CN107428830A - 单体fc结构域 - Google Patents

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Abstract

提供了单体Fc结构域，以及包含单体Fc结构域的多体和单链蛋白。这些蛋白质在治疗疾病中具有效用。尤其包括多特异性多肽。

Description

单体FC结构域
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月5日提交的美国临时申请号62/099,634的权益，将该申请通过引用以其全文(包括任何附图)并入本文
序列表的引用
本申请是连同电子格式的序列表提交的。序列表被提供为题为“NTECH2PCT_ST25txt”的文件，创建于2015年12月31日，大小是100KB。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文并入本文。
技术领域
提供了单体Fc结构域，以及包含单体Fc结构域的多体和单链蛋白。这些蛋白质在治疗疾病中具有效用。尤其包括多特异性多肽。
背景技术
抗体片段如Fab、Fv、scFv、VH和VHH以及更新的抗体片段形式正在开发中，其具有减小的尺寸并且可以提供改善的组织渗透，例如用于治疗实体瘤。还针对结合两种不同表位的双特异性抗体开发了新的形式，提供了增加特异性、扩大效力和利用传统单克隆抗体无法实现的新作用机制的机会。然而，与全尺寸IgG相比，这些形式中的许多具有非常短的半衰期。
Fc结构域通过其与新生儿Fc受体(FcRn)的独特的pH依赖性关联而增加IgG的半衰期。在内化后，IgG的Fc结构域可以在核内体的酸性环境中与FcRn结合，使得IgG然后循环到细胞表面并重新释放到循环中。这种生物系统保护IgG免于降解并导致长的血清半衰期。Fc结构域和治疗性分子的融合物具有延长的半衰期。另外，由于IgG的Fc片段由紧凑的同源二聚体组成，所以每个分子中存在两种治疗性蛋白。产生较小单体Fc融合物的一种方法涉及将突变引入CH3结构域以阻止CH3-CH3同源二聚化(参见例如，WO 2013/138643和WO 2011/063348)。然而，当给予人时，引入突变涉及免疫原性的风险。
因此，仍然需要产生允许使用单体Fc结构域的新蛋白形式。
发明内容
本发明来自于具有串联排列的两个免疫球蛋白CH3结构域的Fc多肽构建体的发现，该Fc多肽构建体产生其中Fc结构域保持单体并与新生儿Fc受体(FcRn)相互作用的功能蛋白。该构建体允许构建一系列单链和多链(多体)蛋白，包括但不限于单链和多体双特异性结合蛋白，例如抗体。
单多肽链中的两个CH3结构域(称为“串联CH3结构域”)可以并入到任何含有Fc结构域的分子中，例如在相同多肽链和/或与含有串联CH3结构域的多肽链多聚化的另外的多肽链上包含其他氨基酸序列或蛋白结构域的分子。尽管Fc结构域保持单体(例如，不是由经历CH3-CH3二聚化的两个Fc结构域形成的Fc二聚体)，但是含有串联CH3结构域的蛋白质可以是单体的或多体的(含有多于一条多肽链，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体)。
含有串联CH3结构域的多肽链典型地可以包含与两个CH3结构域之一连接的CH2结构域，以及任选地另外的感兴趣的蛋白结构域，例如免疫球蛋白可变区如重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，和/或通常任何抗原结合结构域。该结构域可以例如直接与CH2或CH3结构域融合，或通过氨基酸残基的插入序列如肽接头、铰链、CH1结构域或CK结构域等融合。在两个CH3结构域之间的串联CH3结构域内提供合适的接头(例如任何氨基酸序列或其他柔性分子)允许CH3结构域通过非共价相互作用彼此相关联。因此，两个CH3结构域不可用于与其他多肽链的CH3-CH3二聚化，从而避免含有CH3结构域的分子之间的同源二聚化。在一个实例中，将串联CH3结构域并入另外包含CH2结构域的多肽中，得到保持单体的Fc结构域。具有单体Fc结构域的单多肽链可以照原样使用，或可以与其他多肽链结合，以产生具有单体Fc结构域的多体多肽。
本文披露的这些含Fc结构域的分子具有容纳天然CH3结构域的优点。这些分子也可容易地产生。它们还可以含有多于一个功能蛋白结构域，例如抗原结合结构域，允许产生宽范围的含Fc结构域的分子。特别地，可以产生具有结合新生儿Fc(FcRn)受体的单体Fc结构域的双特异性抗体。
在一个方面，提供了串联CH3结构域。在一个方面，提供了包含CH2结构域和串联CH3结构域的Fc结构域。在一个方面，提供了包含串联CH3结构域或Fc结构域的多肽链。在一个方面，提供了包含如下多肽链的多体多肽，该多肽链包含这种串联CH3结构域。在一个实施例中，串联CH3结构域的两个CH3结构域通过柔性肽接头分开。在一个实施例中，串联CH3结构域的两个CH3结构域通过非共价相互作用彼此相关联。在一个实施例中，两个CH3结构域通过每个CH3结构域的CH3二聚化界面彼此相关联。在一个实施例中，串联CH3结构域不能进一步CH3-CH3二聚化(例如，与另一多肽链的CH3结构域)。
在一个实施例中，提供了包含第一和第二CH3结构域的多肽链，其中两个CH3结构域通过非共价相互作用彼此相关联。在一个实施例中，两个CH3结构域通过每个CH3结构域的CH3二聚化界面彼此相关联。在一个实施例中，该多肽链不与包含Fc结构域的另一多肽链二聚化。
在一个实施例中，提供了具有单体Fc结构域的多体(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体)蛋白，该蛋白质包含如下多肽链，该多肽链包含Fc结构域，该Fc结构域包含CH2结构域和串联CH3结构域。在一个实施例中，Fc结构域的两个CH3结构域通过非共价相互作用彼此相关联。
在本文任何方面的一个实施例中，第一CH3结构域通过接头连接到第二CH3结构域。因此，串联CH3结构域可以被置于相同的多肽链上，以具有如下的结构域排列：
–CH3–接头–CH3–
接头将是柔性接头(例如肽接头)。在一个实施例中，该接头允许CH3结构域通过非共价相互作用彼此相关联。在一个实施例中，该接头是具有10-50个氨基酸残基的肽接头。在一个实施例中，该接头具有式(G4S)x。任选地，x是2、3、4、5或6。
在任何实施例中，每个CH3结构域独立地是人全长和/或天然CH3结构域，或保留功能性CH3二聚化界面的片段或经修饰的CH3结构域(例如其保留经历与另一个CH3结构域的CH3-CH3二聚化的能力)。
在本文的任何实施例中，用于在串联CH3结构域或Fc结构域中使用的示例性CH3结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少70％、80％、90％、95％或98％一致的序列。
在本文的任何实施例中，示例性串联CH3结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其至少70％、80％、90％、95％或98％一致的序列。
在一个方面，提供了包含单体Fc结构域的多肽，该单体Fc结构域包含天然CH3结构域(即，其保留功能性CH3二聚化界面)。在一个方面，该多肽是单体多肽。在一个方面，该多肽是包含单体Fc结构域的多体多肽。在一个实施例中，串联CH3结构域不能进一步CH3-CH3二聚化(即，与多肽的另一CH3结构域)。
在任何实施例的一个方面，提供了包含串联CH3结构域的分离的单链多肽。还提供了包含串联CH3结构域的单链Fc结构域分子，如包括单体Fc结构域分子或串联CH3结构域的融合蛋白。在一个实施例中，Fc结构域分子包含与Fc结构域融合的可溶性多肽。在一个实施例中，Fc结构域分子包含与Fc结构域融合的细胞表面受体的细胞外结构域(ECD)，任选地经由氨基酸残基的插入序列(例如接头、蛋白结构域等)。Fc融合多肽的一个实例是具有如下结构域排列的多肽，从N-端(左)至C-端(右)：
(ECD)–CH2–CH3–接头-CH3。
在一个实施例中，融合蛋白是单体或多体抗体衍生的多肽。这些分子包括在Fc结构域或CH3结构域的N-端或C-端融合的另外的多肽。在一些非限制性实例中，异源蛋白是感兴趣的蛋白(在以下的结构域排列中显示为(P))、抗原结合结构域(ABD)、免疫球蛋白可变结构域、细胞因子或受体多肽。蛋白(P)可以是任何所希望的氨基酸残基序列，例如1-20、20-50、10-100、1-200、1-500或20-500个氨基酸残基的序列。串联CH3结构域可以包含在具有以下结构域排列之一的多肽链中，该多肽链可以保持单体或可以与另外的多肽链关联以形成具有单体Fc结构域的多体多肽：
(P)–CH2–CH3–接头-CH3，
(ABD)–CH2–CH3–接头-CH3，
或
(scFv)–CH2–CH3–接头-CH3。
如果需要，异源多肽可以融合到Fc结构域或CH3结构域的N-端和C-端，例如串联CH3结构域可以与感兴趣的第一和第二蛋白(在以下的结构域排列中显示为(P1和P2))一起包含于多肽链中，根据以下示例性结构域排列：
(P1)–CH2–CH3–接头–CH3–(P2)。
具有单体Fc结构域的多体抗体衍生的多肽的实例包括具有以下结构域排列的多肽，其中多肽链可以通过CH1-CK异源二聚化(CH1和CK之间显示的键联)彼此相关联，在相应互补CH1和CK结构域之间形成链间非共价键，以及任选地另外的二硫键。
一个实例如下所示：
其中一条链中的可变区是VH，并且另一条链中的可变区是VL，使得VH和VL形成结合感兴趣的抗原的抗原结合结构域，并且其中一条链的CH1或CK恒定区是CH1，并且另一条链中的CH1或CK恒定区是CK，使得相应链中的CH1和CK通过非共价键(以及任选地另外的二硫键)相关联。每条多肽链可以任选地在其N-端和/或C-端包含一个或多个结构域。在一个实施例中，铰链结构域位于CH1或CK结构域和CH2结构域之间。
蛋白结构域排列的实例包括：
每条多肽链可以任选地在其N-端和/或C-端包含一个或多个结构域。在一个实施例中，铰链结构域位于CH1或CK结构域和CH2结构域之间。在本文任何多肽的一个实施例中，VH或VK结构域或者CH1或CK(或Cλ)结构域将经由铰链区融合到Fc结构域(例如或其CH2结构域)。
这些抗体还特别适合用作多特异性(例如双特异性)结合蛋白。例如，双特异性蛋白可结合待消除的靶细胞上的第一抗原和免疫效应细胞(例如NK细胞和/或T细胞)上的第二抗原，其中效应细胞被引导至靶细胞，例如癌细胞。多特异性抗体保留FcRn结合但缺乏FcγR结合，使得多特异性抗体具有吸引人的体内药效学，但对于感兴趣的特定效应细胞(即表达第二抗原的细胞)是有选择性的，从而降低除表达抗体所结合的特定效应细胞表面抗原的那些以外的免疫细胞介导的毒性。多特异性多肽能够例如引导表达感兴趣的抗原的效应细胞来裂解表达靶抗原例如癌抗原、病毒抗原等的靶细胞。多特异性抗体在以单价方式结合效应细胞表面蛋白和第二抗原(靶细胞表达的抗原)两者时特别有效。
在一个实施例中，提供了各自以单价方式结合第一和第二抗原的多特异性(例如双特异性)多肽，其包含：特异性地结合到感兴趣的第一抗原的第一抗原结合结构域(ABD1)、特异性地结合到感兴趣的第二抗原的第二抗原结合结构域(ABD2)以及由柔性接头分开的第一和第二人CH3结构域。在一个实施例中，由柔性接头分开的第一和第二人CH3结构域居于第一和第二抗原结合结构域之间。在一个实施例中，人CH2结构域置于ABD和CH3结构域之间。在一个实施例中，第一和第二抗原结合结构域各自包含免疫球蛋白可变重结构域和可变轻结构域。在一个实施例中，第一和第二抗原结合结构域各自为scFv。
实例包括具有以下结构域排列的多肽，其中多肽链可以通过CH1-CK异源二聚化(CH1和CK之间显示的键联)彼此相关联，在相应互补CH1和CK结构域之间形成链间非共价键，以及任选地另外的二硫键。
一个实例如下所示：
其中两个scFv中的每个形成结合感兴趣的抗原(例如两种不同抗原)的抗原结合结构域，并且其中一条链的CH1或CK恒定区是CH1，并且另一条链中的CH1或CK恒定区是CK，使得相应链中的CH1和CK通过非共价键(以及任选地另外的二硫键)相关联。每条多肽链可以任选地在其N-端和/或C-端包含一个或多个结构域。在一个实施例中，铰链结构域位于CH1或CK结构域和CH2结构域之间。
在任何多特异性多肽的一个实施例中，每个CH3结构域(或其片段)具有天然人CH3结构域(或其片段)的氨基酸。任选地，与全长野生型人IgG1抗体相比，多特异性多肽(和/或其Fc结构域)具有减少的与人Fcγ受体的结合。在一个实施例中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域由Fc结构域分开，该Fc结构域从N-端至C-端包含人CH2结构域、第一人CH3结构域、柔性氨基酸接头和第二人CH3结构域。
在任何多特异性多肽的一个实施例中，两个CH3结构域通过非共价相互作用彼此相关联。在一个实施例中，两个CH3结构域通过每个CH3结构域的CH3二聚化界面彼此相关联。在一个实施例中，串联CH3结构域不能进一步CH3-CH3二聚化(即，与另一CH3结构域或包含其的多肽)。
在一个实施例中，多特异性多肽(和/或其Fc结构域)能够结合人新生儿Fc受体(FcRn)。
在一个实施例中，多特异性多肽不与另一种Fc衍生的多肽形成二聚体(例如不与另一种相同多肽形成同源二聚体)。
在双特异性多肽的一个实例中，串联CH3结构域可以包含在具有以下结构域排列的多肽链中，该多肽链可以保持单体或可以与另外的多肽链关联以形成具有单体Fc结构域的多体多肽：
(ABD1)–CH2–CH3–接头-CH3–(ABD2)
任选地，该多肽另外包含连接上述结构域之间的氨基酸。在一个实施例中，CH1或CK结构域或其片段、铰链区或其片段、和/或接头肽可以置于ABD1和CH2之间。在一个实施例中，CH1或CK结构域或其片段、铰链区或其片段、和/或接头肽可以置于CH3和ABD2之间。
具有单体Fc结构域的多体抗体衍生的双特异性多肽的实例包括具有以下结构域排列的多肽，其中多肽链可以通过CH1-CK异源二聚化(CH1和CK之间显示的键联)彼此相关联，在相应铰链结构域之间和/或互补CH1和CK结构域之间形成链间二硫键：
在本文任何实施例的一个方面，ABD1和/或ABD2各自独立地包含scFv、亲和体、VH结构域、VL结构域、单结构域抗体(纳米抗体)如V-NAR结构域或VHH结构域。任选地，ABD1和ABD2各自包含scFv、亲和体、VH结构域、VL结构域、或单结构域抗体(纳米抗体)如V-NAR结构域或VHH结构域。任选地，每个ABD1和ABD2各自是人或人源化scFv、亲和体、VH结构域、VL结构域、单结构域抗体(纳米抗体)如V-NAR结构域或VHH结构域。
在本文任何实施例的一个方面，多肽可以(或可以不)在C-端和/或N-端另外包含额外的蛋白结构域，例如另外的ABD、可变结构域、scFv等。
在一个实施例中，例如，与全长野生型人IgG1抗体相比，多肽(和/或其Fc结构域)具有减少的与人Fcγ受体(例如CD16、CD32A、CD32B和/或CD64)的结合(即经由其Fc结构域)。在一个实施例中，与例如具有人IgG1同种型的野生型Fc结构域的相同多肽相比，该多肽具有减少的(例如部分或完全丧失)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、FcR介导的细胞激活(例如通过FcR交联的细胞因子释放)和/或FcR介导的血小板激活/消耗，如由不表达由多肽的抗原结合结构域结合的感兴趣的抗原的免疫效应细胞介导的(即在不存在表达由抗原结合结构域结合的感兴趣的抗原的细胞的情况下)。
抗原结合结构域(当存在时)可以包含抗体重链可变结构域和轻链可变结构域，任选地第一抗原结合结构域包含scFv。
在一个实施例中，第一或第二抗原结合结构域(当存在时)各自独立地包含抗体重链可变结构域和轻链可变结构域，任选地第一抗原结合结构域包含scFv。
在一个实施例中，串联CH3结构域基本上不能在溶液中与另一种Fc衍生的多肽形成CH3-CH3二聚体。例如，串联CH3结构域不与另一种相同的多肽形成二聚体，或者不与野生型人IgG重链形成二聚体。
在一个实施例中，与野生型CH2结构域相比，CH2结构域包含减少与人Fcγ受体的结合的氨基酸修饰。在一个实施例中，Fc多肽在残基N297处包含N联糖基化。在一个实施例中，Fc多肽缺乏N联糖基化或在残基N297处具有经修饰的N联糖基化。在一个实施例中，Fc多肽包含N297X突变(EU编号)，其中X是除天冬酰胺之外的任何氨基酸。
