KR102606190B1 - Nkg2d 및 종양 연관 항원에 대해 유도된 이가 항체 - Google Patents

Nkg2d 및 종양 연관 항원에 대해 유도된 이가 항체 Download PDF

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Abstract

암 세포의 표면 상의 종양 연관 항원 (TAA) 및 NKG2D 수용체와 결합하는 폴리펩티드가 개시되어 있다. NKG2D 수용체는 자연 살해 세포, T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 감마 델타 T 세포와 같은 살해 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 경우, TAA는 CS-1 또는 EGFRvIII이다. 또한, 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 및 개시된 벡터를 포함하는 숙주 세포가 개시된다. 또한, 개시된 폴리펩티드를 포함하는 2가 항체가 개시된다. 또한, 개시된 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다. 또한, 개시된 이중특이적 항체를 사용하여 대상체에서 암을 치료하는 방법이 개시된다.

Description

NKG2D 및 종양 연관 항원에 대해 유도된 이가 항체
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된, 2015년 2월 20일자로 출원된 미국 가출원 제62/118,561호 및 2015년 2월 23일자로 출원된 미국 가출원 제62/119,645호의 이익을 주장한다.
2014년에는 160만 건의 신규 사례가 암으로 진단되었고, 585,720명이 사망한 것으로 보고되었다. 현 치료는 주로 화학요법, 방사선요법, 수술 및 골수 이식에 의존하고 있다. 그러나, 이것들은 심각한 부작용과 연관될 수 있으며, 일부 경우에는 암이 치료에 반응하지 않는다. 따라서, 새로운 치료법이 시급히 필요하다. 암 면역요법은 고도로 특이적이고 림프구로부터 종양 용해 활성을 유도하는 데 효과적이므로 유망하다. 이중특이적 T 세포 결합자(engager) 또는 이중특이적 살해 세포 결합자 (BiTE 및 BiKE)와 같은 융합 단백질은 종양 세포와 T 세포 (또는, 각각 자연 살해 세포) 사이에 연결을 형성하는 암 면역요법이다. BiTE 또는 BiKE 단백질은 상이한 항체의 두 개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 가지며, 그 중 하나는 종양 특이적 분자와 결합하고, 다른 하나는 림프구 표면 상의 수용체와 결합한다. BiTE 및 BiKE 치료법은 종래의 항체 치료법과 비교하여 종양 세포 용해에 대해 100 내지 10,000배 더 높은 효능을 가질 것으로 기대된다. 그러나, BiTE 치료법은 T 세포 표면 상의 CD3 수용체를 특이적으로 표적화하는 한편, BiKE 치료법은 자연 살해 세포의 표면 상의 수용체를 표적화한다. 현재, 이중특이적 결합자 단백질은 CD8+ T 세포, NK 세포, NKT 세포 및 γδT 세포 등을 포함한 모든 살해 면역 세포를 교차-촉발시키도록 설계되어 있지 않다.
종양-연관 항원 (TAA) 및 NKG2D 수용체와 결합하는 폴리펩티드가 개시되어 있다. 폴리펩티드는 TAA와 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TAA는 CS-1 또는 EGFRvIII (따라서, "CS-1 항체" 또는 "EGFRvIII 항체"인 항체 또는 단편)일 수 있다. 폴리펩티드는 NKG2D 수용체와 결합하는 항체 ("NKG2D 항체") 또는 그의 단편을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 NKG2D 항체 및 CS-1 항체 또는 EGFRvIII 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TAA 항체 및/또는 NKG2D 항체는 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 항체이다.
일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는, TAA 항체 및 NKG2D 항체를 발현하는 핵산에 의해 발현되는 융합 단백질이다. 일부 실시 형태에서, TAA 항체 및 NKG2D 항체는 개시된 폴리펩티드를 형성하도록 함께 화학적으로 접합된 별개의 펩티드이다.
폴리펩티드의 일부 실시 형태에서, TAA 항체 및 NKG2D 항체는 비면역원성 링커(linker)에 의해 함께 결합된다. 비면역원성 링커는 인간 근육 알도스 단백질의 아미노산 서열, 그의 단편, 그의 변이체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
NKG2D 수용체는 세포독성 T 세포, 감마-델타 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포 및 NKT 세포에 의해 발현되며, 본 명세서에서 이들은 대체적으로 모두 "살해 세포"로 지칭될 수 있다. NKG2D 수용체는 단백질과 결합 시 살해 세포를 활성화시킬 수 있다. 이러한 활성화는 세포독성이 되는 살해 세포를 포함할 수 있다.
CS-1은 다발성 골수종 세포에 의해 발현되는 항원이다. EGFR III 형 변이체 (EGFRvIII)는, 유방, 난소, 전립선 및 폐 암종에서뿐만 아니라 교모세포종에서도 발견되는 새로운 종양 특이적 표적의 형성을 야기하는, 세포외 도메인의 결실을 갖는다.
따라서, 개시된 폴리펩티드는, 특정 암에 의해 발현되는 TAA, 예를 들어 CS-1 또는 EGFRvIII 및 살해 세포에 의해 발현되는 NKG2D 수용체와 결합할 수 있다. 개시된 폴리펩티드는, 암 세포에 의해 발현되는 TAA 및 살해 세포에 의해 발현되는 NKG2D 수용체와 동시에 결합하고, 그에 의해 암 세포와 살해 세포 사이에 가교를 형성할 수 있다. 이러한 가교는 종양 세포와 살해 세포 사이에 면역 용해 시냅스의 형성을 촉진할 수 있다. 살해 세포는 면역 시냅스 상에서 퍼포린 및/또는 그랜자임을 방출할 수 있으며, 따라서 다발성 골수종 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 사멸은 암 세포의 용해를 포함할 수 있다. 이와 같이, 개시된 폴리펩티드는 살해 세포의 동원 및 활성화를 통해 암 세포의 표적화된 사멸을 달성한다.
또한, 다발성 골수종, 교모세포종, 유방암, 난소암, 전립선암 및 폐암종과 같은 암을, 이의 치료를 필요로 하는 대상체에서, 치료하는 방법이 개시되어 있다. 본 방법은 전술된 폴리펩티드를 대상체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, 폴리펩티드는 치료적 유효량으로 투여된다.
본 발명의 하나 이상의 실시 형태의 세부 사항은 첨부 도면 및 하기 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 상세한 설명 및 도면 및 청구범위로부터 명확해질 것이다.
도 1은 항-CS-1 삼중특이적 세포독성 림프구 결합자 (TriCLE) 폴리펩티드 설계의 개략도이다. 항-CS-1 단일 사슬 가변 단편 (scFv) 및 항-NGK2D scFv는 인간 근육 알도스 (HMA) 링커에 의해 함께 결합된다. VH: 중쇄; VL: 경쇄; (G4S)3: 글리신-세린 링커; 6XHis: 히스티딘의 6회 반복.
도 2는 정제된 단백질이 항-CS-1 TriCLE를 함유하는 scFv임을 확인하는 웨스턴 블롯(Western blot)을 도시한다.
도 3은 항-CS-1 TriCLE의 존재 하에 다중 골수종 (MM) 세포주 H929에 대한 NK 세포주 NKL의 세포독성의 그래프이다. Tri-CLE를 50pg/mL 내지 10ug/mL 범위에서 용량을 증가시키면서, 20:1의 효과기 비의 NKL: H929의 공동배양에 첨가하였다.
도 4a는 CS1+ 세포주에 대한 TriCLE의 결합을 도시한다. 0.2 × 106 H929 세포를 TriCLE와 함께 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 2차 항체-결합 단백질 L-바이오틴으로 염색한 후, 유동 세포계측 분석을 위해 항 바이오틴 PE 항체로 염색하였다. 히스토그램은 세 번의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 것이었다. 도 4b는 항-CS-1 TriCLE의 평균 형광 강도를 1차 항체로서 비교한 그래프를 나타낸다.
도 5a는 TriCLE에 의한 T, NKT 및 NK 세포의 활성화를 도시한다. 5ug/mL의 TriCLE를 4시간 동안 휴지기 인간 PBMC에 첨가한 후, 세포를 수집하고, CD3, CD56, CD14 및 CD69를 실온에서 20분 동안 염색하였다. 세포를 유동 세포계측법으로 분석하였다. 도 5b는 항-CD3 항체가 TriCLE에 상승작용하며, 살해 세포의 3개의 하위세트 모두의 활성화를 증가시킨 것을 도시한다. 도 5c는 활성화된 인간 PBMC의 세포독성이 3개의 다발성 골수종 세포 MM1.s, H929 및 RPMI-8226에 대한 TriCLE에 의해 강화되었음을 도시한다. EC50은 비선형 회귀 곡선으로부터 계산되었다. 도 5d는 24시간 및 48시간째에 CD56이 결핍된 효과기 세포를 사용하여 항-CS-1 TriCLE이 세포독성을 유도한 것을 도시한다. ***은 p<0.001이다.
도 6a는 항-EGFRvIII TriCLE의 그래프 표시를 도시한다. VH: 중쇄; VL: 경쇄; (G4S)3: 글리신-세린 링커; HMA: 인간 근육 알도스. 전체 서열을 pGEX6p1m 벡터 내로 클로닝하였다. 도 6b는 항-EGFRvIII TriCLE에 의한 T, NKT 및 NK 세포의 활성화를 도시한다. 5ug/mL의 TriCLE를 4시간 동안 휴지기 인간 PBMC에 첨가한 후, 세포를 수집하고, CD3, CD56, CD14 및 CD69를 실온에서 20분 동안 염색하였다. 세포를 유동 세포계측법으로 분석하였다. 도 6c는 활성화된 인간 PBMC의 세포독성이 3개의 다발성 골수종 세포 GBM1123에 대한 TriCLE에 의해 강화되었음을 도시한다. EC50은 비선형 회귀 곡선으로부터 계산되었다. 결과는 3명의 독립적인 공여자에 의한 것이었다. ***은 p<0.001이고; **는 p<0.01이다. 도 6c는 나타낸다.
TAA 및 NKG2D 수용체와 결합하는 폴리펩티드. 폴리펩티드는 TAA와 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 도 1a의 개략도에 의해 제시된 것과 같이, TAA는 CS-1 (따라서, "CS-1 항체"인 항체 또는 단편)일 수 있다. 폴리펩티드는 NKG2D 수용체와 결합하는 항체 ("NKG2D 항체") 또는 그의 단편을 추가로 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 CS-1 항체 및 NKG2D 항체를 포함할 수 있다. CS-1 항체 및/또는 NKG2D 항체는 단일 사슬 가변 단편일 수 있다.
개시된 폴리펩티드는 종양 세포 (또는, 바이러스 감염 세포)를 사멸시키기 위해 모든 강력한 살해 세포의 세포독성을 동원하여 탈표적(off-target) 부작용 없이 월등한 효능을 야기함으로써, 종래의 항-CD16 BiKE 또는 항-CD3 BiTE와 상이하다. 일부 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드는 NKG2D 촉발자 분자 및 종양-연관 항원 (TAA)을 표적으로 하는 2개의 단일 사슬 가변 단편 (scFv)의 조작된 융합 단백질을 포함한다. NKG2D 수용체는, 특히 세포독성 T 세포, 감마-델타 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포 상에서 고도로 발현되는 활성화 분자이다. 일단 NKG2D 수용체가, 예를 들어, 항-NKG2D scFv, 항체 또는 다른 리간드에 의해 결합되면, 그의 활성화 모티프는 DAP10과 같은 다른 수용자 단백질의 인산화를 촉발시키고, 후속하여, 일련의 세포 활성화 및 세포독성의 실행을 촉발할 것이다. 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010/0150870호에는 인간 NKG2D에 대한 특이성을 갖는 항체 및 이를 암 치료에 사용하는 방법이 기재되어 있다.
개시된 폴리펩티드는 자연 살해 세포, T 세포 및 종양 세포를 표적화할 수 있는 그의 능력으로 인해, 삼중특이적 세포독성 림프구 결합자 (TriCLE)로 지칭된다.
다른 한편으로, TAA는 암 세포 상에서 발현된다. 특정 TAA는 암 특이적이다. 예를 들어, CS-1은 다발성 골수종 세포 상에서 발현되는 TAA이다. CS1은 신호전달 림프구 활성화 분자 (SLAM) 계열에 속하는 세포 표면 수용체이다. 정상 세포가 아닌 MM 세포 상에서의 CS1의 고발현은 CS1을 MM 치료를 위한 매력적인 표적이 되도록 한다. CS1에 대한 엘로투주맙을 사용한 전임상 데이터는, 엘로투주맙이, PBMC 또는 정제된 NK 세포와 함께 인큐베이션된 경우, 인간 MM 세포주의 용해를 유도하는 강력한 능력을 나타냄을 보여주었다. EGFRvIII는, 유방, 난소, 전립선 및 폐 암종에서뿐만 아니라 교모세포종에서도 발견되는 새로운 종양 특이적 표적의 형성을 야기하는, 세포외 도메인의 결실을 갖는다. scFv의 항원 특이적 특성은, 융합 단백질이 NKG2D 및 TAA 분자와 특이적으로 결합하게 하여, 현 치료법보다 부작용이 더 감소되게 한다.
