CN117015556A - 带电荷对的双特异性抗体及其应用 - Google Patents

带电荷对的双特异性抗体及其应用 Download PDF

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CN117015556A
CN117015556A CN202280013842.3A CN202280013842A CN117015556A CN 117015556 A CN117015556 A CN 117015556A CN 202280013842 A CN202280013842 A CN 202280013842A CN 117015556 A CN117015556 A CN 117015556A
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杰克·重阳·李
贾海群
邹晖
吴惠文
王明晗
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Vance Pharmaceutical
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Vance Pharmaceutical
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Abstract

本文描述了工程改造的双特异性抗体，其在CH1和CL界面单独具有引入的电荷对或者与VH和VL界面的其他电荷对组合。还描述了抗‑CD47/抗‑CLDN18.2和抗‑CD3/抗‑DLL3双特异性抗体及其抗原结合片段。还描述了编码双特异性抗体的核酸、包含该双特异性抗体的组合物，以及生产该双特异性抗体和使用该双特异性抗体治疗或预防疾病，如癌症和/或相关并发症的方法。

Description

带电荷对的双特异性抗体及其应用
相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2021年2月5日提交的美国临时专利申请号第63/146，334号和2021年8月20日提交的美国临时专利申请号第63/260，463号的优先权。以上每个临时专利申请的公开内容以引用方式全文并入于此。
发明领域
本发明涉及人造的双特异性抗体，包括在重链和轻链之间的界面中引入的电荷残基。本发明涉及电荷对、带电荷对的双特异性抗体、编码双特异性抗体的核酸和表达载体，包含载体的重组细胞以及包含双特异性抗体的组合物。同时提供了筛选和使用设计的电荷对来区分双特异性抗体和其生产过程中的主要杂质的物理性质的方法，制造双特异性抗体的方法，以及用双特异性抗体治疗包括癌症在内的疾病和/或相关的应用方法。
电子提交的序列表说明
本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交，文件名为“065799.35WO1 Sequence Listing”，创建日期为2021年12月10日，大小为80kb。通过EFS-Web提交的序列表是合规的一部分，并通过引用的形式并入于此，保证其完整性。
发明背景
抗体(免疫球蛋白)是天然存在的蛋白质，在免疫系统保护身体免受细菌和病毒等外来物质入侵的功能中起到重要作用。天然结构的抗体是Y形蛋白质，由两个臂组成，其中每个臂都包含一条相同的重链(HC)和一条相同的轻链(LC)。重链包含一个可变区(VH)和三个恒定区(分别为CH1，CH2，CH3)，它们按VH，CH1，CH2和CH3的顺序从N端到C端排列，轻链包含一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)，按VL和CL的顺序从N端到C端排列。每个臂中重链和轻链的结合通常被称为“配对”，涉及VH，CH1，VL和CL区域。VH和VL在物理上相互作用，形成抗体与其抗原的结合域，因此Y形的抗体具有两个相同的结合域，每个臂上有一个针对同一抗原的结合域，因此是二价且单特异性的，这是单克隆抗体(mAb)的典型特征。
作为抗体结构的一部分，CH1和CL也在物理结构上彼此相互作用，这涉及物理接触以及分别由CH1和CL上两个天然半胱氨酸的游离巯基形成的链间二硫键(也称为“二硫键”)。链间二硫键有助于使每臂上重链和轻链组成的整体结构更稳定。另外，链内二硫键也作为天然抗体结构的一部分组成。重链的C端结构(CH2和CH3)形成一个紧密的结构，对天然抗体的二价性起重要作用。
单克隆抗体(mAb)因其与抗原的高亲和力结合性、体内半衰期长、天然存在的稳定结构、激活免疫系统对抗药物靶点的能力以及其他诸多优势，成为优秀的蛋白质治疗平台。然而，当治疗策略需要靶向两种不同的抗原时，例如一个抗体靶向一种肿瘤细胞上的两种肿瘤特异性抗原，mAb就无法满足条件。在这种情况下，双特异性抗体被制作出来，靶向同一细胞上的两种不同抗原，用一个臂结合第一种抗原，另一个臂结合第二种抗原。虽然每个抗原是单价结合，但与同一种细胞上的两种抗原结合可以补偿因每种抗原的二价性丧失而失去的亲和力。与单克隆抗体相比，双特异性抗体具有更高的选择性，因为它们与表达两种抗原的细胞比仅表达一种抗原的细胞具有更高的结合力。当正常细胞或组织表达两种抗原中的一种时，它在减少安全问题中起到重要作用。当双特异性抗体与两种不同的细胞表面抗原或可溶性配体/蛋白质结合时，它可以同时靶向这两种途径，这是它与单克隆抗体相比的另一个优势。当双特异性抗体分别结合两个细胞上的不同抗原时可以被用作细胞接合剂(例如T细胞接合剂)，将两个细胞接合在一起并触发目标的生物学效应，从而达到治疗的效果。
如果双特异性抗体是由两个单克隆抗体制成，那它将含有分别来自于两种单克隆抗体的两个不同臂，每条臂含有一条独特的重链和一条独特的轻链。在生产过程中，双特异性抗体在细胞中的表达需要4种不同的蛋白质：两种不同的重链和两种不同的轻链。虽然目标是在生产过程中使双特异性抗体的每一个HC与其相对于的LC相匹配，但经常发生错配并产生不需要的产物，增加了生产和分离目标双特异性抗体产品的难度。目前已经有几种方法用于改进双特异性抗体的生产过程。其中一种是通过蛋白质工程来识别常见的轻链。但是，蛋白质工程中的结构域交换和许多的突变会显著改变抗体的天然结构，从而增加抗体聚集的风险和/或降低稳定性。
T细胞接合剂是多特异性抗体或抗原结合片段，包含至少两个结合域，其中一个结合癌细胞表面表达的肿瘤相关抗原(TAA)，另一个结合T细胞表面分子以激活T细胞。多种T细胞结合域都可以被用作激活成分，其中抗CD3结合域被广泛用作T细胞接合剂。抗CD3双特异性抗体已被用作T细胞参与的免疫治疗剂，用于将T细胞召集到肿瘤细胞中以促进癌症杀伤。
发明内容简介
在总的方面，本发明涉及分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
a.第一重链，H1；
b.第二重链，H2；
c.第一轻链，L1；
d.第二轻链，L2；。
其中，H1和L1形成第一臂，包括第一抗原结合域，用于特异性结合第一抗原，优选人源的第一抗原，和
其中H2和L2形成第二臂，包括第二抗原结合域，用于特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原；其中
(a)H1和H2各包含人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4上的CH1区域；
(b)L1和L2各包含人κ轻链或人λ轻链上的CL区；
其中H1L1和H2L2各自包含由以下氨基酸取代组成的组的电荷对：
(1)分别为H1的CH1区上的G166D/E，L1的CL区上的S114K/R，H2的CH1区上的G166K/R，以及L2的CL区上的S114D/E；
(2)分别为H1的CH1区上的T187D/E，L1的CL区上的D/N170K/R，H2的CH1区上的T187K/R，以及L2的CL区上的D/N170D/E；
(3)分别为H1的CH1区上的S131D/E，L1的CL区上的P119K/R，H2的CH1区上的S131K/R，以及L2的CL区上的P119D/E；
(4)分别为H1的CH1区上的A129D/E，L1的CL区上的S121K/R，H2的CH1区上的A129K/R，以及L2的CL区上的S121D/E；
