CN104168922A - 治疗表皮生长因子缺失突变体viii相关疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用抗原结合蛋白,包括与药物缀合的抗EGFRvIII抗体,治疗表皮生长因子缺失突变体vIII(EGFRvIII)相关疾病,例如成胶质细胞瘤或间变性星形细胞瘤的方法。因此还提供了此类抗体和药物缀合物的诊断和治疗制剂。
Description
本申请要求2012年11月15日提交的美国临时申请No.61/727,029和2011年11月16日提交的美国临时申请No.61/560,731的权益,其通过引用并入本文。
序列表的参考
本申请与序列表一起以电子格式提交。序列表作为2011年11月16日创建的大小为89KB,命名为A-1680-US-PSP_SEQ.txt的文件提供。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及使用抗原结合蛋白,包括与药物缀合的抗EGFRvIII抗体,治疗表皮生长因子缺失突变体vIII(EGFRvIII)相关疾病,例如成胶质细胞瘤或间变性星形细胞瘤的方法。因此还提供了此类抗体和药物缀合物的诊断和治疗制剂。
发明背景
自上世纪以来,就一直在寻求帮助更好诊断和治疗人和动物癌症的肿瘤特异性分子。在人类癌症的大多数类型中,难以提供基于分子结构数据的肿瘤特异性物质的确切证据,基于病毒诱导的癌症和牵涉病毒基因组特化的分子结构的肿瘤特异性物质除外。基于新型分子结构的肿瘤特异性分子的实例非常少。在人恶性胶质瘤和与表皮生长因子受体分子的扩增或变化潜在相关的其它肿瘤,例如乳腺癌和其它人类癌症的情况下,还没有具有独特序列的结构上改变的分子的明确证明。
表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因c-erb B的170KD膜糖蛋白产物。EGFR基因的序列已知(Ullrich等(1984).Human EpidermalGrowth Factor Receptor cDNA Sequence and Aberrant Expression of theAmplified Gene in A431Epidermoid Carcinoma Cells.Nature309:418-425)。EGFR基因是最初在禽成红细胞增多症病毒中鉴定的erb B致癌基因的细胞同系物(Downward等(1984).Close Similarity ofEpidermal Growth Factor Receptor and v-erb B Oncogene ProteinSequence.Nature307:521-527,Ullrich等(1984))。已经在多种人类肿瘤(Haley等(1987A).The Epidermal Growth Factor Receptor Gene in:Oncogenes,Genes,and Growth Factors,编辑:Guroff,G.第12版,第2章第40-76页,Wiley,N.Y)并且尤其在胶质来源的人类肿瘤中(Libermann等(1985).Amplification,Enhanced Expression and PossibleRearrangement of EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours0f Glial Origin.Nature313:144-147;Wong等(1987).IncreasedExpression of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in MalignantGliomas is Invariably Associated with Gene Amplification.Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:6899-6903;Yamazaki等(1988).Amplification ofthe Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth FactorReceptor Gene(c-erbB)in Human Brain Tumors.Molecular and CellularBiology8:1816-1820;Malden等(1988).Selective Amplmcation of theCytoplasmic Domain of me Epidermal Growth Factor Receptor Gerie inGlioblastoma Multiforme.Cancer Research4:2711-2714)观察到这种致癌基因通过基因扩增激活。
已经证明EGF-r在许多类型的实体瘤上过表达。MendelsohnCancer Cells7:359(1989),Mendelsohn Cancer Biology1:339-344(1990),Modjtahedi和Dean Int′l J.Oncology4:277-296(1994)。例如,已经在某些肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、肾癌和前列腺癌中观察到EGFR过表达。Modjtahedi和DeanInt′l J.Oncology4:277-296(1994)。已经证明表皮生长因子(EGF)和转化生长因子-α(TGF-α)均与EGF-r结合并且导致细胞增殖和肿瘤生长。
v-erb B致癌基因与正常EGFR基因之间的一个主要差异是,病毒致癌基因是正常受体的氨基截断形式;它们缺乏大部分细胞质外结构域,但是保留了跨膜和酪氨酸激酶结构域(Fung等,(1984)Activationof the Cellular Oncogene c-erb B by LTR Insertion:Molecular Basis forInduction of Erythroblastosis by Avian Leukosis Virus.Cell33:357-368;Yamamoto等,(1983).A New Avain Erythroblastosis Virus,AEV-HCarries erbB Gene Responsible for the Induction of Both Erythroblastosisand Sarcoma.Cell34:225-232,Nilsen等,(1985).c-erbB Activation inALV-Induced Erythroblastosis:Novel RNA Processing and PromoterInsertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGF Receptor.Cell41:719-726;Gammett等,(1986).Differences in SequencesEncoding the Carboxy-Terminal Domain of the Epidermal Growth FactorReceptor Correlate with Differences in the Disease Potential of ViralerbB Genes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:6053-6057)。这导致蛋白质不能结合表皮生长因子(EGF),但是仍然可以磷酸化其它底物(Gilmore等,(1985).Protein Phosphorlytion at Tyrosine is Induced by thev-erb B Gene Product in Vivo and In Vitro.Cell40:609-618;Kris等,(1985).Antibodies Against a Synthetie Peptide as a Probe for the KinaseActivity of the Avian EGF Receptor and v-erB Protein.Cell40:619-625),并且已经引起人们猜测,因为激酶结构域不受调控并且有组成性活性,所以v-erb B蛋白质致癌(Downward等,1984)。
在病毒erb B致癌基因中可出现多种遗传改变,例如基因羧基末端的氨基酸取代和缺失。然而,现有证据表明氨基截断对癌发生至关重要。氨基截断是所有v-erb B致癌基因的特征,包括由启动子插入或逆转录病毒转导而产生的致癌基因(Nilsen等,(1985).c-erbBActivation in ALV-Induced Erythroblastosis:Novel RNA Processing andPromoter Insertion Results in Expression of an Amino-Truncated EGFReceptor.Cell41:719-726;Gammett等,(1986).Differences inSequences Encoding the Carboxy-Terminal Domain of the EpidermalGrowth Factor Receptor Correlate with Differences in the DiseasePotential of Viral erbB Genes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:6053-6057)。
相反,羧基末端缺失看来仅仅与通过逆转录病毒转导而产生的肿瘤相关并且似乎决定宿主范围和肿瘤类型特异性(Gammett等,1986;Raines等,(1985).c-erbB Activation in Avian Leukosis Virus-InducedErythroblastosis:Clustered Integration Sites and the Arrangement ofProvirus in the c-erbB Alleles.Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:2287-2291)。对氨基截断的禽类c-erb B基因或嵌合病毒致癌基因-人EGF受体的转染实验证明,这种缺失足以单独产生转化蛋白(Pelley等,(1988).Proviral-Activated c-erbB is Leukemogenic but notSarcomagenic:Characterization of a Replication--Competent RetrovirusContaining the Activated c-erbB.Journal of Virology62:1840-1844;Wells等,(1988).Genetic Deterninants ofNeoplastic Transformation bythe Retroviral Oncogene v-erbB.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:7597-7601)。
在约40%的人恶性胶质瘤中出现EGFR基因扩增(Libermann等,(1985)Amplification,Enhanced Expression and Possible Rearrangementof EGF Receptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin.Nature313:144-147;Wong等,(1987).Increased Expression of theEpidermal Growth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas isInvariably Associated with Gene Amplification.Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:6899-6903)。受体基因的重排在有基因扩增的许多肿瘤中很明显。结构改变似乎优先影响基因的氨基末端一半(Yamazaki等,(1985).Amplification,Enhanced Expression and Possible Rearrangement of EGFReceptor Gene in Primary Human Brain Tumours of Glial Origin.Nature313:144-147;Malden等,(1988).Selective Amplification of theCytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene inGlioblastoma Multiforme.Cancer Research4:2711-2714),但是此时还未精确表征在任何肿瘤中的重排性质。
已经报道了几种人类癌症中的大小变异EGFR基因和扩增。(Humphrey等,(1988).Amplification and Expression of the EpidermalGrowth Factor Receptor Gene in Human Glioma Xenografts.CancerResearch48:2231-2238;Bigner等,(1988)J.Neuropathol.Exp.Neurol.,47:191-205;Wong等,(1987).Increased Expression of the EpidermalGrowth Factor Receptor Gene in Malignant Gliomas is InvariablyAssociated with Gene Amplification.Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:6899-6903;和Humphrey等Amplification and expression of theepidermal growth factor receptor gene in human glioma xenografts.Cancer Res.48(8):2231-8(1988))。然而,还未确定细胞中改变的EGFR分子的分子基础。
1989年,Bigner和Vogelstein博士的工作阐明了已经成为众所周知的III型突变体的EGF受体突变体(也称为δ-EGFr或EGFRvIII)的序列。在美国专利No.6,455,498、6,127,126、5,981,725、5,814,317、5,710,010、5,401,828和5,212,290中描述了这项工作,其公开内容据此通过引用并入。
通过伴有EGFR基因扩增的基因重排产生EGFR变体。有八种主要的EGFR变体已知:(i)EGFRvI缺乏大部分EGFR胞外结构域,(ii)EGFRvII由EGFR胞外结构域中的83aa框内缺失组成,(iii)EGFRvIII由EGFR胞外结构域中的267aa框内缺失组成,(iv)EGFRvIV含有EGFR细胞质结构域中的缺失,(v)EGFRvV含有EGFR细胞质结构域中的缺失,(vi)EGFR.TDM/2-7含有EGFR胞外结构域中外显子2-7的复制,(vii)EGFR.TDM/18-25含有EGFR酪氨酸激酶结构域中外显子18-26的复制,和(viii)EGFR.TDM/18-26含有EGFR酪氨酸激酶结构域中外显子18-26的复制(Kuan等,EGF mutant receptor vIII as amolecular target in cancer therapy.Endocr Relat Cancer.8(2):83-96(2001))。另外,有第二种更罕见的EGFRvIII突变体(EGFRvIII/Δ12-13),其具有在外显子11和14的接合点引入新型组氨酸残基的第二缺失(Kuan等,EGF mutant receptor vIII as a moleculartarget in cancer therapy.Endocr Relat Cancer.8(2):83-96(2001))。
EGFRvIII是人类癌症中最常出现的表皮生长因子(EGF)受体的变体(Kuan等,EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancertherapy.Endocr Relat Cancer.8(2):83-96(2001))。基因扩增过程中,在胞外结构域中出现267氨基酸缺失,产生肿瘤特异性单克隆抗体可定向的新接合点。EGF受体的这种变体以配体无关方式,有助于通过组成性信号的肿瘤进展。不知道EGFRvIII在任何正常组织上表达(Wikstrand,CJ.等Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumorspecific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.Cancer Research55(14):3140-3148(1995);Olapade-Olaopa,EO.等,Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor proteinin human prostate cancer.Br J Cancer.82(1):186-94(2000。缺失267个氨基酸和甘氨酸取代产生了可能能够抗体靶向的独特接合点。进一步地,考虑到EGFRvIII在某些肿瘤中表达及其在正常组织中缺乏表达,EGFRvIII可能是肿瘤治疗中药物靶向的理想靶标。具体而言,EGFRvIII看来似乎是肿瘤的免疫缀合物疗法的理想候选物(例如,与抗肿瘤剂或毒素缀合的抗体)。治疗过度表达EGFRvIII的癌症的另一种方法牵涉使用特异性靶向不裂解正常EGFR的变异受体的肿瘤特异性核酶。发现核酶显著抑制无胸腺裸鼠的乳腺癌生长(Luo等,Int.J.Cancer.104(6):716-21(2003))。
已经描述了完整EGFRvIII蛋白质的通用抗体。见国际专利申请No.WO01/62931和Kuan等,EGF mutant receptor vIII as a moleculartarget in cancer therapy.Endocr Relat Cancer.8(2):83-96(2001),Kuan等EGFRvIII as a promising target for antibody-based brain tumortherapy.Brain Tumor Pathol.17(2):71-78(2000),Kuan等,Increasedbinding affinity enhances targeting of glioma xenografts byEGFRvIII-specific scFv.International Journal of Cancer.88(6):962-969(2000),Landry等,Antibody recognition of a conformational epitope ina peptide antigeh:Fv-peptide complex of an antibody fragment specificfor the mutant EGF receptor,EGFRvIII.Journal of Molecular Biology.308(5):883-893(2001),Reist等,Astatine-211labeling of internalizinganti-EGFRvIII monoclonal antibody using N-succinimidyl5-[211At]astato-3-pyridinecarboxylate.Nuclear Medicine and Biology.26(4):405-411(1999),Reist等,In vitro and in vivo behavior ofradiolabeled chimeric anti-EGFRvIII monoclonal antibody:comparisonwith its murine parent.Nuclear Medicine and Biology.24(7):639-647(1997),Wikstrand等,Generation of anti-idiotypic reagents in theEGFRvIII tumor-associated antigen system.Cancer Immunology,Immunotherapy.50(12):639-652(2002),Wikstrand等,Monoclonalantibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast andlung carcinomas malignant gliomas.Cancer Research.55(14):3140-3148(1995),Wikstrand等,The class III variant ofthe epidermal growth factorreceptor(EGFRVIII):characterization and utilization as animmunotherapeutic target.J.Neurovirol.4(2):148-158(1998),Wikstrand等,The classIII variant of the epidermal growth factor receptor(EGFRvIII):characterization and utilization as an immunotherapeutictarget.J.Neurovirol.4(2):148-158(1998),Jungbluth等,A monoclonalantibody recognizing human cancers with amplification/overexpressionof the human epidermal growth factor receptor.Proc Natl Acad Sci U S A.100(2):639-44(2003),Mamot等,Epidermal Growth Factor Receptor(EGFR)-targeted Immunoliposomes Mediate Specific and Efficient DrugDelivery to EGFR-and EGFRvIII-overexpressing Tumor Cells.CancerResearch63:3154-316l(2003))。然而,以上提到的每种抗体在可变和/或恒定区内均具有或含有鼠序列。此类鼠源性蛋白质的存在可导致抗体的快速清除或可导致患者体内产生对抗体的免疫反应。另外,甚至在亲和力成熟后,此类抗体的亲和力也相对较低,近似2.2×10-8至1.5×10-9。(Kuan等,EGF mutant receptor vIII as a molecular target incancer therapy.Endocr Relat Cancer.8(2):83-96(2001))。
为了避免利用鼠或大鼠来源的抗体,研究人员已经将人抗体功能引入啮齿动物,以便啮齿动物可以生成全人抗体。见例如Mendez等,Functional transplant of megabase human immunoglobulin locirecapitulates human antibody response in mice.Nat Genet.15(2):146-56(1997)。这种方法已经连同生成针对野生型EGFR的成功抗体一起使用。见例如Yang x等,Development of ABX-EGF,a fully humananti-EGF receptor monoclonal antibody,for cancer therapy.Crit RevOncol Hemato38(1):17-23(2001);Yang X-D等,Eradication ofEstablished Tumors by a Fully Human Monoclonal Antibody to theEpidermal Growth Factor Receptor without Concomitant Chemotherapy.Cancer Research59(6):1236-1243(1999);和美国专利No.6,235,883。
发明概述
在一个实施方案中,本发明包含与毒素,特别是DM1缀合的经分离人单克隆抗体,其特异性结合EGFRvIII和包含序列L E E K K GN Y V V T D H C(SEQ ID NO:56)的肽,其中所述抗体与毒素,特别是DM1缀合。在另一实施方案中,本发明包含与毒素,特别是DM1缀合的经分离人单克隆抗体,其特异性结合包含L E E K K G N Y V VT D H C(SEQ ID NO:56)的序列中所含的表位,其中通过在SPOT测定中的丙氨酸扫描测定,结合所需的残基选自EEK、KKNYV、LEK、EKNY和EEKGN。
另外的实施方案包括与毒素,特别是DM1缀合的经分离人单克隆抗体,其包含VH3-33基因编码的重链可变区氨基序列。重链可变区氨基序列可包括JH4b基因编码的氨基酸序列或选自D6-13和D3-9的D基因编码的氨基酸序列。
其它实施方案包括与毒素,特别是DM1缀合的经分离人单克隆抗体,其包含A23(VK2)基因编码的轻链可变区氨基序列。轻链可变区氨基序列可包括JK1基因编码的氨基酸序列。
其它实施方案包括经分离抗体或其片段,其与EGFRvIII结合,与毒素,特别是DM1缀合,并且包含重链氨基酸序列,选自如(SEQID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17)中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的重链氨基酸序列。所述抗体可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
所述毒素可经由连接子与所述抗体缔合。所述毒素可经由二次抗体与所述抗体缔合。另外的实施方案包括生成抗体的杂交瘤细胞系和包含编码所述抗体的基因的转化细胞。所述细胞可为(例如)中国仓鼠卵巢细胞。