개시된 폴리펩티드는 재조합 DNA 기법을 사용하여 조작될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는, TAA 항체 및 NKG2D 항체를 발현하는 핵산에 의해 발현되는 융합 단백질이다. 조작된 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 박테리아 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 개시된 폴리펩티드는 용이하게 생성될 수 있고, 다시 접힐 수 있고, 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제될 수 있다 일부 실시 형태에서, TAA 항체 및 NKG2D 항체는 개시된 폴리펩티드를 형성하도록 함께 화학적으로 접합된 별개의 펩티드이다.
항-TAA 항체 및 항-NGK2D 항체의 scFv는 비면역원성 링커와 함께 결합 및 연결될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 인간 근육 알도스 단백질로부터 유래되거나, 그의 변이체일 수 있다.
개시된 폴리펩티드가 TAA를 발현하는 암 세포를 갖는 대상체에 투여되는 경우, 항-TAA scFv는 하나의 아암으로 암 세포 표면과 결합하고, 항-NGK2D scFv는 다른 아암 상에서 살해 세포의 NKG2D 수용체와 결합한다. 이러한 결합은 암과 살해 세포를 가교하여, 면역 용해성 시냅스를 형성한다. 살해 세포는, 세포막을 파괴하고 암 세포의 세포 사멸을 유도하는 시냅스 위에 퍼포린 및 그랜자임을 방출할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-TAA scFv는 항-CS-1이다. 다른 특정 실시 형태에서, 항-TAA scFv는 항-EGFLvIII이다. 따라서, 개시된 폴리펩티드는 살해 세포를 다발성 골수종 세포, 교모세포종, 유방암, 난소암, 전립선암 및 폐암종과 연결시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드는 NKG2D에 부착되는 리간드를 (즉, 항체 대신) 포함한다. 이러한 리간드는 MIC 또는 ULBP 계열로부터의 것일 수 있다. 예를 들어, NKG2D 리간드는 MICA 또는 MICB일 수 있거나, NKG2D 리간드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, 또는 ULBP6일 수 있다.
다른 대안적인 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드는, TAA, 예를 들어, CS-1 또는 EGFRvIII와 결합하는 리간드를 (즉, 항체 대신) 포함한다.
또한, 개시된 폴리펩티드에 대해 코딩하는 2개의 핵산 작제물, 예를 들어 pGEX6p1m-TriCLE 및 pET21d-TriCLE가 본 명세서에 개시된다. 이러한 작제물은 박테리아, 포유류 또는 곰팡이 세포를 사용하여, 단백질의 고수율 번역에 사용될 수 있다. 번역은 강력한 T7 프로모터에 의해 수행될 수 있다. pGEX6p1m 및 pET21d 발현 벡터가 효율적인 단백질 번역을 지원하는 것으로 밝혀졌으나, 본 발명의 범주는 본 명세서에 개시된 융합 단백질을 인코딩하는 서열과 쌍을 이루는 다른 발현 벡터를 포함한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", "the")는 그 문맥에 달리 명확히 나타나 있지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "하나의 세포"는 그의 혼합물을 포함하여, 복수의 세포를 포함한다.
용어 "약" 및 "대략"은 당업자가 이해하는 바와 같이, "근사한" 것으로 정의된다. 비제한적인 일 실시 형태에서, 상기 용어는 10% 이내로 정의된다. 비제한적인 다른 실시 형태에서, 상기 용어는 5% 이내로 정의된다. 비제한적인 또 다른 실시 형태에서, 상기 용어는 1% 이내로 정의된다.
용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는, 하나의 아미노산의 카르복실 기에 의해 다른 아미노산의 알파 아미노 기에 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 천연 또는 합성 분자를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 용어 "단백질"은 펩티드 결합 또는 변형된 펩티드 결합에 의해 서로 결합된 아미노산, 예를 들어 펩티드 등배전자체 (isostere) 등을 포함하며, 20개의 유전자-인코딩 아미노산 이외의 변형된 아미노산을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 번역 후 처리와 같은 천연 과정 또는 당업계에 잘 알려진 화학적 변형 기법에 의해 변형될 수 있다.
용어 "단백질 도메인"은 단백질의 일 부분, 단백질의 부분들 또는 구조적 완전성을 나타내는 전체 단백질을 지칭하며; 이러한 결정은 단백질의 일 부분, 단백질의 부분들 또는 전체 단백질의 아미노산 조성을 기초로 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "펩티드모방체 (peptidomimetic)"는 정상 펩티드 화학의 일부 변경을 포함하는 펩티드의 모방체를 의미한다. 펩티드모방체는 전형적으로 안정성의 증가, 효능의 증가, 전달의 강화, 반감기의 증가 등과 같은 본래 펩티드의 일부 특성을 강화시킨다. 공지된 폴리펩티드 서열에 기초한 펩티드모방체의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제5,631,280호; 제5,612,895호; 및 제5,579,250호에 기재되어 있다. 펩티드모방체의 사용은 주어진 위치에서 비-아미드 연결에 의한 비-아미노산 잔기의 혼입을 수반할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태는, 상기 화합물이 적합한 모방체로 대체된 결합, 펩티드 골격 (peptide backbone) 또는 아미노산 성분을 갖는 펩티드모방체이다. 적합한 아미노산 모방체일 수 있는 비천연 아미노산의 일부 비제한 예는 β-알라닌, L-α-아미노 부티르산, L-γ-아미노 부티르산, L-α-아미노 아이소부티르산, L-ε-아미노 카프로산, 7-아미노 헵탄산, L-아스파르트산, L-글루탐산, N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-리신, N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L 리신, L-메티오닌 설폰, L-노르류신, L-노르발린, N-α-Boc-N-δCBZ-L-오르니틴, N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-오르니틴, Boc-p-니트로-L-페닐알라닌, Boc-하이드록시프롤린 및 Boc-L-티오프롤린을 포함한다.
용어 "융합 단백질"은 하나의 폴리펩티드의 아미노 말단과 다른 폴리펩티드의 카르복실 말단 사이에 형성된 펩티드 결합을 통한 둘 이상의 폴리펩티드의 결합에 의해 형성된 폴리펩티드를 지칭한다. 융합 단백질은 구성 폴리펩티드의 화학적 커플링 (chemical coupling)에 의해 형성될 수 있거나, 이는 단일 인접 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열로부터 단일 폴리펩티드로서 발현될 수 있다. 단일 사슬 융합 단백질은 단일 인접 폴리펩티드 골격을 갖는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 분자 생물학에서의 종래 기법을 사용하여 두 개의 유전자를 단일 핵산으로 프레임 내에서 결합시킨 후, 융합 단백질이 생성되는 조건 하에 적합한 숙주 세포에서 핵산을 발현시킴으로써 제조될 수 있다.
용어 "항체"는 표적 항원에 선택적으로 결합하는 천연 항체 또는 합성 항체를 지칭한다. 상기 용어는 다클론 항체 및 단일클론 항체를 포함한다. 용어 "항체"에는, 온전한 면역글로불린 분자에 더하여, 이들 면역글로불린 분자의 단편 또는 중합체, 및 표적 항원에 선택적으로 결합하는 면역 글로불린 분자의 인간 또는 인간화된 버전이 또한 포함된다.
용어 "단백질 단편" 또는 "항체 단편"은 전장 단백질 또는 항체의 기능적 부분을 지칭한다. 항체 단편의 지칭 시, 단편은 대체적으로 표적 결합 영역 또는 가변 영역이다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편을 포함한다. 항체의 "기능적 단편 또는 유사체"라는 어구는 전장 항체와 공통되는 특질적인 생물학적 활성을 갖는 화합물이다. 예를 들어, 항-CS-1 항체의 기능적 단편 또는 유사체는 암 세포 표면 상에서 CS-1 분자와 결합할 수 있는 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 항체와 관련하여, "기능적 단편"은 Fv, F(ab) 및 F(ab')2 단편을 지칭한다. "Fv" 단편은 완전한 표적 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이러한 영역은 단단한 비공유 결합 (VH-VL 이량체)으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 이러한 구성에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상에 표적 결합 부위를 정의한다. 종합하면, 6개의 CDR이 항체에 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (scFv, 또는 표적에 대해 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차도, 전체 결합 부위보다 친화도가 낮더라도, 표적을 인식하여 결합하는 능력을 갖는다.
용어 "CDR" 및 그 복수형인 "CDR들"은, 3개가 경쇄 가변 영역 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)의 결합 특성을 구성하고, 3개가 중쇄 가변 영역 (CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)의 결합 특성을 구성하는 상보성 결정 영역을 지칭한다. CDR은, 항체와 항원의 특이적 상호작용에 관여하고 따라서 항체 분자의 기능적 활성에 기여하는 대부분의 잔기를 포함하며; 이들은 항원 특이성의 주 결정인자이다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인과 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 대체적으로, Fv 폴리펩티드는, sFv가 표적 결합을 위해 원하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드 (항체를 포함) 또는 수용체를 지칭하는 경우, 용어 "특이적으로 결합한다"는 단백질 및 다른 생물학적 물질의 이종 집단에서의 단백질 또는 폴리펩티드 또는 수용체의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 (예를 들어, 항체의 경우, 면역검정 조건) 하에서, 특정 리간드 또는 항체는, 특정 리간드 또는 항체가 샘플에 존재하는 다른 단백질과 또는 유기체 내에서 상기 리간드 또는 항체가 접촉할 수 있는 다른 단백질과 상당한 양으로 결합하지 않는 경우, 그의 특정 "표적"과 "특이적으로 결합한다" (예를 들어, 항체가 내피 항원과 특이적으로 결합함). 대체적으로, 제2 분자에 "특이적으로 결합하는" 제1 분자는 제2 분자와 약 105 M-1 (예를 들어, 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 및 1012 M-1 이상) 초과의 친화도 (Ka)를 갖는다. 일부 실시 형태에서, Ka는 10-6 M-1 내지 10-9 M-1일 수 있다. 다른 실시 형태에서, Ka는 10-9 M-1 내지 10-12 M-1일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "리간드"는 대체적으로 표적 세포 상의 수용체와 반응하거나 또는 그렇지 않으면 인식하거나 결합할 수 있는 모든 분자를 지칭한다.
개시된 폴리펩티드 작제물의 공유적 변형이 또한 고려되는데, 이는 항상은 아니지만 대체적으로 번역 후 수행된다. 예를 들어, 선택된 측쇄 또는 N-말단 잔기 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 폴리펩티드 작제물의 특정 아미노산 잔기를 반응시킴으로써, 개시된 폴리펩티드의 몇몇 유형의 공유적 변형이 분자 내로 도입될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드의 글리코실화 패턴이 변경된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 글리코실화 패턴은 단백질의 서열 (예를 들어,하기에서 논의되는 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재) 또는 단백질이 생성되는 숙주 세포 또는 유기체 둘 모두에 의존적일 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은, 탄수화물 모이어티(moiety)가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되는 것을 지칭한다. 트라이펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 이들 트라이펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결 글리코실화는, 하이드록시아미노산으로서 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수 있으나, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 지칭한다. 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 다른 수단은 단백질에 글리코사이드를 화학적으로 또는 효소적으로 커플링시키는 것이다. 이러한 과정은 N- 및 O-연결 글리코실화에 대한 글리코실화 능력을 갖는 숙주 세포에서의 단백질의 생성을 요구하지 않는다는 점에서 유리하다.
일부 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드는 하나 이상의 표지(label)를 추가로 포함한다. 표지 그룹은 잠재적인 입체 장애를 줄이기 위해, 다양한 길이의 스페이서 아암을 통해 개시된 폴리펩티드와 커플링될 수 있다. 단백질을 표지하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 대체적으로, 표지는, 그가 검출되는 검정에 따라, 다양한 부류로 분류되며, 하기의 예가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다: a) 방사성이거나, 중동위원소 (heavy isotope)일 수 있는 동위원소 표지, 예를 들어 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (예를 들어, 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125l, 131I); b) 자기 표지 (magnetic label) (예를 들어, 자기 입자); c) 산화환원 활성 모이어티; d) 광학 염료 (발색단, 인광체 및 형광체를 포함하지만, 이에 한정되지 않음), 예를 들어, 형광 기 (예를 들어, FITC, 로다민, 란탄족 인광체), 화학발광 기, 및 "소 분자" 형광물질 또는 단백질 형광물질일 수 있는 형광체; e) 효소 기 (예를 들어, 고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase), β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리 포스파타제); f) 바이오티닐화 기; g) 2차 리포터에 의해 인식되는 미리결정된 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그 등), 및 h) 페길화 (PEGylation).
또한, 개시된 폴리펩티드는, 예를 들어, 분자의 단리에 유용하거나 분자의 조정된 약동학적 프로파일과 연관된 추가 도메인을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 단리에 유용한 도메인은, 단리 방법, 예를 들어, 단리 컬럼에 포획될 수 있는 펩티드 모티프 또는 2차적으로 도입된 모이어티로부터 선택될 수 있다. 이러한 추가 도메인의 비제한 실시 형태는 Myc-태그, HAT-태그, HA-태그, TAP-태그, GST-태그, 키틴 결합 도메인 (CBD-태그), 말토스 결합 단백질 (MBP-태그), 플래그-태그 (Flag-tag), Strep-태그 및 그의 변이체 (예를 들어, Strepll-태그) 및 His-태그로서 알려진 펩티드 모티프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드는, 대체적으로 분자의 아미노산 서열 중의 연속 His 잔기, 바람직하게는 6개의 His 잔기의 반복으로 알려진 His-태그 도메인을 포함한다.
