KR20220145854A - 지방산 분자와 접합된 항체 및 이의 용도 - Google Patents

지방산 분자와 접합된 항체 및 이의 용도 Download PDF

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하이춘 지아
휘 저우
밍한 왕
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Abstract

항원-결합 도메인에 또는 그 근처에 접합된 지방산 (FA) 을 포함하는 단일클론 항체 (mAb) 또는 이중특이적 항체 (bsAb) 또는 다중특이적 항체가 기재된다. 또한, 항체를 인코딩하는 핵산, 항체를 포함하는 조성물, 및 항체를 제조하고, 질환, 예컨대 암 및/또는 관련 합병증을 치료 또는 예방하기 위해 항체를 사용하는 방법이 기재된다.

Description

지방산 분자와 접합된 항체 및 이의 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020 년 2 월 27 일에 출원한 미국 가출원 번호 62/982,476 을 우선권으로 주장한다. 이 개시물은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 단일클론 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 중쇄 가변부 (VH); 및 경쇄 가변부 (VL) 를 포함하고; 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고; VH, VL 내의 아미노산 잔기, 또는 VH 또는 VL 로부터 20 개-아미노산 거리, 바람직하게는 5 개-아미노산 거리 내의 아미노산 잔기는 지방산 (FA) 에 접합될 수 있는 아미노산 잔기로 치환되고; 치환된 아미노산 잔기에서 FA 와 접합시, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며; FA-접합된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생리학적 수준의 알부민 (예를 들어, 35 내지 50 mg/mL) 의 존재 하에 표적 항원에 대한 특이적 결합이 감소하거나 제거된다. 본 발명은 또한 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 FA 에 접합되는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 항원-결합 완부 (arm)(들) 를 포함한다. 본 발명은 또한 항체를 인코딩하는 핵산 및 발현 벡터, 벡터를 함유하는 재조합 세포, 및 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 항체의 제조 방법, 항체를 FA 와 접합시키는 방법, 접합된 항체를 포함하는 조성물의 제조 방법, 및 암을 치료하기 위해 접합된 항체를 사용하는 방법이 또한 제공된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 파일명이 "065799.32WO1 Sequence Listing" 이고 생성일이 2021년 2월 22일이며 크기가 29 kb 인 ASCII 포맷의 서열 목록으로서 EFS-Web 을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함한다. EFS-Web 을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이고 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
T 세포 연결체는 암 세포 표면에 발현된 종양 관련 항원 (TAA) 에 결합하는 하나의 도메인 및 T 세포 표면 분자에 결합하여 T 세포를 활성화시키는 다른 도메인을 갖는 2 개의 결합 도메인으로 이루어지는 분자이다. 다양한 T 세포 결합 도메인이 활성화 성분으로 사용되었지만 항-CD3 결합 도메인은 T 세포 연결체의 일부로서 널리 사용되었다. 항-CD3 이중특이적 항체는 암 사멸을 용이하게 하기 위해 종양 세포에 T 세포를 모집하기 위한 T 세포-연결 면역치료제로서 사용되어 왔다. 이러한 면역종양학 접근법으로의 하나의 주요 쟁점은 사이토카인 방출 증후군 (CRS) 의 위험성이다. 종양 미세환경으로부터 떨어진 위치에서의 T 세포 활성화에서 이들 작용제의 활성을 조절하는 것은 CRS 및 다른 독성의 위험성을 감소시키는 것을 도울 수 있다.
지방산 (FA) 은 순환 혈액 내에서 고농도로 존재한다. 소수성 특성으로 인해, 지방산은 35-50 mg/mL 범위인 혈액 알부민 분자에 결합한다 (Peters, T., 1996. All About Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications. San Diego, CA: Academic Press Limited). 7개의 공통적인 FA 결합 위치가 알부민에서 확인되었다 (Bhattacharya et al., J Mol Biol. 2000. 303:721-32; Petitpas et al., J Mol Biol. 2001.314:955-60.). 또한, 종양은 알부민을 에너지원으로서 사용하여 그들의 공격적인 성장을 지지하는 것이 제시되었는데 (Merlot et al., Front Physiol. 2014. 5:299), 이는 종양 위치에서 알부민 이화작용의 높은 비율과 일치한다 (HRADEC, Br J Cancer. 1958. 12:290-304; Andersson et al., J Surg Res. 1991. 50:156-62; Schilling et al., Int J Rad Appl Instrum B. 1992. 19:685-95; Stehle et al., Crit Rev Oncol Hematol. 1997. 26:77-100.). 종양 위치 상에서 알부민의 높은 회전율은 종양 미세환경에서 감소된 알부민 농도가 존재함을 제시한다. 따라서, 특정 종양 세포 주위의 알부민 수준은 순환 혈액 내의 경우보다 더 낮을 것으로 예상된다. 또한, 간질성 알부민 농도는 혈청 농도에 비해 지방 조직 및 골격근에서 상당히 낮은 것으로 보고되었다 (Ellmerer et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278:E352-E356 (2000)).
순환 혈액에 비해, 조직, 예컨대 지방 조직, 골격근, 및 종양 미세환경에서의 더 낮은 알부민 수준을 활용하여, 알부민 수준이 낮은 조직 또는 위치를 표적화하는 치료요법의 활성을 조절하기 위해 알부민에 대한 FA 의 결합을 사용할 수 있다. 이는 알부민이 FA 에 결합될 때 치료요법의 활성이 감소되거나 제거되도록 치료요법의 활성 위치에 접합된 FA 로 실행될 수 있다. 이러한 접근법이 면역-종양학 치료요법, 예컨대 항-CD3 단일클론 및/또는 이중특이적 항체에 적용되는 경우, 이는 암을 치료하는 방법에서 CRS 및 다른 독성의 위험성을 감소시킬 가능성을 갖는다.
발명의 개요
한 일반적인 양태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 중쇄 가변부 (VH); 및 경쇄 가변부 (VL) 를 포함하고; 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 항원, 바람직하게는 인간 표적 항원에 결합하고; VH, VL 내의 아미노산 잔기, 또는 VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리, 바람직하게는 5 개-아미노산 거리 내의 아미노산 잔기는 지방산 (FA) 에 접합되는 아미노산 잔기로 치환되고; 치환된 아미노산 잔기에서 FA 와 접합시, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 여전히 표적 항원에 결합하며; FA-접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생리학적 수준의 알부민 (예를 들어, 35 내지 50 mg/mL) 의 존재 하에 표적 항원에 대한 특이적 결합이 감소하거나 제거된다. 치환된 아미노산 잔기는 예를 들어 시스테인 잔기 또는 리신 잔기 또는 화학적 접합에 적합한 변형된 아미노산일 수 있다.
특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO:1 의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113 에 상응하는 아미노산 잔기 또는 SEQ ID NO:2 의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67 에 상응하는 아미노산 잔기에서 발생하고, 바람직하게는 치환은 SEQ ID NO:1 의 S25C, Y27C, K62C, K64C, K73C, S76C, D101C, S112C 또는 S113C 에 상응하는 치환 또는 SEQ ID NO:2 의 S26C, S27C, S52C, K53C, S56C 또는 S67C 에 상응하는 치환에서 선택되며, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다. 특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO:1 에 상응하는 잔기 64 또는 SEQ ID NO:2 에 상응하는 잔기 26 에 있고, 바람직하게는 치환은 SEQ ID NO:1 에 상응하는 K64C 치환 또는 SEQ ID NO:2 에 상응하는 S26C 치환에서 선택되며, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다.
특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 의 잔기 119 또는 120, 또는 SEQ ID NO: 13 또는 14 의 잔기 121 또는 124 에서 발생하고, 바람직하게는 치환은 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 의 S119C 또는 T120C, 또는 SEQ ID NO: 13 또는 14 의 S121C 또는 Q124C 에서 선택되며, 잔기는 EU 번호매김에 따라 번호매겨진다. 특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 의 잔기 120 에 있고, 바람직하게는 치환은 T120C 치환이며, 잔기는 EU 번호매김에 따라 번호매겨진다.
특정 구현예에서, 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-면역 세포 조절제 (ICM) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, ICM, 바람직하게는 인간 ICM 에 특이적으로 결합할 수 있다. ICM 은 예를 들어, CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 항-ICM 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, CD3, 바람직하게는 인간 CD3 에 특이적으로 결합할 수 있다. 단리된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 중쇄 상보성 결정 부위 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 부위 1 (LCDR1), LCDR2 및 LCDR3 을 포함할 수 있다 (각각 SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 및 8, 또는 SEQ ID NO:33, 34, 35, 36, 37 및 38 의 폴리펩티드 서열을 각각 가짐).
특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 항-CD3 mAb 의 VH (SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:27) 에서의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113 에서, 또는 항-CD3 mAb 의 VL (SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:28) 에서의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67 에서 발생하고, 바람직하게는 치환은 VH (SEQ ID NO:1 또는 27) 에서의 S25C, Y27C, K62C, K64C, K73C, S76C, D101C, S112C 또는 S113C, 또는 VL (SEQ ID NO:2 또는 28) 에서의 S26C, S27C, S52C, K53C, S56C 또는 S67C 에서 선택되며, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다. 특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 VH (SEQ ID NO:1 또는 27) 에서의 잔기 64 또는 VL (SEQ ID NO:2 또는 28) 에서의 잔기 26 에 있고, 바람직하게는 치환은 VH (SEQ ID NO:1 또는 27) 에서의 K64C 치환 또는 VL (SEQ ID NO:2 또는 28) 에서의 S26C 치환에서 선택되고, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다.
단리된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 불변 도메인 1 (CH1) 부위 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 불변 도메인 (CL) 부위; 또는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위; 또는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기서 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 FA 에 접합되는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 항원-결합 완부(들) 를 포함한다. 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 및 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 를 포함하며, 여기서 Ab1 및/또는 Ab2 는 FA 에 접합되는 치환된 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, Ab1 은 면역 세포 조절제 (ICM), 바람직하게는 인간 ICM 에 결합한다. ICM 은 예를 들어, CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, ICM 은 CD3, 바람직하게는 인간 CD3 이다.
특정 구현예에서, Ab2 는 종양-관련 항원 (TAA), 바람직하게는 인간 종양-관련 항원 (인간 TAA) 에 결합한다. TAA 는 예를 들어 DLL3 일 수 있다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 H1 및 L1 을 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1), 및 H2 및 L2 를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 를 포함하고, 여기서:
(a) H1 및 H2 는 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 CH1 부위를 포함하고;
(b) L1 및 L2 는 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 부위를 포함하고;
이때 H1L1 및 H2L2 는 각각 하기 아미노산 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 전하 쌍을 포함한다:
(1) H1 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L1 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L2 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
(2) H1 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L1 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L2 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
(3) H1 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L1 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L2 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
(4) H1 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L1 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L2 의 CL 에서의 S121D/E 각각;
(5) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
(6) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각;
(7) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각;
(8) H2 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L2 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L1 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
(9) H2 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L2 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L1 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
(10) H2 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L2 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L1 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
(11) H2 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L2 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L1 의 CL 에서의 S121D/E 각각;
(12) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
(13) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각; 또는
(14) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:15 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:17 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:19 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:21 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:29 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:30 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:31 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:32 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:15 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:17 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2);
(b) SEQ ID NO:19 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:21 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2);
(c) SEQ ID NO:29 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:30 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2); 또는
(d) SEQ ID NO:31 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:32 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2).
특정 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 치환된 아미노산 잔기에서 FA 에 접합된다. FA 는 예를 들어 6 개의 탄소, 8 개의 탄소, 10 개의 탄소, 12 개의 탄소, 14 개의 탄소, 16 개의 탄소 또는 18 개의 탄소, 또는 그 사이의 임의 수의 탄소를 갖는 FA 에서 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, FA 는 14 개의 탄소 또는 18 개의 탄소, 또는 그 사이의 임의 수의 탄소를 갖는 FA 에서 선택된다.
특정 구현예에서, FA 는 치환된 아미노산 잔기에 대한 접합을 위한 링커를 포함한다. 링커는 예를 들어, 펩티드 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커에서 선택될 수 있다. 펩티드 링커는 예를 들어 50 개 미만의 아미노산일 수 있다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 접합된 FA 는 알부민에 결합할 수 있고, 여기서 알부민의 FA 에 대한 결합은 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이의 결합의 부분적 또는 완전한 차단을 초래한다. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 특정 구현예에서, Ab1 완부 상의 알부민의 FA 에 대한 결합은 이의 항원에 대한 Ab2 완부의 결합에 영향을 미치지 않거나, Ab2 완부 상의 FA 에 대한 알부민의 결합은 이의 항원에 대한 Ab1 완부의 결합에 영향을 미치지 않는다. 특정 구현예에서, FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 알부민에 결합하지 않은 FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 비해 알부민에 결합시 T 세포를 활성화시키는 감소된 능력을 갖는다.
본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산이 또한 제공된다.
본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터가 또한 제공된다.
본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다.
본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 또한 제공된다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정 구현예에서, 약학 조성물은 FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (FA 는 알부민에 결합함), 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다. 암은 예를 들어, 폐암, 위암, 식도암, 담관암, 담관암종, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피세포 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종, 및 기타 고형 종양, 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 기타 액형 종양으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 방법은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를, 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 조건 하에서 배양시키는 것, 및 임의로는 항체 또는 이의-항원 결합 단편을 세포 또는 배양물로부터 회수하는 것을 포함한다.
본 발명의 FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 치환된 아미노산 잔기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 FA 를 접합시키는 것을 포함한다. FA 에 접합되고 알부민에 결합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 알부민과 접촉시키는 것을 포함한다.
본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 약학 조성물을 수득하는 것을 포함한다.
임의로는 링커를 통해 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 공유 연결된 FA 를 포함하는 접합체와 알부민을 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 접합체에서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 접합체에서의 FA 는 알부민에 결합할 수 있고, FA 에 대한 알부민의 결합은 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이의 결합을 부분적으로 또는 완전히 차단시킨다. 특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH, VL 에서, 또는 VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리, 바람직하게는 5 개-아미노산 거리 내에 하나 이상의 치환된 아미노산 잔기를 포함하고, 하나 이상의 치환된 아미노산 잔기는 임의로는 링커를 통해 FA(들) 에 공유 연결된다. 특정 구현예에서, 접촉 단계는 표적 항원을 포함하는 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 접합체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 알부민은 순환 혈액에 비해 종양 미세환경에서 더 높은 회전율을 갖고/갖거나, 알부민은 대상체의 순환 혈액의 알부민 수준보다 더 낮은 수준으로 종양 미세환경에 존재한다.
본 출원의 전술한 발명의 개요 뿐만 아니라 하기 바람직한 구현예의 상세한 설명은, 첨부된 도면과 함께 판독시 보다 잘 이해될 것이다. 그러나, 본 출원이 도면에서 나타낸 정확한 구현예에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
도 1A-1E 는 VH 부위에 접합된 지방산 (FA) 분자를 갖는 단일클론 항체 (mAb) (도 1A) 및 이중특이적 항체 (bsAb) (도 1B 및 1C) 의 개략적 구조, FA-접합된 이중특이적 항체의 생체내 작용 방식의 예시 (도 1D), 및 FA-접합된 항체를 식별하기 위한 전략의 개략도 (도 1E) 를 나타낸다. 도 1A-1C 는 접합 위치가 VL 부위 및 CL 부위를 포함하는 Fab 부위 내의 다른 적합한 위치 상에 있을 수 있기 때문에 단지 예시 목적을 위해 개략도를 제공한다. 추가로, 이중특이적 항체의 양 완부는 도 1B-1C 에서 접합될 수 있다. FA 는 잠재적으로 상이한 정도로 접합된 완부의 항원-결합 활성을 조절할 수 있다. 도 1A 에서, FA 분자는 양 완부의 VH 부위에 접합되는 것으로 나타나고; 도 1B 에서, FA 분자는 이중특이적 항체의 완부 중 하나의 VH 부위에 접합되는 것으로 나타나며; 도 1C 에서, FA 분자는 이중특이적 항체의 완부 중 하나의 CH1 부위에 접합되는 것으로 나타난다. 접합된 FA 에 결합된 알부민이 접합된 완부에 의해 표적 항원의 결합을 완전히 또는 부분적으로 차단할 수 있기 때문에, 접합된 완부의 항원-결합 활성은 알부민에 의해 조절되는 것으로 예상된다. 도 1D 는 생체내에서 암 세포를 표적화하기 위해 T 세포를 관여시키는데 사용하기 위한 FA-접합된 이중특이적 항체의 작용 방식을 예시한다. 이중특이적 항체의 양 완부가 FA 와 접합될 때, 동일한 목적이 달성될 수 있으나; 이 경우 알부민에 의한 조절은 단 하나의 완부가 접합되는 이중특이적 항체에 비해 증가될 수 있다. 또한, 도 1D 는 알부민 수준이 FA-접합된 이중특이적 항체의 항원-결합 활성을 어떻게 조절하는지를 예시한다. 도 1E 는 FA-접합된 mAb 또는 bsAb 를 식별하기 위한 특정 단계를 나타낸다. 알부민-의존적 활성은 접합된 항체의 활성이 알부민에 의해 조절된다는 점을 지칭한다 (즉, 고농도의 알부민이 항원-결합 활성을 감소시키거나 완전히 차단함).
도 2A-2D 는 예시 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2A 는 항-CD3 항체의 VH 부위의 아미노산 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO:1). 도 2B 는 항-CD3 항체의 VL 부위의 아미노산 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO:2). 도 2C 는 인간 IgG1 (SEQ ID NO:9), IgG2 (SEQ ID NO:10), IgG3 (SEQ ID NO:11) 및 IgG4 (SEQ ID NO:12) 의 CH1 부위의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2D 는 인간 카파 (SEQ ID NO:13) 및 람다 경쇄 (SEQ ID NO:14) 의 CL 부위의 아미노산 서열을 나타낸다. IMGT 및 Kabat 방법의 조합에 의해 결정된 CDR 부위를 회색으로 강조한다. * 는 공지된 대립유전자 변이의 위치를 나타낸다.
도 3A-3G 는 항-CD3 단일클론 항체 (mAb) 에서 FA 와의 접합 및 치환을 위해 선택된 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 도 3A 는 FA 접합을 위한 시스테인 녹인에 대한 잠재적 위치를 확인하기 위한 항-CD3 mAb 에서의 Fab 부위 (VH, CH1, VL 및 CL 함유) 의 3-D 모델링을 나타낸다. 4 개의 위치가 3-D 구조에서 예로서 제시된다 (LC_S26, LC_S31, HC_K64, 및 HC_T120) (LC: 경쇄; HC: 중쇄). 추가적인 위치를 표 3 에 나타낸다. 도 3B-3G 는 Jurkat 세포 상의 CD3 에 대한 시스테인 녹인을 갖는 항-CD3 mAb 의 결합을 입증하는 그래프를 나타낸다. MFI: 평균 형광 강도. 항-CD3 mAb, 야생형 항-CD3 mAb.
도 4A-4C 는 항-CD3 mAb 와의 접합을 위한 FA 분자의 구조 및 FA-접합된 항-CD3 mAb 의 질량 분석 (MS) 프로파일을 나타낸다. 도 4A 는 접합을 위한 FA 분자의 구조를 나타낸다. 모든 FA 분자는 PEG 링커를 통해 접합되었다. 도 4B 는 C18 FA 와 접합된 mAb (LC_S26C, HC_K64C, HC_T120C) 의 MS 프로파일을 나타낸다. 도 4C 는 각각 C6, C10 및 C14 FA 와 접합된 HC_K64C mAb 의 MS 프로파일을 나타낸다. Expt, 예상되는 디콘볼루션된 질량; obs, 관찰되는 디콘볼루션된 질량. LC_S26C 는 경쇄의 S26 위치에서의 세린이 시스테인으로 대체되는 항-CD3 mAb 를 나타내고; 시스테인이 녹인된 모든 다른 mAb 는 동일한 명명 규칙을 따른다.