另外的实施方案包括抑制与EGFRvIII表达相关的细胞增殖的方法,包括用有效量的抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。在一个实施方案中,所述抗体与毒素,特别是DM1缀合,并且包含重链氨基酸序列,选自13.1.2(SEQ ID NO:138)、131(SEQ ID NO:2)、170(SEQ ID NO:4)、150(SEQ ID NO:5)、095(SEQ ID NO:7)、250(SEQID NO:9)、139(SEQ ID NO:10)、211(SEQ ID NO:12)、124(SEQ IDNO:13)、318(SEQ ID NO:15)、342(SEQ ID NO:16)和333(SEQ IDNO:17)的重链氨基酸序列。所述方法可在体内进行,并且可对哺乳动物进行,例如患有牵涉上皮细胞增殖的癌症,例如肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌或卵巢癌或成胶质细胞瘤的人。
另外的实施方案包括杀伤靶细胞的方法。这可通过使靶细胞与和毒素缔合的抗体接触实现。所述抗体与肽LEEKKGNY(SEQ ID NO:133)结合。在一个实施方案中,所述抗体对肽的结合亲和力大于1.3*10-9M。在一个实施方案中所述毒素为DM1。在一个实施方案中,抗体毒素化合物对靶细胞的毒性比对没有所述肽的细胞强10倍。在一个实施方案中,所述抗体包含重链氨基酸序列,选自抗体13.1.2(SEQ ID NO:138)、131(SEQ ID NO:2)、170(SEQ ID NO:4)、150(SEQ ID NO:5)、095(SEQ ID NO:7)、250(SEQ ID NO:9)、139(SEQID NO:10)、211(SEQ ID NO:12)、124(SEQ ID NO:13)、318(SEQ IDNO:15)、342(SEQ ID NO:16)和333(SEQ ID NO:17)的重链氨基酸序列。在另一实施方案中,所述抗体经由不可裂解的连接子与毒素缔合。
本发明另外的实施方案包括与毒素,特别是DM1缀合的经分离抗体,其结合EGFRvIII并且包含含下列互补决定区(CDR)的重链氨基酸序列:
(a)CDR1,由选自如SEQ ID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR1区的氨基酸序列的序列组成;
(b)CDR2,由选自如SEQ ID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR2区的氨基酸序列的序列组成;和
(c)CDR3,由选自如SEQ ID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR3区的氨基酸序列的序列组成。在一个实施方案中,缀合抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人或人源化抗体。在一个实施方案中,缀合抗体与药学上可接受的载体、稀释剂和/或治疗剂缔合。
还包括与毒素,特别是DM1缀合的经分离抗体或其片段,其结合EGFRvIII并且包含轻链氨基酸序列,选自如SEQ ID NO:140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32中标识的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的轻链氨基酸序列。缀合抗体可为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。其可与药学上可接受的载体或稀释剂缔合。
在一个实施方案中,考虑到生成包含轻链氨基酸序列的抗体的杂交瘤细胞系或转化细胞,选自如SEQ ID NO:140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32中标识的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的轻链氨基酸序列。
又一实施方案包括抑制与EGFRvIII表达相关的细胞增殖的方法,包括用有效量的上述缀合抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。所述方法可在体内和对哺乳动物进行,例如患有牵涉上皮细胞增殖的癌症,例如肺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌或成胶质细胞瘤的人。
又一实施方案包括与毒素,特别是DM1缀合的经分离抗体,其结合EGFRvIII并且包含含下列互补决定区(CDR)的轻链氨基酸序列:
(a)CDR1,由选自如SEQ ID NO:140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32中标识的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1区的氨基酸序列的序列组成;
(b)CDR2,由选自如SEQ ID NO:140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32中标识的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1区的氨基酸序列的序列组成;和
(c)CDR3,由选自如SEQ ID NO:140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32中标识的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的CDR1区的氨基酸序列的序列组成。
上一段落中标识的缀合抗体可进一步包括包含下列互补决定区(CDR)的重链氨基酸序列:
(a)CDR1,由选自如SEQ ID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR1区的氨基酸序列的序列组成;
(b)CDR2,由选自如SEQ ID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR2区的氨基酸序列的序列组成;和
(c)CDR3,由选自如SEQ ID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的CDR3区的氨基酸序列的序列组成。
另外的实施方案包括抑制与EGFRvIII表达相关的细胞增殖的方法,包括用有效量的上述缀合抗体或片段处理表达EGFRvIII的细胞。所述方法可在体内对哺乳动物进行,例如患有牵涉上皮细胞增殖的癌症,例如肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、结肠癌、胃癌、肾癌或前列腺癌或成胶质细胞瘤的人。
其它实施方案包括包含编码选自如SEQ ID NO:138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16和17中标识的抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342和333的重链氨基酸序列的重链氨基酸序列或其片段的核苷酸序列的经分离多核苷酸分子,或包含编码选自如SEQ ID NO:140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31和32中标识的抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342和333的轻链氨基酸序列的轻链氨基酸序列或其片段的核苷酸序列的经分离多核苷酸分子。
另外的实施方案包括包含容器、其中容纳的组合物和指明所述组合物可用于治疗特征在于EGFRvIII表达的包装说明书或标签的制品,其中所述组合物包含如上所述缀合抗体。此类癌症包括肺癌、乳腺癌、头颈癌、前列腺癌、结肠癌、胃肾癌或卵巢癌或成胶质细胞瘤。还包括用于检测哺乳动物组织或细胞中的EGFRvIII,以便筛选肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、头颈癌、前列腺癌或卵巢癌或成胶质细胞瘤的测定试剂盒,EGFRvIII是上皮癌表达的抗原,所述试剂盒包含结合抗原蛋白的抗体和指示抗体与抗原(若存在)的反应的工具。所述抗体可为经标记的单克隆抗体,或所述抗体可为未标记的第一抗体并且指示反应的工具包括抗免疫球蛋白的经标记第二抗体。可用选自荧光染料、酶、放射性核素和不透射线的材料的标记物标记结合抗原的抗体。可用第二标记抗体检测与抗原结合的抗体。结合抗原的抗体也可与过度表达的wtEGFR结合。所述试剂盒可在临床上用于患者选择。
一个另外的实施方案包括与毒素,特别是DM1缀合的抗体,其特异性识别含有新型Gly残基的EGFRvIII的表位。
另一实施方案包括与毒素,特别是DM1缀合的抗体或其片段,其结合识别序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO:57)。
在另一实施方案中,提供了一种治疗有肿瘤的哺乳动物的方法,所述方法包括按至少0.1、0.5、1.0、1,5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0或9.5mg/kg至不超过11.0mg/kg的剂量,向有需要的哺乳动物施用抗EGFRvIII抗体-药物缀合物。在一些实施方案中,所述方法提供按至少.5至1mg/kg、.1至2mg/kg、2至3mg/kg、3至4mg/kg、4至5mg/kg、5至6mg/kg、6至7mg/kg、7至8mg/kg、8至9mg/kg、9-10mg/kg、1.5至2.5mg/kg、2.5至3.5mg/kg、3.5至4.5mg/kg、4.5至5.5mg/kg或5.5至6.5mg/kg的剂量,向有需要的哺乳动物施用抗EGFRvIII抗体-药物缀合物。
在本发明的这种方法中,本发明的施用步骤包括经静脉、经团注、经大脑内或经持续释放向所述哺乳动物施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物。
在本发明的这种方法中,施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物至少每周两次、至少每周一次、至少每两周一次、至少每三周一次或至少每四周一次。
在本发明的这种方法中,哺乳动物,特别是人体内的肿瘤表达EGFRvIII。在本发明这个方面的特定实施方案中,肿瘤为肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤或包含胶质组分的肿瘤,特别是成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤或包含胶质组分的肿瘤,更特别是成胶质细胞瘤或间变性星形细胞瘤,更特别是复发成胶质细胞瘤或复发间变性星形细胞瘤。
在本发明的一个实施方案中,哺乳动物体内的肿瘤为少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、胶质肉瘤、混合性神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、成星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑神经胶质瘤病或神经元-胶质肿瘤,包括神经节神经胶质瘤和间变性神经节神经胶质瘤。
在本发明的这种方法中,哺乳动物在施用首剂抗EGFRvIII抗体-药物缀合物后存活超过3、超过4、超过5或超过6个月。
在本发明的这种方法中,从施用首剂抗EGFRvIII抗体-药物缀合物3、4、5或6个月后,所述哺乳动物体内的肿瘤并未进展。
在本发明的这种方法中,所述哺乳动物包含与首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前所述哺乳动物体内的循环肿瘤细胞水平相比降低的循环肿瘤细胞水平。
在本发明的这种方法中,所述哺乳动物包含与首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前所述哺乳动物体内肿瘤特有的外来体水平相比降低的肿瘤特有的外来体水平。在本发明的这种方法中,与施用首剂抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前的肿瘤大小相比,所述哺乳动物体内的肿瘤大小在施用抗EGFRvIII抗体-药物缀合物后减小。
在本发明的这种方法中,根据Macdonald标准或RANO标准评估,与首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前所述哺乳动物体内的肿瘤大小相比,所述哺乳动物体内的肿瘤大小减小至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%。
在本发明的这种方法中,根据Macdonald标准评估,所述哺乳动物表现出完全或部分反应。在本发明的这种方法中,根据Macdonald标准或RANO标准评估,所述哺乳动物从首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物以来表现出6个月无进展生存期。
在本发明的这方面中,以上方法导致与首次施用抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前哺乳动物体内可检测到的表观扩散系数相比,哺乳动物体内来自扩散加权的MRI(DWI)的表观扩散系数增大。
在本发明的这种方法中,抗EGFRvIII抗体-药物缀合物的抗体为抗体131或抗体13.1.2,特别是抗体131。在本发明这种方法的一个实施方案中,抗EGFRvIII抗体-药物缀合物的抗体包含含SEQ ID NO2的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO19的氨基酸序列的轻链可变区。
在这种方法的一些实施方案中,抗EGFRvIII抗体-药物缀合物是图8A、8B和8D中描绘的Ab131-DM1并且包含图8B中描绘的重链可变区和图8D中描绘的轻链可变区。
在这种方法的一些实施方案中,抗EGFRvIII抗体-药物缀合物是图8A、8B和8D中描绘的Ab131-DM1并且包含图8B中描绘的全长重链和图8D中描绘的全长轻链。
在本发明的这种方法中,与抗EGFRvIII抗体缀合的药物为放射性同位素、化学治疗剂、毒素或其片段或变体,特别是至少1-10个、至少1-5个或至少3-5个类美登素DM1。
在本发明的这种方法中,药物经由不可裂解的连接子基团,特别是硫醚连接子基团,更特别是4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)与所述抗EGFRvIII抗体缀合。在缀合抗体中,不可裂解的连接子为MCC。
在这种方法的一个特定实施方案中,抗EGFRvIII抗体包含含SEQ ID NO2的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO19的氨基酸序列的轻链可变区并且通过MCC连接子与3-5个类美登素缀合的抗EGFRvIII抗体用于治疗具有如上所述肿瘤的哺乳动物。
在本发明的这种方法中,在对所述哺乳动物应用手术,应用放射疗法,在初期情况下应用全脑放射疗法,在复发情况下应用病灶放射疗法,在初期和复发情况下施用替莫唑胺,施用抗血管形成化合物例如贝伐单抗,施用伊立替康,施用PCV、甲苄肼、洛莫司汀[CCNU]、长春新碱,植入Gliadel晶片(浸有BCNU的聚苯丙生),施用酪氨酸激酶抑制剂,施用放射致敏剂,施用基于疫苗的疗法,施用抗体药物缀合物或在初期或复发情况下施用双特异性T细胞衔接器,或施用靶向药物治疗所述哺乳动物之前、同时或之后进行所述施用步骤。
在本发明这种方法的一个替代实施方案中,先前未用包括贝伐单抗在内的抗血管形成化合物处理哺乳动物。在这个替代实施方案中,在用本发明的抗EGFRvIII抗体-药物缀合物处理之前未用抗血管形成化合物处理的哺乳动物具有比先前用此类抗血管形成化合物处理的哺乳动物更积极的反应。在一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为另一种抗EGFRvIII治疗性分子,例如抗EGFRvIII疫苗(例如Rindopepimut)、抗EGFRvIII抗体、另一种抗EGFRvIII抗体药物缀合物或抗EGFRvIII双特异性T细胞衔接器。
在本发明这种方法的一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为抗EGFR治疗性分子,例如帕尼单抗(panitumumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、其它抗EGFR抗体、抗EGFR疫苗、抗EGFR抗体药物缀合物或抗EGFR双特异性T细胞衔接器。
在本发明这种方法的一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为抗白细胞间素-6治疗性分子,例如抗白细胞间素-6抗体(例如司妥昔单抗(siltuximab))、抗白细胞间素-6受体抗体(例如托珠单抗(tocilizumab))、抗白细胞间素-6或抗白细胞间素-6受体抗体药物缀合物或抗白细胞间素-6或抗白细胞间素-6受体双特异性T细胞衔接器。
在本发明这种方法的一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为抗白细胞间素-8治疗性分子,例如抗白细胞间素-8抗体、抗白细胞间素-8受体抗体,例如抗白细胞间素-8或抗白细胞间素-8受体抗体药物缀合物,或抗白细胞间素-8或抗白细胞间素-8受体双特异性T细胞衔接器。
在本发明这种方法的一些实施方案中,在施用一种或多种抗EGFRvIII、抗EGFR、抗白细胞间素-6、抗白细胞间素6受体、抗白细胞间素-8或抗白细胞间素-8受体治疗性分子之前、同时或之后向哺乳动物施用本发明的抗EGFRvIII抗体药物缀合物,例如Ab131-DM1。
在本发明这种方法的一些实施方案中,所述哺乳动物为人。
附图简述
图1是野生型EGFR和显示出267氨基酸缺失和G取代的EGFRvIII之间的比对。
图2是EGFRvIII PEP3 14-mer肽的设计图。图2A中,具有氨基酸LEEKK(SEQ ID NO:58)(1-5)的EGFRvIII的N端序列与EGFR的N端序列相同,后面是唯一甘氨酸(Glysine)残基,后面是与EGFR中的残基273至280相同的氨基酸。图2B表示EGFRvIII中缺失的EGFR的氨基酸(6-272)。
图3A-L提供了本发明抗体的序列。为提供的每种抗体,提供了重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列。相应地,为列出的每种抗体提供了四个序列。
图4是比较13.1.2抗体重链区与特定种系重链区的表。“-“表示对该特定位置而言,杂交瘤重链区的氨基酸残基与所述种系相同。用适当氨基酸残基表示与所述种系的偏差。
图5是比较13.1.2抗体轻链区与特定种系轻链区的表。“-“表示对该特定位置而言,杂交瘤轻链区的氨基酸残基与所述种系相同。用适当氨基酸残基表示与所述种系的偏差。
图6是比较不同杂交瘤来源的抗体重链区与特定种系重链区的表。“-“表示对该特定位置而言,杂交瘤重链区的氨基酸残基与所述种系相同。用适当氨基酸残基表示与所述种系的偏差。
图7是比较不同杂交瘤来源的抗体轻链区与特定种系轻链区的表。“-“表示对该特定位置而言,杂交瘤重链区的氨基酸残基与所述种系相同。用适当氨基酸残基表示与所述种系的偏差。
图8A是描绘Ab131-DM1缀合物的结构的示意图。图8B提供了Ab131-DM1缀合物的抗体重链的氨基酸序列,可变结构域画有阴影并且从第一个氨基酸到氨基酸123,而图8C提供了编码抗体重链的核酸序列。图8d提供了Ab131-DM1缀合物的抗体轻链的氨基酸序列,可变结构域画有阴影并且从第一个氨基酸到氨基酸113,而图8E提供了编码抗体轻链的核酸序列。
图9是描绘抗EGFRvIII抗体131(黑色虚线)、Ab131-DM1缀合物(黑色实线)、抗EGFR抗体(灰色点虚线)的结合特异性的曲线图。
图10是根据毒素(DM1)当量(左图)或Ab131-DM1缀合物当量(右图)描绘U251vIII细胞生长抑制的两个标绘图。
图11是根据用媒介物、5.3mg/kg的AB131-DM1缀合物、17.8mg/kg的AB131-DM1缀合物或对照缀合物处理,描绘在D317皮下异种移植物中检测到的磷酸-组蛋白H3(+)细胞的数量(纵轴)的曲线图。
图12是根据时间描绘已经用单剂量的对照缀合物或1.7mg/kg、5.6mg/k8或17mg/kg的Ab131-DM1缀合物处理的U251vIII异种移植物中的肿瘤体积(纵轴)的曲线图。
图13是根据时间描绘已经用媒介物、对照缀合物、抗EGFRvIII抗体131或Ab131-DM1缀合物处理的D317皮下异种移植物中的肿瘤体积(纵轴)的曲线图。
图14是描绘已经用媒介物、对照缀合物或单剂量的7.3mg/kg、14.6mg/kg或22mg/kg的Ab131-DM1缀合物处理的D317皮下异种移植物中的肿瘤体积(纵轴)的曲线图。
优选实施方案的详述
正如以上所讨论的,EGFRvIII是EGFR的缺失突变体,其中EGFr胞外结构域中267个氨基酸在接合点经甘氨酸的单个氨基酸取代而缺失。在图1中野生型EGFR和EGFRvIII之间的序列比对中示出了这些特征。考虑到缺失接合点处甘氨酸的氨基酸取代,生成EGFRvIII中存在,在野生型EGFR中不存在的新型表位的抗体在理论上变得可能。因此,设计了用于免疫和筛选的肽,称为PEP3,如图2所示(Kuan等,EGF mutant receptor vIII as a molecular target in cancer therapy.Endocr Relat Cancer.8(2):83-96(2001))。此类14-mer肽具有为EGFRvIII和野生型EGFR共有的5n-末端氨基酸,唯一的甘氨酸接合位点及野生型EGFR(与残基273-280相对应)和EGFRvIII(与残基7-14相对应)之间保守序列中所含的8个氨基酸残基。另外,成胶质细胞瘤细胞和经编码EGFRvIII的基因转染的细胞(B300.19细胞)也用于免疫和筛选(本文有时称为B300.19/EGFRvIII转染子)。
为了生成抗EGFRvIII的人抗体,用成胶质细胞瘤细胞/EGFRvIII、B300.19/EGFRvIII细胞和针对与野生型EGFR相比,EGFRvIII中示出的新型胞外结构域中的接合区的肽(PEP3)的组合使转基因小鼠免疫。分离来自免疫小鼠的B细胞并且用于生成杂交瘤,接着筛选与EGFRvIII的结合,或使用XenoMaxTM/SLAMTM技术直接用于筛选与EGFRvIII的结合(Babcook等,A novel strategy forgenerating monoclonal antibodies from single,isolated lymphocytesproducing antibodies of defined specificities.Proc Natl Acad Sci U SA.93(15):7843-8(1996)和美国专利No.5,627,052)。在一系列测定中筛选经鉴定与EGFRvIII结合的抗体以确定EGFRvIII的特异性识别。通过这一过程,生成多组与EGFRvIII结合并且对EGFRvIII有特异性的人单克隆抗体,分离并且表征。后续表位作图证明了独特但是重叠的特异性。进一步在体外评估了所有抗体为了将细胞毒性药物递送至细胞,被细胞内化的能力。使展示出有效药物递送的抗体直接与细胞毒性药物缀合并在体外和体内检查其杀伤表达EGFRvIII的肿瘤细胞的能力。这些研究为接下来生成治疗肿瘤隐匿有特定遗传损伤的患者的癌症的抗体药物缀合物提供了基础。
通过上述过程,生成多组全人抗EGFRvIII抗体。使用杂交瘤方法,生成几种与野生型EGFR的交叉反应性受限的抗体,包括在ELISA中与PEP3的结合呈阳性的抗体13.1、13.2、13.3和13.4。这些当中,选择抗体13.1(并且特别是其亚克隆13.1.2)做进一步研究和开发。使用XenoMax方法,生成一组与pep3寡核苷酸结合有高度特异性并且与野生型EGFR的交叉反应性受限的抗体,包括131、139、250和095。在这些中,131抗体具有非常有趣的性质。图4-7中显示了每种抗体的序列(SEQ ID NO:1-33和141-144)。进行各种抗体序列和结合能力的比较并且在图4-10中显示了结果。正如图9A-9L和图10A-10D中可见,与ABX-EGF相比,抗体131、139和13.1.2全部对EGFRvIII表达细胞(H1477)展示出优良选择性。图9M-9P中以曲线图形式示出了一些结果,证明仅与EGFRvIII细胞相比,至少两种抗体13.1.2和131对EGFRvIII表达细胞展示出优良选择性。另外,检查了本实施方案抗体的几种可能实用性;图11-16中示出了其结果。最后,基于预测的结构模型,制成了抗体的变体以便获得结合特征改变的抗体。
进一步地,本发明的抗体对筛选与相同或相似表位结合的其它抗体非常有用。在交叉竞争研究中可利用本发明的抗体阐明就形成的抗原-抗体复合物的特征而论,预计作用相同或改善的其它抗体。
抗体131和13.1.2的每一个对EGFRvIII均具有非常高的亲和力,受细胞内化量化,并且似乎在与毒素缀合时,在细胞杀伤方面高度有效。有趣的是,尽管在XenoMouse小鼠的不同免疫中生成并且利用不同技术,两种抗体仍源自非常相似的种系基因。然而,基于表位作图工作,每种抗体似乎与EGFRvIII分子上稍有不同的表位结合并且在EGFRvIII上具有结合所必需的稍有不同的残基。这些结果表明,种系基因利用对生成靶向EGFRvIII的抗体治疗剂很重要并且小小的变化就可以允许基于这些结构发现,进一步设计抗体和其它治疗剂的方式,改变抗体的结合和作用。
与相同表位结合或与13.1.2和131抗体竞争结合的抗体非常可取。正如下面更加详细描述的那样,通过在SPOT测定中的丙氨酸扫描,已经阐明了某些抗体结合的重要残基。相应地,共用关键结合残基的抗体也非常可取。
定义
除非另有定义,本文使用的科技术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。进一步地,除非上下文另有要求,单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。通常,连同本文所述的细胞和组织培养、分子生物学及蛋白质和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交使用的命名及其技术是本领域中众所周知并且常用的。标准技术拥有充足DNA、寡核苷酸合成及组织培养和转化(例如,电穿孔、脂质转染)。根据生产商的说明书或如本领域通常所实现那样或如本文所述完成酶促反应和纯化技术。通常根据本领域众所周知的常规方法和如本说明书从头至尾叙述和讨论的各种概括和更具体的参考文献中所述完成前述技术和程序。见,例如Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989),其通过引用并入本文。连同本文所述分析化学、合成有机化学、药物与制药化学使用的命名及其实验室程序和技术是本领域中众所周知并且常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送及患者治疗。