아미노산 서열 변형이 또한 고려된다. 예를 들어, 폴리펩티드의 결합 친화도를 향상시키거나, 생물학적 특성을 변경하거나, 또는 기능 획득 돌연변이 (gain-of-function mutation)를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 아미노산 서열 변이체는 적합한 뉴클레오티드 변화를 폴리펩티드의 핵산 내로 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조된다.
용어 "아미노산" 또는 "아미노산 잔기"는, 변형 아미노산, 합성 아미노산 또는 희귀 아미노산이 원하는 대로 사용될 수 있으나, 전형적으로는 알라닌 (Ala 또는 A); 아르기닌 (Arg 또는 R); 아스파라긴 (Asn 또는 N); 아스파트산 (Asp 또는 D); 시스테인 (Cys 또는 C); 글루타민 (Gin 또는 Q); 글루탐산 (Glu 또는 E); 글리신 (Gly 또는 G); 히스티딘 (His 또는 H); 아이소류신 (He 또는 I) : 류신 (Leu 또는 L); 리신 (Lys 또는 K); 메티오닌 (Met 또는 M); 페닐알라닌 (Phe 또는 F); 프롤린 (Pro 또는 P); 세린 (Ser 또는 S); 트레오닌 (Thr 또는 T); 트립토판 (Trp 또는 W); 티로신 (Tyr 또는 Y); 및 발린 (Val 또는 V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산과 같은 당업계에 인식된 정의를 갖는 아미노산을 지칭한다. 대체적으로, 아미노산은 비극성 측쇄 (예를 들어, Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); 음으로 하전된 측쇄 (예를 들어, Asp, Glu); 양으로 하전된 측쇄 (예를 들어, Arg, His, Lys); 또는 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, Asn, Cys, Gin, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, 및 Tyr)를 갖는 것으로서 분류될 수 있다.
아미노산 변형은, 예를 들어, 항체 작제물의 아미노산 서열 내 잔기로부터의 결실, 및/또는 그 내로의 삽입, 및/또는 그의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특성을 보유하는 경우, 최종 작제물에 도달하도록, 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어진다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화와 같이, 개시된 폴리펩티드의 번역 후 과정을 변경할 수 있다.
예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산이 (물론, 그의 길이에 따라) 각각의 CDR에 삽입되거나 결실될 수 있다. 개시된 폴리펩티드의 삽입 변이체는 개시된 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 대한 효소와의 융합 또는 개시된 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합을 포함한다.
치환 돌연변이유발(mutagenesis) 시에 가장 큰 관심대상 부위는 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR, 특히 초가변 영역을 포함한다. 치환은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 보존적 치환이다. 바람직하게는, CDR에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 치환될 수 있으며, 프레임워크 영역 (FR)에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 25개의 아미노산이 CDR 또는 FR의 길이에 따라 치환될 수 있다. 예를 들어, CDR 서열이 6개의 아미노산을 포괄하는 경우, 이들 아미노산 중 1, 2 또는 3개가 치환된 것으로 예상된다. 유사하게, CDR 서열이 15개의 아미노산을 포괄하는 경우, 이들 아미노산 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개가 치환된 것으로 예상된다.
돌연변이유발을 위한 바람직한 위치인 항체 작제물의 특정 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells in Science, 244: 1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같은 이른바 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이다. 여기서, 항체 작제물 내의 잔기 또는 표적 잔기의 그룹이 확인되고 (예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같은 하전된 잔기), 에피토프와 아미노산의 상호작용에 영향을 주기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체된다.
이어서, 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대해 추가의 또는 다른 변이체를 도입함으로써, 치환에 대해 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치가 정제된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위 또는 영역은 미리결정되는 한편, 돌연변이의 특성은 그 자체로 미리결정될 필요가 없다. 예를 들어, 지정된 부위에서 돌연변이의 수행을 분석 또는 최적화하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행될 수 있으며, 발현된 항체 작제물 변이체가 원하는 활성의 최적 조합을 위해 스크리닝된다. 서열을 알고 있는 DNA의 미리결정된 부위에 치환 돌연변이를 생성하는 기법, 예를 들어, M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발이 잘 알려져 있다. 표적 항원 결합 활성의 검정을 사용하여 돌연변이체의 스크리닝이 수행된다.
보존적 아미노산 치환, 비보존적 아미노산 치환 (즉, 축퇴 변이체), 아미노산을 인코딩하는 각 코돈 (즉, DNA 및 RNA)의 워블 위치 (wobble position) 내의 치환, 펩티드의 C-말단에 첨가되는 아미노산들, 또는 기준 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 상동성을 갖는 펩티드를 갖는 개시된 폴리펩티드의 변이체가 또한 개시된다.
용어 "서열 동일성 퍼센트 (%)" 또는 "상동성"은, 필요한 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해, 서열을 정렬하고, 갭을 도입한 후, 기준 핵산 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산과 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율로서 정의된다.
대체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 CDR 또는 모든 CDR에서 아미노산이 치환되는 경우, 그 후 얻어진 "치환된" 서열은 "본래의" CDR 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 동일한 것이 바람직하다. 이는 "치환된" 서열과 동일한 CDR의 길이 정도에 의존적임을 의미한다. 예를 들어, 5개의 아미노산을 갖는 CDR은 적어도 하나의 아미노산이 치환되도록 하기 위해 그의 치환된 서열과 80% 동일할 수 있다. 따라서, 항체 작제물의 CDR은 그의 치환된 서열과 상이한 정도의 동일성을 가질 수 있으며, 예를 들어, CDRL1이 80%를 가질 수 있는 한편, CDRL3는 90%를 가질 수 있다.
일부 경우, 치환 (또는 대체)은 보존적 치환이다. 항체 작제물이 제1 결합 도메인을 통해 NKG2D와 그리고 제2 결합 도메인을 통해 CS-1 또는 EGFRvIII와 같은 TAA와 결합할 수 있는 그의 능력을 보유하는 한, 임의의 치환이 예상된다.
아미노산 서열의 경우, 서열 동일성 및/또는 유사성은 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482]의 국소 서열 동일성 알고리즘, 문헌 [Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443]의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)의 컴퓨터 구현, 바람직하게는 디폴트 세팅 (default setting)을 사용하거나 또는 검사에 의해, 문헌 [Devereux et a/., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395]에 의해 기재된 베스트 피트(Best Fit) 서열 프로그램을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여, 바람직하게는 디폴트 세팅 (default setting)을 사용하여, 또는 검사에 의해, 결정될 수 있다. 바람직하게는, 동일성 퍼센트는 하기 매개변수에 기초하여 FastDB에 의해 계산된다: 1의 불일치 페널티; 1의 갭 페널티; 0.33의 갭 크기 패널티; 및 30의 결합 패널티, 문헌 ["Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.]. 유용한 알고리즘의 예는 PILEUP이다. PILEUP는 진행성 쌍별 정렬 (progressive, pairwise alignment)을 사용하여 관련된 서열의 그룹으로부터 다중 서열 정렬을 생성한다. 이는 또한 정렬을 생성하는 데 사용된 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 수형도를 플로팅할 수 있다. PILEUP는 문헌 [Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360]의 진행성 정렬 방법의 단순화를 사용하며; 상기 방법은 문헌 [Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153]에 기재된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 매개변수는 3.00의 디폴트 갭 가중치, 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 가중 단부 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 다른 예는 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]; 및 문헌 [Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787]에 기재된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 문헌 [Altschul ef al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480]으로부터 얻어진 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 대부분이 디폴트 값으로 설정된 몇몇 검색 매개변수를 사용한다. 조정가능한 매개변수는 하기 값으로 설정된다: 중첩 범위=1, 중첩 분율=0.125, 단어 임계치 (word threshold) (T)=ll. HSP S 및 HSP S2 매개변수는 동적 값이며, 특정 서열의 조성 및 관심대상 서열이 검색된 특정 데이터베이스의 구성에 따라 프로그램 자체에 의해 수립되지만; 민감도를 증가시키기 위해 상기 값을 조정할 수 있다.
추가의 유용한 알고리즘은 문헌 [Altschul ef al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402]에 의해 보고된 바와 같은 갭핑된(gapped) BLAST이다. 갭핑된 BLAST는 BLOSUM-62 치환 스코어; 9로 설정된 임계치 T 매개변수; 갭핑되지 않은 확장을 촉발하기 위한 2-히트 방법 (two-hit method), k의 하전 갭 길이(charge gap length), 10+k의 코스트(cost); 16으로 설정된 Xu, 및 데이터베이스 검색 단계의 경우 40으로 설정되고 알고리즘의 출력 단계의 경우 67로 설정된 Xg를 사용한다. 갭핑된 정렬은 약 22 비트에 상응하는 스코어에 의해 촉발된다.
대체적으로, 개별 변이체 CDR들 사이의 아미노산 상동성, 유사성 또는 동일성은 본 명세서에 기술된 서열에 대해 적어도 60%이며, 더 전형적으로는 적어도 65% 또는 70%, 더 바람직하게는 적어도 75% 또는 80%, 심지어 더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 및 거의 100%의 증가된 상동성 또는 동일성이 바람직하다. 유사한 방식으로, 본 명세서에서 확인된 결합 단백질의 핵산 서열에 대한 "핵산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는, 항체 작제물의 코딩 서열의 뉴클레오티드 잔기와 동일한 후보 서열의 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 정의된다. 특정 방법은 디폴트 매개변수로 설정된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 사용하는데, 중첩 범위와 중첩 분율은 각각 1과 0.125로 설정된다.
대체적으로, 개별 변이체 CDR을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 본 명세서에 기술된 뉴클레오티드 서열 사이의 핵산 서열 상동성, 유사성 또는 동일성은 적어도 60%이며, 더 전형적으로는 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 및 거의 100%의 증가된 상동성 또는 동일성이 바람직하다. 따라서, "변이체 CDR"은 본 발명의 모 CDR에 대해 특정 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는 것이며, 모 CDR의 특이성 및/또는 활성의 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 생물학적 기능을 공유한다.
일부 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드는 하기 식을 갖는 이중특이적 단일 사슬 항체이다:
VLN ― VHN -- VLT ― VHT,
VHN ― VLN -- VHT ― VLT,
VLN ― VHN -- VHT ― VLT, 또는
VHN ― VLN -- VLT ― VHT,
여기서 "VHN"은 NKG2D에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이고;
여기서 "VLN"은 NKG2D에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
여기서 "VHT"는 종양 세포 항원에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이고;
여기서 "VLT"는 종양 세포 항원에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이며;
여기서 "-"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어지고;
여기서 "--"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어진다.
상기 식은 방향을 명시하지 않고 있음에 유의해야 하며, 따라서 어느 일 단부가 아미노 말단 또는 카르복시 말단일 수 있다는 것을 염두에 두어야 한다.
일부 실시 형태에서, 종양 세포 항원은 CS-1 또는 EGFRvIII이다.
일부 실시 형태에서, VHN은 아미노산 서열의 서열 번호 5를 포함하고, VLN은 아미노산 서열의 서열 번호 6을 포함한다. 일부 실시 형태에서, VHT는 아미노산 서열의 서열 번호 13을 포함하고, VLT는 아미노산 서열의 서열 번호 14를 포함한다. 일부 실시 형태에서, VHT는 아미노산 서열의 서열 번호 19를 포함하고, VLT는 아미노산 서열의 서열 번호 20을 포함한다. 일부 실시 형태에서, "-" 링커는 아미노산 서열의 서열 번호 8을 포함한다. 일부 실시 형태에서, "--" 링커는 아미노산 서열의 서열 번호 10을 포함한다. 이들 실시 형태 중 임의의 것에서, 특정 서열이 변형되어 폴리펩티드의 결합 친화도를 향상시키거나, 생물학적 특성을 변경하거나, 또는 기능 획득 돌연변이를 도입할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 상기 서열은, 결합 친화도를 유지하거나 개선시키는, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 예를 들어 보존적 치환을 함유할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열의 서열 번호 21을 포함한다.
이중특이적 항체는 항체 가변 도메인만을 사용하여 작제될 수 있다. 상당히 효율적이면서 비교적 간단한 방법은 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 링커 서열이 짧아서, 이들이 서로 접히지 않고 결합할 수 없도록 하는 것이다. 3 내지 12개의 잔기로 링커 길이를 감소시키면, scFv 분자의 단량체 구성이 방지되고, 분자간 VH-VL 쌍 형성이 촉진되어, 60 kDa의 비공유 결합 scFv 이량체인 "다이아바디"가 형성된다. 다이아바디 형태는 또한, 하나의 항체의 VH 도메인이 짧은 링커에 의해 다른 항체의 VL 도메인에 연결된 것으로 이루어진 두 개의 단일 사슬 융합 생성물의 비공유 결합에 의해 얻어지는 재조합 이중특이적 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 링커 길이를 3개 미만의 잔기로 추가로 감소시키면, 삼량체 ("트라이아바디", 약 90 kDa) 또는 사량체 ("테트라바디", 약 120 kDa)의 형성이 야기될 수 있다. 조작된 항체, 특히 단일 도메인 단편의 검토를 위해, 문헌 [Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23:1126-1136]을 참조한다. 이러한 조작된 항체 모두는 본 명세서에 제공되는 융합 폴리펩티드에 사용될 수 있다.