在本文任何实施例的一个方面，多肽是双特异性多肽，其包含结合癌抗原的第一抗原结合结构域和结合由免疫效应细胞表达的抗原的第二抗原结合结构域，其中该蛋白质具有针对癌抗原(或者病毒或细菌抗原)的比针对免疫效应细胞表达的抗原更高的结合亲和力(单价的)。这样的多肽将提供有利的药理学特性。该多肽将更加密切地模拟(尽管具有更好的特异性)天然抗体，其具有针对靶抗原的较高亲合力和针对Fc受体的较低亲和力。在本发明的任何实施例的一个方面，针对与免疫效应细胞表达的抗原的结合(单价的)，该多肽具有少于10-6M，任选地少于10-7M，任选地少于10-8M，或任选地少于10-9M的Kd。在本发明的任何实施例的一个方面，针对与免疫效应细胞表达的抗原的结合(单价的)，该多肽具有少于10-7M，任选地少于10-8M，任选地少于10-9M，或任选地少于10-10M的Kd。在一个实施例中，该多肽(单价的)结合癌、病毒或细菌抗原的Kd小于(即，具有更好的结合亲和力)(单价的)结合免疫效应细胞表达的抗原的Kd。例如，该多肽(单价的)结合癌、病毒或细菌抗原的Kd比(单价的)结合免疫效应细胞表达的抗原的Kd小至少5倍，任选地小至少10倍。
在本文任何多肽的一个实施例中，多特异性多肽能够引导表达感兴趣的第一或第二抗原中的一种的效应细胞(例如T细胞、NK细胞)来裂解表达所述感兴趣的第一或第二抗原中的另一种的靶细胞(例如癌细胞)。
在本文任何实施例的一个方面，提供了编码本披露的任何蛋白质的多肽链的重组核酸。在本文任何实施例的一个方面，提供了包含编码本披露的任何蛋白质的多肽链的核酸的重组宿主细胞，任选地其中该宿主细胞产生本披露的蛋白质，其产量(纯化后的最终生产力)是至少1、2、3或4mg/L。还提供了试剂盒或一组核酸，其包含编码本披露的第一多肽链的重组核酸，编码本披露的第二多肽链的重组核酸，以及任选地编码本披露的第三、第四和/或第五多肽链的重组核酸。还提供了制备本披露的单体或多体蛋白的方法。
在一个实施例中，本发明提供了制备蛋白质(例如任何异源二聚体、三聚体、四聚体或五聚体蛋白)的方法，该方法包括：
a)提供编码包含如本文所述的串联CH3结构域的多肽链的第一核酸；
b)任选地提供编码本文所述的另外的多肽链(例如经由非共价和/或共价相互作用与(a)的链相关联的链)的另外的核酸；并且
c)在宿主细胞中表达所述第一(和任选地另外的)核酸以分别产生包含所述第一(和任选地另外的)多肽链的蛋白质；并且回收单体(或任选地异源二聚体、异源三聚体、异源四聚体或五聚体)蛋白。任选地，步骤(c)包括将所产生的蛋白质加载到亲和纯化支持体上，任选地亲和交换柱，任选地蛋白质A支持体或柱，并收集异源二聚体蛋白；和/或将所产生的蛋白质(例如，加载到亲和交换或蛋白质A柱上后收集的蛋白质)加载到离子交换柱上；并且收集单体(或任选地异源二聚体、异源三聚体、异源四聚体或五聚体)部分。
在本文任何蛋白质的一个实施例中，提供了包含多种本文所述的含有串联CH3结构域的蛋白质的组合物，其中含有串联CH3结构域的蛋白质的至少70％、80％、90％、95％或98％具有单体Fc结构域(在与第二多肽二聚化时不具有二聚Fc结构域)。在一个实施例中，含有串联CH3结构域的蛋白质的至少70％、80％、90％、95％或98％是单体(即，单链多肽)。在一个实施例中，含有串联CH3结构域的蛋白质的至少70％、80％、90％、95％或98％是二聚体。在一个实施例中，含有串联CH3结构域的蛋白质的至少70％、80％、90％、95％或98％是三聚体。在一个实施例中，含有串联CH3结构域的蛋白质的至少70％、80％、90％、95％或98％是四聚体。
这些方法中的任何一种可以进一步表征为包括本申请中描述的任何步骤，特别包括在“具体实施方式”中的任何步骤。本发明另外涉及可通过本发明方法中的任何一种获得的抗体。本披露另外涉及本发明的抗体的药物或诊断配制品。本披露另外涉及在治疗或诊断方法中使用抗体的方法。
可以在本文的其他地方进一步说明本发明的这些和另外的有利方面和特征。
附图说明
图1A、1B和1C显示了包含具有串联CH3结构域的单体Fc结构域的单体多特异性多肽的实例。
具体实施方式
定义
如在说明书中使用的，“一种/一个(a或an)”可以意指一种/一个或多种/多个。如在权利要求中使用的，当与词“包含(comprising)”结合使用时，这些词“一种/一个(a或an)”可以意指一种/一个或多于一种/一个。
当使用“包含”时，这可以任选地被“基本上由......组成”替代或任选地被“由......组成”替代。
如本文所用的，术语“抗原结合结构域”是指包含能够免疫特异性地结合到表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施例中，所述结构域可以包含高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施例中，该结合结构域可以包含抗体链的至少一个互补决定区(CDR)。在另一个实施例中，该结合结构域可以包含来自非免疫球蛋白支架的多肽结构域。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体包括全长单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段和衍生物，只要它们展现所希望的生物活性即可。例如，在以下文献中提供了与生产抗体相关的各种技术：Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1988)[Harlow等人，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州，(1988)]。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，例如抗原结合区或其可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv(典型地为抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv)、dsFv、Fd片段(典型地为VH和CH1结构域)和dAb(典型地为VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；迷你抗体、双抗体、三抗体、四抗体和κ体(参见例如，Ill etal.,Protein Eng 1997；10:949-57[Ill等人，蛋白质工程1997；10：949-57])；骆驼IgG；IgNAR；和由抗体片段形成的多特异性抗体片段以及一个或多个分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以关联或连接在一起以形成功能性抗体片段。已经在例如以下文献中描述或综述了各种类型的抗体片段：Holliger and Hudson,NatBiotechnol2005；23,1126-1136[Holliger和Hudson，自然生物技术2005；23，1126-1136]；WO 2005040219和公开的美国专利申请20050238646和20020161201。
如本文所用的，术语“抗体衍生物”包含全长抗体或抗体片段，例如至少包含抗原结合区或其可变区，其中一个或多个氨基酸例如通过烷基化、PEG化、酰化、酯形成或酰胺形成等被化学修饰。这包括但不限于PEG化抗体、半胱氨酸-PEG化抗体及其变体。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，在轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat et al.1991[Kabat等人1991])和/或来自“高变环”的那些残基(例如，在轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol 1987；196:901-917[Chothia和Lesk，分子生物学1987；196：901-917])。典型地，这个区域中的氨基酸残基的编号通过Kabat等人，同上中所描述的方法进行。短语如本文的“Kabat位置”、“如在Kabat中对可变结构域残基进行编号”和“根据Kabat”是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际直链氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的FR或CDR的缩短或插入的更少的或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)以及在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。可以通过在抗体序列与“标准”Kabat编号序列的同源性区域进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。
如本文所用的，“框架”或“FR”残基意指排除定义为CDR的那些区域的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步细分为由CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
如本文所定义的，“恒定区”意指由轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因之一编码的抗体衍生恒定区。如本文所用的，“恒定轻链”或“轻链恒定区”意指由κ(Cκ)或λ(Cλ)轻链编码的抗体区域。恒定轻链典型地包含单个结构域，并且如本文所定义的，是指Cκ或Cλ的位置108-214，其中编号是根据EU索引(Kabat et al.,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.,United States Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda[Kabat等人，1991，免疫学上感兴趣的蛋白质序列，第5版，美国公共卫生署，国立卫生研究院，贝塞斯达])。如本文所用的，“恒定重链”或“重链恒定区”意指由μ、δ、γ、α或ε基因编码的抗体区域，以将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE。对于全长IgG抗体，如本文所定义的，恒定重链是指CH1结构域的N-端到CH3结构域的C-端，因此包含位置118-447，其中编号是根据EU索引。
如本文所用的，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离情况下的这种区域，或在多肽、多特异性多肽或ABD或者如本文概述的任何其他实施例的背景下的这种区域。
如本文所用的，“单链Fv”或“scFv”意指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单多肽链中。通常，Fv多肽另外包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，该多肽接头使scFv能够形成所希望的用于抗原结合的结构。用于产生scFv的方法是本领域公知的。关于产生scFv的方法的综述，参见Pluckthun in The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)[Pluckthun，单克隆抗体的药理学，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，施普林格出版社，纽约，第269-315页(1994)]。
如本文所用的，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单个抗体的VL和VH结构域的多肽。
如本文所用的，“Fc”或“Fc区”意指包含除了第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及在这些结构域的N-末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2(CH2)和Cγ3(CH3)以及Cγ1和Cγ2之间的铰链。尽管Fc区的边界可以改变，人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基末端包含残基C226、P230或A231，其中编号是根据EU索引。Fc可以指分离情况下的这种区域，或在如下所述的Fc多肽的背景下的这种区域。如本文所用的，“Fc多肽”或“Fc衍生多肽”意指包含全部或部分Fc区的多肽。Fc多肽包括但不限于抗体、Fc融合物和Fc片段。
IgG的“”铰链、“铰链区”或“铰链结构域”根据Kabat系统通常定义为包括Glu216且在人IgG1的Pro230处终止，但功能上，该链的柔性部分可被认为包括称为上下铰链区的另外的残基，例如从Glu216至Gly237(Roux et al.,1998J Immunol 161:4083[Roux等人，1998免疫学杂志161：4083])，并且下铰链已被看作Fc区的残基233至239。如本文所用的，“铰链”包括上下铰链区。其他IgG同种型的铰链区可以通过放置第一个和最后一个半胱氨酸残基形成重链间S—S结合而与IgG1序列对齐。虽然边界可能稍微变化，如根据Kabat系统编号，CH1结构域与免疫球蛋白重链分子的铰链区的VH结构域和氨基末端相邻，并且包括免疫球蛋白重链的第一(氨基最末端)恒定区结构域，例如从约EU位置118-215。Fc结构域从氨基酸231延伸至氨基酸447；CH2结构域为从约Ala231至Lys340或Gly341，并且CH3为从约Gly341或Gln342至Lys447。CH1区的IgG重链恒定区的残基终止于Lys。EU编号系统是在本领域中常规使用的(通常参见，Kabat et al,Sequences of Protein of ImmunologicalInterest,NIH Publication No.91-3242,US Department of Health and HumanServices(1991)[Kabat等人，免疫学上感兴趣的蛋白质序列，NIH出版号91-3242，美国健康与人类服务部(1991)])。
如本文所用的，“可变区”意指包含一个或多个Ig结构域的抗体区域，其基本上由分别构成轻链(包括κ和λ)和重链免疫球蛋白遗传基因座的VL(包括Vκ和Vλ)和/或VH基因中的任一种所编码。轻链或重链可变区(VL和VH)由被称为“互补决定区”或“CDR”的三个高变区中断的“框架”或“FR”区域组成。框架区和CDR的范围已经被精确定义，例如在Kabat中(参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"E.Kabat et al.,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)[“免疫学上感兴趣的蛋白质序列”，E.Kabat等人，美国健康与人类服务部，(1983)])，以及如在Chothia中。抗体的框架区，即构成性轻链和重链的组合框架区，用于定位和比对主要负责结合抗原的CDR。
术语“特异性地结合到”意指优选地在竞争性结合测定中抗体或多肽可以结合到结合配偶体上，正如使用重组体形式的蛋白质、其中的表位、或存在于分离的靶细胞的表面上的天然蛋白所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其他方法在下面进一步说明，并且在本领域是公知的。
如本文所用的，术语“亲和力”意指抗体或多肽与表位结合的强度。抗体的亲和力通过解离常数KD(定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag])给出，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数KA是由1/KD定义的。用于确定mAb亲和力的优选方法可以在以下文献中找到：Harlow,etal.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1988[Harlow等人，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州，1988]，Coligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)[Coligan等人编辑，免疫学实验指南，格林出版协会和威利国际科学出版公司，纽约州，(1992，1993)]以及Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)[Muller，酶学方法92：589-601(1983)]，将这些参考文献通过引用全然地并入本文。本领域公知的用于确定mAb亲和力的一种优选的标准方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(如通过用BIAcoreTMSPR分析装置分析)。
