CN103857700A - 串联fc双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本文中提供了串联Fc和串联Fc抗体(“TFcA”)，例如串联Fc双特异性抗体(“TFcBA”)，其包含一个或至少两个特异性结合一个或多个细胞表面受体的结合位点。所述结合位点经由TFc连接，所述TFc包含第一Fc区和第二Fc区，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区经由TFc接头连接以形成连续多肽并且二聚以形成Fc二聚体。示例性TFcBA抑制经由TFcBA结合位点特异性细胞表面受体进行的信号转导。

Description

串联FC双特异性抗体
相关申请
本申请要求2011年8月26日提交的美国临时申请号61/527,802的优先权。在允许的情况下，上述申请出于任何及所有目的以全文引用的方式并入。
背景
已确定肿瘤细胞表达能刺激细胞增殖的生长因子和细胞因子的受体，且此外，针对这些受体的抗体可。有效阻断由生长因子和细胞因子介导的细胞增殖刺激以抑制肿瘤细胞生长。靶向癌细胞上的受体的市售治疗性抗体包括例如用于治疗乳腺癌的曲妥珠单抗(trastuzumab)，其靶向HER2受体(也称为ErbB2)；及用于治疗结肠直肠癌和头颈癌的西妥昔单抗(cetuximab)
Figure BDA0000489467110000012
，其靶向表皮生长因子受体(EGFR，也称为HER1或ErbB1)。
尽管这种施用仅包含单一治疗性单克隆抗体的治疗剂的方法(当在不施用另一种治疗性抗体的情况下施用时，在本文中称为单疗法)已经显示出在癌症治疗方面相当成功，但存在许多可能导致这种治疗失败或在初步抑制后发生肿瘤生长复发的因素。举例来说，某些肿瘤依赖于多于一种生长因子介导的细胞增殖信号转导途径，且因而靶向单一途径可能被证实不足以显著影响肿瘤细胞生长。换句话说，即使在一种途径为唯一或主要生长刺激途径的情况下，某些肿瘤细胞也能够在原始途径被抗体阻断时激活另一种信号传导途径以进行生长刺激(先天性治疗抗性)。更进一步，一些肿瘤对抗体单疗法展现出初步反应，但稍后通过切换到使用另一种信号传导途径而发展出治疗抗性(获得型治疗抗性)。
因此，需要用于癌症治疗的其它治疗方法以克服抗体单疗法的限制并且提供其它益处。
概述
本文中提供了经过工程改造的抗体，如串联Fc抗体(“TFcA”)。示例性TFcA为串联Fc双特异性抗体(TFcBA)。TFcBA包含串联Fc，所述串联Fc为包含第一Fc区和第二Fc区的多肽部分，所述第一Fc区和第二Fc区各自具有C末端和N末端；所述第一Fc区和所述第二Fc区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接为单一多肽链(即，所述第一Fc区的C末端被肽键连接至所述TFc接头的N末端，所述TFc接头的C末端又被肽键连接至所述第二Fc区的N末端)。TFcBA可以包含至少两个结合位点(至少一个第一结合位点和一个第二结合位点)。这些结合位点各自特异性结合到细胞表面受体的特定部分。示例性细胞表面受体为由癌细胞表达或过度表达的细胞表面受体。示例性结合位点包括能免疫特异性结合到细胞表面受体的细胞外域的来源于抗体的结合位点。TFcA或TFcBA的第一或第二结合位点可以特异性结合从由以下各项组成的群组中选出的人类受体蛋白：ErbB2、ErbB3(例如US7,846,440中所描述的结合位点)、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、c-Met、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM以及EphA2。通常，这种结合将对受体蛋白的细胞外部分具有特异性。在本文中所公开的某些实施方案中，TFcBA所包含的至少两个结合位点之一是c-Met特异性结合位点，例如抗c-Met Fab或抗cMet scFv。在某些例示的实施方案中，提供了一种TFcBA，其包含单一抗c-Met结合位点和至少一个不结合c-Met的第二结合位点，例如ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM以及EphA2特异性结合位点，其中所述抗c-Met结合位点与所述第二结合位点经由TFc连接以形成连续多肽。提供了TFcBA，所述TFcBA结合单一受体上的两个表位(例如细胞外表位)或两种不同的细胞表面受体，并且在所述结合后强烈抑制由TFcBA所结合的至少一个细胞表面受体的同源配体在正常情况下刺激的信号转导。举例来说，抗c-Met+抗EGFRTFcBA可以抑制由肝细胞生长因子(HGF，C-met的同源配体)和表皮生长因子(EGF，EGFR的同源配体)中的任一者或两者诱导的信号转导，或抗c-Kit+抗RON TFcBA可以抑制由巨噬细胞刺激蛋白(RON的同源配体)和干细胞因子(c-Kit的同源配体)中的任一者或两者诱导的信号转导，或抗c-Met+抗EPCAMTFcBA可以抑制由HGF诱导的信号转导；如对配体诱导的受体磷酸化(即，受TFcBA抑制的信号转导)的抑制所指示，各所述抑制的IC50等于或小于10nM，或者等于或小于1nM，或者等于或小于100pM，或其最大抑制百分比为至少70%或至少80%或至少90%。在某些实施方案中，TFcBA在细胞中的表达产生(i)更多(即，更大百分比的)正确形成的TFcAB分子，相对于结合相同受体但不包含TFc的多价抗体的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcAB分子，如通过例如尺寸排除色谱法(SEC)所确定。
本文中还提供了Ab，所述Ab为TFcBA，其中所述TFcBA包含第一结合位点和第二结合位点，其中所述第一结合位点结合第一标靶且所述第二结合位点结合第二标靶，并且其中(i)所述第一结合位点和所述第二结合位点经由TFc连接；(ii)所述TFc包含第一Fc区和第二Fc区，所述第一Fc区和第二Fc区各自具有C末端和N末端；(iii)所述第一Fc区和所述第二Fc区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接，以形成连续多肽；(iv)所述第一Fc区与所述第二Fc区缔合(结合)以形成Fc二聚体；并且(v)所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者包含一个或多个氨基酸(aa)修饰以增强或稳定所述第一Fc区与所述第二Fc区之间的结合。所述TFcBA可以抑制经由所述第一标靶和所述第二标靶中的任一者或两者进行的信号转导。在某些实施方案中，TFcBA在宿主细胞中在表达产生(i)更多正确形成的TFcAB分子，相对于在结合(多个)相同受体但不包含TFc的多价抗体的匹配宿主细胞中的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcBA分子，如通过例如SEC所确定。
本文中还提供了单价串联FC抗体(TFcA)。单价TFcA可以包含结合一个标靶的单一结合位点，其中所述结合位点连接至包含第一Fc区和第二Fc区的TFc，所述第一Fc区和第二Fc区各自各自具有C末端和N末端；且其中(i)所述第一Fc区和所述第二Fc区经由具有C末端和N末端的TFc接头而连接，以形成连续多肽；(ii)所述第一Fc区和所述第二Fc区缔合以形成Fc二聚体；并且(iii)所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰以增强或稳定所述第一Fc区与所述第二Fc区之间的结合。所述单价TFcA可以抑制经由所述标靶进行的信号转导。在某些实施方案中，单价TFcA在宿主细胞中的表达产生(i)更多正确形成的TFcA分子，相对于在不包含TFc的抗体的匹配宿主细胞中的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcA分子，如通过例如SEC所确定。
TFcA(如TFcBA)所包含的TFc的第一Fc区和第二Fc区分别可以包含第一CH3域和第二CH3域，各所述CH3域具有C末端和N末端。TFcA所包含的TFc的第一Fc区和第二Fc区分别可以包含第一CH2域和第二CH2域，各所述CH2域具有C末端和N末端。TFcA所包含的TFc的第一Fc区和第二Fc区分别可以包含第一铰链和第二铰链，所述第一铰链和所述第二铰链各自具有C末端和N末端。在某些实施方案中，所述第二铰链不包含上铰链亚域。TFcA中所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二CH2域以及第二CH3域。TFcA中所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二CH2域以及第二CH3域。TFcA中所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域。所述第一铰链可以包含上铰链亚域、核心铰链亚域以及下铰链亚域，且所述第二铰链可以包含核心铰链亚域和下铰链亚域，但不包含上铰链亚域，各所述铰链亚域具有C末端和N末端。TFcA所包含的TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链，所述第一铰链在其C末端处连接至第一CH2域的N末端，所述第一CH2域在其C末端处连接至第一CH3域的N末端，所述第一CH3域在其C末端处连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端处连接至第二铰链的N末端，所述第二铰链在其C末端处连接至第二CH2域的N末端，所述第二CH2域在其C末端处连接至第二CH3域的N末端。
TFcA所包含的TFc的TFc接头可以包含20到50个aa。TFc接头可以是Gly-Ser接头，如(Gly4Ser)n，其中n为4、5、6、7或8。TFc接头还可以包含与Gly-Ser接头的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多20、15、10、5、4、3、2或1个aa添加、缺失或取代方面不同的aa序列。
TFcA的TFc可以是IgG1TFc。TFc可以是杂合TFc，例如IgG1/IgG4杂合TFc。TFcA的TFc可以是IgG1TFc并且可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一IgG1铰链、第一IgG1CH2域、第一IgG1CH3域、TFc接头、第二IgG1铰链、第二IgG1CH2域以及第二IgG1CH3域。杂合TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一IgG1/IgG4铰链、第一IgG4CH2域、第一IgG1CH3域、TFc接头、第二IgG4铰链、第二IgG4CH2域以及第二IgG1CH3域。
TFc的第一CH3域和第二CH3域中的任一者或两者可以包含一个或多个能增强或稳定所述第一Fc区与所述第二Fc区之间的结合的aa修饰，如由例如非变性SDS-Page凝胶上的基本上均匀的产物(或色带)所证明。TFc的第一CH3域和第二CH3域各自可以包含氨基酸修饰，所述修饰是能增强第一CH3域与第二CH3域的缔合的缔合增强修饰(Association Enhancing Modification，“AEM”)。所述AEM可以由从由AEM模块1、AEM模块2、AEM模块3以及AEM模块4组成的群组中选出的模块构成。TFc的第一Fc区和第二Fc区中的任一者或两者可以包含aa修饰，所述修饰添加半胱氨酸作为插入或置换，所述半胱氨酸与另一个Fc区中的半胱氨酸一起形成二硫键(“DiS”修饰)。TFc的第一Fc区和第二Fc区中的任一者或两者可以在铰链中包含DiS修饰。在某些实施方案中，第一Fc区和第二Fc区中的任一者或两者在CH3域中包含DiS修饰。所述DiS修饰可以由DiS模块1或DiS模块2构成。TFc的第一CH3域和第二CH3域各自可以包含一个或多个AEM修饰和一个或多个DiS修饰。
TFc的第一CH3域和第二CH3域中的任一者或两者所包含的aa序列可以与本文中所提供，例如从由SEQ ID NO:27-98组成的群组中选出的CH3域的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或与其在至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个aa添加、缺失或取代方面不同。在某些实施方案中，如果CH3域的aa序列不与从由序列群组SEQ ID NO:27-98中选出的序列相同，则CH3域的aa序列仍然包含与其相似的序列的特定AEM和/或DiS。TFc的第一CH3域或第二CH3域可以包含本文中所提供，例如从由SEQ ID NO:27-98组成的群组中选出的aa序列。TFc的第一CH3域与第二CH3域一起可以包含两个不同的成员的配对，各成员是CH3aa序列，各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出：SEQ IDNO:31和35；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ IDNO:57和61；SEQ ID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ IDNO:83和85；SEQ ID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或在至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一CH3域所包含的配对成员与所述第二CH3域所包含的配对成员不同。TFc的第一CH3域和第二CH3域各自所包含的aa序列可以与从由以下各项组成的群组中选出的CH3aa序列配对的一个成员的aa序列相同：SEQ ID NO:31和35；SEQID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98。
TFc的第一铰链所包含的aa序列可以在至多3、2或1个aa缺失、添加或取代方面与本文中所提供，例如从由SEQ ID NO:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的铰链的aa序列不同。TFc的第一铰链所包含的aa序列可以是从由SEQ ID NO:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。TFc的第二铰链所包含的aa序列可以在至多3、2或1个aa缺失、添加或取代方面与本文中所提供，例如从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的铰链的aa序列不同。第二铰链所包含的aa序列可以是从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
TFc的CH2域所包含的aa序列可以与本文中所提供的CH2域的aa序列(例如SEQ ID NO:25、26、261或262)具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个aa缺失、添加或取代方面不同。
所述TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域，其中(i)所述第一铰链所包含的aa序列是从由以下各项组成的群组中选出：SEQ ID NO:4、18、19、263-265以及267-273；(ii)所述第一CH2域经去糖基化且包含如SEQ IDNO:25中所示出的aa序列；(iii)所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ IDNO:31和35；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ IDNO:57和61；SEQ ID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ IDNO:83和85；SEQ ID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98；(iv)所述第二铰链所包含的aa序列由从SEQ ID NO:23、263-265以及267-273组成的群组中选出的序列组成；(v)所述第二CH2域经去糖基化且包含如SEQ ID NO:25中所示出的aa序列；并且(vi)所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:33和37；SEQ IDNO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ ID NO:63和67；SEQ IDNO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ ID NO:84和86；SEQ IDNO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第二序列；并且如果所述第一CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第一序列。
TFc可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域，其中(i)所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出；(ii)所述第一CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:26中所示出的aa序列；(iii)所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98；(iv)所述第二铰链所包含的aa序列由SEQ ID NO:24、263-265以及267-273组成；(v)所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:26中所示出的aa序列；并且(vi)所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第二序列；并且如果所述第一CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第一序列。
TFc的第一Fc区或第二Fc区所包含的aa序列可以与本文中所提供，例如从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的Fc区的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个aa缺失、添加或取代方面不同。所述第一Fc区或所述第二Fc区所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出。所述第一Fc区和所述第二Fc区所包含的aa序列可以与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列配对中的一个aa序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性：SEQ ID NO:99和100；SEQ ID NO:101和102；SEQ ID NO:103和104；SEQ ID NO:105和106；SEQ ID NO:107和108；SEQ ID NO:109和110；SEQ ID NO:111和112；SEQ ID NO:113和114；SEQ ID NO:115和116；SEQ ID NO:117和118；SEQ ID NO:119和120；SEQID NO:121和122；SEQ ID NO:123和124；SEQ ID NO:125和126；SEQ IDNO:127和128；SEQ ID NO:129和130；SEQ ID NO:131和132；SEQ ID NO:133和134；SEQ ID NO:135和136；SEQ ID NO:137和138；SEQ ID NO:139和140；SEQ ID NO:141和142；SEQ ID NO:143和144；SEQ ID NO:145和146；SEQ ID NO:147和148；SEQ ID NO:149和150；SEQ ID NO:151和152；SEQID NO:153和154；SEQ ID NO:155和156；SEQ ID NO:157和158；SEQ IDNO:159和160；SEQ ID NO:161和162；SEQ ID NO:163和164；以及SEQ IDNO:165和166，或与其在至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个aa缺失、添加或取代方面不同，并且其中所述第一Fc区所包含的配对成员与所述第二Fc区所包含的配对成员不同。所述第一Fc区与所述第二Fc区一起可以包含两个不同成员的配对，各成员是Fc aa序列，其中各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出：SEQ ID NO:99和100；SEQ IDNO:101和102；SEQ ID NO:103和104；SEQ ID NO:105和106；SEQ ID NO:107和108；SEQ ID NO:109和110；SEQ ID NO:111和112；SEQ ID NO:113和114；SEQ ID NO:115和116；SEQ ID NO:117和118；SEQ ID NO:119和120；SEQ ID NO:121和122；SEQ ID NO:123和124；SEQ ID NO:125和126；SEQID NO:127和128；SEQ ID NO:129和130；SEQ ID NO:131和132；SEQ IDNO:133和134；SEQ ID NO:135和136；SEQ ID NO:137和138；SEQ ID NO:139和140；SEQ ID NO:141和142；SEQ ID NO:143和144；SEQ ID NO:145和146；SEQ ID NO:147和148；SEQ ID NO:149和150；SEQ ID NO:151和152；SEQ ID NO:153和154；SEQ ID NO:155和156；SEQ ID NO:157和158；SEQID NO:159和160；SEQ ID NO:161和162；SEQ ID NO:163和164；以及SEQID NO:165和166，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或在至多50、40、30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一Fc区所包含的配对成员与所述第二Fc区所包含的配对成员不同。
TFc所包含的aa序列可以与本文中所提供，例如从由SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221组成的群组中选出的TFc的aa序列具有至少约70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，或与其在至多30、25、20、15、10、5、4、3、2或1个aa添加、缺失或取代方面不同。所述TFc所包含的aa序列可以从由SEQ IDNO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221组成的群组中选出。
TFcA，例如TFcBA，例如抗c-Met+抗EGFR TFcBA或抗c-Kit+抗RONTFcBA或抗FGFR2+抗EPCAM TFcBA，可以包含重链，所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：第一重链可变(VH)域、TFc、连接性接头以及第二VH域。所述重链可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头以及第二VH域。所述重链可以按氨基到羧基末端的顺序包含：第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头、第二VH域、scFv接头以及第二轻链可变(VL)域，其中所述第二VH域与所述第二VL域缔合以形成第二结合位点。TFcA可以包含轻链，所述轻链包含第一VL域，所述第一VL域与所述第一VH域二聚以形成第一结合位点。所述轻链可以包含轻链恒定(CL)域，所述CL域连接至所述VL域的羧基末端。所述第一结合位点可以是抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗RON、抗EGFR、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFRα、抗PDGFRβ、抗EPCAM或抗EphA2结合位点，并且所述第二结合位点可以是抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFRα、抗PDGFRβ、抗EphA2或抗EGFR结合位点。如果TFcA是单价TFcA，则所述结合位点可以是抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFRα、抗PDGFRβ、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR结合位点。示例性抗c-Met结合位点可以包含VH域，所述VH域包含以下两项中的任一者或两者：a)SEQ ID NO:223或287中的VH互补性决定区(CDR)3(VHCDR3)的aa序列；和b)VLCDR3，其包含SEQ ID NO:231或289中的VLCDR3的aa序列。另一个示例性抗c-Met结合位点可以包含VH域，所述VH域包含包括VHCDR1、VCDR2以及VHCDR3的三个VH CDR的集合，其中VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3包含SEQ ID NO:223或231中的VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3的aa序列；及VL域，所述VL域包含包括VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的三个VLCDR的集合，其中VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO:287或289中的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的aa序列。示例性抗EGFR结合位点可以包含以下两项中的任一者或两者：a)VHCDR3，其包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的VHCDR3的aa序列；和b)VLCDR3，其包含SEQID NO:233、237、258、275、277或279中的VLCDR3的aa序列。示例性抗EGFR结合位点可以包含VH域，所述VH域包含包括VHCDR1、VCDR2以及VHCDR3的三个VHCDR的集合，其中VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3的aa序列；及VL域，所述VL域包含包括VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的三个VLCDR的集合，其中VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的aa序列。抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFRα、抗PDGFRβ、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR结合位点可以包含重链的N末端部分和轻链的N末端部分。抗EGFR、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFRα、抗PDGFRβ、抗EPCAM、抗EphA2或抗c-Met结合位点可以由完全被重链包含的C末端scFv包含，以形成连续多肽。
TFcA(例如TFcBA)的抗c-Met结合位点可以由VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与抗c-Met结合位点的VH域(例如SEQ ID NO:223、231、287或289中所示出)具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个aa缺失、添加或取代方面不同；并且所述VL域所包含的aa序列与本文中所提供的抗c-Met结合位点的VL域(例如SEQ ID NO:223、231、287或289中所示出)具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个aa缺失、添加或取代方面不同。
TFcA(例如TFcBA)的抗EGFR结合位点可以由VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与本文中所提供的抗EGFR结合位点的VH域(例如SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中所示出)具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个aa缺失、添加或取代方面不同；并且所述VL域所包含的aa序列与本文中所提供的抗EGFR结合位点的VL域(例如SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中所示出)具有至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或与其在至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个aa缺失、添加或取代方面不同。
TFcA或TFcBA可以是电荷互补配对型TFcA或TFcBA，例如其中：电荷互补配对型TFcA或TFcBA是包含一对带电氨基酸的TFcA或TFcBA，所述一对带电氨基酸包含选自群组A的氨基酸和选自群组B氨基酸(电荷互补对)；其中群组A包含pI大于7的所有天然氨基酸，而群组B包含pI小于7的所有天然氨基酸，或任选地，其中群组A包含His、Lys以及Arg，而群组B包含Asp、Glu、Asn、Phe、Gln、Tyr、Ser、Met、Thr、Ile、Gly、Val、Trp、Leu、Ala以及Pro；且所述电荷互补对由第一氨基酸残基和第二氨基酸残基组成，并且所述电荷互补对为297位电荷互补对或299位电荷互补对，其中297位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一Fc区的EU297位且所述第二氨基酸残基位于所述第二Fc区的EU297位的电荷互补对，而299位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一Fc区的EU299位且所述第二氨基酸残基位于所述第二Fc区的EU299位的电荷互补对。电荷互补配对型TFcA或TFcBA可以包含297位电荷互补对和299位电荷互补对，其中所述297位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基与所述299位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基相同或不同。电荷互补配对型TFcA或xxx可以包含297位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的297位电荷互补对的氨基酸之一。电荷互补配对型TFcA或TFcBA可以包含299位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的299位电荷互补对的氨基酸之一。
TFcA或TFcBA的第一结合位点或第二结合位点可以特异性结合从由以下各项组成的群组中选出的人类受体蛋白：ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、c-Met、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM以及EphA2。
本文中还提供了包含TFcA或TFcBA和药学上可接受的载体的药物组合物。还提供了核酸分子，所述核酸分子例如包含至少一个编码序列，所述至少一个编码序列编码TFcA或TFcBA的重链或轻链。核酸分子可以包含至少两个编码序列，其中一个编码序列编码TFcA或TFcBA的重链，而第二编码序列编码TFcBA的轻链。还提供了载体，所述载体例如包含一个或多个本文中所提供的核酸分子。还提供了细胞，例如宿主细胞或经分离细胞，所述细胞包含一种或多种本文中所提供的载体和/或核酸分子。细胞可以包含编码TFcA或TFcBA重链的核酸分子和编码TFcA或TFcBA轻链的核酸分子。
本文中还涵盖产生TFcA或TFcBA的方法，所述方法包括在所述核酸得以表达的条件下培养本文中所描述的宿主细胞，及分离TFcA或TFcBA。用于产生TFcA或TFcBA的方法可以包括在适合于表达TFcA或TFcBA的条件下培养本文中所描述的细胞。
本文中还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文中所描述的TFcA或TFcBA、核酸分子或载体。
附图简述
图1：示例性抗c-Met/抗EGFR串联Fc双特异性抗体(“TFcBA”)(图1A)和串联Fc(“TFc”)的每个域中的示例性突变(图1B)的图。
图1A：按氨基到羧基末端的顺序包含以下三个模块的示例性抗c-Met/抗EGFR TFcBA的图：1)由抗c-Met结合位点组成的第一模块；2)由TFc组成的第二模块；以及3)由抗EGFR结合位点组成的第三模块。在例示的TFcBA中，所述第一模块是抗c-Met Fab，且所述第三模块是抗EGFR scFv。所述TFc包含经由TFc接头连接的两个Fc区。在例示的TFcBA中，所述第一Fc区包含全长IgG1/IgG4杂合铰链、IgG4CH2域以及IgG1CH3域，且所述第二Fc区包含IgG4核心铰链和下铰链(但不包含上铰链)、IgG4CH2域以及IgG1CH3域。在例示的TFcBA中，所述CH3域包含一个或多个缔合增强修饰(“AEM”)，这些修饰增强两个CH3域或两个Fc区之间的缔合。TFcBA还可以包含一个或多个二硫键形成修饰(“DiS”)，这些修饰引入半胱氨酸，从而允许在两个Fc区之间形成二硫键。
图1B：按氨基到羧基末端的顺序显示以下各项的TFc的结构的图：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域。这些域各自的示例性序列和域修饰显示在该图下方。各AEM或DiS中的第一或第二CH3修饰的名称指示在修饰名称后的括号中，其中“AEM”或“DiS”后的第一个数字分别是指AEM或DiS的模块编号，而第二个数字是指两个CH3域中的第一个或第二个。举例来说，在取代“T366S/L368A/Y407V”后指示“AEM1.1”，这些取代是AEM模块1中的一对修饰的两个CH3域中的一个中的取代的组合。TFc可以包含这些域中的每一个的任何组合，条件是当所述TFc的一个CH3域包含两种AEM和/或DiS修饰之一时，另一个CH3域包含AEM和/或DiS的第二种(即，相容性)修饰。举例来说，如果TFc的一个CH3域包含AEM1.1，则另一个CH3域包含AEM1.2。“C末端Cys”是指通过用图中所示的那些aa取代CH3域的后三个aa将C末端半胱氨酸添加到CH3域的修饰。本图和其它图中的Aa残基编号是完整抗体重链中的编号(根据Kabat中的EU指数)。
图2：野生型铰链与变异铰链的aa序列的比对。一个位置上的短划线“-”表示aa与本图第一行中那个位置上的aa一致。A)全长(SEQ ID NO:4、18以及19)或部分(SEQ ID NO:1、2、3、16、17、23以及263-265)野生型(SEQ IDNO:1-4和23)或经修饰(SEQ ID NO:16-19和263-265)IgG1铰链的aa序列。B)全长(SEQ ID NO:20、21以及22)或部分(SEQ ID NO:1、13、14以及24)野生型(SEQ ID NO:1、13、14、20以及24)或经修饰(SEQ ID NO:21和22)IgG1/IgG4杂合铰链的aa。C)全长野生型mIgG1铰链(SEQ ID NO:266)和杂合mIgG1/mIgG2A铰链(SEQ ID NO:267)的aa序列。D)全长野生型hIgG2铰链(SEQ ID NO:7)和经修饰hIgG2铰链(SEQ ID NO:268和269)的aa序列。E)全长野生型hIgA2铰链(SEQ ID NO:270)和经修饰hIgA2铰链(SEQ IDNO:271-273)的aa序列。