Tandab® 분자를 제조하는 방법의 교시를 위해 참고로 포함된 국제 특허 공개 WO 1999057150 A3호 또는 미국 특허 출원 공개 제20060233787호에 기재된 바와 같이, 4가 Tandab®가 실질적으로 제조될 수 있다.
조작된 항체의 항원 인식 부위 또는 전체 가변 영역은 임의의 관심대상 항원 (예를 들어, CS-1)에 대한 하나 이상의 모 항체로부터 유래될 수 있다. 모 항체는 자연 발생 항체 또는 항체 단편, 자연 발생 항체로부터 조정된 항체 또는 항체 단편, 관심대상 항원에 특이적인 것으로 알려진 항체 또는 항체 단편의 서열을 사용하여 새롭게 작제된 항체를 포함할 수 있다. 모 항체로부터 유래될 수 있는 서열은 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 및/또는 CDR, 프레임워크 영역 또는 그의 다른 부분을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 이중특이적 항체는 인간에 투여되는 경우 면역원성이 감소되도록 하는 변경에 적용될 수 있다. 이러한 변경은 키메라화, 인간화, CDR-이식, 탈면역화 및/또는 프레임워크 영역 아미노산을 가장 근사한 인간 생식세포계열 서열에 상응하도록 하는 돌연변이 (생식세포계열화 (germlining))로서 통상 알려진 기법 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 변경된 이중특이적 항체는, 임의의 이러한 변경(들)을 거치지 않은 상응하는 이중특이적 항체보다 면역 반응 관련 부작용이 감소되거나 이러한 부작용이 없이 더 장기간 동안 투여가능한 채로 남아 있을 것이다. 당업자는, 항체가 원치 않는 숙주 면역 반응을 유도하는 것을 방지하기 위해, 항체가 변경되어야만 하는지 여부 및 그 정도를 결정하는 방법을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "살해 세포"는 세포독성 T 세포, 감마-델타 T 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 및 자연 살해 T (NKT) 세포일 수 있다.
대체적으로 링커는 단백질들과 결합하거나 이들 사이에서 어느 정도의 최소 거리 또는 다른 공간적 관계를 유지하는 것 이외에 특정한 생물학적 활성을 갖지 않는다. 그러나, 링커의 구성 아미노산은 분자의 접힘, 순 전하 또는 소수성과 같은 분자의 일부 특성에 영향을 주도록 선택될 수 있다. scFv 항체의 생성에 적합한 펩티드 링커 (-)는, 이들 링커의 교시 및 다양한 링커를 사용하여 상이한 표적에 대한 scFv 항체를 생성하는 방법의 교시를 위해 명세서에 참고로 포함된 문헌 [Kumada Y, et al. Biochemical Engineering Journal. 2007 35(2):158-165]; 문헌 [Albrecht H, et al. J Immunol Methods. 2006 310(1-2):100-16]; 문헌 [Feng J, et al. J Immunol Methods. 2003 282(1-2):33-43]; 문헌 [Griffiths AD, et al. Curr Opin Biotechnol. 1998 9(1):102-8]; 문헌 [Huston JS, et al. Methods Enzymol. 1991 203:46-88]; 문헌 [Bird RE, et al. Science. 1988 242(4877):423-6]; 문헌 [Takkinen K, et al. Protein Eng. 1991 4(7):837-41]; 문헌 [Smallshaw JE, et al. Protein Eng. 1999 12(7):623-30]; 문헌 [Argos P. J Mol Biol. 1990 211(4):943-58]; 및 문헌 [Whitlow M, et al. Protein Eng. 1993 6(8):989-95]에 기재되어 있다.
scFv 분자들을 함께 결합시키는 데 사용되는 펩티드 링커의 특정 길이는 반감기, 면역원성 및 전체 작제물의 활성을 결정하는 데 중요하다. 일부 실시 형태에서, 링커 서열은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 이상의 아미노산 길이이다. 일부 실시 형태에서, 링커 서열 (--)은 인간 근육 알도스 단백질 (서열 번호 10)의 단편, 또는 그의 변이체를 포함한다. 링커는 바람직하게는 VH-VL 사슬의 적절한 접힘 및 결합을 방해하지 않을 정도로 충분히 길지만, 추가된 면역원성을 야기할 만큼 길지는 않다.
본 명세서에 개시된 단백질 또는 단편은 또한 단일 scFv의 VH 사슬과 VL 사슬을 연결하기 위한 적어도 하나의 추가적인 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 GGGGS (서열 번호 22)의 3 내지 5회 반복으로부터 크기가 달라질 수 있는 글리신-세린 링커일 수 있다. 예를 들어, 서열 번호 8은 GGGGS (서열 번호 22)의 3회 반복으로, 15개의 아미노산 길이의 링커를 산출한다. 단일 scFv의 VH 사슬과 VL 사슬을 연결시키는 다른 잠재적인 서열은 CHI 도메인의 처음 6개의 아미노산 및/또는 친수성 알파-튜불린 펩티드 서열을 함유하는 인공 링커를 포함한다.
본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 개시된다. 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 또한 개시된다. 벡터는 (외래의) 유전 물질을 세포로 전달하는 비히클로서 사용되는 핵산 분자이다. 용어 "벡터"는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 대체적으로, 조작된 벡터는 복제 기점, 다중클로닝 부위 및 선택가능한 마커를 포함한다. 벡터 자체는 대체적으로, 삽입물 (전이유전자) 및 벡터의 "골격"으로서 기능하는 더 큰 서열을 포함하는, 뉴클레오티드 서열, 통상적으로는 DNA 서열이다. 최근 벡터는 전이유전자 삽입물 및 골격 이외에 프로모터, 유전 마커, 항생물질 저항성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그의 추가적인 특징을 포괄할 수 있다. 발현 벡터는 표적 세포에서 전이유전자의 발현을 위한 것이며, 대체적으로 제어 서열을 갖는다. 용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 선택적으로 작동자 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
또한, 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포가 개시된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포" 또는 "수용 세포"는 벡터, 외인성 핵산 분자 및 개시된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 수용자; 및/또는 폴리펩티드 자체의 수용자일 수 있거나 또는 그러한 수용자였던 임의의 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함하려는 것이다. 각각의 물질의 세포 내로의 도입은 형질전환, 형질감염 등의 방식으로 수행된다. 용어 "숙주 세포"는 또한 단일 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 포함하려는 것이다. 자연적, 우발적 또는 의도적인 돌연변이로 인해 또는 환경적 영향으로 인해, 다음 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있으므로, 이러한 자손은 실제로 (형태학 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체에서) 모세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나, 이는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어의 범주 내에 여전히 포함된다. 적합한 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포를 포함하며, 또한, 박테리아, 효모 세포, 곰팡이 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어 곤충 세포 및 포유류 세포, 예를 들어 쥣과 동물, 랫트, 마카크 또는 인간을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
개시된 폴리펩티드는 박테리아에서 생성될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 사상 균류 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 개시된 폴리펩티드에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 통상의 빵 효모는 하등 진핵 숙주 미생물 중 가장 통상적으로 사용되는 것이다. 그러나, 쉬조사카로마이세스 폼비 (Schizosaccharomyces pombe), 클루베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, K. 락티스 (K. lactis), K. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12424), K. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16045), K. 위케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24178), K. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56500), K. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36906), K. 테르모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 K. 마륵시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402 226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183 070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레시아 (Trichoderma reesia) (EP 244 234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 쉬완니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬완니오마이세스 오시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 균류, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium), 및 아스퍼길루스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 A. 니둘란스 (A. nidulans) 및 A. 니제르 (A. niger)와 같은 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 본 명세서에 통상 이용가능하며 유용하다.
글리코실화 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큐로바이러스 균주 및 변이체 및 스포돕테라 프루기페다 (Spodoptera frugiperda) (애벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스테르 (Drosophila melanogaster) (과실 파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 아우토그라파 칼리포니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용가능하다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 아라비돕시스 (Arabidopsis) 및 담배의 식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포 배양에서 단백질의 생성에 유용한 클로닝 및 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있다.
적합한 숙주 세포는 또한 척추동물 세포를 포함하고, 배양 (조직 배양)에서의 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 예는, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36 : 59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, 문헌 [Urlaub ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포 (mouse Sertoli cell) (TM4, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)]); 원숭이 신장 세포 (CVI ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL1587); 인간 자궁 경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 갯과 동물 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2,1413 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL5 1); TRI 세포 (문헌 [Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)이다.
또한, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드의 생성 방법으로서, 개시된 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 본 명세서에 개시된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
재조합 기법을 사용하는 경우, 개시된 폴리펩티드는, 주변세포질 공간에서, 세포내에서 생성될 수 있거나, 또는 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 폴리펩티드가 세포내에서 생성되는 경우, 제1 단계로서, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해, 숙주 세포 또는 용해된 단편의 미립자 파편이 제거된다. 폴리펩티드는 또한 E. 콜라이(E. coli)의 주변세포질 공간으로 분비될 수 있다. 요약하면, 세포 페이스트를 약 30분에 걸쳐 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에서 해동시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 폴리펩티드가 배지로 분비되는 경우, 대체적으로 먼저, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액이 구매가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축된다. 단백분해를 저해하기 위해 PMSF와 같은 프로테아제 억제제가 전술한 단계들 중 임의의 단계에 포함될 수 있으며, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위해 항생제가 포함될 수 있다.
숙주 세포로부터 제조된 개시된 폴리펩티드는, 예를 들어 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 회수 또는 정제될 수 있다. 회수될 폴리펩티드에 따라, 단백질 정제를 위한 기타 기법, 예를 들어 이온 교환 컬럼, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE ™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토-포커싱 (chromato-focusing), SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전에서의 분별법이 또한 사용될 수 있다. 개시된 폴리펩티드가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커 본드 ABX 수지 (Bakerbond ABX resin) (미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 J.T. Baker)가 정제에 유용하다.
친화성 크로마토그래피가 사용될 수 있다. 친화성 리간드가 부착된 매트릭스가 가장 흔한 아가로스이지만, 다른 매트릭스가 이용가능하다. 제어된 다공성 유리 또는 폴리(스티렌다이비닐) 벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는, 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속 및 짧은 처리 시간을 가능하게 한다.
약제학적으로 허용가능한 담체 중에 본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 개시된다. "약제학적으로 허용가능한"은 생물학적으로 또는 다르게는 바람직하지 않은 물질을 의미하는 것으로, 즉, 그가 함유된 약제학적 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하거나 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기함이 없이, 상기 물질은 핵산 또는 벡터와 함께 대상체에 투여될 수 있다. 당연히 담체는, 당업자에게 잘 알려져 있는 바와 같이, 활성 성분의 어떠한 분해도 최소화하고 대상체에 어떠한 부작용도 최소화하기 위해, 선택될 것이다.
본 명세서에 기재된 화합물은 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 비경구 제형은 당업계에 공지된 기법을 사용하여 수성 조성물로서 제조될 수 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사가능 제형, 예를 들어, 용액 또는 현탁액; 주사 전 재구성 매질의 첨가 시에 용액 또는 현탁액을 제조하는데 사용하기에 적합한 고체 형태; 에멀젼, 예를 들어 유중수 (w/o) 에멀젼, 수중유 (o/w) 에멀젼 및 이들의 마이크로에멀젼, 리포솜 또는 에멀솜(emulsome)으로서 제조될 수 있다.
담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 하나 이상의 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 예를 들어 식물성 오일 (예를 들어, 땅콩 유, 옥수수 유, 참깨 유 등) 및 이들의 조합을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다.
적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산물의 경우에는 필요 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직할 것이다.
유리 산 또는 염기 또는 그의 약리학적으로 허용가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액 및 분산물은, 계면활성제, 분산제, 유화제, pH 개질제 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 적절히 혼합된 물 또는 다른 용매 또는 분산매 중에서 제조될 수 있다.
적합한 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 또는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 적합한 음이온성 계면활성제는 카르복실레이트, 설포네이트 및 설페이트 이온을 함유하는 것들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 음이온성 계면활성제의 예는 장쇄 알킬 설포네이트 및 알킬 아릴 설포네이트의 나트륨, 칼륨, 암모늄, 예를 들어 소듐 도데실벤젠 설포네이트; 다이알킬 소듐 설포석시네이트, 예를 들어 소듐 도데실벤젠 설포네이트; 다이알킬 소듐 설포석시네이트, 예를 들어 소듐 비스-(2-에틸티옥실)-설포석시네이트; 및 알킬 설페이트, 예를 들어 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 양이온성 계면활성제는 4차 암모늄 화합물, 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 브롬화세트리모늄, 스테아릴 다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 폴리옥시에틸렌 및 코코넛 아민을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 비이온성 계면활성제의 예는 에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 프로필렌 글리콜 미리스테이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 폴리글리세릴-4-올레이트, 소르비탄 아크릴레이트, 수크로스 아크릴레이트, PEG-150 라우레이트, PEG-400 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐에테르, PEG-1000 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 트라이데실 에테르, 폴리프로필렌 글리콜 부틸 에테르, Poloxamer® 401, 스테아로일 모노아이소프로판올아미드 및 폴리옥시에틸렌 수소화 탈로우(tallow) 아미드를 포함한다. 양쪽성 계면활성제의 예는 소듐 N-도데실-β-알라닌, 소듐 N-라우릴-β-이미노다이프로피오네이트, 미리스토암포아세테이트, 라우릴 베타인 및 라우릴 설포베타인을 포함한다.