本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的氨基酸修饰的实例是取代。本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指在蛋白质序列中的给定位置处的氨基酸被另一个氨基酸替换。例如，取代Y50W是指亲本多肽的变体，其中位置50处的酪氨酸被色氨酸替换。多肽的“变体”是指具有与参考多肽(典型地为天然或“亲本”多肽)基本相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体可以在天然氨基酸序列内的某些位置处具有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
“保守”氨基酸取代是以下取代，其中用具有类似理化特性的侧链的氨基酸残基来替换氨基酸残基。具有类似侧链的氨基酸残基的家族在本领域是已知的，并且包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
术语“一致性”或“一致的”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时，是指多肽之间的序列关联程度，如通过两个或更多个氨基酸残基链之间匹配的数目来确定的。“一致性”使用由具体数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的空位比对(如果有的话)测量两个或更多个序列中较短序列之间的一致匹配的百分比。相关多肽的一致性可以通过已知方法容易地计算出。这样的方法包括但不限于在以下文献中描述的那些：ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988[计算分子生物学，Lesk,A.M.编辑，牛津大学出版社，纽约，1988]；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993[生物计算：信息学和基因组项目，Smith,D.W.编辑，学术出版社，纽约，1993]；Computer Analysis of SequenceData,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994[序列数据的计算机分析，第1部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，胡玛纳出版社，新泽西州，1994]；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,AcademicPress,1987[分子生物学的序列分析，von Heinje,G.，学术出版社，1987]；SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991[序列分析引物，Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，斯托克顿出版社，纽约，1991]；以及Carillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)[Carillo等人，工业和应用数学学会应用数学杂志，48，1073(1988)]。
用于确定一致性的优选方法被设计为给出所测试序列之间的最大匹配。在公开可用的计算机程序中描述了确定一致性的方法。用于确定两个序列之间一致性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，该程序包包括GAP(Devereux et al.,Nucl.Acid.Res.12,387(1984)[Devereux等人，核酸研究12，387(1984)]；Genetics Computer Group,Universityof Wisconsin,Madison,Wis.[遗传学计算机组，威斯康辛大学，麦迪逊，威斯康辛州])、BLASTP、BLASTN以及FASTA(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215,403-410(1990)[Altschul等人，分子生物学杂志215，403-410(1990)])。BLASTX程序可以公开地获自美国国家生物技术信息中心(NCBI)以及其他来源(BLAST Manual,Altschul et al.NCB/NLM/NIHBethesda,Md.20894[BLAST手册，Altschul等人，NCB/NLM/NIH贝塞斯达，马里兰州，20894]；Altschul et al.,supra[Altschul等人，同上])。公知的史密斯-沃特曼算法(SmithWaterman algorithm)也可以用来确定一致性。
“分离的”分子是作为其中相对于其所属的分子类别发现的组合物中的主要种类的分子(即，它构成组合物中分子类型的至少约50％，并且典型地将构成组合物中分子种类例如肽的至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更多)。通常，在组合物中所有存在的肽种类的背景下，或至少相对于建议用途的背景下实质上有活性的肽种类，多肽的组合物将显示出98％、98％或99％的多肽同质性。
在本文的背景下，“治疗(treatment或treating)”是指预防、减轻、管理、治愈或减少疾病或障碍的一种或多种症状或临床相关表现(除非与上下文矛盾)。例如，尚未鉴定出疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”是预防性(preventive或prophylactic)治疗，而已鉴定出疾病或障碍的症状或临床相关表现的患者的“治疗”通常不构成预防性(preventive或prophylactic)治疗。
如本文所用的，“NK”细胞是指在非常规免疫中所涉及的淋巴细胞亚群。NK细胞可以凭借某些特点和生物学特性进行鉴定，如人NK细胞的特异性表面抗原包括CD56和/或NKp46的表达、细胞表面上α/β或γ/δTCR复合体的缺失、通过激活特异性细胞溶解机构而结合并杀灭不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞的能力、杀灭表达针对NK激活受体的配体的肿瘤细胞或其他患病细胞的能力以及释放刺激或抑制免疫应答的蛋白分子(称为细胞因子)的能力。利用本领域公知的方法，这些特点和活性中的任一种均可用来鉴定NK细胞。术语NK细胞也将包括NK细胞的任何亚群。在本文的背景下，“活性”NK细胞表示具有生物活性的NK细胞，包括具有裂解靶细胞或增强其他细胞免疫功能的能力的NK细胞。例如，“活性”NK细胞能够杀灭表达激活NK受体的配体和/或不能表达由NK细胞上的KIR识别的MHC/HLA抗原的细胞。NK细胞可以通过本领域已知的多种技术获得，如从血液样品分离、细胞单采术、组织或细胞收集等。用于涉及NK细胞的测定的有用规程可以在以下文献中找到：NaturalKiller Cells Protocols(edited by Campbell KS and Colonna M).HumanPress.pp.219-238(2000)[自然杀伤细胞规程(Campbell KS和Colonna M编辑)，人类出版社，第219-238页(2000)]。
如本文所用的，“T细胞”是指在胸腺中成熟的淋巴细胞亚群，并且其在其他分子中显示其表面上的T细胞受体。T细胞可以凭借某些特点和生物学特性进行鉴定，如特异性表面抗原包括TCR、CD4或CD8的表达、某些T细胞杀灭肿瘤或感染细胞的能力、某些T细胞激活免疫系统的其他细胞的能力以及释放刺激或抑制免疫应答的蛋白分子(称为细胞因子)的能力。利用本领域公知的方法，这些特点和活性中的任一种均可用来鉴定T细胞。在本文的背景下，“活性”T细胞或“激活的”T细胞表示具有生物活性的T细胞，更特别地具有细胞分解或通过分泌细胞因子刺激免疫应答的能力的T细胞。活性细胞能以许多公知方法中的任一种进行检测，包括功能测定和基于表达(如细胞因子如TNF-α的表达)的测定。
产生多肽
本发明涉及串联CH3结构域并且涉及包含串联CH3结构域的多肽。串联CH3结构域可以配置在单多肽链内，使得两个CH3结构域通过形成CH3-CH3二聚体而相互作用。然后，这样的CH3结构域将不可用于与其他含有CH3结构域的多肽(特别是含有Fc结构域的多肽)进一步二聚化。使用本领域可用于产生多肽的技术，感兴趣的任何氨基酸序列、多肽结构域或多肽，例如“亲本”、“起始”或“非变体”多肽，可用作起始点或作为并入到含有串联CH3结构域的多肽中的氨基酸序列的来源。含有串联CH3结构域的多肽可以例如包含人Fc区，该Fc区包含连接到CH3结构域的CH2结构域，其中该CH3结构域是串联CH3结构域之一。
亲本多肽可以是包含Fc区的任何多肽，例如包含Fc结构域(例如二聚体Fc结构域)的Fc融合蛋白。本文的实例包含来自抗体(例如可变结构域)的Fc结构域和抗原结合结构域。
Fc结构域可用于延长任何感兴趣的蛋白质的半衰期，或以其他方式提供Fc结构域赋予的所希望的功能(例如通过二级试剂的识别)，结合固体支持体进行纯化等。因此，Fc结构域分子可以包括任何异源多肽。融合的配偶体可以是任何其他感兴趣的蛋白分子，如酶、可检测分子、与细胞表面受体相互作用时激活的配体、针对激发病原体的肽抗原(Ag)或‘诱饵’蛋白以鉴定在蛋白质微阵列中组装的结合配偶体。
蛋白质的实例包括标记、受体、生长因子、配体、酶、促红细胞生成素、趋化因子、来自非免疫球蛋白支架的抗原结合结构域、治疗性蛋白和激素。在一些非限制性实例中，异源蛋白是人类干扰素、促红细胞生成素(EPO)、可溶性肿瘤坏死因子受体、CTLA-4、可溶性白细胞介素(IL)-4受体或因子IX。可以用作具有单体Fc结构域的单体或多体蛋白并通过并入串联CH3结构域来修饰的含有Fc结构域的分子的实例包括：与人IgG1的Fc融合的CTLA-4(Nulojix(贝拉西普)，用于治疗器官排斥)；与人IgG1的Fc融合的VEGFR1/VEGFR2(Eylea(阿柏西普)，用于治疗年龄相关性黄斑变性)；与人IgG1的Fc融合的IL-1R(Arcalyst(利洛西普)，用于治疗冷吡啉蛋白相关周期性综合征)；与人IgG1的Fc融合的血小板生成素结合肽(NPlate(罗米司亭)，用于治疗慢性免疫性血小板减少性紫癜患者的血小板减少症)；与人IgG1的Fc融合的突变CTLA-4(Orencia(阿巴西普)，用于治疗类风湿性关节炎)；与人IgG1的Fc融合的LFA-3(Amevive(阿法赛特)，用于治疗牛皮癣和移植排斥)；以及与人IgG1的Fc融合的TNFR(Enbrel(依那西普)，用于治疗类风湿性关节炎)。
用于产生作为抗体的Fc多肽的示例性方法在以下章节中更详细地描述。用于本文所述多肽的抗原结合结构域可容易地衍生自多种免疫球蛋白或非免疫球蛋白支架，例如基于葡萄球菌蛋白A的Z结构域的亲和体、工程化Kunitz结构域、基于人类纤连蛋白III的第10细胞外结构域的单体或adnectin、脂质运载蛋白衍生的anticalin、DARPin(经设计的锚蛋白重复结构域)、多聚化LDLR-A模块、亲和多聚体(avimer)或富含半胱氨酸的打结素(knottin)肽。参见例如，Gebauer and Skerra(2009)Current Opinion in ChemicalBiology 13:245–255[Gebauer和Skerra(2009)化学生物学新见13：245–255]，将其披露内容通过引用并入本文。
抗原结合结构域通常衍生自抗体(免疫球蛋白链)，例如处于两条多肽链上存在的关联VL和VH结构域的形式，或单链抗原结合结构域，如scFv、VH结构域、VL结构域、dAb、V-NAR结构域或VHH结构域。抗原结合结构域(例如，ABD1和ABD2)也可以容易地衍生自作为Fab的抗体。
典型地，首先通过用包含多肽或其片段或衍生物(典型地为免疫原性片段，对此希望的是获得抗体(例如人多肽))的免疫原免疫非人类动物(例如小鼠)来获得抗体。对非人类哺乳动物用抗原进行免疫的步骤可以按任何本领域公知的方式进行，以刺激在小鼠体内产生抗体(参见例如，E.Harlow and D.Lane,Antibodies:A Laboratory Manual.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1988)[E.Harlow和D.Lane，抗体：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州(1988)]，将其全部披露内容通过引用并入本文)。
人类抗体还可以通过使用已经被工程化为表达人类抗体谱系的转基因动物进行免疫来产生(Jakobovitz et Nature 362(1993)255[Jakobovitz等人，自然362(1993)255])，或通过使用噬菌体展示方法进行的抗体谱系选择来产生。例如，可将XenoMouse(安根尼克斯公司(Abgenix)，菲蒙，加利福尼亚州)用于免疫。XenoMouse是一种鼠宿主，它的免疫球蛋白基因由功能性人类免疫球蛋白基因替换。因此，由这种小鼠产生的抗体或从这种小鼠的B细胞制备的杂交瘤中产生的抗体已经被人源化。XenoMouse描述于美国专利号6,162,963中，将其通过引用以其全文并入本文。
还可以通过选择免疫球蛋白的重组文库来产生抗体，如例如在(Ward etal.Nature,341(1989)p.544[Ward等人，自然，341(1989)第544页]，将其全部披露内容通过引用并入本文)中披露的。可以使用噬菌体展示技术(McCafferty et al(1990)Nature348:552-553[McCafferty等人(1990)自然348：552-553])从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因谱系产生抗体。参见例如，Griffith et al(1993)EMBO J.12:725-734[Griffith等人(1993)欧洲分子生物学学会杂志12：725-734]；US 5565332；US 5573905；US5567610；US 5229275。当组合文库包含人源的可变(V)结构域基因谱系时，从组合文库的选择将产生人抗体。
此外，在科学和专利文献中可获得宽范围的抗体(包括DNA和/或氨基酸序列)，或可从商业供应商商购。典型地将抗体引导至预定抗原。抗体的实例包括识别由待消除的靶细胞(例如增殖细胞或促进病理的细胞)表达的抗原的抗体。实例包括识别肿瘤抗原、微生物(例如细菌)抗原或病毒抗原的抗体。
抗原结合结构域(ABD)可以基于所希望的细胞靶进行选择，并且可包括例如癌抗原、细菌抗原或病毒抗原等。如本文所用的，术语“细菌抗原”包括但不限于完整的、减毒的或杀死的细菌，任何结构性或功能性细菌蛋白或碳水化合物，或细菌蛋白的具有足够长度(典型地约8个氨基酸或更长))以具抗原性的任何肽部分。实例包括革兰氏阳性细菌抗原和革兰氏阴性细菌抗原。在一些实施例中，细菌抗原来源于选自下组的细菌，该组由以下各项组成：螺杆菌属，特别是幽门螺杆菌；疏螺旋体属(Borelia species)，特别是伯氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)；军团菌属，特别是嗜肺军团菌；分枝杆菌属，特别是结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、戈氏分枝杆菌(M.gordonae)；葡萄球菌属，特别是金黄色葡萄球菌；奈瑟氏菌属，特别是淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏菌；李斯特菌属，特别是单核细胞增生李斯特菌；链球菌属，特别是化脓性链球菌、无乳链球菌、粪链球菌、牛链球菌、肺炎链球菌；厌氧链球菌属；病原性弯曲杆菌属；肠球菌属；嗜血杆菌属，特别是流感嗜血杆菌；芽孢杆菌属，特别是炭疽芽孢杆菌；棒状杆菌属，特别是白喉棒状杆菌；丹毒丝菌属，特别是猪红斑丹毒丝菌；梭菌属，特别是产气荚膜梭菌、破伤风梭菌；肠杆菌属，特别是产气肠杆菌；克雷伯氏菌属，特别是1S肺炎克雷伯氏菌；巴氏杆菌属，特别是多杀性巴氏杆菌；拟杆菌属；梭杆菌属，特别是具核梭杆菌；链杆菌属，特别是念珠状链杆菌；密螺旋体属，特别是梅毒密螺旋体；钩端螺旋体属；致病性埃希氏菌属；以及放线菌属，特别是以色列放线菌(Actinomyces israelli)。