图3：具有或不具有各种aa修饰的IgG1CH3aa序列的比对。各行是不同的CH3域的aa序列。一个位置上的短划线“-”表示aa与本图第一行中那个位置上的aa一致。CH3修饰是根据其模块(例如AEM模块1)加以组织。将各模块分成两组，用两个数字标记：举例来说，将AEM模块1分成群组“AEM11”和“AEM12”，其中AEM11表示对模块AEM1的一个CH3域(域“1”)进行的修饰，而AEM12表示对所述模块的第二个CH3域(域“2”)进行的修饰。模块内的各行表示具有所述模块的修饰且具有或不具有其它修饰的CH3域。一个模块内的CH3aa序列彼此不同，例如，存在或不存在羧基末端赖氨酸和/或存在取代D356E和L358M。
图4：示例性IgG1Fc区的比对。各行是不同的Fc区的aa序列。一个位置上的短划线“-”表示aa与本图第一行中那个位置上的aa一致。各Fc区包含铰链(在第一序列中呈粗体)、CH2以及CH3域(CH3域在第一序列中加下划线)。本图中的各Fc的铰链、CH2以及CH3序列的SEQ ID NO提供于表8中。这些Fc被组织成对，这些配对与其它配对用行分开，并且其中各配对表示相容性Fc，即，可以彼此缔合以形成Fc二聚体的Fc。
图5：示例性IgG1/IgG4杂合Fc区的比对。各行是不同的Fc区的aa序列。一个位置上的短划线“-”表示aa与本图第一行中那个位置上的aa一致。各Fc区包含铰链(在第一序列中呈粗体)、CH2以及CH3域(CH3域在第一序列中加下划线)。本图中的各Fc的铰链、CH2以及CH3序列的SEQ ID NO提供于表9中。这些Fc被组织成对，这些配对与其它配对用行分开，并且其中各配对表示相容性Fc，即，可以彼此缔合以形成Fc二聚体的Fc。
图6：以下IgG1TFc的aa序列：23(SEQ ID NO:171)；23A(SEQ IDNO:173)；23B(SEQ ID NO:175)；23C(SEQ ID NO:177)；23D(SEQ ID NO:179)；23E(SEQ ID NO:181)；23F(SEQ ID NO:183)；23E(35L)(SEQ ID NO:185)；23E(35L反向)(SEQ ID NO:187)；23E(30L)(SEQ ID NO:189)；23E(25L)(SEQ IDNO:191)；23I(SEQ ID NO:193)；以及23J(SEQ ID NO:195)。这些序列各自按氨基到羧基末端的顺序由以下域组成：第一IgG1铰链(加双下划线)、IgG1CH2域、IgG1CH3域(加下划线)、(G4S)n接头(呈斜体)、第二IgG1铰链(加双下划线且仅由核心铰链和下铰链组成)、第二IgG1CH2域以及第二IgG1CH3域(加下划线)。这些分子各自的特异性aa变化以粗体显示，并且在序列上方指出。
图7：以下IgG1/IgG4杂合TFc的aa序列：39(SEQ ID NO:197)；39A(SEQID NO:199)；39B(SEQ ID NO:201)；39C(SEQ ID NO:203)；39D(SEQ IDNO:205)；39E(SEQ ID NO:207)；39F(SEQ ID NO:209)；39E(35L)(SEQ IDNO:211)；39E(35L反向)(SEQ ID NO:213)；39E(30L)(SEQ ID NO:215)；39E(25L)(SEQ ID NO:217)；39I(SEQ ID NO:219)；39J(SEQ ID NO:221)。这些序列各自按氨基到羧基末端的顺序由以下域组成：由IgG1上铰链与IgG4核心铰链和下铰链组成的第一IgG1/IgG4杂合铰链(加双下划线)、IgG4CH2域、IgG1CH3域(加下划线)、(G4S)n接头(呈斜体)、第二IgG4铰链(加双下划线且仅由核心铰链和下铰链组成)、第二IgG4CH2域以及第二IgG1CH3域(加下划线)。IgG1序列以大写字母显示，而IgG4序列以小写字母显示。这些分子各自的特异性aa变化以粗体显示，并且在序列上方指出。
图8：在4%到12%SDS-PAGE凝胶上在A)非还原性或B)还原性条件下分离的TFc23A、23B、23D、23E、39B以及39G的样品。泳道1的分子量标记物(Biorad Precision Plus Marker)的蛋白质分子量(以KDa表示)显示在凝胶的左侧。
图9：以下示例性抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链aa序列：包含人源化5D5VH域和抗EGFR scFv的TFcBA，其包含A)、B)、C)、D)、E)、L)以及M)帕尼单抗的VH和VL域的aa序列(SEQ ID NO:235)；F)2224(SEQ IDNO:239)；G)西妥昔单抗H1L1(SEQ ID NO:260)；H)西妥昔单抗H1L2(SEQ IDNO:281)；I)西妥昔单抗H2L1(SEQ ID NO:283)；以及J)西妥昔单抗H2L2(SEQID NO:285)。K)包含抗c-Met结合位点2的VH域和人源化抗EGFR西妥昔单抗scFv H1L1的抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链aa序列。出于人源化目的引入到西妥昔单抗VH域中的aa以小写字母指示。抗c-Met Fab的CDR用虚线加下划线。CH1域用波状线加下划线。铰链加双下划线。TFc接头呈斜体。CH3域加下划线。CH3域中的AEM和DiS修饰呈粗体。scFv接头呈斜体且加下划线。连接性接头呈斜体且加双下划线。
图10：编码图和说明书中所示出的aa序列的核苷酸序列。
图11：实施例1和2中所使用的TFc的核苷酸和aa序列。各aa序列按氨基到羧基末端的顺序由以下域组成：信号肽(加下划线且呈粗体)、第一IgG1铰链(加双下划线)、IgG1CH2域、IgG1CH3域(加下划线)、TFc接头(呈斜体)、第二IgG1铰链(加双下划线且仅由核心铰链和下铰链组成)、第二IgG1CH2域以及第二IgG1CH3域(加下划线)。IgG1aa以大写字母表示，而IgG4aa以小写字母表示。这些分子各自的特异性aa变化，例如AEM和DiS修饰，以粗体显示，并且在序列上方指出。
图12A：选择奥那单抗(onartuzumab，OTZM)单克隆细胞系：泳道1=尺寸标准物；泳道2-12：2=OTZM系1，3=OTZM系2，4=OTZM系3，5=OTZM系4，6=OTZM系5，7=OTZM系6，8=OTZM系7，9=OTZM系8，10=OTZM系9，11=OTZM系10，12=OTZM系11。
图12B：选择奥那单抗(OTZM)单克隆细胞系：泳道1=尺寸标准物；泳道2-9：2=OTZM系12，3=OTZM系13，4=OTZM系14，5=OTZM系15，6=OTZM系16，7=OTZM系17，8=OTZM系18，9=OTZM系19。
图13A：带电糖基化突变体的非还原型SDS-PAGE：泳道1=尺寸标准物；泳道2-8：2=糖基化野生型，3=糖基化1，4=糖基化2，5=糖基化3，6=糖基化4，7=糖基化5，8=糖基化6。
图13B：带电糖基化突变体的还原型SDS-PAGE：泳道1=尺寸标准物；泳道2-8：2=糖基化野生型，3=糖基化1，4=糖基化2，5=糖基化3，6=糖基化4，7=糖基化5，8=糖基化6。
图14：示例性TFcBA的核苷酸和aa序列。
图15：显示包含39E糖型4骨架、奥那单抗抗体以及2224或帕尼单抗抗体的TFcBA与cMet-Fc和EGFR-his的结合的图。
图16：显示TFc对pMet的抑制的图，所述TFc包含奥那单抗抗体和各种骨架(包括23、23E、39、39E糖型4骨架)，且包括了包含39E糖型4骨架和2224、西妥昔单抗或帕尼单抗抗体的TFcBA。
图17：表23中所示出的示例性TFcBA的糖基化突变体的核苷酸和aa序列。
序列简述：
以下鉴别本文中提到的和序列表中列出的氨基酸(“aa”)序列。
SEQ ID NO:1、2以及3分别是野生型IgG1上铰链、中(或核心)铰链以及下铰链的aa序列(参见表2)。
SEQ ID NO:4是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID NO:1、2以及3组成的呈连续序列形式的完整野生型IgG1铰链的aa序列(参见表2)。
SEQ ID NO:5和6分别是野生型IgG2上铰链和下铰链的aa序列(参见表2)。IgG2中铰链与IgG1的相同，即，SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:7是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID NO:5、2以及6组成的呈连续序列形式的完整野生型IgG2铰链的aa序列(参见表2)。
SEQ ID NO:8、9以及10分别是野生型IgG3上铰链、中铰链以及下铰链的aa序列(参见表2)。
SEQ ID NO:11是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID NO:8、9以及10组成的呈连续序列形式的完整野生型IgG3铰链的aa序列(参见表2)。
SEQ ID NO:12、13以及14分别是IgG4上铰链、中铰链以及下铰链的aa序列(参见表2)。
SEQ ID NO:15是按氨基到羧基末端的顺序由SEQ ID NO:12、13以及14组成的呈连续序列形式的全长IgG4铰链的aa序列(参见表2)。
SEQ ID NO:16是包含aa取代H224C和T225C的IgG1上铰链(SEQ IDNO:1)的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:17是包含aa取代T223C的IgG1上铰链(SEQ ID NO:1)的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:18是包含aa取代H224C和T225C的全长IgG1铰链(SEQ IDNO:4)的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:19是包含aa取代T223C的全长IgG1铰链(SEQ ID NO:4)的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:20是由IgG1上铰链(SEQ ID NO:1)与IgG4中铰链和下铰链(分别为SEQ ID NO:13和14)组成的全长杂合IgG1/IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:21是由包含aa取代H224C和T225C的IgG1上铰链(SEQ IDNO:16)与IgG4中铰链和下铰链(分别为SEQ ID NO:13和14)组成的全长杂合IgG1/IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:22是由包含aa取代T223C的IgG1上铰链(SEQ ID NO:17)与IgG4中铰链和下铰链(分别为SEQ ID NO:13和14)组成的全长杂合IgG1/IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:23是包含IgG1中铰链和下铰链(SEQ ID NO:2和3)，但不包含上铰链的部分IgG1铰链的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:24是包含IgG4中铰链和下铰链(SEQ ID NO:13和14)，但不包含上铰链的部分IgG4铰链的aa序列(参见表4和图2)。
SEQ ID NO:25是在aa297处具有减弱糖基化的aa取代N297Q的全长IgG1CH2域的aa序列。
SEQ ID NO:26是在aa297处具有减弱糖基化的aa取代T299K的全长野生型IgG4CH2域的aa序列。
SEQ ID NO:27是全长野生型人类IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:28是具有SEQ ID NO:27，但缺乏C末端赖氨酸的野生型IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:29是具有含取代D356E和L358M的SEQ ID NO:27的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:30是具有SEQ ID NO:29，但缺乏C末端赖氨酸的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:31是具有含产生“孔”的取代T366S、L368A以及Y470V(缔合增强修饰或“AEM”1.1)的SEQ ID NO:27的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:32是具有SEQ ID NO:31，但缺乏C末端赖氨酸的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:33是具有含产生“孔”的取代T366S、L368A以及Y470V(“AEM”1.1)的SEQ ID NO:29的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:34是具有SEQ ID NO:33，但缺乏C末端赖氨酸的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:35是具有含产生“隆突”或“钮”的取代T366W(AEM1.2)的SEQ ID NO:27的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:36是具有SEQ ID NO:35，但缺乏C末端赖氨酸的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:37是具有含产生“隆突”或“钮”的取代T366W(AEM1.2)的SEQ ID NO:29的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:38是具有SEQ ID NO:37，但缺乏C末端赖氨酸的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:39-98是相对于具有SEQ ID NO:27、28、29或30的IgG1CH3而言包含一个或多个AEM和/或二硫键形成(“DiS”)修饰的IgG1CH3域的aa序列(参见表6和图3)。
SEQ ID NO:99-132是按连续氨基到羧基末端的顺序包含以下各项的示例性IgG1Fc区的aa序列：(a)从由IgG1铰链、包含一个或多个aa取代的IgG1铰链以及部分IgG1铰链组成的群组中选出的铰链；(b)具有N297Q的IgG1CH2域(SEQ ID NO:25)；以及(c)从由SEQ ID NO:29和包含一个或多个AEM和/或DiS修饰的SEQ ID NO:29组成的群组中选出的IgG1CH3域(图4)。所述铰链、CH2以及CH3域在无插入序列的情况下共价连接。SEQ ID NO:99-132的各域的SEQ ID NO示出于表8中。
SEQ ID NO:133-166是按连续氨基到羧基末端的顺序包含以下各项的示例性IgG1/IgG4杂合Fc区的aa序列：(a)从由IgG1/IgG4杂合铰链、包含一个或多个aa取代的IgG1/IgG4杂合铰链以及部分IgG4铰链组成的群组中选出的铰链；(b)具有T299K的IgG4CH2域(SEQ ID NO:26)；以及(c)从由SEQID NO:29和包含一个或多个AEM和/或DiS修饰的SEQ ID NO:29组成的群组中选出的IgG1CH3域。所述铰链、CH2以及CH3域在无插入序列的情况下共价连接。SEQ ID NO:133-166的各域的SEQ ID NO示出于表9中。
SEQ ID NO:167是KSCDKT，它是引入了半胱氨酸的IgG1CH3域的示例性经修饰羧基末端部分。
SEQ ID NO:168是GEC，它是引入了半胱氨酸的IgG1CH3域的示例性经修饰羧基末端部分。
SEQ ID NO:169是示例性非Gly-Ser TFc接头的aa序列。
SEQ ID NO:170-195是示例性IgG1TFc的核苷酸序列(偶数)和aa序列(奇数)，这些序列示出于图6中。构成这些IgG1TFc中的每一个的域的SEQ IDNO示出于表12中。
SEQ ID NO:196-221是包含杂合IgG1/IgG4Fc区的示例性TFc的核苷酸序列(偶数)和aa序列(奇数)，这些序列示出于图7中。构成这些杂合TFc中的每一个的域的SEQ ID NO示出于表13中。
SEQ ID NO:222-223分别是无信号肽的抗c-Met Ab5D5的重链Fab域的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:224-225分别是包含抗c-Met5D5VH域、IgG1TFc(具有AEM1)以及帕尼单抗scFv的IgG1TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
SEQ ID NO:226-227分别是包含抗c-Met5D5VH域、IgG1/IgG4杂合TFc(具有AEM1)以及帕尼单抗scFv的IgG1/IgG4杂合TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
SEQ ID NO:228-229分别是包含抗c-Met5D5VH域、IgG1/IgG4杂合TFc(具有AEM1)以及帕尼单抗scFv的IgG1/IgG4杂合TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
SEQ ID NO:230和231分别是包含人源化5D5抗c-Met VL域和CL域以供例如与包含人源化5D5抗c-Met VH域的重链，例如包含SEQ ID NO:225、227、229、244或343的重链一起使用的轻链的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:232和233是包含帕尼单抗(VECTIBIX)的可变区的抗EGFRscFv的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:234和235分别是包含以下各项的抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(分别示于图9和图10中)：(a)来自人源化5D5的抗c-Met可变域；(b)具有AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及(c)包含帕尼单抗(VECTIBIX)的可变区的抗EGFR scFv(SEQ ID NO:233)。
SEQ ID NO:236和237分别是包含Ab2224的可变区的抗EGFR scFv的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:238和239分别是包含以下各项的抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(分别示于图9和图10中)：(a)来自人源化5D5的抗c-Met可变域；(b)具有AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及(c)包含Ab2224的可变区的抗EGFR scFv(SEQ ID NO:237)。
SEQ ID NO:240和241分别是示例性信号肽的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:242和243分别是示例性信号肽的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:244和245分别是5D5的抗c-Met VH域和含具有SEQ IDNO:241的信号肽的CL域的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:246和247是含具有SEQ ID NO:243的信号肽的具有SEQ IDNO:231的轻链的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:248-254是本说明书中所描述的变异铰链的aa序列。
SEQ ID NO:255和256分别是含由SEQ ID NO:241组成且示于实施例3中的信号肽的抗c-Met结合位点2(SEQ ID NO:287)的重链Fab区的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:257和258分别是包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX)H1L1的可变区的抗EGFR scFv的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:259和260分别是包含以下各项的抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(分别示于图9和图10中)：(a)来自人源化5D5的抗c-Met可变域；(b)具有AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及(c)包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX)H1L1的可变区的抗EGFR scFv(SEQ IDNO:258)。
SEQ ID NO:261是全长野生型IgG1CH2域的aa序列。
SEQ ID NO:262是全长野生型IgG4CH2域的aa序列。
SEQ ID NO:263、264以及265是变异hIgG1铰链的aa序列(图2)。
SEQ ID NO:266是野生型小鼠IgG1铰链的aa序列(图2)。
SEQ ID NO:267是小鼠IgG1/IgG2A杂合铰链的aa序列(图2)。
SEQ ID NO:268和269是变异hIgG2铰链的aa序列(图2)。
SEQ ID NO:270是野生型hIgA2铰链的aa序列(图2)。
SEQ ID NO:271-273是变异hIgA2铰链的aa序列(图2)。
SEQ ID NO:274-279是包含实施例3中所描述的人源化西妥昔单抗AbH1L2、H2L1以及H2L2的可变域的scFv的核苷酸(偶数)和aa(奇数)序列。
SEQ ID NO:280-285分别是包含以下各项的抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸(偶数)和aa(奇数)序列：(a)来自人源化5D5的抗c-Met可变域；(b)包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX)Ab H1L2、H2L1以及H2L2的可变区的抗EGFR scFv(分别为SEQ ID NO:275、277或279)；以及(c)具有AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)(图9)。
SEQ ID NO:286和287分别是实施例3中所描述的抗c-Met结合位点2的重链Fab域的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:288和289分别是实施例3中所描述的抗c-Met结合位点2的轻链Fab域的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:290和291分别是图9和图10中所示的包含以下各项的抗c-Met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列：(a)来自抗c-Met结合位点2的抗c-Met重链Fab域(SEQ ID NO:287)；(b)具有AEM1和DiS2的TFc(SEQID NO:181)；以及(c)包含人源化西妥昔单抗(ERBITUX)H1L1的可变区的抗EGFR scFv(SEQ ID NO:258)(图9)。SEQ ID NO:291的aa序列与具有SEQ IDNO:260的aa序列相同，其中抗c-Met结合域已替换为抗c-Met结合位点2的抗c-Met结合域。
SEQ ID NO:292-341是实施例1和实施例2中所使用以及图11中所显示的TFc的核苷酸(偶数)和aa(奇数)序列。
SEQ ID NO:342和343分别是包含抗c-Met5D5VH域、IgG1TFc(具有AEM1和DiS反向)以及帕尼单抗scFv的IgG1TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
SEQ ID NO:344和345分别是含由SEQ ID NO:243组成且示于实施例3中的信号肽的抗c-Met结合位点2(SEQ ID NO:289)的轻链Fab区的核苷酸和aa序列。
SEQ ID NO:346和347分别是存在人源化5D5抗c-Met和抗EGFR帕尼单抗scFv与IgG1TFc(存在AEM1和具有SEQ ID NO:169的40aa TFc接头)的抗c-met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
SEQ ID NO:348和349分别是存在人源化5D5抗c-Met和抗EGFR帕尼单抗scFv与IgG1/IgG4杂合TFc(存在AEM1和具有SEQ ID NO:169的40aaTFc接头)的抗c-met/抗EGFR TFcBA的重链的核苷酸和aa序列(图9)。
SEQ ID NO:350是包含抗RON重链Fab域、抗EGFR scFv2224以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗RON/抗EGFR TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:351是包含抗RON重链Fab域、抗EGFR scFv2224以及TFc39Egy4(39E糖型4)(SEQ ID NO:394)的抗RON/抗EGFR TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:352是包含抗RON重链Fab域、抗CEA scFv以及Tfc23E(SEQ ID NO:303)的抗RON/抗CEA TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:353是包含抗RON重链Fab域、抗CEA scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗RON/抗CEA TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:354是包含抗CEA重链Fab域、抗cMet scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗CEA/抗cMet TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:355是包含抗CEA重链Fab域、抗RON scFv以及Tfc23E(SEQ ID NO:303)的抗CEA/抗RON TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:356是包含抗CEA重链Fab域、抗cMet scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗CEA/抗scMet TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO357-358是TFc野生型CH2序列以及CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC的aa序列和核苷酸序列；图17。
SEQ ID NO:359是包含抗cMet重链Fab域、抗CEA scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗CEA TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:360是包含抗cMet重链Fab域、抗CEA scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗CEA TFcBA的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:361是包含抗cMet重链Fab域、抗CD44scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:362是包含抗cMet重链Fab域、抗CD44scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:363是包含抗cMet重链Fab域、抗CD44scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:364是包含抗cMet重链Fab域、抗CD44scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗CEA CD44的重链的aa序列，图14。
SEQ ID NO:365是包含抗CD44重链Fab域、抗cMet scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗CD44/抗cMet的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:366是包含抗CD44重链Fab域、抗cMet scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗CD44/抗cMet的重链的aa序列；图14。
SEQ ID NO:367是抗CD44ARH60-16-2轻链的aa序列。
SEQ ID NO368-369是抗cMet抗体奥那单抗和TFc23轻链的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO370-371是抗cMet抗体奥那单抗和TFc39重链的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO372-373是抗cMet抗体奥那单抗和TFc23E重链的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO374-375是抗cMet抗体奥那单抗和TFc39Egy4重链的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO376-377是包含抗cMet重链Fab域、西妥昔单抗抗EGFR scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO378-379是包含抗cMet重链Fab域、帕尼单抗抗EGFR scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO380-381是包含抗cMet重链Fab域、2224抗EGFR scFv以及TFc23E(SEQ ID NO:303)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO382-383是包含抗cMet重链Fab域、西妥昔单抗抗EGFR scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO384-385是包含抗cMet重链Fab域、帕尼单抗抗EGFR scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
SEQ ID NO386-387是包含抗cMet重链Fab域、2224抗EGFR scFv以及TFc39Egy4(SEQ ID NO:394)的抗cMet/抗EGFR的aa序列和核苷酸序列；图14。
对于图17中所公开的序列，双下划线是铰链，单下划线是CH3域，第二双下划线是第二铰链，第二下划线是第二CH3。
SEQ ID NO388-389是糖基化突变体1的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体1包含CH2域中的N297D/T299S::N297D/T299S氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC；图17SEQ ID NO390-391是糖基化突变体2的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体2包含CH2域中的T299K::N297D/T299S氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC；图17。
SEQ ID NO392-393是糖基化突变体3的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体3包含CH2域中的N297D/T299S::T299K氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC；图17。
SEQ ID NO394-395是糖基化突变体4的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体4包含CH2域中的T299K::T299D氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC；图17。
SEQ ID NO396-397是糖基化突变体5的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体5包含CH2域中的T299D::T299K氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC；图17。
SEQ ID NO398-399是糖基化突变体6的aa序列和核苷酸序列，所述糖基化突变体6包含CH2域中的T299D::T299D氨基酸变化(加下划线，粗体)和CH3域中的T366S/L368A/Y407V/CH3C末端半胱氨酸KSCDKT::T366W/CH3C末端半胱氨酸GEC；图17。
详述
本文中提供串联Fc抗体(“TFcA”)，例如串联Fc双特异性抗体(“TFcBA”)。所述分子可以用于治疗细胞增殖性病症，例如癌症。
定义
为了方便起见，以下提供本说明书、实施例以及所附权利要求书中所使用的某些术语和短语的含义。
“aa修饰”或“aa变化”是指对aa序列的一个或多个氨基酸(aa)缺失、添加或取代。aa序列插入包括长度在一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的范围内的氨基末端和/或羧基末端融合物，以及单个或多个aa残基的序列内插入。序列内插入一般地可以在约1至10个残基范围内，例如1至5，例如1至3。
“AEM”或“缔合增强修饰”是指对CH3域进行以增强其与另一个CH3域的缔合的aa修饰。AEM可以在TFc的一个或两个Fc中包含一个或多个aa取代、缺失或添加。AEM是按模块分类，例如模块1(“AEM1”)，其中对两个CH3域之一的修饰称为AEM1.1，且对另一个CH3域的修饰称为AEM1.2。举例来说，AEM1.1由取代T366S/L368A与Y407V的组合组成，而AEM1.2由aa取代T366W组成。当CH3域包含两个或更多aa修饰，例如aa取代时，这些修饰以“/”彼此隔开。当指的是两个CH3域中的修饰时，各CH3域中的修饰以“::”隔开。
“氨基酸取代”是指蛋白质中的一个特定氨基酸(“aa”)被另一个aa置换。取代可以是如下文所定义的保守取代。“抗c-Met结合位点”是指特异性结合人类c-Met的结合位点。“抗EGFR结合位点”是指特异性结合人类EGFR的结合位点。