术语“Macdonald标准”应指Macdonald DR,Cascino TL,ScholdSC Jr,Cairncross JG.Response criteria for phase IIstudies ofsupratentorial malignant glioma.J Clin Oncol.1990;8:1277-1280中列出的标准。
术语“RANO标准”应指Wen PY,Macdonald DR,Reardon DA等,Updated Response Assessment Criteria for High-Grade Gliomas:Response Assessment in Neuro-Oncology Working Group.J ClinOncol.2010;28:1963-1972中列出的标准。
术语“完全反应(CR)”应指间隔至少4周,连续MRI成像扫描上所有增大肿瘤消失,类固醇减少并且在神经学上稳定或改善。
术语“增强损伤”应指基于尺寸(横截面积最大的损伤)和精确重复测量的稳定性选择的损伤。
术语“部分反应(PR)”应指间隔至少4周,连续MRI成像扫描上增大肿瘤的大小减小≥50%,类固醇稳定或减少并且在神经学上稳定或改善。
术语“无进展生存期(PFS)”定义为不管原因如何,从首次施用Ab-131-DM1之日起到疾病进展的放射学迹象(MRI扫描之日)或死亡之日的天数。
术语“阳性反应”应指与首次施用抗EGFRvIII抗体缀合物之前哺乳动物的这些参数相比,肿瘤大小减小、表观扩散系数增大、循环肿瘤细胞减少、与肿瘤相关的循环外显子组减少。也指根据Macdonald或Rano标准测量的无进展生存期、完全反应和部分反应。也指生存期增加。
术语BiTE或双特异性T细胞衔接器应指包含不同抗体的两个单链可变片段的融合蛋白(scFv),其中一个scFv经CD3受体与T细胞结合而另一个scFv与肿瘤细胞上表达的分子结合。已经在USSN735,2641、7,820,166、8,076,450、8101,722和8,236,308中描述了双特异性T细胞抑制剂。
术语“表观扩散系数”应具有Chenevert,T.L.等,Diffudion MagnetResonance Imaging:an Early Surrogate Marker of Therapeutic Efficacyin Brain Tumors.Journal of the National Cancer Institute,第92卷,No.24,2000年12月20日中列出的含义。
如本文所使用的术语“经分离多核苷酸”应指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某一组合,根据其来源,“经分离多核苷酸”(1)与其中在自然界中发现“经分离多核苷酸”的整个或部分多核苷酸没有关联,(2)和与之在自然界中连接的多核苷酸可操作地连接,或(3)在自然界中未作为较大序列的一部分出现。
本文提到的术语“分离蛋白”指cDNA、重组RNA或合成来源的蛋白质或其某一组合,根据其来源或衍生来源,“分离蛋白”(1)与在自然界中发现的蛋白质没有关联,(2)没有来自相同来源的其它蛋白质,例如没有鼠蛋白,(3)由来自不同物种的细胞表达,或(4)在自然界中不存在。
本文将术语“多肽”作为通用术语用于指天然蛋白质、多肽序列的片段或类似物。因此,天然蛋白质、片段和类似物是多肽属的物种。根据本发明优选的多肽包含人重链免疫球蛋白分子和人κ轻链免疫球蛋白分子,以及通过包含重链免疫球蛋白分子和轻链免疫球蛋白分子,例如κ轻链免疫球蛋白分子或λ轻链免疫球蛋白分子的组合形成的抗体分子,并且反之亦然,及其片段和类似物。
如本文所使用的应用于一个对象的术语“天然存在的”指对象可以在自然界中找到的事实。例如,可从自然界中的来源分离的生物体(包括病毒)中存在并且在实验室中尚未人为故意修饰或天然存在的多肽或多核苷酸序列。
如本文所使用的术语“可操作地连接”指这样描述的组分的位置呈允许其以预期方式起作用的关系。以这样的方式连接与编码序列“可操作地连接”的控制序列,以致在与控制序列相容的条件下完成编码序列的表达。
如本文所使用的术语“控制序列”指实现与之连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质因宿主生物而异;在原核生物中,此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列;在真核生物中,通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”在最低限度上包括其存在对表达和加工必不可少的所有组件并且也可包括其存在有利的附加组件,例如前导序列和融合伴侣序列。
如本文所提到的术语“多核苷酸”指长度为至少10个碱基的核苷酸聚合形式,核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。术语包括单链和双链形式的DNA。
如本文所提到的术语“寡核苷酸”包括通过天然存在和非天然存在的寡核苷酸连键连接在一起的天然存在和经修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含200个碱基或更少长度的多核苷酸亚类。优选地,寡核苷酸长度为10至60个碱基并且最优选长度为12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个碱基。寡核苷酸为单链,例如对于探针而言;虽然寡核苷酸可为双链,例如用于构建基因突变体。本发明的寡核苷酸可为有义或反义寡核苷酸。
如本文所提到的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。如本文所提到的术语“经修饰的核苷酸”包括具有经修饰或经取代的糖基的核苷酸等。如本文所提到的术语“核苷酸连键”包括寡核苷酸连键例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、磷酰胺酯等。见例如LaPlanche等,Nucl.Acids Res.14:9081(1986);Stec等,J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984);Stein等,Nucl.Acids Res.16:3209(1988);Zon等Anti-Cancer Drug Design6:539(1991);Zon等,Oligonucleotides andAnalogues:APractical Approach,第87-108页(F.Eckstein编辑,OxfordUniversity Press,Oxford England(1991));Stec等,美国专利No.5,151,510;Uhlmann和Peyman Chemical Reviews90:543(1990),其公开内容据此通过引用并入。若需要,寡核苷酸可包括用于检测的标记。
如本文所使用的术语“变体”为不同与叙述的多肽或多核苷酸,但是只有这样蛋白质的活性未受不利改变的多肽、多核苷酸或分子。可能有表位的变体。可能有抗体的变体。在一个优选实施方案中,蛋白质变体与表位结合的能力未受不利改变。在一个实施方案中,蛋白质变体可以野生型mAb的10-500%的能力结合。例如,蛋白质变体可以野生型mAb的10%、50%、110%、500%或大于500%的能力结合。在一个实施方案中,包括介于10-500%之间的结合能力范围。可能用很多方式反映结合能力,包括但不限于变体对表位的ka、kd或KD。在一个优选实施方案中,表位是在本说明书中描述的表位。
在一个实施方案中,变异抗体与野生型序列的不同可在于有五个氨基酸或更少的取代、缺失或添加。通常可通过修饰公开多肽序列的其中一个,并且使用(例如)本文所述的代表性程序评估经修饰多肽的结合性质鉴定此类变体。在另一实施方案中,多肽变体优选表现出与经鉴定多肽至少约70%,更有选择至少约90%并且最优选至少约95%同一性。优选地,变体仅仅在保守性取代和/或修饰方面不同。变异蛋白质包括结构上相似的蛋白质和与本说明书中描述的蛋白质结构在功能上等效的蛋白质。在另一实施方案中,如果与本说明书中描述的蛋白质在功能上等效,则所述蛋白质为变体,只要变体的互补位与说明书中描述的互补位相似。在一个实施方案中,具有与图17中描述的互补位相似形状的任何物质均为变体。在一个实施方案中,具有与图18中描述的互补位相似形状的任何物质均为变体。在一个实施方案中,具有与图19A和19B中描述的相互作用表面相似形状的任何物质均为变体。
在一个实施方案中,如果核酸序列可在严格条件下与野生型序列选择性杂交,在所述抗体为变体。在一个实施方案中,适合的中等严格条件包括在5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8:0)溶液中预洗;在50℃-65℃下用5×SSC杂交整夜或如果有跨物种同源性,在45℃下用0.5×SSC杂交;接着在65℃下周各含0.1%SDS的2×、0.5×和0.2×SSC洗涤两次,每次20分钟。此类杂交DNA序列也在本发明范围之内,由于密码简并,编码由杂交DNA序列编码的抗体多肽的核苷酸序列也一样。如本文所提到的术语“选择性杂交”指可检测且特异性地结合。在将与非特异性核酸的可检测结合的可观量减到最小的杂交和洗涤条件下,根据本发明所述的多核苷酸、寡核苷酸及其片段与核酸链选择性杂交。正如本领域所知和本文所讨论那样,高度严格条件可用于获得选择性杂交条件。通常,本发明的多核苷酸、寡核苷酸和片段与目标核酸序列之间的核酸序列同源性将为至少80%,并且更通常地,优选至少85%、90%、95%、99%和100%的递增同源性。如果其序列之间存在部分或完全同一性,则两个氨基酸序列同源。例如,85%同源性指在比对两个序列的最大匹配时85%的氨基酸相同。在最大匹配中允许空位(在两个匹配序列的任一个中);优选5个或更少的空位长度,更优选2个或更少。可选且优选地,与本文使用这个术语一样,如果使用具有突变数据矩阵和为6或更高的空位罚分的程序ALIGN,两个蛋白质序列(或源自其中的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)的比对得分超过5(标准偏差单位),则它们同源。见Dayhoff,M.O.,在Atlas of Protein Sequence and Structure中,第101-110页(第5卷,National Biomedical Research Foundation(1972))和该卷的增刊2,第1-10页。如果在使用ALIGN程序最佳比对时,其氨基酸大于或等于50%相同,则所述两个序列或其部分更加优选地同源。本文使用术语“对应”指多核苷酸序列与整个或部分参考多核苷酸序列同源(即,相同,在进化上不严格相关),或多核苷酸序列与参考多核苷酸序列相同。相反,本文使用术语“互补”指互补序列与整个或部分参考多核苷酸序列同源。举例说明,核苷酸序列“TATAC”与参考序列“TATAC”对应并且与参考序列“GTATA”互补。
使用下列术语描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系:“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“大体同一性”。“参考序列”是用作序列比较的基础的规定序列;参考序列可为较大序列的亚类,例如序列表中指定的全长cDNA或基因序列的片段或可包含完整cDNA或基因序列。通常,参考序列长度为至少18个核苷酸或6个氨基酸,常常长度为至少24个核苷酸或8个氨基酸,并且往往长度为至少48个核苷酸或16个氨基酸。因为两个多核苷酸或氨基酸序列可能各自(1)包含两个分子之间相似的序列(即,完整多核苷酸或氨基酸序列的一部分),并且(2)可能进一步包含所述两个多核苷酸或氨基酸序列之间不同的序列,通常通过比较两个分子在“比较窗口”上的序列进行两个(或更多个)分子之间的序列比较以鉴定和比较序列相似的局部区域。如本文所使用,“比较窗口”指至少18个相连核苷酸位置或6个氨基酸的概念片段,其中可将多核苷酸序列或氨基酸序列与至少18个相连核苷酸或6个氨基酸的参考序列做比较,并且其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比,比较窗口中的多核苷酸序列部分可包含20%或更少的添加、缺失、取代等(即,空位),以最佳比对所述两个序列。可通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法,通过Needleman和Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法,通过Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性方法搜索,通过计算机化执行这些算法(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(GeneticsComputer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)、Geneworks或MacVector软件包),或通过检查进行用于比对比较窗口的序列的最佳比对,并且选择通过不同方法产生的最佳比对(即,在比对窗口上产生最高同源性百分比)。
术语“序列同一性”指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口上相同(即,在核苷酸与核苷酸或残基与残基基础上)。术语“序列同一性百分比”通过以下计算:在比较窗口上比较最佳比对序列,测定两个序列中相同核酸碱基(例如,A、T、C、G、U或I)或残基出现的位置数量以获得匹配位置数量,匹配位置数量除以比较窗口中位置的总数(即,窗口大小),并且将结果乘以100以获得序列同一性百分比。如本文所使用的术语“大体同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征,其中所述多核苷酸或氨基酸包含与参考序列相比,在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口上,常常在至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的比较窗口上,具有至少85%序列同一性,优选至少90至95%序列同一性,更通常至少99%序列同一性的序列,其中通过比较参考序列与在比较窗口上可能包括参考序列的总共20%或更少的缺失或添加的序列计算序列同一性百分比。参考序列可为较大序列的亚类。与野生型蛋白质或核酸有大体同一性的氨基酸或核酸是野生型蛋白质或核酸的实例。
如本文所使用,二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis(第2版,E.S.Golub和D.R.Gren编辑,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其通过引用并入本文。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸),非天然氨基酸例如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常规氨基酸也可能是本发明多肽的适合组分。非常规氨基酸的实例包括:4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其它类似氨基酸和亚氨基酸(例如,4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中,根据标准用法和惯例,左手方向为氨基端方向而右手方向为羧基端方向。
类似地,除非另有说明,单链多核苷酸序列的左手末端为5′末端;双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录产物5′至3′添加的方向称为转录方向;具有与RNA相同的序列的DNA链上并且在RNA转录产物5′末端的5′的序列区域称为“上游序列”;具有与RNA相同的序列的DNA链上并且在RNA转录产物3′末端的3′的序列区域称为“下游序列”。
正如应用到多肽那样,术语“大体同一性”指(例如)通过程序GAP或BESTFIT,使用默认空位权重,最佳比对时,两个肽序列共有至少80%序列同一性,优选至少90%序列同一性,更优选至少95%序列同一性和最优选至少99%序列同一性。优选地,不相同的残基位置不同之处在于保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代指具有相似侧链的残基的可互换性。例如,一组具有脂肪族侧链的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸为丝氨酸和苏氨酸;一组具有含酰胺的侧链的氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺;一组具有芳香族侧链的氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;一组具有碱性侧链的氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸;并且一组具有含硫侧链的氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基为:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。具有大体同一性的多肽可为变体。
变异蛋白质也包括具有较小变化的蛋白质。如本文所讨论,将抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的较小变化视为本发明涵盖,条件是氨基酸序列的变化保持至少75%,更优选至少80%、90%、95%并且最优选99%。具体而言,考虑到了保守性氨基酸置换。
保守性置换是在其侧链上相关的氨基酸家族中发生的置换。基因编码的氨基酸通常分为家族:(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸;(2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸;(3)非极性=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸;和(4)不带电、极性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更优选的家族为:丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基家族;天冬酰胺和谷氨酰胺为含酰胺的家族;丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族;并且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香族。例如,特别是如果置换不牵涉骨架位点中的氨基酸,则预料异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸,谷氨酸对天冬氨酸,丝氨酸对苏氨酸的单独置换或结构相关的氨基酸对氨基酸的类似置换不会对所得分子的结合或性质有重大影响是合理的。可通过测定多肽衍生物的特定活性,容易地确定氨基酸变化是否产生功能肽。本文详细地描述了测定。本领域中的普通技术人员可容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。片段或类似物的优选氨基-和羧基-端出现在功能结构域的边界附近。可通过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私有序列数据库鉴定结构和功能结构域。优选地,使用计算机化比较方法鉴定在已知结构和/或功能的其它蛋白质中出现的序列基序或预测蛋白质构象结构域。已知鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法。Bowie等,Science253:164(1991)。因此,前述实例证明,本领域的技术人员可根据本文所述抗体识别可用于限定结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
优选氨基酸取代为:(1)降低对蛋白质水解的敏感性,(2)降低对氧化的敏感性,(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力,(4)改变结合亲和力,和(4)赋予或改变此类类似物的物理化学或功能性质的氨基酸取代。类似物可包括除天然存在的肽序列以外的序列的各种突变蛋白质。例如,可在天然存在的序列中(优选在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中)产生单个或多个氨基酸取代(优选保守性氨基酸取代)。保守性氨基酸取代大体上不得改变母体序列的结构特征(例如,置换氨基酸不得趋于使母体序列中出现的螺旋断裂,或破坏表征母体序列的其它类型的二级结构)。在Proteins,Structures andMolecular Principles(Creighton编辑,W H.Freeman and Company,New York(1984));Introduction to Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991));和Thornton等,Nature354:105(1991)中描述了本领域公认的多肽二级和三级结构的实例,其各自通过引用并入本文。
如本文所使用的术语“多肽片段”指具有氨基端和/或羧基端缺失的多肽,但是其中剩余氨基酸序列与(例如)从全长cDNA序列推导的天然存在的序列中的相应位置相同。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长,优选至少14个氨基酸长,更优选至少20个氨基酸长,通常至少50个氨基酸长,并且甚至更优选至少70个氨基酸长。如本文所使用的术语“类似物”指由与推导氨基酸序列的一部分具有大体同一性的至少25个氨基酸的片段组成的多肽。类似物通常至少20个氨基酸长,优选至少50个氨基酸长或更长,并且常常可与天然存在的全长多肽一样长。片段和类似物均为变体形式。
肽类似物常用于制药工业中作为具有类似于模板肽的性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“模拟肽”。Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986);Veber和Freidinger,TINSp.392(1985);和Evans等,J.Med.Chem.30:1229(1987),其通过引用并入本文。常常借助于计算机分子建模研发此类化合物。结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物可用于产生等效治疗或预防效果。通常,模拟肽在结构上与范例多肽(即,具有生物化学性质或药理活性的多肽),例如人抗体相似,但是其一个或多个肽键通过本领域众所周知的方法经选自以下的连键任选置换:--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和-CH2SO--。相同类型的D-氨基酸对共有序列的一个或多个氨基酸的系统性取代(例如,D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可用于生成更加稳定的肽。另外,可通过本领域已知的方法(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387(1992),通过引用并入本文);例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫桥键的内部半胱氨酸残基,生成包含共有序列或大体上相同的共有序列变异的限制性肽。肽模拟物和模拟肽均为变体形式。
“抗体”或“抗体肽”指完整抗体或其与完整抗体竞争特异性结合的结合片段。通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学裂解生成结合片段。结合片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv和单链抗体。据悉,除“双特异性”或“双功能”抗体以外的抗体的每个结合位点相同。当过量抗体使与反受体结合的受体的量减少至少约20%、40%、60%或80%,并且更通常大于约85%(在体外竞争结合测定中测量)时,抗体大体上抑制受体与反受体的粘着。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合或与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面分型组成,例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链并且通常具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可为“线性”或“构象型”。在线性表位中,蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点均沿蛋白质的一级氨基酸序列呈线性出现。在构象表位中,相互作用点越过蛋白质上相互分开的氨基酸残基出现。据说,当解离常数≤1μM,优选≤100nM并且更优选≤10nM,甚至更优选≤1nM时,抗体特异性结合抗原。一旦确定抗原上的所需表位,例如使用本发明描述的技术,就可能生成该表位的抗体。可选地,发明过程中,抗体的生成和表征可阐明关于所需表位的信息。然后可能由该信息,竞争性筛选与相同表位结合的抗体。实现这一目标的方法是进行交叉竞争研究以发现相互竞争性结合的抗体,例如抗体竞争与抗原结合。在国际专利申请No.WO03/48731中描述了基于其交叉竞争“结合”抗体的高通量过程。正如本领域技术人员将意识到那样,实际上抗体可特异性结合的任何事物均可为表位。表位可包含抗体结合的残基。在一个实施方案中,表位为EGFRvIII表位。在一个实施方案中,表位包含序列LEEKKGNYVVTD(SEQ ID NO:59)。在一个实施方案中,表位包含序列EEKKGNYVVT(SEQ ID NO:57)。在一个实施方案中,表位包含序列EKNY(SEQ ID NO:60)。在一个实施方案中,表位包含序列EEKGN(SEQ ID NO:61)。本领域的技术人员将意识到,实际上这些在单个肽上不需要按这个顺序组装,更确切地说,这些是形成与互补位相互作用的表位的残基。正如本领域技术人员将意识到那样,产生分子形状的残基或侧链占据的空间帮助决定表位是什么。同样,与表位缔合的任何官能团、范德华相互作用(van der Waals interaction)、侧链的移动程度等全部可以决定表位实际上是什么。因此表位也可包括能量相互作用。