(5)分别为H2的CH1区上的G166D/E，L2的CL区上的S114K/R，H1的CH1区上的G166K/R，以及L1的CL区上的S114D/E；
(6)分别为H2的CH1区上的T187D/E，L2的CL区上的D/N170K/R，H1的CH1区上的T187K/R，以及L1的CL区上的D/N170D/E；
(7)分别为H2的CH1区上的S131D/E，L2的CL区上的P119K/R，H1的CH1区上的S131K/R，以及L1的CL区上的P119D/E；
(8)分别为H2的CH1区上的A129D/E，L2的CL区上的S121K/R，H1的CH1区上的A129K/R，以及L1的CL区上的S121D/E；
在某些实施例中，两条重链H1和H2分别包括VH区、CH1区和Fc区(包括CH2和CH3区)，其中VH区有不同的氨基酸序列。在某些实施例中，两条重链H1和H2分别包括VH区、CH1区和Fc区(包括CH2和CH3区)，其中CH1区有不同的氨基酸序列。在某些实施例中，两条重链H1和H2分别包括VH区、CH1区和Fc区(包括CH2和CH3区)，其中Fc区有不同的氨基酸序列。在某些实施例中，两条轻链L1和L2分别含有VL区和CL区，其中VL区有不同的氨基酸序列。在某些实施例中，两条轻链L1和L2分别含有VL区和CL区，其中CL区有不同的氨基酸序列。
在某些实施例中，H1和H2形成异质二聚体。
在某些实施例中，带负电荷的氨基酸(D或E)被引入到H1的CH1中的G166、T187、S131或A129处(同时上述位点在L1的CL区上所对应的位置被引入带正电荷的氨基酸)，带正电荷的氨基酸(K或D)被引入到H2的CH1相应的残基处(同时上述位点在L2的CL上相对应的位置被引入带负电荷的氨基酸)，H1上的VH区和L1上的VL区分别有Q39E和Q38K替换突变，H2上的VH区和L2上的VL区分别有Q39K和Q38E替换突变；或带正电荷的氨基酸(K或R)被引入到H1的CH1上的G166,T187,S131或A129处(同时上述位点在L1的CL上相对应的位置被引入带负电荷的氨基酸)，以及带负电的氨基酸(D或E)被引入到H2的CH1上相应的残基处(同时上述位点在L2的CL上相应的位置被引入带正电荷的氨基酸)，H1上的VH区和L1上的VL区分别有Q39K和Q38E替换突变，H2上的VH区和L2上的VL区分别有Q39E和Q38K替换突变。
在某些实施例中，分离出的双特异性抗体或抗原结合片段包含两个臂之一的CH1和CL区域，包括在对应CH1上SEQ ID NO:17,18,19或20以及CL上SEQ ID NO:21或22的氨基酸对应的氨基酸残基处的氨基酸取代，其中CH1和CL区的氨基酸替换选自：
(1)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的F209C和C214X；
(2)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的F209C和C214X；
(3)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的V209C和C214X；
(4)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的V209C和C214X；其中X选自S，A或G。
在某些实施例中，分离出的双特异性抗体或抗原结合片段包括抗CD47抗体或其抗原结合片段臂和抗TAA抗体或其抗原结合片段臂，其中CD47和TAA在同一个细胞中表达，具有能与CD47和TAA特异性结合的特点，尤其是人CD47和TAA。分离出的抗CD47抗体或其抗原结合片段因此可以包含例如分别包含氨基酸序列为SEQ ID:23,28,24和29的VH，CH1，VL和CL区。
在某些实施例中，分离出的双特异性抗体或抗原结合片段包含特异性结合CD47的第一抗原结合域，尤其是人CD47，以及特异性结合claudin 18.2(CLDN18.2)，尤其是人CLDN18.2。
在某些实施例中，抗CD47抗原结合域包括含有以下氨基酸序列的VH，CH1，VL和CL：
(1)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和29；
(2)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和29；
(3)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和30；
(4)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和30；
(5)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和33；
(6)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和33；
(7)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和34；
(8)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和34；
(9)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和37；
(10)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和37；
(11)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和38；
(12)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和38；
(13)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和41；
(14)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和41；
(15)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和42；
(16)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和42；
(17)分别为SEQ ID NOs:1,43,2和45；
(18)分别为SEQ ID NOs:1,44,2和45；
(19)分别为SEQ ID NOs:1,43,2和46；
(20)分别为SEQ ID NOs:1,44,2和46；
(21)分别为SEQ ID NOs:1,47,2和49；
(22)分别为SEQ ID NOs:1,48,2和49；
(23)分别为SEQ ID NOs:1,47,2和50；
(24)分别为SEQ ID NOs:1,48,2和50；
(25)分别为SEQ ID NOs:1,51,2和53；
(26)分别为SEQ ID NOs:1,52,2和53；
(27)分别为SEQ ID NOs:1,51,2和54；
(28)分别为SEQ ID NOs:1,52,2和54；
(29)分别为SEQ ID NOs:1,55,2和57；
(30)分别为SEQ ID NOs:1,56,2和57；
(31)分别为SEQ ID NOs:1,55,2和58；
(32)分别为SEQ ID NOs:1,56,2和58；
(33)分别为SEQ ID NOs:23,27,24和29；
(34)分别为SEQ ID NOs:23,28,24和29；
(35)分别为SEQ ID NOs:23,27,24和30；
(36)分别为SEQ ID NOs:23,28,24和30；
(37)分别为SEQ ID NOs:25,31,26和33；
(38)分别为SEQ ID NOs:25,32,26和33；
(39)分别为SEQ ID NOs:25,31,26和34；
(40)分别为SEQ ID NOs:25,32,26和34；
(41)分别为SEQ ID NOs:23,35,24和37；
(42)分别为SEQ ID NOs:23,36,24和37；
(43)分别为SEQ ID NOs:23,35,24和38；
(44)分别为SEQ ID NOs:23,36,24和38；