如本文所用的，术语“病毒抗原”包括但不限于完整的、减毒的或杀死的全病毒，任何结构性或功能性病毒蛋白，或病毒蛋白的具有足够长度(典型地约8个氨基酸或更长))以具抗原性的任何肽部分。病毒抗原的来源包括但不限于来自以下家族的病毒：逆转录病毒科(例如人类免疫缺陷病毒，如HIV-1(也被称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III)；以及其他分离株，如HIV-LP；小核糖核酸病毒科(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(例如导致肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(例如冠状病毒)；弹状病毒科(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞体病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(例如汉坦病毒、布尼亚(bunga)病毒、白蛉病毒以及Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(例如呼肠孤病毒、环状病毒以及轮状病毒)；波纳病毒科(Bornaviridae)；噬肝病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(单纯性疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如丁型肝炎(delta hepatitis)的媒介(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)，丙型肝炎；诺瓦克和相关病毒，以及星状病毒)。可替代地，病毒抗原可重组产生。
如本文所用的，术语“癌抗原”和“肿瘤抗原”可互换使用，并且是指由癌细胞差异表达或由具有促肿瘤作用(例如免疫抑制作用)的非肿瘤细胞(例如免疫细胞)表达，并且从而可以被利用以靶向癌细胞的抗原(除NKp46或CD16外)。癌抗原是可以潜在地刺激明显肿瘤特异性免疫应答的抗原。正常细胞编码这些抗原中的一些，虽然它们不一定被表达，或以较低的水平或更低的频率表达。这些抗原可以表征为在正常细胞中通常沉默(即，不表达)的那些、仅在某些分化阶段表达的那些以及暂时表达的那些(如胚胎和胎儿抗原)。其他癌抗原由突变型细胞基因编码，如癌基因(例如激活的ras癌基因)、抑制基因(例如突变型p53)、由内部缺失或染色体易位引起的融合蛋白。仍其他的癌抗原可以由病毒基因编码，如RNA和DNA肿瘤病毒上携带的基因。其他癌抗原可以在能够介导促肿瘤作用的免疫细胞上表达，例如单核细胞或巨噬细胞，任选地抑制性T细胞、调节性T细胞或髓源性抑制细胞。
癌抗原通常是过表达或在异常时间表达或者被靶向的细胞群体表达的正常细胞表面抗原。理想地，靶抗原仅在增殖细胞(例如肿瘤细胞)或促肿瘤细胞(例如具有免疫抑制作用的免疫细胞)上表达，然而这在实践中很少观察到。因此，靶抗原在许多情况下是基于增生/疾病组织与健康组织之间的差异表达来选择的。癌抗原的实例包括：受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Cripto、CD4、CD20、CD30、CD19、CD38、CD47、糖蛋白NMB、CanAg、Her2(ErbB2/Neu)、Siglec家族成员例如CD22(Siglec2)或CD33(Siglec3)、CD79、CD138、CD171、PSCA、L1-CAM、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、BCMA、CD52、CD56、CD80、CD70、E-选择素、EphB2、黑素转铁蛋白(Melanotransferin)、Mud 6和TMEFF2。癌抗原的实例还包括免疫球蛋白超家族(IgSF)，如细胞因子受体，杀伤细胞Ig样受体，CD28家族蛋白，例如杀伤细胞Ig样受体3DL2(KIR3DL2)、B7-H3、B7-H4、B7-H6、PD-L1、IL-6受体。实例还包括MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、主要组织相容性复合体I类相关链A和B多肽(MICA和MICB)、腺苷脱氨酶结合蛋白(ADAbp)、亲环蛋白b、结肠直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、受体蛋白酪氨酸激酶3(TYRO-3)、连接素(例如连接素-4)、主要组织相容性复合体I类相关链A和B多肽(MICA和MICB)、UL16结合蛋白(ULBP)家族的蛋白、视黄酸早期转录物-1(RAET1)家族的蛋白、癌胚抗原(CEA)及其免疫原性表位CAP-1和CAP-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(PSA)、T-细胞受体/CD3-ζ链、肿瘤抗原MAGE-家族、肿瘤抗原GAGE-家族、抗穆勒(Mullerian)激素II型受体、δ样配体4(DLL4)、DR5、ROR1(也称为受体酪氨酸激酶样孤儿受体1或NTRKR1(EC 2.7.10.1)、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、MUC家族、VEGF、VEGF受体、血管生成素-2、PDGF、TGF-α、EGF、EGF受体、人EGF样受体家族的成员例如HER-2/neu、HER-3、HER-4或由至少一个HER亚基构成的异源二聚体受体、胃泌素释放肽受体抗原、Muc-1、CA125、整联蛋白受体、αvβ3整联蛋白、α5β1整联蛋白、αIIbβ3-整联蛋白、PDGFβ受体、SVE-钙粘蛋白、IL-8受体、hCG、IL-6受体、CSF1R(肿瘤相关单核细胞和巨噬细胞)、甲胎蛋白、E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(APC)、胞衬蛋白、连接蛋白37、Ig-独特型、p15、gp75、GM2和GD2神经节苷脂、病毒产物如人乳头瘤病毒蛋白、imp-1、P1A、EBV编码的核抗原(EBNA)-1、脑糖原磷酸化酶、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1和CT-7、以及c-erbB-2，尽管这不旨在为穷尽性的。在一个方面，感兴趣的抗原是例如在被常规的人IgG1抗体结合时，在存在或不存在Fc受体细胞的情况下，能够经历细胞内内化的抗原(例如上面列出的抗原中的任何一种)。
在一个实施例中，抗原靶是存在于能够介导促肿瘤作用的免疫细胞(例如单核细胞或巨噬细胞，任选地抑制性T细胞、调节性T细胞或髓源性抑制细胞)上的多肽。
在包含ABD1和ABD2的多特异性分子的示例性实施例中，这样的ABD中的一种可以结合待消除的靶细胞表达的抗原(例如，肿瘤抗原、微生物(例如细菌)抗原、病毒抗原或在促进炎性或自身免疫性疾病的免疫细胞上表达的抗原)，并且ABD1或ABD2中的另一种将结合免疫细胞(例如免疫效应细胞)上表达的抗原，例如效应细胞(如T或NK细胞)的细胞表面受体。在免疫细胞(任选地免疫效应细胞)上表达的抗原的实例包括在人淋巴样细胞谱系的成员例如人T细胞、人B细胞或人自然杀伤(NK)细胞、人单核细胞、人嗜中性粒细胞或人树突细胞上表达的抗原。有利的是，这样的细胞对待消除的靶细胞(例如，其表达肿瘤抗原、微生物抗原、病毒抗原或在促进炎性或自身免疫疾病的免疫细胞上表达的抗原)具有细胞毒性或凋亡作用。尤其有利的是，人淋巴样细胞是细胞毒性T细胞或NK细胞，其在被激活时对靶细胞发挥细胞毒性作用。根据这个实施例，募集人效应细胞的细胞毒性活性。根据另一个实施例，人效应细胞是人骨髓谱系的成员。
多特异性多肽的ABD可以结合在免疫细胞上表达的抗原，如NK和/或T细胞受体，例如分别在NK细胞或T细胞表面的任何分子，其可以用于将NK或T细胞引导至待消除的预期靶细胞。实例包括例如免疫球蛋白超家族的成员、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)家族的成员、白细胞免疫球蛋白样受体(LILR)家族或凝集素家族或NK细胞凝集素样受体家族。可以例如通过在多特异性多肽的存在下使靶细胞和效应细胞接触来测量活性。
任选地，免疫细胞受体是激活受体，例如激活NK细胞或T细胞受体。如本文所用的，术语“激活NK细胞受体”和“激活T细胞受体”分别指NK细胞或T细胞表面上的任何分子，当被刺激时，导致本领域已知的分别与NK细胞或T细胞活性相关的任何特性或活性可测量增加，如细胞因子(例如IFN-γ或TNF-α)产生，细胞内游离钙水平增加，在如例如在本说明书其他地方所述的重导向杀伤测定中裂解靶细胞的能力，或分别刺激NK细胞或T细胞增殖的能力。术语“激活NK受体”包括激活或共激活受体，包括但不限于如以下项的形式：KIR蛋白(例如KIR2DS受体，KIR2DS2，KIR2DS4)、NKG2受体、NKp30、NKp46、IL-2R、IL-12R、IL-15R、IL-18R和IL-21R。激活受体的一个重要家族是包括NKp30、NKp44和NKp46的天然细胞毒性受体(NCR)。
细胞毒性T细胞的激活可以例如经由这个实施例的多特异性(例如双特异性)多肽，与作为在细胞毒性T细胞表面上的效应抗原的CD3抗原结合而发生。人CD3抗原存在于辅助性T细胞和细胞毒性T细胞两者上。人CD3表示作为多分子T细胞复合物的一部分在T细胞上表达且包含以下三条不同的链的抗原：CD3-ε、CD3-δ和CD3-γ。
多特异性多肽结合的示例性淋巴性细胞相关效应抗原是人CD8抗原、人CD16抗原、人NKG2D抗原、人NKp46抗原、人NKp30抗原、人CD2抗原、人CD28抗原或人CD25抗原。可以使用在效应T细胞上表达的人CD8抗原将这样的T细胞重导向到感兴趣的靶细胞，而不会例如影响CD4T细胞(其可能与不想要的细胞因子产生和相关毒性相关)或TReg细胞。人NKp30并且特别是NKp46抗原主要在NK细胞上表达，并且从而允许NK细胞效应物活性的选择性募集。在一个实施例中，在免疫细胞或免疫效应细胞上表达的抗原选自FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)和FcγRIII(CD16)多肽。
可以在包含在多肽中之前针对任何所希望的活性测试并入Fc多肽中的一个或多个ABD。一旦鉴定出具有所希望的特异性和/或活性的适当的抗原结合结构域，编码ABD中的每一个的DNA能以合适的排列置于一个或多个合适的表达载体中，连同编码任何元件如CH2和CH3结构域、接头和任何其他任选的元件的DNA(例如编码接头或铰链区的DNA)，用于转染到适当的宿主中。然后将该宿主用于Fc多肽的重组产生。
衍生自抗体的ABD通常至少包含足以赋予结合活性的高变区。应当理解的是，ABD可以包含或融合至可能希望的其他氨基酸或功能结构域，包括但不限于接头元件(例如接头肽、CH1、Cκ或Cλ结构域、铰链或其片段，其每个可以置于ABD和CH2或CH3结构域之间，或者根据需要置于其他结构域之间)。在一个实例中，ABD包含scFv、VH结构域和VL结构域、或单结构域抗体(纳米抗体或dAb)如V-NAR结构域或VHH结构域。本文进一步描述了示例性抗体形式，并且可以基于所希望的形式来选择ABD。
在任何实施例中，可以从人源化抗体获得抗原结合结构域，其中来自人抗体的互补决定区(CDR)的残基被来自初始抗体(亲本或供体抗体，例如鼠或大鼠抗体)的CDR的残基替换，同时保持所希望的初始抗体的特异性、亲和力以及能力。亲本抗体的CDR(其部分或全部由源自非人类生物体的核酸编码)全部或部分移植到人抗体可变区的β-片层框架中以产生抗体，其特异性由移入的CDR决定。这样的抗体的产生描述于例如以下文献中：WO 92/11018；Jones,1986,Nature 321:522-525[Jones，1986，自然321：522-525]；Verhoeyen etal.,1988,Science 239:1534-1536[Verhoeyen等人，1988，科学239：1534-1536]。因此，抗原结合结构域可以具有非人高变区或CDR和人框架区序列(任选地具有回复突变)。
将蛋白结构域(例如ABD或ECD)排列在表达载体中，以产生具有彼此可操作地连接的所希望结构域的Fc多肽。然后可以在适当的宿主细胞中或通过任何合适的合成工艺产生Fc多肽。宿主细胞可以是哺乳动物来源的或可以选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或其任何衍生、永生化或转化细胞。可替代地，宿主细胞可以选自不能在抗体上产生哺乳动物糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，如天然或工程化大肠杆菌属、克雷伯氏菌属、或假单胞菌属。
可以构建Fc衍生的多肽链，其包含：(a)感兴趣的蛋白结构域(例如，细胞表面受体的ECD，VH和/或VL，结合感兴趣的第一抗原的抗原结合结构域(ABD1))，(b)包含CH2结构域(或其片段)和串联CH3结构域的Fc结构域，该串联CH3结构域包含第一CH3结构域和通过氨基酸残基的插入序列(例如柔性肽接头)与第一CH3结构域分开的第二CH3结构域。任选地，CH2结构域和感兴趣的结构域通过接头、CH1或CK结构域和/或铰链区分开。任选地，Fc结构域(i)不与另一种Fc衍生多肽经历CH3-CH3二聚化，(ii)能够结合人FcRn和/或(iii)与人Fc受体的结合减少，相比于野生型人IgG1Fc结构域。实例包括具有以下之一的结构域排列的多肽：
(ECD)–CH2–CH3–接头–CH3，
(ECD)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3，
(VH或VL)–CH2–CH3–接头–CH3，
(VH或VL)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3，
(ABD1)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3，
或
(ABD1)–CH2–CH3–接头–CH3。
可以构建多特异性(例如双特异性)Fc衍生的多肽链，其包含：(a)感兴趣的第一蛋白结构域(例如，细胞表面受体的ECD，VH和/或VL，结合感兴趣的第一抗原的抗原结合结构域(ABD1))；(b)包含CH2结构域(或其片段)和串联CH3结构域的Fc结构域，该串联CH3结构域包含第一CH3结构域和通过插入氨基酸序列(例如柔性肽接头)与第一CH3结构域分开的第二CH3结构域，以及(c)感兴趣的第二蛋白结构域(例如，细胞表面受体的ECD，VH和/或VL，结合感兴趣的第二抗原的抗原结合结构域(ABD2))。感兴趣的第一和第二蛋白结构域中的每一个可以独立地是任何所希望的氨基酸序列，例如抗原结合结构域，功能肽如可检测标签、酶识别标签或纯化标签，受体多肽，酶，细胞因子等。具有结构域排列的多肽的实例如下：
(感兴趣的结构域1)–CH2–CH3–接头–CH3–(感兴趣的结构域2)，
(感兴趣的结构域1)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3–(感兴趣的结构域2)，
(ABD1)–CH2–CH3–接头–CH3–(ABD2)，
(ABD1)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3–(ABD2)，
(ECD)–CH2–CH3–接头–CH3–(ABD)，
(ECD)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3–(ABD)，
(ABD)–CH2–CH3–接头–CH3–(ECD)，
或
(ABD)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3–(ECD)。
任选地，感兴趣的蛋白结构域经由接头肽、CH1或CK结构域和/或铰链区与相邻的CH2结构域融合。任选地，CH3结构域经由接头肽与相邻的CH3结构域融合。任选地，Fc结构域(i)不能与另一种Fc衍生多肽经历CH3-CH3二聚化，(ii)能够结合人FcRn和/或(iii)与人Fcγ受体的结合减少，相比于野生型人IgG1Fc结构域。
上述实例的含有串联CH3结构域的部分可以包含例如以下的结构域排列(从N-端至C-端)：CH2–CH3–肽接头–CH3–。
因此，Fc结构域或Fc多肽可以任选地被描述为天然人Fc结构域或包含天然人Fc结构域，该天然人Fc结构域包含CH2结构域和CH3结构域，其中CH3结构域在其自由末端融合至肽接头，该肽接头进而在其自由末端融合至第二CH3结构域。