术语“互补位”意在描述决定与表位的结合的结合区域的总体结构。这种结构影响结合区域是否和可能以何种方式与表位结合。互补位可指抗体负责抗体或其片段与抗原决定簇结合的抗原位点。互补位还指抗体的独特位和与表位结合的互补决定区(CDR)。在一个实施方案中,互补位为图17中的L1 10、L2 30、L3 50、H1 20、H2 40和H3 60的抗体区域。在一个实施方案中,互补位为包含实施例16中L1、L2、L3、H1、H2和H3的CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中,互补位为图18中的L1 110、L2 130、L3 150、H1 120、H2 140和H3 160的抗体区域。在一个实施方案中,互补位为包含实施例18中L1、L2、L3、H1、H2和H3的CDR序列的抗体区域。在一个实施方案中,互补位包含实施例18中列出的序列。在一个实施方案中,互补位包含如图19A和图19B所示与表位相互作用的残基。黑色实体结构为肽结构。在一个实施方案中,互补位包含13.1.2mAb的残基Tyr172Arg。在一个实施方案中,13.1.2mAb的互补位包含至少一个选自以下的残基:Tyr172Arg、Arg101Glu、Leu99Asn、Leu99His、Arg101Asp、Leu217Gln、Leu99Thr、Leu217Asn、Arg101Gln和Asn35Gly。正如本领域技术人员将意识到那样,任何抗体或其变体的互补位均可按本发明提出的方式确定。如果预测贡献10%的结合能,则将残基视为“重要”。在一个实施方案中,如果预测贡献2%的结合能,则将残基视为“重要”。在一个实施方案中,如果预测贡献50%的结合能,则将残基视为“重要”。在一个实施方案中,如果预测与表位的表面或互补位的表面相互作用,则将残基视为“重要”。在一个实施方案中,如果改变残基导致丧失结合,则将残基视为“重要”。
术语“特异性”或“优先”结合或类似短语并非意在指抗体专门与所述表位结合。更确切地说,意思是抗体或其变体可与表位结合,程度高于抗体与抗体对其暴露的至少一种其它物质结合。在一个实施方案中,特异性结合抗体将以高于和EGFR蛋白质结合的亲和力(更紧密或较低KD)与EGFRvIII蛋白质结合。例如,特异性结合抗体将更紧密地结合,至少最小增加1、1-2、2-5、5-10、10-20、20-30、30-50、50-70、70-90、90-120、120-150、150-200、200-300、300-500、500-1000%或更多。
氨基酸、数字、氨基酸的简写例如Leu217Gln指在编号氨基酸处从第一个氨基酸向第二个氨基酸的突变。因此,Tyr172Arg将指虽然野生型蛋白质在位置172处具有酪氨酸,但是突变体在位置172处具有精氨酸。
本文使用术语“试剂”指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制备的提取物。
在本文使用时“哺乳动物”指视为哺乳动物的任何动物。优选地,哺乳动物为人。
用酶(木瓜蛋白酶)消化抗体产生两个相同抗原结合片段,也称为“Fab”片段和“Fc”片段,没有抗原结合活性但是有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)消化抗体产生F(ab’)2片段,其中所述抗体分子的两臂保持连接并且包含两个抗原结合位点。F(ab’)2片段具有交联抗原的能力。
在本文使用时“Fv”指抗体的保留了抗原识别和抗原结合位点的最小片段。也可将这些片段视为抗体的变体。
在本文使用时“Fab”指抗体的包含轻链恒定结构域和重链CH1结构域的片段。
术语“mAb”指单克隆抗体。
对XenoMax方法生成的抗体序列的描述代码如下:“AB”-指抗体,“EGFRvIII”-指抗体的结合特异性,“X”指XenoMouse小鼠来源的,“G1”-指IgG1同种型或“G2”指IgG2同种型,最后三个数字指从中得到抗体的单细胞数量,例如:AB-EGFRvIII-XG1-095将为来自IgG1同种型和细胞数量为95的XenoMouse小鼠的对EGFRvIII具有结合特异性的抗体。
术语“SC”指单细胞并且特定XenoMax方法来源的抗体可称为后面为三个数字的SC或仅为在本文中指从中得到抗体的单细胞数量的三个数字。
对杂交瘤来源的抗体序列的描述代码如下:“AB”-指抗体,“EGFRvIII”-指抗体的结合特异性,“X”指XenoMouse小鼠来源的,“G1”-指IgG1同种型或“G2”指IgG2同种型,“K”指κ,“L’指λ。最后三个数字指从中得到抗体的克隆,例如:AB-EGFRvIII-XG1K-13.1.2。
如本文所使用的“标记”或“经标记”指向多肽添加可检测部分,例如放射性标记、荧光标记、酶标记、化学发光标记或生物素基。放射性同位素或放射性核素可包括3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I,荧光标记可包括若丹明、镧系元素磷或FITC并且酶标记可包括辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶。
如本文所使用的术语“药剂或药物”指向患者适当施用时,能够诱导所需疗效的化学化合物或组合物。本文的其它化学术语根据本领域中的常规用法使用,如The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.编辑,McGraw-Hill,San Francisco(1985))(通过引用并入)为例。
如本文所使用,“大体上纯净”指目标种类为存在的优势种类(即,按摩尔计,比组合物中任何其它个别种类更加丰富),并且优选地大体上纯化的部分是其中目标种类包含存在的所有大分子种类的至少约50%(按摩尔计)的组合物。通常,大体上纯净的组合物将包含组合物中存在的所有大分子种类的80%以上,更优选约85%、90%、95%、99%和99.9%以上。最优选地,将目标种类纯化至必需同质性(通过常规检测方法在组合物中不可检测出污染物种类),其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语“患者”包括人和兽医受试者。
术语“技术”指“选择淋巴细胞抗体法”(Babcook等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,i93:7843-7848(1996)和Schrader,美国专利No.5,627,052,二者通过引用整体并入)。
术语“XenoMaxTM”指SLAM技术与小鼠的使用(如下所述)。
抗体结构
已知抗体基本结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成,每一对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定主要负责效应功能的恒大区。人轻链分为κ和λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常见,Fundamental Immunology第7章(Paul,W.,编辑,第2版,Raven Press,N.Y.(1989))(出于种种目的,通过引用整体并入)。每条轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。
因此,完整抗体具有两个结合位点。除在双功能或双特异性抗体中外,所述两个结合位点相同。
所述链全部展现出通过三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的骨架区(FR)的相同总体结构。来自每一对的两条链的CDR通过骨架区对齐,使得能够与特异性表位结合。从N端到C端,轻链和重链包含结构域FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。对每个结构域的氨基酸分配根据Kabat Sequences of Proteinsof Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987年和1991年))或Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987);Chothia等,Nature342:878-883(1989)的定义。
双特异性或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体。可通过多种方法,包括融合杂交瘤或链接Fab′片段,生成双特异性抗体。见例如Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990),Kostelny等,J.Immunol.148:1547-1553(1992)。双特异性抗体的生成可以是与常规抗体的生成相比相对劳动密集型的过程并且对于双特异性抗体而言,产量和纯净度通常更低。双特异性抗体不以具有单个结合位点的片段形式(例如,Fab、Fab′和Fv)存在。
除抗体的总体结构方面外,可通过结构方法检查互补位和表位之间更具特异性的相互作用。在一个实施方案中,CDR的结构形成互补位,抗体通过互补位能够与表位结合。可能以多种方式确定此类互补位的结构。可使用传统结构检查方法,例如NMR或x射线晶体学。这些方法可单独或当互补位与表位结合时检查互补位的结构。可选地,可在硅片中生成分子模型。可通过商业包,例如来自Accelrys(SanDiego,CA)的InsightII建模包辅助的同源建模生成结构。简言之,人们可使用待检查抗体的序列搜索已知结构的蛋白质的数据库,例如蛋白质数据库(Protein Data Bank)。鉴定具有已知结构的同源蛋白质后,这些同源蛋白质可用作建模模板。可比对每个可能模板,从而基于模板间的序列比对生成结构。然后可将具有未知结构的抗体的序列与这些模板比对以生成具有未知结构的抗体的分子模型。正如本领域技术人员将意识到那样,有许多在硅片中生成此类结构的替代方法,可使用其中任一种。例如,可采用与Hardman等,发布的美国专利No.5,958,708中描述的采用QUANTA(Polygen Corp.,Waltham,Mass.)和CHARM(Brooks,B.R.、Bruccoleri,R.E.、Olafson,B.D.、States,D.J.、Swaminathan,S.和Karplus,M.,1983,J.Comp.Chem,.4:187)(据此通过引用整体并入)的工艺相似的工艺。
不但互补位的形状在决定可能互补位将是否和在多大程度上与表位结合中很重要,而且表位和互补位之间的相互作用本身是变异抗体设计中的重大信息来源。正如本领域技术人员意识到那样,有多种可研究这种相互作用的方式。一种方式是使用或许如上所述生成的结构模型,然后使用具有对接模块,其中能够对互补位及其表位之间的构象和定向空间进行Monte Carlo搜索的程序,例如InsightII(Accelrys,San Diego,CA)。结果是人们能够估计表位是否和如何与互补位相互作用。在一个实施方案中,仅表位的一个片段或变体帮助决定相关相互作用。在一个实施方案中,整个表位用于互补位和表位之间相互作用的建模。正如本领域技术人员将意识到那样,这两种不同方法具有不同优点和缺点。例如,仅使用表位的片段允许更加详细地检查每条侧链的可能变化,不需要大量时间。另一方面,仅使用表位的片段或仅仅使用表位代替整个蛋白质,可能表位片段的特征与完整表位的特征不相同,从而可能增加计算机建模期间误导的风险。在一个实施方案中,两种方法在有限范围内使用,以便交叉核对结果。在一个优选实施方案中,如果使用表位的变体,将优化为表位的变体包含表位最重要的残基。可通过多种方式测定最重要的残基的同一性,例如本发明实施例4和14所述。
通过使用这些生成的结构,能够确定哪些残基在表位和互补位之间的相互作用中最重要。因此,在一个实施方案中,能够容易地选择改变哪些残基以便改变抗体的结合特征。例如,从对接模型可能显而易见的是,互补位中某些残基的侧链可能在空间上阻碍表位的结合,因此将这些残基改变为具有较小侧链的残基可能有益。可通过许多方式确定这一点。例如,可仅仅考察所述两个模型并基于官能团和接近性估计相互作用。可选地,如上所述,可进行表位和互补位的重复配对,以便获得更有利的能量相互作用。也可确定抗体的多种变体的这些相互作用,以确定抗体可能与表位结合的替代方式。也可结合各种模型确定为了获得具有所需特定特征的抗体,应如何改变抗体的结构。
可通过各种技术测试以上确定的模型。例如,可用以上讨论的程序测定相互作用能,以便确定要进一步检查哪些变体。同样,使用电荷和范德华相互作用测定表位和变异互补位的相互作用能。使用定点突变了解抗体结构的预测变化实际上是否产生结合特征的所需变化。可选地,可对表位进行变化以验证模型正确或确定可能正在互补位和表位之间发生的一般结合主题。
以上为结构建模的方法可用于确定蛋白质结构中哪些变化将产生抗体的特定所需特征。这些方法可用于确定蛋白质结构中哪些变化不会产生所需特征。
正如本领域技术人员将意识到那样,虽然这些模型将提供制备本实施方案的抗体及其变体所必需的指导,但是可能通过体外研究,进行硅片模型的常规试验可能仍然可取。另外,正如本领域技术人员将意识到那样,任何修饰也可能对抗体的活性有附加副作用。例如,虽然预测会导致更强结合的任何改变均可能诱导更强的结合,但是也可能产生可能降低或改变抗体活性的其它结构变化。确定这是否是所述情况在本领域中是常规的并且可以通过许多方式实现。例如,与实施例21中一样,可通过ELISA试验测试活性。可选地,可通过使用表面等离子体共振装置测试样品。
抗体结合和较好结合的变异抗体
在一个实施方案中,上述模型用于增加抗体对其表位的结合能力。所述抗体可更容易地与表位结合,因此具有更高的缔合常数(ka)。可选地,所述抗体可能更缓慢地与表位解离,因此具有更低的解离常数(kd),或表位-互补位相互作用的KD在值上可以更小,从而使得表位与互补位之间的结合程度更高。
在一些实施方案中,变异抗体设计为以相反特征结合。即,所述抗体不一样紧密或可能不一样迅速地结合。
在其它实施方案中,变异抗体与野生型抗体在其KD上没有不同,但是变异抗体对特定表位更具特异性。这可能意味着,设计抗体的互补位与其它表位结合的风险更低。所述抗体可具有已经改变的其它特征。例如,变体可能对非特异性抗体结合更具免疫性或即使当抗体以高浓度存在时,也可能在溶液中保持溶剂化。此类变体可能存在于讨论的抗体中。例如,虽然下面检查的一些变异抗体的较高浓度在Biacore实验中产生较缓慢结合的组分,例如13.1.2mAb,但是某些变体即使在相同浓度下,例如L217N-2.1,也未展现出这种较缓慢的组分。
可产生通过以上确定的模型预测的变体,然后试验以确定它们实际上是否以所需特征结合。可选择与表位的总相互作用能较高的突变体做进一步试验。可通过许多方式测定相互作用能,以上描述了其中一种方式。
可通过许多方式试验这些变体。示例性选择包括而不限于KinExA(例如,Lackie,1994年12月13日发布的专利No.5,372,783,通过引用整体并入本文)(Sapidyne Instruments Inc.,ID,Boise)、表面等离子体共振(SPR)(例如,BIACORETM Biacore,Inc.,Pistcataway,N.J.)、截流荧光法、共振镜和荧光偏振。这些选择中的许多能够不但记录数据,而且提供使数据与各种理论曲线拟合的现成方法并因此测定ka、kd和KD以及其它性质。重要的是注意,这些曲线与所得数据的拟合不是没有一些变化的可能性。正因如此,可以不但通过这些曲线拟合机制,而且相互直接比较和根据本领域技术人员的知识检查相关缔合、解离和平衡常数。
人抗体和抗体的人源化
人抗体避免了具有鼠或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的某些问题。此类鼠或大鼠来源的蛋白质的存在可导致抗体快速清除或可导致患者产生对抗体的免疫反应。为了避免利用鼠或大鼠来源的抗体,可通过向啮齿动物中引入人抗体功能生成全人抗体,以致啮齿动物生成全人抗体。
在YAC中克隆和重构兆碱基大小的人类基因座并将其引入小鼠种系中的能力提供了阐明非常大或粗略绘制的基因座的功能组分以及生成有用的人类疾病模型的有力方法。此外,利用此类技术将小鼠基因座取代为其人类等效物可提供对发育期间人类基因产物的表达和调节,它们与其它系统的联系及其在疾病诱导和进展中的牵连的独特理解。
此类策略的重要实际应用为小鼠体液免疫系统的“人源化”。向其中内源Ig基因已经灭活的小鼠引入人免疫球蛋白(Ig)基因座提供了研究抗体程序性表达和组装的潜在机制及其在B细胞发育中的作用的机会。此外,此类策略可提供生成全人单克隆抗体(mAb)的理想来源一在人类疾病中实现抗体疗法诺言的重要里程碑。预计全人抗体将对小鼠或小鼠衍生化mAb固有的免疫原和变态反应减到最少,因此增加了施用抗体的功效和安全性。可以预计全人抗体的使用在需要重复施用抗体的慢性和复发性人类疾病,例如炎症、自身免疫和癌症的治疗中提供了实质性优势。
实现这一目标的一种方法是预先用人Ig基因座的大片段工程化缺乏小鼠抗体生成的小鼠品系,以致在缺乏小鼠抗体时小鼠将生成大量人抗体。人Ig大片段将保持大可变基因多样性以及对抗体生成和表达的适当调控。通过利用用于抗体多样化和选择的小鼠机制及对人蛋白质免疫耐受性的缺乏,这些小鼠品系中再生的人抗体库应产生抗任何目标抗原,包括人抗原的高亲和力抗体。使用杂交瘤技术,可更容易地生成和选择具有所需特异性的抗原特异性人mAb。如1994年所公开那样,连同我们首个XenoMouse小鼠品系的产生,证明了这种总体策略(见Green等,Nature Genetics7:13-21(1994))。用分别含有人重链基因座和κ轻链基因座的含核心可变和恒定区序列的245kb和190kb大小的种系构造片段的酵母人工染色体(YAC)工程化XenoMouse品系。同上。含YAC的人Ig经证明与用于抗体重排和表达的小鼠系统相容并且能够取代失活小鼠Ig基因。这通过其诱导B细胞发育,生成成人样全人抗体库和生成抗原特异性人mAb的能力证明。这些结果还表明,引入含有更多V基因、附加调控元件和人Ig恒定区的人Ig基因座的较大部分可能大体上概括对感染和免疫的人体液反应特有的完整库。Green等的工作最近延伸到分别通过引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构造YAC片段引入大于约80%的人抗体库。见Mendez等,Nature Genetics15:146-156(1997)和1996年12月3日提交的美国专利申请序列号08/759,620,其公开内容据此通过引用并入。
在1990年1月12日提交的美国专利申请序列号07/466,008、1990年11月8日提交的美国专利申请序列号07/610,515、1992年7月24日提交的美国专利申请序列号07/919,297、1992年7月30日提交的美国专利申请序列号07/922,649、1993年3月15日提交的美国专利申请序列号08/031,801、1993年8月27日提交的美国专利申请序列号08/112,848、1994年4月28日提交的美国专利申请序列号08/234,145、1995年1月20日提交的美国专利申请序列号08/376,279、1995年4月27日提交的美国专利申请序列号08/430,938、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/464,584、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/464,582、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/463,191、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/462,837、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/486,853、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/486,857、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/486,859、1995年6月5日提交的美国专利申请序列号08/462,513、1996年10月2日提交的美国专利申请序列号08/724,752和1996年12月3日提交的美国专利申请序列号08/759,620及美国专利No.6,162,963、6,150,584、6,114,598、6,075,181和5,939,598和日本专利No.3 068 180B2、3 068 506B2和3 068 507B2中进一步讨论和叙述了XenoMouse小鼠的产生。同样见Mendez等,Nature Genetics15:146-156(1997)及Green和Jakobovits,J.Exp.Med.188:483-495(1998)。同样见1996年6月12日准予公布的欧洲专利No.EP 0 463 151 B1、1994年2月3日公布的国际专利申请No.WO 94/02602、1996年10月31日公布的国际专利申请No.WO96/34096、1998年6月11日公布的国际专利申请No.WO 98/24893、2000年12月21日公布的国际专利申请No.WO 00/76310、WO03/47336。以上叙述的每个专利、申请和参考文献的公开内容据此通过引用整体并入。
在替代方法中,包括GenPharm International、Inc.在内的其它人已经利用的“微基因座”方法。在微基因座方法中,通过包括来自Ig基因座的碎片(个别基因)模拟外源Ig基因座。因此,使一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定区和第二恒定区(优选γ恒定区)形成供插入动物的构建体。在Surani等的美国专利No.5,545,807和各自属于Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806、5,625,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,877,397、5,874,299和6,255,458,Krimpenfort和Berns的美国专利No.5,591,669和6,023.010,Berns等的美国专利No.5,612,205、5,721,367和5,789,215和Choi和Dunn的美国专利No.5,643,763,和1990年8月29日提交的GenPharm International美国专利申请序列号07/574,748、1990年8月31日提交的07/575,962、1991年12月17日提交的07/810,279、1992年3月18日提交的07/853,408、1992年6月23日提交的07/904,068、1992年12月16日提交的07/990,860、1993年4月26日提交的08/053,131、1993年7月22日提交的08/096,762、1993年11月18日提交的08/155,301、1993年12月3日提交的08/161,739、1993年12月10日提交的08/165,699、1994年3月9日提交的08/209,74l中描述了这种方法,其公开内容据此通过引用并入。同样见欧洲专利No.0 546 073B1、国际专利申请No.WO 92/03918、WO 92/22645、WO 92/22647、WO 92/22670、WO 93/12227、WO 94/00569、WO 94/25585、WO 96/14436、WO97/13852和WO 98/24884和美国专利No.5,981,175,其公开内容据此通过引用整体并入。另见Taylor等,1992,Chen等,1993,Tuaillon等,1993,Choi等,1993,Lonberg等,(1994),Taylor等,(1994)和Tuaillon等,(1995),Fishwild等,(1996),其公开内容据此通过引用整体并入。
Kirin还证明由其中已经通过微细胞融合,引入了大片染色体或全部染色体的小鼠生成人抗体。见欧洲专利申请No.773288和843961,其公开内容据此通过引用并入。Xenerex Biosciences正在开发人抗体的潜在生成方法。在这种技术中,用人淋巴细胞,例如B和/或T细胞重构SCID小鼠。然后小鼠经抗原免疫并且可对抗原产生免疫反应。见美国专利No.5,476,996、5,698,767和5,958,765。人抗小鼠抗体(HAMA)反应已领导工业制备嵌合或其它人源化抗体。虽然嵌合抗体具有人恒定区和鼠可变区,但是预计将观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)反应,特别是在抗体的长期或多剂量利用中。因此,为了损害HAMA或HACA反应的影响和/或作用,将可取的是提供抗EGFRvIII的全人抗体。
缀合抗体治疗剂
正如本文所讨论的,EGFRvIII抗体的功能似乎对其作用模式的至少一部分很重要。举例而言,用功能指EGFRvIII抗体在与EGFRvIII的作用中的活性。相应地,在某些方面,与生成作为抗EGFRvIII的治疗候选物的抗体有关,可取的是抗体能够固定补体和募集细胞毒性淋巴细胞,从而参与CDC和ADCC。有许多有相同能力的抗体同种型,包括但不限于以下:鼠IgM、鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgM、人IgG1、人IgG3和人IgA。同样,与生成作为抗EGFRvIII的治疗候选物的抗体有关,可取的是抗体能够通过使Fc受体接合在效应细胞例如自然杀伤(NK)细胞上,激活抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。有许多能够ADCC的抗体同种型,包括但不限于以下:鼠IgG2a、鼠IgG2b、鼠IgG3、人IgG1和人IgG3。应意识到,生成的抗体不需要最初具有此类同种型,而是生成的抗体可具有任何同种型并且所述抗体可为此后使用本领域众所周知的常规技术转换的同种型。其中,此类技术包括使用直接重组技术(见例如,美国专利No.4,816,397)和细胞融合技术(见例如,美国专利No.5,916,771和6,207,418)。
在细胞融合技术中,制备具有有任何所需同种型的重链的骨髓瘤或其它细胞系并且制备具有轻链的另一种骨髓瘤或其它细胞系。此后,此类细胞可融合并且可分离表达完整抗体的细胞系。