(45)分别为SEQ ID NOs:25,39,26和41；
(46)分别为SEQ ID NOs:25,40,26和41；
(47)分别为SEQ ID NOs:25,39,26和42；
(48)分别为SEQ ID NOs:25,40,26和42；
(49)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和45；
(50)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和45；
(51)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和46；
(52)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和46；
(53)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和49；
(54)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和49；
(55)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和50；
(56)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和50；
(57)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和53；
(58)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和53；
(59)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和54；
(60)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和54；
(61)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和57；
(62)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和57；
(63)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和58；或
(64)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和58。
在某些实施例中，分离出的双特异性抗体或其抗原结合片段是抗CD47和/或抗CLDN18.2双特异性抗体，其中第一抗原结合域和第二抗原结合域的VH，CH1，VL和CL包含以下氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID:1,28,2,29,3,63,4和64；
(2)分别为SEQ ID:1,36,2,37,3,67,4和68；
(3)分别为SEQ ID:1,44,2,45,3,71,4和72；
(4)分别为SEQ ID:1,52,2,53,3,73,4和74；
(5)分别为SEQ ID:1,31,2,34,3,65,4和66；
(6)分别为SEQ ID:1,39,2,42,3,69,4和70；
(7)分别为SEQ ID:1,47,2,50,3,75,4和76；
(8)分别为SEQ ID:1,55,2,58,3,77,4和78；
(9)分别为SEQ ID:23,28,24,29,59,63,60和64；
(10)分别为SEQ ID:23,36,24,37,59,67,60和68；
(11)分别为SEQ ID:23,44,24,45,59,71,60和72；
(12)分别为SEQ ID:23,52,24,53,59,73,60和74；
(13)分别为SEQ ID:25,31,26,34,61,65,62和66；
(14)分别为SEQ ID:25,39,26,42,61,69,62和70；
(15)分别为SEQ ID:25,47,26,50,61,75,62和76；或
(16)分别为SEQ ID:25,55,26,58,61,77,62和78。
在某些实施例中，分离出的双特异性抗体或其抗原结合片段包含一种抗免疫细胞调节剂(ICM)的抗体或其抗原结合片段臂，可以特异性结合ICM，尤其是人ICM。例如，ICM可以筛选自CD3,CD16,CD27,CD28,CD40,CD122,NKp46,OX40,4-1BB,GITR,ICOS,CTLA-4,PD-1,LAG-3,TIM-3,VISTA,SIGLEC7,SIGLEC9,KIR,BTLA,B7-H3以及其他细胞表面免疫调节分子中。
在某些实施例中，抗ICM抗体或抗原结合片段即抗CD3抗体或其抗原结合片段，能特异性结合CD3，尤其是人CD3。分离出的抗CD3抗体或其抗原结合片段可以例如包含分别含有氨基酸序列为SEQ ID:9,10,11和12的VH，CH1，VL和CL。
在某些实施例中，分离出的双特异性抗体或抗原结合片段是抗CD3/抗DLL3双特异性抗体，第一抗原结合域特异性结合CD3，尤其是人源CD3，第二抗原结合域特异性结合DLL3，尤其是人源DLL3。
在某些实施例中，分离出的双特异性抗体或抗原结合片段是抗CD3/抗DLL3双特异性抗体，第一抗原结合域包含氨基酸序列分别为SEQ ID:9,10,11和12的VH，CH1，VL和CL，第二抗原结合域包含氨基酸序列分别为SEQ ID:13,14,15和16的VH，CH1，VL和CL。
同时提供了编码本发明公开的双特异性抗体或抗原结合片段的核酸。
同时提供了核酸编码本发明公开的双特异性抗体或抗原片段所需的载体。
同时提供了核酸编码本发明公开的双特异性抗体或抗原片段所需载体的宿主细胞。
在某些实施例中，提供了包含本发明中分离出的双特异性抗体或抗原结合片段的药物组合物及药学上可接受的载体。
同时提供了靶向CD47和TAA(例如CLDN18.2)的方法，它们两者都通过激活巨噬细胞介导的癌细胞吞噬作用在需要它们的受试者癌细胞表面上表达，包括向需要治疗的受试者施用本发明的药物组合物。
同时提供了通过接合T细胞靶向在需要它的受试者的癌细胞表面表达的DLL3的方法，包括向需要治疗的受试者施用本发明的药物组合物。
同时提供了靶向一种或两种在癌细胞表面表达的抗原的方法，包括使用CD47阻断诱导的巨噬细胞介导的吞噬作用的激活或CD3介导的T细胞活化，包括向受试者施用本发明的药物组合物。
同时提供了在需要治疗的受试者中治疗癌症的方法，包括向受试者施用本发明的药物组合物。所述癌症可以是任意实体瘤或液体瘤，例如，包括但不限于肺癌，胃癌，食道癌，胆管癌，胆管癌，结肠癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱尿路上皮癌，转移性黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，头颈癌，胰腺癌，神经胶质瘤，胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓系白血病(AML)和其他液体肿瘤。
同时提供了生产本发明中分离出的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括含有编码双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，能在条件下生产双特异性抗体或其抗原结合片段，从细胞或培养物中回收双特异性抗体或其抗原结合片段。
还提供了生产包含本发明中分离出的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体结合以获得该药物组合物。
附图的简要说明
上文的概述和下文具体描述的本申请优选实施例，结合附图阅读将得到更好的理解。但应当理解，本申请不仅限于应用在附图中所示的实施例中。
图1显示了分别具有mAb1臂和mAb2臂的双特异性抗体(bsAb)的结构示意图。两条臂都具有不同的重链VH和轻链VL区；双特异性抗体的重链(HCs)和轻链(LCs)分别位于IgG1和κ的主链上，作为一个展示实例。在两个HC的CH3区引入孔中旋钮(KiH)突变以促进异二聚体的形成。此外，分别向两个CH3区引入半胱氨酸残基，促进链间二硫键的形成以使异二聚体更稳定。H1和L1分别是mAb 1臂的重链和轻链，H2和L2分别是mAb 2臂的重链和轻链。