제형은 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유할 수 있다. 적합한 보존제는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 및 티메로살을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 제형은 또한 활성제(들)의 분해를 방지하기 위한 항산화제를 함유할 수 있다.
제형은 전형적으로 재구성 시에 비경구 투여를 위해 pH 3 내지 8로 완충된다. 적합한 완충제는 인산염 완충제, 아세테이트 완충제 및 시트레이트 완충제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
수용성 중합체는 종종 비경구 투여용 제형에 사용된다. 적합한 수용성 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 덱스트란, 카르복시메틸셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
멸균 주사가능 용액은 필요한 양의 활성 화합물을 적합한 용매 또는 분산매 중에서 상기 열거된 부형제들 중 하나 이상과 함께 혼입시킨 후, 필요에 따라, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 대체적으로, 분산물은 다양한 멸균된 활성 성분을, 기본 분산매 및 상기 열거된 것 이외의 다른 필요한 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 그의 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분을 더한 활성 성분의 분말을 산출하는 진공 건조 및 동결 건조 기법이다. 분말은 입자가 본질적으로 다공성인 방식으로 제조할 수 있으며, 이는 입자의 용해를 증가시킬 수 있다. 다공성 입자의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
펩티드는 유도체의 경구 전달이 효과적이도록 화학적으로 변형될 수 있다. 대체적으로, 고려되는 화학적 변형은 성분 분자 자체에 적어도 하나의 모이어티를 부착하는 것으로, 상기 모이어티는 (a) 단백분해의 저해; 및 (b) 위 또는 장으로부터 혈류로의 흡수를 가능하게 한다. 또한, 성분 또는 성분들의 전체 안정성이 증가하고 체내 순환 시간이 증가하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 페길화는 약제학적 용도로 바람직한 화학적 변형이다. 사용될 수 있는 다른 모이어티는 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리프롤린, 폴리-1,3-다이옥솔란 및 폴리-1,3,6-티옥소칸을 포함한다.
경구 제형의 경우, 방출 위치는 위, 소장 (십이지장, 공장 (jejunem) 또는 회장) 또는 대장일 수 있다. 당업자는, 위에서 용해되지 않지만, 십이지장 또는 장 내의 다른 위치에서 물질을 방출하는 입수가능한 제형을 갖는다. 바람직하게는, 방출은 장에서와 같이 위 환경 이외에서의 펩티드 (또는, 유도체)의 보호에 의해 또는 펩티드 (또는, 유도체)의 방출에 의해 위 환경의 유해한 영향을 회피할 것이다.
완전한 위 저항성을 보장하기 위해, 코팅이 적어도 pH 5.0에서 불투과성일 수 있다. 장용 코팅제로서 사용되는 더 통상적인 불활성 성분의 예는 셀룰로스 아세테이트 트라이멜리테이트 (CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), 유드라지트 L30D (Eudragit L30D), 아쿠아테리릭 (Aquateric), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 유드라지트 L, 유드라지트 S 및 쉘락 (Shellac)이다. 이러한 코팅은 혼합 필름으로서 사용할 수 있다.
코팅 또는 코팅들의 혼합물은 또한, 위에 대해 보호하도록 의도되지 않은 정제에 사용될 수 있다. 이는 당 코팅, 또는 정제를 삼키기 쉽게 하는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조 치료제 (즉, 분말)의 전달을 위한 경질 쉘(shell) (예를 들어, 젤라틴)로 이루어질 수 있고, 액체 형태에 대해서는 연질 젤라틴 쉘이 사용될 수 있다. 카세제 (cachet)의 쉘 물질은 진한 전분 또는 다른 식용 종이일 수 있다. 알약, 로젠지 (lozenge), 성형된 정제 또는 습제 정제 (tablet triturate)의 경우, 습식 대량 기법 (moist massing technique)이 사용될 수 있다.
수성 환경으로의 펩티드의 용해를 돕기 위해, 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 소듐 라우릴 설페이트, 다이옥틸 소듐 설포석시네이트 및 다이옥틸 소듐 설포네이트와 같은 음이온성 표면활성제 (anionic detergent)를 포함할 수 있다. 양이온성 표면활성제가 사용될 수 있으며, 염화벤잘코늄 또는 염화벤제토뮴을 포함할 수 있다. 계면활성제로서 제형에 포함될 수 있는 잠재적인 비이온성 표면활성제의 목록은 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소첨가 피마자 유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 20, 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스이다. 이러한 계면활성제는 단독으로 또는 상이한 비들의 혼합물로서 단백질 또는 유도체의 제형에 존재할 수 있다.
펩티드의 흡수를 잠재적으로 강화하는 첨가제에는, 예를 들어 지방산 올레산, 리놀레산 및 리놀렌산이 있다.
제어된 방출 경구 제형이 바람직할 수 있다. 펩티드는 확산 또는 침출 메커니즘에 의한 방출을 가능하게 하는 불활성 매트릭스, 예를 들어 검 (gum) 내로 혼입될 수 있다. 서서히 축퇴되는 매트릭스가 또한 상기 제형 내로 혼입될 수 있다. 일부 장용 코팅이 또한 지연 방출 효과를 갖는다. 제어된 방출의 다른 형태는 오로스 (Oros) 치료 시스템 (Alza Corp.)에 기초한 방법에 의한 것으로, 즉, 삼투압 효과로 인해 작은 단일 개구부를 통해 물이 유입되어, 약물을 밀어낼 수 있게 하는 반투막 내에 약물이 둘러싸여 있다.
다른 코팅이 상기 제형을 위해 사용될 수 있다. 이는 코팅 팬에 적용될 수 있는 다양한 당을 포함한다. 펩티드는 또한 필름 코팅된 정제로 제공될 수 있으며, 이 경우에 사용되는 물질은 2개의 군으로 나누어진다. 제1 군은 비장용 물질이며, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸하이드록시-에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필-메틸 셀룰로스, 소듐 카르복시-메틸 셀룰로스, 프로비돈 (providone) 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 제2 군은 통상 프탈산의 에스테르인 장용 물질로 이루어진다.
최적의 필름 코팅을 제공하기 위해 물질들의 혼합물이 사용될 수 있다. 필름 코팅은 팬 코팅기 또는 유동층에서 또는 압축 코팅에 의해 수행될 수 있다.
암의 치료를 필요로 하는 대상체에서, 암을 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 또한 개시된다. 일부 경우, 폴리펩티드는 치료적 유효량으로 투여된다.
약제학적 조성물을 포함하는 본 명세서에 개시된 조성물은, 국소 치료가 바람직한지 또는 전신 치료가 바람직한지에 따라 그리고 치료될 부위에 따라, 많은 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 개시된 조성물은 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 공동내 (intracavity) 또는 경피로 투여될 수 있다. 조성물은 경구, 비경구 (예를 들어, 정맥내), 근육내 주사, 복강내 주사, 경피, 체외, 안구, 질내, 직장내, 비강내, 국소 비강내 투여 또는 흡입제에 의한 투여를 포함하는 국소 등으로 투여될 수 있다.
조성물의 비경구 투여는, 사용되는 경우, 대체적으로 주사에 의해 특징지어 진다. 주사가능 물질은 액체 용액 또는 현탁액, 액체 중 현탁액의 용액에 적합한 주사 전 고체 형태, 또는 에멀젼으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 보완된 접근법은 일정한 투여량이 유지되도록 저속 방출 또는 서방형 시스템의 사용을 수반한다.
본 명세서에 개시된 조성물은 암에 걸릴 위험이 있는 환자 또는 대상체에 예방적으로 투여될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 조성물의 투여 전에 암에 걸릴 위험이 있는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
필요한 조성물의 정확한 양은 대상체의 종, 연령, 중량 및 일반적인 상태, 치료되는 알레르기 장애의 중증도, 사용된 특정 핵산 또는 벡터, 그의 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 따라서, 모든 조성물에 대해 정확한 양을 지정하는 것은 불가능하다. 그러나, 적정 양은 본 명세서에서 교시된 일상적인 실험만을 사용하여, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 조성물을 투여하기 위한 유효한 투여량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 조성물의 투여를 위한 투여량 범위는 증상 장애에 미치는 원하는 효과를 생성하기에 충분히 큰 양의 범위이다. 투여량은 원하지 않는 교차 반응, 과민성 반응 등과 같은 부정적인 부작용을 야기할 만큼의 다량이 아니어야 한다. 대체적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질병의 정도, 투여 경로, 또는 다른 약제가 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 어떠한 사용금지사유가 있는 경우에는 개별 의사에 의해 조정될 수 있다. 투여량은 다양할 수 있으며, 1일 또는 수 일 동안 매일 1회 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 지정된 분류의 의약품의 적정 투여량에 대한 지침은 문헌에서 찾아 볼 수 있다. 예를 들어, 항체의 적정 용량 선택에 대한 지침은 항체의 치료적 사용에 관한 문헌, 예를 들어 문헌 [Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357]; 문헌 [Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389]에서 찾아 볼 수 있다. 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 1일 투여량은 전술된 인자에 따라 약 1 ㎍/㎏체중/일 내지 최대 100 mg/㎏체중/일 이상의 범위일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 개시된 폴리펩티드는 약 0.1 ng/㎏체중 내지 약 100 g/㎏체중, 약 10 ng/㎏체중 내지 약 50 g/㎏체중, 약 100 ng/㎏체중 내지 약 1 g/㎏체중, 약 1 ㎍/㎏체중 내지 약 100 mg/㎏체중, 약 1 ㎍/㎏체중 내지 약 50 mg/㎏체중, 약 1 mg/㎏체중 내지 약 500 mg/㎏체중; 및 약 1 mg/㎏체중 내지 약 50 mg/㎏체중의 비경구 투여와 등가인 용량으로 투여된다. 대안적으로, 치료적 유효한 용량을 달성하기 위해 투여되는 폴리펩티드의 양은 약 0.1 ng/㎏체중, 1 ng/㎏체중, 10 ng/㎏체중, 100 ng/㎏체중, 1 ㎍/㎏체중, 10 ㎍/㎏체중, 100 ㎍/㎏체중, 1 mg/㎏체중, 2 mg/㎏체중, 3 mg/㎏체중, 4 mg/㎏체중, 5 mg/㎏체중, 6 mg/㎏체중, 7 mg/㎏체중, 8 mg/㎏체중, 9 mg/㎏체중, 10 mg/㎏체중, 11 mg/㎏체중, 12 mg/㎏체중, 13 mg/㎏체중, 14 mg/㎏체중, 15 mg/㎏체중, 16 mg/㎏체중, 17 mg/㎏체중, 18 mg/㎏체중, 19 mg/㎏체중, 20 mg/㎏체중, 30 mg/㎏체중, 40 mg/㎏체중, 50 mg/㎏체중, 60 mg/㎏체중, 70 mg/㎏체중, 80 mg/㎏체중, 90 mg/㎏체중, 100 mg/㎏체중, 500 mg/㎏체중 이상이다.
용어 "대상체"는 투여 또는 치료의 표적이 되는 임의의 개체를 지칭한다. 대상체는 척추동물, 예를 들어 포유류일 수 있다. 따라서, 대상체는 인간 또는 수의과 환자일 수 있다. 용어 "환자"는 임상의, 예를 들어, 의사의 치료 하에 있는 대상체를 지칭한다.
개시된 방법의 암은 비조절 성장, 침윤 또는 전이를 겪고 있는 대상체의 임의의 세포일 수 있다. 일부 태양에서, 암은, 현재 방사선요법이 사용되는 임의의 신생물 또는 종양일 수 있다. 대안적으로, 암은 표준 방법을 사용하여 방사선요법에 충분히 민감하지 않은 신생물 또는 종양일 수 있다. 따라서, 암은 육종, 림프종, 백혈병, 암종, 아세포종 또는 생식 세포 종양일 수 있다. 개시된 조성물이 치료에 사용될 수 있는 대표적이나 비제한적인 암의 목록은 림프종, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 균상 식육종, 호지킨병, 골수성 백혈병, 방광암, 뇌암, 신경계 암, 두경부암, 두부 및 경부의 편평세포암종, 신장암, 폐암 (lung cancer), 예를 들어 소세포 폐암 (small cell lung cancer) 및 비소세포 폐암 (non-small cell lung cancer), 신경아세포종/교모세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간암, 흑색종, 구강, 인후, 후두 및 폐의 편평 세포 암종, 결장암, 자궁경부암, 자궁경부암종, 유방암, 상피암, 신장암, 비뇨생식기암, 폐암 (pulmonary cancer), 식도암종, 두부 및 경부 암종, 대장암, 조혈암; 고환암; 결장 및 직장 암, 전립선암 및 췌장암을 포함한다.