“抗原结合位点”是指包含抗体或其至少一个CDR的VH域和/或VL域的结合位点，条件是所述抗原结合位点特异性结合其标靶抗原。举例来说，抗原结合位点可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：单独VHCDR3，或与VHCDR2且任选地与VHCDR1一起。在某些实施方案中，抗原结合位点包含可能存在于同一多肽上或两个不同的多肽上VH域和VL域，例如，VH域存在于重链上，而VL域存在于轻链上。
抗体的“抗原结合部分”是指保留特异性结合抗原(例如c-met或EGFR)的能力的一个或多个抗体片段。已证明抗体的抗原结合功能可以被全长抗体的片段保留。术语抗体的“抗原结合部分”内所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL以及CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH域和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL域和VH域组成的Fv片段；(v)由VH域组成的dAb片段；以及(vi)分离的互补性决定区(“CDR”)。此外，尽管VL和VH是Fv片段的两个域，VL和VH是由独立的基因编码，但它们可以使用重组法由合成接头接合，所述合成接头使它们能够成为其中VL区与VH区配对以形成称作单链Fv(scFv)的单价蛋白质的单一蛋白质链(参见例如美国专利第5,892,019号)。所述单链抗体也打算涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖单链抗体的其它形式，如双链抗体。双链抗体是二价双特异性抗体，其中VH域和VL域表达于单一多肽链上，但使用因过短而无法允许同一链上的两个域配对，从而促使这些域与另一个链的互补域配对并且产生两个抗原结合位点的接头。
“结合亲和力”是指结合相互作用的强度并且包括实际结合亲和力以及表观结合亲和力两者。实际结合亲和力是缔合速率相对于解离速率的比率。表观亲和力可以包括例如由多价相互作用引起的亲合力。解离常数(Kd)典型地为结合亲和力的倒数，并且可以使用表面等离子共振测定(例如，如用BIACORE3000仪器(GE Healthcare)确定，例如使用重组EGFR作为分析物且使用抗EGFR抗体作为配体)或细胞结合测定来方便地测量，所述测定各自描述于美国专利第7,846,440号的实施例3中。
“结合部分”、“结合域”或“结合位点”是指结合多肽或在有规定时指其重链或轻链中直接参与调节抗体与标靶分子(即，抗原)特异性结合的部分、区域或位点。示例性结合域包括抗原结合位点、配体的受体结合域、受体的配体结合域或酶域。在优选实施方案中，结合域包含以下或由以下组成：抗原结合位点(例如，包含可变重(VH)链序列和可变轻(VL)链序列)或抗体的放在交替框架区(例如任选地包含一个或多个aa取代的人类框架区)中的六个CDR。在某些实施方案中，结合位点可能基本上仅由VH或VL链序列构成。结合位点可以全部来自一个物种，例如它仅具有来源于一个物种的生殖系序列的序列。举例来说，结合位点可以是人类(即，来自人类)、小鼠或大鼠的。结合位点还可以是经过人源化的，即，CDR来自于一个物种，而框架(FR)来自于另一个物种。举例来说，结合位点可以具有来源于小鼠抗体的CDR和来自人类的FR。某些人源化结合位点在一个或多个CDR中包含突变以使所述CDR看起来更像供体抗体的CDR。某些人源化抗体还可以在一个或多个FR中包含突变。一般来说，结合位点中的突变可以增强结合位点与其标靶抗原的结合亲和力，和/或它们可以稳定所述结合位点，例如延长其半衰期。
“CDR”或“互补性决定区”是指在重链多肽和轻链多肽两者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。以下文献已经描述了这些特定区域：Kabat等,J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等,Sequences of protein ofimmunological interest.(1991)；及Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和MacCallum等,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)，其中当相对于彼此进行比较时，所述定义包括重叠aa残基或aa残基子集。阐述了涵盖如以上各引用参考文献所定义的CDR的aa残基以供比较。如本文中所使用且如果没有另外规定，则“CDR”如Kabat所定义。
表1.CDR定义
Figure BDA0000489467110000291
1残基编号遵照上述Kabat等,1991的命名法
2残基编号遵照上述Chothia等的命名法
3残基编号遵照上述MacCallum等的命名法
“CH1域”是指位于VH域与铰链之间的重链免疫球蛋白恒定域。它跨越EU118位到215位。CH1域可以是天然存在的CH1域或其中一个或多个氨基酸(“aa”)已经过取代、添加或缺失的天然存在的CH1域，条件是所述CH1域具有所希望的生物学性质。所希望的生物学活性可以是天然生物学活性、相对于天然存在的序列有所提高的生物学活性或有所降低的生物学活性。
“CH2域”是指位于铰链与CH3域之间的重链免疫球蛋白恒定域。如此处所定义，它跨越EU237位到340位。CH2域可以是天然存在的CH2域，或其中一个或多个aa已经过取代、添加或缺失的天然存在的CH2域，条件是所述CH2域具有所希望的生物学性质。所希望的生物学活性可以是天然生物学活性、相对于天然存在的域的生物学活性有所提高的生物学活性或有所降低的生物学活性。
“CH3域”是指位于CH2域C末端且从CH2域N末端跨越约110个残基，例如约341位到446b位(EU编号系统)的重链免疫球蛋白恒定域。CH3域可以是天然存在的CH3域，或其中一个或多个aa已经过取代、添加或缺失的天然存在的CH3域，条件是所述CH3域具有所希望的生物学性质。所希望的生物学活性可以是天然生物学活性、相对于天然存在的域的生物学活性有所提高的生物学活性或有所降低的生物学活性。CH3域可能包含或可能不包含C末端赖氨酸。“CH4域”是指位于IgM和IgE抗体中的CH3域C末端的重链免疫球蛋白恒定域。CH4域可以是天然存在的CH4域或其中一个或多个aa已经过取代、添加或缺失的天然存在的CH4域，条件是所述CH4域具有所希望的生物学性质。所希望的生物学活性可以是天然生物学活性、相对于天然存在的域的生物学活性有所提高的生物学活性或有所降低的生物学活性。
“CL域”是指位于VL域C末端的免疫球蛋白轻链恒定域。它跨越约Kabat107A位到216位。CL域可以是天然存在的CL域或其中一个或多个aa已经过取代、添加或缺失的天然存在的CL域，条件是所述CL域具有所希望的生物学性质。所希望的生物学活性可以是天然生物学活性、相对于天然存在的域的生物学活性有所提高的生物学活性或有所降低的生物学活性。CL域可能包含或可能不包含C末端赖氨酸。
“c-Met”或“c-MET”是指间质上皮转化(MET)因子，它也称为肝细胞生长因子受体(HGFR)、分散因子(SF)受体、AUTS9、RCCP2，对应于Gene ID4233，且具有酪氨酸激酶活性。原生单链前体蛋白在转译后裂解以产生α和β亚单位，所述亚单位为经过连接以形成成熟受体的二硫化物。已发现这个基因的编码不同的同种型的两种转录变体。HGF是唯一已知的c-Met配体。人类c-Met同种型a前体的aa序列提供于Genbank登录号NP_001120972.1下，且同种型b前体提供于Genbank登录号NP_000236.2下。
“保守取代”或“保守氨基酸取代”是指对于各特定取代前aa残基，蛋白质或肽中的一个或多个aa残基被置换为已知不可能改变蛋白质或肽的构形或功能的特定置换aa，其中所述特定aa残基被所述特定置换aa取代。所述保守取代典型地包括一个aa被在电荷和/或大小方面与所述第一aa相似的另一个aa置换，且包括异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或白氨酸(L)彼此置换；经过取代的天冬氨酸(D)置换谷氨酸(E)和E置换经过取代的D；谷氨酰胺(Q)置换天冬酰胺(N)和N置换Q；以及丝氨酸(S)置换苏氨酸(T)和T置换S。本领域中已知在特定序列或结构环境下为保守型的其它取代。举例来说，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)往往可以彼此取代以产生保守取代，如可为丙氨酸和缬氨酸(V)。相对具有疏水性的甲硫氨酸(M)往往可以取代白氨酸或异亮氨酸且有时取代缬氨酸或被其保守取代。赖氨酸(K)和精氨酸(R)的位置往往可互换，其中aa残基的显著特征在于其电荷且预料到这两个碱性aa残基的pK差异不显著。所述取代的作用可以使用如PAM120、PAM-200以及PAM-250等取代评分矩阵来计算。其它所述保守取代，例如取代具有相似疏水性特征的整个区域(例如跨膜域)，是众所周知的。
免疫球蛋白轻链的“恒定区”或恒定域可互换地称为“CL”、“轻链恒定区域”、“CL区”或“CL域”。免疫球蛋白重链上的恒定域(例如铰链、CH1、CH2或CH3域)可互换地称为“CH”、“重链恒定域”、“CH”区或“CH域”。免疫球蛋白轻链上的可变域可互换地称为“VL”、“轻链可变域”、“VL区”或“VL域”。免疫球蛋白重链上的可变域可互换地称为“VH”、“重链可变域”、“VH区”或“VH域”。
“DiS”是指导致添加半胱氨酸的域(例如铰链或CH3域)修饰，所述半胱氨酸可以与另一个半胱氨酸形成二硫键。DiS可以包含TFc的一个或两个Fc中的一个或多个aa取代、缺失或添加。DiS是按模块分类，例如模块1(“DiS1”)，其中对两个Fc之一的修饰称为DiS1.1，且对另一个Fc的修饰称为DiS1.2。举例来说，DiS1.1由取代Y349C组成，而DiS1.2由aa取代S354C组成。
“域”一般是指可以包含例如可由β折叠片和/或链内二硫键加以稳定的肽环(例如1至4个肽环)的重链多肽或轻链多肽的一个区域，例如独立地折叠的球状区域或非球状区域(例如连接亚域)。免疫球蛋白重链和轻链的恒定区和可变区典型地折叠成域。确切地说，CH1、CH2、CH3、CH4、CL、VH以及VL域中的每一个典型地形成环结构。
“EC50”或“EC50”是指对特定系统(如结合测定或信号转导途径)提供50%最大蛋白质效应的分子(例如TFcA)浓度。
“EGFR”是指表皮生长因子受体，其也称为ErbB1、HER-1、mENA以及PIG61。已知EGFR结合配体，包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGf-α)、双调蛋白、肝素结合EGF(hb-EGF)、β细胞因子、表皮调节素，且具有Gene ID1956(Herbst,R.S.,和Shin,D.M.,Cancer94(2002)1593-1611；Mendelsohn,J.,和Baselga,J.,Oncogene19(2000)6550-6565)。EGFR是跨膜糖蛋白，它是经由酪氨酸激酶介导的信号转导途径(包括但不限于激活可控制细胞增殖、分化、细胞存活、细胞凋亡、血管生成、有丝分裂发生以及转移的信号转导途径)来调节许多细胞过程的蛋白激酶超家族的一员(Atalay,G.等,Ann.Oncology14(2003)1346-1363；Tsao,A.S.,和Herbst,R.S.,Signal4(2003)4-9；Herbst,R.S.,和Shin,D.M.,Cancer94(2002)1593-1611；Modjtahedi,H.等,Br.J.Cancer73(1996)228-235)。配体与EGFR结合诱导受体二聚和酪氨酸自磷酸化，由此导致细胞增殖。已发现这个基因的可编码不同的蛋白质同种型的多个交替剪接转录变体。人类EGFR同种型a到d前体的aa序列提供在Genbank登录号NP_005219.2、NP_958439.1、NP_958440.1以及NP_958441.1下。
“ErbB2”或“HER2”是指与EGF受体相似的假定酪氨酸激酶生长因子受体EGFR2，p185HER2/NEU抗原。ErbB2同种型的aa序列提供在Genbank登录号NP_004439.2和NP_001005862.1下，且核苷酸序列具有GeneID2064。
“ErbB3”或“HER3”是指由人类ERBB3基因编码且在蛋白质氨基酸磷酸化中起作用的受体酪氨酸蛋白激酶。ErbB3同种型的aa序列提供在Genbank登录号NP001973.2和NP_001005915.1下，且核苷酸序列具有Gene ID2065。
“ErbB4”或“HER4”在调节细胞增殖和分化的受体酪氨酸激酶信号转导中起作用。ErbB3同种型的aa序列提供在Genbank登录号NP001973.2和NP_001005915.1下，且核苷酸序列具有Gene ID2066。
ERBB2、ERBB3以及ERBB4基因编码神经胶质生长因子(heregulin)/神经调节蛋白(neuregulin)受体，所述受体为EGFR相关I型受体酪氨酸激酶亚家族的成员。所编码的蛋白质形成同源二聚体和异源二聚体，由此使功能分配复杂化：ERBB2同源二聚体不结合神经胶质生长因子，但ERBB2/ERBB3异源二聚体结合神经胶质生长因子。赫赛汀是细胞外域的替代性分泌ERBB2产物，其结合p185ERBB2，破坏ERBB2二聚体，减弱p185磷酸化，且抑制生长。人类ERBB2基因位于17p12-21。HER-2的过度表达与乳腺癌的不良预后相关。
“IGF1R”是指胰岛素样生长因子1受体。示例性人类IGF1R核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:3480和GenBank登录号：NP_000866.1中。
“IGF2R”是指胰岛素样生长因子2受体。示例性人类IGF2R核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:3482和GenBank登录号：NP_000867.2中。
“胰岛素受体”是指胰岛素细胞受体。示例性人类胰岛素受体核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:3643和GenBank登录号：NP_000199.2中。
“c-MET”是指肝细胞生长因子受体。示例性人类c-Met核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:4233和GenBank登录号：NP_001120972.1中。
“RON”是指巨噬细胞刺激蛋白受体的受体。示例性人类RON核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:4486和GenBank登录号：NP_002438.2中。
“c-Kit”是指v-kit Hardy-Zuckerman4猫科肉瘤病毒致癌基因同源物。示例性人类c-Kit核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:3815和GenBank登录号：NP_001087241.1中。
“VEGFR1”是指血管内皮生长因子1。示例性人类VEGFR1核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:2321和GenBank登录号：NP_002010.2中。
“VEGFR2”是指血管内皮生长因子2。示例性人类VEGFR2核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:3791和GenBank登录号：NP_002244.1中。
“TNFR”是指肿瘤坏死因子受体。示例性人类TNFR核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:7132和GenBank登录号：NP_001056.1中。
“FGFR1”是指纤维母细胞生长因子受体1。示例性人类FGFR1核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:2260和GenBank登录号：NP_001167537.1中。
“FGFR2”是指纤维母细胞生长因子受体2。示例性人类FGFR2核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:2263和GenBank登录号：NP_001138390.1中。
“FGFR3”是指纤维母细胞生长因子受体3。示例性人类FGFR3核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:2261和GenBank登录号：NP_000133.1中。
“FGFR4”是指纤维母细胞生长因子受体4。示例性人类FGFR4核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:2264和GenBank登录号：NP_075252.2中。
“PDGFRα”是指血小板衍生生长因子受体α。示例性人类PDGFRα核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:5156和GenBank登录号:NP_006197.1中。
“PDGFRβ”是指血小板衍生生长因子受体β。示例性人类PDGFRβ核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:5159和GenBank登录号:NP_002600.1中。
“EpCAM”是指上皮细胞粘附分子。示例性人类EpCAM核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:4072和GenBank登录号：NP_002345.2中。
“EphA2”是指EPH受体A2。示例性人类EphA2核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:1969和GenBank登录号：NP_004422.2中。
“CEA”是指癌胚抗原相关细胞粘附分子5。示例性人类CEA核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:1048和GenBank登录号：NP_004354.2中。
“CD44”是指细胞表面糖蛋白CD44。示例性人类CD44核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:960和GenBank登录号：NP_001189486.1中。
“ALK”是指间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶。示例性人类ALK核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:238和GenBank登录号：NP_004295.2中。
“AXL”是指AXL受体酪氨酸激酶。示例性人类AXL核酸和蛋白质序列分别示出于RefSeqGene Gene ID:558和GenBank登录号：NP_068713.2中。
“EU”指示重链恒定区中的aa位置，包括CH1、铰链、CH2以及CH3域中的aa位置，在本文中是根据EU指数编号系统进行编号(参见Kabat等,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”,美国卫生与公众服务部,第5版,1991)。
“Fab”是指抗体的抗原结合部分，其包含两个链：包含VH域和CH1域的第一链及包含VL域和CL域的第二链。尽管Fab典型地被描述为经过木瓜蛋白酶处理的抗体N末端片段且包含铰链区的一部分，但它在本文中也用于指重链不包含铰链的一部分的结合域。
“Fc区”是指单一免疫球蛋白重链中始于正好在木瓜蛋白酶裂解位点(即，IgG中的残基216，取重链恒定区的第一个残基为114)上游的铰链区且止于抗体C末端的部分。因此，完整Fc区至少包含铰链、CH2域以及CH3域。二聚的两个Fc区称为“Fc”或“Fc二聚体”。Fc区可以是天然存在的Fc区，或其中一个或多个aa已经过取代、添加或缺失的天然存在的Fc区，条件是所述Fc区具有所希望的生物学性质。所希望的生物学活性可以是天然生物学活性、相对于天然存在的域的生物学活性有所提高的生物学活性或有所降低的生物学活性。
“框架区”或“FR”或“FR区”包括作为可变区的一部分但不是CDR(例如，使用CDR的Kabat定义)的一部分的aa残基。所以，可变区框架的长度介于约100到120个aa之间，但仅包括CDR以外的那些aa。对于重链可变区的具体实例和如上述Kabat等,1991所定义的CDR，框架区1对应于涵盖aa1-30的可变区的域；框架区2对应于涵盖aa36-49的可变区的域；框架区3涵盖aa66-94的可变区的域；且框架区4对应于涵盖aa103到可变区末端的可变区的域。轻链框架区类似地由各轻链可变区CDR隔开。类似地，使用Chothia等或McCallum等的CDR定义，框架区边界由如上文所述的相应CDR末端隔开。在优选实施方案中，CDR如Kabat所定义。
“全长抗体”或“全长Ab”是包含任选地可以连接的一个或多个重链和一个或多个轻链的抗体(“Ab”)。各重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由CH1、CH2以及CH3三个域和任选地第四域CH4构成。各轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域CL构成。VH区和VL区可以进一步再分成被称为互补性决定区(CDR)的高变区，夹杂被称为框架区(FR)的较保守区域。各VH和VL典型地由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。免疫球蛋白可以属于任何类型或类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA以及IgY)或子类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)。
“Gly-Ser接头”或“Gly-Ser肽”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性Gly-Ser肽包含aa序列(Gly4Ser)n，其中n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在某些实施方案中，n是介于1与5之间的数字，n是介于6与10之间的数字，n是介于11与15之间的数字，n是介于16与20之间的数字，n是介于21与25之间的数字，或n是介于26与30之间的数字。
“铰链”或“铰链区”或“铰链域”是指位于CH1域与CH2域之间的重链可挠性部分。它大约为25个aa长，且被分成“上铰链”、“中铰链”或“核心铰链”以及“下铰链”。铰链可以是天然存在的铰链，或其中一个或多个aa已经过取代、添加或缺失的天然存在的铰链，条件是所述铰链具有所希望的生物学性质。所希望的生物学活性可以是天然生物学活性、相对于天然存在的序列有所提高的生物学活性或有所降低的生物学活性。
“铰链亚域”是指上铰链、中(或核心)铰链或下铰链。IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4的铰链亚域的aa序列示出于表2中：
表2：IgG铰链亚域清单
Figure BDA0000489467110000361
完整铰链按氨基到羧基末端的顺序由上铰链亚域、中铰链亚域以及下铰链亚域组成且无插入序列。
“IC50”或“IC50”是指提供50%最大活性(例如对刺激或组成性活性的反应)抑制的分子(例如TFcA)浓度，即，使活性降到最大活性与基线之间的一半水平的浓度。IC50值可以使用例如Cheng-Prusoff方程式转变为绝对抑制常数(Ki)。在受结合剂抑制的系统(如抗体或本文中所提供的TFcA)中，可能难以区分IC50与EC50。
结合蛋白对生物学活性的“抑制”是指由所述结合蛋白介导的在生物学活性方面的任何可再现性可检测降低。在一些实施方案中，抑制提供统计上显著的生物学活性降低，例如，生物学活性相对于不存在所述结合蛋白时所确定的生物学活性降低约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
“分离”在与多核苷酸、多肽或蛋白质有关时意指所述多核苷酸、多肽或蛋白质实质上是从多核苷酸、多肽、蛋白质或者与其或其类似物一起存在于自然界中的其它大分子中移出。尽管术语“分离”不打算要求具体纯度，但通常，所述蛋白质应为至少约75%纯，更优选地为至少约80%纯，更优选地为至少约85%纯，更优选地为至少约90%纯，更优选地为至少约95%纯，且最优选地为至少约99%纯。在某些实施方案中，TFcA(例如TFcBA)是分离的TFcA。在某些实施方案中，TFcA是单克隆TFcA。
“Kabat”连同免疫球蛋白aa序列位置的指示一起指示轻链恒定区(例如CL域)中的氨基酸位置是根据Kabat指数编号系统进行编号(参见Kabat等,1991,在上面所引的著作中)。
“连接至”在上下文中是指氨基酸或核苷酸的直接或间接键联或连接。“间接键联”是指经由包含例如一个或多个aa或核苷酸的接头或域介导的键联。“直接键联”或“直接连接”在指两个多肽链段时是指这两个多肽链段之间存在共价键，例如，这两个多肽部分连续接合而无插入序列。
“接头”是指将两个域或区域连接在一起的一个或多个aa。接头可以是可挠性的，以允许所述域由所述接头连接以形成适当三维结构，从而允许它们具有所需要的生物学活性。连接scFv的VH和VL的接头在本文中称为“scFv接头”。将VH域的N末端或CH3域的C末端连接至第二VH或VL域(例如scFv的VH或VL域)的接头称为“连接性接头”。
“模块”是指TFcA中具有结构和/或功能独特性的部分，如结合位点(例如scFv域或Fab域)何TFc。本文中所提供的模块可以重新排列(通过重组核酸或者完全或部分从头合成新的多核苷酸来重组其编码序列)成与其它模块的多种组合，以产生多种TFcA，例如，如本文中所公开。“模块”还用于指AEM或DiS修饰的类型。在本文中且如本文中进一步描述，“模块”是用于增强或促成包含aa取代、添加或缺失的Fc区的缔合或二聚的两个或更多个这些修饰中的一个或组合。
“同一性百分比”或“同一性%”是指两个或更多个核酸或多肽序列或子序列在比对这两个序列的最大同一性并且加以比较时相同(100%一致)或具有规定百分比的相同核苷酸或aa残基。为了比对最大同一性，可以在所比较的序列之一中引入间隙。然后比较并定量相应位置的aa残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的残基占据时，则所述序列在该位置一致。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的一致位置数的函数(例如同一性%=一致位置数/位置(例如，重叠位置)总数×100)。在某些实施方案中，两个序列具有相同长度。确定一个序列与另一个序列具有所测量的同一性%可以使用数学算法来确定。用于对两个序列进行所述比较的数学算法的非限制性实例并入ALIGN程序(版本2.0)中，所述程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来例如比较aa序列时，可以使用PAM120权重残数表、间隙长度罚分12以及间隙罚分4。用于序列分析的其它算法在本领域中是众所周知的，并且许多可以在线获得。
参考部分的(例如域的)的“部分”或“片段”是指整个参考部分(例如域，例如天然存在的域)中占参考部分的大小的至少或至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的离散部分。
“scFv接头”是指插入在scFv的VL域与VH域之间的肽或多肽域。scFv接头优选允许VL和VH域在抗原结合构形中的定向。在一个实施方案中，scFv接头包含仅包含甘氨酸和丝氨酸的肽或多肽接头(“Gly-Ser接头”)或由其组成。在某些实施方案中，scFv接头包含二硫键。
“相似性”或“相似性百分比”在两个或更多个多肽序列的情况下是指两个或更多个序列或子序列在比较并且比对最大同一性时具有规定百分比的相同或经过保守取代的aa残基。举例来说，当与第一序列中所含数目相等的数目的aa相比较时，或当与已利用本领域中已知的计算机类比程序加以比对的多肽比对相比较时，当第一aa序列与第二aa序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%或甚至99%同一性或相对于第二序列经保守取代时，可以认为第一aa序列与第二aa序列相似。这些术语还适用于两个或更多个多核苷酸序列。
“特异性结合”、“选择性结合”以及“特异性地结合”、“选择性地结合”在指结合位点与其标靶表位的结合或结合位点与其标靶表位的组合时意指结合位点对标靶表位展现出免疫特异性结合。特异性结合表位的结合位点对标靶表位展现出明显亲和力，且一般来说，与其它表位不展现交叉反应性，因为它对任何无关表位不展现明显亲和力，且优选地对任何无关表位不展现等于、大于或在两个数量级内低于对标靶表位的亲和力的亲和力。“明显”或优选结合包括以解离常数(Kd)10-8、10-9M、10-10、10-11、10-12M、10-13M或甚至更低的Kd值结合。注意，Kd(解离常数)值越低，表明结合亲和力越高，因而，Kd10-7是比Kd10-8高的Kd值，但表明比Kd10-8低的结合亲和力。约10-7M和甚至低达约10-8M的解离常数值处于适合治疗性抗体的解离常数的高端部分。结合亲和力可以由解离常数范围指示，例如，10-6到10-12M、10-7到10-12M、10-8到10-12M或更佳(即，或更低解离常数值)。在纳摩尔(10-9M)到皮摩尔(10-12M)范围内或更低的解离常数典型地最适用于治疗性抗体。合适的解离常数为等于或小于50nM的Kd(即，等于或大于50nM的结合亲和力，例如45nM的Kd)或者等于或小于40nM、30nM、20nM、10nM、1nM、100pM、10pM或1pM的Kd。特异性或选择性结合可以根据本领域认可的用于确定所述结合的任何手段来确定，包括例如根据Scatchard分析和/或竞争性结合确定。
“TFc”或“串联Fc”是指按氨基到羧基末端的顺序包含以下各项的实体：第一Fc区，所述第一Fc区在其C末端连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端连接至第二Fc区的N末端，其中所述第一Fc区与所述第二Fc区缔合以形成Fc。
“TFcA”是指串联Fc抗体。TFcA可以是单价或单特异性TFcA，例如包含单一结合位点。TFcA还可以是双特异性TFcA，其在本文中称为TFcBA。TFcA可以单克隆的。
“TFcBA”是指串联Fc双特异性抗体，这是一种包含至少两个不同的结合部分或域且因而包含至少两个不同的结合位点(例如两个不同的抗体结合位点)的人工杂合蛋白，其中所述多个结合位点中的一个或多个是例如经由肽键彼此共价连接。本文中所描述的示例性TFcBA是抗c-Met+抗EGFR TFcBA，这是一种包含特异性结合c-Met蛋白(例如人类c-Met蛋白)的第一结合位点和一个或多个特异性结合EGFR蛋白(例如人类EGFR蛋白)的第二结合位点的多价双特异性抗体。当TFcBA名称包含由加号(+)隔开的两个抗原时，这表明两个抗原的结合位点可能在分子中呈任一相对氨基到羧基定向，而当TFcBA名称包含由斜线(/)隔开的两个抗原结合位点名称时，在斜线左侧的抗原结合位点相对于斜线右侧的抗原结合位点为氨基末端。TFcBA可以是二价结合蛋白、三价结合蛋白、四价结合蛋白或具有多于4个结合位点的结合蛋白。示例性TFcBA是二价双特异性抗体，即，具有2个结合位点的抗体，各结合位点结合不同的抗原或表位。在某些实施方案中，TFcBA的N末端结合位点是Fab，而C末端结合位点是scFv。
串联Fc Ab
本文中提供串联Fc抗体(“TFcA”)，其可以是单价或多价的，例如二价、三价或四价。多价TFcA可以是单特异性、双特异性(“串联Fc双特异性Ab”或“TFcBA”)、三特异性或四特异性TFcBA。当TFcBA是单特异性抗体时，其可以是具有一种或多种特异性的单价抗体。
在某些实施方案中，TFcA是TFcBA。示例性TFcBA抑制经由TFcBA所靶向的一个或两个受体进行的配体诱导的信号转导且从而可以抑制肿瘤细胞增殖或肿瘤生长。TFcBA还可以诱导受体下调或阻断受体二聚。示例性抗c-Met/抗EGFR TFcBA包含单一抗c-Met结合位点(对于抗c-Met而言为单价)和一个或多个抗EGFR结合位点(对于抗EGFR而言为单价或多价)。TFc典型地包含经由TFc接头与第二Fc区连接的第一Fc区，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区二聚以形成Fc。
图1显示示例性TFcBA的图，该图显示所述分子的各种元件。如图所示，TFcBA包含第一结合位点(例如抗c-Met Fab)、第二结合位点(例如抗EGFRscFv)以及将所述第一结合位点与所述第二结合位点连接在一起的串联Fc(“TFc”)。TFcBA可以描述为含有三个模块，其中第一模块包含第一结合位点，第二模块包含TFc，且第三模块包含第二结合位点。TFc一般在连续aa序列中包含第一Fc区、TFc接头以及第二Fc区，其中所述TFc接头连接所述第一Fc区与所述第二Fc区且允许该两个Fc区缔合。如图1中的示例性TFcBA所说明，TFc的两个Fc区各自可以包含铰链、CH2域以及CH3域。这些区域各自可以来自相同的免疫球蛋白同型或来自不同的同型。举例来说，铰链、CH2以及CH3域可以都来自于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或其某些域或部分可能来自于一种免疫球蛋白同型，而另一个域或部分可能来自于另一种免疫球蛋白同型。举例来说，图1中所图示的TFcBA包含来自于IgG1的所有域，或替代地，它可以包含IgG1/IgG4杂合铰链、IgG4CH2域以及IgG1CH3域。Fc区优选包含人类Fc域，然而也可以使用来自于其它哺乳动物或动物的序列，条件是所述TFcBA保留其生物学活性且优选在人类受试者中不具显著免疫原性。
在优选实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含一个或多个修饰以增强其缔合和/或稳定所述缔合。在某些实施方案中，TFcA的第一CH3域和/或第二CH3域包含一个或多个修饰以增强包含所述修饰的CH3域或Fc的缔合。所述修饰在本文中称为缔合增强修饰或“AEM”。示例性修饰包括两个CH3域中旨在增强其相互作用的aa取代，例如钮/孔(knob/hole)突变。
在某些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含向所述Fc区添加一个或多个半胱氨酸的aa修饰，以便从而与所述TFc的另一个Fc区形成二硫键。所述修饰在本文中称为二硫化物形成修饰或“DiS”修饰。DiS修饰可以存在于铰链、CH2和/或CH3域中。
TFc可以包含一个或多个AEM和/或一个或多个DiS修饰。图1B显示可对CH3区或铰链进行的示例性修饰。Fc区还可以包含其它修饰，例如调节由Fc区介导的生物学活性(如ADCC)的修饰。
尽管一般来说，第一Fc区和第二Fc区包含铰链、CH2域以及CH3域，但在某些实施方案中，Fc区可以包含CH3域和CH2域，但无铰链。在其它实施方案中，Fc区包含CH3域和铰链，但不包含CH2域。在其它实施方案中，Fc区可以包含CH3域和CH4域，但既不包含CH2域也不包含铰链。在其它实施方案中，Fc区可以包含CH3域、CH4域、CH2域，但不包含铰链。在其它实施方案中，Fc区可以包含CH3域、CH4域、铰链，但不包含CH2域。在某些实施方案中，缺乏一个或多个域的一部分。
在某些实施方案中，第一Fc区所包含的aa序列在一个或多个aa添加、缺失或取代方面与第二Fc区的aa序列不同(“异源二聚Fc”)。这通常是AEM和DiS修饰的情形，所述修饰典型地向第一Fc区和第二Fc区中引入不同的修饰。在其它实施方案中，第一Fc区所包含的aa序列与第二Fc区相同(“同源二聚Fc”)。
在某些实施方案中，Fc域(铰链、CH2或CH3域)直接连接至另一个Fc域。举例来说，铰链可以直接连接至CH2域和/或CH2域可以直接连接至CH3域。在其它实施方案中，Fc域经由接头连接至另一个Fc域，所述接头可以是一个或多个aa长，条件是包含这些域的TFcA具有所希望的生物学活性和稳定性以及任何其它所希望的特征。
在某些实施方案中，结合位点是抗原结合位点，其包含例如重链可变(VH)域和轻链可变(VL)域。VH域和VL域一般各自含有3个互补性决定区(CDR)，但在某些实施方案中，少于6个CDR可能就足以提供对抗原的特异性结合。在某些实施方案中，VH域为Fab的一部分，在这种情况下，VH域一般按自然顺序连接至CH1域，即，VH域连接至CH1的N末端。当抗原结合位点为Fab的一部分时，VL域一般可以按自然顺序连接至轻链恒定(CL)域，即，VL域连接至CL域的N末端。