도 5A-5C 는 Jurkat 세포 상의 CD3 에 대한 C18 FA-접합된 항-CD3 mAb 의 결합에 대한 알부민의 효과를 나타낸다. 어세이를 50 mg/mL 소 혈청 알부민 (BSA) 의 부재 또는 존재 하에 실행하였다. 도 5A, 접합된 LC_S26C; 도 5B, 접합된 HC_K64C; 도 5C, 접합된 HC_T120C.
도 6A-6C 는 C18 FA-접합된 항-CD3 mAb 에 의한 T 세포 활성화에 대한 상이한 농도의 알부민의 효과를 나타낸다. 도 6A, 접합된 LC_S26C; 도 6B, 접합된 HC_K64C; 도 6C, 접합된 HC_T120C. 어세이 배지는 1% FBS (소 태아 혈청) 를 함유하며; 표지된 BSA 농도는 어세이 배지에 첨가된 BSA 를 나타낸다.
도 7A-7C 는 각각 C6, C10 및 C14 FA-접합된 항-CD3 mAb 에 의한 T 세포 활성화에 대한 상이한 농도의 알부민의 효과를 나타낸다. 도 7A, C6 FA-접합된 HC_K64C; 도 7B, C10 FA-접합된 HC_K64C; 도 7C, C14 FA-접합된 HC_K64C. 어세이 배지는 1% FBS 를 함유하며; 표지된 BSA 농도는 어세이 배지에 첨가된 BSA 를 나타낸다: 대조군, BSA 를 첨가하지 않음.
도 8A-8C 는 항-CD3 완부의 HC 상의 잔기 K64 가 시스테인으로 대체되는 정제된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체 bsAb HC_K64C 의 순도를 나타낸다. 도 8A 는 특정 불순물 표준을 갖는 정제된 bsAb HC_K64C 의 HIC HPLC 분석 결과를 나타내고; 도 8B 는 특정 불순물 표준을 갖는 정제된 bsAb HC_K64C 의 SCX HPLC 분석 결과를 나타내고; 도 8C 는 정제된 bsAb HC_K64C 의 SEC HPLC 분석 결과를 나타낸다. 항-CD3 놉 (knob) 동종이량체/절반 몰, 불순물 표준, 이는 항-CD3 HC 및 항-CD3 LC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임; 항-DLL3 홀 (hole) 동종이량체/절반 몰, 불순물 표준, 이는 항-DLL3 HC 및 항-DLL3 LC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임; 2x 항-CD3 LC 미스매치, 불순물 표준, 이는 항-CD3 HC, 항-CD3 LC 및 항-DLL3 HC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임; 2x 항-DLL3 LC 미스매치, 불순물 표준, 이는 항-CD3 HC, 항-DLL3 HC 및 항-DLL3 LC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임. 절반 몰, 절반 IgG 분자 (단 하나의 HC 및 하나의 LC 를 가짐).
도 9A-9C 는 항-CD3 완부의 HC 상의 잔기 T120 이 시스테인으로 대체되는 정제된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체 bsAb HC_T120C 의 순도를 나타낸다. 도 9A 는 특정 불순물 표준을 갖는 정제된 bsAb HC_T120C 의 HIC HPLC 분석 결과를 나타내고; 도 9B 는 특정 불순물 표준을 갖는 정제된 bsAb HC_T120C 의 SCX HPLC 분석 결과를 나타내고; 도 9C 는 정제된 bsAb HC_T120C 의 SEC HPLC 분석 결과를 나타낸다. 항-CD3 놉 동종이량체/절반 몰, 불순물 표준, 이는 항-CD3 HC 및 항-CD3 LC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임; 항-DLL3 홀 동종이량체/절반 몰, 불순물 표준, 이는 항-DLL3 HC 및 항-DLL3 LC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임; 2x 항-CD3 LC 미스매치, 불순물 표준, 이는 항-CD3 HC, 항-CD3 LC 및 항-DLL3 HC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임; 2x 항-DLL3 LC 미스매치, 불순물 표준, 이는 항-CD3 HC, 항-DLL3 HC 및 항-DLL3 LC 로 형질감염된 세포의 배지로부터 정제된 단백질 A 임. 절반 몰, 절반 IgG 분자 (단 하나의 HC 및 하나의 LC 를 가짐).
도 10A-10B 는 지방산 분자와 접합된 정제된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체의 순도를 나타낸다. 도 10A 는 지방산 분자와 접합된 정제된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체의 HIC HPLC 분석 결과를 나타내고; 도 10B 는 지방산 분자와 접합된 정제된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체의 SEC HPLC 분석 결과를 나타낸다. bsAb HC_T120C_C18 은 C18 FA 와 접합된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체 bsAb HC_T120C 를 지칭하고; 다른 접합된 이중특이적 항체는 동일한 명명 규칙을 따른다.
도 11 은 차단 항체의 존재 또는 부재 하에 미접합 및 접합된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체에 의한 SHP-77 및 Jurkat 세포의 가교 어세이 결과를 나타낸다. 항-DLL3 차단 mAb 는 항-DLL3 완부의 mAb 버전이고; 항-CD3 차단 mAb 는 항-CD3 완부의 mAb 버전이다 (시스테인 녹인 없음). WT bsAb, 야생형 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체 (시스테인 녹인 없음); SHP-77 + Jurkat 대조군에 대해, 어세이를 항체 첨가 없이 세포로 수행하였다.
도 12A-12B 는 미접합 및 접합된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 SHP-77 세포 (DLL3 을 발현함) 의 존재 하에 Jurkat 세포 상의 T-세포-수용체-CD3 (TCR/CD3) 복합체의 활성화에 대한 결과를 나타낸다. 항-DLL3 차단 mAb 를 사용하여 활성화를 억제하여, Jurkat 세포 활성화가 이중특이적 항체에 의한 SHP-77 세포의 동시 결합을 필요로 한다는 것을 입증하였다. 어세이 배지는 0.5% FBS 를 함유한다.
도 13A-13B 는 미접합 및 접합된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체에 의해 매개된 SHP-77 세포 (DLL3 을 발현함; 표적 세포로도 공지됨) 의 존재 하에 Jurkat 세포 상의 TCR/CD3 복합체의 활성화에 대한 BSA 의 효과에 대한 결과를 나타낸다. 어세이 배지는 0.5% FBS 를 함유하며; 표지된 BSA 농도는 어세이 배지에 첨가된 BSA 를 나타낸다.
도 14 는 접합된 이중특이적 항체의 항-DLL3 완부의 항원-결합 활성에 대한 BSA 의 효과를 평가하기 위해 사용된 ELISA 어세이의 결과를 나타낸다. 항-DLL3 F(ab')2 를, 접합된 이중특이적 항체의 항-DLL3 완부에 의한 DLL3 결합의 억제를 위한 대조군으로서 사용하였다.
발명의 상세한 설명
다양한 발행물, 논문 및 특허가 배경 및 명세서 전반에 걸쳐 인용되거나 기재되며; 이들 참고문헌 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 재료, 장치, 물품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 사안 중 임의의 것 또는 전부가 개시되거나 청구된 임의의 발명과 관련하여 종래 기술의 일부를 형성한다는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는, 본 발명이 적용되는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 다르게는, 본원에서 사용되는 특정 용어는 본 명세서에서 나타내는 바와 같은 의미를 갖는다.
본원 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태의 "부정 관사" 및 "정관사" 는, 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다는 것에 유의해야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치는 용어 "약" 에 의해 모든 경우에 변형되는 것으로서 이해되어야 한다. 따라서, 수치는 전형적으로 인용된 값의 ±10% 를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL 의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL 를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v) 의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v) 를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 수치 범위의 사용은 맥락상 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 모든 가능한 하위범위, 그러한 범위 내의 정수 및 값의 분수를 포함하는 그 범위 내의 모든 개별 수치를 명시적으로 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소에 선행하는 용어 "적어도" 는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을, 단지 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나, 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "망라하다", "망라하는", "포함하다", "포함하는", "갖다", "갖는", "함유하다" 또는 "함유하는" 또는 이의 임의의 다른 변형은, 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하나 임의의 다른 정수 또는 정수의 군을 배제하지는 않는 것으로 이해될 것이며, 비-배타적이거나 개방형인 것으로 의도된다. 예를 들어, 요소의 목록을 포함하는 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품 또는 장치는 반드시 이들 요소에만 한정되는 것이 아니라, 이러한 조성물, 혼합물, 공정, 방법, 물품 또는 장치에 고유하지 않거나 명백하게 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 또한, 반대로 명시적으로 언급되지 않는 한, "또는" 은 포괄적인 것을 나타내거나 배타적이지 않은 것을 나타낸다. 예를 들어, 조건 A 또는 B 는 하기 중 어느 하나에 의해 충족된다: A 가 참 (또는 존재함) 이고 B 가 거짓 (또는 존재하지 않음), A 가 거짓 (또는 존재하지 않음) 이고 B 가 참 (또는 존재함), 그리고 A 와 B 둘 모두가 참 (또는 존재함).
본원에서 사용된 바와 같이, 다수의 인용된 요소 사이의 결합 용어 "및/또는" 은 개별 및 조합된 옵션 둘 모두를 포함하는 것으로서 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는" 으로 결합되는 경우, 첫 번째 옵션은, 두 번째 요소가 없는 첫 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 두 번째 옵션은, 첫 번째 요소가 없는 두 번째 요소의 적용 가능성을 나타낸다. 세 번째 옵션은, 첫 번째 요소와 두 번째 요소 함께의 적용 가능성을 나타낸다. 이들 옵션 중 임의의 하나는 그 의미에 포함되는 것으로서 이해되며, 따라서 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "및/또는" 의 요건을 충족시킨다. 하나 이상의 옵션의 동시 적용 가능성 또한 그 의미에 속하는 것으로서 이해되며, 따라서 용어 "및/또는" 의 요건을 총족시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "이루어지다", 또는 "~로 이루어지다" 또는 "~로 이루어지는" 과 같은 변형은 임의의 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하나, 추가 정수 또는 정수의 군은 명시된 방법, 구조 또는 조성물에 추가될 수 없다는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 용어 "본질적으로 이루어지다", 또는 "~로 본질적으로 이루어지다" 또는 "~로 본질적으로 이루어지는" 과 같은 변형은 임의의 언급된 정수 또는 정수의 군을 포함하고, 명시된 방법, 구조 또는 조성물의 기본 또는 신규 특성을 실질적으로 변화시키지 않는 임의의 언급된 정수 또는 정수의 군을 선택적으로 포함한다는 것을 나타낸다. M.P.E.P. § 2111.03 을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대상체" 는 임의의 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포유동물" 은 임의의 포유동물을 포함한다. 포유동물의 예는 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그, 원숭이, 인간 등, 보다 바람직하게는 인간을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
단어 "우측", "좌측", "하측" 및 "상측" 은 참조하는 도면에서의 방향을 지정한다.
또한, 바람직한 발명의 성분의 치수 또는 특징을 나타낼 때 본원에서 사용되는 용어 "약", "대략", "일반적으로", "실질적으로" 및 유사한 용어는, 기재한 치수/특징이 엄격한 경계 또는 매개변수가 아니며 당업자에게 이해되는 바와 같이 기능적으로 동일하거나 유사한 작은 변형을 그로부터 배제하지 않는다는 것을 나타낸다는 것이 이해되어야 한다. 최소한, 수치 매개변수를 포함하는 이러한 참조는 당업계에서 허용되는 수학적 및 산업적 원리 (예를 들어, 반올림, 측정 또는 다른 계통 오차, 제작 공차 등) 를 사용하여 최하위 숫자를 변화시키지 않는 변형을 포함할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상이한 중쇄" 또는 "상이한 경쇄"는 본 명세서 및 청구항 전반에서 사용되고, 중쇄 또는 경쇄가 서로 동일하지 않은 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열 (예를 들어, 항-DLL3 항체, 항-CD3 항체, 항-CD3/항-DLL3 이중특이적 항체, DLL3 폴리펩티드 및 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CD3 폴리펩티드 및 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드) 의 문맥에서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 또는 육안 검사를 통해서 측정하여, 최대 상응도에 대해 비교 및 정렬될 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 명시된 백분율을 갖거나 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위 서열을 지칭한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열을 그에 대해 비교하는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 하여, 참조 서열에 대한 시험 서열(들) 의 서열 동일성 % 를 계산한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬을 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) 의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI 에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 에 의해, 또는 육안 검사에 의해 (일반적으로, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel) 참조) 실시할 수 있다.
서열 동일성 % 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 각각 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 [Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402] 에 기재되는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립생물정보센터를 통해 공개적으로 입수가능하다. 이 알고리즘은, 첫 번째로, 데이터베이스 서열 중 동일한 길이의 워드 (word) 와 정렬될 때 매칭되거나 일부 양의 값인 역치 스코어 T 를 충족시키는, 질의 서열 내 길이 W 의 짧은 워드를 확인함으로써 고 스코어 서열 쌍 (HSP) 을 확인하는 것을 수반한다. T 는, 네이버후드 워드 스코어 (neighborhood word score) 역치로서 지칭된다 (상기 Altschul et al.). 이와 같이 처음에 출현하는 네이버후드 워드 히트 (word hit) 는, 이를 포함하는 더 긴 HSP 를 찾기 위한 검색을 개시하는 시드 (seed) 로서 역할한다. 워드 히트는, 누적 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한, 각각의 서열을 따라서 양 방향으로 연장된다.
누적 스코어는, 뉴클레오티드 서열에 대해, 매개변수 M (매칭 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 > 0) 및 N (미스매칭 잔기에 대한 패널티 스코어; 항상 < 0) 을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 스코어링 매트릭스가 누적 스코어를 계산하기 위해 사용된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 이의 최대 획득 값으로부터 X 분량만큼 떨어질 때; 하나 이상의 음-스코어 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 스코어가 0 이하가 될 때; 또는 어느 하나의 서열의 말단에 도달될 때 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X 는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. (뉴클레오티드 서열용) BLASTN 프로그램은 워드 길이 (W) 11, 예상치 (E) 10, M = 5, N = -4 를 디폴트 값으로 사용하며, 두 가닥 모두를 비교한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 워드 길이 (W) 3, 예상치 (E) 10 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989) 참조) 를 디폴트 값으로서 사용한다.
서열 동일성 % 를 계산하는 것에 추가로, BLAST 알고리즘은 또한 2 개 서열 사이의 유사성의 통계적 분석을 수행한다 (예를 들어, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 최소 확률 합 (P(N)) 이며, 이는 2 개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 일어날 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 참조 핵산에 대한 시험 핵산 비교에서 최소 확률 합이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이라면, 핵산은 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
2 개의 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가의 표시는, 하기 기재된 바와 같이, 제 1 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드가 제 2 핵산에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성이라는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 전형적으로 예를 들어 2 개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 제 2 폴리펩티드와 실질적으로 동일하다. 2 개의 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는, 2 개의 분자가 엄격한 조건 하에 서로 하이브리드화한다는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 동의어로 "핵산 분자", "뉴클레오티드" 또는 "핵산" 으로서 지칭되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 는, 미변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA 일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드" 는 비제한적으로, 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 부위 및 이중 가닥 부위의 혼합물인 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 부위 및 이중 가닥 부위의 혼합물인 RNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로는 이중 가닥일 수 있거나 단일 가닥 부위 및 이중 가닥 부위의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA 를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오티드" 는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 둘 모두를 포함하는 삼중 가닥 부위를 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 또는 RNA, 및 안정성 또는 다른 이유로 변형된 백본을 갖는 DNA 또는 RNA 를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어, 트리틸화 염기 및 예외적 염기 예컨대 이노신을 포함한다. 다양한 변형이 DNA 및 RNA 에 이루어질 수 있으며; 따라서, "폴리뉴클레오티드" 는 바이러스 및 세포에 특유한 DNA 및 RNA 의 화학적 형태 뿐만 아니라 자연에서 전형적으로 발견되는 폴리뉴클레오티드의 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 형태를 포함한다. "폴리뉴클레오티드" 는 또한 올리고뉴클레오티드로 종종 지칭되는 상대적으로 짧은 핵산 사슬을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터" 는 세그먼트의 복제 또는 발현이 야기되도록 또 다른 핵산 세그먼트가 작동가능하게 삽입될 수 있는 레플리콘이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포" 는 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포를 지칭한다. "숙주 세포" 는 임의 유형의 세포, 예를 들어 1 차 세포, 배양 중인 세포, 또는 세포주로부터의 세포일 수 있다. 한 구현예에서, "숙주 세포" 는 본 발명의 핵산 분자로 형질감염된 세포이다. 또 다른 구현예에서, "숙주 세포" 는 이러한 형질감염된 세포의 자손 또는 잠재적 자손이다. 세포의 자손은 예를 들어 후속 세대 또는 숙주 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 통합에서 발생할 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 부모 세포와 동일할 수 있거나 동일하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현" 은, 유전자 산물의 생합성을 지칭한다. 용어는 RNA 로의 유전자의 전사를 포함한다. 용어는 또한 하나 이상의 폴리펩티드로의 RNA 의 번역을 포함하며, 모든 자연적으로 발생하는 전사후 및 번역후 변형을 추가로 포함한다. 발현되는 단일클론 또는 이중특이적 항체는 숙주 세포의 세포질 내에, 세포외 환경 예컨대 세포 배양의 성장 배지에 있을 수 있거나 또는 세포막에 앵커링될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질" 은 아미노산으로 구성된 분자를 지칭할 수 있고, 당업자가 단백질로 인식할 수 있다. 아미노산에 대한 통상의 1-글자 또는 3-글자 코드가 본원에서 사용된다. 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 임의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있이며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 이 용어는 또한 자연적으로 또는 개재에 의해; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한 이 정의 내에, 예를 들어, 아미노산 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 의 하나 이상의 유사체를 비롯하여, 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다.
본원에 기술된 펩티드 서열은 펩티드의 N-말단 부위가 좌측에 있고 C-말단 부위가 우측에 있는 일반적인 협약에 따라 기재된다. 아미노산의 이성질체 형태가 공지되어 있지만, 달리 명백히 표시되지 않는 한, 표시되는 것은 아미노산의 L-형태이다.
본원에서 기재되는 바와 같이, 용어 "CD3" 은 T 세포 수용체 (TCR) 에 대한 보조 수용체로서 기능하는 멀티-서브유닛 단백질 복합체인 분화 클러스터 3 (Cluster of Differentiation 3) 을 지칭한다 (Dong et al., Nature 573(7775):546-552 (2019)). 표적 세포 표면 상의 펩티드-MHC (pMHC) 에 대한 TCR 의 결합은 TCR-CD3 복합체의 클러스터링을 유도하며 CD3 의 ζ 사슬 에 의해 매개된 세포내 신호전달을 활성화시킨다 (Annu Rev Immunol. 27:591-619 (2009)). CD3 은 CAR-T-세포 및 CD3-기재 T 세포 연결체에서와 같은 치료제에 의한 T-세포의 활성화 및 그의 pMHC-독립적 활성화에 요구되며, 종양 세포를 사멸시키기 위해 T 세포를 동원시키는데 매우 효과적이다 (Brown and Mackall, Nat Rev Immunol 19(2):73-74 (2019) and Clynes and Desjarlais, Annu Rev Med 70:437-450 (2019)). 인간 CD3 엡실론 서브유닛의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_000724.1 로 표시된다.