举例而言,本文讨论的某些抗EGFRvIII抗体为人抗EGFRvIIIIgG1抗体。如果此类抗体具有对EGFRvIII分子的所需结合,可为易于转换以生成人IgM、人IgG3或人IgGA,同时仍具有相同可变区(其限定抗体的特异性及其一些亲和力)的同种型。则此类分子,包括IgG1,将能够固定补体并参与CDC,并且如果包含IgG1或IgG3恒定区,此类分子将还能够通过募集细胞毒性淋巴细胞参与抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)。
相应地,因为生成的抗体候选物满足以上讨论的所需“结构”属性,所以通常可通过同种型转换提供具有至少某些所需“功能”属性的抗体候选物。
其它治疗剂的设计和生成
基于本文对于EGFRvIII生成和表征的抗体的活性,促进了除抗体部位外的其它治疗形式的设计。此类形式包括但不限于先进的抗体治疗剂,例如双特异性抗体、免疫毒素和放射性标记治疗剂,生成肽治疗剂、基因疗法,特别是胞内抗体、反义治疗剂和小分子。
与先进抗体治疗剂的生成有关,补体固定和细胞毒性淋巴细胞的募集是可取属性时,例如可能通过使用双特异性抗体、免疫毒素或放射性标记增强细胞杀伤。
例如,与双特异性抗体有关,可生成双特异性抗体,其包含(i)缀合在一起的两种抗体,一种对EGFRvIII有特异性而另一种对第二分子有特异性,(ii)一条链对EGFRvIII有特异性而第二条链对第二分子有特异性的单一抗体,或(iii)对EGFRvIII和另一种分子有特异性的单链抗体。可使用例如与(i)和(ii)有关(见例如,Fanger等,ImmunolMethods4:72-81(1994)及Wright和Harris,同上)和与(iii)有关(见例如,Traunecker等,Int.J.Cancer(Suppl.)7:51-52(1992))的众所周知的技术生成此类双特异性抗体。在所有情况下,可对Fc链激活受体,包括但不限于CD16或CD64(见例如Deo等,18:127(1997))、CD3(Micromet的BiTE技术)或CD89(见例如Valerius等,Blood90:4485-4492(1997))产生第二特异性。根据前述制备的双特异性抗体将很可能杀伤表达EGFRvIII的细胞,并且特别是在其中本发明的EGFRvIII抗体有效的细胞。
与免疫毒素有关,可利用本领域众所周知的技术修饰抗体以起免疫毒素的作用。见例如,Vitetta Immunol Today14:252(1993)。同样见美国专利No.5,194,594。与放射性标记抗体的制备有关,也可利用本领域众所周知的技术容易地制备此类经修饰的抗体。见例如,Junghans等,在Cancer Chemotherapy and Biotherapy655-686中(第2版,Chafner和Longo编辑,Lippincott Raven(1996))。同样见美国专利No.4,681,581、4,735,210、5,101,827、5,102,990(RE 35,500)、5,648,471和5,697,902。免疫毒素和放射性标记分子中每一个都将很可能杀伤表达EGFRvIII的细胞,并且特别是在其中本文所述抗体有效的细胞。
可将抗体设计为更快结合,或与表位更缓慢地解离,因此可将抗体本身设计为治疗剂。例如,在向患者施用治疗剂时,可利用抗体改变的特征。
治疗性免疫缀合物
正如将意识到那样,与药物、毒素或其它分子缀合的抗体(本文可交换地称为免疫缀合物、免疫毒素或抗体药物缀合物(“ADC”))在表达可被特异性结合分子,例如抗体特异性结合的分子的细胞的靶向杀伤中非常有用。如以上所讨论,已知EGFRvIII不在任何正常组织上表达。进一步地,EGFRvIII在许多人类肿瘤中显示出明显表达。相应地,EGFRvIII是供免疫毒素靶向的极具吸引力的分子。
关于用单克隆抗体-药物缀合物尝试特异性靶向肿瘤细胞已经出现了许多报道(Sela等,在Immunoconjugates189-216中(C.Vogel编辑,1987);Ghose等,在Targeted Drugs1-22中(E.Goldberg编辑,1983);Diener等,在Antibody Mediated Delivery Systems1-23中(J.Rodwell编辑,1988);Pietersz等,在Antibody Mediated Delivery Systems25-53中(J.Rodwell编辑,1988);Bumol等,在Antibody Mediated DeliverySystems55-79中(J.Rodwell编辑,1988)。细胞毒性药物例如氨甲蝶呤(methotrexate)、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱、长春花碱(vinblastine)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)已经与多种鼠单克隆抗体缀合。在一些情况下,药物分子通过中间载体分子例如血清白蛋白(Garnett等,Cancer Res.46:2407-2412(1986);Ohkawa等,CancerImmumol.Immunother.23:81-86(1986);Endo等,Cancer Res.47:1076-1080(1980))、葡聚糖(Hurwitz等,Appl.Biochem.2:25-35(1980);Manabi等,Biochem.Pharmacol.34:289-291(1985);Dillman等,Cancer Res.46:4886-4891(1986);Shoval等,Proc.Natl.Acad.Sci.85:8276-8280(1988))或多聚谷氨酸(Tsukada等,J.Natl.Canc.Inst.73:721-729(1984);Kato等,J.Med.Chem.27:1602-1607(1984);Tsukada等,Br.J.Cancer52:111-116(1985))与抗体分子连接。
已经采用了大量连接子技术制备此类免疫缀合物并且已经研究了可裂解和不可裂解的连接子。然而在大多数情况下,如果药物分子可在靶位点呈未修饰形式从缀合物上释放,则仅可观察到药物的全部细胞毒性潜力。
已经用于制备抗体-药物缀合物的其中一种可裂解连接子为基于顺式乌头酸,利用不同细胞内隔室例如受体介导的内吞作用期间遇到的核内体和溶酶体的酸性环境的酸不稳定连接子。Shen和Ryser介绍了这种方法,用于制备柔红霉素与大分子载体的缀合物(Biochem.Biophys.Res.Commun.102:1048-1054(1981))。Yang和Reisfeld使用相同技术缀合柔红霉素与抗黑素瘤抗体(J.Natl.Canc.Inst.80:1154-1159(1988))。最近,Dillman等也以类似方式使用酸不稳定连接子制备柔红霉素与抗T细胞抗体的缀合物(Cancer Res.48:6097-6102(1988))。
Trouet等采用的替代方法牵涉经由肽间隔臂连接柔红霉素与抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.79:626-629(1982))。这在游离药物可通过溶酶体肽酶的作用从此类缀合物释放的前提下进行。
然而在体外细胞毒性试验中,已经显示抗体-药物缀合物很少达到与游离非缀合药物相同的细胞毒性效力。这表明药物分子从抗体释放的机制非常低效。在免疫毒素领域中,证实经由单克隆抗体和具催化活性的蛋白质毒素之间的二硫桥键形成的缀合物比含有其它连接子的缀合物更具细胞毒性。见Lambert等,J.Biol.Chem.260:12035-12041(1985);Lambert等,在Immunotoxins175-209中(A.Frankel编辑,1988);Ghetie等,Cancer Res.48:2610-2617(1988)。这归因于有助于抗体分子和毒素之间二硫键的有效裂解的细胞内高谷胱甘肽浓度。尽管如此,仅有一些报道的使用二硫桥键制备药物与大分子的缀合物的实例。Shen等描述了氨甲蝶呤向巯基乙酰胺衍生物的转化,接着经由二硫键与聚-D-赖氨酸缀合(J.Biol.Chem.260:10905-10908(1985))。另外,报道描述了含三硫化物的毒性药物刺孢霉素(calicheamycin)与抗体的缀合物的制备(Menendez等,FourthInternational Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates forCancer,San Diego,Abstract81(1989))。另一报道描述了含三硫化物的毒性药物刺孢霉素与抗体的缀合物的制备(Hinman等,53Cancer Res.3336-3342(1993))。
缺乏二硫化物连接的抗体-药物缀合物的一个原因是带有可容易地用于经由二硫桥键连接药物与抗体的含硫原子的部分的细胞毒性药物不可用。此外,不削弱其细胞毒性潜力,对现有药物化学修饰很难。
现有抗体-药物缀合物的另一主要缺点是由于靶向抗原的数量有限并且制癌药物如氨甲蝶呤、柔红霉素和长春新碱的细胞毒性相对温和,现有抗体-药物缀合物不能将足够浓度的药物递送至靶位点。为了达到明显的细胞毒性,大量药物分子直接或通过聚合载体分子与抗体的连接变得必要。然而,此类经大量修饰的抗体常常展示出与靶抗原的结合受损并且在体内从血流中快速清除。
类美登素是高细胞毒性的药物。美登素(maytansine)首次由Kupchan等从东非灌木齿叶美登木分离并且证实比常规癌症化学治疗剂如氨甲蝶呤、柔红霉素和长春新碱细胞毒性高100至1000倍(美国专利No.3,896,111)。随后,发现一些微生物也生成类美登素,例如美登醇(maytansinol)和美登醇的C-3酯(美国专利No.4,151,042)。还报道了美登醇和美登醇的类似物的合成C-3酯(Kupchan等,J.Med.Chem.21:31-37(1978);Higashide等,Nature270:721-722(1977);Kawai等,Chem.Pharm.Bull.32:3441-3451(1984))。已经由其制备了C-3酯的美登醇类似物的实例包括在芳香环或C-9、C-14(例如,羟基化甲基)、C-15、C-18、C-20和C-4,5有修饰的美登醇。
天然存在和合成的C-3酯可分为两类:
(a)与简单羧酸的C-3酯(美国专利No.4,248,870、4,265,814、4,308,268、4,308,269、4,309,428、4,317,821、4,322,348和4,331,598);和
(b)与N-甲基-L-丙氨酸的C-3酯(美国专利No.4,137,230、4,260,608、5,208,020;和Chem.Pharm.Bull.12:3441(1984))。
发现(b)类的酯比(a)类的酯更具细胞毒性。
美登素是有丝分裂抑制剂。已经报道用美登素处理体内L1210细胞会导致67%的细胞在有丝分裂中积累。据报道未处理的对照细胞展示出范围从3.2到5.8%的有丝分裂指数(Sieber等,43ComparativeLeukemia Research1975,Bibl.Haemat.495-500(1976))。海胆卵和蛤蜊蛋的实验表明,美登素通过抑制微管蛋白(tubulin)的聚合妨碍微管形成,抑制有丝分裂(Remillard等,Science189:1002-1005(1975))。
在体外,已经发现P388、L1210和LY5178鼠白血病细胞悬液受10-3-10-1μg/μl剂量的美登素抑制,P388系最敏感。还已证实美登素是人鼻咽癌细胞体外生长的活性抑制剂,并且据报道人急性淋巴母细胞性白血病系CEM受低至10-7mg/ml的浓度抑制(Wolpert-DeFillippes等,Biochem.Pharmacol.24:1735-1738(1975))。
在体内,已经证实美登素有活性。经证实P388淋巴细胞性白血病系统中的肿瘤生长在50至100倍剂量范围内受抑制,这表明治疗指数高;同样,可用L1210小鼠白血病系统、人Lewis肺癌系统和人B-16黑素癌系统证明显著抑制活性(Kupchan,Ped.Proc.33:2288-2295(1974))。
缀合类美登素与细胞结合剂(例如抗体)的现有方法牵涉两个反应步骤。首先用交联剂例如N-吡啶二硫代丙酸琥珀酰亚胺酯(SPDP)修饰细胞结合剂,例如抗体,以向抗体中引入二硫代吡啶基(Carlsson等,Biochem.J.173:723-737(1978);美国专利No.5,208,020)。第二步,向经修饰的抗体添加作为起始试剂的具有硫醇基的反应性类美登素,例如DM1(正式称为N2′-去乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素),导致经修饰抗体中的硫代吡啶基被置换并且生成二硫键连接的细胞毒性类美登素/抗体缀合物(美国专利No.5,208,020)。在USSN11/927,217专利申请(公布No.US 2008/0114153)中描述了使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)连接子的另一种方法。在美国专利No.6,441,163中描述了类美登素缀合的一步法。基于类美登素的免疫毒素技术可从Immunogen Corporation(Cambridge,MA)得到。
另一种重要的毒素技术基于奥里斯他汀(auristatin)毒素。奥里斯他汀源自从印度洋海兔Dolabella获得的作为有效细胞生长抑制物质的多拉司他汀10(Dolastatin10)。见美国专利No.4,816,444和4,978,744。关于其它多拉司他汀,同样见美国专利No.4,414,205(多拉司他汀-1、2和3)、5,076,973(多拉司他汀-3)、4,486,414(多拉司他汀-A和B)、4,986,988(多拉司他汀-13)、5,138,036(多拉司他汀-14)和4,879,278(多拉司他汀-15)。亚利桑那大学的Pettit博士和同事分离和合成的多种奥里斯他汀衍生物已经试验并且证实对细胞有高毒性。见Pettit等,Antineoplastic agents337.Synthesis of dolastatin10structuralmodifications.Anticancer Drug Des.10(7):529-44(1995),Woyke等,Invitro activities and postantifungal effects of the potent dolastatin10structural modification auristatin PHE.Antimicrobial Agents andChemotherapy.45:3580-3584(2001),Pettit等,Specific activities ofdolastatin10and peptide derivatives against Cryptococcus neoformans.Antimicrobial Agents and Chemotherapy.42:2961-2965(1998),WoykeThree-dimensional visualization of microtubules during theCryptococcus neoformans cell cycle and the effects of auristatin PHE onmicrotubule integrity and nuclear localization.Submitted,AntimicrobialAgents and Chemotherapy。
最近,已经研发了在作为抗体上的有效负载递送时似乎非常有效的另外的奥里斯他汀衍生物。例如已经证实与肿瘤特异性抗体缀合时,单甲基奥里斯他汀E(MMAE)为肿瘤细胞的有效毒素。Doronina等,Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates forcancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在线可用),Francisco等,cAC10-vcMMAE,an anti-CD30-monomerhyl auristatin E conjugate withpotent and selective antitumor activity.Blood.(2003)5月8日[打印前的电子出版物]。2003年4月24日电子出版物(在线可用)。除奥里斯他汀分子的毒性外,研究还证实肽连接的缀合物更稳定,并且因此在缓冲液和血浆中对正常组织比其它连接子技术特异性更高而毒性更低。Doronina等,Development of potent monoclonal antibody auristatinconjugates for cancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在线可用),Francisco等,cAC10-vcMMAE,an anti-CD30-monomethyl auristatin Econjugate with potent and selective antitumor activity.Blood.(2003)5月8日[打印前的电子出版物]。2003年4月24日电子出版物(在线可用)。此类连接子基于支链肽设计并且包括(例如)mAb-缬氨酸-瓜氨酸-MMAE和mAb-苯丙氨酸-赖氨酸-MMAE缀合物。Doronina等,Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates forcancer therapy.Nature Biotechnology.(2003)(在线可用),Francisco等,cAC10-vcMMAE,an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate withpotent and selective antitumor activity.Blood.(2003)5月8日[打印前的电子出版物].2003年4月24日电子出版物(在线可用)。例如,King等,Monoclonal antibody conjugates of doxorubicin prepared withbranched peptide linkers:inhibition of aggregation bymethoxytriethyleneglycol chains.J Med Chem.45(19):4336-43(2002)和Dubowehik等,Cathepsin B-sensitive dipeptide prodrugs.2.Models ofanticancer drugs paclitaxel(Taxol),mitomycin C and doxorubicin.Bioorg Med Chem Lett.8(23):3347-52(1998)描述了此类设计和缀合技术。以前面所述为基础的基于奥里斯他汀E的免疫毒素技术可从Seattle Genetics Corporation(Seattle,WA)获得。
有许多从天然来源获得的产生微管的新型化合物-提取物,和似乎具有作为毒素生成免疫缀合物的潜力的半合成和合成类似物。(见网站newmedinc“dot”com)。此类分子及利用此类分子的药品的实例包括下列:秋水仙碱位点粘合剂(Curacin)、康普瑞汀(AVE806,康普瑞汀A-4前药(CA4P),Oxi-4503)、念珠藻素(Cryptophycin)(LY355703)、圆皮海绵内酯(Discodermolide)、多拉司他汀和类似物(奥里斯他汀PHE、多拉司他汀10、ILX-651、Symplostatin1、TZT-1027)、埃博霉素(Epothilone)(BMS-247550、BMS-310705、EPO906、KOS-862、ZK-EPO)、艾榴塞洛素(Eleutherobin)、FR182877、软海绵素B(Halichondrin B)(E7389)、月苄三甲氯铵(Halimide)(NPI-2352和NPI-2358)、哈米特林(Hemiasterlins)(HTI-286)、Laulimalide、类美登素(“DM1”)(美比伐单抗、美坎珠单抗、huN901-DM1/BB-10901TAP、MLN591DM1、My9-6-DM1、Trastuzumab-DM1)、PC-SPES、PelorusideA、白藜芦醇(Resveratrol)、S-烯丙半胱氨酸(SAMC)、海绵抑制素(Spongistatin)、维替乐福酰胺(Vitilevuamide)、分子马达驱动蛋白(SB-715992)、设计的秋水仙碱位点粘合剂(A-289099、A-293620/A-318315、ABT-751/E7010、D-24851/D-64131、ZD6126)、其它新型纺锤体毒素(2-甲氧雌二醇(2-ME2)、苯并咪唑氨基甲酸酯(ANG600系列,甲苯咪唑)、CP248/CP461、HM-214、R440、SDX-103、T67/T607)。进一步地,在Mayer,A.M.S.Marine Pharmacology in1998:Antitumor and Cytotoxic Compounds.The Pharmacologist.41(4):159-164(1999)中评论了另外的海洋来源的毒素。
治疗施用和制剂
作用持续时间延长将允许通过交替肠胃外途径例如静脉、皮下或肌肉注射,更低频率和更方便的给药方案。
用于体内施用时,本文所述的缀合抗体制剂,特别是Ab131-DM1缀合物应无菌。这易于在冻干和复水之前或之后(例如)通过无菌滤膜过滤实现。缀合抗体一般将呈冻干形式或溶液储存。通常将治疗性抗体组合物置于具有无菌入口的容器中,例如具有允许取回制剂的接头(例如皮下注射针可刺破的塞子)的静脉溶液包或小瓶。
抗体施用的途径与已知方法一致,例如通过静脉、腹膜内、大脑内、肌肉、眼内、动脉、鞘内、吸入或病灶内途径,或通过如下所示缓释系统注射或输注。优选通过不断注射或大剂量注射施用抗体。在一个实施方案中经静脉施用Ab131-DM1缀合物。在另一实施方案中通过注射向肿瘤施用Ab131-DM1缀合物。在另一实施方案中经由贮器、储存制剂或植入装置直接向肿瘤不断施用Ab131-DM1缀合物。
在本发明的一些实施方案中,提供了缀合抗体例如Ab131-DM1缀合物的特定给药方案。对于指定患者而言抗体制剂的剂量将由主治医师考虑已知改变药物作用的各种因素决定,包括疾病的严重程度和类型、体重、性别、饮食、施用时间和途径、其它药物和其它相关临床因素。
通常,临床医师将施用抗体直至达到实现所需效果的剂量。这种疗法的进展易于通过常规测定和本文描述的测定监测,包括放射成像例如MRI。
如本文所述的缀合抗体,例如Ab131-DM1缀合物,可制备成与药学上可接受的载体的混合物。治疗性组合物可经静脉或通过鼻子或肺部,优选呈液体或粉雾剂(冻干)施用。如需要,也可经肠胃外或皮下施用组合物。当全身施用时,治疗性组合物应无菌、无热原并且呈适当考虑了pH,例如pH为4至约6,具有等渗性和稳定性的肠胃外可接受的溶液。这些条件为本领域技术人员已知。
简言之,通过混合具有所需纯度的缀合抗体,例如Ab131-DM1缀合物和生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂制备所述化合物的剂型以便储存或施用。此类材料在采用的剂量和浓度下对受者无毒,并且包括缓冲液例如硼酸盐、琥珀酸重碳酸盐、磷酸钠(“NaOAC”)、Tris-HCl、Tris缓冲液、柠檬酸盐、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(即,PBS缓冲液)、醋酸盐和其它有机酸盐;抗氧化剂例如抗坏血酸;低分子量(小于约十个残基)肽(例如聚精氨酸)、蛋白质(例如血清白蛋白)、明胶、免疫球蛋白;亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸;单糖、二糖和其它碳水化合物,包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、蔗糖、甘露糖或糊精;螯合剂例如EDTA;糖醇例如甘露糖醇或山梨糖醇;反离子例如钠和/或非离子表面活性剂(例如吐温(TWEEN)),包括聚山梨醇酯20或80、PLURONICS、三硝基甲苯(triton)、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal)或聚乙二醇。此类剂型可包含一定浓度的化合物,例如Ab131-DM1,范围从1mg/ml至160mg/ml。
可根据Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,MackPublishing Company,Easton,PA,1990)中描述的传统药学实践配制供注射的无菌组合物。例如,可能需要将活性化合物溶解或悬浮在媒介物中,例如水或天然存在的植入油(如芝麻、花生或棉籽油)或合成脂肪媒介物(如油酸乙酯)等。可根据公认的药学实践并入缓冲液、防腐剂、抗氧化剂等。
缓释制剂的适合实例包括含有缀合抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质,所述基质呈成形物品、膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如,Langer等,J.BiomedMater.Res.,(1981)15:167-277和Langer,Chem.Tech.,(1982)12:98-105描述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919、EP58,481)、L-谷氨酸和L-谷氨酸-γ-乙酯的共聚物(Sidman等,Biopolymers,(1983)22:547-556)、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等,同上)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRON DepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
虽然聚合物例如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使分子能够释放100天以上,但是某些水凝胶释放蛋白质的时间段更短。当封装蛋白质长时间留在体内时,由于在37℃下暴露于水分,封装蛋白质可能变性或聚集,导致生物活性丧失并且免疫原性可能变化。可根据所涉机制设计合理策略进行蛋白质稳定化。例如,如果发现聚集机制是通过二硫键互换形成分子间S-S键,可通过修饰硫氢基,从酸性溶液冻干,控制水分含量,使用适当添加剂和开发特定的聚合物基质组合物实现稳定化。