可变域(VH和VL)可以直接或间接地连接至恒定域(CH1和CL)，例如经由接头，所述接头可以是一个或多个aa长，条件是包含这些域的TFcA具有所希望的生物学活性和稳定性以及任何其它所希望的特征。
在某些实施方案中，VH域为scFv的一部分，在这种情况下，VH域经由scFv接头连接至VL域，且scFv连接至TFc的N末端和/或C末端。当结合位点是scFv时，可变区一般不与CH1或CL域连接。
在某些实施方案中，TFcA是单价且单特异性的。单价TFcA可以在TFc的氨基末端或C末端包含结合位点。单价TFcA的结合位点可以是Fab或scFv。单价TFcA的示例性重链按氨基到羧基末端的顺序包含：
i)VH域和TFc；
ii)VH域、CH1域以及TFc；
iii)VH域、scFv接头、VL域以及TFc；
iv)TFc、连接性接头以及VH域；
v)TFc、连接性接头、VH域以及CH1域；以及
vi)TFc、连接性接头、VH域、scFv接头以及VL域。
当TFcA包含Fab时，TFcA还包含包括Fab VL域且任选地包含CL域的轻链。
在某些实施方案中，TFcA是TFcBA。TFcBA可以包含特异性结合第一抗原的一个Fab和特异性结合第二抗原的第二Fab。TFcBA还可以包含特异性结合第一抗原的第一scFv和特异性结合第二抗原的第二scFv。TFcBA还可以包含特异性结合第一抗原的Fab和特异性结合第二抗原的scFv。在某些实施方案中，TFc的氨基末端连接至Fab，且TFc的羧基末端连接至scFv。或者，TFc的氨基末端连接至scFv，且TFc的羧基末端连接至Fab。示例性分子具有以下形式：Fab-TFc-scFv；Fab-TFc-Fab；scFv-TFc-scFv；以及scFv-TFc-Fab。
在一个实施方案中，TFcBA包含重链，所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：
(i)第一VH域、TFc、连接性接头以及第二VH域；
(ii)第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头以及第二VH域；
(iii)第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头、第二VH域、scFv接头以及第二VL域，其中所述第二VH域与所述第二VL域缔合以形成第二结合位点；
(iv)第一VH域、TFc、连接性接头、第二VH域以及CH1域；
(v)第一VH域、第一CH1域、TFc、连接性接头、第二VH域以及第二CH1域；
(vi)第一VH域、第一scFv接头、第一VL域、TFc、连接性接头以及第二VH域，其中所述第一VL域与所述第一VH域缔合以形成第一结合位点；
(vii)第一VH域、第一scFv接头、第一VL域、TFc、连接性接头、第二VH域以及CH1域，其中所述第一VL域与所述第一VH域缔合以形成第一结合位点；以及
(viii)第一VH域、第一scFv接头、第一VL域、TFc、连接性接头、第二VH域、第二scFv接头以及第二VL域，其中所述第一VH域与所述第一VL域形成第一结合位点且所述第二VH域与所述第二VL域形成第二结合位点。
(i)到(v)的TFcBA可以进一步包含包括第一VL域和任选地位于所述VL域C末端的CL域的轻链，其中所述第一VH域与所述第一VL域缔合以形成第一结合位点。(i)、(ii)、(iv)到(vii)的TFcBA可以进一步包含包括第二VL域且任选地包含位于所述VL域C末端的CL域的轻链，其中所述第一VH域与所述第一VL域缔合以形成第二结合位点。
在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端。在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至CH1域的N末端，所述CH1域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端。在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至CH1域的N末端，所述CH1域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端，所述第二VH域在其C末端连接至scFv接头的N末端，所述scFv接头在其C末端连接至第二VL域的N末端，其中所述第二VH域与所述第二VL域缔合以形成第二结合位点。在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端，所述第二VH域在其C末端连接至CH1域的N末端。在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至第一CH1域的N末端，所述第一CH1域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端，所述第二VH域在其C末端连接至第二CH1域的N末端。在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至第一scFv接头的N末端，所述第一scFv接头在其C末端连接至第一VL域的N末端，所述第一VL域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端，其中所述第一VH域与所述第一VL域缔合以形成第一结合位点。在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至第一scFv接头的N末端，所述第一scFv接头在其C末端连接至第一VL域的N末端，所述第一VL域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端，所述第二VH域在其C末端连接至CH1域的N末端，其中所述第一VH域与所述第一VL域缔合以形成第一结合位点。在某些实施方案中，重链包含第一VH域，所述第一VH域在其C末端连接至第一scFv接头的N末端，所述第一scFv接头在其C末端连接至第一VL域的N末端，所述第一VL域在其C末端连接至TFc的N末端，所述TFc在其C末端连接至连接性接头的N末端，所述连接性接头在其C末端连接至第二VH域的N末端，所述第二VH域在其C末端连接至第二scFv接头的N末端，所述第二scFv接头在其C末端连接至第二VL域的N末端，其中所述第一VH域与所述第一VL域形成第一结合位点且所述第二VH域与所述第二VL域形成第二结合位点。
在某些实施方案中，以上构建体中的VL域被VH域替代且VH域被VL域替代。
当重链不包含第一VL域或第二VL域时，VL域可以由轻链提供。轻链可以包含第一VL域或第二VL域且任选地包含CL域。举例来说，scFv可以按氨基到羧基末端的顺序包含VL域、scFv接头以及VH域。
在某些实施方案中，TFcBA包含特异性结合第一受体的第一抗原结合位点和特异性结合第二受体的第二抗原结合位点。在某些实施方案中，特异性结合第一受体的第一抗原结合位点是Fab，且特异性结合第二受体的第二抗原结合位点是scFv。结合位点的示例性组合示出于表3中，其中“是”表明可能的组合且抗c-Met+抗EGFR TFcBA用于说明这些可能的组合：
表3：抗c-Met+抗EGFR TFcBA的结合位点的示例性组合
Figure BDA0000489467110000451
在某些实施方案中，TFcBA包含多于2个结合位点。TFcBA可以包含3、4、5、6或更多个结合位点。其它结合位点可以连接至例如TFcA或TFcBA的N和/或C末端。举例来说，重链可以包含一个或多个连接至TFc的氨基或羧基末端的Fab和/或scFv。
下文进一步描述TFcBA的示例性域。
示例性铰链
在一个实施方案中，TFcA(例如TFcBA)的第一Fc区和/或第二Fc区包含IgG上铰链、IgG中铰链和/或IgG下铰链。举例来说，Fc区可以分别包含一个或多个例如SEQ ID NO:1、2以及3中所示出的IgG1上铰链、中铰链以及下铰链(参见表2)。Fc区还可以分别包含一个或多个例如SEQ ID NO:5、2以及6中所示出的IgG2上铰链、中铰链以及下铰链(IgG1和IgG2的中铰链具有相同aa序列/参见表2)。Fc区还可以分别包含一个或多个例如SEQ IDNO:8、9以及10中所示出的IgG3上铰链、中铰链以及下铰链(表2)。Fc区还可以分别包含一个或多个例如SEQ ID NO:12、13以及14中所示出的IgG4上铰链、中铰链以及下铰链(表2)。Fc区还可以包含一个或多个小鼠Ig序列或IgA1或IgA2序列。
TFcA的第一Fc区和/或第二Fc区还可以包含aa序列不同于天然存在的序列(如本文中所示出的序列，例如SEQ ID NO:1-14)且包含多达1、2、3、4或5个aa修饰(例如aa取代、缺失或添加)的上铰链、中铰链或下铰链的aa序列。举例来说，可以使用以下IgG1上铰链：
EPKSCDKTCC(SEQ ID NO:16；对应于具有aa取代H224C和T225C(加下划线)的SEQ ID NO:1)；和
EPKSCDKCHT(SEQ ID NO:17；对应于具有aa取代T223C(加下划线)的SEQ ID NO:1)。
本文中所提到的铰链残基的氨基酸编号是根据其在全长抗体中的编号(EU编号；参见图2)。
在一个实施方案中，TFcA的第一铰链和/或第二铰链是包含以下aa序列的全长野生型IgG1铰链：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:4)。
TFcBA的第一铰链和/或第二铰链还可以由相对于SEQ ID NO:4包含多达1、2、3、4或5个aa修饰(例如aa取代、缺失或添加)的IgG1铰链组成。举例来说，可以使用以下IgG1铰链：
EPKSCDKTCCCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:18；对应于具有aa取代H224C和T225C的SEQ ID NO:4)；和
EPKSCDKCHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:19；对应于具有aa取代T223C的SEQ IDNO:4)。
在一个实施方案中，TFcA的第一铰链和/或第二铰链是杂合铰链，即，包含来自于不同的IgG子类的部分的铰链。在一个实施方案中，铰链包含来自于IgG1的上铰链及来自于IgG4的中铰链和下铰链，且可以例如由以下aa序列组成：
EPKSCDKTHTcpscpapeflg(SEQ ID NO:20；大写字母残基表示IgG1序列，且小写字母残基表示IgG4序列)。
TFcBA的第一铰链和/或第二铰链还可以是包含SEQ ID NO:20中所示出的aa序列的杂合铰链，其包含多达1、2、3、4或5个aa修饰，例如aa取代、缺失或添加。举例来说，可以使用以下IgG1/IgG4杂合铰链：
EPKSCDKTCCcpscpapeflg(SEQ ID NO:21；对应于具有aa取代H224C和T225C的SEQ ID NO:20；大写字母残基表示IgG1序列，且小写字母残基表示IgG4序列)；和
EPKSCDKCHTcpscpapeflg(SEQ ID NO:22；对应于具有aa取代T223C的SEQ ID NO:20)。
在某些实施方案中，第一Fc区和/或第二Fc区包含铰链的一部分而不是全长铰链。举例来说，TFcBA的第一Fc区和/或第二Fc区可以包含缺乏上铰链、中铰链和/或下铰链的铰链。在某些实施方案中，Fc区包含中铰链和下铰链，但不包含上铰链。IgG1中铰链和下铰链的示例性aa序列如下：
CPPCPAPELLG(SEQ ID NO:23)。
IgG4中铰链和下铰链的示例性aa序列如下：
CPSCPAPEFLG(SEQ ID NO:24)。
以上提供的铰链及其部分的aa编号的概述示出于表4中。IgG1与IgG1/IgG4杂合铰链的比对示出于图2中。
表4：示例性铰链及其亚域的SEQ ID NO
Figure BDA0000489467110000481
半胱氨酸还可以引入在铰链中除T223、H224以及T225以外的位置，例如通过取代K222C，如WO2010/064090中所描述。
可以用于TFcA中的其它铰链包括了包含以下aa序列之一的hIgG1铰链变体(图2)：
PPPPCDKTHTCPPCP  (SEQ ID NO:263；hIgG1外加脯氨酸v1)
EPKSCPPPCPPCP    (SEQ ID NO:264；hIgG1外加脯氨酸v2)
EPKSCPPCPCPPCP   (SEQ ID NO:265；hIgG1样双核心)。
可用于TFcA中的铰链还可以包括小鼠铰链序列，例如mIgG1和mIgG2序列，及其杂合物。示例性mIgG1/mIgG2A铰链包含aa序列：
VPRDCTIKPCPPCP(SEQ ID NO:267)。
可用于TFcA中的其它铰链包含IgG2铰链或其变体，如包含以下氨基酸顺序之一的变体(图2)：
ERKPCVECPPCP    (SEQ ID NO:268；hIgG2C232P)
ERKCPVECPPCP    (SEQ ID NO:269；hIgG2C233P)。
在某些实施方案中，TFcA包含IgA(例如IgA2)铰链或其变体。示例性IgA2铰链变体包括了包含以下aa序列之一的变体(图2)：
EPKSCPCPPPPPCCP   (SEQ ID NO:271；hIgA2经修饰v1)
EPKSCPCPPPPCCP    (SEQ ID NO:272；hIgA2经修饰v2)
EPKSCPVPPPPPCCP   (SEQ ID NO:273；hIgA2经修饰v3)。
其它变化(例如aa修饰)也可以引入铰链中。举例来说，可以在IgG4的中铰链中进行取代S228P以稳定两个包含IgG4中铰链的Fc区之间的相互作用。
在Fab域中包含IgG2序列的TFcA可以在Fab域的重链部分中包含突变C129S，所述突变为正常情况下连接重链与轻链的半胱氨酸的突变。所述突变将促使轻链半胱氨酸与重链C232之间形成二硫键，且C233将与相邻铰链的C233(除CPPCP基元中的两个二硫化物以外)配对。
在某些实施方案中，使用以下变异铰链：PRDCGCKPCICT(SEQ IDNO:248)、PKSCGCKPCICT(SEQ ID NO:249)、PKSCGCKPCICP(SEQ IDNO:250)、PRDCGCKPCPPCP(SEQ ID NO:251)、PRDCGCHTCPPCP(SEQ IDNO:252)、PKSCDCHCPPCP(SEQ ID NO:253)以及RKCCVECPPCP(SEQ IDNO:254)。
在某些实施方案中，TFcBA不包含第一铰链或第二铰链。举例来说，代替第一铰链，TFcBA可以包含连接第一结合位点与第一CH2域的连接性接头。所述接头可以是如本文在TFc接头内容中进一步描述的Gly-Ser接头。在某些实施方案中，连接性接头包含(G4S)2或(G4S)3或(G4S)4序列。其它肽序列也可以用作连接性接头，条件是它们能提供接头的某些部分的所需可挠性和刚性。在某些实施方案中，TFcBA不包含第二铰链，而是包含连接性接头，所述连接性接头可以是与TFc接头相似的Gly-Ser接头。
示例性CH2域
在某些实施方案中，Fc区包含CH2域。CH2域可以来自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或来自于其组合(“杂合”CH2域)。示例性全长野生型IgG1CH2域由以下aa序列组成：
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKENWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：261).
具有N297Q取代以减弱该残基处的糖基化，使得该变体在表达于哺乳动物细胞中时实质上经去糖基化的示例性全长IgG1CH2域由以下氨基酸顺序组成：
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：25).
示例性全长野生型IgG4CH2域包含以下aa序列：
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTTSKAK(SEQ ID NO：262).
具有T299K取代以减弱残基297处的糖基化，使得该变体在表达于哺乳动物细胞中时实质上经去糖基化的示例性全长IgG4CH2域由以下氨基酸顺序组成：
GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSKYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：26).
CH2域所包含的aa序列还可以与IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的aa序列在一个或多个aa修饰(例如aa缺失、添加或取代)方面不同。在某些实施方案中，CH2域所包含的aa序列与天然存在的(或野生型)CH2域(例如SEQ IDNO:261和262)或与SEQ ID NO:25或26的aa序列在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个aa方面不同。在某些实施方案中，CH2域所包含的aa序列与天然存在的CH2域(例如SEQ ID NO:261和262)或SEQID NO:25或26的aa序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或相似性。示例性修饰包括能减弱或去除aa297处的糖基化的其它修饰。修饰一般可以包含EU297-299位(aa基元NXT)中任一处的氨基酸取代，以使得变体在表达于哺乳动物细胞中时实质上经去糖基化。除T299K以外，可在aa299处进行以减弱aa297处的糖基化的其它取代包括T299S、T299A、T299N、T299G、T299Y、T299C、T299H、T299E、T299D、T299R、T299G、T299I、T299L、T299M、T299F、T299P、T299W以及T299V，如例如WO/2005/018572中所描述。
其它aa变化可能影响抗体效应因子功能(例如ADCC和CDC)或稳定性或其它所希望的抗体特征。举例来说，FcγRI与IgG1Fc区结合可以通过修饰Leu235和/或Gly237来调节。与C1q结合以实现CDC可以利用取代Ala330和/或Pro331来调节。可对CH2域进行以调节效应因子功能的其它修饰包括234到238、253、279、310、318、320以及322位的一个或多个aa取代。
示例性CH3域
在某些实施方案中，TFcA(例如TFcBA)的第一Fc区和/或第二Fc区包含CH3域。CH3域可以来自于人类免疫球蛋白，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或来自于其组合(“杂合”CH3域)。示例性全长野生型IgG1CH3域包含以下aa序列：
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLVKFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：27).
在某些实施方案中，可以使用SEQ ID NO:27的变异形式。举例来说，CH3域的C末端赖氨酸可以缺失(参见图3中的SEQ ID NO:28)。在其它实施方案中，CH3域包含aa取代D356E和L358M，且C末端赖氨酸可能存在或不存在(分别为SEQ ID No:29和30，且示于图3中)。
在某些实施方案中，TFcA的第一CH3域和/或第二CH3域经过修饰以增强分别包含第一CH3域与第二CH3域的第一Fc与第二Fc之间的缔合。所述CH3修饰在本文中称为缔合增强修饰(“AEM”)。如实施例中进一步描述，已意外发现添加接合Ab的两个Fc区的TFc接头进一步提高了具有AEM的Ab适当地组装并且提高其稳定性的能力。
可使用的示例性AEM修饰为产生“钮入孔”且描述于例如美国专利第7,183,076号中的修饰。在这种策略中，CH3域经过工程改造而产生一个凸出的“钮”或“隆突”，且其它CH3域经过工程改造而产生互补的“孔”，从而促成CH3域的缔合。对产生“孔”的CH3域的示例性aa修饰为aa取代T366S、L368A以及Y407V的组合(例如在SEQ ID NO:31-34中；图3)。具有“孔”的所述CH3域将与具有“钮”或“隆突”的CH3域，例如包含氨基酸取代T366W的CH3域(例如在SEQ ID NO:35-38中；图3)顺利地二聚。所述一对钮/孔突变在本文中称为“AEM模块1”或“AEM1”，其中第一CH3域和第二CH3域分别称为“AEM1.1”和“AEM1.2”。
在另一个实施方案中，TFcA的两个CH3域之一包含由取代Y407T产生的孔(例如在SEQ ID NO:39-42中；图3)，而另一个CH3域包含由取代T366Y产生的钮(例如在SEQ ID NO:43-46中；图3)。这第二对钮/孔突变在本文中称为“AEM模块2”或“AEM2”，其中第一CH3域和第二CH3域分别称为“AEM2.1”和“AEM2.2”。
两个CH3域之间的缔合还可以通过除产生典型钮/孔以外的机制来增强，例如通过静电修饰。在一个实施方案中，TFcA的两个CH3域之一包含取代S364H与F405A的组合(例如在SEQ ID NO:47-50中；图3)，而另一个CH3域包含取代Y349T与T394F的组合(例如在SEQ ID NO:51-54中；图3)。这第三对修饰在本文中称为“AEM模块3”或“AEM3”，其中第一CH3域和第二CH3域分别称为“AEM3.1”和“AEM3.2”。
在一个实施方案中，TFcA的两个CH3域之一包含取代K370D、K392D以及K409D的组合(例如在SEQ ID NO:55-58中；图3)，而另一个CH3域包含取代E(或D)356K、E357K以及D399K的组合(例如在SEQ ID NO:59-62中；图3)。这第四对修饰在本文中称为“AEM模块4”或“AEM4”，其中第一CH3域和第二CH3域分别称为“AEM4.1”和“AEM4.2”。356位的aa可以是E或D，取决于所使用的序列，且因此，该位置的取代称为“E(或D)356”。
在某些实施方案中，TFcA的第一CH3域和/或第二CH3域包含一个或多个aa修饰，导致添加一个或多个半胱氨酸，从而允许在两个CH3域或Fc域之间形成一个或多个二硫键。在一个实施方案中，TFcA的两个CH3域之一包含取代Y349C(例如在SEQ ID NO:63-66中；图3)，而另一个CH3域包含取代S354C(例如在SEQ ID NO:67-70中；图3)。所述一对二硫化物形成修饰在本文中称为“DiS模块1”或“DiS1”，其中第一CH3域和第二CH3域分别称为“DiS1.1”和“DiS1.2”。
在其它实施方案中，半胱氨酸被添加到TFcA的两个CH3域各自的C末端，从而在两个CH3域之间形成二硫键。举例来说，两个CH3域之一可以包含用“KSCDKT”取代羧基末端aa“PGK”(例如在SEQ ID NO:71-72中；图3)，而另一个CH3域可以包含用“GEC”取代羧基末端aa“PGK”(例如在SEQ IDNO:73-74中；图3)。
在某些实施方案中，CH3域包含两个或更多个aa变化的组合。举例来说，一个或多个AEM可以与一个或多个DiS修饰组合。在示例性实施方案中，CH3域包含孔突变T366S、L368A、Y407V以及二硫键产生突变Y349C(AEM1.1+DiS1.1)。所述CH3域可以与包含钮突变T366W和二硫键产生突变S354C的CH3域组合在TFc中(AEM1.2+DiS1.2)。包含这种取代组合的示例性aa序列包括SEQ ID NO:75-82(图3)。
在CH3域中进行的用于促成包含这些修饰的CH3域或Fc区缔合的AEM与DiS的示例性组合示出于表5中，其中“是”表明组合可以使用。
表5：AEM与DiS修饰的示例性组合
Figure BDA0000489467110000521
Figure BDA0000489467110000531
*对于在356位具有E的序列(例如SEQ ID NO:29和30)，这个突变是E356K。
具有AEM和/或DiS的示例性IgG1CH3域的aa序列包含SEQ IDNO:31-98。这些aa序列的比对提供于图3中，且这些序列的描述提供于表6中。表6和图3中的CH3域是根据其AEM模块(编号1、2、3或4)及其DiS模块(编号1或2)加以组织。相容性CH3域被列出为模块编号后缀以“1”和“2”。
表6：具有AEM和/或DiS的IgG1CH3域的SEQ ID NO
Figure BDA0000489467110000532
Figure BDA0000489467110000541
*对于在356位具有E的序列(例如SEQ ID NO:29和30)，这个突变是E356K。
可用于TFcA中的其它CH3AEM包括以下aa修饰配对，其中对AEM修饰配对中的第一成员和第二成员的取代由“和”隔开：
1)F405A和T394F；S364D和Y349K；S364E和L368K；S364E Y349K；S364F和K370G；S364H和Y349K；S364H和Y349T；S364Y和K370G；T411K和K370E；V397S/F405A和T394F；K370R/T411K和K370E/T411E；L351E/S364D和Y349K/L351K；L351E/S364E和Y349K/L351K；L351E/T366D和L351K/T366K；P395T/V397S/F405A和T394F；S364D/K370G和S364Y/K370R；S364D/T394F和Y349K/F405A；S364E/F405A和Y349K/T394F；S364E/F405S和Y349K/T394Y；S364E/T411E和Y349K/D401K；S364H/D401K和Y349T/T411E；S364H/T394F和Y349T/F405A；Y349C/S364E和Y349K/S354C；L351E/S364D/F405A和Y349K/L351K/T394F；L351K/S364H/D401K和Y349T/L351E/T411E；S364E/T411E/F405A和Y349K/T394F/D401K；S364H/D401K/F405A和Y349T/T394F/T411E；S364H/F405A/T411E和Y349T/T394F/D401K(WO2011/028952)。
2)T366W和Y407Α；T366W和T366S；L368Α和Y407Υ；K409E和D399K；K409E和D399R；and K409D和D399K；K409D和D399R；K392E和D399R；K392E和D399K；K392D和D399R；以及K392D和D399R(WO2009/089004)。
3)T366W和Y407A；F405A和T394W；Y407T和T366Y；T366Y/F405A和T394W/Y407T；T366W/F405W和T394S/Y407A；F405W/Y407A和T366W/T394S；以及F405W和T394S(美国专利第7,642,228号)。
一般来说，可以使用本领域中所描述的任何其它AEM或DiS。
CH3域所包含的aa序列还可以与本文中所提供的CH3aa序列，例如SEQID NO:27-98在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30个aa方面不同。在某些实施方案中，CH3域所包含的aa序列与本文中所提供的CH3aa序列，例如SEQ ID NO:27-98具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性。因为若干种抗体效应因子功能(例如ADCC和CDC)至少部分是由CH3域中的多个区域介导，所以可对CH3域进行的aa变化包括了影响Fc区的效应因子功能的变化。本文中进一步描述可对CH3域进行的示例性修饰。
示例性Fc区
TFcA的Fc区包含铰链、CH2域、CH3域以及CH4域中的一个或多个，所述Fc区可以是全长Fc区或者不是，并且可以是野生型Fc区或具有aa修饰。Fc域可以来自于人类免疫球蛋白(“Ig”)或非人类Ig，例如小鼠Ig，并且可以来自于Ig的任何类型或同型，如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4)或IgA(例如IgA1和IgA2)。
在某些实施方案中，TFcA包含包括来自于人类免疫球蛋白(例如IgG1)的第一Fc区和/或第二Fc区的TFc。Fc区优选按连续氨基到羧基末端的顺序包含：IgG1铰链或其部分(例如核心铰链和下铰链)、IgG1CH2域以及IgG1CH3域。Fc区可以包含本文中所示出的IgG1铰链(或其部分)、IgG1CH2域以及IgG1CH3域的任何组合，条件是所述TFcA具有所希望的活性和稳定性。
在某些实施方案中，TFc包含呈杂合Fc区形式的第一Fc区和/或第二Fc区。杂合Fc区可以包含来自于两个或更多个IgG子类(IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4)的Fc域。在一个实施方案中，杂合Fc区按连续氨基到羧基末端的顺序包含：IgG1上铰链、IgG4中铰链以及下铰链、IgG4CH2域以及IgG1CH3域。示例性IgG1/IgG4杂合Fc区可以包含本文中所示出的IgG1上铰链、IgG4核心铰链、IgG4下铰链、IgG4CH2域以及IgG1CH3域的任何组合，条件是包含所述TFc的TFcA具有所希望的活性和稳定性。
在某些实施方案中，Fc区不包含全长铰链。举例来说，TFcBA可以包含包括全长铰链的第一Fc区和包含由核心铰链和/或下铰链组成且不包含上铰链的铰链的第二Fc区。
在某些实施方案中，TFc所包含的铰链已经过修饰而包含半胱氨酸以便与另一个Fc区中的另一个半胱氨酸形成二硫键，从而稳定所述TFc。在一个实施方案中，IgG1铰链包含取代H224C和T225C(例如，SEQ ID NO:18；图2)。在另一个实施方案中，铰链包含取代T223C(例如SEQ ID NO:19；图2)。
在一个实施方案中，TFcA包含有按氨基到羧基末端的顺序包含以下各物的IgG1TFc：i)从由以下各项中所示出的aa序列组成的铰链群组中选出的IgG1铰链：SEQ ID NO:4(全长IgG1铰链)、SEQ ID NO:18(具有H224C/T225C的SEQ ID NO:4)、SEQ ID NO:19(具有T223C的SEQ ID NO:4)以及SEQ IDNO:23(仅中IgG1铰链和下IgG1铰链)；ii)包含SEQ ID NO:261或25的IgG1CH2域；以及iii)包含从由SEQ ID NO:31-98中所示出的aa序列组成的CH3域群组中选出的aa序列的CH3域(图3)。在另一个实施方案中，TFcA包含有按氨基到羧基末端的顺序包含以下各物的IgG1/IgG4杂合TFc：i)从由以下各项中所示出的aa序列组成的铰链群组中选出的铰链：SEQ ID NO:20(IgG1上铰链及IgG4核心铰链和下铰链)、SEQ ID NO:21(具有H224C/T225C的SEQID NO:20)、SEQ ID NO:22(具有T223C的SEQ ID NO:20)以及SEQ IDNO:24(仅中IgG4铰链和下IgG4铰链)；ii)包含SEQ ID NO:262或26的IgG4CH2域；以及iii)包含从由aa序列SEQ ID NO:31-98组成的CH3域群组中选出的aa序列的CH3域(图3)。铰链和CH3域的示例性组合示出于表7中，其中“是”表明组合可以使用，且其中相容性修饰与其它修饰由空行隔开。
表7：用于形成Fc区的铰链和CH3域的示例性组合
Figure BDA0000489467110000571
Figure BDA0000489467110000581
在一个实施方案中，TFcA包含包括IgG1Fc区的TFc，所述IgG1Fc区包含包括SEQ ID NO:4的铰链、包含SEQ ID NO:25的CH2域以及包含SEQID NO:29的CH3域，且可以形成例如包含SEQ ID NO:99的IgG1Fc区(参见表8和图4)。IgG1铰链、IgG1CH2域及IgG1CH3域的其它组合以及由所述组合产生的示例性IgG1Fc提供于表8中。表8中所列出的示例性IgG1Fc的aa序列(SEQ ID NO:99-132)提供于图4中。表8中的相容性IgG1Fc与其它IgG1Fc由空行隔开。
表8：形成示例性IgG1Fc的IgG1铰链、CH2域以及CH3域的示例性组合的SEQ ID NO
IgG1铰链 IgG1CH2 IgG1CH3 IGG1Fc
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：29 SEQ IDNO：99
SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：29 SEQ IDNO：100
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：101
SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：37 SEQ ID NO：102
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：37 SEQ ID NO：103
SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：33 SEQ ID NO：104
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：77 SEQ IDNO：105
SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：81 SEQ ID NO：106
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：81 SEQ ID NO：107
SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：77 SEQ ID NO：108
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：41 SEQ ID NO：109
SEQ ID NO：23 SEQ ID NO：25 SEQ ID NO：45 SEQ ID NO：110
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在一个实施方案中，TFcA包含包括IgG1/IgG4Fc区的TFc，所述IgG1/IgG4Fc区包含包括SEQ ID NO:20的铰链、包含SEQ ID NO:26的CH2域以及包含SEQ ID NO:29的CH3域，且可以形成例如包含SEQ ID NO:133的IgG1/IgG4杂合Fc区(参见表9和图4)。IgG1/IgG4铰链、IgG4CH2域及IgG1CH3域的其它组合以及由所述组合产生的示例性IgG1/IgG4杂合Fc提供于表9中。表9中所列出的示例性IgG1/IgG4杂合Fc的aa序列(SEQ IDNO:133-166)提供于图5中。表9中的相容性IgG1Fc与其它IgG1Fc由空行隔开。
表9：形成示例性IgG1/IgG4杂合Fc的IgG1/IgG4铰链、CH2域以及CH3域的示例性组合
铰链 IgG4CH2 IgG1CH3 IgG1/IgG4Fc
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用于TFcA中的Fc区所包含的aa序列还可以与本文中所描述的aa序列，例如SEQ ID NO:99-166在一个或多个aa修饰(例如aa缺失、添加或取代)方面不同。在某些实施方案中，Fc区所包含的aa序列与本文中所示出的序列，例如与从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的序列在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个aa方面不同。在某些实施方案中，Fc区所包含的aa序列与本文中所示出的序列，例如从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性。举例来说，由从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的序列组成的Fc区的CH3域可以包含C末端赖氨酸缺失和/或E356D和/或M358L。因为若干种抗体效应因子功能(例如ADCC和CDC)是由Fc区介导，所以可对Fc区进行的aa变化包括了影响Fc区的效应因子功能的变化。本文中阐述了这些域的示例性突变。这些aa修饰中的任一者都是允许的，条件是所述Fc区保留所希望的性质，例如生物学活性、稳定性以及低免疫原性。
影响效应因子活性的示例性Fc修饰
TFcA可以包含包括影响Fc区效应因子活性的aa修饰的TFc。以下阐述示例性aa修饰。