본원에서 기재되는 바와 같이, 용어 "DLL3" 은 델타 유사 3 또는 델타 유사 단백질 3 으로도 공지된 델타 유사 표준 노치 리간드 3 (DLL3) 을 지칭하며, 이는 초기 발생 동안 체절 분절에 요구된다 (Dunwoodie et al., Development 129:1795-806 (2002)). 노치 수용체 신호전달을 모두 트랜스로 활성화시키는 포유동물 노치 패밀리 리간드 DLL1, DLL4, JAG1 및 JAG2 와 달리 (Ntziachristos et al., Cancer Cell 25(3):318-34 (2014)), DLL3 은 골지체에서 주로 국소화되고 노치 신호전달을 활성화시킬 수 없다 (Chapman et al., Hum Mol Genet 20(5):905-16 (2011) and Geffers et al., J Cell Biol 178(3):465-76 (2007)). 정상 발생 동안, DLL3 은 Notch 및 DLL1 과 상호작용함으로써 시스-작용 및 트랜스-작용 노치 경로 활성화 모두를 억제한다 (Chapman et al., Hum Mol Genet 20(5):905-16(2011)). DLL3 은 뇌를 제외한 성인 정상 조직에서 보통 부재하거나 매우 낮은 수준으로 존재하지만, 폐암, 고환암, 신경교종 및 흑색종 샘플에서 과발현된다 (Uhlen et al., Science 357(6352): eaan2507 (2017)). 또한, DLL3 은 소세포 폐암 (SCLC) 및 대세포 신경내분비암종 (LCNEC) 종양 세포의 표면에서 검출가능하여 (Saunders et al., Sci Transl Med 7(302):302ra136 (2015) and Sharma et al., Cancer Res 77(14):3931-41 (2017)), 암 치료요법을 위한 단일클론 항체의 잠재적 표적이 되게 한다. 따라서, 항-DLL3 단일클론 항체는 DLL3-발현 종양 세포를 특이적으로 표적화하고 잠재적인 항암 치료제로서 작용하도록 사용될 수 있다. 용어 "인간 DLL3" 은 인간에서 기원하는 DLL3 을 지칭한다. 인간 DLL3 의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_058637.1 로 표시된다.
본원에 기재되는 "종양-관련 항원 (TAA)" 은 정상 조직에서보다 종양에서 더 높은 수준으로 존재하는 임의의 세포 표면 펩티드 및/또는 항원 또는 세포 표면 펩티드 및/또는 항원과 그의 번역후 변형 모이어티 (예컨대 글리코실화) 의 조합을 지칭한다. 종양에 특이적으로 존재하는 종양-관련 항원 중 일부는 또한 종양-특이적 항원 (TSA) 으로 공지되어 있다. 종양-관련 항원의 예는 종양원성 바이러스에 의해 인코딩된 바이러스 단백질; 돌연변이된 종양단백질 또는 종양 억제인자; 종양 세포 상에서 및/또는 종양 세포에서 과발현된 정상 단백질; 세포 표면 단백질의 번역후 변형; 발현이 성인 조직이 아닌 발생 단계에서 정상적으로 제한되는 종양태아 단백질; 및 발현이 비필수 조직으로 제한되는 세포 유형 특이적 단백질이다.
본원에 기재된 바와 같은 "지방산" 은 일반적으로 6-22 개의 탄소 원자를 갖는 카르복실산 기로 종결되는 탄화수소 사슬로 구성된 화학 분자를 지칭한다. 여기서 본 발명의 경우, 다양한 지방산 유도체는 또한 알부민에 결합하는 그의 능력에 대해 지방산으로 간주된다. 지방산 및 그의 유도체는 지질의 주요 성분이며 소수성 특성을 부여한다. 탄화수소 사슬의 길이 및 포화도는 관련된 물리적 특성을 결정하는 지방산에 따라 가변적이다. 지방산의 유형은 불포화 지방산( 다중불포화 및 단일불포화) 및 포화 지방산을 포함하고; 포화 지방산은 수소로 포화되며, 대부분 짝수의 탄소 원자를 갖는 직쇄 탄화수소 사슬이다.
본원에서 기재되는 "면역 세포 조절제 (ICM)" 는 면역 세포의 표면에서 발현되어 면역 세포의 기능을 조절하는 단백질과 같은 임의의 세포 표면 분자를 지칭한다. ICM 은 자극 분자 및 억제 분자를 포함한다. 자극 ICM 은 특정한 특징을 갖는 특이적 항체 또는 항원-결합 단편이 자극 ICM 에 특이적으로 결합할 때 면역 세포의 활성화를 매개할 수 있다. 억제 ICM 은 리간드/상호작용 파트너에 의한 결합시 면역 세포의 활성을 억제하며, 이는 면역 세포의 활성화를 유도하는 특정한 특징을 갖는 특이적 항체 또는 항원-결합 단편에 의해 차단될 수 있다. 이들 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 대식세포 또는 면역계의 다른 유형의 세포일 수 있다. ICM 의 예는 CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα, 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "완전 차단" 또는 "완전 봉쇄" 는 표적 항원-결합 도메인 (예를 들어, 단일클론 또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 에 결합하는 표적 항원 (예를 들어, ICM, 예컨대 CD3) 의 완전 억제를 지칭한다. 표적 항원-결합의 완전 억제는 표적 항원-결합 도메인에 표적 항원이 결합하지 않음 (예를 들어, 0% 결합) 을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "부분 차단" 또는 "부분 봉쇄" 는 표적 항원-결합 도메인 (예를 들어, 단일클론 또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편) 에 결합하는 표적 항원 (예를 들어, ICM, 예컨대 CD3) 의 불완전 억제를 지칭한다. 표적 항원-결합의 불완전 억제는 표적 항원-결합 도메인에 표적 항원이 적어도 일부 결합함 (예를 들어, 1% 내지 99% 결합) 을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "특이적 결합" 은 대조군 항원과 비교하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 유의한 결합, 및/또는 대조군 항체 또는 항원-결합 단편과 비교하여 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 유의한 결합을 지칭하며, 여기서 대조군 항원은 서열 및/또는 구조 비교에 의해 표적 항원과 상이하고, 대조군 항체 또는 항원-결합 단편은 서열 및/또는 구조 비교에 의해 표적 항원과 상이한 그의 상응하는 항원에만 유의하고 선택적으로 결합한다.
항체
본 발명은 일반적으로 중쇄 가변부 (VH) 및 경쇄 가변부 (VL) 를 포함하는 항원-결합 도메인에 접합되거나 그 근처 (예를 들어, VH, VL 내에, 또는 VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리, 바람직하게는 5 개-아미노산 거리 내) 에 있는 지방산 (FA) 분자를 포함하는 단일클론 항체 (mAb) (예를 들어, 항-ICM mAb, 예컨대 항-CD3 mAb) 또는 이중특이적 항체 (bsAb) (예를 들어, 항-CD3/항-DLL3 bsAb) 에 관한 것이다. 접합 위치는 항원-결합 도메인 내의 또는 그 근처의 반응성 잔기이고, 시스테인 또는 또 다른 반응성 아미노산에 녹인될 수 있다. 접합 위치의 장소는 녹인 시스테인 (또는 다른 반응성 아미노산) 또는 접합된 FA 가 항원-결합 도메인의 표적 항원 (예를 들어, ICM, 예컨대 CD3) 결합 활성을 제거하지 않는 것으로 확인된다. 접합된 FA 는 알부민 분자에 결합할 수 있고, 결합된 알부민 분자는 항원-결합 도메인과 표적 항원 (예를 들어, ICM, 예컨대 CD3) 사이의 유의한 공간을 차지할 수 있다. 결합된 알부민 분자는 항원-결합 도메인에 대한 표적 항원의 결합을 입체적으로 방해하여, 항원-결합 도메인과의 표적 항원의 결합의 감소 또는 완전한 차단을 초래할 수 있다. FA-접합된 mAb 또는 bsAb 의 FA-접합된 완부는 면역 세포 조절제 (ICM) 에 반대한 것일 수 있으며, 이는 항체 결합시 면역 세포 활성화를 초래할 수 있다. ICM 의 예는 CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα, 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 접합된 mAb 또는 bsAb 의 면역 세포 활성화 활성은 접합된 FA 에 결합된 알부민에 의해 조절될 수 있다. 조절의 정도는 접합된 mAb 또는 bsAb 주변의 알부민의 농도, FA 분자의 길이, 및 접합 위치의 특정 장소에 따라 좌우된다. 본 발명은 또한 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 FA 에 접합되는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 항원-결합 완부(들) 를 포함한다.
mAb 또는 bsAb 또는 다중특이적 항체 상의 접합된 FA 는 혈액 중 알부민을 순환시킴으로써 결합될 수 있으며, 이는 T 세포 상의 표적 항원 (예를 들어, ICM, 예컨대 CD3) 에 대한 접합된 mAb 또는 bsAb 의 결합을 감소시키거나 차단하여 T 세포 활성화의 부분적 또는 완전한 억제를 초래하는 역할을 할 수 있다. 순환 혈액에 비해 알부민 회전율이 더 높고, 국소 알부민 수준이 순환 혈액에 비해 더 낮을 것으로 예상되는 종양 미세환경에서, 접합된 항체는 이들에 결합된 알부민을 덜 갖거나 갖지 않고, 이는 증가된 표적 항원-결합 (예를 들어, CD3) 및 T 세포 활성화를 초래할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 종양 미세환경에서 더 높은 알부민 회전율은 알부민-결합된 mAb 또는 bsAb 또는 다중특이적 항체의 수준을 감소시키고 항원-결합 도메인을 노출시켜, 증가된 표적 항원-결합 (예를 들어, CD3) 및 T 세포 활성화를 초래할 수 있다. 접합된 항체는 생체내 안전성에 관해 이점을 가질 수 있고, 치료 목적으로 사용될 수 있다. 접합된 bsAb 는 또한 하나의 완부가 종양-관련 항원 (TAA) 에 대한 항원-결합 도메인을 포함하고 다른 완부가 접합된 항-ICM 항원-결합 부위 (예를 들어, 항-CD3 항원-결합 부위) 를 포함하는 T 세포 연결체 또는 다른 면역 세포 연결체로서 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체" 는 넓은 의미로 사용되며 인간, 인간화, 복합 및 키메라 항체, 및 항체 단편 (단일클론 또는 다중클론) 을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자를 포함한다. 일반적으로, 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 펩티드 사슬이다. 항체 구조는 널리 공지되어 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라 5 개의 주요 부류 (즉, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 로 배정될 수 있다. IgA 및 IgG 는 동형 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 로서 추가로 하위분류된다. 따라서, 본 발명의 항체는 5 개의 주요 부류 중 어느 하나 또는 상응하는 하위부류의 것일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 이다. 척추동물 종의 항체 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 2 개의 명확히 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나에 배정될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체는 카파 또는 람다 경쇄 불변 도메인을 함유할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 항체는 랫트 또는 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 불변부를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 추가로, 항체는 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부로 구성되는 항원-결합 부위를 함유하며, 이의 각각은 3 개의 도메인을 포함한다 (즉, 상보성 결정 부위 1-3; (CDR1, CDR2 및 CDR3)). 경쇄 가변부 도메인은 대안적으로 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 으로 지칭되며, 중쇄 가변부 도메인은 대안적으로 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 으로 지칭된다.
항체 내 아미노산 잔기의 번호매김에 여러 시스템이 사용된다. Kabat 번호매김 방법은 항체의 가변부를 기반으로 하는 제도이다 (Elvin A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991). EU 번호매김 시스템은 불변 도메인 (CH1, 힌지 및 Fc 의 부분을 포함함) 에 널리 사용된다 (Elvin A. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 항체" 는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다 (예를 들어, DLL3 에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 DLL3 에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없고; CD3 에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 CD3 에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없고; CD3 및 DLL3 에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 CD3 및 DLL3 에 결합하지 않는 항체가 실질적으로 없다). 또한, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질이 실질적으로 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일클론 항체" 는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉, 모집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 제외하고는, 동일하다. 본 발명의 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 파지 디스플레이 기술, 단일 림프구 유전자 클로닝 기술 또는 재조합 DNA 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 인간 중쇄 이식유전자 (transgene) 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스 또는 랫트와 같은 트랜스제닉 비인간 동물로부터 수득한 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편" 은 항체 단편, 예를 들어, 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술피드 안정화 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 디술피드 안정화 디아바디 (ds 디아바디), 단일 사슬 항체 분자 (scFv), 단일 도메인 항체 (sdab), scFv 이량체 (이가 디아바디), 하나 이상의 CDR 을 포함하는 항체의 일부로부터 형성된 다중특이적 항체, 카멜화 (camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 이가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하나 전체 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모 항체 또는 모 항체 단편이 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 특정 구현예에 따르면, 항원-결합 단편은 경쇄 가변부, 경쇄 불변부 및 중쇄의 Fd 세그먼트를 포함한다. 다른 특정 구현예에 따르면, 항원-결합 단편은 Fab 및 F(ab') 를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일-사슬 항체" 는 약 15 내지 약 20 개 아미노산의 짧은 펩티드에 의해 연결된 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부를 포함하는, 당업계의 통상적인 단일-사슬 항체를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단일 도메인 항체" 는 중쇄 가변부 및 중쇄 불변부를 포함하거나 중쇄 가변부만을 포함하는 당업계의 통상적인 단일 도메인 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체" 는 당업계에 공지된 임의의 기법을 사용하여 만들어진 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 인간에 의해 생성된 항체를 지칭한다. 인간 항체의 이러한 정의는 온전한 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체" 는 항체의 항원-결합 특성이 유지되나 인체 내 그의 항원성이 감소되도록, 인간 항체에 대한 서열 상동성을 증가시키기 위해 변형되는 비-인간 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항체" 는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다. 경쇄 및 중쇄 둘 모두의 가변부는 종종, 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 한 종의 포유동물 (예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 등) 로부터 유래된 항체의 가변부에 상응하는 한편, 불변부는 또 다른 종의 포유동물 (예를 들어, 인간) 로부터 유래된 항체의 서열에 상응하여, 그 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 방지한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "다중특이적 항체" 는 복수의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 항체를 지칭하며, 여기서 복수의 제 1 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제 1 에피토프에 대한 결합 특이성을 가지고, 복수의 제 2 면역글로불린 가변 도메인 서열은 제 2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질 (또는 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 있다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 중첩되거나 실질적으로 중첩된다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 중첩되지 않거나 실질적으로 중첩되지 않는다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질 (또는 상이한 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 있다. 한 구현예에서, 다중특이적 항체는 제 3, 제 4 또는 제 5 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 한 구현예에서, 다중특이적 항체는 이중특이적 항체 분자, 삼중특이적 항체 분자 또는 사중특이적 항체 분자이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이중특이적 항체" 는 2 개 이하의 에피토프 또는 2 개의 항원에 결합하는 다중특이적 항체를 지칭한다. 이중특이적 항체는 제 1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제 1 면역글로불린 가변 도메인 서열 및 제 2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 제 2 면역글로불린 가변 도메인 서열을 특징으로 한다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 동일한 항원, 예를 들어 동일한 단백질 (또는 다량체성 단백질의 서브유닛) 상에 있다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 중첩되거나 실질적으로 중첩된다. 한 구현예에서, 제 1 및 제 2 에피토프는 상이한 항원, 예를 들어 상이한 단백질 (또는 다량체성 단백질의 상이한 서브유닛) 상에 있다. 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 제 1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열, 및 제 2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 중쇄 가변 도메인 서열 및 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 제 1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 반-항체 (half antibody) 또는 이의 단편, 및 제 2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 반-항체 또는 이의 단편을 포함한다. 한 구현예에서, 이중특이적 항체는 제 1 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편, 및 제 2 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 scFv 또는 이의 단편을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "CD3" 은 분화 클러스터 3 을 지칭한다. 인간 CD3 엡실론 서브유닛의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_000724.1 로 표시된다. 용어 "4-1BB" 는 CD137 및 ILA (림프구 활성화에 의해 유도됨) 로도 공지되어 있는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 9 (tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 (TNFRSF9)) 를 지칭한다. 인간 4-1BB 의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_001552.2 로 표시된다. 용어 "OX40" 은 CD134 로도 공지되어 있는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 4 (TNFRSF4) 를 지칭한다. 인간 OX40 의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_003318.1 로 표시된다. 용어 "CD28" 은 분화 클러스터 28 을 지칭한다. 인간 CD28 변이체의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_001230006.1, NP_001230007.1, NP_006130.1, XP_011510496.1 및 XP_011510499.1 로 표시된다. 용어 "PD-1" 은 프로그래밍된 세포 사멸 1 (programmed cell death 1) 을 지칭한다. 인간 PD-1 의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_005009.2 로 표시된다. 용어 "GITR" 은 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 멤버 18 (TNFRSF18) 또는 활성화-유도성 TNFR 패밀리 수용체 (activation-inducible TNFR family receptor (AITR)) 로도 공지되어 있는 글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질 (glucocorticoid-induced TNFR-related protein (GITR)) 을 지칭한다. 인간 GITR 변이체의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_004186.1, NP_683699.1 및 NP_683700.1 로 표시된다. 용어 "VISTA" 는 V-세트 면역조절 수용체 (V-set immunoregulatory receptor (VSIR)) 로도 공지되어 있는 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자를 지칭한다. 인간 VISTA 의 예시적 아미노산 서열은 GenBank 등록 번호 NP_071436.1 로 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "CD3 및/또는 DLL3 에 특이적으로 결합하는" 항체는 1Х10-7 M 이하, 바람직하게는 1Х10-8 M 이하, 보다 바람직하게는 5Х10-9 M 이하, 1Х10-9 M 이하, 5Х10-10 M 이하, 또는 1Х10-10 M 이하의 KD 로, CD3 및/또는 DLL3, 바람직하게는 인간 CD3 및/또는 인간 DLL3 에 결합하는 항체를 지칭한다. 용어 "KD" 는 해리 상수를 지칭하고, 이는 Kd 대 Ka 의 비 (즉, Kd/Ka) 로부터 수득되며 몰 농도 (M) 로 표시된다. 항체에 대한 KD 값은 본 개시물을 고려하여 당업계의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 KD 는 표면 플라스몬 공명, 예컨대 바이오센서 시스템, 예를 들어 Biacore® 시스템을 사용하거나, 생체층 간섭계 기술, 예컨대 Octet RED96 시스템을 사용하여 결정될 수 있다.
항체의 KD 값이 작을수록, 항체가 표적 항원에 결합하는 친화성이 높아진다.