可以设想各种结构域排列。例如，可以将含有串联CH3结构域的Fc部分融合至串联ABD或scFv的C-端。非限制性实例包括具有以下任何结构域排列(从N-端至C-端)的多肽：
(ABD1)–(ABD2)–CH2–CH3–接头–CH3，
(ABD1)–(ABD2)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3，
或
(scFv1)–(scFv2)–CH2–CH3–接头–CH3。
使用scFv的其他实例包括具有以下结构域排列(从N-端至C-端)的蛋白质：
(scFv1)–CH2–CH3–接头–CH3–(scFv2)
或
(scFv1)–CH1–CH2–CH3–接头–CH3–(scFv2)。
多特异性蛋白的另外实例包括多体蛋白，包括具有PCT申请号WO2015/197593(将其披露内容通过引用并入)中所示的单体Fc结构域的蛋白质和结构域排列。例如，异源二聚体可以例如具有如下构型(还参见显示为图1C中所示的形式11和12的这样的蛋白质的实例)：
其中第一多肽链的Va-1和第二多肽链的Vb-1中的一个是轻链可变结构域，并且另一个是重链可变结构域，并且其中Va-2和Vb-2中的一个是轻链可变结构域，并且另一个是重链可变结构域。
在另一个实例中，所得到的异源二聚体可以具有如下构型(还参见显示为图1B中所示的形式10的这样的蛋白质的实例)：
其中第一多肽链的Va-1和第二多肽链的Vb-1中的一个是轻链可变结构域，并且另一个是重链可变结构域，并且其中Va-2和Vb-2中的一个是轻链可变结构域，并且另一个是重链可变结构域。
另外的实例包括三聚体。示例性三聚体可以具有如下构型(还显示为图1C中的形式17)：
在任何Fc多肽中，在感兴趣的蛋白质或结构域之间可以存在CH1或CK(或Cλ)结构域，例如ABD、ECD和CH2结构域，或者在感兴趣的结构域和CH2结构域之间可以不存在CH1或CK(或Cλ)结构域。在一个实施例中，在感兴趣的蛋白质或结构域和CH2结构域之间存在肽接头。在一个实施例中，在CH1和CH2结构域之间存在铰链区或其片段，例如经修饰的铰链，其缺乏涉及天然抗体重链中的链间桥的一个或全部两个半胱氨酸。第一和第二ABD可以通过具有足够长度的接头连接在一起，以使得ABD能够以允许与ABD预期结合的相应抗原结合的方式折叠。用于在连接ABD1与ABD2中使用或用于在连接ABD与CH2或CH3中使用的合适的肽接头是本领域已知的，参见例如WO 2007/073499，将其披露内容通过引用并入本文。接头序列的实例包括(G4S)x，其中x是整数(例如1、2、3、4或更多)。因此，Fc多肽可以例如具有结构(ABD1–肽接头-ABD2–肽接头-CH2–CH3–肽接头–CH3)。例如，该多肽可以包含(作为融合产物)结构(scFv1–肽接头-scFv2-肽接头–CH2–CH3)，其中每个元件与下一元件融合。Fc多肽的另一个实例具有以下结构：(ABD1–肽接头-CH2–CH3–肽接头–CH3–肽接头–ABD2)。
用于说明目的，排列是从N-端(左侧)至C-端显示。结构域可以被称为彼此融合(例如，可以说结构域可以融合至其左侧的结构域的C-端，和/或可以说结构域可以融合至其右侧的结构域的N-端)。结构域可以直接或经由插入氨基酸序列彼此融合。
如在某些实例中所示，可以制备多特异性抗体，其中两个抗原结合结构域位于Fc结构域的相对末端。此蛋白可以提供如下构象，该构象可提供与不同细胞上的靶抗原的更好结合。这种构型还允许使用更宽范围的抗体可变区；一些在串联scFv形式中未保留功能性的抗体结合结构域在单一scFv形式中将保留功能性。因此，在一个方面，该多肽可以包含：(a)结合感兴趣的第一抗原的第一抗原结合结构域(ABD1)，(b)包含至少部分人Fc结构域的含有串联CH3结构域的部分，该人Fc结构域包含第一CH3结构域和通过插入氨基酸序列与第一CH3结构域分开的第二CH3结构域，其中含有串联CH3结构域的部分融合(任选地经由氨基酸残基插入序列)至第一抗原结合结构域的C-端，以及(c)结合感兴趣的第二抗原的第二抗原结合结构域(ABD2)，融合(任选地经由插入氨基酸序列)至含有串联CH3结构域的部分的C-端。
在任何实施例的一个方面，第一抗原结合结构域和/或第二抗原结合结构域包含scFv，任选地其中scFv包含人框架氨基酸序列。
用在串联CH3结构域内的示例性CH3结构域可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或与其至少70％、80％、90％、95％或98％一致的序列：
G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T KN Q V S L T C L V K G F Y P SD I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D KS R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G(SEQ ID NO:1)
下面示出了具有柔性肽接头(加下划线的)的示例性串联CH3。因此，示例性串联CH3结构域可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其至少70％、80％、90％、95％或98％一致的序列：
G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P SD I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D KS R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G G G G G S G G G G S G G G G S G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K GF Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K LT V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G(SEQID NO:2)
在一个实施例中，用于将ABD(例如scFv、VH或VL结构域)连接到CH2或CH3的肽接头包含CH1结构域或CH1结构域的片段。例如，可将CH1结构域或CH1结构域的N-末端氨基酸序列与ABD(例如scFv、VH或VL结构域等)融合，以便尽可能接近地模拟抗体的天然结构。在一个实施例中，接头包含2-4个残基之间、2-4个残基之间、2-6个残基之间、2-8个残基之间、2-10个残基之间、2-12个残基之间、2-14个残基之间、2-16个残基之间、2-18个残基之间、2-20个残基之间、2-22个残基之间、2-24个残基之间、2-26个残基之间、2-28个残基之间、2-30个残基之间、10-20个残基之间、10-22个残基之间、10-24个残基之间、2-26个残基之间、10-28个残基之间、12-20个残基之间、15-30个残基之间、15-20个残基之间或10-30个残基之间的N-末端CH1氨基酸序列。在一个实施例中，接头包含氨基酸序列RTVA或由其组成。
当ABD是scFv时，形成scFv的VH结构域和VL结构域(保留结合特异性的VL或VH结构域或其片段)通过具有足够长度的接头连接在一起，以使得ABD能够以允许与ABD预期结合的抗原结合的方式折叠。接头的实例包括例如包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，例如氨基酸序列GEGTSTGS(G2S)2GGAD。在一个具体实施例中，scFv的VH结构域和VL结构域通过氨基酸序列(G4S)3连接在一起。
用于将两个CH3结构域彼此连接的肽接头可以是具有足够长度的任何氨基酸序列，以使得两个CH3结构域以允许它们通过非共价相互作用(特别是经历CH3-CH3二聚化)关联的方式折叠。接头的实例包括例如包含甘氨酸和丝氨酸残基的接头，例如氨基酸序列(G4S)x，其中x在1和10之间，任选地在2和6之间，例如(G4S)3。
用于将两个CH3结构域彼此连接的任何肽接头可包含的长度为至少5个残基，任选地至少10个残基、至少15个残基、至少20个残基、至少25个残基、至少30个残基或者更多。在其他实施例中，接头包含的长度为5-10个残基之间、4-12个残基之间、5-14个残基之间、5-16个残基之间、5-18个残基之间、5-20个残基之间、5-22个残基之间、5-24个残基之间、5-26个残基之间、5-28个残基之间、5-30个残基之间、10-20个残基之间、10-22个残基之间、10-24个残基之间、2-26个残基之间、10-28个残基之间、12-20个残基之间、15-30个残基之间、15-20个残基之间或10-30个残基之间。
在一个实施例中，该铰链区将是铰链区的片段(例如，没有半胱氨酸残基的截短的铰链区)，或者可以包含一个或多个氨基酸修饰以去除(例如用另一个氨基酸取代或缺失)半胱氨酸残基，任选地在铰链区中的全部两个半胱氨酸残基。去除半胱氨酸可用于防止在单体多肽中形成二硫键。
恒定区结构域可以衍生自任何合适的抗体。特别感兴趣的是重链结构域，包括恒定重(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的背景下，IgG同种型各自具有三个CH区域。因此，IgG的背景下的“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的位置118-220。“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的位置237-340，并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的位置341-447。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”意指包含在抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处结束，并且IgGCH2结构域开始于残基EU位置237。除非另有说明或如上下文另有规定，否则在IgG抗体的背景下，提及在多肽内发现的恒定区结构域内的氨基酸残基应该是参考Kabat。
可以在本发明抗体中起作用的CH3结构域可以衍生自任何合适的抗体。这样的CH3结构域可以充当经修饰的CH3结构域的基础。任选地，CH3结构域是人源的。在本文的某些实施例中，CH3结构域可以是天然人CH3结构域，而在其他实施例中，CH结构域可以包含一个或多个氨基酸修饰(例如氨基酸取代)。这些修饰通常将避免破坏CH3二聚化界面，使得串联CH3结构域将保留彼此关联的能力。任选地，CH3结构域修饰将不会另外干扰Fc衍生多肽结合新生儿Fc受体(FcRn)(例如人FcRn)的能力。
CH2结构域可以容易地从任何合适的抗体获得。任选地，CH2结构域是人源的。CH2可以与或可以不与接头氨基酸序列的铰链连接(例如在其N-端)。在一个实施例中，CH2结构域是IgG1、2,4或4亚型的天然存在的人CH2结构域。在一个实施例中，CH2结构域是CH2结构域的片段(例如至少10、20、30、40或50个氨基酸)。
在一个实施例中，当存在于本文所述的多肽中时，CH2结构域将保留与新生儿Fc受体(FcRn)(特别是人FcRn)的结合。
在一个实施例中，当存在于本文所述的多肽中时，CH2结构域和本文所述的多肽将赋予减少的与Fc受体(特别是FcγRIIIA(CD16))的结合或缺乏此结合。包含不结合CD16的CH2结构域的多肽不能通过不表达感兴趣的效应细胞抗原(例如NKp46、CD3等)的细胞(例如NK细胞、T细胞)激活或介导ADCC。
在一个实施例中，本文所述的多肽及其一个或多个Fc结构域和/或其CH2结构域将具有减少的或将基本上缺乏抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、FcR介导的细胞激活(例如通过FcR交联的细胞因子释放)和/或FcR介导的血小板激活/消耗。
在一个实施例中，多肽中的CH2结构域将基本上丧失与激活Fcγ受体(例如FcγRIIIA(CD16)、FcγRIIA(CD32A)或CD64)或抑制性Fc受体(例如FcγRIIB(CD32B))的结合。在一个实施例中，多肽中的CH2结构域还将基本上丧失与补体(C1q)的第一组分的结合。
任选地，CH2结构域另外包含IgG2残基向人IgG1的取代，以进一步减少与Fcγ受体的结合。已经显示，在位置233-236(EU编号)的取代和位置327、330和331(EU编号)的IgG4残基显示与Fc受体的结合(并且因此与ADCC和CDC的结合)大大减少。此外，Idusogie et al.(2000)J Immunol.164(8):4178-84[Idusogie等人(2000)免疫学杂志164(8)：4178-84]证明，不同位置处的丙氨酸取代(包括K322)显著降低补体激活。在一个实施例中，保留与人FcRn结合但具有减少的与Fcγ受体的结合的CH2结构域将缺乏或具有经修饰的N联糖基化，例如残基N297(Kabat EU)处。在一个实施例中，丧失与Fcγ受体的结合的CH2结构域在Fc区的CH2结构域中将包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个氨基酸修饰)。
在一个实施例中，单体多肽将以1:1的比例(每个单体多肽1个FcRn)结合FcRn。
含有单体Fc结构域的多肽可以保留部分FcRn结合(例如，与野生型全长人IgG1抗体相比)。任选地，单体多肽能够以中等亲和力结合人FcRn，例如与全长野生型人IgG1抗体相比，保留与FcRn的结合但与人FcRn受体的结合减少。Fc部分可另外包含调节与一个或多个Fcγ受体的结合的一个或多个氨基酸修饰，例如在CH2结构域中。
在本文任何多肽的一个实施例中，含有串联CH3结构域的多肽基本上以单体形式(即，作为单多肽链)存在。这可能是如下情况，含有串联CH3结构域的多肽是最终产物，或者当多肽是多体(例如二聚体)多肽时，含有串联CH3结构域的多肽是生产中间体。
化合物的用途
在一个方面，提供了本文定义的任何化合物用于制造用以治疗或诊断对其有需要的哺乳动物的药物制剂的用途。还提供了使用任何上文定义的化合物作为药物或药物中的活性成分或活性物质的用途。在另一个方面，提供了用于制备含有如上文定义的化合物的药物组合物的方法，以提供用于口服给药、局部给药或通过注射给药的固体或液体配制品。这种方法或工艺至少包括将化合物与药学上可接受的载体混合的步骤。
在一个方面，提供了通过发挥某种作用来治疗、预防或更普遍地影响预定病况，或使用本文的化合物或包含本文披露的化合物的(药物)组合物来检测某种病况的方法。
本文所述的多肽可用于预防或治疗可用抗体治疗的障碍，例如癌症、实体瘤和非实体瘤、血液恶性肿瘤、感染(如病毒感染)和炎性或自身免疫性障碍。
在一个实施例中，感兴趣的抗原在选自下组的癌症类型的恶性肿瘤细胞的表面上表达，该组由以下各项组成：癌，包括膀胱、头颈、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、前列腺、胰腺、胃、宫颈、甲状腺、以及皮肤的癌，包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血肿瘤、包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特(Burketts)淋巴瘤；骨髓谱系的造血细胞肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌、淋巴谱系的造血肿瘤例如T细胞和B细胞肿瘤。
在一个实施例中，本文所述的多肽可用于预防或治疗选自下组的癌症，该组由以下各项组成：癌，包括膀胱、头颈、乳腺、结肠、肾、肝、肺、卵巢、前列腺、胰腺、胃、宫颈、甲状腺、以及皮肤的癌，包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血肿瘤、包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；骨髓谱系的造血细胞肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和早幼粒细胞性白血病；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周围神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间质起源的肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；以及其他肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡状癌和畸胎癌。根据本发明可以治疗的其他示例性障碍包括淋巴谱系的造血肿瘤，例如T细胞和B细胞肿瘤。