置换Fc部分中的aa残基以改变抗体效应因子功能在本领域中是已知的(参见例如美国专利第5,648,260号和第5,624,821号)。抗体的Fc部分介导若干种重要效应因子功能，例如细胞因子诱导、抗体依赖性细胞毒性(“ADCC”)、吞噬作用、互补依赖性细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原抗体复合物的半衰期/清除率。在一些情况下，这些效应因子功能对于治疗性抗体为理想的，但在其它情况下可能为不必要的或甚至为有害的，取决于治疗目标。某些人类IgG同型，特别是IgGl和IgG3，分别经由结合FcγR和补体CIq来介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。
在一个实施方案中，TFcA保留一种或多种且优选保留所有以下属性：在人类中由与激活性FcγRI、FcγRIIa/c、FcγRIIIa以及抑制性FcγRIIb受体的相互作用决定的ADCC和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；由结合补体系统组分的抗体触发的CDC；以及经由新生Fc受体(FcRn)的活性再循环介导的长半衰期。当需要时，可以协调所有这些功能以使抗癌疗法的效果最佳化。
可以对免疫球蛋白恒定区进行某些aa修饰，例如一个或多个aa添加、缺失和/或取代，以降低或提高如上文所示出的那些恒定域的天然生物学活性。
在某些实施方案中，TFcA(例如TFcBA)在Fc区中包含可改变所述域的一种或多种抗原非依赖性效应因子功能(例如，包含所述域的蛋白质的循环半衰期)的aa修饰(例如aa取代、添加或缺失)。当与缺乏所述aa变化的抗体相比时，示例性抗体展现出增加或减少的FcRn结合，且因此分别具有增加或减少的血清半衰期。预期包含对FcRn的亲和力有所提高的Fc变体的抗体具有较长血清半衰期，而预计包含FcRn结合亲和力有所降低的Fc变体的抗体具有较短半衰期。在一个实施方案中，FcRn结合有所改变的TFcA包含至少一个在Fc区的“FcRn结合环”内具有一个或多个aa变化的Fc区。FcRn结合环由野生型全长Fc的aa残基280-299(EU)构成。在某些实施方案中，FcRn结合亲和力有所改变的TFcA包含至少一个在
Figure BDA0000489467110000641
FcRn“接触区”内具有一个或多个aa取代的Fc区。术语
Figure BDA0000489467110000642
FcRn“接触区”包括野生型全长Fc域中处于以下位置的残基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424-440(EU)。在某些实施方案中，FcRn结合亲和力有所改变的TFcA包含至少一个在对应于任一个以下EU位置的aa位置具有一个或多个aa变化的Fc区(例如一个或两个Fc部分)：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如N434A或N434K)以及438。国际PCT公开号WO05/047327中公开了改变FcRn结合活性的示例性aa变化。
能增强FcRn结合的其它Fc修饰包括259位、308位、428位以及434位处的取代，例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y、434M、428L/434S、259I/308F以及259I/308F/428L。增加Fc与FcRn结合的其它变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216；Hinton等2006Journal of Immunology176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等,Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604，以全文引用的方式并入)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等,Journal of Immunology,2002,169:5171-5180；Dall'Acqua等,2006,Journal of Biological Chemistry281:23514-23524，以全文引用的方式并入)。Yeung等,2010,J Immunol,182:7663-7671中描述了用于调节FcRn结合的其它修饰。
在一些实施方案中，TFcA包含有例如与野生型Fc区相比包含能改变多肽的抗原依赖性效应因子功能(确切地讲，ADCC或补体激活)的aa变化的Fc变体。在示例性实施方案中，所述抗体展现出与Fcγ受体(例如CD16)的结合有所改变。当与野生型多肽相比时，所述抗体展现出与FcγR的结合有所增加或降低，且因此分别介导增强或减弱的效应因子功能。预期对FcγR的亲和力有所提高的Fc变体将增强效应因子功能，且所述蛋白质可能在治疗哺乳动物的方法(其中需要进行标靶分子破坏)中，例如在肿瘤疗法中具有有用的应用。相比之下，预计FcγR结合亲和力有所降低的Fc变体会减弱效应因子功能。在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的TFcA相比，TFcA包含至少一种有所改变的抗原依赖性效应因子功能，所述抗原依赖性效应因子功能是从由以下各项组成的群组中选出：调理作用、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性、抗原依赖性细胞毒性(ADCC)或效应细胞调节。
在某些实施方案中，TFcA对激活性FcγR(例如FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa)展现出有所改变的结合。在某些实施方案中，TFcA对抑制性FcγR(例如FcγRIIb)展现出有所改变的结合亲和力。在其它实施方案中，FcγR结合亲和力有所增加(例如FcγRIIIa结合亲和力有所增加)的TFcA包含至少一个在对应于一个或多个以下位置的aa位置处具有aa变化的Fc域：239、268、298、332、334以及378(EU)。在某些实施方案中，FcγR结合亲和力有所降低(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIIIa结合亲和力有所降低)的TFcA包含至少一个在对应于一个或多个以下位置的aa位置具有aa取代的Fc域：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378以及435(EU)。
在某些实施方案中，补体结合亲和力有所增加(例如C1q结合亲和力有所增加的TFcA)包含在对应于一个或多个以下位置的aa位置具有aa变化的Fc域：251、334、378以及435(EU)。在某些实施方案中，补体结合亲和力有所降低(例如C1q结合亲和力有所降低的TFcA)包含在对应于一个或多个以下位置的aa位置具有aa取代的Fc域：239、294、296、301、328、333以及376(EU)。国际PCT公开号WO05/063815中公开了改变FcγR或补体结合活性的示例性aa变化。在某些实施方案中，TFcA可以包含一个或多个以下特定Fc区取代：S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A以及N434K(EU)。
与FcγR和/或补体的结合有所减弱的其它Fc变体包括有包含一个或多个以下aa取代的变体：34G、235G、236R、237K、267R、269R、325L、328R、236R/328R、297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P以及234V。去除297位的糖基化(参见下文)也减弱与FcyR的结合。
能改善与FcγR和/或补体的结合的Fc修饰包括有包含一个或多个以下aa取代的变体：236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D以及332E。优选变体包括但不限于239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T以及267E/268F/324T。用于增强FcγR与补体相互作用的其它修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I以及396L。
能改善与FcγRllb的结合的变体包括有包含一个或多个以下aa取代的变体：234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y以及332E、235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E以及267E/328F。
Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology20:685-691中描述了调节Fc的Fc修饰。
TFcA还可以包含能改变TFcA的糖基化的aa取代。举例来说，TFcA的免疫球蛋白恒定区可以包含具有能减弱糖基化(例如N或O连接糖基化)的突变的Fc域，或可以包含野生型Fc域的经过改变的糖型(例如低岩藻糖或无岩藻糖聚糖)。“经过工程改造的糖型”是指共价连接至Fc区的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组合物在化学性质上不同于亲本Fc区。经过工程改造的糖型可用于多种目的，包括但不限于增强或减弱效应因子功能。经过工程改造的糖型可以通过本领域中已知的多种方法(US6,602,684；美国专利公开号2010-0255013；美国专利公开号2003-0003097；WO00/61739A1；WO01/29246A1；WO02/31140A1；WO02/30954A1)、PotelligentTM技术(新泽西州普林斯顿的Biowa,Inc.)以及GlycoMAbTM糖基化工程改造技术(瑞士苏黎士的Glycart Biotechnology AG)来产生。这些技术中有许多是基于控制共价连接至Fc区的岩藻糖基化和/或平分型低聚糖的水平，例如通过在经过工程改造或未经工程改造的各种生物体或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达Fc多肽，通过调节参与糖基化途径的酶(例如FUT8[a1,6-岩藻糖基转移酶]和/或31,4-N-乙酰葡糖胺转移酶III[GnTI11])，或通过在Fc多肽已经得以表达后修饰碳水化合物。
在示例性实施方案中，aa变化(例如aa取代)所产生的Fc区包含有所减弱的N连接聚糖糖基化(正常在aa297位(EU)处发现)。Fc区还可以在aa297位(EU)包含低岩藻糖或无岩藻糖聚糖。在某些实施方案中，TFcA在糖基化基元(例如含有aa序列NXT或NXS的N连接糖基化基元)附近或内部具有aa取代。在一个具体实施方案中，TFcA在对应于Fc297或299(EU)的aa位置包含aa取代，如本文中进一步描述。国际PCT公开号WO05/018572和美国专利公开号2007/0111281中公开了减弱或改变糖基化的示例性aa取代。
在其它实施方案中，TFcA所包含的至少一个Fc域具有一个或多个位于溶剂暴露表面的经过工程改造的半胱氨酸残基或其类似物。优选经过工程改造的半胱氨酸残基或其类似物不干扰所希望的TFcA生物学活性。举例来说，可能需要所述变化不干扰Fc结合Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)或补体蛋白(例如C1q)或触发免疫效应因子功能(例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、吞噬作用或CDC)的能力。在某些实施方案中，TFcA所包含的Fc域包含至少一个实质上不以二硫键结合第二半胱氨酸残基的经过工程改造的游离半胱氨酸残基或其类似物。TFcA所包含的Fc区可以在CH3域中的一个或多个以下位置具有经过工程改造的半胱氨酸残基或其类似物：349-371、390、392、394-423、441-446以及446b(EU)，且更具体地为位置350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443以及EU位置446b。
所希望的效应因子功能还可以通过从特定免疫球蛋白类别或子类中选择Fc或通过组合来自于特定免疫球蛋白类别或子类(例如IgG1、IgG2等)的特定区域来获得。举例来说，因为ADCC和CDC(分别经由IgG结合FcγR和C1q)是由位于铰链和CH2域中的残基介导，且因为IgG4本质上缺乏效应因子功能，所以通过组合IgG4的铰链和CH2域与IgG1的CH3域而构建的Fc具有大大减弱的效应因子功能。lgG1/lgG3杂合变体可以通过用来自于两种同型有所不同的位置处的lgG3的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的lgG1位置来构建。因而，所构建的杂合变异IgG抗体可以包含一个或多个以下取代：274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R以及436F。在某些实施方案中，lgG1/lgG2杂合变体可以通过用来自于两种同型有所不同的位置处的lgG1的氨基酸取代CH2和/或CH3区中的lgG2位置来构建。因而，所构建的杂合变异IgG抗体可以包含一个或多个以下氨基酸取代：233E、234L、235L、-236G(是指236位的甘氨酸插入)以及327A。
示例性TFc接头
TFcA所包含的TFc可以包含经由TFc接头连接至第二Fc区的第一Fc区。可以使用多种接头，条件是它们的可挠性足以允许适当折叠TFc和包含所述TFc的TFcA。在某些实施方案中，接头在生物学上是惰性的，例如，主要是不能诱导生物反应，例如免疫反应。
TFc接头可以是1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或至少90-100个aa长。TFc接头的大小可以取决于第二Fc区是包含铰链、其部分还是完全不包含铰链。举例来说，当第二Fc区包含铰链时，可以使用的TFc接头比当第二Fc区不包含铰链时短。举例来说，当第二Fc区不包含铰链时，TFc接头的长度可能多出对应于铰链长度的aa数目。当第二Fc区不包含上铰链时，TFc接头的长度可能多出对应于上铰链的aa数目。在一个优选实施方案中，TFcA(例如TFcA)所包含的第二铰链由中铰链和下铰链组成，且所包含的TFc接头包含35到45个aa，如37到43个aa，如38到42个aa，如39到41个aa，且更确切地包含40个aa。
TFc接头可以包含Gly-Ser接头。“Gly-Ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性Gly-Ser接头包含具有式(Gly4Ser)n的aa序列，其中n是正整数(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)。举例来说，在某些实施方案中，TFc接头包含以下或由以下组成：(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)5或(Gly4Ser)6或(Gly4Ser)7或(Gly4Ser)8。在一个优选实施方案中，TFc接头是(Gly4Ser)8。
可以使用的其它接头包括有包含Gly和Ser但不呈(G4S)n结构的接头。举例来说，接头可以包含(Gly-Gly-Ser)n或(Gly-Ser-Gly-Ser)n，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大。其它接头可以包含Pro或Thr。合适的接头可以在http://partsregistry.org/Protein_domains/Linker的《标准生物零件登记册》(Registry of Standard Biological Parts)中获得(还参见例如Crasto CJ和Feng JA.LINKER:a program to generate linker sequencesfor fusion proteins.Protein Eng2000年5月;13(5)309-12；及George RA和Heringa J.An analysis of protein domain linkers:their classification and role inprotein folding.Protein Eng2002年11月;15(11)871-9)。
在某些实施方案中，TFc接头包含以下aa序列：
TRPAPPSTATTAGSTPQPESASPSGKEPAASSPSSTNTGS(SEQ IDNO:169)。
还可以使用所包含的aa序列在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个aa方面与SEQ ID NO:169或(G4S)n序列不同的TFc接头。
TFc接头还可以是非肽接头，如非肽聚合物。术语“非肽聚合物”是指包括两个或更多个由除肽键以外的共价键彼此连接的重复单元的生物相容性聚合物。非肽聚合物的实例包括聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚醚型多元醇、聚乙烯醇、多糖、右旋糖酐、聚乙烯醚、如聚(乳酸)(PLA)和聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)等生物可降解聚合物、脂质聚合物、甲壳素以及透明质酸，最优选的是聚(乙二醇)(PEG)。
示例性TFc
TFcA所包含的TFc可以包含经由TFc接头连接至第二Fc区的第一Fc区。在某些实施方案中，TFc包含彼此一致的第一Fc区和第二Fc区。在其它实施方案中，第一Fc区和第二Fc区在至少一个aa方面彼此不同(“异聚型TFc”)。第一Fc区和第二Fc区可以是本文中公开的任何Fc区或其变化形式。举例来说，TFc可以包含包括全长铰链(例如全长IgG1或IgG1/IgG4杂合铰链)的第一Fc区和包含部分铰链(例如缺乏上铰链的铰链)的第二Fc区。
第一Fc区和第二Fc区可以与本文中所描述的任何TFc接头组合。如上文所阐述，一般来说TFc接头的长度可以取决于第二Fc区是包含铰链、其部分还是完全不包含铰链。
在某些实施方案中，IgG1TFc包含包括SEQ ID NO:99的第一Fc区和包含SEQ ID NO:100的第二Fc区。表10中阐述可用于IgG1TFc中的第一Fc区与第二Fc区的组合。
表10：供用于IgG1TFc的第一Fc区与第二Fc区的示例性组合(示于图4中)
第一Fc区 第二Fc区
SEQ ID NO:99 SEQ ID NO:100
SEQ ID NO:101 SEQ ID NO:102
SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:104
SEQ ID NO:105 SEQ ID NO:106
SEQ ID NO:107 SEQ ID NO:108
SEQ ID NO:109 SEQ ID NO:110
SEQ ID NO:111 SEQ ID NO:112
SEQ ID NO:113 SEQ ID NO:114
SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:116
SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:118
SEQ ID NO:119 SEQ ID NO:120
SEQ ID NO:121 SEQ ID NO:122
SEQ ID NO:123 SEQ ID NO:124
SEQ ID NO:125 SEQ ID NO:126
SEQ ID NO:127 SEQ ID NO:128
SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:130
SEQ ID NO:131 SEQ ID NO:132
在某些实施方案中，IgG1/IgG4杂合TFc包含包括SEQ ID NO:133的第一Fc区和包含SEQ ID NO:134的第二Fc区。表11中阐述可用于IgG1/IgG4杂合TFc中的第一Fc区与第二Fc区的组合。
表11：供用于IgG1/IgG4TFc的第一Fc区与第二Fc区的示例性组合(示于图5中)
第一Fc区 第二Fc区
SEQ ID NO:133 SEQ ID NO:134
SEQ ID NO:135 SEQ ID NO:136
SEQ ID NO:137 SEQ ID NO:138
SEQ ID NO:139 SEQ ID NO:140
SEQ ID NO:141 SEQ ID NO:142
SEQ ID NO:143 SEQ ID NO:144
SEQ ID NO:145 SEQ ID NO:146
SEQ ID NO:147 SEQ ID NO:148
SEQ ID NO:149 SEQ ID NO:150
SEQ ID NO:151 SEQ ID NO:152
SEQ ID NO:153 SEQ ID NO:154
SEQ ID NO:155 SEQ ID NO:156
SEQ ID NO:157 SEQ ID NO:158
SEQ ID NO:159 SEQ ID NO:160
SEQ ID NO:161 SEQ ID NO:162
SEQ ID NO:163 SEQ ID NO:164
SEQ ID NO:165 SEQ ID NO:166
TFc可以包含表10或11中所示出的两个Fc的组合，这两个Fc由TFc接头连接在一起以形成按氨基到羧基末端的顺序包含以下的连续多肽：第一Fc区，所述第一Fc区在其C末端连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端连接至第二Fc区的N末端。所述TFc接头可以包含20到50个氨基酸长度或由其组成。
示例性TFc可以包含：i)第一Fc区，其包含包括SEQ ID NO:4的铰链、包含SEQ ID NO:25的CH2域、包含SEQ ID NO:33的CH3域；ii)TFc接头，其包含(G4S)8；以及iii)第二Fc区，其包含包括SEQ ID NO:23的铰链、包含SEQ ID NO:25的CH2域以及包含SEQ ID NO:37的CH3域。包含此元件集合的示例性IgG1TFc为包含SEQ ID NO:171的TFc。表12和13中分别提供了形成IgG1和IgG1/IgG4杂合TFc的域或元件的其它组合。表12和13中的各元件或域提到了其SEQ ID NO和其所包含的特定AEM和/或DiS。表12和13中的各域或元件可以直接或间接地连接。
表12中所列出的各TFc的aa序列(SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193以及195)提供于图6中。表13中所提供的各TFc的aa序列(SEQ ID NO:197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221)提供于图7中。表12和13的第一列中列出了包含该表格相应行中所列出的元件的示例性TFc的名称和SEQ ID NO。
表12：图6中所示出的IgG1TFc
Figure BDA0000489467110000711
Figure BDA0000489467110000721
表13：图7中所示出的IgG1/IgG4杂合TFc
Figure BDA0000489467110000732
Figure BDA0000489467110000741
在某些实施方案中，TFc所包含的aa序列与本文中所描述的TFc的aa序列，例如从由SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221组成的群组中选出的aa序列在至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或300个aa方面不同，条件是所述TFc具有所希望的生物学活性，如效应因子功能或其缺乏、适当折叠、充足稳定性和溶解度。不同之处可能在于一个或多个aa插入、缺失和/或取代。在某些实施方案中，TFc所包含的aa序列与本文中所描述的TFc的aa序列，例如从由SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221组成的群组中选出的aa序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，条件是包含所述TFc的TFcA具有所希望的生物学活性，如效应因子功能或其缺乏、适当折叠、充足稳定性和/或充足溶解度。
示例性结合位点
TFcA可以是包含单一结合位点的单价TFcA。单一结合位点可以位于TFc的氨基末端或羧基末端。单一结合位点可以是Fab或scFv。当单一结合位点为Fab时，单价TFcA包含包括VH域且任选地包含CH1域的重链及包含VL域且任选地包含CL域的轻链。
TFcA还可以是包含两个结合位点的TFcBA，例如其中各结合位点结合相同或不同的表位或抗原(二价单特异性或双特异性TFcA)。TFcBA的结合位点可以是相同类型或不同类型。举例来说，两个结合位点都可以是TFc，两个结合位点都可以是Fab，一个结合位点可以是Fab且另一个结合位点可以是scFv。还可以使用单域结合位点。Fab一般将包含可以连接至TFcBA重链上的CH1域的VH域和可以连接至该分子轻链上的CL域的VL域。scFv一般将包含连接至scFv接头的VH域，所述scFv接头连接至VL域。
scFv可以由连接性接头连接至TFc。连接性接头可以为约1-5、1-10、1-15、1-20个aa长或更长。连接性接头优选为化学惰性的、非免疫原性的，且具有所要求的可挠性和刚性以允许包含scFv的TFcBA的适当构形。在一个实施方案中，连接性接头包含Gly-Ser序列，例如aa序列(G4S)n，其中n为1、2、3、4或5或更大。在一个实施方案中，连接性接头包含(G4S)2(参见例如图9)。
scFv包含将VH域与VL域连接在一起的scFv接头。scFv接头可以为15-30或20-25个aa长。scFv接头优选为化学惰性的、非免疫原性的，且具有所要求的可挠性和刚性以允许包含scFv的TFcBA的适当构形。在一个实施方案中，scFv接头包含Gly-Ser序列，例如aa序列(G4S)n，其中n为1、2、3、4或5或更大。然而，也可以使用其它序列。在某些实施方案中，scFv接头可以单独包含铰链的一部分或全长铰链，或与其它aa一起，如(G4S)n序列。在某些实施方案中，scFv接头在肽接头(如Gly-Ser接头，例如(G4S)4)上游包含序列“AST”(CH1域的前3个aa)(参见例如图9)。
在某些实施方案中，TFcA不包含第一铰链和/或第二铰链。代替铰链，TFcA可以包含连接性接头。所述接头可以是如本文在TFc接头内容中进一步描述的Gly-Ser接头。示例性连接性接头可以比TFc接头短。在某些实施方案中，连接性接头包含(G4S)3或(G4S)4序列。在某些实施方案中，连接性接头包含铰链的一部分，例如上铰链、中铰链、下铰链或其组合或这些铰链之一的一部分以及另一个肽序列，如(G4S)n序列，其中n为1、2、3、4或5。其它肽序列也可以用作连接性接头，条件是它们能提供接头的某些部分的所需可挠性和刚性。
在某些实施方案中，结合位点是抗原结合位点，如Fab、scFv或单域。示例性TFcA包含一个或多个VH和/或VL CDR，如来自于一个或多个本文中所提供的可变区的CDR。在某些实施方案中，抗c-Met结合位点包含图9中所示出的VHCDR3和/或VLCDR3序列，如人源化抗体5D5可变域(US2006/0134104)或抗c-Met结合位点2的序列(参见实施例3)。在某些实施方案中，抗c-Met结合位点包含图9中所示出的VH域之一的1、2或3个CDR和/或图9中所示出的VL域的1、2或3个CDR。在某些实施方案中，抗EGFR结合位点包含图9中所示出的VHCDR3和/或VLCDR3序列。在某些实施方案中，抗EGFR结合位点包含图9中所示出的VH域之一的1、2或3个CDR和/或图9中所示出的VL域之一的1、2或3个CDR。结合位点还可以包含图9中所示出的一个或多个CDR，其中1、2或3个aa已经改变过，例如经过取代、添加或缺失，条件是所述结合位点仍能够特异性结合其标靶。
在某些实施方案中，TFcA包含图9中所示出的一个或多个可变域。举例来说，抗c-Met结合位点可以包含图9中所示出的VH和/或VL序列，如人源化抗体5D5可变域(US2006/0134104)或抗c-Met结合位点2。示例性抗EGFR结合位点包含图9中所示出的VH和/或VL序列，如帕尼单抗、2224、西妥昔单抗或人源化西妥昔单抗H1L1、H1L2、H2L1或H2L2的序列(参见实施例3)。
在某些实施方案中，抗c-Met/抗EGFR TFcA包含抗c-Met Fab和抗EGFRscFv。表14显示可用于形成TFcA的各以下抗c-Met与抗EGFR aa序列的CDR或可变域的组合。如果本文中提供序列，则该表格提供SEQ ID NO，或如果有可能组合，但未具体提供所得aa序列，则该表格提供“是”。本领域技术人员应能够基于本文中所提供的所述蛋白质的所有元件及其编码核苷酸序列，在不过度实验的情况下产生所述分子。
表14：示例性TFcA的重链
Figure BDA0000489467110000771
可与图14中的重链一起使用的轻链为TFcA中所使用的特定抗c-Met Fab的轻链。举例来说，包含来自于人源化5D5的VH域的TFcA，例如包含SEQID NO:225、227、229、235、239、260、281、283、285以及342中的任一者的TFcA，可以与包含人源化5D5的VL域的轻链(即，SEQ ID NO:231)一起使用。包含来自于抗c-Met结合位点2的VH域的TFcA(例如包含SEQ IDNO:291的TFcA)可以与包含抗c-Met结合位点2的VH域(例如具有SEQ IDNO:289的VL域)的轻链一起使用。
抗原结合位点(例如本文中所描述的抗原结合位点)可以经过工程改造以提高稳定性、降低异质性、提高表达表达、提高溶解度或其它希望有的特征。用于工程改造抗体片段(如scFv、VH、VL以及Fab)以提高稳定性且增加表达的方法描述于例如US2006/0127893、US2009/0048122以及其中的参考文献中。
可变域可以与本文中所示出的可变域在或在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100个aa方面不同，条件是可变区经修饰的结合位点保留其特异性结合其标靶抗原(例如从c-MET、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM以及EphA2中选出的人类抗原)的能力。用于TFcA(例如TFcBA)的可变域所包含的VH或VL aa序列还可以与图9中所示出的VH或VL aa序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，条件是可变域经修饰的结合位点保留其特异性结合其标靶抗原的能力。
抗c-MET和/或抗EGFR TFcBA所包含的结合位点与本文中所提供的结合位点(如具有图9中所示出的序列的结合位点)还可以结合人类c-Met或人类EGFR上的相同表位。本文中所涵盖的结合位点还可以竞争性阻断本文中所描述的结合位点(如具有图9中所示出的序列的结合位点)的结合，或与其竞争。包含与本文中所描述的结合位点竞争结合标靶抗原或表位的结合位点的TFcA包括例如当在参考结合位点之后加入ELISA中时能够置换参考结合位点(例如，如本文中所描述)的结合位点以及当结合位点在参考结合位点之后加入到ELISA中时能防止参考结合位点结合的结合位点。
TFcA还可以包含来自于本领域中已知的抗c-Met、抗c-Kit、抗ErbB2、抗ErbB3、抗ErbB4、抗IGF1R、抗IGF2R、抗胰岛素受体、抗RON、抗VEGFR1、抗VEGFR2、抗TNFR、抗FGFR1、抗FGFR2、抗FGFR3、抗FGFR4、抗PDGFRα、抗PDGFRβ、抗EPCAM、抗EphA2或抗EGFR抗体的可变域。已知的抗c-Met抗体示出于美国专利第5,686,292号、美国专利第7,476,724号、WO2004/072117、WO2004/108766、WO2005/016382、WO2005/063816、WO2006/015371、WO2006/104911、WO2007/126799以及WO2009/007427中。示例性已知抗EGFR抗体包括ABX-EGF(Abgenix)(Yang,X.D.等,Crit.Rev.Oncol./Hematol.38(2001)17-23)和人源化ICR62(WO2006/082515)。示例性抗c-Kit抗体示出于US7915391和EP0586445B1中。示例性抗ErbB2抗体示出于US5821337和US7560111中。示例性抗ErbB3抗体示出于US7705130、US7846440以及WO2011/136911中。示例性抗ErbB4抗体示出于US7332579和US2010/0190964中。示例性抗IGF1R抗体示出于US7871611和US7700742中。示例性抗胰岛素受体抗体示出于Bhaskar V.等,Diabetes.2012年5月;61(5):1263-71。示例性抗RON抗体示出于WO2012/006341、US2009/0226442以及US7947811中。示例性抗VEGFR1抗体示出于WO2005/037235中。示例性抗VEGFR2抗体示出于US8057791和US6344339中。示例性抗TNFR1抗体示出于EP1972637B1和US2008/0008713中。示例性抗FGFR1抗体示出于Ronca R等,Mol Cancer Ther;9(12);3244-53,2010以及WO2005/037235中。示例性抗FGFR2抗体示出于WO2011/143318中。示例性抗FGFR3抗体示出于WO2010/002862和EP1423428B1中。示例性抗FGFR4抗体示出于WO03/063893、WO2008/052796以及US2010/0169992中。示例性抗PDGFRα抗体示出于US8128929和WO1995/000659中。示例性抗PDGFRβ抗体示出于US7740850中。示例性抗EPCAM抗体示出于US7976842、US2003/0157054以及WO2001/007082中。示例性抗EphA2抗体示出于EP1575509B1、US7402298以及US7776328中。示例性CD-44m抗体示出于US8071072、WO2008/079246、US6972324中。示例性CEA抗体示出于US7626011中。示例性ALK抗体示出于US6696548、US7902340以及WO2008/131575中。示例性AXL抗体示出于US2010/0330095、US2012/0121587以及WO2011/159980中。
在另一个实施方案中，结合位点是结合肽。c-Met结合肽是例如从Matzke,A.等,Cancer Res65(14)(2005)6105-10；和Tam,Eric,M.等,J.Mol.Biol.385(2009)79-90中获知。
结合位点优选特异性结合其标靶，Kd为10-6、10-7、10-8、10-9M或10-10M或甚至更低的Kd值，如例如通过表面等离子共振(例如使用BIAcore系统)所测量。
TFcA可以特异性结合任何标靶蛋白，例如，可溶性或膜人类标靶蛋白。示例性标靶蛋白包括从由以下各项组成的群组中选出的人类受体蛋白：ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、c-Met、EPCAM以及EphA2。
示例性重链和轻链
在一个实施方案中，TFcA包含重链和轻链。在一个实施方案中，抗c-Met/抗EGFR TFcBA包含包括图9中所示出的aa序列的重链和/或包含实施例3中所示出的aa序列的轻链。
TFcBA所包含的重链和/或轻链还可以包含与图9中所示出的aa序列在或在至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100、200或300个aa方面不同的aa序列，条件是所述TFcBA具有所希望的生物学特征，如本文中进一步描述。TFcBA所包含的重链和/或轻链还可以包含与图9的重链或轻链aa序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的aa序列，其中所述TFcBA具有所希望的生物学特征。
TFcBA还可以包含多于2个结合位点，在该种情况下，重链将包含1、2、3、4或更多个VH域，所述VH域可以连接至以下分子中任一者的N和/或C末端：Fab-TFc-scFv；Fab-TFc-Fab；scFv-TFc-scFv；以及scFv-TFc-Fab。其它结合位点可以是Fab或scFv。