한 특정 양태에서, 본 발명은 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편에 관한 것이며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 중쇄 가변부 (VH); 및 경쇄 가변부 (VL) 를 포함하고; 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 항원, 바람직하게는 인간 표적 항원에 결합하고; VH, VL 내의 아미노산 잔기, 또는 VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리, 바람직하게는 5 개-아미노산 거리 내의 아미노산 잔기는 지방산 (FA) 에 접합되는 아미노산 잔기로 치환되고; 치환된 아미노산 잔기에서 FA 와 접합시, 항체 또는 항원-결합 단편은 여전히 표적 항원에 결합하며; FA-접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 생리학적 수준의 알부민 (예를 들어, 35 내지 50 mg/mL) 의 존재 하에 표적 항원에 대한 특이적 결합이 감소하거나 제거된다. 치환된 아미노산 잔기는 예를 들어 시스테인 잔기 또는 리신 잔기일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리 내" 는 가변 중쇄 또는 경쇄로부터 20 개-아미노산 거리 미만인 CH1 또는 CL 부위 내의 잔기를 지칭한다. 어구 "VH 또는 VL 의 5 개-아미노산 거리 내" 는 가변 중쇄 또는 경쇄로부터 5 개-아미노산 거리 미만인 CH1 또는 CL 부위 내의 잔기를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 어구 "표적 항원에 여전히 결합하는" 은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이, 지방산 (FA) 에 접합될 때, 여전히 표적 항원에 결합할 수 있다는 것을 나타낸다. FA-접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 결합 수준은, 예를 들어 접합된 FA 의 부재 하에 본 발명의 접합을 위한 아미노산 치환을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 결합 수준의 약 10% 내지 약 100% 일 수 있다. 특정 구현예에서, FA-접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 결합 수준은 접합된 FA 의 부재 하에 본 발명의 접합을 위한 아미노산 치환을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 결합 수준의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 또는 약 100% 이다. 당업자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 표적 항원에 대한 FA-접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합 수준을 결정할 수 있을 것이다. 결합 수준은 지방산에 접합되지 않는 본 발명의 접합을 위한 아미노산 치환을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 비교될 수 있다. 지방산에 접합되지 않는 본 발명의 접합을 위한 아미노산 치환을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 대한 표적 항원의 결합 수준은 야생형 항체 또는 항원-결합 단편에 의한 경우의 적어도 50% 이다.
특정 양태에 따르면, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO:1 의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113 에 상응하는 아미노산 잔기 또는 SEQ ID NO:2 의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67 에 상응하는 아미노산 잔기에서 발생하고, 바람직하게는 치환은 SEQ ID NO:1 의 S25C, Y27C, K62C, K64C, K73C, S76C, D101C, S112C 또는 S113C 에 상응하는 치환 또는 SEQ ID NO:2 의 S26C, S27C, S52C, K53C, S56C 또는 S67C 에 상응하는 치환에서 선택되며, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다. 특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO:1 에 상응하는 잔기 64 또는 SEQ ID NO:2 에 상응하는 잔기 26 에 있고, 바람직하게는 치환은 SEQ ID NO:1 에 상응하는 K64C 치환 또는 SEQ ID NO:2 에 상응하는 S26C 치환에서 선택되며, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, SEQ ID NO 의 아미노산 잔기 번호에 상응하는 치환된 아미노산을 지칭하는 경우, SEQ ID NO 는 관심 서열의 치환된 아미노산 잔기를 결정하기 위한 참조이다. 당업자는 치환될 아미노산 잔기의 위치를 결정하기 위해 참조 SEQ ID NO 와 관심 서열을 정렬할 것이다. 예를 들어, SEQ ID NO:1 의 아미노산 잔기 번호 25 (이는 항-CD3 단일클론 항체의 중쇄 가변부임) 는 세린 잔기이다. 관심 항체의 중쇄 가변부와 정렬시, SEQ ID NO:1 의 위치 번호 25 에서의 세린 잔기와 정렬되는 잔기는 아미노 치환을 위해 표적화될 것이다.
특정 양태에 따르면, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 CH1 에서의 잔기 119 또는 120, 또는 SEQ ID NO:13 또는 14 의 CL 에서의 잔기 121 또는 124 에서 발생하고, 바람직하게는 치환은 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 CH1 에서의 S119C 또는 T120C, 또는 SEQ ID NO:13 또는 14 의 CL 에서의 S121C 또는 Q124C 에서 선택되며, 잔기는 EU 번호매김에 따라 번호매겨진다. 특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 CH1 부위에서의 잔기 120 에 있고, 바람직하게는 치환은 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 CH1 부위에서의 T120C 치환이며, 잔기는 EU 번호매김에 따라 번호매겨진다.
특정 양태에 따르면, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고, CD3, 바람직하게는 인간 CD3 에 특이적으로 결합할 수 있다. 단리된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 중쇄 상보성 결정 부위 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 부위 1 (LCDR1), LCDR2 및 LCDR3 을 포함할 수 있다 (각각 SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 및 8, 또는 SEQ ID NO:33, 34, 35, 36, 37 및 38 의 폴리펩티드 서열을 각각 가짐).
특정 양태에 따르면, 치환된 아미노산은 항-CD3 mAb 의 VH (SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:27) 에서의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113, 또는 항-CD3 mAb 의 VL (SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:28) 에서의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67 에서 선택되고, 바람직하게는 치환은 VH (SEQ ID NO:1 또는 27) 에서의 S25C, Y27C, K62C, K64C, K73C, S76C, D101C, S112C 또는 S113C, 또는 VL (SEQ ID NO:2 또는 28) 에서의 S26C, S27C, S52C, K53C, S56C 또는 S67C 에서 선택되며, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다. 특정 구현예에서, 치환된 아미노산은 VH (SEQ ID NO:1 또는 27) 에서의 잔기 64 또는 VL (SEQ ID NO:2 또는 28) 에서의 잔기 26 에 있고, 바람직하게는 치환은 VH (SEQ ID NO:1 또는 27) 에서의 K64C 치환 또는 VL (SEQ ID NO:2 또는 28) 에서의 S26C 치환에서 선택되며, 잔기는 Kabat 에 따라 번호매겨진다.
특정 양태에 따르면, 단리된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위; 또는 T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위; 또는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위; 또는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함할 수 있다.
특정 양태에 따르면, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 본원에서 제공되며, 여기서 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 발명의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 FA 에 접합되는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 항원-결합 완부(들) 를 포함한다. 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
특정 구현예에서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 각각의 완부는 동일하거나 상이한 접합된 FA 를 갖는 상이한 잔기 위치에서 치환된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 각각의 완부는 동일하거나 상이한 접합된 FA 를 갖는 상이한 잔기 위치에서 동일한 치환된 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 각각의 완부는 동일하거나 상이한 접합된 FA 를 갖는 동일한 잔기 위치에서 치환된 아미노산을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 각각의 완부는 동일하거나 상이한 접합된 FA 를 갖는 동일한 잔기 위치에서 동일한 치환된 아미노산을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 및 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 를 포함하며, 여기서 Ab1 및/또는 Ab2 는 FA 에 접합되는 치환된 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, Ab1 은 CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα, 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어지는 군에서 선택되는 면역 세포 조절제 (ICM), 바람직하게는 인간 ICM 에 결합한다. ICM 은 예를 들어, CD3, 바람직하게는 인간 CD3 일 수 있다.
특정 구현예에서, Ab2 는 종양-관련 항원 (TAA), 바람직하게는 인간 종양-관련 항원 (인간 TAA) 에 결합한다. TAA 는 예를 들어 DLL3 일 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항-CD3/항-DLL3 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 여기서 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 는 CD3, 바람직하게는 인간 CD3 에 특이적으로 결합하고, 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 는 DLL3, 바람직하게는 인간 DLL3 에 특이적으로 결합한다.
특정 양태에 따르면, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: H1 및 L1 을 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1), 및 H2 및 L2 를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 를 포함하며, 여기서
(a) H1 및 H2 는 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 CH1 부위를 포함하고;
(b) L1 및 L2 는 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 부위를 포함하고;
H1L1 및 H2L2 는 각각 하기 아미노산 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 전하 쌍을 포함한다:
(1) H1 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L1 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L2 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
(2) H1 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L1 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L2 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
(3) H1 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L1 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L2 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
(4) H1 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L1 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L2 의 CL 에서의 S121D/E 각각;
(5) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
(6) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각;
(7) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각;
(8) H2 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L2 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L1 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
(9) H2 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L2 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L1 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
(10) H2 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L2 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L1 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
(11) H2 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L2 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L1 의 CL 에서의 S121D/E;
(12) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
(13) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각; 또는
(14) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "전하 쌍" 은 하나는 양전하를 갖고 다른 것은 음전하를 갖는 아미노산의 쌍을 지칭하며, 이는 이중특이적 항체의 제 1 완부의 중쇄 CH1 부위 및 경쇄 CL 부위 내의 천연 아미노산 잔기를 각각 대체하여 도입될 수 있고, 동시에, 동일한 양전하 및 음전하 아미노산 쌍은 이중특이적 항체의 제 2 완부의 경쇄 CL 부위 및 중쇄 CH1 부위 내의 천연 아미노산 잔기를 각각 대체하여 도입될 수 있다. 대안적으로, 양전하 및 음전하 아미노산은 이중특이적 항체의 제 1 완부의 중쇄의 VH 부위 및 경쇄의 VL 부위에 대한 아미노산 치환 각각에 의해 도입될 수 있고, 동시에, 동일한 양전하 및 음전하 아미노산 쌍은 제 2 완부의 경쇄의 VL 부위 및 중쇄의 VH 부위에 대한 아미노산 치환 각각에 의해 도입될 수 있다. 전하 쌍을 형성하는데 사용되는 아미노산은 통상 D/E (음전하) 및 K/R (양전하) 을 포함한다. CH1/CL 부위 또는 VH/VL 부위에 도입되고 나면, 전하 쌍 아미노산은 구조적으로 매우 근접해 있고, 반대 전하를 통해 동일한 완부의 중쇄/경쇄 상호작용을 향상시키고 동일한 전하를 통해 미스매칭된 중쇄/경쇄 상호작용 (미스매칭된 중쇄 및 경쇄는 2 개의 상이한 완부로부터 유래함) 을 배출할 것으로 예상된다. 도입된 전하 쌍의 생성된 전하 분포는 하기와 같다: H1 (CH1 양전하)/L1 (CL 음전하)/H2 (CH1 음전하)/L2 (CL 양전하) 또는 H1 (CH1 음전하)/L1 (CL 양전하)/H2 (CH1 양전하)/L2 (CL 음전하). 다수의 전하 쌍은 조합되고 CH1 및 CL 계면에 도입될 수 있는데, 모든 양전하 아미노산이 CH1 에 도입되고 모든 음전하 아미노산이 동일한 완부의 CL 에 도입되거나 또는 그 반대여서, 상기 분포 패턴을 만족시킬 수 있다. 유사한 접근방식을 VH/VL 계면에 적용할 수 있다. 또한, 하나 또는 다수의 전하 쌍은 또한 CH1/CL 계면에 도입된 하나 또는 다수의 전하 쌍과 조합으로 VH 및 VL 의 계면에 도입될 수 있다 - 동일한 사슬 (H1, L1, H2 또는 L2) 에 도입된 아미노산은 통상 동일한 전하를 가지며, 도입된 전하 쌍의 생성 분포는 하기와 같다: H1 (CH1 및 VH 양전하)/L1 (CL 및 VL 음전하)/H2 (CH1 및 VH 음전하)/L2 (CL 및 VL 양전하) 또는 H1 (CH1 및 VH 음전하)/L1 (CL 및 VL 양전하)/H2 (CH1 및 VH 양전하)/L2 (CL 및 VL 음전하). 전하 쌍 치환은 또한 동족 사슬 쌍형성 선호도 (각각 H1L1 및 H2L2) 를 추가로 개선하고/하거나 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 HIC 를 사용하여 이중특이적 항체의 정제를 촉진시키기 위해 다른 변형과 조합될 수 있다. 예를 들어, 전하 쌍 치환에 추가로, 이중특이적 항체의 하나의 완부 상의 천연 사슬간 디술피드 결합은 이동될 수 있는 한편, 다른 완부는 천연 사슬간 디술피드 결합을 갖는다 (예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함되는 2020 년 12 월 3 일에 출원한 PCT/US2020/063066 참조).
전하 쌍을 기재함에 있어서, G166D/E 는 위치 166 (EU 번호매김) 에서의 G 의 D 또는 E 로의 치환을 나타내며, 이 경우 G166 은 녹-인 위치이고; D170D/E 는 위치 170 에서의 D 의 유지 또는 위치 170 에서의 D 의 E 로의 치환을 나타내고; K/R133D/E 는 위치 133 에서의 K 또는 R (이 위치에 있는 어느 것이든) 의 D 또는 E 로의 치환을 나타내며; 모든 다른 치환은 동일한 명명 규칙을 따른다.
특정 양태에 따르면, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:15 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:17 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:19 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:21 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:29 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:30 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은: SEQ ID NO:31 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:32 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함한다.
특정 양태에 따르면, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 하기를 포함한다:
(a) SEQ ID NO:15 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:17 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2);
(b) SEQ ID NO:19 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:21 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2);
(c) SEQ ID NO:29 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:30 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2); 또는
(d) SEQ ID NO:31 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:32 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 및 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 2 항원-결합 완부 (Ab2).
특정 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 치환된 아미노산 잔기에서 FA 에 접합된다. FA 는 예를 들어, 6 개의 탄소, 7 개의 탄소, 8 개의 탄소, 9 개의 탄소, 10 개의 탄소, 11 개의 탄소, 12 개의 탄소, 13 개의 탄소, 14 개의 탄소, 15 개의 탄소, 16 개의 탄소, 17 개의 탄소 또는 18 개의 탄소를 갖는 FA 에서 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, FA 는 14 개의 탄소 또는 18 개의 탄소, 또는 그 사이의 임의 수의 탄소를 갖는 FA 에서 선택된다. FA 의 길이는 FA 에 대한 알부민의 상대적 결합을 결정할 수 있으며, 이는 표적 항원에 대한 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 상대적 결합을 결정할 수 있다. 접합된 FA 가 길수록, 접합된 FA 가 알부민에 대해 갖는 결합 친화성이 커져, 접합된 mAb 또는 bsAb 에 의한 표적 항원에 대한 특이적 결합의 더 큰 알부민-매개 감소를 초래한다. FA 가 짧을수록, 접합된 FA 가 알부민에 대해 갖는 결합 친화성이 낮아져, 접합된 mAb 또는 bsAb 에 의한 표적 항원에 대한 특이적 결합의 더 적거나 무시할만한 알부민-매개 감소를 초래한다.
특정 구현예에서, FA 는 치환된 아미노산 잔기에 대한 접합을 위한 링커를 포함한다. 링커는 예를 들어, 펩티드 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 링커에서 선택될 수 있다. 펩티드 링커는 예를 들어 50 개 미만의 아미노산일 수 있다. 펩티드 링커는 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5 개 또는 그 이하의 아미노산일 수 있다.
특정 구현예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 접합된 FA 는 알부민에 결합할 수 있다. FA 에 대한 알부민의 결합은 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이의 결합의 부분적 또는 완전한 차단을 초래한다. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고 Ab1 완부만이 FA 와 접합되는 특정 구현예에서, FA 에 대한 알부민의 결합은 TAA 에 대한 Ab2 완부의 결합에 영향을 미치지 않는다. 특정 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이고 완부 Ab1 및 Ab2 둘 모두가 FA 와 접합되는 특정 구현예에서, FA 에 대한 알부민의 결합은 각각 Ab1 및 Ab2 를 위한 표적 항원에 대한 Ab1 및 Ab2 결합의 감소 또는 제거를 초래한다. 특정 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 알부민에 결합하지 않은 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 비해 알부민에 결합시 T 세포를 활성화시키는 감소된 능력을 갖는다.
본 발명의 한 구현예에서, 본 발명의 항-CD3/항-DLL3 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 전장 이중특이적 항체는 예를 들어, 동시발현을 사용하거나 시험관내 세포-무함유 환경에서 별개 특이성을 갖는 2 개 항체 절반 분자의 이종이량체 형성에 호의적이도록 각 절반 분자에서 중쇄 CH3 계면에 치환을 도입시킴으로써 2 개 단일 특이적 2가 항체들 사이에서 Fab 완부 교환 (또는 절반 분자 교환) 을 사용하여 생성될 수 있다. Fab 완부 교환 반응은 CH3 도메인의 해리-결합 및 디술피드-결합 이성질체화 반응의 결과이다. 모 (parent) 단일 특이적 항체의 힌지 부위에서 중쇄 디술피드 결합이 환원된다. 모 단일특이적 항체 중 하나의 생성 유리 시스테인은 제 2 의 모 단일특이적 항체 분자의 시스테인 잔기와 중쇄간 디술피드 결합을 형성하고, 동시에 모 항체의 CH3 도메인은 해리-결합에 의해 방출되고 재형성된다. Fab 완부의 CH3 도메인은 동종이량체화에 비해서 이종이량체화에 호의적이도록 조작될 수 있다. 최종 생성물은 각각이 별개 에피토프, 즉 CD3 상의 에피토프 및 DLL3 상의 에피토프에 결합하는 2 개 Fab 완부 또는 절반 분자를 갖는 이중특이적 항체이다.
본원에서 사용되는 "동종이량체화" 는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2 개 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "동종이량체" 는 동일한 CH3 아미노산 서열을 갖는 2 개 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 "이종이량체화" 는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2 개 중쇄의 상호작용을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "이종이량체" 는 동일하지 않은 CH3 아미노산 서열을 갖는 2 개 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"놉-인-홀 (knob-in-hole)" 전략 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO2006/028936 참조) 을 사용하여 전장 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. 간략하게, 인간 IgG 에서의 CH3 도메인의 계면을 형성하는 선택된 아미노산은 이종이량체 형성을 촉진하도록 CH3 도메인 상호작용에 영향을 미치는 위치에서 돌연변이될 수 있다. 소형 측쇄 (홀) 를 갖는 아미노산은 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄에 도입되고, 대형 측쇄 (놉) 를 갖는 아미노산은 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄에 도입된다. 2 개 항체의 동시발현 후, 이종이량체는 "홀" 을 갖는 중쇄와 "놉" 을 갖는 중쇄의 우선적인 상호작용의 결과로서 형성된다. 놉 및 홀을 형성하는 예시적 CH3 치환 쌍은 (제 1 중쇄의 제 1 CH3 도메인 내 변형된 위치/제 2 중쇄의 제 2 CH3 도메인 내 변형된 위치로 표시): T366Y/F405A, T366W/ F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S 및 T366W/T366S_L368A_Y407V 이다.
US 특허 공개 번호 US2010/0015133; US 특허 공개 번호 US2009/0182127; US 특허 공개 번호 US2010/028637; 또는 US 특허 공개 번호 US2011/0123532 에서 기재된 바와 같이, 하나의 CH3 표면에서 양으로 하전된 잔기 및 제 2 의 CH3 표면에서 음으로 하전된 잔기를 치환함으로써 정전기적 상호작용을 사용하여 중쇄 이종이량체화를 촉진시키는 것과 같은 다른 전략을 사용할 수 있다. 다른 전략에서, 이종이량체화는 하기 치환에 의해 촉진될 수 있다 (제 1 중쇄의 제 1 CH3 도메인 내 변형된 위치/제 2 중쇄의 제 2 CH3 도메인 내 변형된 위치로 표시): U.S. 특허 공개 번호 US2012/0149876 또는 U.S. 특허 공개 번호 US2013/0195849 에서 기재된 바와 같이, L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, 또는 T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W.