缓释组合物还包括悬浮于能够保持晶体悬浮的适合制剂中的抗体的晶体制剂。在皮下或腹膜内注射时,这些制剂可产生缓释效应。其它组合物还包括脂质体包裹的抗体。含此类抗体的脂质体本身通过已知方法制备:美国专利No.DE3,218,121;Epstein等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1985)82:3688-3692;Hwang等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1980)77:4030-4034;EP 52,322;EP 36,676;EP 88,046;EP 143,949;142,641;日本专利申请83-118008;美国专利No.4,485,045和4,544,545;和EP 102,324。
应意识到,与本文组合物和方法一致的治疗实体的施用将与并入制剂中以提供改善的转运、递送、耐受性等的适合载体、赋形剂和其它试剂一起施用。可以在所有药剂化学师已知的处方集中找到大量的适当制剂:Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,MackPublishing Company,Easton,PA(1990)),特别是其中Block,Lawrence,第87章。这些制剂包括(例如)粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(例如LipofectinTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂聚乙二醇(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含聚乙二醇的半固体混合物。在根据本发明的治疗和疗法中前述任一混合物均适合,条件是制剂中的活性成分未被所述制剂灭活并且所述制剂与施用途径在生理上相容并且耐受。与药剂化学师众所周知的制剂、赋形剂和载体有关的附加信息,同样见Baldrick P.“Pharmaceutical excipient development:the need forpreclinical guidance.”Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2):210-8(2000),Wang W.“Lyophilization and development of solid proteinpharmaceuticals.”Int.J.Pharm.203(1-2):1-60(2000),Charman WN“Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-some emergingconcepts.”J PharmSci.89(8):967-78(2000),Powell等“Compendium ofexcipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311(1998)和其中的引用。
本发明的治疗实体,例如Ab131-DM1也可用于联合疗法。联合疗法涵盖对哺乳动物应用手术,应用放射疗法,在初期情况下应用全脑放射疗法,在复发情况下应用病灶放射疗法,在初期和复发情况下施用替莫唑胺,施用贝伐单抗,施用伊立替康,施用PCV、甲苄肼、洛莫司汀[CCNU]、长春新碱,植入Gliadel晶片(浸有BCNU的聚苯丙生),施用酪氨酸激酶抑制剂,施用放射致敏剂,施用基于疫苗的疗法,施用抗体药物缀合物或在初期或复发情况下施用BiTE,或施用靶向药物治疗所述哺乳动物之前、同时或之后,向哺乳动物,优选人,施用本发明的治疗性分子,例如Ab131-DM1。
在一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为另一种抗EGFRvIII治疗性分子,例如抗EGFRvIII疫苗(例如Rindopepimut)、抗EGFRvIII抗体、另一种抗EGFRvIII抗体药物缀合物或抗EGFRvIII双特异性T细胞衔接器。
在一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为抗EGFR治疗性分子,例如帕尼单抗、西妥昔单抗、其它抗EGFR抗体、抗EGFR疫苗、抗EGFR抗体药物缀合物或抗EGFR双特异性T细胞衔接器。
在一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为抗白细胞间素-6治疗性分子,例如抗白细胞间素-6抗体(例如司妥昔单抗)、抗白细胞间素-6受体抗体(例如托珠单抗)、抗白细胞间素-6或抗白细胞间素-6受体抗体药物缀合物或抗白细胞间素-6或抗白细胞间素-6受体双特异性T细胞衔接器。
在一些实施方案中,与本发明的抗EGFRvIII药物缀合物,例如Ab131-DM1结合向哺乳动物施用的治疗性分子为抗白细胞间素-8治疗性分子,例如抗白细胞间素-8抗体、抗白细胞间素-8受体抗体,例如抗白细胞间素-8或抗白细胞间素-8受体抗体药物缀合物,或抗白细胞间素-8或抗白细胞间素-8受体双特异性T细胞衔接器。
在一些实施方案中,在施用一种或多种抗EGFRvIII、抗EGFR、抗白细胞间素-6、抗白细胞间素6受体、抗白细胞间素-8或抗白细胞间素-8受体治疗性分子之前、同时或之后向哺乳动物施用本发明的抗EGFRvIII抗体药物缀合物,例如Ab131-DM1。
此类联合疗法对治疗有表达EGFRvIII的肿瘤、肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤或包含胶质组分的肿瘤,特别是成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤、复发成胶质细胞瘤、复发间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、胶质肉瘤、混合性神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、成星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑神经胶质瘤病或神经元-胶质肿瘤,包括神经节神经胶质瘤或间变性神经节神经胶质瘤的哺乳动物有用。
缀合抗体的制备
通过利用如下所述和通过引用整体并入本文的US 7,628,986中描述的技术制备如本文所述的缀合抗体。然后,此类小鼠能够生成人免疫球蛋白分子和抗体而缺乏鼠免疫球蛋白分子和抗体的生成。在本文公开的专利、申请和参考文献中公开了用于实现这一点的技术。然而,具体而言,在1996年12月3日提交的美国专利申请序列号08/759,620及1998年6月11日公布的国际专利申请No.WO 98/24893和2000年12月21日公布的国际专利申请No.WO00/76310中公开了转基因生产小鼠和来自其中的抗体的一个实施方案,其公开内容据此通过引用并入。同样见Mendez等,NatureGenetics:146-156(1997),其公开内容据此通过引用并入。
通过使用这种技术,可生成多种抗原的全人单克隆抗体。在一个实施方案中,用目标抗原(例如EGFRvIII)使系的小鼠免疫,从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如B细胞),并且使此类细胞与髓类细胞系融合以制备永生杂交瘤细胞系,并且筛选和选择此类杂交瘤细胞系以鉴定生成对目标抗原有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。本文提供了生成对EGFRvIII有特异性的抗体的杂交瘤细胞系的生产方法。进一步地,本文提供了此类细胞系生成的抗体的表征,包括此类抗体重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列。
可选地,不与骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤,进一步筛选从免疫的系小鼠分离的回收细胞生成的抗体对原始抗原,优选EGFRvIII蛋白质的反应性。此类筛选包括对EGFRvIII蛋白质的ELISA,与稳定表达全长EGFRvIII的NR6M细胞的体外结合和NR6M细胞中抗体对EGFRvIII受体的内化。然后使用EGFRvIII特异性溶血空斑测定分离分泌目标抗体的单B细胞(Babcook等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,i93:7843-7848(1996))。靶向溶解的细胞优选为EGFRvIII抗原包覆的绵羊红细胞(SRBC)。在分泌目标免疫球蛋白和补体的B细胞培养物存在下,空斑形成表明EGFRvIII介导靶细胞特异性溶解。可分离空斑中心的单抗原特异性浆细胞并且从单浆细胞分离编码抗体特异性的遗传信息。使用逆转录酶PCR,可以克隆编码分泌抗体的可变区的DNA。然后可进一步将此类克隆DNA插入适合表达载体中,优选表达盒例如pcDNA,更优选含有免疫球蛋白重链和轻链的恒定结构域的此类pcDNA载体。然后可将生成的载体转染至宿主细胞,优选CHO细胞中,并且在视情况经改良的传统营养培养基中培养,以诱导启动子,选择转化体,或扩增编码所需序列的基因。在此,我们描述了生成对EGFRvIII有特异性的抗体的多个单浆细胞的分离。进一步地,分离编码抗EGFRvIII抗体的特异性的遗传物质,引入适合表达载体中,然后将表达载体转染至宿主细胞中。
来自XenoMouse小鼠的B细胞也可用作可生成抗体展示库的遗传物质的来源。可使用本领域的普通技术在噬菌体、酵母或体外经由核糖体展示制备这种库。超免疫XenoMouse小鼠可能是可从中分离高亲和力、抗原反应性抗体的丰富来源。相应地,对EGFRvIII超免疫的XenoMouse小鼠可用于生成可从中分离出对EGFRvIII的高亲和力抗体的抗体展示库。可用pep3寡肽和由此得到的用表达EGFRvIII的细胞筛选的抗体筛选这种库以确认对天然展示抗原的特异性。然后可使用重组DNA技术表达全IgG抗体。见例如WO 99/53049。
例如,可由转染细胞生成本发明缀合抗体的抗体。可用编码本申请图8中描绘的Ab131-DM1缀合物的重链和轻链的质粒转染细胞(用于瞬时表达的293细胞和用于稳定表达的CHO细胞)。可通过去除细胞和细胞碎片从转染细胞中回收条件培养基。可将澄清的条件培养基装到蛋白质A-琼脂糖柱上。任选地,可以先浓缩培养基,然后装到蛋白质A琼脂糖柱上。可通过大量PBS洗涤去除非特异性结合。可通过从蛋白质A柱上标准酸性抗体洗脱(50mM柠檬酸盐,pH3.0),回收蛋白质A琼脂糖柱上结合的抗体蛋白。可通过尺寸排阻色谱法或在阳离子交换树脂例如SP-琼脂糖树脂上的结合离子交换色谱法去除蛋白质A琼脂糖混合物中聚集的抗体蛋白。可用过量柱体积的缓冲液洗脱抗体。
一般而言,以上提到的细胞系生成的抗体具有全人IgG1或IgG2重链和人κ轻链。在一个实施方案中,通过固相和溶液相测量时,所述抗体具有高亲和力,通常具有约10-9至约10-13M的Kd。在其它实施方案中,所述抗体具有约10-6至约10-8M的较低亲和力。
如本领域技术人员所意识到那样,根据本实施方案所述的抗体可在除杂交瘤细胞系外的细胞系中表达。编码特定抗体的序列可用于转化适合的哺乳动物宿主细胞。可以通过任何已知方法转化,将多核苷酸引入宿主细胞,包括(例如)将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体)中并且用所述病毒(或载体)转导宿主细胞或通过本领域已知的转染程序进行,如美国专利No.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(所述专利据此通过引用并入本文)所例证。使用的转化程序取决于要转化的宿主。向哺乳动物细胞中引入异源多核苷酸的方法在本领域中众所周知并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装在脂质体中和向细胞核直接显微注射DNA。
可用作宿主进行表达的哺乳动物细胞系在本领域中众所周知并且包括可从美国模式培养物保藏所(ATCC)获得的许多永生化细胞系,包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如,Hep G2)和许多其它细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表达水平并且生成具有组成EGFRvIII结合性质的抗体,例如Ab131-DM1缀合物,选择特别优选的细胞系。
实施例
提供下列实施例,包括进行的实验和得到的结果,仅仅是为了说明的目的而不得视为对本发明的限制。
生成EGFRvIII特异性抗体的策略最初牵涉用抗原组合(肽、各种可溶性蛋白质、抗原表达细胞)使XenoMouse小鼠免疫,接着分离抗体生成细胞,通过融合生成杂交瘤或通过XenoMaxTM/SLAMTM技术分离B细胞。通过ELISA使抗体生成细胞经受初步筛选其特异性并且通过FMAT和/或FACS经受二次筛选其细胞表面结合。然后进行内化测定以鉴定将对药物递送有用的抗体。测量抗体的亲和力。选择某些抗体进行表位作图。另外,选择某些抗体进行体外和体内试验以分析此类抗体对癌症治疗的功效。
实施例1
抗原制备
A.EGFRvIII PEP3-KLH抗原制备
与实施例2有关,通过R&D系统定制合成14-mer人EGFRvIIIPEP3(L E E K K G N Y V V T D H C(SEQ ID NO:56))肽。然后使PEP3肽与钥孔血蓝素(KLH)缀合,如下:使用蒸馏水使EGFRvIIIPEP3(200mcg)(R&D)与50mcg钥孔血蓝素(KLH;Pierce,Rockford,IL)混合至165mcl的最终体积。添加250mcl缀合缓冲液(0.1M MES、0.9MNaCl,pH4.7)并且通过添加25mcl的1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐的10mg/ml原液(EDC,Pierce,Rockford,IL)交联EGFRvIIIPEP3和KLH。在室温下培育缀合物2小时并且通过使用PBS pH7.4通过1kDa过滤器(离心过滤器;Millipore,Bedford,MA)离心,去除未反应的EDC。
与实施例3有关,定制合成14-mer人EGFRvIII PEP3(L E E K KG N Y V V T D H C(SEQ ID NO:56))肽。然后使PEP3肽与KLH缀合,如下:使用蒸馏水使人EGFRvIII PEP3(200mcg)与50mcg钥孔血蓝素(KLH;Pierce,Rockford,IL)混合至165mcl的最终体积。添加250mcl缀合缓冲液(0.1M MES、0.9M NaCl,pH4.7)并且通过添加25mcl的1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐的10mg/ml原液(EDC,Pierce,Rockford,IL)交联EGFRvIII PEP3和KLH。在室温下培育缀合物2小时并且通过使用PBS pH7.4通过1kDa过滤器(离心过滤器;Millipore,Bedford,MA)离心,去除未反应的EDC。
B.B300.19/EGFRvIII转染子
为了制备B300.19/EGFRvIII转染子,最初由A431细胞克隆野生型EGFR并且将EGFR基因修饰为编码EGFRvIII以删除编码残基6-273的密码子,在缺失接合点产生编码甘氨酸残基的密码子。在缺失GTT(缬氨酸)和CGT(精氨酸)周围的密码子中出现缺失,以致缺失后所得的密码子为GGT(甘氨酸)。(Wikstrand等,J Neurovirol.4(2):148-58(1998))
1.野生型EGFR构建体的克隆:
使用Micro-fast RNA试剂盒(Invitrogen,Burlington,ON)从A431(ATCC)细胞提取PolyA+mRNA。用随机pdN6引物和M-MuLV逆转录酶(NEB,New England Biolabs,Beverly,Mass.)由PolyA+mRNA合成总cDNA。使用Pfu DNA聚合酶,用下列引物由A431cDNA扩增2.3kb PCR产物:
有义5’-GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3’(SEQ ID NO:62)
反义5’-CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3’(SEQ ID NO:63)。
用XhoI消化PCR产物,凝胶纯化并且连接到质粒pWBFNP中(见国际专利申请No.WO 99/45031,其公开内容据此通过引用并入),所述质粒用XhoI线性化以产生质粒Wt-EGFR/pWBFNP。
2.EGFRvIII构建体的生成:
连接用引物对C13659/C29538和C29539/C14288(BioSourceInternational),由质粒Wt-EGFR/pWBFNP模板扩增的PCR产物以在编码EGFR胞外结构域的氨基酸6至273的序列中引入缺失并且亚克隆至表达载体pWBDHFR2中(见国际专利申请No.WO 99/45031,其公开内容据此通过引用并入),其中C29538和C29539经T4多核苷酸激酶(NEB,New England Biolabs,Beverly,Mass.)磷酸化:
C13659:5’-CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3’(有义)(SEQ ID NO:64);
C29538:5’-CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3’(反义)(SEQ ID NO:65);
C29539:5’-GTAATTATGTGGTGACAGATC-3’(有义)(SEQ IDNO:66);
C14288:5’-CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3’(反义)(SEQ ID NO:67)。
用引物对C13659/C29538由经Pfu聚合酶(NEB,New EnglandBiolabs,Beverly,Mass.)扩增的Wt-EGFR/pWBFNP模板生成表示缺失的5’末端的232bp片段。PCR产物经EcoR1(NEB,New EnglandBiolabs,Beverly,Mass.)消化并且经凝胶纯化。用引物对C29539/C14288由Wt-EGFR/pWBFNP和经Pfu聚合酶扩增的模板生成表示缺失的3’末端的1273bp片段。PCR产物经Xho1(NEB,NewEngland Biolabs,Beverly,Mass.)消化并且经凝胶纯化。用T4DNA连接酶(NEB,New England Biolabs,Beverly,Mass.)将片段连接到经EcoR1/Xho1消化的pWBDHFR2中以产生构建体EGFRvIII/pWBDHFR。
将EGFR的胞内结构域引入所得构建体中,如下:从质粒Wt-EGFR/pWBFNP分离1566bp DraIII/XhoI片段并连接到经DraIII/XhoI消化的EGFRvIII/pWBDHFR中以产生EGFRvIII-FL/pWBDHFR。
3.用EGFRvIII-FL/pWBDHFR转染B300.19细胞:
每次转染,在700μl DMEM/HI培养基中使用B300.19细胞(8×106个)。添加20μg EGFRvIII-FL/pWBDHFR和2μg CMV-Puro质粒DNA。在300伏/960uF下,用Bio-Rad基因脉冲仪使细胞电穿孔。电穿孔后,细胞在冰上冷却10分钟,之后添加10ml非选择培养基(DMEM/HI葡萄糖、10%FBS、50μM BME、2mM L-谷氨酰胺、100单位青霉素(Penicillin)-G/ml、100单位MCG链霉素(Streptomycin)/ml)。在37℃、7.5%CO2下培育细胞48小时。
培育后,在96孔板中按2×104、0.4×104和0.08×104个细胞/孔,将细胞分到选择培养基(DMEM/HI葡萄糖、10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、50μM BME、100单位青霉素-G/ml、100单位MCG链霉素/ml、2ug/ml嘌呤霉素(puromycin))中并且在选择培养基中选择14天以产生稳定克隆。抗嘌呤霉素的克隆经E752mAb(Yang等,Crit Rev OncolHematol.,38(1):17-23(2001)中描述的一种抗EGFR抗体)染色,然后在FACS Vantage(Becton Dickinson)上分析山羊抗人IgG PE。
C.EGFRvIII-RbFc表达构建体的构建。
为了生成EGFRvIII兔Fc融合蛋白,我们首先构建含有编码兔Fc的DNA的载体。这与编码EGFRvIII的DNA连接。下面更详细地描述了这种方法:
1.RbFc/pcDNA3.1Hygro的构建:
使用引物1322/867(下面)扩增编码兔IgG的铰链-CH2-CH3结构域的721bp片段。
#1322(有义):5’-GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3’(SEQ ID NO:68)
#867(反义):5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3’(SEQ ID NO:69)
所得PCR产物经KpnI和NotI消化,凝胶纯化并且连接到经KpnI/NotI消化的pcDNA3.1(+)/Hygro(Invitrogen,Burlington,ON)中,以产生质粒RbFc/pcDNA3.1Hygro。
2.EGFRvIII-RbFc/pCEP4的构建:
用Pfu聚合酶,使用引物1290/1293(下面)由EGFRvIII-FL/pWBDHFR质粒模板扩增1165bp产物。
#1290(有义):5’-CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3’(SEQ ID NO:70)
#1293(反义):5’-CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3’(SEQ ID NO:71)
所得PCR产物经NheI和KpnI消化,凝胶纯化并且连接到经NheI/KpnI消化的RbFc/pcDNA3.1Hygro中,以产生质粒EGFRvIII-RbFc/pcDNA3.1Hygro。
从EGFRvIII-RbFc/pcDNA3.1Hygro中分离2170bp SnaBI/XhoI片段并亚克隆到经SnaBI/XhoI消化的pCEP4(Invitrogen,Burlington,ON)中,以产生质粒EGFRvIII-RbFc/pCEP4。
3293F EGFRvIII-RbFc稳定细胞系的生成:
通过磷酸钙转染将质粒EGFRvIII-RbFc/pCEP4引入293F细胞(Gibco,Grand Island,NY)中,如下:转染前一天,将1×106个293F细胞接种到凝胶包被的100mm组织培养皿上并且在5%CO2、37℃下培育。转染前2-3小时,为细胞供给10ml新鲜的非选择培养基(DMEM/F12、10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100U/mlMCG链霉素)。在微量离心管中制备转染试剂,如下:使10μg的DNA(EGFRvIII-RbFc/pCEP4)与62μl的2M磷酸钙和去离子水混合以达到最终体积500μl。在另一根移液管中,吸取500μl的2XHBS并用于转移转染试剂。
将移液管中的溶液逐滴添加到细胞中,同时通过将细胞留在5%CO2培育箱中维持适当pH,直至进行转染。转染后15-20小时,用PBS洗涤细胞并供给10ml的新鲜293F非选择培养基。转染后用胰蛋白酶48-72收获表达细胞并且按0.08×104个细胞/孔将细胞接种在96孔板中的293F选择培养基(DMEM/F12、10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素G、100U/ml MCG链霉素、250ug/ml潮霉素(hygromycin))中14天。
使用1ug/ml的抗EGFR抗体E763(美国专利No.6,235,883)作为捕获抗体并且用1∶100稀释的山羊抗兔IgG HRPO(CalTag)检测,通过ELISA筛选抗潮霉素的克隆。
D.EGFRvIII PEP3经由马来酰亚胺缀合与OVA缀合
用于抗体滴定(实施例3)的EGFRvIII肽-OVA生成如下:
使用预先称重的来自Pierce(#20291)的DTT还原207μg的EGFRvIII PEP3。使用100μL去离子水溶解一小瓶7.7mg预先称重的DTT。向EGFRvIII PEP3中添加DTT原液。使用PBS pH7.4,使反应体积达到600μL。在室温下转动反应物30分钟。
称出5克的G10交联葡聚糖珠粒并添加40mL的PBS,混合并留在室温下10分钟,然后在1000rpm下离心珠粒10分钟制备G10柱。去除上清液并且再添加20mL的PBS。在1000rpm下离心珠粒10分钟。去除上清液并且添加足够PBS以制备G10交联葡聚糖珠粒的50%浆料。将5mL的50%浆料混合物添加到5mL离心柱中并且将所述柱置于14mL聚丙烯管中。在1000rpm下离心所述柱3分钟。再添加3mL的PBS并且再次在1000rpm下离心所述柱3分钟。用新管置换聚丙烯管并且所述柱现在可以使用。
从还原肽中去除DTT。还原肽30分钟反应时间后,每个柱添加300μL还原肽。在1000rpm下离心所述柱3分钟。再向每个柱添加250μL的PBS并且再次在1000rpm下离心3分钟。将还原肽收集在14mL聚丙烯管中。
还原肽与马来酰亚胺活化的OVA缀合并且收集在埃彭道夫管(eppendorf tube)中。用马来酰亚胺缀合缓冲液溶解2mg马来酰亚胺活化的OVA(Pierce:77126,Rockford IL)以制备10mg/mL原液。向埃彭道夫管中的还原肽中添加414μg马来酰亚胺活化的OVA。向反应中添加500μL马来酰亚胺缀合缓冲液。使反应物在室温下培育2小时,然后添加2mg半胱氨酸以猝灭可能已经存在的任何活性马来酰亚胺基团。使半胱氨酸在室温下再反应30分钟。然后使用1X PBS pH7.4,将缀合物与10K离心柱一起洗涤3次。这样去除了没有与OVA缀合的所有游离肽和游离半胱氨酸。使用凝胶负载尖端从离心柱上去除缀合物并转移到埃彭道夫管中。最后,使用1X PBS pH7.4使缀合物达到所需浓度。生成的缀合物的摩尔比为14.5∶1(肽∶OVA)
实施例2
通过产生杂交瘤生成抗EGFRvIII抗体