图2A-2F显示了各种抗体成分的序列。图2A为人类IgG1(SEQ ID NO:17),IgG2(SEQID NO:18),IgG3(SEQ ID NO:19)和IgG4(SEQ ID NO:20)的CH1区的排列。图2B为人类κ型(SEQ ID NO:21)和λ型(SEQ ID NO:22)轻链的CL区的排列。图2C-2D为抗CD47单克隆抗体和抗CLDN18.2单克隆抗体的VH区(图2)和VL区(图3)序列。图2E-2F为抗CD3单克隆抗体(VH:SEQ ID NO:5；VL:SEQ ID NO:6)和抗DLL3(VH:SEQ ID NO:7；VL:SEQ ID NO:8)单克隆抗体的VH区(图2E)和VL(图2F)区序列。高亮突出展示了通过Kabat方法确定的CDR区。*代表已知的等位基因变异位点。
图3A-3Q显示了在标准转染率下构建带多种电荷对的双特异性抗体的分析。图3A-3B为桥连ELISA法分析纯化的蛋白质A样品的结果，样品来自转染了指定的双特异性抗体的ExpiCHO-S细胞的培养基。图3C-3N为纯化后的蛋白质A样品的CEX-HPLC(阳离子交换色谱高效液相色谱法)分析，样品来自转染了指定的双特异性抗体或抗体主要杂质标样的ExpiCHO-S细胞的培养基。图3O-3Q显示了蛋白质A纯化样品的液相色谱/质谱(LC/MS)分析，样品来自转染了指定的双特异性抗体的ExpiCHO-S细胞的培养基。WT是图1中描述的具有抗CD47(mAb1臂)和抗CLDN18.2(mAb2臂)的双特异性抗体；其他的双特异性抗体包含表3中描述的WT结构的变种。每种双特异性抗体的主要杂质标样被生成，并和该双特异性抗体一起用CEX-HPLC法分析：抗CD47结的同源二聚体/半mol.，来自双特异性抗体设计中的抗CD47HC和LC转染的ExpiCHO-S细胞培养基的蛋白A纯化样品；抗CLDN18.2旋钮的同源二聚体/半mol.，来自用双特异性抗体设计的抗CLDN18.2 HC和LC转染的ExpiCHO-S细胞培养基的蛋白A纯化样品；2X抗CD47 LC错配(也称为2X抗CD47 LC)，蛋白A纯化样品来自转染了双特异性抗体设计中的抗CD47 HC和LC以及抗CLDN18.2 HC的ExpiCHO-S细胞培养基，；2X抗CLDN18.2LC错配(也称为2X抗CLDN18.2 LC)，蛋白A纯化样品来自转染了双特异性抗体设计中的抗CLDN18.2 HC和LC以及抗CD47 HC的ExpiCHO-S细胞培养基。
图4A-4L显示了偏向性DNA转染率下带有不同“EK”电荷对的双特异性抗体的分析。图4A显示了蛋白质A纯化样品的桥连ELISA法分析结果，样品来自于在偏向性DNA率(biasedDNA ratio)下转染了indicated双特异性抗体的ExpiCHO-S细胞培养基。图4B显示了蛋白质A纯化样品的CEX-HPLC分析。图4C-4D显示了蛋白质A纯化样品的LC/MS分析，样品来自转染了带有DNA偏向率的双特异性抗体的ExpiCHO-S细胞培养基。图4E-4F显示了指示蛋白质A样品的CEX-FPLC(快速蛋白液相色谱的阳离子交换色谱)分析，用线性pH梯度纯化的双特异性抗体样品。图4G显示了图4E-4F中不同峰值样品的桥连ELISA分析结果。图4H-4L显示了图4E-4F中CEX-FPLC色谱法峰值的LC/MS分析。
图5A-5F显示了标准DNA转染率下带不同“KE”电荷对的双特异性抗体的分析。图5A显示了线性pH梯度下目标蛋白A纯化的双特异性抗体样品的CEX-FPLC分析。图5B显示了图5A中不同峰值的样品的桥连ELISA分析。图5C-5F显示了图5A中CEX-FPLC色谱法峰值的LC/MS分析。
图6A-6F显示了带“EK”电荷对的逐步CEX-FPLC纯化和分析。用CEX-FPLC法分析了蛋白质A纯化样品，样品来自偏向性DNA转染率下转染了不同种双特异性抗体的ExpiCHO-S细胞培养基，并采用优化的逐步纯化方法纯化各双特异性抗体(图6A)。样品来自图6A中逐步CEX-FPLC分析的峰值样品用桥连ELISA法分析了双特异性活性，以及使用LC/MS分析了每个峰值样品的纯度(图6C-6F)。
图7A-7K显示了带“ekEK”或“keKE”电荷对的双特异性抗体的分析。图7A显示了蛋白A纯化样品的桥连ELISA分析结果，样品来自用指示双特异性抗体转染的ExpiCHO-S细胞培养基。图7B-7I显示了蛋白质A纯化样品的CEX-HPLC分析，样品来自转染了指示双特异性抗体或它们各自的主要杂质标样的ExpiCHO-S细胞培养基。图7J-7K显示了蛋白质A纯化样品的LC/MS分析，样品来自转染了指示双特异性抗体的ExpiCHO-S细胞。
图8A-8L显示了带“ekEK”或“keKE”电荷对的指示蛋白质A纯化双特异性抗体的CEX-FPLC分析结果，以及对每个峰值的桥连ELISA和LC/MS分析。图8A和8G分别显示了“ekEK”和“keKE”双特异性抗体的CEX-FPLC分析，使用线性pH梯度。图8B和8H分别显示了图8A和8G的不同峰值样品的桥连ELISA分析结果。图8C-8F显示了图8A上CEX-FPLC色谱法峰值的LC/MS的分析。图8I-8L显示了图8G上CEX-FPLC色谱法峰值的LC/MS的分析。
图9A-9J显示了逐步CEX-FPLC法纯化的蛋白质A纯化的带电荷对的双特异性抗体，以及对每个峰值的桥连ELISA和LC/MS分析。蛋白质A纯化样品用CEX-FPLC分析，样品来自用不同种双特异性抗体转染的ExpiCHO-S细胞培养基，以及用优化的逐步纯化方法纯化每种双特异性抗体(图9A和9E)。图9A和9E的逐步CEX-FPLC法可收集的峰值样品用桥连ELISA法分析其双特异性活性(图9B和9F)，以及用LC/MS分析每个峰值的纯度(图9C-9D和9G-9J)。
图10A-10C显示了用不同分析方法分析的抗CD3/抗DLL3双特异性抗体bsAb_33的纯度。图10A是HIC(疏水作用色谱)HPLC分析的纯化bsAb_33，用几个杂质标样作对比；图10B是强阳离子交换(SCX)HPLC分析的纯化bsAb_33，用几个杂质标样作对比；图10C是SEC(尺寸排阻色谱法)HPLC分析的纯化bsAb_33。
图11A-11B显示了抗CD3/抗DLL3双特异性抗体bsAb_33的分析结果。图11A显示了用抗CD3/抗DLL3双特异性抗体bsAb_33交联的SHP-77细胞(表达DLL3)和Jurkat细胞。图11B显示了在SHP-77细胞(表达DLL3)存在的情况下抗CD3/抗DLL3双特异性抗体bsAb_33介导的报告Jurkat细胞活化。抗DLL3阻断mAb是bsAb_33的抗DLL3臂的单克隆版本；抗CD3阻断mAb是bsAb_33的抗CD3臂的单克隆版本。
发明的具体描述
背景部分和整个说明书中引用或描述了多个出版物、文章和专利，其中每一个都以引用的形式完整地并入本文。对已包含在本说明书中的文件、行为、材料、设备、物品或类似内容的讨论是为了提供本发明的背景。这些讨论并不承认任何或所有上述事项构成关于任何公开或要求保护的发明的现有技术的一部分。
除非另有定义，本文中使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。除此以外，本文使用的某些术语的含义在说明书中由陈述。
必须注意的是，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用，除非在上下文中另有明确规定。
除非另有说明，任何数值在所有情况下都由“大约”修饰，例如此处描述的浓度或浓度范围。因此，数值通常为所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样地，1％至10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。如本文所用，数值范围的使用明确包括所有可能的子范围，该范围内的所有单个数值，包括此类范围内的整数和分数值，除非上下文明确指出。
除非另有说明，一系列成分前的“至少”一词应理解为指的是系列中的每个成分。本领域技术人员将认识到或能够仅用常规实验来确定许多等同于本文描述的本发明的具体实施例。所述等同实施例被意在被本发明所包含。