TFcA的生物学活性
在某些实施方案中，结合一种或多种标靶蛋白的TFcA(例如TFcBA)抑制由该一种或多种标靶蛋白介导的信号转导。举例来说，抗c-Met+抗EGFRTFcBA可以抑制由c-Met和EGFR中的任一者或两者介导的信号转导。对信号转导的抑制可以由例如对EGFR和ERK磷酸化的抑制证明。在某些实施方案中，当例如在实验结束时进行确定时，例如，如实施例中所示出，相对于不存在TFcA时的磷酸化，TFcA对c-Met、EGFR和/或ERK磷酸化的抑制程度为至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或更大。优选TFcA几乎完全(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%)抑制c-Met和/或EGFR信号转导，例如由对c-Met和EGFR磷酸化的抑制来衡量。
尽管这部分所描述的生物学特性主要在抗c-Met/抗EGFR TFcBA情形下加以描述，但该描述也适用于其它TFcBA以及单价TFcA。
对a)配体介导的c-Met磷酸化和b)配体介导的EGFR磷酸化的抑制可以由TFcBA可再现地降低a)由HGF家族配体诱导的c-Met磷酸化、b)由EGFR配体(例如EGF)诱导的EGFR磷酸化或c)由c-Met配体或EGFR配体诱导的ERK磷酸化的水平的能力(各自相对于未与TFcBA接触的对照细胞中的磷酸化)来证明。表达c-Met和/或EGFR的细胞可以是天然存在的细胞或细胞系的细胞，或可以通过向宿主细胞中引入编码c-Met和/或EGFR的核酸而重组产生。在某些实施方案中，如例如通过ELISA加以确定且如实施例中所示出加以计算，TFcA对HGF家族配体介导的c-Met磷酸化的抑制程度为至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大。在某些实施方案中，如例如通过ELISA加以确定且如实施例中所示出加以计算，TFcA对EGF介导的EGFR磷酸化的抑制程度为至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大。在某些实施方案中，如例如通过ELISA加以确定且如实施例中所示出加以计算，TFcA对EGF和/或c-Met介导的ERK磷酸化的抑制程度为至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大。
TFcBA可以抑制至少70%或80%配体诱导的c-Met磷酸化，至少85%、90%或95%配体诱导的EGFR磷酸化，且任选地抑制至少5%或10%配体诱导的ERK磷酸化。TFcBA还可以抑制至少85%配体诱导的c-Met磷酸化、至少85%配体诱导的EGFR磷酸化，且任选地抑制至少5%配体诱导的ERK磷酸化。在某些实施方案中，TFcBA抑制至少50%配体诱导的c-Met磷酸化及至少90%配体诱导的EGFR磷酸化，且任选地抑制至少5%配体诱导的ERK磷酸化。
TFcBA还可以由其抑制c-Met、EGFR以及ERK中一者或多者的磷酸化的EC50(即，获得50%最大抑制时的TFcBA浓度)来定义，所述EC50可以如本文中所示出进一步确定。举例来说，本文中所公开的TFcBA抑制c-Met磷酸化的EC50可为10-8M、10-9M、10-10M或更低。其抑制EGFR磷酸化的EC50可为10-8M、10-9M、10-10M或更低。其抑制ERK磷酸化的EC50可为10-7M、10-8M、10-9M、10-10M或更低。本文中所公开的一些TFcBA抑制至少80%或85%c-Met磷酸化的EC50为10-8M、10-9M、10-10M或更低；抑制至少80%或85%EGFR磷酸化的EC50为10-8M、10-9M、10-10M或更低；且任选地，抑制至少5%ERK磷酸化的EC50为10-7M、10-8M、10-9M、10-10M或更低。在一些情况下，利用本文中所公开的TFcBA可以基本上完全阻断c-Met磷酸化和EGFR磷酸化中的任一者或两者。
在某些实施方案中，以0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15mg/ml或更高浓度(或介于这些数字中任两个之间的浓度范围)包含TFcA的溶液包含多于70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%呈非聚集形式的TFcBA(在这中情形下称为单体)，如例如在如下文所描述的稳定性测试之后，例如利用尺寸排除色谱法(SEC)所确定。可在以下稳定性测试中的一个之后确定溶液中的单体百分比：a)在4℃下孵育1、2、3、4、5或6天，或者1、2、3周或更久；b)在室温下孵育1、2、3、4、5或6天，或者1、2、3周或更久；c)在37℃下孵育1、2、3、4、5或6天，或者1、2、3周或更久；d)1、2、3、4或5个冷冻/解冻循环；以及e)搅拌，例如在室温下在轨道振荡器上轻缓搅拌，例如持续1、2、3、4、5小时或更久。
在某些实施方案中，TFcA在37℃下在血清中孵育1、2、3、4或5天之后展现出了相对于其在第0天的稳定性为至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的稳定性，其中蛋白质的稳定性是通过例如SEC或通过测量其在孵育后结合一个或多个其标靶抗原的能力来确定。
在某些实施方案中，如实施例中所描述，如例如通过差示扫描荧光测定法(DSF)所确定，TFcA的熔融温度(Tm)为至少50℃、55℃、58℃或60℃。
TFcA可以具有本文所示出的两种或更多种特征的组合。举例来说，TFcBA可以抑制至少70%配体诱导的c-Met磷酸化和至少70%配体诱导的EGFR磷酸化，且还展现出一种或多种以下特征：(i)至少55℃或60℃的Tm，如通过DSF所确定；和(ii)在室温下5天或更久、在4℃下2周、一个或多个冷冻-解冻循环或轻缓搅拌之后，为含至少70%、80%或90%单体的10mg/mLPBS溶液。在某些实施方案中，TFcBA具有至少60℃的Tm和室温稳定性，在4℃或37℃下为至少90%(在这些条件下孵育后的单体浓度相对于初始单体浓度)。
在某些实施方案中，TFcA组合物包含一种或多种以下特征：1)在蛋白A上纯化后，SDS PAGE上可见至少50%、60%、70%、80%、90%或更多蛋白质；2)SDS-PAGE凝胶上所观察到的物质中至少50%、60%、70%、80%、90%或更多具有正确分子量；3)如利用差示扫描荧光测定法所测量的热稳定性曲线不显示熔球特性；4)不包含多于50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%或更多单体，如利用SEC所观察；以及5)抑制超过95%由加入外源性EGF配体激活的EGF受体信号传导，如由pEGFR抑制来衡量。
标准测定可用于确定TFcA(如TFcBA)的生物学活性和特征。实施例中提供示例性测定。
核酸、表达载体以及宿主细胞
本文中提供了编码本文中所描述的多肽的核酸，例如DNA和RNA。本文中所提供的示例性核苷酸序列为编码图中所示出的aa序列的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码TFcA重链或轻链的核苷酸序列连接至可提高或促进核苷酸序列在细胞中的表达的序列以产生蛋白质。所述核酸可以涵盖在载体(例如表达载体)内。
出于分泌的目的，TFcA重链和/或轻链优选包含信号序列，所述信号序列正常在分泌后被切断以提供成熟多肽。可以使用以下信号顺序：
用于例如表达重链的MGFGLSWLFLVAILKGVQC(SEQ ID NO:241)；和用于例如表达轻链的MGTPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:243)。
编码SEQ ID NO:241的示例性核苷酸序列为atgggcttcggactgtcgtggctttttctggtggcgattcttaagggggtccagtgc(SEQ ID NO:240)，且编码SEQ ID NO:243的示例性核苷酸序列为atgggcacccccgcacagctcttgttcttgctgcttctttggctccctgacacaactggt(SEQ ID NO:242)。
本文中还涵盖所包含的核苷酸序列与编码本文中所描述的多肽的核苷酸序列或本文中所示出的核苷酸序列具有至少约70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性，且如本文中进一步描述编码TFcA或其部分的重链和或轻链的核酸，例如DNA。所述核苷酸序列可以编码本文中所示出的蛋白质或可以编码与本文中所示出的蛋白质或其部分(例如域)具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性或相似性的蛋白质，如任一图中所示出的aa序列。
本文中还涵盖包含本文中所提供核酸或载体的细胞，例如宿主细胞。
本文中所描述的TFcA可以通过重组手段来产生。重组产生方法在目前技术水平下广为人知，且包含在原核和真核细胞中进行蛋白质表达，随后分离抗体且通常纯化到药学上可接受的纯度。为了在宿主细胞中表达TFcA，利用标准方法将编码相应多肽(例如轻链和重链)的核酸插入到表达载体中。在如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞等适当原核或真核宿主细胞中进行表达，且从所述细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收TFcA。重组产生抗体的一般方法在目前技术水平下是众所周知的，且描述于例如以下综述文献中：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif17183-202(1999)；Geisse,S.等,Protein Expr.Purif.8271-282(1996)；Kaufman,R.J.,MoI.Biotechnol.16151-161(2000)；Werner,R.G.,Drug Res.48870-880(1998)。
可以通过如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析或亲和色谱法等常规免疫球蛋白纯化程序适当地分离TFcA与培养基。容易地分离编码TFcA的DNA和RNA且使用常规程序测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。在分离后，DNA可以插入到表达载体中，然后转染到如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞等否则不产生免疫球蛋白的宿主细胞中，以在宿主细胞中合成重组TFcA。
TFcA的aa序列变体(或突变体)可以通过向TFcA DNA中引入适当核苷酸变化或通过核苷酸合成来制备。
“宿主细胞”表示可以经过工程改造以产生本文中所描述的TFcA的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中，使用HEK293细胞和CHO细胞作为宿主细胞。例如以下文献描述了在NSO细胞中的表达：Barnes,L.M.等,Cytotechnology32109-123(2000)；Barnes,L.M.等,Biotech.Bioeng.73261-270(2001)。例如以下文献描述了瞬时表达：Durocher,Y.等,Nucl.Acids.Res.30E9(2002)。以下文献描述了可变域的克隆：Orlandi,R.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833-3837(1989)；Carter,P.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA894285-4289(1992)；以及Norderhaug,L.等,J.Immunol.Methods20477-87(1997)。以下文献描述了示例性瞬时表达系统(HEK293)：Schlaeger,E.-J.,和Christensen,K.,Cytotechnology3071-83(1999)；及Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods194191-199(1996)。
举例来说，适合于原核生物的控制序列包括启动子、任选地运算子序列以及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子以及多聚腺苷酸化信号。
核酸在功能相关时与另一个核酸序列“可操作地连接”。举例来说，前序列或分泌前导序列的DNA如果表达为参与多肽分泌的前蛋白则可操作地连接至所述多肽的DNA；启动子或增强子如果影响编码序列的转录则可操作地连接至所述编码序列；或核糖体结合位点如果经过定位以便促进转译则可操作地连接至编码序列。一般来说，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情况下是连续的且处于阅读框中。然而，增强子不必非得是连续的。连接伴随着便利限制性位点处的结扎。如果这些位点不存在，则合成低聚核苷酸衔接子或接头根据常规做法加以使用。
可以利用标准技术(包括本领域中众所周知的碱/SDS处理、CsCl显带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳等等)对TFcA进行纯化以便消除细胞组分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白质。参见Ausubel,F.等编,Current Protocolsin Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。已确立了不同的方法且广泛用于蛋白质纯化，如利用微生物蛋白质的亲和色谱法(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱法)、离子交换色谱法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)以及混合模式交换)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇及其它SH配体)、疏水性相互作用或芳烃吸附色谱法(例如用苯基琼脂糖凝胶、亲氮杂芳烃树脂或间氨基苯基硼酸)、金属螯合物亲和色谱法(例如用Ni(II)和Cu(II)亲和性材料)、尺寸排除色谱法以及电泳法(如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.Appl.Biochem.Biotech.7593-102(1998))。
TFcA的使用方法
本文中提供了TFcA(例如TFcBA)的使用方法。TFcBA可以用于治疗与受体依赖性信号传导相关的疾病或病症，包括多种癌症。
在一个实施方案中，提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，所述肿瘤细胞表达TFcA标靶，例如c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体r、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM和/或EphA2。一种方法可以包含使肿瘤细胞与TFcA接触，以便抑制、减缓或停止肿瘤细胞增殖，或使得肿瘤细胞死亡。
本文中提供了通过施用患者能有效治疗与TFcBA标靶的信号传导途径相关的疾病或病症的量的TFcBA来治疗所述疾病或病症的方法，所述TFcBA标靶为例如c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM和/或EphA2，所述方法是。合适的疾病或病症包括例如多种癌症，包括但不限于乳腺癌和下文所示出的癌症。在一个实施方案中，治疗患有如癌症等增殖性疾病的受试者的方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的一种或多种TFcA。
还提供了一种用于治疗患者的肿瘤的方法(或TFcA，例如药物)，所述肿瘤表达TFcA(例如TFcBA)的标靶，例如c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM、EphA2和/或EGFR，所述方法包括施用能有效减缓或停止肿瘤生长、停止或收缩肿瘤、或减缓或停止肿瘤浸润或肿瘤转移的量的TFcA。可以治疗表达c-Met、ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1-4、PDGFR(α和β)、c-Kit、EPCAM、EphA2和/或EGFR的肿瘤，包括以下癌症的肿瘤：胃癌、食道癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌以及甲状腺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤/神经胶母细胞瘤以及乳腺癌(基底样乳腺癌/三阴性乳腺癌以及HER2+乳腺癌)。
治疗肿瘤或患有肿瘤的受试者的方法还可以包括施用第二抗癌剂与TFcA的组合。因而，预期包含TFcA与第二抗癌剂，典型地包含生物制剂与至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的新颖组合物。
还提供了包含一种或多种TFcA的试剂盒。所述试剂盒可以包括标签，所述标签指示试剂盒内含物的预定用途且任选地包括所述试剂盒用于治疗与TFcA标靶依赖性信号传导(例如EGFR和/或c-Met依赖性信号传导)相关的疾病或病症的使用说明。术语标签包括提供在试剂盒上或与试剂盒一起提供或以其它方式伴随试剂盒的任何书写材料、销售材料或记录材料。
药物组合物
在另一个方面，提供了一种用于治疗患者的肿瘤的组合物(例如药物组合物)，以及各所述组合物用于治疗患者的肿瘤的使用方法。本文中所提供的组合物含有一种或多种本文中所公开的抗体(例如TFcA)，所述抗体是与药学上可接受的载体一起调配。如本文中所使用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何及所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等等。优选地，所述载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、经脊髓或经表皮给药(例如通过注射或输注)。取决于施用途径，所述抗体可以包覆在材料内以保护其免受酸作用和可能使蛋白质失活的其它自然条件。
药物组合物可以单独或与疗法组合(即，与其它制剂组合)施用。举例来说，组合疗法可以包括本公开的抗体与至少一种附加治疗剂，如抗癌剂。药物组合物还可以连同另一种抗癌治疗形态(如放射疗法和/或手术)一起施用。
本公开的组合物可以利用本领域中已知的多种方法施用。如熟练技术人员应了解，施用途径和/或模式将取决于所希望的结果而变化。
为了通过某些施用途径施用本文中所提供的组合物，可能必需或需要用能防止抗体失活的材料包覆所述抗体或将所述抗体与能防止其失活的材料共同施用。举例来说，所述抗体可于适当载体(例如脂质体)或稀释剂中施用患者。药学上可接受的稀释剂包括生理盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体。
药学上可接受的载体包括用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌水溶液或分散液和无菌粉末剂。将所述介质和制剂用于药学活性物质在本领域中是已知的。除非任何赋形剂、稀释剂或制剂与活性化合物不相容，否则预期其用于本文所提供的药物组合物中。补充活性化合物(例如附加抗癌剂)也可以并入组合物中。
治疗组合物典型地在制造和存储条件下必须为无菌且稳定的。所述组合物可以调配为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可以采用生理盐水溶液及葡萄糖水溶液及甘油溶液作为液体载体，特别是对于可注射溶液。如果有需要，所述组合物还可以含有少量润湿剂或增溶剂、稳定剂、防腐剂或pH值缓冲剂。在许多情况下，在所述组合物中包括等张剂将是有用的，例如氯化钠、糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇、甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇)。可以通过在所述组合物中包括延迟吸收的制剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来延长可注射组合物的吸收。
实施例
以下实施例不应被视为限制本公开的范围。
在所有实施例中，除非另外陈述，否则使用以下材料和方法。一般来说，除非另外指明，否则采用化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(尤其是例如抗体技术)、药理学、制药学的常规技术以及标准多肽制备技术来实施本公开的技术。
实施例1：稳定串联Fc结构的识别
本实施例描述稳定多价Ab形式的识别。在本实施例和实施例2中，使用不含结合位点的蛋白质构建体。比较若干种形式，且这些形式各自来源于以下两种串联Fc构建体中的任一种：
1)TFc“23”或“IgG1TFc”，其所包含的IgG1TFc包含IgG1铰链；包含取代N297Q的IgG1CH2域；包含取代T366S/L368A/Y407V的IgG1CH3域；由(G4S)8组成的TFc接头；不包含上铰链的IgG1铰链；包含取代N297Q的IgG1CH2域；以及包含取代T366W的IgG1CH3域。这种构建体包含如SEQID NO:293中所示出的aa序列(参见图11)；以及
2)TFc“39”或“IgG1/IgG4TFc”，其所包含的IgG1/IgG4串联TFc包含杂合IgG1/IgG4铰链，其包含IgG1上铰链及核心IgG4铰链和下IgG4铰链；包含取代T299K的IgG4CH2域；包含取代T366S/L368A/Y407V的IgG1CH3域；由(G4S)8组成的TFc接头；不包含上铰链的IgG4铰链；包含取代T299K的IgG4CH2域；以及包含取代T366W的IgG1CH3域。这种构建体包含如SEQID NO:319中所示出的aa序列(参见图11)。
产生TFc23和39的六种经修饰型式，且这些经修饰型式列于表15中。简而言之，第一修饰为在钮或孔附近添加二硫键(TFc23A)。另一种修饰为将23A的钮孔变成较小钮/孔(TFc23B)。另一种修饰在第一铰链的上铰链中引入1或2个半胱氨酸，以在TFc内产生二硫键(分别为TFc23D和TFc23C)。另一种修饰在CH3域中引入C末端半胱氨酸(TFc23E)。TFc中的另一种修饰由将TFc接头的长度减少20个aa组成(TFc23F，也称为“23G”)。这些经过重新修饰的TFc的aa序列(示于表15中)与图6和图7中所示出的那些相同，但本实施例中所使用的TFc不包含上铰链部分，即，aa EPKSC，且包含信号肽。这些TFc的核苷酸和aa序列示于图11中，且TFc的各域或元件的同一性示出于表12和表13中，不同之处仅在于第一铰链在其N末端不包含EPKSC。
表15：TFc
Figure BDA0000489467110000891
*23G所含有的TFc与别处称为“23F”的TFc相同。
将不同的核酸(具有SEQ ID NO:292、294、296、298、300、302、304、318、320、322、324、326或328)瞬时转染到Freestyle293F细胞(Invitrogen)中且用一步蛋白A纯化基本上如下进行纯化。使用标准重组DNA技术将编码所述蛋白质的核酸作为单一蛋白质克隆到表达质粒中。所采用的表达载体是pCEP4(Invitrogen)。使用聚乙烯亚胺(2.5μg/ml培养物)和DNA(1μg/ml细胞培养物)来转染表达质粒。将经过转染的细胞在37℃、5%CO2下孵育六天，然后加以收集。使用蛋白A亲和力方案，根据制造商说明书纯化所有蛋白质。蛋白A亲和力步骤用于选择性地且有效地结合所收集的细胞培养液(HCCF)外的融合蛋白。这就在单一步骤中以高产率和高通量去除了>95%的产物杂质。在这个步骤之后，对于融合蛋白而言，所希望的分子形式的部分在60%到98%范围内。使用得自于GE的MABSELECT作为蛋白A亲和力树脂。将经过纯化的材料浓缩并且透析到PBS中。
A)单体百分比
利用尺寸排除色谱法(SEC)在初始溶液中或在4℃、37℃下孵育之后、在冷冻-解冻之后或在室温下在轨道振荡器上轻缓搅拌之后确定TFc溶液中所存在的单体百分比。基本上如下进行SEC。使用Agilent1100Series HPLC系统进行SEC。将50μg各分子注入TSK Super SW3000凝胶柱(Tosoh Biosciences，P/N18675)上。使用PBS作为跑胶和平衡缓冲液(流速：0.35ml/min)。
表16提供了具有所指示浓度的初始溶液中的示例性TFc的单体百分比。
表16：示例性TFc的单体百分比
蛋白质 浓度 第0天的单体%
23G 3mg/ml 87.9
23 5mg/ml 71.4
39C 0.5mg/ml 39.5
39D 0.5mg/ml 50.9
39 12.5mg/ml 66.4
在另一个实验中，在基本上如上文所描述浓缩分子之后确定初始溶液中的单体百分比。表17提供结果。
表17：浓缩后初始溶液中的单体百分比
mg/ml 单体%
23A 5.2 67%
23D 10.0 78%
23E 16.8 74%
表16和表17的汇总显示于以下表18中。
表18：示例性TFc的单体百分比
Figure BDA0000489467110000901
表19显示如所在已经暴露于各种条件之后所确定的溶液中TFc39E和23C的单体百分比。
表19：在暴露于各种条件之后39E和23C的单体百分比
条件 39E 23C
12.9mg/ml 5mg/ml
第0天 89.7% 74.6%
4℃，2周 90.6% 82.5%
室温，10天 90.3% 83.0%
37℃，2周 88.1% -
冷冻/解冻 90.9% 85.0%
搅拌 90.7% -
结果表明，TFc在第0天和在所测试的各种条件下的溶液稳定性有很大差异。39E和23G似乎比其它TFc具有更好的稳定性。
B)SDS PAGE分析
将TFc在4%到12%SDS-PAGE凝胶上在非变性条件下跑胶且利用Coomassie染色加以观察。结果示于图8中。
实施例2：合成第二代TFc
为了进一步改善TFc分子的特征，对它们进行进一步修饰。所述修饰包括(i)改变TFc接头的长度(“23E(35L)”、“39E(35L)”、“23E(30L)”、“39E(30L)”、“23E(25L)”以及“39E(25L)”)；(ii)改变两个CH3域各自内部的AEM与C末端半胱氨酸修饰的组合(“23E(35L)反向”和“39E(35L)反向”)；以及(iii)改变能增强CH3缔合的突变(“23I”、“39I”、“23J”以及“39J”)。这些修饰概括于表20中。这些经过重新修饰的TFc的aa序列示出于图11中，且其各域或元件的同一性示出于表12和表13中。
表20：第二代TFc
Figure BDA0000489467110000911
Figure BDA0000489467110000921
基本上如实施例1中所描述表达并纯化第二代TFc。
A)单体百分比
利用SEC对TFc溶液确定初始溶液中或在4℃下7天后所存在的单体百分比。基本上如实施例1中所描述进行SEC。
表21提供了初始溶液中和在4℃下7天后的示例性第二代TFc的单体百分比。
表21：示例性TFc的单体百分比
第1天 第7天
Fc1 23E/25L 74.8%
Fc2 23E/35L 未测量 77.9%
Fc3 39E/30L 80.2%
Fc4 39E/35L 未测量 78.9%
Fc5 39E/35L反向 79.3%
Fc6 23E/30L 80.2%
Fc7 23E/35L反向 79.1%
Fc8 39E/25L 78.1%
原始IgG1Fc 23E/40L 78.8%
原始IgG1/4Fc 39E/40L 88.3%
结果表明，40个aa的接头(例如在分子23E和39E中)比较短接头产生更稳定的TFc。
实施例3：示例性抗c-Met/抗EGFR TFcBA
A)示例性抗c-Met结合位点
TFcBA所包含的抗c-Met结合位点可以包含人源化5D5Ab的结合位点或由其组成(美国专利第7,476,724号)。所述重链可以包含以下Fab域或其VH域：
1)无信号肽：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSD TRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGSYVSPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
(SEQ ID NO:223；CDR用虚线加下划线，且CH1域加下划线)
2)包括由SEQ ID NO:241组成的示例性信号肽(加下划线)：
MGFGLSWLFLVAILKGVOCEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYWLHWVRQAPGKGLEWVGMIDPSNSDTRFNPNFKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAHDTAVYYCARYGSYVSPLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKV
(SEQ ID NO:245；信号肽加下划线且呈粗体，CDR用虚线加下划线，且CH1域加下划线)
所述轻链可以包含以下Fab域或其VH域：
1)无信号肽：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWAST RESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(SEQ ID NO:231；CDR用虚线加下划线，且CL域加下划线)
2)包括由SEQ ID NO:243组成的示例性信号肽：
MGTPAQLLFLLLLWLPDTTGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLYTSSQKNY LAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSGTDFYLTISSLQPEDFATYYCQQY YAYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
(SEQ ID NO:247；信号肽加下划线且呈粗体，CDR用虚线加下划线，且CL域加下划线)
TFcBA还可以包含包括重链和轻链部分或由重链和轻链部分组成且再本文中称为“抗c-Met结合位点2”的抗c-Met结合位点。所述重链可以包含以下Fab域或其VH域：
1)无信号肽：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNG LANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEITTEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALYSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
(SEQ ID NO:287；CDR用虚线加下划线，且CH1域加下划线)
2)包括由SEQ ID NO:241组成的示例性信号肽(加下划线)：
MGFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTAYTMHWVRQAPGQGLEWMGWIKPNNGLANYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSEKTTEFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVD KKV
(SEQ ID NO:256；信号肽加下划线且呈粗体；CDR用虚线加下划线，且CH1域加下划线)
所述轻链可以包含以下Fab域或其VH域：
1)无信号肽：
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEDPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLSSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSENRGEC
(SEQ ID NO:289；CDR用虚线加下划线，且CL域加下划线)
2)包括由SEQ ID NO:243组成的示例性信号肽：
MGTPAQLLFLLLLWLPDTTCDIVLTQSPDSLAVSLGERATINCKSSESVDSYANSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASTRESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKE DPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFVPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC
(SEQ ID NO:345；信号肽加下划线且呈粗体；CDR用虚线加下划线，且CL域加下划线)
示例性成熟TFcBA重链的aa序列按氨基到羧基末端的顺序包含：i)抗c-Met结合位点5D5的Fab域(SEQ ID NO:223)；ii)包含AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及iii)具有SEQ ID NO:233的帕尼单抗抗EGFR scFvH1L1(参见下文)，所述aa序列阐述为SEQ ID NO:235(图9)。示例性成熟TFcBA重链的aa序列按氨基到羧基末端的顺序包含：i)抗c-Met结合位点2的Fab域(SEQ ID NO:287)；ii)包含AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及iii)具有SEQ ID NO:258的西妥昔单抗抗EGFR scFv H1L1(参见下文)，所述aa序列阐述为SEQ ID NO:291(图9)。一般来说，此处所提供的示例性抗c-Met Fab重链序列可连接至本文中所公开的任何任何TFc或包含TFc的构建体。这些蛋白质可以用信号序列表达，所述信号顺序可以是由SEQ IDNO:241组成的信号顺序。
B)示例性抗EGFR scFv
TFcBA可以包含以下抗EGFR scFv(或其可变域或CDR)中的任一者：
1)帕尼单抗(VECTIBIX)scFv
帕尼单抗VH域和VL域的aa序列提供于美国专利第6,235,883号中，且组装成具有以下aa序列的scFv：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNT NYNPSLKSRLTISIDTSKTQFLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSKFSGSGSGTDFTFFISSLQPEDEATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRT
(SEQ ID NO:233；scFv接头呈斜体且VH CDR和VL CDR用虚线加下划线)
2)2224scFv
Ab2224的VH域和VL域的aa序列提供于美国专利公开号2010/0009390中，且组装成具有以下aa序列的scFv：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIAN YAQKFQGRVTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAVSVALGQTVKITCQGDSLR SYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVL
(SEQ ID NO:237；scFv接头呈斜体且VH CDR和VL CDR用虚线加下划线)
3)人源化西妥昔单抗(ERBITUX)scFv
将西妥昔单抗的可变区人源化且用来构建以下scFv，其中CDR用虚线加下划线，scFv接头呈斜体且由人源化产生的aa修饰以小写字母表示：