상기 기재된 방법에 추가로, 본 발명의 이중특이적 항체는 PCT 특허 공개 번호 WO2011/131746 에 기재된 방법에 따라, 2 개 단일 특이적 동종이량체 항체의 CH3 부위 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고 환원 조건 하에 2 개 모 단일특이적 동종이량체 항체로부터 이중특이적 이종이량체 항체를 형성시켜 디술피드 결합 이성질체화를 허용시킴으로써 시험관내 세포-무함유 환경에서 생성될 수 있다. 방법에서, 제 1 단일특이적 2가 항체 및 제 2 단일특이적 2가 항체는 이종이량체 안정성을 촉진하는 CH3 도메인에 특정 치환을 갖도록 조작되고; 항체는 힌지 부위 내 시스테인이 술피드 결합 이성질체화를 거치도록 하기에 충분한 환원 조건 하에서 함께 인큐베이션되고; 그로써 Fab 완부 교환에 의해 이중특이적 항체가 생성된다. 인큐베이션 조건은 임의로는 비-환원 조건으로 복원될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적 환원제는 2-머캅토에틸아민 (2-MEA), 디티오트레이톨 (DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP), L-시스테인 및 베타-머캅토에탄올이고, 바람직하게는 환원제는 2-머캅토에틸아민, 디티오트레이톨 및 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀으로 이루어지는 군에서 선택된다. 예를 들어, 적어도 90 분 동안 적어도 20℃ 의 온도에서 적어도 25 mM 2-MEA 의 존재 하 또는 적어도 0.5 mM 디티오트레이톨의 존재 하, pH 5-8, 예를 들어 pH 7.0 또는 pH 7.4 에서의 인큐베이션을 사용할 수 있다.
본 발명의 전장 이중특이적 항체는 상기 이종이량체화 접근법 및 하기와 같은 여러 접근법의 조합을 사용하여 생성될 수 있다: (a) 이중특이적 항체의 하나의 완부 상의 HC/LC 사슬간 디술피드 결합을 이동시킴 (예를 들어, 본원에 그 전체가 참고로 포함되는, 2020 년 12 월 3 일에 출원한 PCT/US2020/063066 참조); (b) VH/VL 계면에 전하 쌍을 도입시킴; (c) CH1/CL 계면에 전하 쌍을 도입시킴; 또는 (d) (a)-(c) 에 기재된 일부 또는 모든 접근법의 조합 (예를 들어, 본원에 그 전체가 참조로 포함되는, 2021 년 2 월 5 일에 출원한 U.S. 가출원 번호 63/146,334 에 최초로 기재된 바, 참조).
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 단백질의 코딩 서열이 변화 (예를 들어, 대체, 결실, 삽입 등) 될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 따라서, 당업자는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열이 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않고 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 플라스미드, 코스미드, 파지 벡터 또는 바이러스 벡터와 같은, 본 개시물을 고려하여 당업자에게 공지된 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 플라스미드와 같은 재조합 발현 벡터이다. 벡터는 발현 벡터의 종래의 기능을 확립하기 위한 임의의 요소, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 요소, 터미네이터, 인핸서, 선택 마커 및 복제 원점을 포함할 수 있다. 프로모터는 구성적, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 핵산을 세포에 전달할 수 있는 다수의 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 세포에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조를 위해 본원에서 사용될 수 있다. 종래의 클로닝 기법 또는 인공 유전자 합성을 사용하여 본 발명의 구현예에 따른 재조합 발현 벡터를 생성할 수 있다. 이러한 기법은 본 개시물을 고려하여 당업자에게 잘 공지되어 있다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 개시물을 고려하여 당업자에게 공지된 임의의 숙주 세포가 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 재조합 발현에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 대장균 (E. coli) TG1 또는 BL21 세포 (예를 들어, scFv 또는 Fab 항체의 발현을 위함), CHO-DG44 또는 CHO-K1 세포 또는 HEK293 세포 (예를 들어, 전장 IgG 항체의 발현을 위함) 이다. 특정 구현예에 따르면, 재조합 발현 벡터는 화학적 형질감염, 열 충격 또는 전기천공법과 같은 종래의 방법에 의해 숙주 세포에 형질전환되는데, 재조합 핵산이 효과적으로 발현되도록 숙주 세포 게놈에 안정적으로 통합된다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 조건 하에 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하고, 세포 또는 세포 배양물 (예를 들어, 상청액) 로부터 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 것을 포함하는, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법에 관한 것이다. 발현된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 종래의 기법에 따라 및 본원에 기재된 바와 같이 세포로부터 수확 및 정제될 수 있다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법에 관한 것이다. 방법은 치환된 아미노산 잔기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 FA 를 접합시키고, FA 에 접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 것을 포함한다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 FA 에 접합되고 알부민에 결합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법에 관한 것이다. 방법은 FA 에 접합된 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 알부민과 접촉시키고, 알부민에 결합된 FA 에 접합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 것을 포함한다.
약학 조성물
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 단리된 단일클론 또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어 지방산 (FA) 에 접합될 수 있다. FA-접합된 단일클론 또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 알부민에 결합될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "약학 조성물" 은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 발명의 항체를 포함하는 생성물을 의미한다. 본 발명의 항체 및 이를 포함하는 조성물은 또한 본원에 언급된 치료 적용을 위한 약제의 제조에 유용하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "담체" 는 임의의 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 오일, 지질, 지질 함유 소포, 미소구체, 리포솜 피포, 또는 약학 제형에서의 사용을 위해 당업계에 널리 공지된 다른 물질을 지칭한다. 담체, 부형제 또는 희석제의 특징이 특정 적용을 위한 투여 경로에 의존적일 것임이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 본 발명에 따른 조성물의 효과 또는 본 발명에 따른 조성물의 생물학적 활성을 방해하지 않는 비-독성 물질을 지칭한다. 특정 구현예에 따르면, 본 개시물을 고려하여, 항체 약학 조성물에서 사용하기에 적합한 임의의 약학적으로 허용가능한 담체가 본 발명에서 사용될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체와의 약학적 활성 성분의 제형화는 당업계에, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (예를 들어, 21 판 (2005), 및 임의의 이후 판) 에 공지되어 있다. 추가적 성분의 비-제한적 예는 완충제, 희석제, 용매, 등장성 조절제, 보존제, 안정화제 및 킬레이트제를 포함한다. 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체가 본 발명의 약학 조성물을 제형화하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 약학 조성물은 액체 제형이다. 액체 제형의 바람직한 예는 수성 제형, 즉 물을 포함하는 제형이다. 액체 제형은 용액, 현탁액, 에멀전, 마이크로에멀전, 겔 등을 포함할 수 있다. 수성 제형은 전형적으로 적어도 50% w/w 의 물, 또는 적어도 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 적어도 95% w/w 의 물을 포함한다.
한 구현예에서, 약학 조성물은 예를 들어 주사 장치 (예를 들어, 주사기 또는 주입 펌프) 를 통해 주사될 수 있는, 주사가능물질로서 제형화될 수 있다. 주사는 예를 들어 피하, 근육내, 복강내, 유리체강내 또는 정맥내로 전달될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 고체 제형, 예를 들어, 동결 건조 또는 분무 건조된 조성물이며, 그대로 사용되거나, 의사 또는 환자가 사용 전에 이에 용매 및/또는 희석제를 첨가하여 사용될 수 있다. 고체 투약 형태는 정제, 예컨대 압축 정제 및/또는 코팅 정제, 및 캡슐 (예를 들어, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐) 을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 또한 예를 들어 향낭, 드라제, 분말, 과립, 로젠지, 또는 재구성용 분말의 형태일 수 있다.
투약 형태는 수용성 또는 수분산성 담체를 포함할 수 있는 경우인 즉시 방출형일 수 있거나, 위장관 또는 피부 아래에서의 투약 형태의 용해 속도를 조절하는 수불용성 중합체를 포함할 수 있는 경우인 지연 방출, 지속 방출 또는 변형 방출일 수 있다.
다른 구현예에서, 약학 조성물은 비강내, 협내 또는 설하로 전달될 수 있다.
수성 제형 중의 pH 는 pH 3 내지 pH 10 일 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 제형의 pH 는 약 7.0 내지 약 9.5 이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 제형의 pH 는 약 3.0 내지 약 7.0 이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 완충제를 포함한다. 완충제의 비제한적 예는 아르기닌, 아스파르트산, 비신, 시트레이트, 디소듐 히드로겐 포스페이트, 푸마르산, 글리신, 글리실글리신, 히스티딘, 리신, 말레산, 말산, 소듐 아세테이트, 소듐 카르보네이트, 소듐 디히드로겐 포스페이트, 소듐 포스페이트, 숙시네이트, 타르타르산, 트리신 및 트리스(히드록시메틸)-아미노메탄, 및 이의 혼합물을 포함한다. 완충제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 완충제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 보존제를 포함한다. 보존제의 비제한적 예는 벤즈에토늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 브로노폴, 부틸 4-히드록시벤조에이트, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로로헥시딘, 클로르페네신, o-크레졸, m-크레졸, p-크레졸, 에틸 4-히드록시벤조에이트, 이미드우레아, 메틸 4-히드록시벤조에이트, 페놀, 2-페녹시에탄올, 2-페닐에탄올, 프로필 4-히드록시벤조에이트, 소듐 데히드로아세테이트, 티오메로살, 및 이의 혼합물을 포함한다. 보존제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 보존제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 등장화제를 포함한다. 등장화제의 비제한적인 예는 염 (예컨대 소듐 클로라이드), 아미노산 (예컨대 글리신, 히스티딘, 아르기닌, 리신, 이소류신, 아스파르트산, 트립토판, 및 트레오닌), 알디톨 (예컨대 글리세롤, 1,2-프로판디올 프로필렌글리콜), 1,3-프로판디올, 및 1,3-부탄디올), 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG400), 및 이의 혼합물을 포함한다. 등장화제의 또 다른 예는 당을 포함한다. 당의 비제한적 예는 단당류, 이당류 또는 다당류, 또는 수용성 글루칸, 예를 들어 프룩토오스, 글루코오스, 만노오스, 소르보오스, 자일로오스, 말토오스, 락토오스, 수크로스, 트레할로오스, 덱스트란, 풀루란, 덱스트린, 시클로덱스트린, 알파 및 베타-HPCD, 가용성 전분, 히드록시에틸 전분 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스일 수 있다. 등장화제의 또 다른 예는 당 알코올이며, 여기서 용어 "당 알코올" 은 적어도 하나의 -OH 기를 갖는 C(4-8) 탄화수소로서 정의된다. 당 알코올의 비제한적 예는 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 갈락티톨, 둘시톨, 자일리톨 및 아라비톨을 포함한다. 등장화제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 등장화제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 킬레이트제를 포함한다. 킬레이트제의 비제한적 예는 시트르산, 아스파르트산, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) 의 염, 및 이의 혼합물을 포함한다. 킬레이트제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 킬레이트제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 안정화제를 포함한다. 안정화제의 비제한적 예는 하나 이상의 응집 억제제, 하나 이상의 산화 억제제, 하나 이상의 계면활성제 및/또는 하나 이상의 프로테아제 억제제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 약학 조성물은 안정화제를 포함하는데, 여기서 상기 안정화제는 카르복시-/히드록시셀룰로오스 및 이의 유도체 (예컨대 HPC, HPC-SL, HPC-L 및 HPMC), 시클로덱스트린, 2-메틸티오에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어 PEG 3350), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리비닐 피롤리돈, 염 (예를 들어 소듐 클로라이드), 황-함유 물질 예컨대 모노티오글리세롤, 또는 티오글리콜산이다. 안정화제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.01 mg/ml 내지 약 50 mg/ml, 예를 들어 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 안정화제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다.
본 발명의 추가 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 계면활성제, 바람직하게는 계면활성제, 적어도 하나의 계면활성제, 또는 2 개의 상이한 계면활성제를 포함한다. 용어 "계면활성제" 는 수용성 (친수성) 부분 및 지용성 (친유성) 부분으로 구성되는 임의의 분자 또는 이온을 지칭한다. 계면활성제는 예를 들어, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제 및/또는 양쪽이온성 계면활성제로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 계면활성제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 계면활성제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다.
본 발명의 추가 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 프로테아제 억제제, 예를 들어, EDTA, 및/또는 벤자미딘 염산 (HCl) 을 포함한다. 프로테아제 억제제는 개별적으로 또는 합하여, 약 0.1 mg/ml 내지 약 20 mg/ml 의 농도로 존재할 수 있다. 이러한 특정 프로테아제 억제제 중 각각을 포함하는 약학 조성물은 본 발명의 대안적인 구현예를 구성한다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 약학 조성물을 수득하는 것을 포함하는, 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
사용 방법
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 암 세포 표면 상에 발현되는 종양-관련 항원 (TAA) (예를 들어, DLL3) 을 표적화하는 방법에 관한 것이다. 방법은 본 발명의 FA 에 접합된 Ab1 완부 (예를 들어, 항-ICM 완부, 예컨대 항-CD3 완부) 를 포함하는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항-CD3/항-DLL3 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 낮은 알부민 수준에서 동시에 항-TAA 완부 (Ab2 완부) 를 통해 TAA-발현 암 세포 및 항-CD3 완부 (Ab1 완부) 를 통해 T 세포에 단리된 FA-접합된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 결합하는 것은 암 세포 사멸을 매개할 수 있다. 알부민 수준이 높은 (예를 들어, 35 내지 50 mg/mL) 순환 혈액에서, FA-접합된 항-CD3 완부는 알부민 결합된 상태이고, 따라서 T 세포에 결합하여 활성화시키는 능력이 감소된다. Ab1 완부가 결합하는 T 세포 표적 항원은 또 다른 T 세포 ICM, 예컨대 4-1BB, GITR, CD28 또는 PD-1 일 수 있다. 이러한 접근법은 온-타겟, 오프-종양 (on-target, off-tumor) 독성을 최소화시킴으로써 항-ICM (예를 들어, 항-CD3) 기반 이중특이적 T 세포 연결체의 안전 범위를 증가시킬 수 있다. 또한, 접근법은 다른 면역 세포의 연결체로서 사용될 수 있는 bsAb (항-TAA 완부 및 접합된 항-ICM 완부 포함) 에 적용될 수 있다. 또한, 접근법은 순환에서 온-타겟 안전성 쟁점이 최소화되도록 순환 혈액의 경우보다 국소 알부민 수준이 더 낮은 표적 조직 (예컨대 지방 조직 또는 골격근) 에 FA-접합된 mAb 및/또는 bsAb 를 사용하는 것에 적용될 수 있다 (Ellmerer et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000. 278: E352-E356).
표적 항원 (예를 들어, ICM, 예컨대 CD3) 에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 TAA (예를 들어, DLL3) 및 T 세포 표적 항원 (예를 들어, ICM, 예컨대 CD3) 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편의 기능적 활성은 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같은 방법에 의해 특징분석될 수 있다. TAA (예를 들어, DLL3) 및 T 세포 표적 항원 (예를 들어, CD3) 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편을 특징분석하는 방법은 Biacore, ELISA, FACS 및 OctetRed 분석을 포함하는 친화성 및 특이성 어세이를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에 따르면, DLL3 및 CD3 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편을 특징분석하는 방법은 하기에 기재된 것들을 포함한다. ICM 에 결합하는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 CD3 외에 ICM 및 TAA (예를 들어, DLL3) 둘 모두에 결합하는 이중특이적 항체 및 이의 항원-결합 단편의 기능적 활성은 상기의 것들과 유사한 방법에 의해 특징분석될 수 있다.
또 다른 일반적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 암은 임의의 액형암 또는 고형암일 수 있으며, 이는 예를 들어 폐암, 위암, 식도암, 담관암, 담관암종, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피세포 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종, 및 기타 고형 종양, 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 기타 액형 종양에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구현예에 따르면, 약학 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 단일클론 항체 또는 항원-결합 단편, 또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량" 은 대상체에서의 원하는 생물학적 또는 의학적 반응을 이끌어내는 활성 요소 또는 성분의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 언급된 목적과 관련하여 경험적으로, 및 정례적 방식으로 결정될 수 있다.
단일클론 및/또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 치료적 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 조절하는 단일클론 및/또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 의미한다. 단일클론 및/또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, 치료적 유효량은 질환, 장애 또는 병상의 치료를 초래하고; 질환, 장애 또는 병상의 진행을 방지하거나 늦추거나; 질환, 장애 또는 병상과 연관된 증상을 감소시키거나 완전히 경감시키는 단일클론 및/또는 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 의미한다.
특정 구현예에 따르면, 치료할 질환, 장애 또는 병상은 암, 바람직하게는 폐암, 위암, 식도암, 담관암, 담관암종, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피세포 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종 및 기타 고형 종양, 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 기타 액형 종양으로 이루어지는 군에서 선택되는 암이다. 다른 특정 구현예에 따르면, 치료할 질환, 장애 또는 병상은 염증 질환, 대사 질환, 심혈관 질환, 신경 질환, 감염성 질환, 또는 이중특이적 항체가 치료요법으로서 사용될 수 있는 임의의 다른 질환이다.
특정 구현예에 따르면, 치료적 유효량은 하기 효과 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 그 이상을 달성하기에 충분한 치료요법의 양을 지칭한다: (i) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상의 중증도를 감소시키거나 완화시킴; (ii) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상의 지속기간을 감소시킴; (iii) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상의 진행을 방지함; (iv) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상의 퇴행을 유발함; (v) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상의 발전 또는 발병을 방지함; (vi) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상의 재발을 방지함; (vii) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상을 갖는 대상체의 입원을 감소시킴; (viii) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상을 갖는 대상체의 입원 길이를 감소시킴; (ix) 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상을 갖는 대상체의 생존을 증가시킴; (xi) 대상체에서 치료할 질환, 장애 또는 병상, 또는 이와 연관된 증상을 억제 또는 감소시킴; 및/또는 (xii) 또 다른 치료요법의 예방 또는 치료 효과(들) 를 향상 또는 개선시킴.
치료적 유효량 또는 투약량은 치료할 질환, 장애 또는 병상, 투여 수단, 표적 위치, 대상체의 생리학적 상태 (예를 들어, 연령, 체중, 건강 포함), 대상체가 인간 또는 동물인지 여부, 투여되는 다른 약물, 및 치료가 예방 또는 치료인지 여부와 같은 다양한 인자에 따라 가변적일 수 있다. 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 치료 투약량을 최적으로 적정한다.
특정 구현예에 따르면, 본원에 기재된 조성물은 대상체에 대해 의도된 투여 경로에 적합한 것으로 제형화된다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 정맥내, 피하 또는 근육내 투여에 적합한 것으로 제형화될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 는 모두 암과 관련된 적어도 하나의 측정가능한 물리적 매개변수의 개선 또는 반전을 의미하는 것으로 의도되며, 이는 대상체에서 반드시 식별가능한 것은 아니지만 대상체에서 식별될 수 있다. 용어 "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 는 또한, 퇴행을 일으키거나, 진행을 예방하거나, 적어도 질환, 장애 또는 병상의 진행을 늦추는 것을 지칭할 수 있다. 특정 구현예에서, "치료", "치료하는" 및 "치료" 는 종양 또는 보다 바람직하게는 암과 같은 질환, 장애 또는 병상과 연관된 하나 이상의 증상의 경감, 발생 또는 발병의 예방, 또는 지속기간의 감소를 지칭한다. 특정 구현예에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 는 질환, 장애 또는 병상의 재발의 예방을 지칭한다. 특정 구현예에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 는 질환, 장애 또는 병상을 갖는 대상체의 생존 증가를 지칭한다. 특정 구현예에서, "치료하다", "치료하는" 및 "치료" 는 대상체에서의 질환, 장애 또는 병상의 제거를 지칭한다.