在一个方面，治疗方法包括向个体给予治疗有效量的多特异性多肽。治疗有效量可以是在患有疾病或障碍的患者体内具有治疗效果的任何量(或在至少相当大比例的患者体内促进、增强、和/或诱导这样的作用，这些患者患有该疾病或障碍和与该患者基本上类似的特征)。
多特异性多肽可以被包括在试剂盒中。这些试剂盒可以任选地另外含有任何数量的多肽和/或其他化合物，例如1、2、3、4种或任何其他数量的多特异性多肽和/或其他化合物。应当理解的是，这些试剂盒的内容物的描述不以任何形式进行限制。例如，该试剂盒可以含有其他类型的治疗性化合物。任选地，这些试剂盒还包括使用这些多肽的说明书，例如详细说明本文所述的方法。
还提供了包含如上文定义的化合物的药物组合物。化合物可以作为药物组合物与药物载体一起以纯化的形式给药。该形式取决于预期的给药方式和治疗或诊断应用。该药物载体可以是适合于将化合物递送到患者的任何相容的无毒物质。药学上可接受的载体在本领域是公知的，并且包括例如水性溶液，如(无菌)水或生理缓冲盐水或者其他溶剂或运载体，如乙二醇、甘油、油类(如橄榄油)或可注射的有机酯、醇、脂肪、蜡和惰性固体。药学上可接受的载体可以另外含有生理学上可接受的化合物，例如其作用以稳定或增加化合物的吸收的化合物。这样的生理学上可接受的化合物包括例如碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白或其他稳定剂或赋形剂。本领域技术人员应了解，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如组合物的给药途径。药学上可接受的佐剂、缓冲剂、分散剂等也可以掺入药物组合物中。
这些化合物可以肠胃外给药。用于肠胃外给药的化合物的制剂必须是无菌的。灭菌可以任选地在冷冻干燥和重构之前或之后，通过经无菌的滤过膜过滤来容易地完成。用于给予化合物的肠胃外途径符合已知方法，例如通过静脉内、腹膜内、肌内、动脉内或病灶内途径进行的注射或输注。可以将这些化合物通过输注或通过弹丸注射连续地给药。用于静脉内输注的典型组合物可以制成为含有100至500ml无菌0.9％NaCl或5％葡萄糖，任选地补充有20％白蛋白溶液和1mg至10g该化合物，这取决于化合物的具体类型及其所需的给药方案。用于制备肠胃外可给予的组合物的方法是本领域公知的。
实例
实例1：双特异性单体串联CH3 Fc多肽的构建
材料与方法
基于对人肿瘤抗原CD19具有特异性的scFv(抗CD19 scFv)和对NK细胞上的人激活受体NKp46具有特异性的scFV(抗NKp46 scFv)，制成了用于制备双特异性Fc多肽的不同构建体。
下表1中所示的是蛋白质的抗CD19组分的轻链和重链可变区氨基酸序列。
表1
下表2中所示的是蛋白质的抗NKp46组分的轻链和重链可变区以及scFv氨基酸序列。
表2
重组蛋白的克隆和产生
通过直接合成和/或通过PCR产生编码序列。使用PrimeSTAR MAX DNA聚合酶(塔卡拉公司(Takara)，#R045A)进行PCR，并使用NucleoSpin凝胶和PCR清除试剂盒(马歇雷-纳格尔公司(Macherey-Nagel)，#740609.250)从1％琼脂糖凝胶纯化PCR产物。如制造商规程(克罗泰克公司(ClonTech)，#ST0345)中所述，一旦纯化，在进行In-Fusion连接反应之前，对PCR产物进行定量。使用Nucleospin 96质粒试剂盒(马歇雷-纳格尔公司，#740625.4)，在EVO200(帝肯公司(Tecan))上运行微量制备之后获得质粒。然后在转染CHO细胞系之前对质粒进行测序用于序列确认。
使CHO细胞在补充有酚红和6mM GlutaMax的CD-CHO培养基(英杰公司(Invitrogen))中生长。在转染前一天，对细胞进行计数并以175,000个细胞/ml接种。对于转染，如AMAXA SF细胞系试剂盒(AMAXA，#V4XC-2032)中所述制备细胞(200,000个细胞/转染)，并用Nucleofector 4D装置使用DS137规程进行核转染。所有转染均使用300ng经验证的质粒进行。转染后，将细胞接种到预温培养基中的24孔板中。24小时后，将潮霉素B加入培养基(200μg/ml)中。在培养1周后监测蛋白质表达。然后将表达蛋白质的细胞亚克隆以获得最佳生产者。使用96孔平底板进行亚克隆，其中细胞以每孔一个细胞接种到补充有200μg/ml潮霉素B的200μl培养基中。在测试克隆的生产力之前，将细胞放置三周。
使用Protein-A珠(-rProteinA Sepharose fast flow，通用电气医疗集团(GEHealthcare)，参考号：17-1279-03)纯化含有IgG1-Fc片段的重组蛋白。简言之，将细胞培养上清液浓缩，通过离心澄清并注射到Protein-A柱上以捕获含有重组Fc的蛋白质。将蛋白质在酸性pH(柠檬酸0.1M pH 3)下洗脱，立即使用TRIS-HCL pH 8.5中和，并用1X PBS透析。使用钴树脂通过亲和层析来纯化含有“six his”标签的重组scFv。通过尺寸排阻层析(SEC)纯化其他重组scFv。
形式3(F3)：CD19-F3-NKp46-3
F3多肽的结构域结构示于图1A中。Fc部分的DNA和氨基酸序列包含串联CH3结构域，其中相同多肽链上的两个CH3结构域彼此相关联，从而防止不同双特异性蛋白之间的二聚化。
单链多肽具有如下排列(N-端至C-端)的结构域：
(VK–VH)抗CD19–CH2–CH3–CH3–(VH–VK)抗NKp46
(VK-VH)单元由VH结构域、接头和VK单元(scFv)组成。
如上所述克隆、生产和纯化蛋白质。使用prot-A珠通过亲和层析从细胞培养上清液纯化双特异性蛋白，并通过SEC分析和纯化。该蛋白质显示出高生产率3.4mg/L和简单的SEC图。F3蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:10中。
形式4(F4)：CD19-F4-NKp46-3
构建了具有图1A中显示为“形式4”的结构域排列scFvCD19–CH2(N297S)–CH3–CH3–scFvNkp46-3的蛋白质。Fc部分的DNA和氨基酸序列包含如形式F3中的串联CH3结构域，但是另外包含N297S突变以防止N联糖基化和消除FcγR结合。如上所述克隆、生产和纯化蛋白质。使用prot-A珠通过亲和层析从细胞培养上清液纯化双特异性蛋白，并通过SEC分析和纯化。该蛋白质显示出良好生产率1mg/L和简单的SEC图。具有NKp46-3可变结构域的F4蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:11中。
形式9(F9)：CD19-F9-NKp46-3
F9多肽是具有中心多肽链和各自经由CH1-CK二聚化与中心链相关联的两条多肽链的三聚体多肽。三聚体F9蛋白的结构域结构示于图1B中，其中CH1和CK结构域之间的键是链间二硫键。两个抗原结合结构域具有F(ab)结构，从而允许使用抗体，而不管它们是否以scFv形式保留功能性。Fc部分的DNA和氨基酸序列包含如形式F4中的串联CH3结构域和包含N297S取代的CH2结构域。产生F9蛋白的三种变体：(a)铰链区中的半胱氨酸残基保持完整(野生型，称为F9A)，(b)铰链区中的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替换(F9B)和(c)接头序列GGGSS替换了铰链中的残基DKTHTCPPCP(F9C)。变体F9B和F9C通过避免中心链的同源二聚体的形成而提供了生产优点。异源三聚体由以下组成：
(1)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第一(中心)多肽链：
VH抗CD19–CH1–CH2–CH3–CH3–VH抗NKp46–CK
以及
(2)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第二多肽链：
VK抗NKp46–CH1
以及
(3)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第三多肽链：
VK抗CD19–CK
如上所述克隆、生产和纯化蛋白质。使用prot-A珠通过亲和层析从细胞培养上清液纯化双特异性蛋白，并通过SEC分析和纯化。该蛋白质显示出高生产率8.7mg/L(F9A)和3.0mg/L(F9B)以及简单的SEC图。
F9蛋白变体F9A的三条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:12、13和14中。F9蛋白变体F9B的三条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:12、15和14中。F9蛋白变体F9C的三条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:12、16和14中。
形式10(F10)：CD19-F10-NKp46-3
F10多肽是具有中心多肽链和通过CH1-CK二聚化与中心链相关联的第二多肽链的二聚体蛋白。二聚体F10蛋白的结构域结构示于图1B中，其中CH1和CK结构域之间的键是链间二硫键。两个抗原结合结构域中的一个具有Fab结构，并且另一个是scFv。Fc部分的DNA和氨基酸序列包含如形式F4中的串联CH3结构域和具有N297S取代的CH2结构域。此外，产生F10蛋白的三种变体：(a)铰链区中的半胱氨酸残基保持完整(野生型，称为F10A)，(b)铰链区中的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替换(F10B)和(c)接头序列GGGSS(SEQ ID NO:28)替换了铰链中的残基DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:29)(F10C)。变体F10B和F10C通过避免中心链的同源二聚体的形成而提供了生产优点。(VK-VH)单元由VH结构域、接头和VK单元(scFv)组成。异源二聚体由以下组成：
(1)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第一(中心)多肽链：
VH抗CD19–CH1–CH2–CH3–CH3–(VH–VK)抗NKp46
以及
(2)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第二多肽链：
VK抗CD19–CK。
如上所述克隆、生产和纯化蛋白质。使用prot-A珠通过亲和层析从细胞培养上清液纯化双特异性蛋白，并通过SEC分析和纯化。该蛋白质显示出良好生产率2mg/L(F10A)和简单的SEC图。F10A蛋白变体的两条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:17(第二链)和SEQ IDNO:18(第一链)中。F10B蛋白变体的两条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:17(第二链)和SEQID NO:19(第一链)中。F10C蛋白变体的两条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:17(第二链)和SEQ ID NO:20(第一链)中。
形式11(F11)：CD19-F11-NKp46-3
F11多肽的结构域结构示于图1C中。异源二聚体蛋白与F10相似，但抗原结合结构域的结构相反。两个抗原结合结构域中的一个具有Fab样结构，并且另一个是scFv。异源二聚体由以下组成：
(1)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第一(中心)多肽链：
(VK–VH)抗CD19–CH2–CH3–CH3–VH抗NKp46–CK
以及
(2)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第二多肽链：
VK抗NKp46–CH1。
如上所述克隆、生产和纯化蛋白质。使用prot-A珠通过亲和层析从细胞培养上清液纯化双特异性蛋白，并通过SEC分析和纯化。该蛋白质显示出良好生产率2mg/L和简单的SEC图。F11蛋白的两条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:21(链1)和SEQ ID NO:22(链2)中。
形式12(F12)：CD19-F12-NKp46-3
二聚体F12多肽的结构域结构示于图1C中，其中CH1和CK结构域之间的键是二硫键。异源二聚体蛋白与F11相似，但F(ab)结构内的CH1和CK结构域颠倒。异源二聚体由以下组成：
(1)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第一(中心)多肽链：
(VK–VH)抗CD19–CH2–CH3–CH3–VH抗NKp46–CH1
以及
(2)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第二多肽链：
VK抗NKp46–CK。
如上所述克隆、生产和纯化蛋白质。使用prot-A珠通过亲和层析从细胞培养上清液纯化双特异性蛋白，并通过SEC分析和纯化。该蛋白质显示出良好生产率2.8mg/L和简单的SEC图。下文示出了F12蛋白的DNA和氨基酸序列。F12蛋白的两条链的氨基酸序列示于SEQID NO:23(链1)和SEQ ID NO:24(链2)中。
形式17(F17)：CD19-F17-NKp46-3
三聚体F17多肽的结构域结构示于图1C中，其中CH1和CK结构域之间的键是二硫键。异源二聚体蛋白与F9相似，但C-末端F(ab)结构中的VH和VK结构域以及CH1和CK结构域分别与其配偶体颠倒。异源三聚体由以下组成：
(1)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第一(中心)多肽链：
VH抗CD19–CH1–CH2–CH3–CH3–VK抗NKp46–CH1
以及
(2)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第二多肽链：
VH抗NKp46–CK
以及
(3)具有如下排列(N-端至C-端)的结构域的第三多肽链：
VK抗CD19–CK
此外，产生F17蛋白的三种变体：(a)铰链区中的半胱氨酸残基保持完整(野生型，称为F17A)，(b)铰链区中的半胱氨酸残基被丝氨酸残基替换(F10B)和(c)接头序列GGGSS(SEQ ID NO:28)替换了铰链中的残基DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:29)(F17C)。如上所述克隆、生产和纯化蛋白质。F17B蛋白的三条链的氨基酸序列示于SEQ ID NO:25、26和27中。
实例2：
通过表面等离子体共振(SPR)的双特异性蛋白的NKp46结合亲和力
Biacore T100通用程序和试剂
在25℃下在Biacore T100装置(Biacore通用电气医疗集团)上进行SPR测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(Biacore通用电气医疗集团)和NaOH 10mM分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。使用Biacore T100评估软件来分析传感图。从(通用电气医疗集团)购买Protein-A。在英内特制药公司(Innate Pharma)克隆、生产和纯化人NKp46重组蛋白。
Protein-A的固定
将Protein-A蛋白共价地固定在传感器芯片CM5上的右旋糖酐层中的羧基基团上。用EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(Biacore通用电气医疗集团))将芯片表面激活。将Protein-A在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)中稀释至10μg/ml，并且注射直到达到适当的固定水平(即2000RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(Biacore通用电气医疗集团)将剩余的激活的基团失活。
结合研究
以来自NKp46-3抗体的具有抗NKp46可变区的不同形式F3、F4、F9、F10、F11测试双特异性蛋白，并与作为全长人IgG1的NKp46-3抗体进行比较。