본 발명의 다수의 실시 형태가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 다른 실시 형태들은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
실시예
실시예 1: 항-CS-1 TriCLE의 생성 및 그의 특성
물질 및 방법
항-CS1 및 항-EGFRvIII TriCLE의 클로닝. TriCLE를 인실리코로 설계하였으며, 유전자 단편 (인비트로젠)으로서 합성하였다. 유전자 단편을 발현 벡터 (예를 들어, pGEX6p-1 및 pET21d) 내로 클로닝하였다. 서열 번호 1 및 서열 번호 2는 각각 pET21d-TriCLE 및 pGEX6p-1-TriCLE의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
단백질 생성. 30℃에서 하룻밤 동안 100μM IPTG를 첨가하여, 단백질의 발현을 유도하였다. 이어서, 박테리아 세포를 수집하고, Tris pH7.4 및 프로테아제 억제제를 함유하는 용해 완충제에서 초음파 처리하여 용해시켰다. TriCLE 단백질을 HisTRAP 컬럼 (GE Health Science)에서 정제하고, 다시 접고, 원심분리 필터 유닛을 사용하여 PBS/글리세린에 의해 투석하였다. TriCLE의 농도를 측정하고 실험을 위해 희석하였다.
유동 세포계측법. TriCLE의 결합 친화도를 유동 세포계측법을 사용하여 시험하였다. 2 × 10-5의 다발성 골수종 세포주 (예를 들어, MM1.s) 또는 교모세포종 (GBM) 세포주를 사용하여 1차 염색 시약으로서 TriCLE로 염색하고, 이어서 scFv의 존재의 검출을 위해 바이오틴 표지 단백질 L을 사용하고 유동 세포계측법에 의해 PE 접합 항-바이오틴 항체에 의해 검출하였다. 인간 말초 혈액 단핵구 세포 상의 다른 표현형결정에 대해, 이들 항체를 사용하였다: CD56-APC (Beckman Coulter), CD3-APCH7 (BD Bioscience), CD14-FITC (BD Bioscience), CD69-PE (Beckman Coulter).
세포독성 검정. TriCLE에 대한 세포독성 검정을 24시간 및 48시간 동안 수행하였다. 따라서, 유동-기반 세포독성 검정을 사용하였다. 요약하면, NK 세포주 NKL을 다중 골수종 세포주 H929 세포와 20:1의 효과기 대 표적 비로 혼합하였다. TriCLE을 50pg/mL로부터 10ug/mL까지 지시된 용량을 증가시키면서 공동배양물에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다 TriCLE과 함께 또는 그가 없이 NKL을 단독으로 그리고 H929를 단독으로 대조군으로서 사용하여 TriCLE의 독성을 결정하였다. 세포를 수집하고 유동 세포계측법으로 분석하여, 각각의 조건에 대해 생존 세포와 사멸 세포의 백분율을 결정하였다.
서열:
pET21d- 항-CS-1-TriCLE의 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00001
Figure 112017088758390-pct00002
Figure 112017088758390-pct00003
Figure 112017088758390-pct00004
pGEX6p1m-항-CS-1-TriCLE의 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00005
Figure 112017088758390-pct00006
Figure 112017088758390-pct00007
항-NKG2D 중쇄 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00008
항-NKG2D 경쇄 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00009
항-NKG2D 중쇄 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00010
항-NKG2D 경쇄 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00011
ScFv 링커(G4S)3 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00012
ScFv 링커(G4S)3 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00013
HMA의 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00014
HMA의 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00015
3' → 5' CS-1 scFv 중쇄 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00016
3' → 5' CS-1 scFv 경쇄 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00017
3' → 5' CS-1 scFv 중쇄 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00018
3' → 5' CS-1 scFv 경쇄 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00019
히스티딘 태그 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00020
히스티딘 태그 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00021
3' → 5' EGFRvIII scFv 중쇄 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00022
3' → 5' EGFRvIII scFv 경쇄 DNA 서열
Figure 112017088758390-pct00023
3' → 5' EGFRvIII scFv 중쇄 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00024
3' → 5' EGFRvIII scFv 경쇄 단백질 서열
Figure 112017088758390-pct00025
TriCLE
Figure 112017088758390-pct00026
글리신-세린 링커
GGGGS (서열 번호 22)
scFv (G4S)4 링커인 20개의 아미노산 링커 인간 근육 알도스에 의해, 항-NKG2D 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-CS1 항체의 중쇄 및 경쇄를 결합시킴으로써 TriCLE를 인실리코로 설계하였다 (문헌 [Chu et al., Leukemia 28 (2014), 917-27] 및 문헌 [Chu et al. Clin Cancer Res 20 (2014), 3989-4000]). 설계는 도 1에 도시되어 있다. 항-NKG2D scFv의 DNA 및 단백질 서열은 상기에 열거되어 있다 (서열 번호 3 내지 서열 번호 6). 항-NKG2D scFv 및 항-CS1 scFv에서 중쇄와 경쇄를 결합시키기 위해, 글리신과 세린의 반복으로 구성된 링커를 사용하였다 (서열 번호 7 및 8). HMA의 DNA 및 단백질 서열은 서열 번호 9 및 서열 번호 10으로서 열거되어 있다. 항-CS-1 scFv의 DNA 서열 (서열 번호 11 및 서열 번호 12) 및 단백질 서열 (서열 번호 13 및 서열 번호 14)은 3'에서 5' 방향으로 나타냈다. 전체 서열에 이어서 6개의 히스티딘 카피가 존재한다 (서열 번호 15 및 서열 번호 16).
항-CS-1 TriCLE의 생화학적 분석은 그가 56.6kDa의 분자량을 갖고 7.99의 pI를 갖는 것을 보여주었다. 완전한 아미노산 조성이 표 1에 열거되어 있다. 단백질 L에 의해 검출된 바와 같이, 웨스턴 블롯 및 쿠마시 블루 염색 (Commassie Blue staining)을 사용한 표준 SDS-PAGE에 의해, TriCLE의 크기를 확인하였다 (도 2). TriCLE에 대한 흡광 계수는 물에서 102720M-1cm-1이다. 박테리아의 예상 반감기는 10시간 초과이다.
Figure 112017088758390-pct00027
실시예 2: 다발성 골수종 (MM) 세포에 대한 항-CS-1 Tri-CLE 활성화 NK 세포의 세포독성
도 3은 항-CS-1 Tri-CLE의 존재 하에 다중 골수종 (MM) 세포주 H929에 대한 NK 세포주 NKL의 세포독성의 그래프이다. Tri-CLE를 50pg/mL 내지 10ug/mL 범위에서 용량을 증가시키면서, 20:1의 효과기 비의 NKL: H929의 공동배양에 첨가하였다.
실시예 3: 항-CS-1 TriCLE은 다발성 골수종 세포를 효율적으로 염색할 수 있다.
유동 세포계측법을 위한 염색 시약으로서 항-CS-1 TriCLE를 사용한 경우, 다발성 골수종 환자로부터 분리된 전형적인 세포주인 MM1.s의 80%를 염색할 수 있었다 (도 4a). 아이소타입(isotype) 대조군과 비교하는 경우, 평균 형광 강도가 유의하게 증가했다. 이는 CS1 scFv가 기능적이었음을 시사한다 (도 4b).
실시예 4: 항-CS-1 TriCLE은 인간 살해 세포를 활성화시켰고 특이적 세포독성을 촉발하였다.
CD69의 상향조절에 의해 지시된 바와 같이, 5 ㎍/mL의 TriCLE은 PBMC 중의 1차 T, NKT 및 NK 세포를 4시간 후에 활성화시켰다 (도 5a). 이는 항-NKG2D scFv가 고정화되었고 세포 활성화를 촉발하는데 기능적이었음을 시사한다. 항-CD3 항체가 동시에 투여된 경우, CD69의 상향조절을 관찰하였다 (도 5b). MM1.s, H929 및 RPMI-8226과 같은 다발성 골수종 세포주의 공동배양에 TriCLE를 사용한 경우, TriCLE-활성화된 PBMC로부터의 세포독성은 증가되었다 (도 5c). MM1.s에 대한 EC50은 3 × 10-12M이었다. CS1 발현이 낮은 세포주의 경우, H929 세포에 대한 EC50은 1.2 × 10-9 M이었고, RPMI-8226에 대한 EC50은 1.8 × 10-9 M이었다. TricLE은 24시간 및 48시간째에 CD56 결핍 효과기 세포를 사용하여 세포독성을 유도하였다 (도 5d).
실시예 5: 항-EGFRvIII TriCLE은 인간 살해 세포를 활성화시켰고 특이적 세포독성을 촉발하였다.
도 1a는 항-EGFLvIII Tri-CLE의 그래픽 표시를 도시한다. EGFRvIII scFv의 중쇄 및 경쇄에 대한 DNA 및 단백질 서열은 서열 번호 17 내지 서열 번호 20으로 나타나 있다. 도 6a는 항-EGFRvIII TriCLE에 의한 T, NKT 및 NK 세포의 활성화를 도시한다. 5 ㎍/mL의 TriCLE를 4시간 동안 휴지기 인간 PBMC에 첨가한 후, 세포를 수집하고, CD3, CD56, CD14 및 CD69를 실온에서 20분 동안 염색하였다. 세포를 유동 세포계측법으로 분석하였다. 도 6b는 활성화된 인간 PBMC의 세포독성이 3개의 다발성 골수종 세포 GBM1123에 대한 항-EGFRvIII TriCLE에 의해 강화되었음을 도시한다. EC50은 비선형 회귀 곡선으로부터 계산되었다. 결과는 3명의 독립적인 공여자에 의한 것이었다. ***는 p<0.001이고; **는 p<0.01이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 개시된 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 인용된 공보 및 이들이 인용된 자료는 참고로 구체적으로 포함된다.