3.1)西妥昔单抗scFv H1L1
QVQLVESGGGVVQPGESLRLSCAvSGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVgVIWSGGNT DYNTPFTSRFTISkDNSKNTvYLQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSdIVLTQSPDFQSVTPGEKVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLIKYASWSISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDWATYYCQQNNNW PTTFGQGTKVEIKRT
(SEQ ID NO:258)
3.2)西妥昔单抗scFv H1L2
QVQLVESGGGVVQPGESLRLSCAvSgFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWVGVIWSGGNT DYNTPFTSRFTISkDNSKNTvYLQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSdIVLTQSPsslSVTPGEKVTfTCRASOSIGTNIHWYQQKPgQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSvEAEDEATYYSQQNNNWPT TFGQGTKIEIKRT
(SEQ ID NO：275)
3.3)西妥昔单抗scFvH2L1
QVQLVESGGGVVQPGESLRiSCAvSGDSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWlGVIWSGGNTD YNTPFTSRITISkDNSKsTvYfQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSdIVLTQSPDFQSVTPGEKVTITCRASQSIGTNIHWYQQKPDQSPKLLlKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDEATYYCQQNNNWPTTFGQGTKVEIKRT
(SEQ ID NO:277)
3.4)西妥昔单抗scFv H2L2
QVQLVESGGGVVQPGESI，RiSCAvSGFSLTNYGVHWVRQAPGKGLEWlgVIWSGGNTD YNTPFTSRITISkUNSKsTvYfQMNSLRAEDTAVYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSFFGGSGGGGSdIVLTQSPsslSVTPGEKVTfTCRASQSIGTNIHWYQQKPgQSPKLLIKYASESISGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSvEAEDEATYYCQQNNNWPTTFGQGTKIEIKRT
(SEQ ID NO:279)
人源化西妥昔单抗Ab的VH域和VL域可以用于任何其它形式的Ab中，例如具有包含两个重链和两个轻链的天然存在的结构的Ab。
抗c-Met/抗EGFR TFcBA重链的aa序列包含：i)人源化5D5抗c-Met VH域(SEQ ID NO:223)；ii)包含AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及iii)具有SEQ ID NO:233的帕尼单抗抗EGFR scFv，所述aa序列阐述为SEQ IDNO:235(图9)。抗c-Met/抗EGFR TFcBA重链的aa序列包含与SEQ ID NO:235中相同的结合位点，但包含不同TFc，所述aa序列示出于SEQ ID NO:343、225、227以及229中(图9)。抗c-Met/抗EGFR TFcBA重链的aa序列包含：i)人源化5D5抗c-Met VH域(SEQ ID NO:223)；ii)包含AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及iii)具有SEQ ID NO:237的2224抗EGFR scFv，所述aa序列阐述为SEQ ID NO:239(图9)。抗c-Met/抗EGFR TFcBA重链的aa序列包含：i)人源化5D5抗c-Met VH域(SEQ ID NO:223)；ii)包含AEM1和DiS2的TFc(SEQ ID NO:181)；以及iii)由SEQ ID NO:258、275、277或279组成的西妥昔单抗抗EGFR scFv，所述aa序列分别阐述为SEQ IDNO:260、281、283以及285(图9)。一般来说，本文中所公开的任何抗EGFRscFv或其可变序列或CDR序列可连接至本文中所公开的任何TFc或包含TFc的构建体。
编码Fab域、scFv以及TFcBA的核苷酸序列提供于图10中。
其它示例性抗c-Met/抗EGFR TFcBA示出于表21中，其中按氨基到羧基末端的顺序，在无插入序列的情况下，各序列可以连接至相邻序列。
表21：示例性TFcBA
Figure BDA0000489467110000961
Figure BDA0000489467110000971
Figure BDA0000489467110000981
实施例4：制备和表征TFcA或TFc的方法
A)蛋白质表达和纯化
稳定转染：使用1:1(:1)的质粒比将核酸转染到CHO-K1细胞(中国仓鼠卵巢；
Figure BDA0000489467110000991
目录号CCL-61TM)中，且用一步蛋白A纯化法，例如根据以下方案进行纯化。使用标准重组DNA技术将编码TFcA或TFc的核酸作为单一蛋白质克隆到表达质粒中。所采用的示例性表达载体为pMP10K(SELEXIS)。使表达质粒线性化，使用
Figure BDA0000489467110000992
纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化，且使用
Figure BDA0000489467110000993
LTX(Invitrogen)共同转染到CHO-K1细胞中。用含有10%FBS的Ham F12培养基
Figure BDA0000489467110000994
回收经过转染的细胞，在无选择压力的情况下持续2天，然后在选择压力下持续4天。4天后，它们在选择压力下变成了含谷氨酰胺的无血清培养基
Figure BDA0000489467110000995
。一周后，检查细胞的表达且按比例增加到所希望的体积。使用根据制造商说明书进行的蛋白A亲和力方案来纯化所有蛋白质。蛋白A亲和力步骤用于选择性地且有效地结合所收集的细胞培养液(HCCF)外的TFcA或TFc。这就在单一步骤中以高产率和高通量去除了>95%的产物杂质。在这个步骤之后，对于TFcA或TFc而言，预计所希望的分子形式的部分在60%到98%范围内。使用得自于GE的MABSELECT作为蛋白A亲和力树脂。将经过纯化的材料浓缩并且透析到PBS中。
瞬时转染：将核酸瞬时转染到FreestyleTM293F细胞(Invitrogen)中且基本上如下用一步蛋白A纯化进行纯化。使用标准重组DNA技术将编码所述蛋白质的核酸作为单一蛋白质克隆到表达质粒中。所采用的示例性表达载体为pCEP4(Life Technologies，目录号R790-07)。使用聚乙烯亚胺(2.5μg/ml培养物)和DNA(1μg/ml细胞培养物)来转染表达质粒。将经过转染的细胞在37℃、5%CO2下孵育六天，然后加以收集。使用蛋白A亲和力方案，根据制造商说明书纯化所有蛋白质。蛋白A亲和力步骤用于选择性地且有效地结合所收集的细胞培养液(HCCF)外的融合蛋白。这就在单一步骤中以高产率和高通量去除了>95%的产物杂质。使用得自于GE的MABSELECT作为蛋白A亲和力树脂。将经过纯化的材料浓缩并且透析到PBS中。B)SDS-PAGE分析
将TFcBA或TFc在4%到12%SDS-PAGE凝胶上在非变性条件下跑胶且利用Coomassie染色加以观察。这种方法可以用来确定是否适当地形成或组装了TFcA或TFc。
C)利用DSF进行热稳定性测量
基本上如下利用差示扫描荧光测定法(DSF)来确定TFcA或TFc展开时的温度。DSF测定是在IQ5实时检测系统(Bio-Rad)中进行。将15uM TFcA或TFc、1×Sypro Orange(Invitrogen Life Technologies)以及1×PBS的20μl溶液加入到96孔板的孔中。以1℃/min的加热速率将板从20℃加热到90℃。将数据传到GraphPad
Figure BDA0000489467110001001
以供分析。
D)pEGFR抑制
TFcBA对经由EGFR进行的信号转导(例如配体诱导的信号转导)的抑制可以通过测量特定TFcA对EGFR磷酸化的作用来确定。
使用以下方案来测量对EGFR的抑制。将细胞(例如A431细胞(
Figure BDA0000489467110001004
目录号CRL-1555TM)或NCI-H322M(国家癌症学会))维持在补充有10%胎牛血清、青霉素/链霉素以及L-谷氨酰胺的DMEM培养基中。对于信号传导实验，将3.5×104个细胞接种在96孔组织培养板中的完全培养基中。第二天，将完全培养基替换为无血清培养基，且在37℃下将细胞孵育过夜。将细胞预处理2小时，以300nM为起始浓度且针对各TFcA或TFc对11个浓度剂量以3倍因子向下滴定，然后用8nM EGF(人类重组EGF；目录号AF-100-15；PeproTech)刺激10分钟。用PBS洗涤细胞且溶解于补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(以简易包装提供的cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物片剂，目录号4693124001，Roche Diagnostics Corp；
Figure BDA0000489467110001005
磷酸酶抑制剂混合物片剂，目录号4906837001，Roche Diagnostics Corp)的MPER缓冲液(目录号PI78505，VWR International)中。磷酸化EGFR(pEGFR)的ELISA是根据制造商方案(pEGFR ELISA R&D试剂盒(目录号：DYC1095-C))进行，不同之处在于捕捉Ab为EGFR Ab-11，克隆：199.12(Fisher Scientific，目录号MS396P1ABX)。加入
Figure BDA0000489467110001002
ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(目录号PI37069，VWR International)且在PerkinElmer Envision板读数器上对板进行读数。将发光值在标准化后针对在最低TFcA或TFc浓度下所观察到的信号进行绘图。对于数据分析，取两份相同样品的平均值且使用误差线来表示两份相同样品之间的标准偏差。使用GraphPad
Figure BDA0000489467110001003
软件(GraphPad Software,Inc.)经由针对4参数逻辑方程的数据回归来计算抑制曲线和相应的IC50值。为了计算抑制百分比，可以如下利用最大(‘max’)和最小(‘min’)抑制剂效能的回归值：
曲线_跨度=max-min；
基线_跨度=max；
百分比_抑制=100*曲线_跨度/基线_跨度。
E)pERK抑制
TFcA对经由c-Met和/或EGFR进行的信号转导(例如配体诱导的信号转导)的抑制可以通过测量特定TFcA对ERK磷酸化的作用来确定。可以使用以下方案来测量对pERK的抑制。第1天：将活跃对数中期(约80%融合)生长的细胞(例如A431细胞)分到DMEM(+10%FBS+L-谷氨酰胺+青霉素/链霉素)培养基中。在96孔板的每个孔中接种约35,000个细胞。第2天：将培养基从10%FBS变成无血清培养基-0.5%FBS(+L-谷氨酰胺+青霉素/链霉素)培养基。第3天：将抑制剂/抗体稀释到适当体积的血清培养基中。每个孔加入100μL每种浓度的各抑制剂。允许在37℃下孵育抑制剂2小时。在2小时周期结束时，最终浓度8nM的EGF(人类重组EGF；目录号AF-100-15；PeproTech,Inc.)加入到各抑制剂和各抑制剂浓度持续10分钟。用冷PBS将细胞洗涤2次，且稍后溶解于40μL/孔的
Figure BDA0000489467110001011
溶解缓冲液(用水以1:5稀释储备液)中。通常在溶解后5分钟内将溶解产物置于-80℃下。第4天：用于进行
Figure BDA0000489467110001012
pERK1/2ELISA的方案可以在Perkin Elmer网站上获得(ALPHASCREEN PROTEIN A10K PTS，PerkinElmer Life Sciences,Inc.，目录号：6760617M；TGR Surefire ERK1384试剂盒for10,000Ass；PerkinElmer LifeSciences,Inc.，目录号：TGRES10K)。基本上，在室温下将-80℃溶解产物解冻。同时，根据方案混合活化缓冲液与反应缓冲液来制备反应缓冲液。最后向反应缓冲液中加入蛋白A检测试剂盒试剂，随后加入到384孔板上。将4μL解冻的溶解产物转移到
Figure BDA0000489467110001013
白色384浅孔板上(得自于Perkin Elmer；目录号6008280)。在加入蛋白A检测试剂盒试剂后，将7μL最终反应缓冲液转移到各孔(其中已经有4μL溶解产物)。用铝密封剂将板紧密地密封。在Eppendorf桌上型离心机中以1800rpm将板快速离心1分钟。在室温下将板轻缓振荡2小时。然后在Perkin Elmer
Figure BDA0000489467110001014
Reader中对板进行读数。如关于pEGFR所描述进行发光数据的标准化和IC50的计算。
实施例5：基于ELISA板的抗体结合的测量方案
双特异性抗体与可溶性cMet-Fc和EGFR-his的结合
将
Figure BDA0000489467110001015
板(96孔)用50μL cMet-Fc(2μg/mL PBS溶液)涂布且在4℃下孵育过夜。第二天，用PBS-T(PBS+0.05%Tween-20)对板进行洗涤，在室温下用100μL阻断缓冲液阻断1小时，且再用PBS-T洗涤。在室温下将板与50μL双特异性抗体一起孵育2小时，然后用PBS-T洗涤。抗体浓度起始于500nM(PBS-T溶液)，且包括十个附加两倍稀释液和一个空白(仅PBS-T)。然后在室温下将板与50μL EGFR-his(1μg/ml PBS-T溶液)一起孵育一小时。将板用PBS-T洗涤，然后在室温下与1:10,000稀释于PBS-T中的抗his-HRP抗体一起孵育1小时，且再用PBS-T洗涤。在室温下将板与100μL TMB底物一起孵育5到10分钟，且通过加入100μl停止溶液来停止反应。在450nm下测量吸光率，且使用GraphPad
Figure BDA0000489467110001021
分析所得数据。
上述方法中使用TFcBA的示例性结果可见于图15中，该图显示奥那单抗-39Egy-2224(方形)和奥那单抗-39Egy4-帕尼单抗(圆形)的结合亲和力。
实施例6：现有不对称Fc域技术得到分子量异质性
CHO-K1细胞的稳定转染
使悬浮适应型CHO-K1细胞在补充有8mM L-谷氨酰胺的培养基中生长到2000000个/毫升的密度。在转染当天，将细胞以80,000个细胞/毫升的密度再悬浮于无血清培养基(
Figure BDA0000489467110001023
I)中。然后使用2.75μL
Figure BDA0000489467110001024
在24孔板中用1μg总DNA(包括10ng pNeo载体，即携带遗传霉素选择标记物的自制载体)转染细胞(500μL)。3小时后，加入1mL恢复培养基(HAMS-F12+10%FBS)，且允许经过转染的细胞恢复48小时。然后将细胞扩增到96孔板中，且向恢复培养基中加入500μg/ml选择标记物遗传霉素。再过4天后，将培养基替换为无血清Hyclone培养基(补充有L-谷氨酰胺)，且允许经过转染的细胞适应。一周后，所选细胞形成了群落，且由上清液测试这些孔的所希望的特征与Western印迹。将所希望的克隆扩增到24孔板中，然后扩增到T-25烧瓶中，且最好扩增到摇瓶中。用SDS-PAGE证实所希望的克隆，且按比例增加到所希望的体积。当活力低于80%时，通过离心(6000g，30分钟)收集细胞，且使用0.22μm过滤器过滤上清液。
如上文所述转染细胞且如下文所述加以分析。结果示于以下表22中。
A)Western印迹方案
将表达奥那单抗的细胞上清液在4%到12%SDS-PAGE凝胶上在非变性条件下跑胶。使用Invitrogen
Figure BDA0000489467110001025
将蛋白质转移到硝化纤维纸上。用PBS-T洗涤印迹，然后与结合到IRD700的抗人类FC一起孵育一小时。用PBS-T将印迹洗涤三次，然后使用
Figure BDA0000489467110001031
成像。结果示于图12中。
B)单体百分比
对TFc溶液进行利用SEC确定初始溶液中所存在的单体百分比。基本上如实施例1中所描述进行SEC。
表22提供了初始溶液中的示例性第二代TFc的单体百分比。
表22：示例性奥那单抗克隆的单体百分比
蛋白质 高MW物质 单体% 低MW物质
奥那单抗1 78 22
奥那单抗2 75 25
奥那单抗3 n/d
奥那单抗4 24 75
奥那单抗5 89 11
奥那单抗6 2.2 98
实施例7：带电去糖基化突变体的产生和分析
如下文所述识别稳定多价Ab形式。使用不含结合位点的蛋白质构建体。如表23和图17所示比较若干种形式。
表23：TFc
Figure BDA0000489467110001032
基本上如实施例4中所描述，将核酸(具有SEQ ID NO:357和389-399(奇数))瞬时转染到FreestyleTM293F细胞中，且用一步蛋白A纯化进行纯化，随后进行DSF。
表24：暴露于各种条件后的TFc单体百分比
Figure BDA0000489467110001033
Figure BDA0000489467110001041
B)SDS PAGE分析
将TFc在4%到12%SDS-PAGE凝胶上在变性条件下跑胶且利用Coomassie染色加以观察。结果示于图13A(非还原型)和图13B(还原型)中。
C)利用DSF进行热稳定性测量
基本上如下利用差示扫描荧光测定法(DSF)来确定TFcA或TFc展开时的温度。DSF测定是在IQ5实时检测系统(Bio-Rad)中进行。将15uM TFcA或TFc、
Figure BDA0000489467110001051
Orange(Invitrogen Life Technologies)以及1×PBS的20μl溶液加入到96孔板的孔中。以1℃/min的加热速率将板从20℃加热到90℃。将数据传到GraphPad以供分析。利用DSF对糖基化位点突变体进行的热稳定性确定的示例性结果示于表25中。
表25.串联Fc的DSF
蛋白质 Tm
glyco_wt 60.5
glyco_1 55.5
glyco_2 57.9
glyco_3 57.9
glyco_4 57.3
glyco_5 56.3
glyco_6 51.5
实施例8：骨干变体的DSF分析
利用DSF进行热稳定性测量
如上文所述利用差示扫描荧光测定法(DSF)来确定TFcA或TFc展开时的温度。结果示于以下表26中。这些数据显示，如添加二硫键和糖基化突变等骨干修饰可以提高热稳定性。
表26.具有骨干变异的串联Fc的DSF
蛋白质 Tm
奥那单抗 57.1
奥那单抗-23 46.9
奥那单抗-39 51.2
奥那单抗-23E 57.8
奥那单抗-39Egy4 60.3
奥那单抗-39Egy4-西妥昔单抗 57.3
奥那单抗-39Egy4-帕尼单抗 n/a
奥那单抗-39Egy4-2224 55.7
实施例9：使用奥那单抗结合位点的单价和双特异性tFc分子的产生与分 析
使用尺寸排除色谱法确定单体百分比
使用20mM磷酸钠(+300mM NaCl)作为跑胶缓冲液将50μg样品注入到TSKgel SuperSW3000柱(4.6mm ID×30cm)上。所有测量都是在配有自动采样器、二元泵以及二极管阵列检测器的Agilent1100HPLC上进行。通过在Chemstation软件中分析数据来确定单体百分比。通常，所有样品都仅经过蛋白A纯化且以5mg/mL浓度处于1×PBS中。
表27.MM131分子在4℃下的SEC稳定性
Figure BDA0000489467110001061
Fortebio结合方案
所需材料：
96孔黑色圆形平底聚丙烯微板(Greiner Bio-one，编号655209)。
Octet仪器和软件(版本3.0)。
蛋白A传感器探头(Fortebio，编号18-5010)。
1×PBS，抗原(经过his标记的cMET)，抗体。
方案：
使所有试剂平衡且使样品达到室温。在1×PBS中使蛋白A传感器探头
Figure BDA0000489467110001062
编号18-5010)水合10分钟。使用
Figure BDA0000489467110001063
软件和程序根据制造商说明书进行动力学测定。测定步骤典型地包括：在1×PBS中平衡1至2分钟，抗体装载4分钟(浓度：50μg/mL，1×PBS溶液)，基线稳定1至2分钟，抗体:抗原缔合4分钟，以及抗体:抗原解离4分钟。全部使用1×PBS作为基质。利用
Figure BDA0000489467110001064
数据分析软件分析数据，处理，且使用1:1结合模型与曲线拟合以确定动力学参数(Kd、Kon以及Koff)。
表28.具有各种骨干修饰的抗cMet TFc的Kd
实施例10：利用奥那单抗和双特异性变体进行信号传导抑制
为了测试表28中的构建体抑制pMet的能力，在HGF诱导的SW620细胞(
Figure BDA0000489467110001072
目录号：CCL-227TM)中如下测试TFc变体：在第1天，活跃对数中期(约80%融合)生长的细胞(例如SW620细胞)分到RPMI(+10%FBS+L-谷氨酰胺(2mM)+青霉素/链霉素)培养基中。在96孔板的每个孔中接种约20,000个细胞。在第2天，将培养基从10%FBS变成无血清培养基-RPMI+0.5%FBS(+L-谷氨酰胺+青霉素/链霉素)培养基。在第3天，将HGF(经过刺激的对照)和各种抑制剂/抗体稀释到适当体积的无血清培养基中。每个孔加入100μL每种浓度的各抑制剂。允许抑制剂在37℃下孵育2小时。然后用冷PBS将细胞洗涤2次且稍后溶解于50微升/孔的MPER(目录号PI78505，VWRInternational)+150mM NaCl+蛋白酶和磷酸酶抑制剂缓冲液(以简易包装提供的cOmpleteTM蛋白酶抑制剂混合物片剂，目录号4693124001，RocheDiagnostics Corp；
Figure BDA0000489467110001073
磷酸酶抑制剂混合物片剂，目录号4906837001，Roche Diagnostics Corp)中。通常在溶解后5分钟内将溶解产物置于-80℃下。
为了测量pMet信号，使用ELISA试剂盒(人类磷酸化HGF R/c-METDuoSet IC经济装，目录号DYC2480E，R & D Systems)。用得自于R & DSystems的捕捉抗MET抗体涂布得自于的384孔高结合黑色固体板，最终浓度为每孔4μg/mL(于PBS缓冲液中)。将板留在室温下过夜。在第4天，在室温下将-80℃溶解产物解冻。然后在BIOTEK板洗涤器中用PBST(PBS+0.05%
Figure BDA0000489467110001075
)以50微升/孔将板洗涤3次。在室温下用50微升/孔的2%BSA/PBS将384孔板阻断1小时。将两份相同的溶解产物汇集到一个孔中且在2%BSA/0.1%Tween-20/25%MPER/PBS中稀释2倍。通过在2%BSA/0.1%
Figure BDA0000489467110001076
MPER/PBS中进行10次2倍连续稀释来制备重组标准曲线。用0.05%Tween-20/PBS洗涤ELISA板。一式四份地将20μL溶解产物从96孔板转移到384孔板。在室温下将板孵育2小时且用0.05%Tween-20/PBS洗涤3次。将20μL检测抗磷酸酪氨酸一抗4G10(目录号05-321，Millipore/Upstate)以1:1000稀释度加入到ELISA板中且在室温下孵育1小时。根据制造商的指导加入20μL
Figure BDA0000489467110001081
ELISA Pico化学发光底物(目录号PI37069，VWR International)且在
Figure BDA0000489467110001082
板读数器(PerkinElmer)上进行读数。对于数据分析，取两份相同样品的平均值且使用误差线来表示两份相同样品之间的标准偏差。使用GraphPad
Figure BDA0000489467110001083
软件(GraphPadSoftware,Inc.)经由针对4参数逻辑方程的数据回归来计算抑制曲线和相应的IC50值。
如图16中所示，所测试的所有分子都以类似方式抑制pMet信号传导，而与TFc核心区的特性无关。二价奥那单抗_39Egy4_2224、奥那单抗_39Egy4_帕尼单抗以及奥那单抗_39Egy4_西妥昔单抗变体抑制到与单价奥那单抗_39Egy4变体类似的程度。
等效内容
本领域技术人员应认识到或仅使用常规实验就能够确定并且实施本文中所描述的具体实施方案的许多等效内容。所附权利要求书打算涵盖所述等效内容。预期所附权利要求书中所公开的实施方案的任何组合都处于本公开的范围内。
以引用的方式并入
本文中所提到的美国和外国的专利及申请中的专利申请及公开中的每一个的公开内容明确地以全文引用的方式并入。

Claims (123)

1.一种抗体，其为串联Fc双特异性抗体(“TFcBA”)，其中所述TFcBA包含为单一抗c-Met结合位点的第一结合位点和至少一个特异性结合除c-Met以外的细胞表面受体的第二结合位点；任选地，细胞表面受体选自ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、RON、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、PDGFRα、PDGFRβ、c-Kit、AXL、ALK、CEA、CD44、EPCAM以及EphA2，其中所述抗c-Met结合位点和所述第二结合位点经由串联Fc(“TFc”)连接；
所述TFc包含第一Fc区和第二Fc区，各所述第一Fc区和第二Fc区具有C末端和N末端；所述第一Fc区和所述第二Fc区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接以形成连续多肽；且
所述第一Fc区与所述第二Fc区缔合以形成Fc二聚体。
2.根据权利要求1所述的TFcBA，其中
a.所述TFcBA抑制由HGF和由所述至少一个第二结合位点特异性结合的受体的同源配体中的任一者或两者诱导的信号转导，其中IC50等于或小于10nM或者等于或小于1nM或者等于或小于100pM，或最大抑制百分比为至少70%或至少80%或至少90%，如对c-Met和由所述至少一个第二结合位点特异性结合的所述受体中的任一者或两者的磷酸化的抑制所指示；或
b.所述TFcBA在细胞中的表达产生(i)更多正确形成的TFcAB分子，相对于不包含TFc的多价抗体的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcAB分子，如利用尺寸排除色谱法(SEC)所确定。
3.根据权利要求1或2所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区分别包含第一CH3域和第二CH3域，各所述CH3域具有C末端和N末端。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区分别包含第一CH2域和第二CH2域，各所述CH2域具有C末端和N末端。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区分别包含第一铰链和第二铰链，所述第一铰链和所述第二铰链各自具有C末端和N末端。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链不包含上铰链亚域。
7.根据权利要求6所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二CH2域以及第二CH3域。
8.根据权利要求6所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二CH2域以及第二CH3域。
9.根据权利要求6所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域。
10.根据权利要求9所述的TFcBA，其中所述第一铰链包含上铰链亚域、核心铰链亚域以及下铰链亚域，且所述第二铰链包含核心铰链亚域和下铰链亚域，但不包含上铰链亚域，各所述铰链亚域具有C末端和N末端。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的TFcBA，其中所述TFcBA所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链，所述第一铰链在其C末端处连接至第一CH2域的N末端，所述第一CH2域在其C末端处连接至第一CH3域的N末端，所述第一CH3域在其C末端处连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端处连接至第二铰链的N末端，所述第二铰链在其C末端处连接至第二CH2域的N末端，所述第二CH2域在其C末端处连接至第二CH3域的N末端。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含20到50个aas。
13.根据权利要求12所述的TFcBA，其中所述TFc接头是Gly-Ser接头。
14.根据权利要求13所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含(Gly4Ser)n，其中n为4、5、6、7或8。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是IgG1TFc。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是杂合TFc。
17.根据权利要求16所述的TFcBA，其中所述TFc是IgG1/IgG4TFc。
18.根据权利要求15所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一IgG1铰链、第一IgG1CH2域、第一IgG1CH3域、TFc接头、第二IgG1铰链、第二IgG1CH2域以及第二IgG1CH3域。
19.根据权利要求17所述的TFcBA，其中所述杂合TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一IgG1/IgG4铰链、第一IgG4CH2域、第一IgG1CH3域、TFc接头、第二IgG4铰链、第二IgG4CH2域以及第二IgG1CH3域。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰，所述修饰能增强或稳定所述第一Fc区与所述第二Fc区之间的结合。
21.根据权利要求20所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域各自包含氨基酸修饰，所述修饰是能增强所述第一CH3域与所述第二CH3域的缔合的缔合增强修饰(“AEM”)。
22.根据权利要求21所述的TFcBA，其中所述AEM是由从由AEM模块1、AEM模块2、AEM模块3以及AEM模块4组成的群组中选出的模块构成。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者包含aa修饰，所述修饰添加半胱氨酸作为插入或置换，所述半胱氨酸与另一个Fc区中的半胱氨酸一起形成二硫键(“DiS”修饰)。
24.根据权利要求23所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者在铰链中包含DiS修饰。
25.根据权利要求23所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者在CH3域中包含DiS修饰。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的TFcBA，其中所述DiS修饰由DiS模块1或DiS模块2构成。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域各自包含一个或多个AEM修饰和一个或多个DiS修饰。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域中的任一者或两者所包含的aa序列与从由SEQ IDNO:27-98组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
29.根据权利要求28所述的TFcBA，其中所述第一CH3域或所述第二CH3域所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:27-98组成的群组中选出。
30.根据权利要求1至28中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域一起包含两个不同的成员的配对，各成员是CH3aa序列，各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出：SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一CH3域所包含的配对成员与所述第二CH3域所包含的配对成员不同。
31.根据权利要求30所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域各自所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的CH3aa序列配对的一个成员的aa序列相同：SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ IDNO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ ID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ IDNO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ ID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ IDNO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
33.根据权利要求32所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
35.根据权利要求34所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的TFcBA，其包含CH2域，所述CH2域所包含的aa序列与SEQ ID NO:25、26、261或262具有至少70%同一性或与其在至多30个aa缺失、添加或取代方面不同。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域，其中
a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:4、18、19、263-265以及267-273组成的群组中选出；
b.所述第一CH2域经去糖基化且包含如SEQ ID NO:25所示出的aa序列；
c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98；
d.所述第二铰链所包含的aa序列由从SEQ ID NO:23、263-265以及267-273组成的群组中选出的序列组成；
e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:25中所示出的aa序列；且
