 하더라도, 본 발명은 많은 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명은 부가된 청구항들 및 임의의 이의 등가물에 따라 해석되어야 하는 것으로 인정될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Hill, John Stephen Hamblett, Kevin J. <120> METHODS OF TREATING EPIDERMAL GROWTH FACTOR DELETION MUTANT VIII RELATED DISORDERS <130> A-1680-US-PSP <140> TO BE ASSIGNED <141> 2011-11-16 <160> 144 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Asn Pro Arg Asp Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 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240 agcagggtgg aagctgagga tgtgggggtt tattactgca tgcaaggtac acaatttcct 300 atcaccttcg gccaagggac acgactggag attaaa 336 <210> 35 <211> 375 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtggtt actactggag ctggatccgc 120 cagcacccag ggaagggcct ggagtggatt gggttcatct attacagagg gaacacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagttacc atatcagttg acacgtctaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gactgccgcg gacacggccg tgtattactg tgcgcgagac 300 ggatattgta gtagaaccgg ctgctatggc ggctggttcg acccctgggg ccagggaacc 360 ctggtcacgt ctcct 375 <210> 36 <211> 335 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 atattgtgat gactcagtct ccactctccc tgcccgtcac ccctggagag ccggcctcca 60 tctcctgcag gtctagtcag agcctcctgt atagaaatgg aaacaactat ttggattggt 120 atctgcagaa gccagggcag tctccacagc tcctgatcta tttgggttct aatcgggcct 180 ccggggtccc tgacaggttc agtggcagtg gatcgggcac agattttaca ctgaacatca 240 gcagagtgga ggctgaggat gttgggcatt attactgcat gcaggctcta caaactcctc 300 ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaa 335 <210> 37 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccctcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atgtcatatg atggaagtaa agaagactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tctagagaca attccgagaa catgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtat attactgtgt gagcgaagga 300 tattgtagta gtcgtagctg ctataagtac tactactacg gcatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ctca 384 <210> 38 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gatactgtga tgacccagac tccactctcc tcacatgtaa cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta cacagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120 cttcagcaga ggccaggcca acctccaaga ctcctaattt ataggatttc taggcggttc 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actggaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaatctac acacgttcct 300 cggacgttcg gccaagggac caaggtggag atcaaa 336 <210> 39 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagt ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcaga aactatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtga taaatactat 180 gcagactccg tgaggggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatggc 300 tacgatattt tgactggtaa tcctagggac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 40 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 gaggtgcagg tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcggct attagtggta gtggtggtag tacaaactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtct attactgtgc tgggagcagt 300 ggctggtccg agtactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcg 348 <210> 41 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acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agctacagtt ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaagggcat atcacaggtc caggtggtat 180 tacgagtatg cagtatcggt gaaaagtcga ataaacatca ccccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agaggcagtc gctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 44 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacaatg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccag cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatgattatg tagtatctgt gaaaagtcga ataaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgta 300 agaggcagtc gctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 45 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gctattgtgt tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgtt cacagggatg gaaacaccta cttgagttgg 120 cttcagcaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aacctgacga tgtcggggtt tattactgca tgcatactac acaacttcct 300 tggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 46 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctccta tatagaaatg gaaacaacta tttggattgg 120 tatctgcaga ggccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac attgaaaatc 240 ggcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaggctct acaaactcct 300 cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 47 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt caccctcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg acatcatatg atggaagtaa aaaagactat 180 gcagactccg cgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgt gagcgaagga 300 tattgtagta gtagtagctg ctataagtac tactattacg gtatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ttca 