本文所用的“包括”、“包含”、“具有”或其他类似的词语，应被理解为包含所述完整物或完整物组，但不排除任何其他完整物或完整物组，旨在非排他性或开放式性。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、过程、方法、条款或设备不一定仅限于这些元素，而是可以包括未明确列出的该组合物、混合物、过程、方法、物品或设备的其他元素。此外，除非另有明确说明，“或”是指包容性或而非排他性或。例如，条件A或B满足以下任一条件：A为真(或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，A和B均为真(或存在)。
本文所用到的多个列举的元素之间的结合术语“和/或”应被理解为包括单个的以及组合的选项。例如，当两个元素由“和/或”连接时，第一种选项是指只有第一个而没有第二个元素的适用性，第二种选项是指只有第二个而没有第一个元素的适用性，第三种选项是指同时有第一个和第二个元素时的适用性。这些选项中的任何一个应被理解为属于该含义，因此满足本文中使用术语“和/或”的要求。
如本文所用，说明书全文和权利要求中使用的术语“组成”或类似变体表示包含任何被列举的完整物或完整物组，但是不允许额外的完整物或完整物组添加到指定的方法、结构或组合中。
如本文所用，术语“基本上由”或诸如“基本上由”或“基本上由”等变体，如在整个说明书和权利要求中使用的，表示包括任何所列举的整数或整数组，以及可选择性地包括任何不实质性改变指定方法、结构或组成的基本或新颖属性的完整物或完整物组。见M.P.E.P.§2111.03。
如本文所用，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人类。本文所用的术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。所述哺乳动物包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人类等，更优选为人类。
附图中用“右”、“左”、“下”和“上”等词来指示方向。
还应当理解的是，本文在指代优选发明的组分的尺寸或特征时使用的“大约”、“大约”、“一般”、“实质上”以及类似的术语，表明所描述的尺寸/特征不是严格的边界或参数，不排除有微小变化但中功能相同或相近的，正如具有本领域普通技能的人所理解的那样。至少，包含数值参数的此类引用将包括使用本领域所接受的数学和工业规则(例如舍入、测量或其他系统性误差、制造公差等)，不会改变最小有效数字。
如本文所用，说明书和权利要求中使用的术语“不同的重链”或“不同的轻链”表示重链或轻链具有彼此不相同的序列。
在两个或多个核酸或多肽序列(例如双特异性抗体、抗CD3抗体、抗DLL3抗体、抗CD47抗体、抗CLDN18.2抗体、抗CD3/抗DLL3双特异性抗体、抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体、DLL3多肽及编码的多聚核苷酸、CD3多肽及编码的多聚核苷酸、CD47多肽及编码的多聚核苷酸、CLDN18.2多肽及编码的多聚核苷酸)的上下文中提到的术语“相同”或“一致性”百分比，指的是在比较和对齐以获得最大对应性时，两个或多个序列或子序列相同，或有特定占比的氨基酸残基或核苷酸相同，使用以下序列比较算法之一或通过目视检查的方法进行衡量。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与其进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的一致性百分比。
可以通过以下方法进行序列最优比对，例如Smith&Waterman的局部同调算法(Adv.Appl.Math.2:482(1981))，Needleman&Wunsch的同调比对算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))，Pearson&Lipman的相似搜索法(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988))，用计算机执行以上算法(GAP,BESTFIT,FASTA,Wisconsin Genetics Software Package里的TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI)，或是用目视检查(参见F.M.Ausubel等人主编的《Current Protocols in Molecular Biology》，CurrentProtocols是Greene Publishing Associates公司和John Wiley&Sons公司的合资企业(1995Supplement)(Ausubel))。
BLAST和BLAST 2.0算法是适用于确定序列相似性和一致性百分比的算法示例，分别在Altschul等.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等.(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中被描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。此算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短单词来识别高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的单词比对时，这些短单词匹配或满足某些正值阈值分数T。T称为邻域单词分数阈值(Altschul等,同上)。这些初始邻域词命中充当启动搜索以查找包含它们的较长HSP的种子。然后单词命中沿每个序列向两个方向扩展，以尽可能增加累积比对分数。
对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的加分；始终>0)和N(不匹配残基的减分；始终<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，用一种评分矩阵来计算累积分数。在以下情况下，单词命中在每个方向上的扩展将停止：累积对齐分数从其最大值下降数量X；累积分数为零或以下，因为累积了一个或多个负分残差比对；或到达任一序列的末尾。BLAST算法的参数W、T和X决定了对比的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望(E)为10，M＝5，N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3、期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
除了计算序列一致性百分比外，BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(例如见Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，它指示了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然匹配的概率。例如，如果试验核酸与参比核酸的最小总和概率小于约0.1，则认为核酸与参考序列相似，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001。
两个核酸序列或多肽实质上相同的进一步迹象是，由第一个核酸编码的多肽与由第二个核酸编码的多肽在免疫上产生交叉反应，如下所述。因此，当其中两种肽的区别仅在于保守的替代时，两个多肽通常实质上相同。两个核酸序列实质上相同的另一个迹象是，两个分子在严格的条件下相互杂交。