특정 구현예에 따르면, 암 치료에 사용되는 조성물이 제공된다. 암 치료요법을 위해, 조성물은 화학요법, 항-TIM-3 mAb, 항-LAG-3 mAb, 항-CD73 mAb, 항-CD47 mAb, 항-아펠린 mAb, 항-CTLA-4 항체, 항-EGFR mAb, 항-HER-2 mAb, 항-CD19 mAb, 항-CD20 mAb, 항-CD33 mAb, 항-TIP-1 mAb, 항-DLL3 mAb, 항-CLDN18.2 mAb, 항-PD-L1 항체, 항-PD-1 항체, PD-1/PD-L1 치료요법, 다른 면역항암 약물, 항혈관신생제, 방사선 요법, 항체-약물 접합체 (ADC), 표적 치료요법, 또는 기타 항암 약물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 또 다른 치료와 조합으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체에게 둘 이상의 치료요법을 투여하는 맥락에서 용어 "조합으로" 는 하나 초과의 치료요법의 사용을 지칭한다. 용어 "조합으로" 의 사용은 치료요법이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 제 1 치료요법 (예를 들어, 본원에 기재된 조성물) 은 제 2 치료요법을 대상체에게 투여하기 전 (예를 들어, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 16 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주 또는 12 주 전), 제 2 치료요법을 대상체에게 투여하는 것과 동시에, 또는 제 2 치료요법을 대상체에게 투여한 후 (예를 들어, 5 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 12 시간, 16 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 8 주 또는 12 주 후) 에 투여될 수 있다.
임의로는 링커를 통해 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 공유 연결된 지방산 (FA) 를 포함하는 접합체와 알부민을 접촉시키는 것을 포함하는 방법이 또한 제공되며, 여기서 접합체에서의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 접합체에서의 FA 는 알부민에 결합할 수 있고, FA 에 대한 알부민의 결합은 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이의 결합을 부분적으로 또는 완전히 차단시킨다. 특정 구현예에서, 접촉 단계는 표적 항원을 포함하는 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 접합체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 알부민은 순환 혈액에 비해 종양 미세환경에서 더 높은 회전율을 갖고/갖거나, 대상체의 순환 혈액의 알부민 수준보다 더 낮은 수준으로 종양 미세환경에 존재한다.
구현예
본 발명은 또한 하기의 비제한적 구현예를 제공한다.
구현예 1 은 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기를 포함하며:
a. 중쇄 가변부 (VH);
b. 경쇄 가변부 (VL);
항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표적 항원, 바람직하게는 인간 표적 항원에 결합하고;
하나의 또는 양 완부 상에서 VH, VL 내의, 또는 VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리 내의 아미노산 잔기가 지방산 (FA) 에 접합되는 아미노산 잔기로 치환되고;
치환된 아미노산 잔기에서 FA 와 접합시, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표적 항원에 여전히 결합하는,
단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 2 는 치환된 아미노산 잔기가 하나의 또는 양 완부 상에서 VH 또는 VL 의 5 개-아미노산 거리 내에 있는 것인 구현예 1 의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 3 은 치환된 아미노산 잔기가 시스테인 잔기, 리신 잔기 또는 화학적 접합에 적합한 변형된 아미노산인 구현예 1 또는 2 의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 4 는 구현예 3 의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 치환된 아미노산 잔기가 하기에 상응하는 아미노산 잔기에서 발생하는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다:
(1) VH 에서 SEQ ID NO:1 의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113 (Kabat 번호매김);
(2) VL 에서 SEQ ID NO:2 의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67 (Kabat 번호매김);
(3) CH1 에서 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 잔기 119 또는 120 (EU 번호매김); 또는
(4) CL 에서 SEQ ID NO:13 또는 14 의 잔기 121 또는 124 (EU 번호매김).
구현예 5 는 구현예 4 의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 치환된 아미노산 잔기가 하기에 상응하는 아미노산 잔기에서 발생하는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다:
(1) VH 에서 SEQ ID NO:1 의 K64C 치환;
(2) VL 에서 SEQ ID NO:2 의 S26C 치환, 또는
(3) CH1 부위에서 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 T120C 치환.
구현예 6 은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항-면역 세포 조절제 (ICM) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며 ICM, 바람직하게는 인간 ICM 에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 구현예 1 내지 5 중 어느 하나의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 7 은 ICM 이 CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 구현예 6 의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 8 은 ICM 이 CD3 이고 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 중쇄 상보성 결정 부위 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 부위 1 (LCDR1), LCDR2 및 LCDR3 (각각 SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 및 8; 또는 각각 SEQ ID NO:33, 34, 35, 36, 37 및 38 의 폴리펩티드 서열을 가짐) 을 포함하는 것인 구현예 7 의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 9 는 구현예 7 또는 8 의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, ICM 이 CD3 이고, 치환된 아미노산 잔기가 하기에서 선택되는 아미노산 잔기에서 발생하는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다:
(1) VH 에서 SEQ ID NO:1 또는 27 의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113 (Kabat 번호매김);
(2) VL 에서 SEQ ID NO:2 또는 28 의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67 (Kabat 번호매김);
(3) CH1 에서 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 잔기 119 또는 120 (EU 번호매김); 또는
(4) CL 에서 SEQ ID NO:13 또는 14 의 잔기 121 또는 124 (EU 번호매김).
구현예 10 은 하기를 포함하는 구현예 5 내지 9 중 어느 하나의 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다:
(1) K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:2 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
(2) K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
(3) SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
(4) SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
(5) T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:13 또는 14 로부터의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위;
(6) SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위; 또는
(7) SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위.
구현예 11 은 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 구현예 1 내지 10 중 어느 하나의 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 FA 에 접합되는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 항원-결합 완부(들) 를 포함하는 것인 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 12 는 구현예 11 의 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 및 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 를 포함하는 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편이고, Ab1 및/또는 Ab2 가 FA 에 접합되는 치환된 아미노산을 포함하는 것인 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
구현예 13 은 Ab1 이 면역 세포 조절제 (ICM), 바람직하게는 인간 ICM 에 결합하는 것인 구현예 12 의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 14 는 ICM 이 CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 구현예 13 의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 15 는 Ab2 가 종양-관련 항원 (TAA), 바람직하게는 인간 종양-관련 항원 (인간 TAA) 에 결합하는 것인 구현예 12 내지 14 중 어느 하나의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 16 은 TAA 가 DLL3 인 구현예 15 의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 17 은 구현예 12 내지 16 중 어느 하나의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 가 H1 및 L1 을 포함하고 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 가 H2 및 L2 를 포함하며:
(a) H1 및 H2 가 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 CH1 부위를 포함하고;
(b) L1 및 L2 가 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 부위를 포함하고;
H1L1 및 H2L2 가 각각 하기 아미노산 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 전하 쌍을 포함하는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다:
(1) H1 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L1 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L2 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
(2) H1 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L1 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L2 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
(3) H1 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L1 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L2 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
(4) H1 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L1 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L2 의 CL 에서의 S121D/E 각각;
(5) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
(6) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각;
(7) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각;
(8) H2 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L2 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L1 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
(9) H2 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L2 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L1 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
(10) H2 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L2 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L1 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
(11) H2 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L2 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L1 의 CL 에서의 S121D/E;
(12) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
(13) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각; 또는
(14) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각.
구현예 18 은 구현예 12 내지 17 중 어느 하나의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기를 포함하는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다:
a. SEQ ID NO:15 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:17 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1);
b. SEQ ID NO:19 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:21 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1);
c. SEQ ID NO:29 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:30 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 또는
d. SEQ ID NO:31 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:32 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1).
구현예 19 는 구현예 18 의 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 가 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 20 은 FA 가 6 개의 탄소, 8 개의 탄소, 10 개의 탄소, 12 개의 탄소, 14 개의 탄소, 16 개의 탄소 또는 18 개의 탄소, 또는 그 사이의 임의 수의 탄소를 갖는 FA 에서 선택되는 것인 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 21 은 FA 가 14 개의 탄소 또는 18 개의 탄소, 또는 그 사이의 임의 수의 탄소를 갖는 FA 에서 선택되는 것인 구현예 20 의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 22 는 FA 가 치환된 아미노산 잔기에 대한 접합을 위한 링커를 포함하는 것인 구현예 1 내지 21 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 23 은 링커가 펩티드 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커에서 선택되는 것인 구현예 22 의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 24 는 펩티드 링커가 50 개 미만의 아미노산인 구현예 23 의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 25 는 구현예 1 내지 24 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 접합된 FA 가 알부민에 결합할 수 있고, 알부민의 FA 에 대한 결합이 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이 결합의 부분적 또는 완전한 차단을 초래하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
구현예 26 은 구현예 1 내지 25 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 알부민에 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 비해 알부민에 결합시 T 세포를 활성화시키는 능력이 감소되는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
구현예 27 은 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산이다.
구현예 28 은 구현예 27 의 단리된 핵산을 포함하는 벡터이다.
구현예 29 는 구현예 27 의 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포이다.
구현예 30 은 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이다.
구현예 31 은 대상체에게 구현예 30 의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이다.
구현예 32 는 암이 폐암, 위암, 식도암, 담관암, 담관암종, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피세포 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종, 및 기타 고형 종양, 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 기타 액형 종양으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 구현예 31 의 방법이다.
구현예 33 은 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서, 방법은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 조건 하에 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 것, 및 항체 또는 이의-항원 결합 단편을 세포 또는 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는 방법이다.
구현예 34 는 치환된 아미노산 잔기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 FA 를 접합시키는 것을 더 포함하는, 구현예 33 의 방법이다.
구현예 35 는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서, 방법은 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 약학 조성물을 수득하는 것을 포함하는 방법이다.
구현예 36 은 알부민을 구현예 1 내지 26 중 어느 하나의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 방법으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, FA 가 알부민에 결합할 수 있으며, 알부민의 FA 에 대한 결합이 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이 결합의 부분적 또는 완전한 차단을 초래하는 것인 방법이다.
구현예 37 은 접촉 단계가 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 종양 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 종양이 표적 항원을 포함하는 것인 구현예 36 의 방법이다.
구현예 38 은 알부민이 순환 혈액에 비해 종양 미세환경에서 더 높은 회전율을 갖고/갖거나, 대상체의 순환 혈액 중의 알부민 수준보다 더 낮은 수준으로 종양 미세환경에 존재하고, 바람직하게는, 종양 미세환경에서의 더 낮은 수준의 알부민이 종양 미세환경에서의 높은 알부민 이화작용 및/또는 종양 미세환경에서의 높은 수준의 프로테아제로 인한 것인 구현예 36 또는 37 의 방법이다.
실시예
실시예 1: 지방산 분자와의 접합을 위한 단일클론 항체의 구축 및 특징분석
도 1A 는 VH 부위 내의 잔기가 확인되고 시스테인 (녹인된 시스테인) 으로 치환되는 단일클론 항체 (mAb) 의 개략도를 도시한다. 링커 및 반응성 기를 포함하는 지방산 (FA) 분자는 각각의 mAb 가 2 개의 FA 분자를 함유하도록 녹인된 시스테인에 접합된다 (도 1A). 단일클론 항체는 또한 CH1 또는 CL 부위 내의 VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리 내, 바람직하게는 5 개-아미노산 거리 내, 또는 VL 에서 치환된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 녹인 시스테인 잔기는 또한 FA 접합에 적합한 또 다른 반응성 아미노산 잔기일 수 있다.
접합된 FA 분자는 혈액 내에서 순환하는 알부민 및/또는 조직 내 간질액과 결합할 수 있다. 결합된 알부민 분자는 결합된 알부민의 입체 장애 효과로 인해 접합된 mAb 의 항원-결합 도메인 (VH 및 VL 을 포함함) 과 항원의 상호작용을 부분적으로 또는 완전히 차단할 것으로 예상된다. 따라서, 접합된 mAb 의 항원-결합 활성은 주변 알부민 수준에 의해 조절될 수 있다. 녹인 아미노산 잔기의 위치, FA 의 길이, 링커의 존재 및 링커의 길이에 따라, 표적 항원에 결합하는 mAb 의 상이한 조절 정도가 달성될 수 있다.
도 1A 에서의 mAb 는 예를 들어, 항-CD3 항체일 수 있다. 접합 후, 항-CD3 mAb 의 활성은 알부민에 의해 생체내 조절될 수 있어서, 항-CD3 mAb 는 순환 혈액에서 불활성이거나 덜 활성이다. 종양 미세환경에서, 순환 혈액에 비해 알부민의 더 높은 회전율로 인해, 나출 (naked) 접합된 mAb (즉, 비-알부민 결합한 접합된 항-CD3 mAb) 의 농도는 증가하고, T 세포의 활성화는 항-CD3 mAb 에 의해 매개되는 암 사멸 효과를 야기한다. mAb 는 다른 암 표적 특히 ICM (예를 들어, 4-1BB, GITR, OX40, CD28 또는 PD-1) 에 유도될 수 있으며, 여기서 치료 접근법은 순환 혈액에서 mAb 의 더 적은 활성을 필요로 하거나 활성을 필요로 하지 않고 종양 미세환경에서 더 많은 활성을 필요로 한다. 또한, 접합 및 조절 전략은 mAb 가 아닌 항원-결합 단편과 함께 사용될 수 있다. 이 경우, FA 접합 위치, FA 의 길이, 링커의 존재 및 링커의 길이는 FA-결합된 알부민이 항원-결합 도메인과 표적 항원 사이 계면으로 돌출되도록 선택된다.
접합된 mAb 또는 이의 항원-결합 단편은 또 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 이중특이적 항체 (bsAb) 또는 이의 항원-결합 단편을 구축하는데 사용될 수 있다. 예시 목적으로, 접합된 이중특이적 항체를 도 1B-1C 에서 나타낸다. Ab1 완부는 항-CD3 항체로부터 유래하고, Ab2 완부는 종양-관련 항원 (TAA) 에 대한 mAb 로부터 유래한다. 항-CD3 완부의 부위 (예를 들어, VH, VL, 또는 VH 또는 VL 부위의 20 개-아미노산 거리 내, 바람직하게는 5 개-아미노산 거리 내) 에 대한 FA 분자의 접합은 항-CD3 활성을 조절할 수 있고, 따라서 이중특이적 항체에 의한 T 세포 활성화를 조절하는 한편, TAA 에 대한 항-TAA 완부의 결합은 주변 알부민 농도에 의해 영향을 받지 않는다. FA-접합된 이중특이적 항체는 알부민 수준이 높은 (예를 들어, 35 내지 50 mg/mL) 순환 혈액 및/또는 특정 조직 유체에서 덜 활성이거나 활성이 없는 것으로 예상된다. FA-접합된 이중특이적 항체는 알부민의 높은 회전율로 인해 특정 종양 미세환경에서 T 세포를 자극하는데 활성일 것으로 예상되며, 이는 더 낮은 국소 알부민 수준 및 더 높은 농도의 나출 접합된 bsAb (즉, 비-알부민 결합한 접합된 항-CD3 bsAb) 및 T 세포의 활성화에 의한 증가된 암 세포 사멸을 초래한다. bsAb 의 항-CD3 완부는 다른 암 표적, 특히 ICM (예를 들어, 4-1BB, GITR, OX40, CD28 또는 PD-1) 에 유도될 수 있으며, 여기서 치료적 접근법은 순환 혈액에서 bsAb 의 더 적은 활성을 필요로 하거나 활성을 필요로 하지 않고 종양 미세환경에서 더 많은 활성을 필요로 한다. 이러한 접근법은 온-타겟, 오프-종양 독성을 최소화시킴으로써 항-CD3 기반 이중특이적 T 세포 연결체의 안전 범위를 증가시킬 수 있다. 이러한 치료제는 통상 항-CD3 T 세포 연결체로 관찰되는 사이토카인 폭풍 증후군 (cytokine storm syndrome (CRS)) 의 위험을 감소시킬 수 있다. 접합 및 조절 전략은 이중특이적 항체가 아닌 이중특이적 항원-결합 단편과 함께 사용될 수 있다. 이 경우, FA 접합 위치, FA 의 길이, 링커의 존재 및 링커의 길이는 FA-결합된 알부민이 항원-결합 도메인과 표적 항원 사이 계면으로 돌출되도록 선택된다.
도 1D 는 암 세포를 사멸시키는 FA-접합된 이중특이적 항체 T 세포 연결체에 대한 작용 메커니즘을 입증하는 개략도를 제공한다. 항-TAA 완부는 주변 알부민 수준에 관계없이 암 세포 표면 상의 TAA 에 결합한다. FA-접합된 T 세포 연결 완부 (예를 들어, 항-CD3 완부) 는 주변 알부민 수준이 높은 (예를 들어 순환 혈액에서, 예를 들어 35 내지 50 mg/mL) 경우 표적 항원 (예를 들어, CD3) 에 결합하지 않지만; 주변 알부민 수준이 낮은 경우, FA-접합된 T 세포 연결 완부 (예를 들어, 항-CD3 완부) 는 표적 항원 (예를 들어, CD3) 에 결합하고, T 세포를 활성화시켜, 암 세포의 사멸을 초래한다. FA-접합된 완부는 4-1BB, GITR, OX40, CD28, PD-1, 또는 T 세포 상에서 발현되며 특이적 항체에 의한 결합시 T 세포 활성화를 매개할 수 있는 임의의 다른 표적과 같은 다른 T 세포 ICM 에 대한 T 세포 연결 완부일 수 있다. 또한, FA-접합된 완부는 다른 면역 세포 상의 ICM 에 대항하는 것일 수 있다. 순환 혈액에서의 경우와 비교하여 표적 위치에서의 더 낮은 알부민 수준을 활용하는 접근법은 또한 국소 알부민 수준이 낮은 조직을 표적으로 하는 치료요법에 적용될 수 있으며; 이들 조직은 지방 조직 및 골격근을 포함한다 (Ellmerer et al., Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000. 278: E352-E356). 도 1E 는 FA-접합된 mAb 또는 bsAb 를 식별하기 위한 특정 단계를 나타낸다.
변형된 항-CD3 항체를 사용하여 접합된 mAb 를 구축하였다. 항-CD3 mAb 의 VH 및 VL 부위의 서열 및 번호매김을 도 2A-2B 및 표 1 (각각 SEQ ID NO:1 및 2) 에 나타낸다. CDR 부위 (HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3) 의 서열을 표 2 (각각 SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 및 8, 및 각각 SEQ ID NO:33, 34, 35, 36, 37 및 38) 에 열거한다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중쇄 (HC) 의 CH1 부위의 서열 및 번호매김을 도 2C 및 표 1 (각각 SEQ ID NO:9, 10, 11 및 12) 에 나타낸다. 카파 및 람다 경쇄 (LC) 의 CL 부위의 서열 및 번호매김을 도 2D 및 표 1 (각각 SEQ ID NO:13 및 14) 에 나타낸다.
구조 모델링을 사용하여 항-CD3 항체의 Fab 부위의 표면 상의 잔기를 확인하였다. 항-CD3 mAb 의 서열을 Schrodinger Bioluminate® (Schrodinger; New York, NY) 에 의해 1SY6 및 3EO9 로 모델링하였다. 측쇄 용매 접근성을 계산하고, 30%-70% 범위의 측쇄 접근성을 갖는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변부 내의 또는 그 근처의 잔기를 가능한 시스테인 녹인 후보로서 선택하였다. 녹인에 대해 확인된 잔기를 표 3 에 열거한다. 시스테인 녹인 실험에 대해 선택된 4 개의 잔기를 예시로서 항-CD3 mAb 의 3-D 구조로 나타낸다 (도 3A): VL 부위에서의 S26 및 S31, HC 의 VH 부위에서의 K64, 및 CH1 부위에서의 T120 (VH 부위의 C-말단으로부터 떨어진 3-아미노산 잔기). 이들 위치 내로 녹인된 시스테인을 갖는 mAb 를 각각 LC_S26C, LC_S31C, HC_K64C 및 HC_T120C 로 명명하였다. LC_S26C 는 경쇄 상의 S26 위치에서의 세린 잔기가 시스테인으로 치환된 항-CD3 mAb 를 나타낸다. 다른 mAb 는 동일한 명명 규칙을 따른다.