384 <210> 48 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gaggggcagc tgttggagtc tgggggaggc tgggtacagc ctggggagtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcggct attagtggta gtggtggtag cacaaattac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaagtga acagcctgag agtcgaggac acggccgtat attactgtgc tgggagcagt 300 ggctggtccg agtactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348 <210> 49 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagcgtcacc 60 atcacttgcc ggacaagtca gggcattaga aaaaatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagcgcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatccgcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctccag catcatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaggg tggagatcag a 321 <210> 50 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctccta tatagaaatg gaaacaacta tttggattgg 120 tatctgcaga ggccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaggctct acaaactcct 300 cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 51 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 51 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt caccctcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg acatcatatg atggaagtaa aaaagactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgt gagcgaagga 300 tattgtgata gtagtagctg ctataagtac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ttca 384 <210> 52 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctccta tatagaaatg gaaacaacta tttggattgg 120 tatctgcaga ggccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaggctct acaaactcct 300 cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 53 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 53 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt caccctcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ctaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg acatcatatg atggaagtaa aaaagactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgt gagcgaagga 300 tattgtgata gtactagttg ctataagtac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg tcaccgtctc ttca 384 <210> 54 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca gagcctccta tatagaaatg gaaacaacta tttggattgg 120 tatctgcaga ggccagggca gtctccacaa ctcctgatct atttgggttc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaggctct acaaactcct 300 cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336 <210> 55 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cctctggatt caccctcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtg acatcatatg atggaagtaa aaaagactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgt gagcgaagga 300 tattgtgata gtactagctg ctataagtac tactactacg gtatggacgt ctggggccaa 360 gggaccacgg 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Met Asp Glu Glu Asp Met Asp Asp Val Val 705 710 715 720 Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe Phe Ser Ser Pro 725 730 735 Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala Thr Ser Asn 740 745 750 Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn Gly Leu Gln Ser Cys Pro 755 760 765 Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp Pro Thr Gly 770 775 780 Ala Leu Thr Glu Asp Ser Ile Asp Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu 785 790 795 800 Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser Val Gln Asn 805 810 815 Pro Val Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser Arg Asp Pro 820 825 830 His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Val Gly Asn Pro Glu Tyr Leu 835 840 845 Asn Thr Val Gln Pro Thr Cys Val Asn Ser Thr Phe Asp Ser Pro Ala 850 855 860 His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln Ile Ser Leu Asp Asn Pro Asp 865 870 875 880 Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe 885 890 895 Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln 900 905 910 Ser Ser Glu Phe Ile Gly 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Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala 195 200 205 Ala Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys 210 215 220 Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu 225 230 235 240 Tyr Asn Pro Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr 245 250 255 Ser Phe Gly Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg 260 265 <210> 137 <211> 512 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gtagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgga 300 tggcagcagc tggccccctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct ctagcaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg ca 512 <210> 138 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Trp Gln Gln Leu Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 <210> 139 <211> 496 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 gatattgtga tgacccagac tccactctcc tcacctgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagcctcgtg catagtgatg gaaacaccta cttgagttgg 120 cttcaccaga ggccaggcca gcctccaaga ctcctaattt ataagatttc taaccggttc 180 tctggggtcc cagacagatt cagtggcagt ggggcaggga cagctttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aagctgagga tgtcggggtt tattactgca tgcaagctac acaacttcct 300 cggacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgctagcgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccagg 496 <210> 140 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu His Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Thr Gln 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Claims (29)