将1μg/ml的双特异性蛋白捕获到Protein-A芯片上，并在捕获的双特异性抗体上以5μg/ml注入重组人NKp46蛋白。对于空白减法，再次进行循环，用运行缓冲液替换NKp46蛋白。
亲和力研究
遵循制造商推荐的常规捕获-动力学规程(Capture-Kinetic protocol)(Biacore通用电气医疗集团动态术(kinetic wizard))进行单价亲和力研究。在捕获的双特异性抗体上依次注入人NKp46重组蛋白的七个系列稀释(范围为从6.25至400nM)，并且允许在再生前解离10分钟。使用1:1动态结合模型拟合整个传感图组。
结果
SPR显示形式F3、F4、F9、F10和F11的所有双特异性多肽保留与NKp46的结合。单价亲和力以及动态结合和解离速率常数显示于下表3中。
表3
双特异性mAb ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
CD19-F3-NKp46-3 3.905E+5 0.01117 28E-09
CD19-F4-NKp46-3 3.678E+5 0.01100 30E-09
CD19-F9A-NKp46-3 2.070E+5 0.00669 32E-09
CD19-F10A-NKp46-3 2.607E+5 0.00754 29E-09
CD19-F11A-NKp46-3 3.388E+5 0.01044 30E-09
NKp46-3IgG1 2.224E+5 0.00433 20E-09
实例3：
NKp46作用机制
将具有根据实例1中所述的F3形式的排列的NKp46x CD19双特异性蛋白与利妥昔单抗(抗CD20ADCC诱导抗体)和人IgG1同种型对照抗体针对引导CD16-/NKp46+NK细胞系来裂解CD19阳性肿瘤靶细胞的功能性能力进行比较。
简言之，在U型底96孔板中经典的4-h 51Cr-释放测定中评估CD16-/NKp46+人NK细胞系KHYG-1的细胞溶解活性。用51Cr(50μCi(1.85MBq)/1x106个细胞)标记Daudi或B221细胞，然后以等于50:1的效应物/靶比例，在从10-7mol/L开始以1/5稀释的稀释范围(n＝8个浓度)的测试抗体存在下，与KHYG-1混合。
在37℃下进行短暂的离心和4小时的孵育后，取出50μl的上清液并转移到LumaPlate(珀金埃尔默生命科学公司(Perkin Elmer Life Sciences)，波士顿，马萨诸塞州)中，并用TopCount NXTβ检测器(珀金埃尔默生命科学公司，波士顿，马萨诸塞州)测量51Cr释放。所有实验条件一式三份地分析，并且如下测定特异性裂解的百分比：100x(平均cpm实验释放-平均cpm自发释放)/(平均cpm总释放-平均cpm自发释放)。通过用2％TritonX100(西格玛公司(Sigma))裂解靶细胞获得总释放百分比，并且自发释放对应于培养基中的靶细胞(无效应物或Ab)。
结果
在KHYG-1 hNKp46 NK实验模型中，每个NKp46 x CD19双特异性蛋白通过人KHYG-1hNKp46 NK细胞系诱导Daudi或B221细胞的特异性裂解，而利妥昔单抗和人IgG1同种型对照(IC)抗体没有。
实例4：
不同双特异性形式与FcRn的结合
通过将重组FcRn蛋白共价固定在传感器芯片CM5上的右旋糖酐层中的羧基基团上，通过表面等离子体共振(SPR)研究不同抗体形式对人FcRn的亲和力。测试具有人IgG1恒定区的嵌合全长抗CD19抗体和具有根据实例1中所述的F3、F4、F9、F10或F11形式的排列的NKp46 x CD19双特异性蛋白；对于每种分析物，使用稳态或1:1SCK结合模型拟合整个传感图。
Biacore T100通用程序和试剂
在25℃下在Biacore T100装置(Biacore通用电气医疗集团)上进行SPR测量。在所有Biacore实验中，乙酸缓冲液(50mM乙酸盐pH 5.6，150mM NaCl，0.1％表面活性剂p20)和HBS-EP+(Biacore通用电气医疗集团)分别充当运行缓冲液和再生缓冲液。使用BiacoreT100评估软件来分析传感图。重组小鼠FcRn购自R&D系统公司(R&D Systems)。
FcRn的固定
将重组FcRn蛋白共价地固定在传感器芯片CM5上的右旋糖酐层中的羧基基团上。用EDC/NHS(N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(Biacore通用电气医疗集团))将芯片表面激活。将FcRn蛋白在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH5.6)中稀释至10μg/ml，并且注射直到达到适当的固定水平(即2500RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(Biacore通用电气医疗集团)将剩余的激活的基团失活。
亲和力研究
遵循单周期动力学(SCK)规程进行单价亲和力研究。将可溶性分析物(抗体和双特异性分子)的五个系列稀释(范围为从41.5至660nM)注入到FcRn上(无再生)，并且允许在再生前解离10分钟。对于每种分析物，使用1:1SCK结合模型拟合整个传感图。
结果
结果示出在下表4中。具有单体Fc结构域的双特异性蛋白(F3、F4、F9、F10、F11)显示与FcRn的结合。具有二聚体Fc结构域的人IgG1/K抗CD19抗体显示7.8的KD(nM)。
表4
所有标题和小标题在本文仅出于方便的目的来使用，并且不应被解释为以任何方式限制本发明。在所有可能的变体中上述元件的任何组合涵盖于本发明中，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。在本文引证数值的范围仅旨在用作单独地提及每个单独的数值落在该范围内的速记的方法，除非本文另外说明，并且每个单独的数值被结合到本说明书中就像它被单独地在本文引证一样。除非另外说明，在本文提供的所有确切数值是相应近似值的代表(例如，就特定因子或测量值所提供的所有确切的示例性数值可以被认为还提供了对应的近似测量值，当适当时通过“约”来修饰)。
在本文描述的所有方法能够以任何适合顺序进行，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。
本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。在本说明书中没有语言可以被解释为指示任何元素对于本发明的实践是至关重要的，除非被如此清楚地说明。
除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在本文对于使用了例如涉及一种或多种要素的术语的本发明的任何方面或实施例的描述，旨在提供对“由那一种或多种特定要素组成”、“基本上由那一种或多种特定要素组成”或“基本上包含那一种或多种特定要素”的本发明的类似方面或实施例的支持(例如，除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在本文所述的包含特定要素的组合物应理解为也描述由那个要素组成的组合物)。
本发明包括在本文提出的被可适用法律最大程度允许的多个方面或权利要求中引证的主题的所有变更和等效物。
所有在本说明书中引用的公开文件以及专利申请都通过引用以其全文并入本文，如同各个单独的公开文件或专利申请被确切地并且单独地指明为通过引用而结合。
尽管以上发明已经出于清楚理解的目的通过说明和举例的方式进行了一些详细的描述，对于本领域普通技术人员而言在本发明的传授内容的启发下应该容易清楚的是，在不偏离随附权利要求书的精神或范围下可以对其进行某些改变和变更。
序列表
<110> 依奈特制药公司
<120> 单体FC结构域
<130> NTECH2
<150> US 62/099,634
<151> 2015-01-05
<160> 29
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 2
<211> 227
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
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Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly
225
<210> 3
<211> 333
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 3
gacattcagc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120
caacagatac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtatct 180
gggattccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggacccttgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
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Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
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<210> 5
<211> 372
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 5
caggttcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgcggc ctgggtcctc agtgaagatt 60
tcctgcaaag catctggcta cgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120
cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180
aacggaaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagacg aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctggc ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgagaa 300
acgaccactg tcgggcgtta ttactatgct atggactact ggggtcaagg aaccacagtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 6
<211> 124
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
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<211> 116
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<213> 小家鼠
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
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Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
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Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
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Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val
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Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser
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Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ile Gly Gly Thr Ser Tyr
50 55 60
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser
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Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
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Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser
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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Val Met Thr Gln
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<210> 10
<211> 837
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合小家鼠智人
<400> 10
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
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Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
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Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
165 170 175
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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<220>
<223> 嵌合小家鼠智人
<400> 11
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Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val
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Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met
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Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln
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Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly
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Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
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Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