如本文所用，术语“多核苷酸”同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”，是指任意多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰后的RNA或DNA。“多聚核苷酸”包括但不限于单链和双链DNA，单链和双链混合的DNA，单链和双链RNA，单链和双链混合的RNA，由DNA和RNA组成的杂交分子，可以是单链的，或者更典型的是双链或单链和双链区域的混合物。此外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或同时包含RNA和DNA的三链区域。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及具有为了稳定性或其他原因而修饰主链的DNA或RNA。“修饰”碱基包括例如三苯化碱基和如肌苷等不常见的碱基。由于DNA和RNA可以进行各种修饰，因此“多核苷酸”包括自然界中典型存在的化学、酶或代谢修饰形式的多核苷酸，也包括有病毒和细胞特征的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还包括相对较短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
如本文所用，术语“载体”是一种复制子，可以可操作性地插入进另一个核酸片段，以便进行该片段的复制或表达。
本文所用的术语“宿主细胞”是指包含本发明中的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施例中，“宿主细胞”是指用本发明中的核酸分子转染的细胞。在另一个实施例中，“宿主细胞”是这种转染细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可能与亲本细胞相同，也可能不相同，原因可能是后代可能发生的突变或环境影响，或核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
本文所用的术语“表达”是指基因产物的生物合成过程。该术语包括将基因转录为RNA。该术语还包括将RNA翻译成一种或多种多肽，并进一步包括所有自然发生的转录后和翻译后修饰。表达的双特异性抗体可以在宿主细胞的细胞质内，也可以进入细胞外环境，例如细胞培养的生长培养基，或者锚定在细胞膜上。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可以指由氨基酸组成的、可以被本领域技术人员识别为蛋白质的分子。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以在本文中互换使用，以指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可以是直链的或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。上述术语还包括经过自然修饰或经过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的结合。定义中还包括，例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)的多肽，以及本领域已知的其它修饰。
本文描述的肽序列是根据通常的惯例编写的，其中肽的N末端区域在左侧，C末端区域在右侧。尽管氨基酸的异构体形式是已知的，但除非另有明确说明，否则表示的是氨基酸的L型。
如本文所用，术语“CD47”是指属于免疫球蛋白超家族的多跨膜受体，已被认为参与多种细胞过程，包括细胞迁移、粘附和T细胞功能。CD47，也称为整合素相关蛋白(IAP)，卵巢癌抗原(OA3)，Rh相关抗原和MER6，最初作为人类卵巢癌的肿瘤抗原被识别，随后被证明在多种人类肿瘤类型上表达，包括血液系统瘤和实体瘤。CD47与信号调节蛋白α(SIRP，一种在巨噬细胞上表达的抑制蛋白)之间的相互作用可防止表达CD47的细胞的吞噬作用。CD47在几乎所有非恶性细胞上也以低水平表达。术语“人源CD47”是指来源于人类的CD47。人源CD47的示例性氨基酸序列展示在GenBank中，编号为No.NP_001768.1。
本文所用的术语“CLDN18.2”是指密蛋白(claudin)18变体2、claudin 18.2、claudin-18.2或claudin-18a2.1，属于claudin跨膜蛋白家族。CLDN18.2在胃中上皮细胞表面特异性表达(Niimi等,Mol Cell Biol.2001；21:7380-7390)，成为上皮细胞之间紧密连接的主要结构成分之一(Sahin等,Physiol Rev.2013；93:525-569)。术语“人源CLDN18.2”是指源自人类的CLDN18.2。人源CLDN18.2的示例性氨基酸序列展示在GenBank中，编号No.AAL15637.1。
本文所用的术语“DLL3”是指德尔塔样标准Notch配体3(DLL3)，也称为delta样3或delta样蛋白3，是在早期发育过程中体节分割(somite segmentation)的必要成分(Dunwoodie等.,Development 129:1795-806(2002))。
不同于反式激活Notch受体信号传导的哺乳动物源Notch家族配体DLL1，DLL4，JAG1和JAG2，DLL3主要局限于高尔基体，无法激活Notch信号(Chapman等,Hum Mol Genet20(5):905-16(2011)和Geffers等.,J Cell Biol 178(3):465-76(2007))。在正常发育过程中，DLL3通过与Notch和DLL1相互作用来抑制顺式和反式作用的Notch途径激活(Chapman等,Hum Mol Genet20(5):905-16(2011))。DLL3在除脑外的成人正常组织中通常不存在或以非常低的水平存在，但在肺癌、睾丸癌、胶质瘤和黑色素瘤样本中过度表达(Uhlen等,Science 357(6352):eaan2507(2017))。此外，DLL3可在小细胞肺癌(SCLC)和大细胞神经内分泌癌(LCNEC)肿瘤细胞表面检测到(Saunders等,Sci Transl Med7(302):302ra136(2015)和Sharma等.,Cancer Res 77(14):3931-41(2017))，使其成为癌症治疗中单克隆抗体的潜在靶标。因此，抗DLL3单克隆抗体可用于特异性靶向表达DLL3的肿瘤细胞，从而作为潜在的抗癌疗法。术语“人源DLL3”是指源自人类的DLL3。人源DLL3的示例性氨基酸序列展示在GenBank中，编号No.NP_058637.1。
如本文所述，术语“CD3”是指分化簇3，它是一种多亚基蛋白复合物，作为T细胞受体的共受体(TCR)(Dong等,Nature 573(7775):546-552(2019))。
TCR与靶细胞表面的肽MHC(pMHC)结合诱导TCR-CD3复合物的聚集，并激活由CD3ζ链介导的细胞内信号传导(Annu Rev Immunol.27:591–619(2009))。CD3是T细胞活化所必需的，其pMHC非依赖性激活通过治疗剂(例如在CAR-T细胞和基于CD3的T细胞接合剂中)在动员T细胞杀死肿瘤细胞方面非常有效(Brown and Mackall,Nat Rev Immunol 19(2):73-74(2019)和Clynes和Desjarlais,Annu Rev Med 70:437-450(2019))。人源CD3的ε亚基的示例性氨基酸序列展示在GenBank中，编号No.NP_000724.1。
如本文所述，“肿瘤相关抗原(TAA)”是指任何细胞表面肽和/或抗原或细胞表面肽和/或抗原及其翻译后修饰部分(如糖基化)的组合，其存在于肿瘤中的水平高于正常组织中的水平。肿瘤中特异性存在的一些肿瘤相关抗原也称为肿瘤特异性抗原(TSA)。肿瘤相关抗原的例子包括由致癌病毒编码的病毒蛋白；突变的癌蛋白或肿瘤抑制因子；肿瘤细胞上和/或肿瘤细胞中过表达的正常蛋白质；细胞表面蛋白的翻译后修饰；癌胎蛋白，其表达通常在发育阶段受到限制，但在成人组织中不受限制；以及细胞类型特异性蛋白，其表达仅限于非必需组织。