표 1: 항-CD3 VH, 항-CD3 VL, #2 항-CD3 VH, #2 항-CD3 VL, IgG1 CH1, IgG2 CH1, IgG3 CH1, IgG4 CH1, 카파 CL 및 람다 CL 부위의 서열
Figure pct00001
표 2: 항-CD3 mAb 및 #2 항-CD3 mAb 에 대한 CDR 부위
Figure pct00002
HC: 중쇄; LC: 경쇄; CDR: 상보성 결정 부위; IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212) 및 Kabat 방법 (Elvin A. Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991)) 의 조합을 이용하여 항-CD3 mAb 에 대한 CDR 을 결정하였다.
표 3: 접합을 위한 항-CD3 mAb 에 대한 후보 아미노산 치환
Figure pct00003
Figure pct00004
주의: 볼드체로 나타낸 mAb 가 제조되었으며 시스테인 녹인 후 상당한 CD3 결합 활성을 갖는 것으로 나타났다 (최대 결합은 야생형 항-CD3 mAb 의 최대 항원-결합 활성의 50% 초과임). 항원-결합 활성에 대한 아미노산 치환의 효과를 시험하지 않은 잔기를 일정 형태로 나타낸다. VH 및 VL, Kabat 번호매김; CH1 및 CL, EU 번호매김.
인간 IgG4 HC 및 인간 카파 LC 골격 내의 4 개의 mAb LC_S26C, LC_S31C, HC_K64C 및 HC_T120C 를 CHO 세포에서 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, Jurkat 세포를 사용하여 FACS 에 의해 CD3 결합을 시험하였다 (도 3B-3E). LC_S31C 는 시스테인 녹인 후 상당한 활성을 손실하였다 (도 3C). LC_S26C, HC_K64C 및 HC_T120C 는 CD3 결합에 있어서 실질적 활성을 가졌으며 (도 3B 및 도 3D-3E), 추가 연구를 위해 선택되었다. 시스테인 녹인을 또한 표 3 에서 나타낸 바와 같이 추가의 잔기에서 실행하였다. IgG4 HC 및 카파 LC 골격 내의 생성 mAb 를 CHO 세포에서 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, Jurkat 세포를 사용하여 FACS 에 의해 CD3 결합을 시험하였다. 시스테인 녹인이 야생형 항-CD3 mAb 의 최대 항원-결합 활성의 50% 초과로 유지된 후 잔기를 표 3 에서 볼드체 형태로 나타내고, Jurkat 세포를 사용하는 FACS 에 의한 CD3 결합에 대한 결과를 도 3F-3G 에서 나타낸다. 항원-결합 활성에 대한 아미노산 치환의 효과를 시험하지 않은 잔기를 일정 형태로 나타낸다 (표 3).
실시예 2: 지방산 분자와 접합된 단일클론 항체의 특징분석
C18, C14, C10 및 C6 을 포함하는 접합에 사용된 FA 분자를 도 4A 에 나타낸다. 모든 분자는 PEG 링커 및 브로모아세트아미드 반응성 기를 함유한다. 접합 반응을 위해, 항체를 20-30 mg/mL 의 농도로 농축하고, 완충제를 TBS 완충제로 교환하였다. 10 당량의 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP) 을 첨가하여 항체를 부분적으로 환원시키고, 용액을 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 항체를 DPBS 로 완충제 교환하고, 실온 (RT) 에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 30 당량의 데히드로아스코르브산으로 재산화시켰다. 항체를 접합 완충제 (20 mM 트리스 pH 8.5 + 150 mM NaCl + 10% 글리세롤) 로 완충제 교환하고, 10 mg/mL 의 농도로 희석하였다. FA 분자를 DMSO 중 50 mM 용액으로부터 20 당량으로 첨가하고, 생성 혼합물을 실온에서 1 또는 2 일 동안 인큐베이션하였다. 최종 생성물을 접합 완충제로 완충제 교환하여, 미반응 FA 분자를 제거하였다. 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하고 액체 크로마토그래피/질량 분석법 (LC/MS) 으로 분석하였다. HC 또는 LC 상의 올바른 접합체는 각각의 접합된 mAb 에 대해 질량 분광법 (MS) 을 사용하여 확인하였다 (도 4B-4C). 우측 시스테인 녹인 위치에 대한 FA 의 접합을 LC/MS 로 확인하였다 (표 4).
표 4: 우측 시스테인 녹인 위치에 대한 FA 의 접합의 확인
Figure pct00005
주의: 접합된 mAb 를 트립신 소화 처리하고 LC/MS 로 분석하였다. 주어진 접합된 mAb 에 대해, 올바른 시스테인 녹인 위치에 접합된 FA 를 갖는 펩티드 단편에 상응하는 피크를 LC/MS 상에서 확인하였다. m/z, 질량 대 전하 비, 여기서 m 은 질량이고 z 는 전하 수임; expt, 예상값; obs, 관찰값.
C18-접합된 mAb 를 50 mg/mL 소 혈청 알부민 (BSA) 의 부재 또는 존재 하에 Jurkat 세포 (CD3 을 발현하는 것으로 알려져 있음) 에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다 (도 5A-5C). Jurkat 세포를 1차 항체 결합 단계 동안 BSA 가 있거나 없이 0.1% 카제인을 함유하는 HBSS 완충제 중에서 표시된 항체와 함께 인큐베이션한 후, BSA 를 포함하지 않는 완충제 중에서 처리하였다. 항체 결합을 FACS 에 의해 정량하였다. 미접합된 mAb 의 Jurkat 세포에 대한 결합이 입증되었고, 결합은 BSA 의 존재에 의해 영향받지 않았다 (도 5A-5C). 접합된 mAb 는 여전히 Jurkat 세포에 결합할 수 있었다 (도 5A-5C). Jurkat 세포에 대한 접합된 mAb 의 결합은 BSA 에 의해 억제되었으며, 이는 접합된 FA 가 BSA 에 결합할 수 있고, 이후 항-CD3 mAb 에 의한 항원 결합을 감소시켰다는 것을 나타낸다. 접합된 mAb 에 의한 CD3 결합에 대한 BSA 의 억제 효과를 확인하기 위해, 2 명의 상이한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 사용하여 T 세포 활성화 어세이를 실행하였다. PBMC 를 다중 농도의 BSA 를 함유하는 배지에서 표시된 항체와 함께 16 시간 동안 인큐베이션하였다. T 세포 활성화를 FACS 를 통해 CD25 발현을 측정함으로써 평가하였다. 배지가 1% FBS 를 함유하므로, 낮은 수준의 BSA (1% FBS 로부터 추정에 의해 약 0.25 mg/mL) 가 어세이에서 각각의 군에 있으며, 이것은 BSA 가 배지에 첨가되기 전에 접합된 mAb 에 의한 T 세포 활성화를 억제할 것으로 예상된다 (도 6A-6C). 배지에 BSA 를 첨가하였을 때, 첨가된 BSA 에 의한 T 세포 활성화의 증가된 억제가 관찰되었다 (도 6A-6C).
접합된 FA 분자의 길이의 효과를 시험하기 위해서, C6, C10 및 C14 FA 분자를 각각 HC_K64C 에 접합시켰다. 각각의 mAb 의 중쇄에 특이적인 각각의 FA 의 접합을 LC/MS 에 의해 확인하였다 (도 4C). 각각의 시스테인 녹인 위치에 대한 FA 의 접합을 LC/MS 에 의해 확인하였다 (표 4). 접합된 mAb 를 상기 기재된 바와 같이 2 명의 상이한 공여자로부터의 PBMC 를 사용하여 T 세포 활성화에 대해 시험하였다 (도 7A-7C). C6 및 C10 접합은 더 높은 농도의 BSA 의 존재 하에 CD3 결합을 차단하는데 있어서 덜 효과적이었으며 (도 7A-7B); C14 접합은 더 높은 농도의 BSA 의 존재 하에 CD3 결합을 완전히 차단하였다 (도 7C). 이들 데이터는 접합시에 C14 및 C18 과 같은 더 긴 FA 분자가 결합된 BSA 를 통해 CD3 결합을 차단하는데 더 강력한 반면, 접합시에 더 짧은 C6 및 C10 FA 분자는 결합된 BSA 를 통해 CD3 결합을 차단하는데 덜 강력하다는 것을 나타내었다. 이러한 특징 각각은 종양 미세환경에서 상이한 조건 하에 치료적으로 활용될 수 있다. 예를 들어, 종양 미세환경과 순환 혈액 사이의 차이가 있는 알부민 수준에 따라, 더 긴 FA 또는 더 짧은 FA 가 최상의 생체내 효능/안전 마진 (margin) 을 달성하기 위해 접합된 분자로서 바람직할 수 있다.
지방산 분자와 접합된 이중특이적 항체의 특징분석
FA 접합 접근법은 이중특이적 항체의 2 개의 완부 중 하나의 항원 결합 활성을 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 항-TAA/항-CD3 T 세포 연결체일 수 있고, 여기서 FA 는 항-CD3 완부 (도 1B-1C 에서 Ab1 완부로서 예시됨) 의 Fab 부위에 접합된다. 여기서는 항-TAA 완부에 대한 예로서 항-DLL3 완부를 사용하였다. 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체의 구축에 사용된 서열 (그 전체가 본원에 참조로 포함되는 2021 년 2 월 5 일 출원한 미국 가출원 번호 63/146,334 에 최초로 기재된 것으로서임) 을 사용하여 FA 접합을 위한 시스테인 녹인을 도입하였다. 시스테인을 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체의 항-CD3 완부의 K64 위치 (VH 부위; Kabat 번호매김) 또는 T120 위치 (CH1 부위; EU 번호매김) 에 녹인시켰다. 생성 bsAb 는 각각 bsAb HC_K64C 및 bsAb HC_T120C 로 명명되며, 이들의 서열은 표 5 에 열거된다. bsAb HC_K64C 및 bsAb HC_T120C 는 동일한 항-DLL3 완부를 갖는 것에 주목한다 (표 5). 이중특이적 항체는 IgG1 의 Fc 부위에서 하기 변형을 갖는 인간 IgG1 HC 및 인간 카파 LC 골격 상에 있다: 항-CD3 완부의 HC 는 T366W (EU 번호매김) 돌연변이를 가져 "놉" 을 형성하고, 항-DLL3 완부의 HC 는 돌연변이 T366S, L368A 및 Y407V 를 가져 "홀" 을 형성한다. 또한, S354C 시스테인 돌연변이가 항-CD3 HC 상에 도입되었고 Y349C 시스테인 돌연변이가 항-DLL3 HC 상에 도입되어, 이종이량체 쌍형성을 안정화시켰다. 또한, L234A 및 L235A 돌연변이를 H1 및 H2 모두의 CH2 부위에 도입하였다.
표 5: 접합을 위한 녹인 시스테인을 갖는 이중특이적 항체의 VH, VL, CH1 및 CL 부위의 서열
Figure pct00006
Figure pct00007
주의: VH 및 VL, Kabat 번호매김; CH1 및 CL, EU 번호매김
bsAb HC_K64C 및 bsAb HC_T120C 이중특이적 항체를 ExpiCHO-S 세포에서 일시적으로 형질감염시키고, 동일한 세포에서 2 개 중쇄 및 2 개 경쇄의 동시 발현은 원하는 이중특이적 항체 및 특정 불순물의 발현 및 어셈블리를 유도하였다. 필요에 따라 동일한 HC 및 LC 벡터를 사용하여 일시적 형질감염에 의해 불순물 표준을 제조하였다. 이중특이적 항체를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 먼저 정제하였다. 단백질 A 정제된 샘플을 최종 pH 5.5 로 pH 조정하고, 25 mM 포스페이트 (pH 5.8) + 210 mM NaCl 로 예비평형화된 poros XS (Thermo) CEX 컬럼에 직접 로딩하였다. 샘플을 선형 구배로 용리하였다 [완충제 A - 25 mM 포스페이트 포스페이트 (pH 5.8) + 210 mM NaCl; 완충제 B - 25 mM 포스페이트 (pH 8) + 115 mM NaCl]. 용리된 분획을 강한 양이온 교환 (SCX) HPLC 로 분석하고, 2x 항-DLL3 LC 미스매치의 완전한 제거를 나타내는 분획 (양 완부 상에 매치된 항-DLL3 LC 를 갖는 HC 이종이량체) 을 풀링하였다. (NH4)2SO4 를 700 mM 의 최종 농도로 풀링된 분획에 첨가하고, 샘플을 50 mM 트리스 (pH 7.5) + 700 mM (NH4)2SO4 + 3% 글리세롤로 예비평형화된 Butyl Sepharose High Performance (Cytiva) HIC (소수성 상호작용 크로마토그래피) 컬럼에 직접 로딩하였다. 샘플을 선형 구배를 사용하여 용리하였다 [완충제 A - 50 mM 트리스 (pH 7.5) + 700 mM (NH4)2SO4 + 3% 글리세롤; 완충제 B - 50 mM 트리스 (pH 7.5) + 10% 글리세롤]. 용리된 분획을 HIC HPLC 에 의해 분석하고, 2x 항-CD3 LC 미스매치의 완전한 제거를 나타내는 분획 (양 완부 상에 매치된 항-CD3 LC 를 갖는 HC 이종이량체) 을 정제된 단백질로서 풀링하였다. 정제된 이중특이적 항체는 3 가지 상이한 방법으로 분석하였다.
HIC HPLC 를 위해, 샘플을 1 M (NH4)2SO4 를 함유하는 완충제 중 1 mg/mL 의 최종 농도로 희석하고, 15 μl 을 Agilent AdvanceBio HIC 4.6 x 100 mm 3.6 μm 컬럼 (PN: 685975-908) 을 사용하여 HIC HPLC 분석을 위해 직접 주입하였다. 샘플을 선형 구배 (완충제 A - 50 mM 트리스 pH 7.5 + 1 M (NH4)2SO4; 완충제 B - 50 mM 트리스 pH 7.5 + 10% 글리세롤) 를 사용하여 30℃ 에서 1 mL/min 의 유속으로 분석하였다.
SCX HPLC 를 위해, 샘플을 25 mM 시트레이트 pH 4.5 를 함유하는 완충제 중 1 mg/mL 의 최종 농도로 희석하고, 15 μl 을 Waters Bioresolve SCX mAb 4.6 x 100 mm 3 μm 컬럼 (PN: 18609060) 을 사용하여 SCX HPLC 분석을 위해 직접 주입하였다. 샘플을 선형 구배 (완충제 A - 25 mM 포스페이트 pH 5.8 + 2% ACN; 완충제 B - 25 mM 포스페이트 pH 8 + 250 mM NaCl + 2% ACN) 를 사용하여 30℃ 에서 1 mL/min 의 유속으로 분석하였다.
크기-배제 크로마토그래피 (SEC) HPLC 를 위해, 샘플을 PBS 중 1 mg/mL 의 최종 농도로 희석하고, 8 μl 를 Agilent AdvanceBio SEC 300A 2.7 μm 4.6 x 300 mm 컬럼 (PN: PL1580-5301) 을 사용하여 SEC HPLC 분석을 위해 직접 주입하였다. 샘플을 등용매 용리 (완충제 - 50 mM 포스페이트 pH 7.4 + 300 mM NaCl + 5% 이소프로판올) 를 사용하여 0.35 mL/min 의 유속으로 분석하였다.
정제된 bsAb 를 HIC HPLC, SCX HPLC 및 SEC HPLC 상에서 분석하였다 (도 8A-8B 및 9A-9B). 도 8A 에서, HIC HPLC 상에서 2x 항-DLL3 LC 미스매치를 제외한 불순물로부터 정제된 bsAb HC_K64C 가 분리되었으나; SCX HPLC 상에서 분석하였을 때, 정제된 bsAb HC_K64C 가 2x 항-DLL3 LC 미스매치로부터 잘 분리되었다 (도 8B). 이들 데이터는 정제된 bsAb HC_K64C 가 불순물을 갖고 있지 않다는 것을 입증한다. 또한, 정제된 bsAb HC_K64C 는 SEC HPLC 상의 단일 종류였다 (도 8C). 유사한 관찰이 bsAb HC_T120C 으로 이루어졌으며 (도 9A-9B), 이는 정제된 bsAb HC_T120C 의 높은 순도를 나타낸다.
정제된 bsAb HC_K64C 및 bsAb HC_T120C 이중특이적 항체를 상이한 FA 분자와 접합하였다. 접합을 위해, K64 또는 T120 에서 녹인된 시스테인을 갖는 이중특이적 항체를 20-30 mg/mL 의 농도로 농축하고, TBS 완충제로 완충제 교환하였다. 10 당량의 TCEP 를 첨가하여 이중특이적 항체를 부분적으로 환원시키고, 용액을 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 이중특이적 항체를 DPBS 로 완충제 교환하고, 첨가한 30 당량의 데히드로아스코르브산으로 재산화시키고, 용액을 RT 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 최종 이중특이적 항체 샘플을 접합 완충제 (20 mM 트리스 pH 8.5 + 150 mM NaCl + 10% 글리세롤) 로 완충제 교환하고, 10 mg/mL 의 농도로 희석하였다. FA 분자를 DMSO 중 50 mM 용액으로부터 12 당량으로 첨가하고, 생성 혼합물을 RT 에서 1 일 동안 인큐베이션하였다. 최종 생성물을 접합 완충제로 완충제 교환하여 미반응 FA 분자를 제거한 다음, HIC 정제에 의해 정제하였다. 정제한 접합된 이중특이적 항체를 HIC HPLC (도 10A) 및 SEC HPLC (도 10B) 상에서 분석하였다. 각각의 접합된 bsAb 는 상응하는 미접합된 bsAb 의 경우와 상이한 체류 시간을 갖는 단일 피크로서 나타났는데 (도 10A), 이는 접합의 높은 효율을 입증한다. 또한, 각각의 접합된 bsAb 는 SEC HPLC 상에서 단일 피크로서 나타났다 (도 10B).
표 6: FA 의 bsAb 에 대한 접합의 확인
Figure pct00008
주의: 모 bsAb, 시스테인 녹인 없는 항-DLL3/항-CD3 bsAb; mw, 분자량; + 1 시스테인, 하나의 시스테인은 녹인된 시스테인에 공유 연결되는 것으로 예상되며 생성 mw 는 예상되는 바와 같음.