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Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ala
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
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450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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<223> 嵌合小家鼠智人
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385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
465 470 475 480
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
485 490 495
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
500 505 510
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
515 520 525
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
530 535 540
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
545 550 555 560
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
565 570 575
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
580 585 590
Ser Thr Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val
595 600 605
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr
610 615 620
Phe Thr Glu Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser
625 630 635 640
Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ile Gly Gly Thr Ser Tyr
645 650 655
Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser
660 665 670
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala
675 680 685
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
690 695 700
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
705 710 715 720
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
725 730 735
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
740 745 750
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
755 760 765
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
770 775 780
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
785 790 795 800
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
805 810 815
Lys Thr His
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合小家鼠智人
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合小家鼠智人
<400> 25
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 792
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合小家鼠智人
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ser
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
465 470 475 480
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
485 490 495
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
500 505 510
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
515 520 525
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
530 535 540
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
545 550 555 560
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Thr
565 570 575
Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr
580 585 590
Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser
595 600 605
Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu
610 615 620
Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe
625 630 635 640
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val
645 650 655
Glu Pro Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe
660 665 670
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ser Thr
675 680 685
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
690 695 700
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
705 710 715 720
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
725 730 735
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
740 745 750
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
755 760 765
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
770 775 780
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
785 790
<210> 27
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 嵌合小家鼠智人
<400> 27
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Pro Asn Ile Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
115 120 125
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
130 135 140
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
145 150 155 160
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
180 185 190
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
195 200 205
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 接头
<400> 28
Gly Gly Gly Ser Ser
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人
<400> 29
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10

Claims (36)

1.一种包含由柔性接头分开的第一CH3结构域和第二CH3结构域的多肽链。
2.如权利要求1所述的多肽链，其中该第一CH3结构域和第二CH3结构域由足够长度的接头分开，以允许该第一CH3结构域和第二CH3结构域经由非共价相互作用彼此相关联。
3.如权利要求1-2所述的多肽链，其中分开该第一CH3结构域和第二CH3结构域的氨基酸序列是具有10个和30个之间的残基的肽接头。
4.如以上权利要求中任一项所述的多肽链，其中分开该第一CH3结构域和第二CH3结构域的氨基酸序列是具有式(G4S)x的肽接头，其中x是2、3、4、5或6。
5.如以上权利要求中任一项所述的多肽链，其中该多肽是包含与该第一CH3结构域融合的CH2结构域的Fc多肽。
6.如以上权利要求中任一项所述的多肽链，其中该多肽从N-端至C-端包含感兴趣的多肽、CH2结构域、第一CH3结构域、柔性肽接头、以及第二CH3结构域。
7.如权利要求6所述的多肽链，其中该多肽从N-端至C-端包含特异性地结合到感兴趣的抗原的抗原结合结构域(ABD)、CH2结构域、第一CH3结构域、柔性肽接头、以及第二CH3结构域。
8.如权利要求6或7所述的组合物，其中该多肽具有以下结构域排列：(ABD)–-接头–CH2–CH3–-接头–CH3。
9.如以上权利要求中任一项所述的多肽链，其中该多肽从N-端至C-端包含特异性地结合到感兴趣的第一抗原的第一抗原结合结构域(ABD1)、CH2结构域、第一CH3结构域、柔性肽接头、第二CH3结构域、以及特异性地结合感兴趣的第二抗原的第二抗原结合结构域(ABD2)。
10.如权利要求9所述的多肽，其中该多肽具有以下结构域排列：(ABD1)–-接头–CH2–CH3–-接头–CH3–接头–-(ABD2)。
11.如权利要求10所述的多肽，其中该多肽具有以下结构域排列：(ABD1)–-接头–CH1–CH2–CH3–-接头–CH3–接头–-(ABD2)。
12.一种蛋白质，该蛋白质包含如以上权利要求中任一项所述的多肽链和与之相关联的一个或多个另外的多肽链。
13.一种多功能蛋白，该多功能蛋白包含：
(a)感兴趣的第一多肽，
(b)包含由氨基酸残基序列分开的第一CH3结构域和第二CH3结构域的Fc衍生部分，该Fc衍生部分可操作地连接到该感兴趣的第一多肽的C-端，以及
(c)可操作地连接到(b)的Fc衍生部分的C-端的感兴趣的多肽，其中该多特异性多肽能够结合人新生儿Fc受体(FcRn)。
14.如权利要求13所述的组合物，其中该感兴趣的第一多肽是结合第一抗原的第一抗原结合结构域(ABD1)。
15.如权利要求13-14所述的组合物，其中该感兴趣的第二多肽是结合第二抗原的第二抗原结合结构域(ABD2)。
16.如权利要求13-15所述的组合物，其中该多肽是以单价方式结合第一和第二抗原的多特异性多肽。
17.如权利要求13-16所述的组合物，其中(b)的Fc衍生部分从N-端至C-端包含CH2结构域、第一CH3结构域、肽接头和第二CH3结构域。
18.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该多肽基本上缺乏经由其Fc结构域与选自下组的一种或多种人Fcγ受体的结合，该组由以下各项组成：CD16、CD32A、CD32B和CD64。
19.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该多特异性多肽能够结合人新生儿Fc受体(FcRn)。
20.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该CH2结构域包含用以减少与人Fcγ受体的结合的氨基酸取代。
21.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中每个ABD包含抗体的高变区，任选地重链和轻链CDR。
22.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中ABD包含免疫球蛋白重链可变结构域和轻链可变结构域。
23.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中ABD是scFv。
24.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该多肽是双特异性多肽。
25.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗原结合结构域中的一个与癌抗原结合。
26.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗原结合结构域中的一个与病毒或细菌抗原结合。
27.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗原结合结构域中的一个与免疫效应细胞上的细胞表面受体结合。
28.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗原结合结构域中的一个与免疫效应细胞上的细胞表面受体结合，并且该抗原结合结构域中的另一个结合癌、病毒或细菌抗原。
29.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中免疫效应细胞上的该细胞表面受体是免疫球蛋白超家族的成员。
30.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中免疫效应细胞上的该细胞表面受体是天然细胞毒性受体家族或NK细胞凝集素样受体家族的成员。
31.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中免疫效应细胞上的该细胞表面受体选自下组，该组由以下各项组成：激活KIR、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、CD8和CD3。
32.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中该抗体包含来自人框架区的框架残基。
33.一种药物组合物，该药物组合物包含如以上权利要求中任一项所述的多肽或蛋白质以及药学上可接受的载体。
34.如以上权利要求中任一项所述的组合物用作治疗疾病的药物的用途。
35.一种治疗受试者的疾病的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求1-33所述的组合物。
36.如权利要求34-35所述的方法或用途，其中该疾病是癌症、感染性疾病或者炎性或自身免疫性疾病。
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