  1. 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트를 종양 치료를 필요로 하는 포유동물에게 약 0.1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중의 용량으로 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 가진 포유동물을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트가 종양 치료를 필요로 하는 포유동물에게 적어도 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 또는 9.5 mg/kg 내지 11.0 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트가 종양 치료를 필요로 하는 포유동물에게 적어도 0.5 내지 1 mg/kg, 0.1 내지 2 mg/kg, 2 내지 3 mg/kg, 3 내지 4 mg/kg, 4 내지 5 mg/kg, 5 내지 6 mg/kg, 6 내지 7 mg/kg, 7 내지 8 mg/kg, 8 내지 9 mg/kg, 9 내지 10 mg/kg, 1.5 내지 2.5 mg/kg, 2.5 내지 3.5 mg/kg, 3.5 내지 4.5 mg/kg, 4.5 내지 5.5 mg/kg 또는 5.5 내지 6.5 mg/kg의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 단계가 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트를 포유동물에게 정맥내 투여, 볼러스 주사에 의한 투여, 뇌내 투여 또는 지속 방출 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트가 매주 적어도 2회, 매주 적어도 1회, 2주마다 적어도 1회, 3주마다 적어도 1회 또는 4주마다 적어도 1회 투여되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양이 EGFRvⅢ를 발현하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양이 폐 암종, 유방 암종, 결장 암종, 위 암종, 신장 암종, 두경부 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 교모세포종, 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 또는 신경교세포 성분을 포함하는 종양, 특히 교모세포종, 역형성 별아교세포종, 별아교세포종, 또는 신경교세포 성분을 포함하는 종양인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양이 교모세포종 또는 역형성 별아교세포종인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양이 재발성 교모세포종 또는 재발성 역형성 별아교세포종인 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양이 희소돌기아교세포종, 희소돌기별아교세포종, 신경교육종, 혼합성 신경아교종, 모양세포성 별아교세포종, 다형성 황색별아교세포종, 뇌실막하 거대세포 별아교세포종, 별아교모세포종, 해면모세포종, 대뇌 교종증, 또는 신경절교종 또는 역형성 신경절교종을 포함하는 신경-아교세포 종양인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 최초 투여 후 3개월 초과, 4개월 초과, 5개월 초과 또는 6개월 초과 동안 생존하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양이 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 최초 투여로부터 3개월 후, 4개월 후, 5개월 후 또는 6개월 후 진행되지 않는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 최초 투여 전의 상기 포유동물의 순환 종양 세포 수준과 비교하여 감소된 순환 종양 세포 수준을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 최초 투여 전의 상기 포유동물의 종양 엑소좀 특성 수준과 비교하여 감소된 종양 엑소좀 특성 수준을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양 크기가, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 최초 투여 전의 종양 크기와 비교하여 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 투여 후에 감소되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물의 종양 크기가, 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 최초 투여 전의 상기 포유동물의 종양 크기와 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100% 감소되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 완전한 또는 부분적 반응을 나타내는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 최초 투여로부터 6개월의 무진행 생존을 나타내는 것인 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 맥도날드(Macdonald) 기준 또는 RANO 기준에 의해 평가되는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트의 항체가 항체 131인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체 약물 컨주게이트의 항체가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체에 컨주게이트된 약물이 방사선활성 동위원소, 화학요법제, 독소 또는 그의 단편 또는 변이체인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체가 적어도 1 내지 10, 적어도 1 내지 5, 적어도 3 내지 4 또는 적어도 3 내지 5개의 메이탄시노이드 DM1 분자에 컨주게이트된 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 절단불가 링커 그룹을 통해 항-EGFRvⅢ 항체에 컨주게이트된 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물이 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (SMCC)를 통해 항-EGFRvⅢ 항체에 컨주게이트된 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체-약물 컨주게이트가 도 8a, 8b 및 8d에 도시된 Ab 131-DM1이고 도 8b에 도시된 전장 중쇄 및 도 8d에 도시된 전장 경쇄를 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-EGFRvⅢ 항체가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고 상기 항-EGFRvⅢ 항체가 MCC 링커에 의해 3 내지 5개의 메이탄시노이드에 컨주게이트된 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계가 포유동물을 수술하거나, 포유동물에게 방사선요법을 적용하거나, 일차 셋팅에서 전뇌 방사선 요법을 적용하거나, 반복 셋팅에서 초점 방사선 치료를 적용하거나, 일차 및 반복 셋팅에서 테모졸로마이드를 투여하거나, 베바시주맙을 투여하거나, 이리노테칸을 투여하거나, PCV, 프로카바진, 로무스틴 [CCNU], 빈크리스틴을 투여하거나, 글라이아델(Gliadel) 웨이퍼 (BCNU로 함침된 폴리페프로산)를 이식하거나, 티로신 키나제 억제제를 투여하거나, 방사선-감작제를 투여하거나, 백신 기반 요법을 실시하거나, 항체 약물 컨주게이트를 투여하거나, 일차 또는 반복 셋팅에서 이중특이적 T-세포 인핸서를 투여하거나, 표적화된 약물을 투여하는 처치 이전, 이러한 처치와 동시에 또는 이러한 처치 이후에 수행되는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
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