DLL3 및 CD3 둘 모두에 대한 미접합된 및 접합된 이중특이적 항체의 결합 활성을 동시에 평가하기 위해, 정제된 이중특이적 항체를 상이한 형광 마커로 표지된 SHP-77 세포 및 Jurkat 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이중특이적 항체에 의해 유도된 이중 염색 이벤트를 유세포분석법에 의해 검출하고 정량화하였다. 간략하게, 제조사의 프로토콜에 따라 Jurkat 세포를 Violet Proliferation Dye 450 (BD, Cat: 562158) 으로 염색하고, SHP-77 세포를 CFSE (ThermoFisher, Cat: 34554) 에 의해 염색하였다. 그런 다음, 1:1 비율로의 표지된 SHP-77 및 Jurkat 세포를 1.5 μM 항-DLL3 차단 mAb 또는 1.5 μM 항-CD3 차단 mAb 의 존재 또는 부재 하에 2 μg/mL bsAb 와 함께 인큐베이션하였다 (도 11). 차단 mAb 를 사용한 경우, SHP-77 세포를 10 분 동안 실온에서 4.5 μM 항-DLL3 차단 mAb 로 전처리한 후 1.5 μM 항-DLL3 차단 mAb 의 최종 농도로 Jurkat 세포와 함께 인큐베이션하거나, Jurkat 세포를 10 분 동안 실온에서 4.5 μM 항-CD3 차단 mAb 로 전처리한 후 1.5 μM 항-CD3 차단 mAb 의 최종 농도로 SHP-77 세포와 함께 인큐베이션하였다. CO2 인큐베이터에서 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2% 포름알데히드로 고정시키고, TBS 로 1 회 세척하고, FACS 완충제 (HBSS, 0.1% BSA, 0.05% 소듐 아지드) 에 재현탁한 다음, 유세포분석법 (Attune NxT) 에 의해 분석하였다. bsAb 의 존재 하의 두 세포 유형의 가교결합은 FACS 상에서 검출되었고, 각각의 bsAb (미접합 및 접합) 에 대한 신호는 항-DLL3 또는 항-CD3 차단 mAb 에 의해 억제되었다 (도 11). 이들 데이터는 미접합된 및 접합된 bsAb 가 2 개의 상이한 항원에 동시에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
이중특이적 항체를 또한 기능적 T 세포 활성화 어세이에서 T 세포를 활성화시키는데 사용하였다. 활성화 (CD3-매개 활성화 포함) 시 개똥벌레 루시퍼라아제를 조건적으로 발현하는 Jurkat NFAT 루시퍼라아제 리포터 세포주 (BPS Bioscience) 를 사용하였다. 각각의 bsAb (미접합 및 접합) 의 존재 하에 및 항-DLL3 차단 항체의 존재 또는 부재 하에 (500 nM 의 최종 농도로) 22 시간 동안 성장 배지 중 37℃ 에서 CO2 인큐베이터에서 리포터 세포를 SHP-77 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음, 세포를 루시퍼라아제 검출 시약 및 광도계에 의해 활성화에 대해 어세이하였다. 이중특이적 항체 각각은 표적 세포 SHP-77 와 함께 인큐베이션할 때 리포터 세포의 용량-의존적 활성화를 유도하였고, 신호는 항-DLL3 차단 항체 (항-DLL3 완부의 mAb 버전) 에 의해 억제되었는데 (도 12A-12B), 이는 이중특이적 항체의 T 세포 연결체 기능을 입증한다. 어세이 동안 세포 생존을 위한 배양 배지의 일부로서 0.5% FBS (소 태아 혈청) 가 요구되므로, 낮은 수준의 BSA (0.5% FBS 로부터 추정에 의해 약 0.13 mg/mL) 가 어세이에 있으며, 이것은 bsAb HC_K64C_C10, bsAb HC_K64C_C14 및 bsAb HC_K64C_C18 에 의해 감소된 T 세포 활성화 신호를 유도할 것으로 예상된다 (도 12A).
Jurkat NFAT 루시퍼라아제 리포터 세포주를 사용하는 T 세포 활성화 어세이를 또한 낮은 및 높은 BSA 수준의 존재 하에 실행하여, 접합된 이중특이적 항체의 T 세포 활성화 기능에 대한 알부민의 억제 효과를 평가하였다. 어세이 동안 세포 생존을 위한 배양 배지의 일부로서 0.5% FBS 가 요구되므로, 낮은 수준의 BSA (0.5% FBS 로부터 추정에 의해 약 0.13 mg/mL) 가 어세이에서 각 군에 있었다. 높은 수준의 BSA (0.5% FBS 에 추가로 10 mg/mL BSA 의 최종 농도) 를 어세이에 첨가했을 때, 접합된 이중특이적 bsAb HC_K64C_C14 및 bsAb HC_K64C_C18 에 의해 유도된 T 세포 활성화는 대조군 (0.5% FBS 만) 과 비교시 억제되었고 (도 13A); 높은 수준의 BSA (10 mg/mL BSA + 0.5% FBS) 는 대조군 (0.5% FBS 만) 과 비교시 접합된 이중특이적 bsAb HC_T120C_C14 및 bsAb HC_T120C_C18 에 의해 유도된 T 세포 활성화를 억제하였다 (도 13B). 이들 데이터는 FA 분자와 접합된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체의 활성이 BSA 수준에 의해 조절될 수 있다는 것을 나타낸다. 도 5B 는 mAb HC_K64C 에 대한 FA 접합이 접합된 완부의 CD3 에 대한 결합을 변화시키지 않았음을 나타내고; 또한, 도 11 은 bsAb HC_K64C 에 대한 FA 접합이 그의 이중특이적 활성을 크게 변화시키지 않았음을 나타내는데, 이는 도 13A 에서 bsAb HC_K64C_C10 의 더 낮은 활성이 배양 배지의 일부로서 요구되는 0.5% FBS 에 의해 이어지는 낮은 BSA 수준으로 인한 것임을 시사한다. 유사한 관찰이 HC_K64C_C14 및 HC_K64C_C18 에 대해 이루어졌다 (도 13A). 이러한 관찰은 도 6B 및 7A-7C 에서의 데이터와 일치하는데, 이는 K64 에서의 FA 접합이 BSA 의 존재 하 T120 에서의 경우보다 훨씬 더 항-CD3 완부의 CD3 에 대한 결합에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 이는 또한, K64C 에서 접합된 FA 에 결합한 BSA 가 CDR 에 더 가까우며 T120C 에서보다 표적 항원 (CD3) 결합을 더 효율적으로 차단할 수 있다는 사실과 일치한다.
각각의 접합된 이중특이적 항체의 항-DLL3 완부의 항원-결합 활성에 대한 BSA 의 효과를 평가하기 위해 ELISA 어세이를 실행하였다. 96-웰 ELISA 플레이트를 DLL3 단백질 (Adipogen, Cat#: AG-40B-0151-C010) 로 1 시간 동안 RT 에서 코팅한 후, TBST 중 5% BSA 로 1 시간 동안 RT 에서 차단하였다. 플레이트를 TBST 로 3 회 세척하고 차단제 (200 μg/mL 항-DLL3 F(ab')2 또는 50 mg/mL BSA (Sigma, Cat#: A4612-25G); TBST 를 비-차단제 군에 사용하였음) 의 존재 또는 부재 하에 RT 에서 1 시간 동안 예비인큐베이션하였다. 그런 다음, 플레이트를 100 μg/mL 항-DLL3 F(ab')2 또는 50 mg/mL BSA 의 존재 또는 부재 하에 30 분 동안 RT 에서 1 μg/mL bsAb 와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고 Envision 광도계를 사용하여 신호를 HRP 접합된 항-인간 IgG 2차 항체 (ThermoFisher, Cat#: H10007) 및 TMB 기질 (ThermoFisher, Cat#: 34029) 로 검출하였다. 도 14 는 BSA 가 각각의 접합된 bsAb 의 항-DLL3 완부의 항원-결합 활성에 대해 매우 적은 영향을 갖는다는 것을 나타낸다.
항-CD3 (#2 항-CD3) VH 및 VL 서열 (각각 SEQ ID NO:27 및 28; Kabat 번호매김) 의 제 2 세트를 또한 접합된 mAb 및 bsAb 를 구축하는데 사용할 수 있으며 표 1 에 열거한다. 추가로, 이들 서열의 변형된 버전을 또한, SEQ ID NO:29 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:30 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 또는 SEQ ID NO:31 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:32 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 포함하는 접합된 항-DLL3/항-CD3 이중특이적 항체 (표 5) 를 구축하는데 사용할 수 있다. 각각의 상기 경우에, 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 는 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함한다. 또한, 상기 언급된 각각의 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 를 DLL3 외에 CD3 및 TAA 에 대한 이중특이적 항체를 구축하는데 사용할 수 있다.
당업계의 숙련자는 본 발명의 광범위한 개념을 벗어나지 않고 상기 기재한 구현예를 변경할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명이 개시된 특정 구현예에 제한되는 것이 아니라, 상세한 설명에 의해 정의되는 바와 같이 본 발명의 취지 및 범주 내의 변형을 포함하는 것으로 의도된다는 것이 이해된다.
<110> Phanes Therapeutics, Inc. <120> Antibodies Conjugated with Fatty Acid Molecules and Uses Thereof <130> 065799.32WO1 <150> US 62/982,476 <151> 2020-02-27 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 variable heavy chain region (VH) <400> 1 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 variable light chain region (VL) <400> 2 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 HCDR1 <400> 3 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 HCDR2 <400> 4 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 HCDR3 <400> 5 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 LCDR1 <400> 6 Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 LCDR2 <400> 7 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 LCDR3 <400> 8 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 9 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 CH1 <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 10 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG2 CH1 <400> 10 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 100 <210> 11 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG3 CH1 <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly 100 105 <210> 12 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 CH1 <400> 12 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly 100 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kappa CL <400> 13 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 14 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lambda CL <400> 14 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys 100 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_K64C, anti-CD3 VH <400> 15 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Cys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 16 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_K64C, anti-CD3 CH1 <400> 16 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Lys Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_K64C, anti-CD3 VL <400> 17 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_K64C, anti-CD3 CL <400> 18 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Glu Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 19 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_T120C, anti-CD3 VH <400> 19 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_T120C, anti-CD3 CH1 <400> 20 Ala Ser Cys Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Lys Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 100 <210> 21 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_T120C, anti-CD3 VL <400> 21 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_T120C, anti-CD3 CL <400> 22 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Glu Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 23 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-DLL3 VH <400> 23 Glu Val Arg Leu Ser Gln Ser Gly Gly Gln Met Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Met Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Arg Arg Pro Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Thr Lys Tyr Ala Arg Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Tyr Ser Asp Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Ala 100 105 110 Pro Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 24 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-DLL3 CH1 <400> 24 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser 100 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-DLL3 VL <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-DLL3 CL <400> 26 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Lys Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser 100 105 <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 VH <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 VL <400> 28 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_K64C, #2 anti-CD3 VH <400> 29 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Cys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_K64C, #2 anti-CD3 VL <400> 30 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_T120C, #2 anti-CD3 VH <400> 31 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> bsAb HC_T120C, #2 anti-CD3 VL <400> 32 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 HCDR1 <400> 33 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His 1 5 10 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 HCDR2 <400> 34 Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 35 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 HCDR3 <400> 35 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 LCDR1 <400> 36 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 LCDR2 <400> 37 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 Anti-CD3 LCDR3 <400> 38 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 1 5

Claims (38)

  1. 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 하기를 포함하며:
    a. 중쇄 가변부 (VH);
    b. 경쇄 가변부 (VL);
    항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표적 항원, 바람직하게는 인간 표적 항원에 결합하고;
    하나의 또는 양 완부 상에서 VH, VL 내의, 또는 VH 또는 VL 의 20 개-아미노산 거리 내의 아미노산 잔기가 지방산 (FA) 에 접합되는 아미노산 잔기로 치환되고;
    치환된 아미노산 잔기에서 FA 와 접합시, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표적 항원에 여전히 결합하는,
    단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 이의 치환된 아미노산 잔기가 하나의 또는 양 완부 상에서 VH 또는 VL 의 5 개-아미노산 거리 내에 있는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 이의 치환된 아미노산 잔기가 시스테인 잔기, 리신 잔기 또는 화학적 접합에 적합한 변형된 아미노산인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제 3 항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기가 하기에 상응하는 아미노산 잔기에서 발생하는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) SEQ ID NO:1 의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113;
    (2) SEQ ID NO:2 의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67;
    (3) SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 잔기 119 또는 120; 또는
    (4) SEQ ID NO:13 또는 14 의 잔기 121 또는 124.
  5. 제 4 항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기가 하기에 상응하는 아미노산 잔기에서 발생하는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) SEQ ID NO:1 의 K64C 치환;
    (2) SEQ ID NO:2 의 S26C 치환; 또는
    (3) SEQ ID NO:9, 10, 11 또는 12 의 T120C 치환.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항-면역 세포 조절제 (ICM) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며 ICM, 바람직하게는 인간 ICM 에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제 6 항에 있어서, ICM 이 CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα 및 다른 세포 표면 면역 조절 항원으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제 7 항에 있어서, ICM 이 CD3 이고, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 각각 SEQ ID NO:3, 4, 5, 6, 7 및 8; 또는 각각 SEQ ID NO:33, 34, 35, 36, 37 및 38 의 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 부위 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, 경쇄 상보성 결정 부위 1 (LCDR1), LCDR2 및 LCDR3 을 포함하는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기가 하기에서 선택되는 아미노산 잔기에서 발생하는 것인 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) SEQ ID NO:1 또는 27 의 잔기 25, 27, 62, 64, 73, 76, 101, 112 또는 113;
    (2) SEQ ID NO:2 또는 28 의 잔기 26, 27, 52, 53, 56 또는 67;
    (3) SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 의 잔기 119 또는 120; 또는
    (4) SEQ ID NO: 13 또는 14 의 잔기 121 또는 124.
  10. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    1) K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
    2) K64C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
    3) SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
    4) SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위 및 S26C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위;
    5) T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위;
    6) SEQ ID NO:1 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위;
    7) SEQ ID NO:27 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:28 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, T120C 의 아미노산 치환을 갖는 SEQ ID NO: 9, 10, 11 또는 12 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:13 또는 14 에서 선택되는 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위.
  11. 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 FA 에 접합되는 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 하나 이상의 항원-결합 완부(들) 을 포함하는 것인 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제 11 항에 있어서, 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 및 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 를 포함하는 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편이고, Ab1 및/또는 Ab2 가 FA 에 접합되는 치환된 아미노산을 포함하는 것인 단리된 다중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제 12 항에 있어서, Ab1 이 면역 세포 조절제 (ICM), 바람직하게는 인간 ICM 에 결합하는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제 13 항에 있어서, ICM 이 CD3, CD27, CD28, CD40, CD122, OX40, CD16, 4-1BB, GITR, ICOS, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, TIGIT, VISTA, SIGLEC7, NKG2D, SIGLEC9, KIR, CD91, BTLA, NKp46, B7-H3, SIPRα 및 다른 세포 표면 면역 조절 분자로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, Ab2 가 종양-관련 항원 (TAA), 바람직하게는 인간 종양-관련 항원 (인간 TAA) 에 결합하는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제 15 항에 있어서, TAA 가 DLL3 인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항원-결합 완부 (Ab1) 가 H1 및 L1 을 포함하고 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 가 H2 및 L2 를 포함하며:
    (a) H1 및 H2 가 각각 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 CH1 부위를 포함하고;
    (b) L1 및 L2 가 각각 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄의 CL 부위를 포함하고;
    H1L1 및 H2L2 가 각각 하기 아미노산 치환으로 이루어지는 군에서 선택되는 전하 쌍을 포함하는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (1) H1 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L1 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L2 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
    (2) H1 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L1 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L2 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
    (3) H1 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L1 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L2 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
    (4) H1 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L1 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L2 의 CL 에서의 S121D/E 각각;
    (5) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
    (6) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각;
    (7) H1 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L1 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H2 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L2 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각;
    (8) H2 의 CH1 에서의 G166D/E 및 L2 의 CL 에서의 S114K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 G166K/R 및 L1 의 CL 에서의 S114D/E 각각;
    (9) H2 의 CH1 에서의 T187D/E 및 L2 의 CL 에서의 D/N170K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 T187K/R 및 L1 의 CL 에서의 D/N170D/E 각각;
    (10) H2 의 CH1 에서의 S131D/E 및 L2 의 CL 에서의 P119K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 S131K/R 및 L1 의 CL 에서의 P119D/E 각각;
    (11) H2 의 CH1 에서의 A129D/E 및 L2 의 CL 에서의 S121K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 A129K/R 및 L1 의 CL 에서의 S121D/E;
    (12) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 K207K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 K207D/E 각각;
    (13) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 I/L117K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 I/L117D/E 각각; 또는
    (14) H2 의 CH1 에서의 K/R133D/E 및 L2 의 CL 에서의 F/V209K/R 각각, 및 H1 의 CH1 에서의 K/R133K/R 및 L1 의 CL 에서의 F/V209D/E 각각.
  18. 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    1) SEQ ID NO:15 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:17 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1);
    2) SEQ ID NO:19 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:21 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1);
    3) SEQ ID NO:29 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:30 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:16 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1); 또는
    4) SEQ ID NO:31 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:32 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:22 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 제 1 항원-결합 완부 (Ab1).
  19. 제 18 항에 있어서, 제 2 항원-결합 완부 (Ab2) 가 SEQ ID NO:23 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VH 부위, SEQ ID NO:25 의 폴리펩티드 서열을 갖는 VL 부위, SEQ ID NO:24 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CH1 부위, 및 SEQ ID NO:26 의 폴리펩티드 서열을 갖는 CL 부위를 포함하는 것인 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, FA 가 6 개의 탄소, 8 개의 탄소, 10 개의 탄소, 12 개의 탄소, 14 개의 탄소, 16 개의 탄소 또는 18 개의 탄소, 또는 그 사이의 임의 수의 탄소를 갖는 FA 에서 선택되는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제 20 항에 있어서, FA 가 14 개의 탄소 또는 18 개의 탄소, 또는 그 사이의 임의 수의 탄소를 갖는 FA 에서 선택되는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, FA 가 치환된 아미노산 잔기에 대한 접합을 위한 링커를 포함하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 제 22 항에 있어서, 링커가 펩티드 링커 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커에서 선택되는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제 23 항에 있어서, 펩티드 링커가 50 개 미만의 아미노산인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 접합된 FA 가 알부민에 결합할 수 있고, 알부민의 FA 에 대한 결합이 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이 결합의 부분적 또는 완전한 차단을 초래하는 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 알부민에 결합하지 않는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 비해 알부민에 결합시 T 세포를 활성화시키는 능력이 감소된 것인 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 단리된 핵산.
  28. 제 27 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  29. 제 28 항에 따른 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  30. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  31. 대상체에게 제 30 항에 따른 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 암이 폐암, 위암, 식도암, 담관암, 담관암종, 결장암, 간세포 암종, 신세포 암종, 방광 요로상피세포 암종, 전이성 흑색종, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 두경부암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종, 및 기타 고형 종양, 및 비-호지킨 림프종 (NHL), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 다발성 골수종 (MM), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 기타 액형 종양으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법으로서, 방법은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하기 위한 조건 하에 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 배양하는 것, 및 항체 또는 이의-항원 결합 단편을 세포 또는 배양물로부터 회수하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 치환된 아미노산 잔기에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 FA 를 접합시키는 것을 더 포함하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 제조 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법으로서, 방법은 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 약학 조성물을 수득하는 것을 포함하는 방법.
  36. 알부민을 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는 방법으로서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, FA 가 알부민에 결합할 수 있으며, 알부민의 FA 에 대한 결합이 표적 항원과 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이 결합의 부분적 또는 완전한 차단을 초래하는 것인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 접촉 단계가 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 종양 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 종양이 표적 항원을 포함하는 것인 방법.
  38. 제 36 항 또는 제 37 항에 있어서, 알부민이 순환 혈액에 비해 종양 미세환경에서 더 높은 회전율을 갖고/갖거나, 대상체의 순환 혈액 중의 알부민 수준보다 더 낮은 수준으로 종양 미세환경에 존재하고, 바람직하게는, 종양 미세환경에서의 더 낮은 수준의 알부민이 종양 미세환경에서의 높은 알부민 이화작용 및/또는 종양 미세환경에서의 높은 수준의 프로테아제로 인한 것인 방법.
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