f.所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第一序列。
38.根据权利要求1至36中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域，其中
a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出；
b.所述第一CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:26中所示出的aa序列；
c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98；
d.所述第二铰链所包含的aa序列由SEQ ID NO:24、263-265以及267-273组成；
e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:26中所示出的aa序列；且
f.所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第一序列。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区或所述第二Fc区所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同。
40.根据权利要求39中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区或所述第二Fc区所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出。
41.根据权利要求39所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列配对中的一个aa序列具有至少70%同一性：SEQ ID NO:99和100；SEQ ID NO:101和102；SEQ ID NO:103和104；SEQ ID NO:105和106；SEQID NO:107和108；SEQ ID NO:109和110；SEQ ID NO:111和112；SEQ IDNO:113和114；SEQ ID NO:115和116；SEQ ID NO:117和118；SEQ ID NO:119和120；SEQ ID NO:121和122；SEQ ID NO:123和124；SEQ ID NO:125和126；SEQ ID NO:127和128；SEQ ID NO:129和130；SEQ ID NO:131和132；SEQ ID NO:133和134；SEQ ID NO:135和136；SEQ ID NO:137和138；SEQID NO:139和140；SEQ ID NO:141和142；SEQ ID NO:143和144；SEQ IDNO:145和146；SEQ ID NO:147和148；SEQ ID NO:149和150；SEQ ID NO:151和152；SEQ ID NO:153和154；SEQ ID NO:155和156；SEQ ID NO:157和158；SEQ ID NO:159和160；SEQ ID NO:161和162；SEQ ID NO:163和164；以及SEQ ID NO:165和166，或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同，且其中所述第一Fc区所包含的配对成员与所述第二Fc区所包含的配对成员不同。
42.根据权利要求40所述的TFcBA，其中所述第一Fc区与所述第二Fc区一起包含两个不同的成员的配对，各成员是Fc aa序列，其中各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出：SEQ ID NO:99和100；SEQ ID NO:101和102；SEQ ID NO:103和104；SEQ ID NO:105和106；SEQ ID NO:107和108；SEQ ID NO:109和110；SEQ ID NO:111和112；SEQ ID NO:113和114；SEQ ID NO:115和116；SEQ ID NO:117和118；SEQ ID NO:119和120；SEQID NO:121和122；SEQ ID NO:123和124；SEQ ID NO:125和126；SEQ IDNO:127和128；SEQ ID NO:129和130；SEQ ID NO:131和132；SEQ ID NO:133和134；SEQ ID NO:135和136；SEQ ID NO:137和138；SEQ ID NO:139和140；SEQ ID NO:141和142；SEQ ID NO:143和144；SEQ ID NO:145和146；SEQ ID NO:147和148；SEQ ID NO:149和150；SEQ ID NO:151和152；SEQID NO:153和154；SEQ ID NO:155和156；SEQ ID NO:157和158；SEQ IDNO:159和160；SEQ ID NO:161和162；SEQ ID NO:163和164；以及SEQ IDNO:165和166，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一Fc区所包含的配对成员与所述第二Fc区所包含的配对成员不同。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性，或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
44.根据权利要求43所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221组成的群组中选出。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的TFcBA，其包含重链，所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：第一重链可变(VH)域、TFc、连接性接头以及第二VH域。
46.根据权利要求45所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头以及第二VH域。
47.根据权利要求46所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头、第二VH域、scFv接头以及第二轻链可变(VL)域，其中所述第二VH域与所述第二VL域缔合以形成第二结合位点。
48.根据权利要求47所述的TFcBA，其包含轻链，所述轻链包含第一VL域，所述第一VL域与所述第一VH域二聚以形成第一结合位点。
49.根据权利要求48所述的TFcBA，其中所述轻链包含轻链恒定(CL)域，所述CL域连接至所述VL域的羧基末端。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的TFcBA，其中所述第一结合位点是N末端结合位点，且所述第二结合位点是C末端结合位点。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的TFcBA，其中所述抗c-Met结合位点包含VH域，所述VH域包含以下各项中的任一者或两者：a)SEQ IDNO:223或287中的VH互补性决定区(CDR)3(VHCDR3)的aa序列；和b)VLCDR3，其包含SEQ ID NO:231或289中的VLCDR3的aa序列。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的TFcBA，其中所述c-Met结合位点包含VH域，所述VH域包含包括VHCDR1、VCDR2以及VHCDR3的三个VH互补性决定区(CDR)的集合，其中VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3包含SEQ ID NO:223或231中的VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3的aa序列；及VL域，所述VL域包含包括VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的三个VLCDR的集合，其中VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含SEQID NO:287或289中的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的aa序列。
53.根据权利要求1至52中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点为包含以下两项中的任一者或两者的抗EGFR结合位点：a)VHCDR3，其包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的VHCDR3的aa序列；和b)VLCDR3，其包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的VLCDR3的aa序列。
54.根据权利要求1至53中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点为抗EGFR结合位点，其包含VH域，所述VH域包含包括VHCDR1、VCDR2以及VHCDR3的三个VHCDR的集合，其中VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的VHCDR1、VHCDR2以及VHCDR3的aa序列；及VL域，所述VL域包含包括VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的三个VLCDR的集合，其中VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3包含SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的aa序列。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的TFcBA，其中所述抗c-Met结合位点包含所述重链的N末端部分和所述轻链的N末端部分。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点被完全被所述重链包含的C末端scFv包含。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的TFcBA，其中所述抗c-Met结合位点被VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与SEQ ID NO:223、231、287或289中所示出的VH域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同；且所述VL域所包含的aa序列与SEQ ID NO:223、231、287或289中所示出的VL域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的TFcBA，其中所述第二结合位点为抗EGFR结合位点，其被VH域和VL域中的任一者或两者包含，其中所述VH域所包含的aa序列与SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中所示出的VH域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同；且所述VL域所包含的aa序列与SEQ ID NO:233、237、258、275、277或279中所示出的VL域具有至少70%同一性或与其在至多10个aa缺失、添加或取代方面不同。
59.一种Ab，其为TFcBA，其中所述TFcBA包含第一结合位点和第二结合位点，其中所述第一结合位点结合第一标靶且所述第二结合位点结合第二标靶，其中
所述第一结合位点与所述第二结合位点经由TFc连接；
所述TFc包含第一Fc区和第二Fc区，所述第一Fc区和第二Fc区各自具有C末端和N末端；所述第一Fc区和所述第二Fc区经由具有C末端和N末端的TFc接头连接以形成连续多肽；
所述第一Fc区与所述第二Fc区缔合以形成Fc二聚体；且
所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰以增强或稳定所述第一Fc区与所述第二Fc区之间的结合。
60.根据权利要求59所述的TFcBA，其中
a.所述TFcBA抑制经由所述第一标靶和所述第二标靶中的任一者或两者进行的信号转导；或
b.所述TFcBA在细胞中的表达产生(i)更多正确形成的TFcAB分子，相对于不包含TFc的多价抗体的表达而言；或(ii)超过80%正确形成的TFcAB分子，如利用尺寸排除色谱法(SEC)所确定。
61.根据权利要求59或60所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区分别包含第一CH3域和第二CH3域，所述CH3域各自具有C末端和N末端。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区分别包含第一CH2域和第二CH2域，所述CH2域各自具有C末端和N末端。
63.根据权利要求59至62中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区分别包含第一铰链和第二铰链，所述第一铰链和所述第二铰链各自具有C末端和N末端。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链不包含上铰链亚域。
65.根据权利要求64所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二CH2域以及第二CH3域。
66.根据权利要求64所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二CH2域以及第二CH3域。
67.根据权利要求64所述的TFcBA，其中所述TFcBA中所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、TFc接头、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域。
68.根据权利要求67所述的TFcBA，其中所述第一铰链包含上铰链亚域、核心铰链亚域以及下铰链亚域，且所述第二铰链包含核心铰链亚域和下铰链亚域，但不包含上铰链亚域，所述铰链亚域各自具有C末端和N末端。
69.根据权利要求59至68中任一项所述的TFcBA，其中所述TFcBA所包含的TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链，所述第一铰链在其C末端处连接至第一CH2域的N末端，所述第一CH2域在其C末端处连接至第一CH3域的N末端，所述第一CH3域在其C末端处连接至TFc接头的N末端，所述TFc接头在其C末端处连接至第二铰链的N末端，所述第二铰链在其C末端处连接至第二CH2域的N末端，所述第二CH2域在其C末端处连接至第二CH3域的N末端。
70.根据权利要求59至69中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含20到50个aas。
71.根据权利要求70所述的TFcBA，其中所述TFc接头是Gly-Ser接头。
72.根据权利要求71所述的TFcBA，其中所述TFc接头包含(Gly4Ser)n，其中n为4、5、6、7或8。
73.根据权利要求59至72中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是IgG1TFc。
74.根据权利要求59至72中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc是杂合TFc。
75.根据权利要求74所述的TFcBA，其中所述TFc是IgG1/IgG4TFc。
76.根据权利要求73所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一IgG1铰链、第一IgG1CH2域、第一IgG1CH3域、TFc接头、第二IgG1铰链、第二IgG1CH2域以及第二IgG1CH3域。
77.根据权利要求75所述的TFcBA，其中所述杂合TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一IgG1/IgG4铰链、第一IgG4CH2域、第一IgG1CH3域、TFc接头、第二IgG4铰链、第二IgG4CH2域以及第二IgG1CH3域。
78.根据权利要求59至77中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域与所述第二CH3域中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰，所述修饰能增强或稳定所述第一Fc区与所述第二Fc区之间的结合。
79.根据权利要求78所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域各自包含氨基酸修饰，所述修饰是能增强所述第一CH3域与所述第二CH3域的缔合的缔合增强修饰(“AEM”)。
80.根据权利要求79所述的TFcBA，其中所述AEM是由从由AEM模块1、AEM模块2、AEM模块3以及AEM模块4组成的群组中选出的模块构成。
81.根据权利要求1至80中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者包含aa修饰，所述修饰添加半胱氨酸作为插入或置换，所述半胱氨酸与另一个Fc区中的半胱氨酸一起形成二硫键(“DiS”修饰)。
82.根据权利要求81所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者在铰链中包含DiS修饰。
83.根据权利要求81所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者在CH3域中包含DiS修饰。
84.根据权利要求80至83中任一项所述的TFcBA，其中所述DiS修饰是由DiS模块1或DiS模块2构成。
85.根据权利要求59至84中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域各自包含一个或多个AEM修饰和一个或多个DiS修饰。
86.根据权利要求1至85中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域中的任一者或两者所包含的aa序列与从由SEQ IDNO:27-98组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
87.根据权利要求28所述的TFcBA，其中所述第一CH3域或所述第二CH3域所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:27-98组成的群组中选出。
88.根据权利要求1至86中任一项所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域一起包含两个不同的成员的配对，各成员是CH3aa序列，各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出：SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一CH3域所包含的配对成员与所述第二CH3域所包含的配对成员不同。
89.根据权利要求88所述的TFcBA，其中所述第一CH3域和所述第二CH3域各自所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的CH3aa序列配对的一个成员的aa序列相同：SEQ ID NO:31和35；SEQ ID NO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ IDNO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ ID NO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ IDNO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ ID NO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ IDNO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98。
90.根据权利要求59至89中任一项所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
91.根据权利要求90所述的TFcBA，其中所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:4、18、19、20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
92.根据权利要求59至91中任一项所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列在至多3个aa缺失、添加或取代方面不同。
93.根据权利要求92所述的TFcBA，其中所述第二铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:23、24、263-265以及267-273组成的群组中选出的aa序列。
94.根据权利要求59至93中任一项所述的TFcBA，其包含CH2域，所述CH2域所包含的aa序列与SEQ ID NO:25、26、261或262具有至少70%同一性或与其在至多30个aa缺失、添加或取代方面不同。
95.根据权利要求1至94中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域，其中
a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:4、18、19、263-265以及267-273组成的群组中选出；
b.所述第一CH2域经去糖基化且包含如SEQ ID NO:25所示出的aa序列；
c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98；
d.所述第二铰链所包含的aa序列由从SEQ ID NO:23、263-265以及267-273组成的群组中选出的序列组成；
e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:25中所示出的aa序列；且
f.所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第一序列。
96.根据权利要求59至94中任一项所述的TFcBA，其中所述TFc按氨基到羧基末端的顺序包含：第一铰链、第一CH2域、第一CH3域、第二铰链、第二CH2域以及第二CH3域，其中
a.所述第一铰链所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:20、21、22、263-265以及267-273组成的群组中选出；
b.所述第一CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:26中所示出的aa序列；
c.所述第一CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98；
d.所述第二铰链所包含的aa序列由SEQ ID NO:24、263-265以及267-273组成；
e.所述第二CH2域经去糖基化且包含SEQ ID NO:26中所示出的aa序列；且
f.所述第二CH3域所包含的aa序列是从由以下各项组成的CH3域序列配对群组中选出的序列配对中的任一序列：SEQ ID NO:31和35；SEQ IDNO:33和37；SEQ ID NO:39和43；SEQ ID NO:41和45；SEQ ID NO:47和51；SEQ ID NO:49和53；SEQ ID NO:55和59；SEQ ID NO:57和61；SEQ IDNO:63和67；SEQ ID NO:65和69；SEQ ID NO:71和73；SEQ ID NO:72和74；SEQ ID NO:75和79；SEQ ID NO:77和81；SEQ ID NO:83和85；SEQ IDNO:84和86；SEQ ID NO:87和89；SEQ ID NO:88和90；SEQ ID NO:91和93；SEQ ID NO:92和94；SEQ ID NO:95和97；以及SEQ ID NO:96和98，其中如果所述第一CH3域包含序列配对的第一序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第二序列；且如果所述第一CH3域包含序列配对的第二序列，则所述第二CH3域包含所述序列配对的第一序列。
97.根据权利要求59至96中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区或所述第二Fc区所包含的aa序列与从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同。
98.根据权利要求97中任一项所述的TFcBA，其中所述第一Fc区或所述第二Fc区所包含的aa序列是从由SEQ ID NO:99-166组成的群组中选出。
99.根据权利要求97所述的TFcBA，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列配对中的一个aa序列具有至少70%同一性：SEQ ID NO:99和100；SEQ ID NO:101和102；SEQ ID NO:103和104；SEQ ID NO:105和106；SEQID NO:107和108；SEQ ID NO:109和110；SEQ ID NO:111和112；SEQ IDNO:113和114；SEQ ID NO:115和116；SEQ ID NO:117和118；SEQ ID NO:119和120；SEQ ID NO:121和122；SEQ ID NO:123和124；SEQ ID NO:125和126；SEQ ID NO:127和128；SEQ ID NO:129和130；SEQ ID NO:131和132；SEQ ID NO:133和134；SEQ ID NO:135和136；SEQ ID NO:137和138；SEQID NO:139和140；SEQ ID NO:141和142；SEQ ID NO:143和144；SEQ IDNO:145和146；SEQ ID NO:147和148；SEQ ID NO:149和150；SEQ ID NO:151和152；SEQ ID NO:153和154；SEQ ID NO:155和156；SEQ ID NO:157和158；SEQ ID NO:159和160；SEQ ID NO:161和162；SEQ ID NO:163和164；以及SEQ ID NO:165和166，或与其在至多50个aa缺失、添加或取代方面不同，且其中所述第一Fc区所包含的配对成员与所述第二Fc区所包含的配对成员不同。
100.根据权利要求99所述的TFcBA，其中所述第一Fc区与所述第二Fc区一起包含两个不同的成员的配对，各成员是Fc aa序列，其中各配对是从由以下各项组成的配对群组中选出：SEQ ID NO:99和100；SEQ ID NO:101和102；SEQ ID NO:103和104；SEQ ID NO:105和106；SEQ ID NO:107和108；SEQ ID NO:109和110；SEQ ID NO:111和112；SEQ ID NO:113和114；SEQ ID NO:115和116；SEQ ID NO:117和118；SEQ ID NO:119和120；SEQID NO:121和122；SEQ ID NO:123和124；SEQ ID NO:125和126；SEQ IDNO:127和128；SEQ ID NO:129和130；SEQ ID NO:131和132；SEQ ID NO:133和134；SEQ ID NO:135和136；SEQ ID NO:137和138；SEQ ID NO:139和140；SEQ ID NO:141和142；SEQ ID NO:143和144；SEQ ID NO:145和146；SEQ ID NO:147和148；SEQ ID NO:149和150；SEQ ID NO:151和152；SEQID NO:153和154；SEQ ID NO:155和156；SEQ ID NO:157和158；SEQ IDNO:159和160；SEQ ID NO:161和162；SEQ ID NO:163和164；以及SEQ IDNO:165和166，各成员aa序列与各所述配对的各序列具有至少70%同一性，或在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同，其中所述第一Fc区所包含的配对成员与所述第二Fc区所包含的配对成员不同。
101.根据权利要求59至100中任一项所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列与从由以下各项组成的群组中选出的aa序列具有至少70%同一性：SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221，或与其在至多30个aa添加、缺失或取代方面不同。
102.根据权利要求101所述的TFcBA，其包含TFc，所述TFc所包含的aa序列是从由以下各项组成的群组中选出：SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219以及221。
103.根据权利要求59至102中任一项所述的TFcBA，其包含重链，所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：第一重链可变(VH)域、TFc、连接性接头以及第二VH域。
104.根据权利要求103所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头以及第二VH域。
105.根据权利要求104所述的TFcBA，其中所述重链按氨基到羧基末端的顺序包含：第一VH域、CH1域、TFc、连接性接头、第二VH域、scFv接头以及第二轻链可变(VL)域，其中所述第二VH域与所述第二VL域缔合以形成第二结合位点。
106.根据权利要求105所述的TFcBA，其包含轻链，所述轻链包含第一VL域，所述第一VL域与所述第一VH域二聚以形成第一结合位点。
107.根据权利要求106所述的TFcBA，其中所述轻链包含连接至所述VL域的羧基末端的轻链恒定(CL)域。
108.根据权利要求59至107中任一项所述的TFcBA，其中所述第一结合位点是抗c-Met结合位点，且所述第二结合位点是抗EGFR结合位点。
109.一种单价TFcA，其包含与TFc连接的结合位点，所述TFc包含经由TFc接头连接的第一Fc区和第二Fc区，其中所述第一Fc区和所述第二Fc区缔合以形成Fc，且其中所述第一Fc区和所述第二Fc区中的任一者或两者包含一个或多个aa修饰以增强或稳定所述第一Fc区与所述第二Fc区之间的结合。
110.根据权利要求1至109中任一项所述的TFcA或TFcBA，其为电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中
电荷互补配对型TFcA或TFcBA是包含一对带电氨基酸的TFcA或TFcBA，所述一对带电氨基酸包含选自群组A的氨基酸和选自群组B的氨基酸(电荷互补对)；
其中群组A包含pI大于7的所有天然氨基酸，且群组B包含pI小于7的所有天然氨基酸，或任选地，其中群组A包含His、Lys以及Arg，且群组B包含Asp、Glu、Asn、Phe、Gln、Tyr、Ser、Met、Thr、Ile、Gly、Val、Trp、Leu、Ala以及Pro；且
所述电荷互补对由第一氨基酸残基和第二氨基酸残基组成；并且
所述电荷互补对为297位电荷互补对或299位电荷互补对，其中
297位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一Fc区的EU297位且所述第二氨基酸残基位于所述第二Fc区的EU297位的电荷互补对，并且299位电荷互补对是所述第一氨基酸残基位于所述第一Fc区的EU299位且所述第二氨基酸残基位于所述第二Fc区的EU299位的电荷互补对。
111.根据权利要求110所述的电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA包含297位电荷互补对和299位电荷互补对，其中所述297位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基与所述299位电荷互补对的第一氨基酸残基和第二氨基酸残基相同或不同。
112.根据权利要求110或111所述的电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA包含297位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的297位电荷互补对的氨基酸之一。
113.根据权利要求110、111或112所述的电荷互补配对型TFcA或TFcBA，其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA包含299位电荷互补对，且其中所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA与不是电荷互补配对型TFcA或TFcBA但除了对应于所述第一氨基酸残基和所述第二氨基酸残基的氨基酸残基都是由相同带电氨基酸组成的残基以外与所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA一致的TFcA或TFcBA相比更稳定，所述相同带电氨基酸是所述电荷互补配对型TFcA或TFcBA的299位电荷互补对的氨基酸之一。
114.根据权利要求59至113中任一项所述的TFcA或TFcBA，其中所述第一结合位点或所述第二结合位点特异性结合从由以下各项组成的群组中选出的人类蛋白质：ErbB2、ErbB3、ErbB4、IGF1R、IGF2R、胰岛素受体、Ron、c-Met、EGFR、VEGFR1、VEGFR2、TNFR、FGFR1FGFR2、FGFR3、FGFR4、PDGFRα、PDGFRβ、c-Kit、EPCAM以及EphA2。
115.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至114中任一项所述的TFcA或TFcBA和药学上可接受的载体。
116.一种核酸分子，其包含至少一个编码序列，所述至少一个编码序列编码根据权利要求1至114中任一项所述的TFcA或TFcBA的重链或轻链。
117.一种核酸分子，其包含至少两个编码序列，其中一个编码序列编码根据权利要求1至114中任一项所述的TFcA或TFcBA的重链，且第二编码序列编码所述TFcBA的轻链。
118.一种载体，其包含一个或多个根据权利要求116或117所述的核酸分子。
119.一种细胞，其包含一种或多种根据权利要求118所述的载体或根据权利要求116或117所述的核酸分子。
120.一种细胞，其包含编码根据权利要求1至114中任一项所述的TFcA或TFcBA的重链的核酸分子和编码所述TFcA或TFcBA的轻链的核酸分子。
121.一种产生TFcA或TFcBA的方法，其包括在表达核酸的条件下培养根据权利要求119或120所述的宿主细胞，以及分离所述TFcA或TFcBA。
122.一种用于产生TFcA或TFcBA的方法，其包括在适合于表达所述TFcA或TFcBA的条件下培养根据权利要求119或120所述的细胞。
123.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至120中任一项所述的TFcA或TFcBA、核酸分子或载体。
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