如本文所述，“免疫细胞调节剂(ICM)”是指在免疫细胞表面表达并调节免疫细胞功能的任何细胞表面分子，例如蛋白质。ICM包括刺激性分子和抑制性分子。刺激性ICM与具有某些特征的特定抗体或抗原结合片段特异性结合时，可以介导免疫细胞的激活。抑制性ICM在与配体/相互作用分子伴侣结合时抑制免疫细胞的活性，其可以被具有某些特征的特定抗体或抗原结合片段阻断，从而导致免疫细胞的激活。这些免疫细胞可以是T细胞，NK细胞，巨噬细胞或免疫系统中其他类型的细胞。ICM的例子包括但不限于CD3,CD16,CD27,CD28,CD40,CD122,NKp46,OX40,4-1BB,GITR,ICOS,CTLA-4,PD-1,LAG-3,TIM-3,VISTA,SIGLEC7,SIGLEC9,KIR,BTLA,和B7-H3。
本文所用的术语“完全阻断”或“完全阻隔”是指完全抑制靶标抗原(例如CD3等ICM)与靶标抗原结合域的结合(例如，单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段)。靶标抗原结合的完全抑制意味着靶抗原与靶抗原结合域没有结合(例如0％结合)。
本文所用的术语“部分阻断”或“部分阻隔”是指不完全抑制靶标抗原(例如CD3等ICM)与靶标抗原结合域(例如，单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段)结合。靶标抗原结合的不完全抑制意味着靶标抗原与靶标抗原结合域至少有某种程度的结合(例如1％至99％的结合)。
抗体和双特异性抗体
本发明总体涉及分离的双特异性抗体，包括每个臂中CH1和CL界面处的电荷突变，以改进同源链配对偏好和/或修改和区分双特异性抗体本身的物理性质和错误配对的杂质，以促进用阳离子交换色谱法纯化。
生产由两条不同的重链(HC)和轻链(LC)组成的双特异性抗体有难度，因为两条重链和两条轻链会倾向错误配对，导致在制造过程中产生难以消除的不需要的产品；即使在纯化过程中可以消除错配产生的不需要的产物，这种错配也会降低目标双特异性抗体产物的生产效率。通过将单臂策略中的“移动链间二硫键”(PCT/US2020/063066，2020年12月3日提交，全文通过引用并入本文)与电荷对相结合，同时引入孔中旋钮和Fc区域中形成二硫键的半胱氨酸突变，使用离子交换色谱和疏水相互作用色谱等常规方法可以生产效率更高且易于纯化地异二聚体双特异性抗体。这种双特异性抗体的生产，包括但不限于抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体和抗CD3/抗DLL3双特异性抗体。
本发明总体涉及分离出的带电荷对的双特异性抗体，或带组合的电荷对，或带具有移动链间二硫键的电荷对的组合，同时保持第二臂上的天然链间二硫键。特别地，本发明总体涉及针对在同一癌细胞上表达的两种抗原的双特异性抗体，一种抗原在癌细胞上表达，另一种抗原作为可溶性配体表达，或两种抗原一种在癌细胞上表达，另一种抗原表达在不同细胞上，例如免疫细胞；涉及编码双特异性抗体的核酸和表达载体；涉及含有所述载体的重组细胞；以及涉及包含所述双特异性抗体的组合物。还提供了制造双特异性抗体的方法，以及使用双特异性抗体治疗疾病(包括癌症)的方法。本发明的双特异性抗体具有一种或多种理想的功能特性，包括但不限于对两种抗原的高亲和力结合，对两种抗原的高特异性，诱导效应分子介导的肿瘤细胞裂解的能力，刺激补体依赖性细胞毒性的能力(CDC)，抗体依赖性的吞噬作用(ADPC)，和/或针对表达一种或两种抗原的细胞的抗体依赖性细胞介导的毒性作用(ADCC)，调解招募结合药物的能力，以及单独给药或与其他抗癌疗法联合给药时抑制受试者和动物模型中肿瘤生长的能力。本发明的双特异性抗体可以是两个臂与同一细胞上的两种不同抗原结合并介导多种生物学效应的抗体。两个臂中的一个可以是CD47，它可以被阻断以诱导巨噬细胞介导的吞噬作用。本发明的双特异性抗体也可以作为免疫细胞接合剂，例如T细胞接合剂，其一个臂与癌细胞上的抗原结合，另一个臂与T细胞结合以介导T细胞依赖性癌细胞杀伤。在双特异性抗体各臂的CH1和CL区中引入的带相反电荷的氨基酸可以增强每个重链与其相应的轻链(H1L1和H2L2)的正确同源配对。带相反电荷对可以更好地区分双特异性抗体和生产过程中细胞表达的潜在杂质的物理性质，从而促进目标双特异性抗体的纯化和生产。
如本文所用，术语“抗体”是广义的，包括免疫球蛋白或包括人源、人源化、复合和嵌合抗体以及单克隆或多克隆的抗体片段。一般情况下，抗体是表现出与特定抗原结合特异性的蛋白质或肽链。抗体结构是众所周知的。免疫球蛋白可分为五大类(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)，具体取决于重链恒定结构区的氨基酸序列。IgA和IgG进一步细分为同型抗原IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可以是五大类或相应的子类中的任何一类。优选地，本发明的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。脊椎动物物种的抗体轻链可以根据其恒定区的氨基酸序列分为两种明显不同的类型，即κ和λ。因此，本发明的抗体可以含有κ或λ轻链恒定结构区。根据具体实施例，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链恒定区和轻链恒定区外，抗体还包含一个由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合域，每个区都包含三个结构域(即互补性决定区1-3；CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区也指LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链可变区也指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
有几种系统用于抗体中氨基酸残基的编号。Kabat编号方法是一种基于抗体可变区域的方案(Elvin A.Kabat等,《免疫学感兴趣的蛋白序列》(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)第5版.(1991))。欧盟编号系统广泛用于恒定区(包括部分CH1、铰链和Fc)(Elvin A.Kabat等.,《免疫学感兴趣的蛋白序列》第5版.(1991))。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含有其他具有不同抗原特异性抗体的抗体(例如，与DLL3特异性结合的分离的抗体中基本上不含不与DLL3结合的抗体，与CD3特异性结合的分离的抗体中基本上不含不与CD3结合的抗体，与CD3和DLL3特异性结合的双特异性抗体中基本上不含不与CD3和DLL3结合的抗体)。此外，分离的抗体基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从实质均质抗体群中获得的抗体，即组成抗体群的个体抗体是相同的，除了少量可能存在的自然发生的突变。本发明的单克隆抗体可以通过杂交瘤法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或重组DNA法制备。例如，单克隆抗体可以由杂交瘤法产生，包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠或大鼠)获得的B细胞，其基因组包括人源重链转基因和轻链转基因。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指如下的抗体片段，例如双抗抗体，Fab，Fab'，F(ab')2，Fv片段，二硫键稳定的Fv片段(dsFv)，(dsFv)2，双特异性dsFv(dsFv-dsFv')，二硫键稳定的双抗抗体(ds diabody)，单链抗体分子(scFv)，单域抗体(sdab)，scFv二聚体(二价双抗抗体)，由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体，骆驼单域抗体，纳米抗体，单价结构域抗体，双价结构域抗体，以及其他任何能与抗原结合但不构成完整抗体结构的抗体片段。抗原结合片段与亲本抗体或亲本抗体片段能结合的抗原相同。根据具体实施例，抗原结合片段包括轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd段。根据其它具体实施例，抗原结合片段包括Fab和F(ab')。