对这种方法而言在第0天使生成具有γ-1恒定区的抗体的八只XenoMouse小鼠(XenoMouse G1小鼠)免疫并且在第11、21、32、44和54天加强并且在第58天进行融合。所有免疫均通过在尾根部皮下施用加上对所有注射而言腹膜内施用进行。用悬浮在1∶1v/v混有完全弗氏佐剂(complete Freunds adjuvant)(CFA)(Sigma,St.Louis,MO)的无热源DPBS中的1.5×107个B300.19/EGFRvIII转染细胞(实施例1A)进行第0天免疫。用在1∶1v/v混有非完全弗氏佐剂(incomplete Freundsadjuvant)(IFA)(Sigma,St.Louis,MO)的DPBS中的1.5×107个B300.19/EGFRvIII转染细胞进行第11、21和32天的加强。用在1∶1v/v混有IFA的DPBS中的5μg PEP3(EGFRvIII肽)-KLH缀合物(实施例1)进行第44天的加强,并且用在没有佐剂的DPBS中的5ugPEP3(EGFRvIII肽)-KLH缀合物进行第54天的加强。
第58天,使小鼠安乐死,然后回收腹股沟和腰部淋巴结。使用组织研磨器,通过机械破坏淋巴结释放淋巴细胞,然后通过CD90阴性选择耗尽T细胞。通过按1∶1的比例混合经洗涤的富集B细胞和从ATCC购买的,目录号#CRL1580(Kearney等,J.Immunol.123:1548-1550(1979))非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞进行融合。通过在800g下离心轻轻粒化细胞混合物。完全去除上清液后,用2-4mL链霉蛋白酶溶液(CalBiochem,目录号#53702;在PBS中0.5mg/ml)处理细胞不超过2分钟。然后,添加3-5ml的FBS以终止酶活性并且使用细胞电融合液ECFS(0.3M蔗糖,Sigma,目录号#S7903;0.1mM醋酸镁,Sigma,目录号#M2545;0.1mM醋酸钙,Sigma,目录号#C4705(St.Louis,MO))将悬浮液调节为40ml总体积。
离心后去除上清液并且通过再次悬浮于40ml ECFS中洗涤细胞。重复这个洗涤步骤并且再次将细胞悬浮于ECFS中至2×106个细胞/ml的浓度。使用ECM2001型融合发生器(Genetronic,Inc.,San Diego,CA.)进行电细胞融合。使用的融合室尺寸为2.0ml,并且使用下列仪器设置:比对条件:电压:50v,时间:50s;膜破裂:电压:3000v,时间:30μs;融合后保持时间:3s。融合之后,使细胞再次悬浮于含有HAT并且补充了L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、OPI(草酰乙酸、丙酮酸盐、牛胰岛素)(全部来自Sigma,St.Louis,MO)和IL-6(BoehringerMannheim)的DMEM(JRH Biosciences)、15%FCS(Hyclone)中,在37℃和空气中10%CO2下培养。
按4×104个细胞/孔,将细胞接种在平底96孔组织培养板中。在转移到HT补充培养基之前,将培养物保持在HAT(次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶)补充培养基中2周。按在HAT培养基中的存活率选择杂交瘤并且通过ELISA筛选上清液的抗原活性。ELISA形式需要在经抗原包被的板上(经EGFRvIII肽-OVA包被的板和经野生型EGFr肽-OVA包被的板作为反筛)培育上清液和使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人IgG检测EGFRvIII特异性结合(见表2.1)。
表2.1
正如将观察到那样,检测到至少四种抗原特异性杂交瘤:13.1、13.2、13.3和13.4。在ELISA测定EGFRvIII特异性中呈阳性的这些杂交瘤,通过对表达EGFRvIII的稳定转染300.19细胞与未转染300.19亲本细胞的FACS确认。
使用限制稀释接种对选择的抗原阳性孔进行克隆。目测检查板上单菌落生长的存在,然后通过如上所述的抗原特异性ELISA和FACS确认,筛选来自单菌落孔的上清液。使用Luminex仪器,通过多重ELISA测定高反应性克隆以检验人γ和κ链的纯度。基于ELISA和FACS测定中的EGFRvIII特异性,选择克隆13.1.2作为最有前景的候选物,做进一步筛选和分析。图3L中示出了13.1.2抗体重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列,重链和轻链核酸为SEQ ID NO:137和139并且重链和轻链氨基酸序列为138和140。另外,13.1.2重链和轻链序列与来其来源的种系序列的比较如图4和5所示。
实施例3
通过使用XenoMax技术生成抗体
XenoMouse动物的免疫
通过依次使生成具有γ-1恒定区的抗体的XenoMouse小鼠(XenoMouse G1小鼠)、生成具有γ-2恒定区的抗体的XenoMouse小鼠(XenoMouse XMG2小鼠)和生成具有γ-4恒定区的抗体的XenoMouse小鼠(XenoMouse G4小鼠)免疫研发抗人EGFRvIII的人单克隆抗体。
为通过XenoMax技术生成mAb,用EGFRvIII PEP3(实施例1A)和表达EGFRvIII的300.19细胞(实施例1B)或用细菌表达的EGFRvIII蛋白质的胞外结构域(EGFRvIII-ECD)(美国杜克大学Bigner博士)和表达EGFRvIII的300.19细胞或用EGFRvIII-兔Fc融合蛋白(EGFRvIII-RbFc)(实施例1C)和表达EGFRvIII的300.19细胞或用EGFRvIII-RbFc,仅经由脚掌(FP)或经由尾根部通过皮下注射和腹膜内(BIP),使成群XenoMouse G1和XMG2小鼠免疫。
对于脚掌免疫而言,初次免疫每只小鼠用或不用10X106个表达EGFRvIII的300.19细胞用或不用10μg按1∶1v/v混有Titermax金的EGFRvIII PEP3或EGFRvIII-ECD或EGFRvIII-RbFc(Sigma,Oakville,ON)。用初次免疫中使用的一半量的免疫原进行后续加强。如下面表3.1所示,前四次加强通过每只小鼠取混有吸附过夜的明矾的免疫原(Sigma,Oakville,ON)进行。如表3.1所示,在这之后,注射在Titermax金中的各免疫原一次,注射明矾一次,然后是在PBS中的免疫原的最后加强。具体而言,在第0、3、7、10、14、17、21和24天使动物免疫。在第19天为动物放血以获得血清并测定滴度以进行收获选择。在第28天收获动物。
表3.1
脚掌免疫程序表
如对脚掌免疫所述,用各免疫原进行的初次BIP免疫每只小鼠1∶1v/v混有完全弗氏佐剂(CFA,Sigma,Oakville,ON)。首先每只小鼠分别用1∶1v/v混有非完全弗氏佐剂(IFA,Sigma,Oakville,ON)的免疫原进行后续加强,接着每只小鼠用PBS中的免疫原最后加强。如下面表3.2所示,在第0、14、28、42、56和75天(最后加强)使动物免疫。在第63天为动物放血以获得血清并测定滴度以进行收获选择。在第78天收获动物。
表3.2
Bip免疫程序表
通过滴度测定选择收获的动物
通过ELISA测定抗hEGFRvIII抗体滴度。在四度下将EGFRvIII-RbFc(2.5μg/ml)或对照RbFc(2μg/ml)或EGFRvIII肽-OVA(2μg/ml)(实施例1)或对照OVA(4μg/ml)涂到Costar Labcoat通用结合聚苯乙烯96孔板(Corning,Acton,MA)上过夜。去除含有未结合抗原的溶液并且用紫外光(365nm)处理所述板4分钟(4000微焦耳)。用dH2O洗涤所述板五次。从1∶100初始稀释开始,在按1∶2稀释的2%牛奶/PBS中滴定来自经EGFRvIII免疫的动物或未实验的动物的血清。最后一个孔留为空白。用dH2O洗涤所述板五次。在室温下按1μg/mL的最终浓度添加山羊抗人IgG Fc特异性辣根过氧化物酶(HRP,Pierce,Rockford,IL)缀合抗体达1小时。用dH2O洗涤所述板五次。添加TMB生色底物(Gaithersburg,MD)使所述板显影30分钟并且通过添加1M磷酸终止ELISA。由450nm下的光密度测定单独动物的具体滴度并且示于表3.3和3.4中。滴度表示血清的稀释倍数倒数,因此数字越大,对hEGFRvIII的体液免疫反应越强。
对于经由尾根部通过皮下注射和腹膜内免疫的小鼠,除用EGFRvIII-RbFc(2.0μg/ml)或对照RbFc(2.5μg/ml)包被所述板外,滴度测定完全同上。
表3.3
根据血清学选择来自表3.3的第5组的所有XenoMouse动物和来自第6组的XenoMouse动物0743-5进行XenoMax收获。
表3.4
根据表3.4中的血清学数据选择XenoMouse动物(0695-1、0695-3和0695-4)收获。
B细胞的选择。
收获并培养来自以上讨论的动物的B细胞。如Babcook等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:7843-7848(1996)中所述,分离那些分泌EGFRvIII-肽特异性抗体的B细胞。使用ELISA鉴定原发EGFRvIII-肽-OVA特异性孔。在24596孔板中,按500或150或50个细胞/孔,由XenoMouse动物培养约5百万个B细胞,并且用EGFRvIII-肽-OVA筛选以鉴定抗原特异性孔。约515个孔在背景上明显显示出OD,表3.5中示出了其代表性样本。
表3.5
再次用EGFRvIII-肽-OVA和OVA筛选OD>0.5的224个EGFRvIII-肽-OVA-Elisa阳性孔以确认其具EGFRvIII-肽特异性。表3.6中示出了这些结果的代表性实例。
表3.6
限制抗原测定和分析
限制抗原分析是相对于所有其它抗原特异性抗体,对B细胞培养物上清液中存在的抗原特异性抗体的亲和力评级的方法。在极低抗原包衣的存在下,仅最高亲和力的抗体应能够在平衡下的任何可检测水平结合。(见,例如,国际专利申请No.WO 03/48730)
可在三个浓度下将EGFRvIII肽-OVA涂到板上;7.5ng/ml、1.5ng/ml和0.03ng/ml,4℃下在96孔Elisa板上包被过夜。向所述板添加50ul在有0.05%叠氮化钠的PBS中的1%牛奶之前,用dH2O洗涤每张板5次,接着向每个孔添加4μl的B细胞上清液。在室温下于振荡器上18小时后,再用dH2O洗涤所述板5次。向每个孔添加50ul的1μg/ml山羊抗人(Fc)-HRP。在室温下1小时后,再用dH2O洗涤所述板5次并且向每个孔添加50μl的TMB底物。通过向每个孔添加50uL的1M磷酸终止反应并且在450nm波长下读板并且结果示于表3.7中。
表3.7
比较由限制抗原分析产生的结果与高抗原测定中获得的总OD。通过将限制抗原测定中获得的OD比例与高抗原测定中获得的OD比例进行比较进行相对亲和力评级。具有越高比例的抗体将具有最高亲和力。表3.7示出了基于限制抗原测定OD(对于0.03ng/ml的最低抗原接种浓度而言)与高抗原测定OD评级的B细胞培养物上清液样本。
通过FMAT的天然细胞结合
分析EGFRvIII肽-OVA-Elisa阳性孔上清液与NR6细胞(NR6M细胞)上稳定表达的天然形式的EGFRvIII结合的能力(见Batra等,Epidermal growth factor ligand-independent,unregulated,cell-transforming potential of a naturally occurring human mutantEGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6(10):1251-9(1995))。在96孔FMAT板中按8000个细胞/孔接种NR6M细胞并且培育过夜。然后去除培养基,在孔中留15μl。添加15μl B细胞培养上清液并且向孔中添加15μl最终浓度1μg/ml的抗人IgG Fc Cy5。然后使其在4℃下培育2小时。在FMAT上读数之前,用150μl PBS洗涤细胞并固定。结果表示为总荧光强度(表3.8)。人抗EGFRvIII mAb13.1.2用作阳性对照,从1μg/ml最终浓度开始并且阴性对照为相同浓度的PK16.3.1。测试了244个样品中134个与NR6M细胞结合,其中62个的总荧光量大于8000。这134种结合剂中的6种为假阳性。
对NR6野生型细胞(表达EGF受体的NR6细胞)进行相同类型的天然结合测定(见Batra等,Epidermal growth factor ligand-independent,unregulated,cell-transforming potential of a naturally occurring humanmutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6(10):1251-9(1995))以消除由于和野生型受体结合的结合(表3.8)。ABX-EGF用作阳性对照而相同浓度的PK16.3.1用作阴性对照抗体。134种NR6M结合剂中的3种与NR6野生型细胞牢固结合。在Elisa中244个孔中结合EGFRvIII肽的190个孔也与细胞上的天然形式结合。表3.8中给出了实例。
表3.8
表3.8中,将来自孔187A4的上清液鉴定为野生物结合剂而14lC6对NR6M细胞结合为假阳性。孔129H6和183E11是没有天然结合的强肽结合剂。
内化测定
进一步测定了前60种天然结合B细胞培养上清液内化受体的能力。按8000个细胞/孔将NR6M细胞接种在96孔FMAT板中并且培育过夜。去除培养基并且添加10-15μl B细胞培养上清液,培养基总体积为30μl,一式双份。接下来,添加15μl二次抗体(1.5μg/ml最终浓度的SS Alexa647抗人IgG Fab)并于冰上培育混合物1小时。使用不相关的B细胞培养上清液了解培养基的影响。人抗EGFRvIII mAb13.2.1用作阳性对照,从1μg/ml(最终浓度)开始并且阴性对照为相同浓度的PK16.3.1(人抗KLH IgG2抗体)。培育之后,用冷PBS洗涤细胞,向所有孔添加50μl培养基,其中一份在37℃下培育30分钟,而另一份留在冰上。培育之后,去除培养基,向在37℃下培育的一组添加100ul的冷50mM谷胱甘肽并且向另一组添加100μl冷培养基,然后两组均留在冰上1小时。然后用100μl冷PBS洗涤细胞,再用1%多聚甲醛固定并且在FMAT中读数。结果表示为内化%,按谷胱甘肽存在时的总荧光量/没有谷胱甘肽时的总荧光量X100计算。表3.9中给出了代表信息。
表3.9
EGFRvIII特异性溶血空斑测定
进行这项测定需要许多专用试剂。这些试剂制备如下。
1.绵羊红细胞(SRBC)互物素化。将SRBC作为25%原液储存在RPMI培养基中。通过将1.0ml的SRBC等分到新的埃彭道夫管中,获得250μl SRBC包装的细胞团粒。在微量离心管中在8000rpm(6800rcf)下经脉冲旋转粒化SRBC,抽去上清液,将团粒再次悬浮于1.0ml pH8.6的PBS中,并且重复离心。洗涤周期重复2次,然后将SRBC团粒转移到15-ml falcon管中并且用PBS pH8.6制成5ml。在单独50ml falcon管中,向45ml的PBS pH8.6添加2.5mg的Sulfo-NHS生物素。一旦生物素完全溶解,就添加5ml SRBC并且使所述管在室温下旋转1小时。SRBC在3000rpm下离心5分钟并且抽去上清液。将生物素化SRBC转移到埃彭道夫管并且同上,但是用PBS pH7.4洗涤3次,然后在l5ml falcon管中用绵羊细胞培养基(RPMI1640)制成5ml(5%B-SRBC原液)。将原液储存在4℃下,直至需要。
2.B-SRBC的链霉亲和素(SA)包衣。将1ml的5%B-SRBC原液转移到新的埃彭道夫管。同上洗涤B-SRBC细胞3次并且再次悬浮在1.0ml PBS pH7.4中以产生5%(v/v)的最终浓度。添加10μl的10mg/ml链霉亲和素(CalBiochem,San Diego,CA)原液,使管混合并且在室温下旋转20分钟。重复洗涤步骤并且使SA-SRBC再次悬浮在1ml PBSpH7.4中(5%(v/v))。
3.SA-SRBC的EGFRvIII包衣。用10μg/ml的生物素化EGFRvIII肽-OVA包被SA-SRBC,混合并且在室温下旋转20分钟。同上,用1.0ml PBS pH7.4洗涤SRBC两次。使EGFRvIII包被的SRBC再次悬浮在RPMI(+10%FCS)中至5%(v/v)的最终浓度。
4.通过免疫荧光(IF)测定EGFRvIII肽-SRBC的质量。向装有40ul的PBS的单独新的1.5ml埃彭道夫管添加各10μl的5%SA-SRBC和10μl的5%EGFRvIII肽包被SRBC。向每个SRBC样品添加45μg/ml的对照人抗EGFRvIII抗体。使管在室温下旋转25分钟,然后用100μlPBS洗涤细胞三次。使细胞再次悬浮在50μl PBS中并且用40mcg/mL与Alexa488(Molecular Probes,Eugene,OR)缀合的山羊抗人IgG Fc抗体培育。使管在室温下旋转25分钟,然后用100μl PBS洗涤细胞并且使细胞再次悬浮在10μl PBS中。将10μl染色细胞点到清洁的显微镜载玻片上,盖上盖玻片,在荧光下观察并且按0-4的任意刻度评分。
5.浆细胞的制备。收获先前通过各种测定鉴定为含有分泌目标免疫球蛋白的B细胞克隆的单个微培养孔的内容物。使用100-1000μl自动移液器,通过添加37C RPMI(10%FCS)回收所述孔的内容物。通过移液使细胞再次悬浮,然后转移到新的1.5ml埃彭道夫管中(最终体积约500-700μl)。在室温下,在微量离心管中在2500rpm(660rcf)下离心细胞1分钟,然后使管旋转180度并且在2500rpm下再离心1分钟。抽去冷冻培养基并且使免疫细胞再次悬浮在100μl RPMI(10%FCS)中,然后离心。重复用RPMI(10%FCS)这样洗涤并且使细胞再次悬浮在60μl RPMI(10%FCS)中并且储存在冰上直至准备好使用。
6.对浆细胞的显微操作。提前用硅树脂边缘制备好载玻片(2×3英寸)并且使其在室温下固化整夜。使用之前,用约5ul SigmaCoat(Sigma,Oakville,ON)均匀擦拭玻璃表面处理载玻片,使其干燥,然后用力擦拭。向60μl细胞样品添加各60μl的EGFRvIII肽包被SRBC(5%v/v原液)、在RPMI(10%FCS)中制备的4×豚鼠补体(Sigma,Oakville,ON)原液和4×增强血清原液(1∶150,在有10%FCS的RPMI中)。将混合物(10-15μl)点到准备好的载玻片上并且用未经稀释的石蜡油盖住所述点。在37℃下培育载玻片至少45分钟。从空斑中鉴定EGFRvIII特异性浆细胞并通过显微操作营救(见表3.10)。
表3.10
重组抗EGFRvIII抗体的单细胞PCR、克隆、表达、纯化和表征
通过对显微操作的单个浆细胞的RT-PCR营救编码可变区的基因。提取mRNA并且进行逆转录酶PCR以生成cDNA。使用聚合酶链式反应特异性扩增编码可变重链和轻链的cDNA。将人可变重链区克隆至IgG1表达载体中。通过将人IgG1的恒定结构域克隆至pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen,Burlington,ON)的克隆位点生成这种载体。将人可变轻链区克隆至IgK表达载体中。通过将人IgK的恒定结构域克隆至pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen,Burlington,ON)的多克隆位点生成这些载体。然后重链和轻链表达载体共同脂质转染至60mm皿的70%汇合人胚肾293细胞中并且使转染细胞分泌具有与原浆细胞相同特异性的重组抗体24-72小时。从HEK293细胞收获上清液(3mL)并且用夹心ELISA证明完整抗体的分泌以特异性检测人IgG(表3.11)。使用ELISA,通过重组抗体与EGFRvIII结合评估特异性(表3.11)。
表3.11
如下进行分泌ELISA试验。对于Ab分泌而言,将2μg/mL山羊抗人IgG H+L而对抗原结合而言,将1.5μg/ml的EGFRvIII-Rab Ig Fc融合蛋白涂到Costar Labcoat通用结合聚苯乙烯96孔板上并且保持在四度下过夜。用dH2O洗涤所述板五次。1∶2滴定7个孔来自未稀释的微脂质转染上清液的重组抗体。用dH2O洗涤所述板五次。对于用1μg/ml Rb抗Hu Fc在室温下检测1小时的分泌板和结合板,按1μg/1L的最终浓度在室温下添加山羊抗人IgG Fc特异性HR缀合抗体1小时。用dH2O洗涤所述板五次。添加TMB使所述板显影30分钟并且通过添加1M磷酸终止ELISA。分析每张ELISA板以测定450nm下每个孔的光密度。
测序和序列分析
在两个方向上为克隆的重链和轻链cDNA测序以确定抗体的种系序列起源并鉴定从种系序列的变化。图3A-3K和(SEQ ID NO:34-55)中提供了此类序列。图4-7中提供了对每条重链和轻链序列与其来源的种系序列的比较。另外,在图4和5中将杂交瘤来源的13.1.2抗体的序列与其种系序列做了比较。
正如将从本文的讨论意识到那样,每个131抗体和13.1.2抗体对EGFRvIII具有极高亲和力,受细胞良好内化并且似乎当与毒素缀合时,在细胞杀伤方面非常有效。有趣的是,尽管已经在XenoMouse小鼠的不同免疫中生成并且利用了不同技术,每种抗体仍源自非常相似的种系基因。基于表位作图工作(本文所述),然而,每种抗体似乎与EGFRvIII分子上稍有不同的表位结合并且在EGFRvIII上具有结合所必需的稍有不同的残基。这些结果表明,种系基因利用对生成靶向EGFRvIII的抗体治疗剂很重要并且小小的变化就可以允许基于这些结构发现,进一步设计抗体和其它治疗剂的方式,改变抗体的结合和作用。
抗EGFRvIII mAb与细胞上表达的天然EGFRvIII的结合
在这个实施例中,测量了抗EGFRvIII抗体与NR6M细胞的结合。具体地,测定XenoMax来源的IgG1重组抗体的未量化上清液与NR6M和NR6野生型细胞结合的能力。按10000个/孔接种细胞并且在37C下在FMAT96孔板中培育过夜。去除培养基并添加40μl微脂质上清液(经滴定),在冰上培育细胞1小时。添加人13.1.2EGFRvIII抗体和ABX EGF(E7.6.3,美国专利No.6,235,883)抗体作为阳性对照。PK16.3.1抗体用作阴性对照。用冷PBS洗涤细胞,按1μg/ml、40μl/孔添加二次抗体(SS Alexa抗人IgG Fc)并且在冰上培育1小时。然后用冷PBS洗涤细胞,固定并用FMAT读数。通过对NR6野生型细胞的反筛测试所有抗体对结合的特异性。
重组抗EGFRvIII抗体的纯化
为了更大规模生产,将重链和轻链表达载体(每条链2.5μg/个皿)经脂质转染到十个100mm皿中,其70%与HEK293细胞汇合。在37℃下培育转染细胞4天,收获上清液(6mL)并更换为6mL新鲜培养基。在第7天,去除上清液并且与初期收获物(来自10张板总计120mL)混合。使用蛋白质A琼脂糖(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)亲和色谱法从上清液中纯化每种抗体(1mL)。用500mcL的0.1M甘氨酸pH2.5从蛋白质A柱洗脱抗体。在PBS pH7.4中透析洗脱物并且经过滤灭菌。通过非还原SDS-PAGE分析抗体以评估纯度和产量。还通过在OD250下的紫外分析测量了浓度。
EGFRvIII受体被重组抗EGFRvIII mAb内化
如前所述,表达、纯化和量化XenoMax来源的IgG1重组抗体。进一步测定抗体将EGFRvIII受体内化于NR6M细胞中的能力。在冰上在96孔v型底板中,用0.25μg/ml的一次抗体(SC95、SC131、SC133、SC139、SC150、SC170、SC211、SC230、SC250和人13.1.2作为对照)培育250,000个NR6M细胞7分钟,一式三份。用在PBS中的10%冷FCS洗涤细胞并且添加3μg/ml的二次抗体Fab(SS Alexa antihumanIgG Fab)并在冰上培育7分钟。用在PBS中的10%冷FCS洗涤细胞一次,然后再次悬浮在冷培养基中。接下来,在37℃下培育三份的其中两组而剩余一组在4℃下培育1小时。之后,在冰上用谷胱甘肽(如前所述)处理在4℃下培育的细胞和在37℃下培育的一组细胞1小时。然后洗涤细胞并且再次悬浮在100μl在PBS中的1%冷FCS中并通过FACS分析。由从FACS分析获得的几何平均值计算内化%[(有谷胱甘肽37℃下的平均值-有谷胱甘肽4℃下的平均值)/(没有谷胱甘肽37℃下的平均值-没有谷胱甘肽4C下的平均值)]。NA指进行了FACS分析,但是表3.12中没有提供数据。
表3.12
13.1.2是通过先前通过杂交瘤生成(实施例2),针对EGFRvIII表位生成的并且在该实验中用作阳性对照的抗体。表3.12中的结果证明有效内化(70-80%)和未有效内化(22%或更少)的两组抗体的存在。
实施例4
抗体131-DM1缀合
131抗体的纯化
将哺乳动物细胞培养2936-E细胞上瞬时表达的131抗体(包含图8B的重链和图8D的轻链)装到已经在25mM Tris、150mM氯化钠(pH7.4)中平衡的MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)上。然后经3个洗涤步骤洗涤结合有131抗体的柱:先是平衡缓冲液洗涤,接着是25mMTris、500mM L-精氨酸(pH7.5)洗涤和最后用平衡缓冲液洗涤。用100mM醋酸钠(pH3.5)洗脱131抗体。混合含所述抗体的部分并用1MTris(pH8.0)调节至5.0的最终pH。随后使抗体透析到缀合缓冲液中(2mM EDTA、50mM氯化钠、50mM磷酸钾,pH6.5)。
用SMCC修饰131抗体
用胺反应性连接子4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)(Thermo Scientific)修饰纯化的131抗体以引入硫醇反应性马来酰亚胺基团。用12个摩尔当量的SMCC处理抗体并且在室温下培育90分钟,用装有Sephadex G-25精细树脂(GE Healthcare)的HiPrep26/10脱盐柱为反应混合物脱盐。
SMCC连接的131抗体与DM1的缀合
用每个马来酰亚胺基团1.7个摩尔当量的DM1(Immunogen)处理经SMCC修饰的131抗体,在最终反应混合物中用2mM EDTA、150mM NaCl、35mM柠檬酸钠(pH5.0)缓冲,调节至3%DMA(v/v)。在室温下培育反应混合物过夜长达20小时。将反应混合物装到经20mM磷酸钠、150mM氯化钠(pH6.5)平衡的Superdex200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。收集各部分并且混合和测定含单体抗体的部分。通过测量252nm和280nm下的吸光度,测定每个抗体连接的DM1分子的摩尔比,并且对于不同缀合批次而言,发现介于3.0-3.5个DM1分子/抗体之间。