당업자는 일상적인 실험만을 사용하여, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시 형태에 대한 다수의 균등물을 인식할 것이고, 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포괄되려는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Ohio State Innovation Foundation <120> BIVALENT ANTIBODY DIRECTED AGAINST NKG2D and TUMOR ASSOCIATED ANTIGENS <130> 10336-214WO1 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6898 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60 ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120 tgttagcagc cggatctcag cggccgcgtg gtgatgatgg tgatggctct gtacctgcag 180 ctgctgcgga cccgcctcaa gaacgcgcgg gccggctgat accttcaggg aacatttggc 240 cgaaccatag ctgaaggtgg tgtaccacat gttccacact ttctggcggg ggccctggcc 300 cagttcccag atgcccatga tatgtgggct atcgctttcg gtgcgcagat tctgtttaaa 360 tttgtctttc gcagtcagag tcacgtcttt tgaagaggag gtggcataca tttgcagaga 420 ggaaggggtc gactcatcgc tggccacgta atagcacgcc cgcgatgtca taatcgcggt 480 ccgtgccata tcgtaccatc cttggcccgt cgacaccgtc acggagcccc ctcccccgct 540 gcccccaccg ccactaccac cgccgccaga gtcaatcacc atggtttggg actgcttgct 600 catggaggtg ctaactccgt cgcgaactga aattgtacat ttggcagact ggtccacgat 660 cgttcccacc gcccagtact gctgtttcgg accctgagaa ggtttcagaa ggatatagct 720 tgcactatac cggtacgtac ctaccggatc acggaacgta ccgctgcctg atcctgtatc 780 aaaggtaaag gtaatagagt tcacctgcgc ttcgtcaagc gccacgtaat agcactgctg 840 gtgatagctc gtagggaggg taaatcccgc acccgtcttg agttccagtt tgtaggcgtg 900 atttgacaca aacagggact ccgatgccgc cgcgcccgcc tggccgctcg gcagcacggt 960 cagtttagta ccgccgccaa aaactgggcc atttaagcta tcatcccatg cggcgcaata 1020 ataatcagct tcatcctcgc tctggagacc cgaaatagcc agaaaagccg aggtacccga 1080 tttactgccg gaaaagcggt cactaactcc acttggcagc aaatcatcat agtaaatcag 1140 cagtttcggc gcttttcccg gcagttgctg ataccagttc actgcgttgt taccgatgtt 1200 ggagctgctc ccactacagc tgatcgtgat cgactgaccc ggggaacccg acaccgacgc 1260 cggctgcgta agcgctgact gactgccacc tccgccgctg ccaccgccac cagagccgcc 1320 cccacctgaa ctaacggtaa cggtggtgcc ctgaccccag taatcgaagt acgtaccatc 1380 acccaggcca cgatctttag cgcaatagta aacggcggta tcttcggcgc gcaggctatt 1440 catttgcagg tacagggtat ttttgctatt gtcgcggcta atagtgaagc gtccttttac 1500 tgagtcggca taatatttgt tagacccatc gtagcggatg aacgcaaccc actccagacc 1560 tttgccaggc gcctgacgca cccaatgcat accataagag ctgaaggtaa aacccgacgc 1620 ggcacagctc agacgcaaag agccgcccgg cttgaccaga ccgccaccgg attcaaccag 1680 ctgcacttgc atgaattcta tatctccttc ttaaagttaa acaaaattat ttctagaggg 1740 gaattgttat ccgctcacaa ttcccctata gtgagtcgta ttaatttcgc gggatcgaga 1800 tctcgatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 1860 ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 1920 tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg 1980 ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac 2040 tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagatccc ggacaccatc 2100 gaatggcgca aaacctttcg cggtatggca tgatagcgcc cggaagagag tcaattcagg 2160 gtggtgaatg tgaaaccagt aacgttatac gatgtcgcag agtatgccgg tgtctcttat 2220 cagaccgttt cccgcgtggt gaaccaggcc agccacgttt ctgcgaaaac gcgggaaaaa 2280 gtggaagcgg cgatggcgga gctgaattac attcccaacc gcgtggcaca acaactggcg 2340 ggcaaacagt cgttgctgat tggcgttgcc acctccagtc tggccctgca cgcgccgtcg 2400 caaattgtcg cggcgattaa atctcgcgcc gatcaactgg gtgccagcgt ggtggtgtcg 2460 atggtagaac gaagcggcgt cgaagcctgt aaagcggcgg tgcacaatct tctcgcgcaa 2520 cgcgtcagtg ggctgatcat taactatccg ctggatgacc aggatgccat tgctgtggaa 2580 gctgcctgca ctaatgttcc ggcgttattt cttgatgtct ctgaccagac acccatcaac 2640 agtattattt tctcccatga agacggtacg cgactgggcg tggagcatct ggtcgcattg 2700 ggtcaccagc aaatcgcgct gttagcgggc ccattaagtt ctgtctcggc gcgtctgcgt 2760 ctggctggct ggcataaata tctcactcgc aatcaaattc agccgatagc ggaacgggaa 2820 ggcgactgga gtgccatgtc cggttttcaa caaaccatgc aaatgctgaa tgagggcatc 2880 gttcccactg cgatgctggt tgccaacgat cagatggcgc tgggcgcaat gcgcgccatt 2940 accgagtccg ggctgcgcgt tggtgcggat atctcggtag tgggatacga cgataccgaa 3000 gacagctcat gttatatccc gccgttaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg 3060 caaaccagcg tggaccgctt gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag 3120 ctgttgcccg tctcactggt gaaaagaaaa accaccctgg cgcccaatac gcaaaccgcc 3180 tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa 3240 agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt aagttagctc actcattagg caccgggatc 3300 tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat 3360 gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc 3420 ggcagcgctc tgggtcattt tcggcgagga ccgctttcgc tggagcgcga cgatgatcgg 3480 cctgtcgctt gcggtattcg gaatcttgca cgccctcgct caagccttcg tcactggtcc 3540 cgccaccaaa cgtttcggcg agaagcaggc cattatcgcc ggcatggcgg ccccacgggt 3600 gcgcatgatc gtgctcctgt cgttgaggac ccggctaggc tggcggggtt gccttactgg 3660 ttagcagaat gaatcaccga tacgcgagcg aacgtgaagc gactgctgct gcaaaacgtc 3720 tgcgacctga gcaacaacat gaatggtctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac 3780 gcggaagtca gcgccctgca ccattatgtt ccggatctgc atcgcaggat gctgctggct 3840 accctgtgga acacctacat ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt 3900 tctctggtcc cgccgcatcc ataccgccag ttgtttaccc tcacaacgtt ccagtaaccg 3960 ggcatgttca tcatcagtaa cccgtatcgt gagcatcctc tctcgtttca tcggtatcat 4020 tacccccatg aacagaaatc ccccttacac ggaggcatca gtgaccaaac aggaaaaaac 4080 cgcccttaac atggcccgct ttatcagaag ccagacatta acgcttctgg agaaactcaa 4140 cgagctggac gcggatgaac aggcagacat ctgtgaatcg cttcacgacc acgctgatga 4200 gctttaccgc agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 4260 gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 4320 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga 4380 tagcggagtg tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 4440 catatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct 4500 cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 4560 cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 4620 acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 4680 ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 4740 ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 4800 gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 4860 gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 4920 ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 4980 actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 5040 gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 5100 ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 5160 ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 5220 gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 5280 tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 5340 tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 5400 aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 5460 aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 5520 tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 5580 gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 5640 agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 5700 aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag 5760 gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat 5820 caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc 5880 cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc 5940 ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa 6000 ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac 6060 gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt 6120 cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc 6180 gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa 6240 caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca 6300 tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat 6360 acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa 6420 aagtgccacc tgaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt 6480 aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 6540 aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 6600 acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 6660 aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc 6720 ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 6780 aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 6840 gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca ggcgcgtccc attcgcca 6898 <210> 2 <211> 5828 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 acgttatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg 60 gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt 120 tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc 180 tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 240 cacaggaaac agtattcgga tccccggaat tcatgcaagt gcagctggtt gaatccggtg 300 gcggtctggt caagccgggc ggctctttgc gtctgagctg tgccgcgtcg ggttttacct 360 tcagctctta tggtatgcat tgggtgcgtc aggcgcctgg caaaggtctg gagtgggttg 420 cgttcatccg ctacgatggg tctaacaaat attatgccga ctcagtaaaa ggacgcttca 480 ctattagccg cgacaatagc aaaaataccc tgtacctgca aatgaatagc ctgcgcgccg 540 aagataccgc cgtttactat tgcgctaaag atcgtggcct gggtgatggt acgtacttcg 600 attactgggg tcagggcacc accgttaccg ttagttcagg tgggggcggc tctggtggcg 660 gtggcagcgg cggaggtggc agtcagtcag cgcttacgca gccggcgtcg gtgtcgggtt 720 ccccgggtca gtcgatcacg atcagctgta gtgggagcag ctccaacatc ggtaacaacg 780 cagtgaactg gtatcagcaa ctgccgggaa aagcgccgaa actgctgatt tactatgatg 840 atttgctgcc aagtggagtt agtgaccgct tttccggcag taaatcgggt acctcggctt 900 ttctggctat ttcgggtctc cagagcgagg atgaagctga ttattattgc gccgcatggg 960 atgatagctt aaatggccca gtttttggcg gcggtactaa actgaccgtg ctgccgagcg 1020 gccaggcggg cgcggcggca tcggagtccc tgtttgtgtc aaatcacgcc tacaaactgg 1080 aactcaagac gggtgcggga tttaccctcc ctacgagcta tcaccagcag tgctattacg 1140 tggcgcttga cgaagcgcag gtgaactcta ttacctttac ctttgataca ggatcaggca 1200 gcggtacgtt ccgtgatccg gtaggtacgt accggtatag tgcaagctat atccttctga 1260 aaccttctca gggtccgaaa cagcagtact gggcggtggg aacgatcgtg gaccagtctg 1320 ccaaatgtac aatttcagtt cgcgacggag ttagcacctc catgagcaag cagtcccaaa 1380 ccatggtgat tgactctggc ggcggtggta gtggcggtgg gggcagcggg ggagggggct 1440 ccgtgacggt gtcgacgggc caaggatggt acgatatggc acggaccgcg attatgacat 1500 cgcgggcgtg ctattacgtg gccagcgatg agtcgacccc ttcctctctg caaatgtatg 1560 ccacctcctc ttcaaaagac gtgactctga ctgcgaaaga caaatttaaa cagaatctgc 1620 gcaccgaaag cgatagccca catatcatgg gcatctggga actgggccag ggcccccgcc 1680 agaaagtgtg gaacatgtgg tacaccacct tcagctatgg ttcggccaaa tgttccctga 1740 aggtatcagc cggcccgcgc gttcttgagg cgggtccgca gcagctgcag gtacagagcc 1800 atcaccatca tcaccacgcg gccgcatcgt gactgactga cgatctgcct cgcgcgtttc 1860 ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 1920 taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 1980 cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtataattc ttgaagacga 2040 aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 2100 acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 2160 atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2220 tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 2280 gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 2340 gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 2400 gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 2460 ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 2520 tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 2580 acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 2640 cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 2700 catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 2760 cgtgacacca cgatgcctgc agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 2820 ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 2880 ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 2940 ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 3000 atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 3060 gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 3120 atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 3180 tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 3240 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 3300 ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 3360 actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta 3420 gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3480 ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3540 gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 3600 acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 3660 tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 3720 gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 3780 cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 3840 cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 3900 ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 3960 gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 4020 agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt 4080 tcacaccgca taaattccga caccatcgaa tggtgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga 4140 tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat 4200 gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc 4260 cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct gaattacatt 4320 cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc 4380 tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat 4440 caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa 4500 gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg 4560 gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc gttatttctt 4620 gatgtctctg accagacacc catcaacagt attattttct cccatgaaga cggtacgcga 4680 ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca 4740 ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct cactcgcaat 4800 caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa 4860 accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc caacgatcag 4920 atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc 4980 tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc gtcaaccacc 5040 atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct gcaactctct 5100 cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc 5160 accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 5220 ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 5280 ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 5340 tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacggatt 5400 cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc 5460 gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 5520 gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggcg ctttgcctgg tttccggcac 5580 cagaagcggt gccggaaagc tggctggagt gcgatcttcc tgaggccgat actgtcgtcg 5640 tcccctcaaa ctggcagatg cacggttacg atgcgcccat ctacaccaac gtaacctatc 5700 ccattacggt caatccgccg tttgttccca cggagaatcc gacgggttgt tactcgctca 5760 catttaatgt tgatgaaagc tggctacagg aaggccagac gcgaattatt tttgatggcg 5820 ttggaatt 5828 <210> 3 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 caagtgcagc tggttgaatc cggtggcggt ctggtcaagc cgggcggctc tttgcgtctg 60 agctgtgccg cgtcgggttt taccttcagc tcttatggta tgcattgggt gcgtcaggcg 120 cctggcaaag gtctggagtg ggttgcgttc atccgctacg atgggtctaa caaatattat 180 gccgactcag taaaaggacg cttcactatt agccgcgaca atagcaaaaa taccctgtac 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgccgaagat accgccgttt actattgcgc taaagatcgt 300 ggcctgggtg atggtacgta cttcgattac tggggtcagg gcaccaccgt taccgttagt 360 tca 363 <210> 4 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 cagtcagcgc ttacgcagcc ggcgtcggtg tcgggttccc cgggtcagtc gatcacgatc 60 agctgtagtg ggagcagctc caacatcggt aacaacgcag tgaactggta tcagcaactg 120 ccgggaaaag cgccgaaact gctgatttac tatgatgatt tgctgccaag tggagttagt 180 gaccgctttt ccggcagtaa atcgggtacc tcggcttttc tggctatttc gggtctccag 240 agcgaggatg aagctgatta ttattgcgcc gcatgggatg atagcttaaa tggcccagtt 300 tttggcggcg gtactaaact gaccgtgctg 330 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 ggtgggggcg gctctggtgg cggtggcagc ggcggaggtg gcagt 45 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 ccgagcggcc aggcgggcgc ggcggcatcg gagtccctgt ttgtgtcaaa tcacgcctac 60 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Pro Ser Gly Gln Ala Gly Ala Ala Ala Ser Glu Ser Leu Phe Val Ser 1 5 10 15 Asn His Ala Tyr 20 <210> 11 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 agcgttaccg tgagtacagg ccagggctgg tatgacatgg cacgtacagc catcatgacc 60 tcgcgcgcat gttactacgt cgcgtcagat gaatcgacgc cttcctcgct gcaaatgtat 120 gcaacctcca gcagcaaaga tgttaccctg accgcaaagg acaagtttaa acagaatttg 180 cgtacggaga gtgactcccc gcacatcatg ggaatctggg agttgggtca ggggcctcgt 240 cagaaggtat ggaacatgtg gtatacaact ttttcgtacg gctcagcaaa atgcagcttg 300 aaagtgtcgg caggtccgcg cgtgctggag gccggtccgc agcagctgca agtccagtct 360 <210> 12 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 aaacttgagt tgaagaccgg tgccggcttc accttaccga ccagttatca tcaacaatgc 60 tattacgtgg ccctggacga agcacaggtg aattcaatta cgtttacgtt tgataccggc 120 tctggcagcg gtacatttcg tgatcccgtg ggcacttacc gctattcggc gagttatatc 180 ttgctgaaac cttcccaagg tccgaaacag cagtactggg cggttggcac cattgtagac 240 caatcagcca aatgtacaat ctcggttcgc gatggtgtca gtacgtcgat gtctaagcag 300 tcacagacaa tggttatcga t 321 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Ser Val Thr Val Ser Thr Gly Gln Gly Trp Tyr Asp Met Ala Arg Thr 1 5 10 15 Ala Ile Met Thr Ser Arg Ala Cys Tyr Tyr Val Ala Ser Asp Glu Ser 20 25 30 Thr Pro Ser Ser Leu Gln Met Tyr Ala Thr Ser Ser Ser Lys Asp Val 35 40 45 Thr Leu Thr Ala Lys Asp Lys Phe Lys Gln Asn Leu Arg Thr Glu Ser 50 55 60 Asp Ser Pro His Ile Met Gly Ile Trp Glu Leu Gly Gln Gly Pro Arg 65 70 75 80 Gln Lys Val Trp Asn Met Trp Tyr Thr Thr Phe Ser Tyr Gly Ser Ala 85 90 95 Lys Cys Ser Leu Lys Val Ser Ala Gly Pro Arg Val Leu Glu Ala Gly 100 105 110 Pro Gln Gln Leu Gln Val Gln Ser 115 120 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Lys Leu Glu Leu Lys Thr Gly Ala Gly Phe Thr Leu Pro Thr Ser Tyr 1 5 10 15 His Gln Gln Cys Tyr Tyr Val Ala Leu Asp Glu Ala Gln Val Asn Ser 20 25 30 Ile Thr Phe Thr Phe Asp Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Arg Asp 35 40 45 Pro Val Gly Thr Tyr Arg Tyr Ser Ala Ser Tyr Ile Leu Leu Lys Pro 50 55 60 Ser Gln Gly Pro Lys Gln Gln Tyr Trp Ala Val Gly Thr Ile Val Asp 65 70 75 80 Gln Ser Ala Lys Cys Thr Ile Ser Val Arg Asp Gly Val Ser Thr Ser 85 90 95 Met Ser Lys Gln Ser Gln Thr Met Val Ile Asp 100 105 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 catcaccatc atcaccac 18 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 His His His His His His 1 5 <210> 17 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 agtagcgtga ctgttctgac gggacagggt tggtatgagt cttggggttc ctccggcgcg 60 tgttactatg ttgcgaccga tgaagcgcgc ttgagcaata tgcaactgta ccttactaac 120 aagagtaatg accgttccat cacgtttcgg ggcaaagtta gcgacgcata taatacctca 180 ggtggcagcg ggtctatcgc aagcgtctgg gagctcggta aaggccccgc acaacgtgtg 240 tggagtatgg cttacagtag ctttactttc ggatctgctg catgctccct gcgcctgtcc 300 ggagggccac aggttctggg tggtggcagt gaactggtcc aggtggag 348 <210> 18 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 tcaaatcacg cctacaaaat tgaagtgaaa acggggggcg gtagtacgtt gccgtattcc 60 caccatcagc tgtgttatta tacagcattc gacgagcctc aattatcatc tgttatcctg 120 accttcgaaa ccggatctgg ctctgggacg ttccggtctc cggtgggctc ccagctgaac 180 tcagccgcgt atattctgcg caaaccagcg aaagggccga aacaacagta ctgggccctg 240 aacaatcgca ttggacagtc ggcccgttgc acgatcaccg tccgggacgg agtcagtgcg 300 agcctgagtt ccccgtcgca gaccatgcag attgat 336 <210> 19 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Ser Ser Val Thr Val Leu Thr Gly Gln Gly Trp Tyr Glu Ser Trp Gly 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Cys Tyr Tyr Val Ala Thr Asp Glu Ala Arg Leu Ser 20 25 30 Asn Met Gln Leu Tyr Leu Thr Asn Lys Ser Asn Asp Arg Ser Ile Thr 35 40 45 Phe Arg Gly Lys Val Ser Asp Ala Tyr Asn Thr Ser Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Ala Ser Val Trp Glu Leu Gly Lys Gly Pro Ala Gln Arg Val 65 70 75 80 Trp Ser Met Ala Tyr Ser Ser Phe Thr Phe Gly Ser Ala Ala Cys Ser 85 90 95 Leu Arg Leu Ser Gly Gly Pro Gln Val Leu Gly Gly Gly Ser Glu Leu 100 105 110 Val Gln Val Glu 115 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Ser Asn His Ala Tyr Lys Ile Glu Val Lys Thr Gly Gly Gly Ser Thr 1 5 10 15 Leu Pro Tyr Ser His His Gln Leu Cys Tyr Tyr Thr Ala Phe Asp Glu 20 25 30 Pro Gln Leu Ser Ser Val Ile Leu Thr Phe Glu Thr Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Phe Arg Ser Pro Val Gly Ser Gln Leu Asn Ser Ala Ala Tyr 50 55 60 Ile Leu Arg Lys Pro Ala Lys Gly Pro Lys Gln Gln Tyr Trp Ala Leu 65 70 75 80 Asn Asn Arg Ile Gly Gln Ser Ala Arg Cys Thr Ile Thr Val Arg Asp 85 90 95 Gly Val Ser Ala Ser Leu Ser Ser Pro Ser Gln Thr Met Gln Ile Asp 100 105 110 <210> 21 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 gtggtgatga tggtgatggc tctgtacctg cagctgctgc ggacccgcct caagaacgcg 60 cgggccggct gataccttca gggaacattt ggccgaacca tagctgaagg tggtgtacca 120 catgttccac actttctggc gggggccctg gcccagttcc cagatgccca tgatatgtgg 180 gctatcgctt tcggtgcgca gattctgttt aaatttgtct ttcgcagtca gagtcacgtc 240 ttttgaagag gaggtggcat acatttgcag agaggaaggg gtcgactcat cgctggccac 300 gtaatagcac gcccgcgatg tcataatcgc ggtccgtgcc atatcgtacc atccttggcc 360 cgtcgacacc gtcacggagc cccctccccc gctgccccca ccgccactac caccgccgcc 420 agagtcaatc accatggttt gggactgctt gctcatggag gtgctaactc cgtcgcgaac 480 tgaaattgta catttggcag actggtccac gatcgttccc accgcccagt actgctgttt 540 cggaccctga gaaggtttca gaaggatata gcttgcacta taccggtacg tacctaccgg 600 atcacggaac gtaccgctgc ctgatcctgt atcaaaggta aaggtaatag agttcacctg 660 cgcttcgtca agcgccacgt aatagcactg ctggtgatag ctcgtaggga gggtaaatcc 720 cgcacccgtc ttgagttcca gtttgtaggc gtgatttgac acaaacaggg actccgatgc 780 cgccgcgccc gcctggccgc tcggcagcac ggtcagttta gtaccgccgc caaaaactgg 840 gccatttaag ctatcatccc atgcggcgca ataataatca gcttcatcct cgctctggag 900 acccgaaata gccagaaaag ccgaggtacc cgatttactg ccggaaaagc ggtcactaac 960 tccacttggc agcaaatcat catagtaaat cagcagtttc ggcgcttttc ccggcagttg 1020 ctgataccag ttcactgcgt tgttaccgat gttggagctg ctcccactac agctgatcgt 1080 gatcgactga cccggggaac ccgacaccga cgccggctgc gtaagcgctg actgactgcc 1140 acctccgccg ctgccaccgc caccagagcc gcccccacct gaactaacgg taacggtggt 1200 gccctgaccc cagtaatcga agtacgtacc atcacccagg ccacgatctt tagcgcaata 1260 gtaaacggcg gtatcttcgg cgcgcaggct attcatttgc aggtacaggg tatttttgct 1320 attgtcgcgg ctaatagtga agcgtccttt tactgagtcg gcataatatt tgttagaccc 1380 atcgtagcgg atgaacgcaa cccactccag acctttgcca ggcgcctgac gcacccaatg 1440 cataccataa gagctgaagg taaaacccga cgcggcacag ctcagacgca aagagccgcc 1500 cggcttgacc agaccgccac cggattcaac cagctgcact tgcat 1545 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

Claims (30)

  1. 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함하는 NKG2D 결합 부위, 및
    서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함하는 CS-1 결합 부위
    를 포함하는, NKG2D 수용체 및 종양 연관 항원 (TAA) 둘 모두와 결합하는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, NKG2D 결합 부위는 단일 사슬 가변 단편인, 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, CS-1 결합 부위는 단일 사슬 가변 단편인, 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비면역원성 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 비면역원성 링커는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 하기 식을 포함하는 폴리펩티드:
    VLN ― VHN -- VLT ― VHT,
    VHN ― VLN -- VHT ― VLT,
    VLN ― VHN -- VHT ― VLT, 또는
    VHN ― VLN -- VLT ― VHT,
    여기서 "VHT"는 CS-1에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLT"는 CS-1에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLN"은 NKG2D에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VHN"은 NKG2D에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이며;
    여기서 "-"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어지고;
    여기서 "--"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어짐.
  7. 이중특이적 항체로서,
    제6항의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 VLN 및 VHN은 이량체화되어 NKG2D에 대한 항원 결합 부위를 형성하며, VHT 및 VLT는 이량체화되어 CS-1에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 이중특이적 항체.
  8. 이중특이적 항체로서,
    NKG2D 수용체에 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 CS-1에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하고;
    제1 항원 결합 영역은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
    CS-1에 결합하는 제2 항원 결합 영역은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  9. 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 제8항의 이중특이적 항체를 포함하는, 대상체에서의 암의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  10. 제1항, 제2항, 제3항 및 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 이종성 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  13. 폴리펩티드로서,
    NKG2D 수용체 및 종양 연관 항원 (TAA) 둘 모두와 결합하고,
    NKG2D와 결합하는 항체 또는 그의 단편 ("NKG2D 항체"); 및
    TAA와 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함하고,
    NKG2D 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함하며,
    TAA는 CS-1이며, CS-1 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는,
    폴리펩티드.
  14. 제13항에 있어서, 하기 식을 포함하는 폴리펩티드:
    VLN ― VHN -- VLT ― VHT,
    VHN ― VLN -- VHT ― VLT,
    VLN ― VHN -- VHT ― VLT, 또는
    VHN ― VLN -- VLT ― VHT,
    여기서 "VHT"는 CS-1에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLT"는 CS-1에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLN"은 NKG2D에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VHN"은 NKG2D에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이며;
    여기서 "-"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어지고;
    여기서 "--"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어짐.
  15. 이중특이적 항체로서,
    제14항의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 VLN 및 VHN은 이량체화되어 NKG2D에 대한 항원 결합 부위를 형성하며, VHT 및 VLT는 이량체화되어 CS-1에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 이중특이적 항체.
  16. 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함하는 NKG2D 결합 부위, 및
    서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함하는 EGFRvIII 결합 부위
    를 포함하는, NKG2D 수용체, 및 종양 연관 항원 (TAA) 둘 모두와 결합하는 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, NKG2D 결합 부위는 단일 사슬 가변 단편인, 폴리펩티드.
  18. 제16항에 있어서, EGFRvIII 결합 부위는 단일 사슬 가변 단편인, 폴리펩티드.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 비면역원성 링커를 추가로 포함하는, 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 비면역원성 링커는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  21. 제16항에 있어서, 하기 식을 포함하는 폴리펩티드:
    VLN ― VHN -- VLT ― VHT,
    VHN ― VLN -- VHT ― VLT,
    VLN ― VHN -- VHT ― VLT, 또는
    VHN ― VLN -- VLT ― VHT,
    여기서 "VHT"는 EGFRvIII에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLT"는 EGFRvIII에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLN"은 NKG2D에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VHN"은 NKG2D에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이며;
    여기서 "-"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어지고;
    여기서 "--"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어짐.
  22. 이중특이적 항체로서,
    제21항의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 VLN 및 VHN은 이량체화되어 NKG2D에 대한 항원 결합 부위를 형성하며, VHT 및 VLT는 이량체화되어 EGFRvIII에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 이중특이적 항체.
  23. 이중특이적 항체로서,
    NKG2D 수용체에 결합하는 제1 항원 결합 영역, 및 EGFRvIII에 결합하는 제2 항원 결합 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하고;
    제1 항원 결합 영역은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하고;
    EGFRvIII에 결합하는 제2 항원 결합 영역은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는, 이중특이적 항체.
  24. 약제학적으로 허용가능한 담체 중에 제23항의 이중특이적 항체를 포함하는, 대상체에서의 암의 치료에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  25. 제16항, 제17항, 제18항 및 제21항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  26. 이종성 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제25항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  27. 제26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 폴리펩티드로서,
    NKG2D 수용체 및 종양 연관 항원 (TAA) 둘 모두와 결합하고,
    NKG2D와 결합하는 항체 또는 그의 단편 ("NKG2D 항체"); 및
    TAA와 결합하는 항체 또는 그의 단편을 포함하고,
    NKG2D 항체는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 도메인 및 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 도메인을 포함하며,
    TAA는 EGFRvIII이며, EGFRvIII 항체 또는 그의 단편은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는,
    폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 하기 식을 포함하는 폴리펩티드:
    VLN ― VHN -- VLT ― VHT,
    VHN ― VLN -- VHT ― VLT,
    VLN ― VHN -- VHT ― VLT, 또는
    VHN ― VLN -- VLT ― VHT,
    여기서 "VHT"는 EGFRvIII에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLT"는 EGFRvIII에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VLN"은 NKG2D에 대해 특이적인 경쇄 가변 도메인이고;
    여기서 "VHN"은 NKG2D에 대해 특이적인 중쇄 가변 도메인이며;
    여기서 "-"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어지고;
    여기서 "--"는 펩티드 링커 또는 펩티드 결합으로 이루어짐.
  30. 이중특이적 항체로서,
    제29항의 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 VLN 및 VHN은 이량체화되어 NKG2D에 대한 항원 결합 부위를 형성하며, VHT 및 VLT는 이량체화되어 EGFRvIII에 대한 항원 결합 부위를 형성하는, 이중특이적 항체.
KR1020177025740A 2015-02-20 2016-02-22 Nkg2d 및 종양 연관 항원에 대해 유도된 이가 항체 KR102606190B1 (ko)

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