实施例5
抗体131-DM1结合特异性
分离EGFR阳性、EGFRvIII阴性A431细胞和EGFRvIII阳性U87vIII细胞并且计数。向每根管加1×106个细胞并且洗涤。通过向细胞添加FACS洗涤缓冲液(PBS、2%胎牛血清、0.02%叠氮化钠)洗涤细胞,接着在1800rpm下离心5分钟,丢弃上清液。在4℃下用一次抗体,抗EGFRvIII抗体(131抗体)、抗体131-DM1缀合物、还结合EGFRvIII的抗野生型EGFR抗体或对照IgG1抗体培育细胞1小时。培育后,洗涤细胞,然后在4℃下用二次抗体,抗人IgG抗体Alexa Fluor488(Invitrogen,Carlsbad,CA)培育1小时。洗涤细胞并再次悬浮在FACS洗涤缓冲液中并且使用FACS Calibur流式细胞器分析。
如图9所示,抗EGFRvIII抗体(黑色虚线)、Ab131-DM1缀合物(黑色实线)、抗EGFR抗体(灰色点虚线)全部与EGFRvIII表达细胞结合。与抗EGFR抗体相反,抗EGFRvIII抗体或Ab131-DM1均不与EGFR(野生型)过表达细胞结合。
实施例6
抗体131-DM1内化
按10,000个细胞/孔,将U251vIII细胞接种在具有200μL生长培养基(含10%FBS的DMEM)的96孔板上并且在37℃、5%CO2下培育3天,以在测定当天达到90%细胞汇合。在4C下按5μg/mL向细胞中添加Ab131-DM1缀合物20分钟。在4℃下向测定培养基中的细胞添加抗人IgG Fab’Alexa488(Nanoprobes,Yaphank,NY)和Hoechst33342(Invitrogen,Carlsbad,CA)20分钟。用测定培养基洗涤细胞两次,然后在37℃下培育1.5小时。并使用BD细胞固定/通透试剂盒(cytofix/cytoperm kit)(BD biosciences,San Diego,CA)固定和透性化细胞,简单地用BD洗涤缓冲液洗涤细胞一次,接着添加固定/通透溶液(Fix/perm solution)。在室温下用0.5μg/mL的抗EEA1抗体(BDBiosciences,San Diego,CA)培育细胞20分钟。用BD洗涤缓冲液洗涤细胞并向细胞中添加抗小鼠Alexa568(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在室温下培育细胞20分钟,接着是两个BD缓冲液洗涤步骤。用与带有Openlab图像分析软件(Improvision Inc,Lexington,MA)的Hamamutsu数码相机连接的Leica荧光显微镜获得共定位的细胞图像。
在0小时,Ab131-DM1缀合物结合的EGFRvIII受体在U251vIII细胞表面可见。培育1.5小时后,Ab131-DM1缀合物从细胞表面内化到细胞质中并且共定位到核内体。
实施例7
Ab131-DM1缀合物抑制U251vIII细胞生长
按500个细胞/孔,将U251和U251vIII细胞接种在具有100μL生长培养基(含10%FBS的DMEM)的96孔组织培养板上并且在37℃、5%CO2下培育4小时。培育4小时后,向细胞添加剂量滴定的Ab、对照缀合物或单独的媒介物。测量细胞ATP水平之前,在37℃、5%CO2下连续培育细胞4天。使CellTiter-Glo(Promega Corp.,Madison,WI)缓冲液和底物平衡约60分钟至室温(RT)。将板从37℃培育箱中取出并且在室温下培育30分钟。使CellTiter-Glo缓冲液与CellTiter-Glo底物混合以生成CellTiter-Glo试剂。按CellTiter-Glo试剂与培养基1∶1比例,向两张板的每个孔添加CellTiter-Glo试剂。将板置于板振荡器上并且缓慢振荡2分钟。测量发光度之前,培育板10分钟。用Wallac EnVision2103多标记酶标仪(Perkin Elmer,Waltham,MA)测量发光度,读数时间为每孔0.1秒。使用Prism4.01(GraphPad,San Diego,CA)进行统计分析。在y轴上绘制了发光度结果而在x轴上绘制了按DM1当量nM计的浓度对数。使用对数转换浓度数据的非线性回归分析(S形曲线拟合)由剂量反应曲线测定IC50值。
如图10所示,在表达EGFRvIII的U251vIII细胞中,Ab131-DM1导致显著细胞生长抑制,IC50为0.068nM DM1当量或3.0ng/mL Ab131-DM1。用对照缀合物未观察到细胞生长抑制。
实施例8
Ab131-DM1缀合物增加D317异种移植物中的磷酸-组蛋白H3水平
使带有D317人成胶质细胞瘤异种移植物的动物(传代213)安乐死并且在无菌条件下取出肿瘤。将肿瘤切成适合13号规格植入套针的相似尺寸片段。将肿瘤植入未实验CB-17/SCID小鼠的侧腹,传代数量214。肿瘤测量:用电子数字卡尺测量长度和宽度。肿瘤体积(mm3)=[(W2XL)/2],其中宽度(W)定义为2次测量的较小宽度而长度(L)定义为2次测量的较大长度。测量肿瘤体积并且在植入后第十四天,42只动物体内肿瘤体积范围为258至875mm3。随后将动物随机分为六只动物一组,开始治疗。在第十四天,通过尾静脉经静脉施用治疗。为动物施用媒介物、5.3和16.7mg/kg的Ab131-DM1(分别为80和250ug DM1/kg)或17.8mg/kg的对照缀合物(250ug DM1/kg)。使用组体重按10mL/kg的体积为动物给药。在治疗施用40小时后进行安乐死之前,测量肿瘤和动物重量。
施用后四十小时,使动物安乐死从每只动物收集肿瘤,在10%中性缓冲福尔马林中固定肿瘤,常规加工并包埋在石蜡块中。对于磷酸-组蛋白H3免疫组织化学而言,在Decloaker压力仪表(Biocare)中使用Diva溶液(Biocare#DV2004G1)进行抗原修复之前,将每个肿瘤的4-6微米切片置于带电载玻片上,脱石蜡并且再水合。在室温下用1ug/ml的抗磷酸-组蛋白H3抗体(Millipore/Upstate#06-570)培育切片1小时并且用抗兔Envision(Dako K4003)和DAB(Dako3468)使结合可视化,接着用苏木精复染。使用Aperio ScanScope XT数字化扫描载玻片并且由对治疗组不清楚的专业认证兽医病理学家使用ImageScope软件在所得图片上画出每个切片内的存活肿瘤。使用IHC核心算法量化存活肿瘤区域内磷酸-组蛋白H3阳性细胞的数量并且表示为每mm2存活肿瘤区域的阳性细胞数量。
使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test),使用用于Windows的5.04版GraphPad Prism(GraphPad Software,SanDiego,CA),比较治疗组中每mm2磷酸-组蛋白H3阳性细胞的平均数与对照组中观察到的数量。
如图11所示,与媒介物或对照缀合物治疗的动物相比,用Ab131-DM1治疗导致阳性磷酸-组蛋白H3细胞的数量显著增加。
实施例9
异种移植物模型中的Ab131-DM1缀合物
在下面实施例46A、46B和46C中,用电子数字卡尺测量长度和宽度。按[(W2XL)/2]计算肿瘤体积(mm3),其中宽度(W)定义为2次测量的较小宽度而长度(L)定义为2次测量的较大长度。使用组体重按10mL/kg的体积为动物给药。每周测量肿瘤体积和动物重量两或三次。当肿瘤负荷达到体重的10%时,使动物安乐死。将肿瘤体积表示为平均值加或减标准误差并且根据时间作图。通过Dunnett调整的事后多重比较对对数转换肿瘤体积数据的协方差重复测量分析,估计生长曲线之间观察到的差异的统计显著性。使用有基线对数肿瘤体积、天数、治疗和天数与治疗的相互作用的模型效应的SAS proc混合进行分析;哪一天为重复值的重复声明,动物受试者和Toeplitz协方差结构;进行比较对照组和其它治疗组的Dunnett分析的lsmeans声明。因为体积越大往往方差越大,并且基线对数肿瘤体积作为协变量包括在模型中,是预处理肿瘤体积可能差异的原因,所以数据经对数转换。所有统计计算均通过使用与SAS v9-1(SAS Institute,Inc.,Cary,NC)连接的JMP软件v7.0进行。
实施例9A:U251vIII异种移植物模型中的Ab131-DM1缀合物
要测定U251vIII皮下异种移植物中Ab131的功效,体外扩展U251vIII细胞,直至获得足够的用于植入的活细胞。使细胞再次悬浮在没有胎牛血清的DMEM中并且与BD生长因子还原基质胶(BDBiosciences,San Diego,CA)1∶1混合以达到100×106个细胞/mL的最终浓度。在侧腹为CD-1nu/nu小鼠植入100μL细胞/基质胶溶液或10×106个细胞。测量肿瘤体积并且在第十八天,60只动物体内肿瘤体积范围从172到476mm3。随后在开始治疗之前,将这六十只动物随机分为十只动物一组。在植入后第18天通过尾静脉,经静脉施用对照缀合物、非缀合131抗体和Ab131-DM1治疗。
一个群组中动物接受单个IV剂量的14.4mg/kg对照缀合物,另一群组中动物接受1.7mg/kg Ab131-DM1,另一群组中动物接受5.6mg/kg Ab131-DM1并且另一群组中动物接受17mg/kg Ab131-DM1。如上所述每周测量肿瘤体积两次。如图12所示,与经媒介物或对照缀合物治疗的动物相比,用5.6或17mg/kg的Ab131-DM1治疗导致肿瘤生长显著延迟。在5.6和17mg/kg的Ab131-DM1下观察到肿瘤消退,在17mg/kg剂量下完全消退。在任何动物中均未观察到对重量减轻的影响。
实施例9B:D317异种移植物模型中的Ab131-DM1缀合物
使D317肿瘤片段在CB-17/SCID小鼠中连续传代。使带有D317人成胶质细胞瘤异种移植物的动物安乐死并且在无菌条件下取出肿瘤。将肿瘤切成适合13号规格植入套针的相似尺寸片段。将肿瘤植入未实验CB-17/SCID小鼠的侧腹。植入后测量肿瘤体积并且在第十一天,42只动物体内肿瘤体积范围从106到373mm3。随后将四十二只动物随机分为六个组,每组七只动物,开始治疗。在植入后第11和18天通过尾静脉,经静脉施用治疗。动物接受媒介物、20.5mg/kg的抗EGFRvIII抗体131、4.9、9.8或20.5mg/kg的Ab131-DM1缀合物(分别为60、120和250μg DM1/kg)或17.8mg/kg的对照缀合物(250μg DM1/kg)。在第15天,由于肿瘤体积大,将媒介物组的一只动物、131抗体组的两只动物、对照缀合物组的三只动物、9.8mg/kg Ab131-DM1剂量组的一只动物和4.9mg/kg Ab131-DM1剂量组的两只动物安乐死。在第18天,由于肿瘤体积大,使施用了媒介物、对照缀合物、131抗体和4.9mg/kg剂量的Ab131-DM1的其余所有小鼠安乐死。由于肿瘤尺寸大,使9.8mg/kgAb131-DM1剂量组的两只动物安乐死。在第18天,为9.8mg/kg AB131-DM1剂量组的其余四只小鼠和20.5mg/kg AB131-DM1组的所有七只小鼠静脉给药第二剂量。在整个研究期间监测小鼠体重和肿瘤体积,在第29天结束。
如图13所示,与经媒介物治疗的动物相比,用20.5mg/kg的Ab131-DM1缀合物导致肿瘤生长显著延迟,而131抗体和对照缀合物没有作用。
实施例9C:D317异种移植物模型中对Ab131-DM1缀合物的剂量反
应实验
使D317细胞再次悬浮在没有胎牛血清的DMEM中并且与BD生长因子还原基质胶(BD Biosciences,San Diego,CA)1∶1昆合以达到1×106个细胞/mL的最终浓度。在侧腹为CB-17/SCID小鼠植入200μL细胞/基质胶溶液或0.2×106个细胞。在植入后第九天测量肿瘤体积,将137-313mm3范围的五十只动物随机分组并治疗。小鼠在植入后第九天接受单次静脉注射媒介物、26.8mg/kg的对照缀合物(375ugDM1/kg)或7.3、14.6或22mg/kg的Ab131-DM1缀合物(分别为125、250或375ug DM1/kg)。
如图14所示,在所有剂量下用Ab131-DM1治疗均导致肿瘤生长的显著延迟,在22mg/kg下观察到消退。对照缀合物没有作用。
实施例9D:Ab131-DM1缀合物治疗的D317异种移植物模型中的
MRI表观扩散系数
在这项研究中,测试磁共振成像(MRI)表观扩散系数(ADC)作为成胶质细胞瘤原位模型中由于Ab131-DM1治疗引起的肿瘤组织结构变化的早期读出。
在第0天通过向大脑右半球立体定向注射,为CB17SCID小鼠植入D317人成胶质细胞瘤细胞(100,000个细胞/小鼠)。在第7天经MRI为小鼠成像并且根据肿瘤体积随机分为五个治疗组。小鼠用媒介物、6.5、11或22mg/kg Ab131-DM1经i.v.每周两次,或用10mg/kg替莫唑胺经p.o.每天一次,每周五天(N=8只/组)。随后在第14天和第21天经MRI为小鼠成像。通过手动跟踪覆盖整个肿瘤体积的多层T2加权RARE(快速采集弛豫增强)图像中的高信号区评估所有小鼠体内的肿瘤体积。使用整个肿瘤体积上的手动跟踪区域,由扩散加权自旋回波图像(b=100、300、700、1000和1200s/mm2)为媒介物和22mg/kgAb131-DM1治疗组中的各肿瘤计算平均MRI表观扩散系数。
虽然在第14天组间肿瘤体积没有显著差异,但是在第21天观察到Ab131-DM1对肿瘤体积的剂量依赖性效应。在第21天,相对于媒介物,在替莫唑胺和Ab131-DM1治疗组(22和11mg/kg)中生长受抑制(p<0.0001)。用Ab131-DM1(22mg/kg)治疗后在第14天(23%,与媒介物相比p<0.01)和第21天(32%,与媒介物相比p<0.0001),平均MRI ADC值明显更高,而媒介物组的MRI ADC在任何时间点均未出现显著变化。
Ab131-DM1显示出对常位注入小鼠脑部的D317细胞的剂量依赖性生长抑制。Ab131-DM1治疗后肿瘤表观扩散系数增大在肿瘤生长的可测量抑制之前,表明MRI ADC为疗效的早期生物标志。数据还表明MRI ADC是比肿瘤体积减小更早的疗效生物标志。
实施例10:评价AB131-DM1在有表达突变表皮生长因子受体变体
III(EGFRvIII)的复发恶性胶质瘤的受试者中的安全性、耐受性、药
代动力学和药效学的1期首项人类研究
在单种试剂的开放标签、连续剂量探索性研究中,在有复发GBM和/或AA的受试者中,静脉(IV)施用Ab131-DM1每三周一次(Q3W)。参加研究的合格受试者将在研究第1天开始经60分钟输注接受Ab131-DM1IV Q3W。前两剂Ab131-DM1之后和成功完成28天评估剂量限制性毒性时,受试者将在第5周期间经受用MRI放射性评估其肿瘤。例如,除非有根据Macdonald标准的进行性疾病(PD)的影像学证据,受试者变得对研究药剂不耐受,或者经主要研究者确定临床进展的指征和症状明显,则服用Ab131-DM1(Q3W)可能在第7周回复。通过MRI的后续肿瘤评评价将在第9周和之后每8周进行一次。
将限制显示出肿瘤组织中EGFRvIII表达的证据的患者参加。另外,进入研究还需要通过MRI的放射性评估确认可通过Macdonald标准测量疾病进展。
自适应剂量探索经用药研究中(使用实际不断重新评估方法[CRM][Zhou,2002])并且直至测定最大耐受剂量(MTD),如果可行,评价AB131-DM1的安全性、耐受性、PK和PD。将MTD定义为剂量限制性毒性(DLT)的可能性小于或等于25%时的最大剂量。
为确保安全剂量增加,任何时刻的最大剂量增加将≤2×当前剂量。用于剂量探索的预定标称剂量为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0mg/kgAB131-DM1(IV;Q3W)。若需要,也可使用中间剂量(0.5mg/kg的倍数)和替代剂量频率。
可使用Macdonald标准(见Macdonald DR、Cascino TL、Schold SCJr、Cairncross JG.Response criteria for phase II studies of supratentorialmalignant glioma.J Clin Oncol.1990;8:1277-1280)或神经肿瘤反应评估(RANO)标准(见Wen PY、Macdonald DR、Reardon DA等UpdatedResponse Assessment Criteria forHigh-Grade Gliomas:ResponseAssessment in Neuro-Oncology Working Group.J ClinOncol.2010;28:1963-1972)放射性评估给药方案的功效。
通过参考并入
本文引用的所有参考文献,包括专利、专利申请、论文、教材等及其中引用的参考文献在还没有达到的程度上据此通过引用整体并入本文。
等同专利
前面的描述和实施例详述了本发明的某些优选实施方案并且描述了发明人预期的最佳模式。然而,应意识到,不管前述内容可能多么详细地出现在文本中,本发明也可通过许多方式实践并且应根据所附权利要求及其任何等同权利要求解释本发明。
Claims (29)
1. 一种治疗有肿瘤的哺乳动物的方法,包括按约0.1mg/kg至约10mg/kg体重的剂量向有需要的哺乳动物施用抗EGFRvIII抗体-药物缀合物。
2. 根据权利要求1所述的方法,其中按至少0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 8.5、9.0或9.5mg/kg至不超过11.0mg/kg的剂量向有需要的哺乳动物施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物。
3. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中按至少.5-1mg/kg、.1-2mg/kg、2-3mg/kg、3-4mg/kg、4-5mg/kg、5-6mg/kg、6-7mg/kg、7-8mg/kg、8-9mg/kg、9-10mg/kg、1.5-2.5mg/kg、2.5-3.5mg/kg、3.5-4.5mg/kg、4.5-5.5mg/kg或5.5-6.5mg/kg的剂量向有需要的哺乳动物施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物。
4. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中本发明的所述施用步骤包括经静脉、经团注、经大脑内或经持续释放向所述哺乳动物施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物。
5. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物至少每周两次、至少每周一次、至少每两周一次、至少每三周一次或至少每四周一次。
6. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物体内的肿瘤表达EGFRvIII. I。
7. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物体内的肿瘤为肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、肾癌、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌、成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤或包含胶质组分的肿瘤,特别是成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、星形细胞瘤或包含胶质组分的肿瘤。
8. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物体内的肿瘤为成胶质细胞瘤或间变性星形细胞瘤。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物体内的肿瘤为复发成胶质细胞瘤或复发间变性星形细胞瘤。
10. 根据前述权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物体内的肿瘤为少突神经胶质瘤、少突星形细胞瘤、胶质肉瘤、混合性神经胶质瘤、毛细胞性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、室管膜下巨细胞星形细胞瘤、成星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、脑神经胶质瘤病或神经元-胶质肿瘤,包括神经节神经胶质瘤或间变性神经节神经胶质瘤。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物在首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物后存活超过3、超过4、超过5或超过6个月。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中从首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物3、4、5或6个月后,所述哺乳动物体内的肿瘤未曾进展。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物包含与首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前所述哺乳动物体内的循环肿瘤细胞水平相比降低的循环肿瘤细胞水平。
14. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物包含与首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前所述哺乳动物体内肿瘤特有的外来体水平相比降低的肿瘤特有的外来体水平。
15. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中与首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前的肿瘤大小相比,所述哺乳动物体内的肿瘤大小在施用抗EGFRvIII抗体-药物缀合物后减小。
16. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中与首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物之前所述哺乳动物体内的肿瘤大小相比,所述哺乳动物体内的肿瘤大小减小至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100%。
17. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物表现出完全或部分反应。
18. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物从首次施用所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物以来表现出6个月无进展生存期。
19. 根据前述权利要求15-18中任一项所述的方法,根据Macdonald标准或RANO标准评估。
20. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物的抗体为抗体131。
21. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抗EGFRvIII抗体-药物缀合物的抗体包含含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变区。
22. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中与所述抗EGFRvIII抗体缀合的所述药物为放射性同位素、化学治疗剂、毒素或其片段或变体。
23. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抗EGFRvIII抗体与至少1-10个、至少1-5个、至少3-4个或至少3-5个类美登素(maytansinoid)DM1分子缀合。
24. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述药物经由不可裂解的连接子基团与所述抗EGFRvIII抗体缀合。
25. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述药物经由4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)与所述抗EGFRvIII抗体缀合。
26. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中抗EGFRvIII抗体-药物缀合物是图8A、8B和8D中描绘的Ab 131-DM1并且包含图8B中描绘的全长重链和图8D中描绘的全长轻链。
27. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述抗EGFRvIII抗体包含含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的重链可变区和含SEQ ID NO 19的氨基酸序列的轻链可变区并且所述抗EGFRvIII抗体通过MCC连接子与3-5个类美登素缀合。
28. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中在对所述哺乳动物应用手术,应用放射疗法,在初期情况下应用全脑放射疗法,在复发情况下应用病灶放射疗法,在初期和复发情况下施用替莫唑胺(temozolomide),施用贝伐单抗(bevacizumab),施用伊立替康(irinotecan),施用PCV、甲苄肼(procabazine)、洛莫司汀(lomustine)[CCNU]、长春新碱(vincristine),植入Gliadel晶片(浸有BCNU的聚苯丙生(polifeprosan)),施用酪氨酸激酶抑制剂,施用放射致敏剂,施用基于疫苗的疗法,施用抗体药物缀合物或在初期或复发情况下施用双特异性T细胞增强剂,或施用靶向药物治疗所述哺乳动物之前、同时或之后进行所述施用步骤。
29. 根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述哺乳动物为人。
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