本文所用的术语“单链抗体”是指本领域中常规的单链抗体，包括由约15至20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。本文所用的术语“单域抗体”是指本领域中常规的单域抗体，包括重链可变区和重链恒定区或仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人源抗体”是指由人产生的抗体或由本领域已知技术制成的具有与人源抗体相对应的氨基酸序列的抗体。人源抗体的定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一种人源重链和/或轻链多肽的抗体。
本文所用的术语“人源化抗体”是指非人抗体，其被修饰以增加与人抗体的序列同源性，使得抗体的抗原结合特性得以保留，但其在人体内的抗原性降低。
本文所用的术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两种或多种物种的抗体。轻链和重链的可变区通常对应来自一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区，具有所需的特异性、亲和力和能力，而恒定区对应来自另一种哺乳动物(例如人类)的抗体序列，以避免在该物种中引发免疫应答。
本文所用的术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中，所述第一个免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，所述第二个免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施例中，第一表位和第二表位位于同一个抗原上，如同一个蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施例中，第一表位和第二表位重叠或基本重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位不重叠或实质上不重叠。在一个实施例中，第一和第二表位位于不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在一个实施例中，多特异性抗体包括第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施例中，多特异性抗体指的是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
本文所用的术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两种抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施例中，第一表位和第二表位位于同一个抗原上，例如，同一个蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)。在一个实施例中，第一表位和第二表位重叠或基本重叠。在一个实施例中，第一表位和第二表位位于不同的抗原上，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)。在一个实施例中，双特异性抗体包括对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列，以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施例中，双特异性抗体包括对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施例中，双特异性抗体包括对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
如本文所用，术语“电荷对”是指一对氨基酸，其中一对带正电荷，另一个带负电荷，其可以通过分别替换双特异性抗体第一臂的重链CH1区和轻链CL区中的天然氨基酸残基来引入，同时也可以通过分别替换双特异性抗体第二臂轻链CL区和重链CH1区的天然氨基酸残基，从而引入同一对正电荷和负电荷氨基酸。或者，正电荷和负电荷氨基酸可以通过氨基酸替换分别引入双特异性抗体第一臂的重链的VH区和轻链的VL区，同时，同一对正电荷和负电荷氨基酸可以通过氨基酸替换分别引入第二臂的轻链的VL区和重链的VH区。用于形成电荷对的氨基酸通常包括D/E(负电荷)和K/R(正电荷)。一旦引入CH1/CL区或VH/VL区，电荷对氨基酸在结构上非常接近，并有望通过相反的电荷增强同一臂的重链/轻链相互作用，并通过相同的电荷排除错配的重链/轻链相互作用(错配的重链和轻链来自两个不同的臂)。引入电荷对后的电荷分布如下：H1(CH1正电荷)/L1(CL负电荷)/H2(CH1负电荷)/L2(CL正电荷)或H1(CH1负电荷)/L1(CL正电荷)/H2(CH1正电荷)/L2(CL负电荷)。多个电荷对组合可以被并入CH1和CL界面，所有正电荷氨基酸引入CH1，所有负电荷氨基酸引入同一臂的CL，反之亦然，以满足上述分布模式。类似的方法可以应用于VH/VL界面。此外，还可以将一个或多个电荷对引入VH和VL的界面，并结合引入CH1/CL界面的一个或多个电荷对，引入同一链(H1，L1，H2或L2)的氨基酸通常具有相同的电荷，引入电荷对后的结果分布如下：H1(CH1和VH正电荷)/L1(CL和VL负电荷)/H2(CH1和VH负电荷)/L2(CL和VL正电荷)或H1(CH1和VH负电荷)/L1(CL和VL正电荷)/H2(CH1和VH正电荷)/L2(CL和VL负电荷)。电荷对替换也可以与其他修饰相结合，以进一步改善同源链配对偏好(分别为H1L1和H2L2)和/或使用离子交换色谱和/或HIC促进双特异性抗体的纯化。例如，除了电荷对替换之外，双特异性抗体的一个臂上的天然链间二硫键可以移动，而另一个臂具有天然链间二硫键(参见如WO2021/126538，通过引用将其全文并入本文)。
在描述电荷对时，G166D/E表示用D或E替换位置166(欧盟编号)处的G，在这种情况下，G166是敲入位点；D170D/E表示将D保持在位置170或用E替换位置170的D；所有其他替换都遵循相同的命名规则。
本文所用的“特异性结合CD3、DLL3及其组合”或“特异性结合CD47、CLDN18.2及其组合”的抗体是指与CD3、DLL3及其组合结合的抗体或与CD47、CLDN18.2及其组合结合的抗体，优选人源CD3、人源DLL3、人源CD47、人源CLDN18.2，KD为1×10-7M或更小，优选1×10-8M或更小，更优选5×10-9M或更小，1×10-9M或更小，5×10-10M或更小，或1×10-10M或更小。术语“KD”是指解离常数，它由Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。鉴于本公开，可以使用本领域的方法确定抗体的KD值。例如，抗体的KD可以通过使用表面等离子体共振来确定，例如通过使用生物传感器系统，例如系统，或使用生物层干涉测量技术，例如Octet RED96系统。
抗体的KD值越小，抗体与靶标抗原结合的亲和力就越高。
本文所用的术语“特异性结合”是指与对照抗原相比，靶抗原与抗体或其抗原结合片段的显著性结合，和/或与对照抗体或抗原结合片段相比，靶抗原与抗体或其抗原结合片段的显著结合，其中对照抗原通过序列和/或结构比较与靶抗原不同，并且对照抗体或抗原结合片段仅通过序列和/或结构比较显着且选择性地与其与靶抗原不同的相应抗原结合。
本文所用的术语“EC50”是指本发明的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的最大有效浓度的一半。EC50是指在指定的暴露时间内诱导基线和最大值之间的生物反应(即细胞死亡)的单克隆或双特异性抗体或其抗原结合片段的浓度。在某些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段或其双特异性抗体或抗原结合片段的EC50小于约1M，约1000nM至约100nM，约100nM至约10nM，约10nM至约1nM，约1000pM至约500pM，约500pM至约200pM，小于约200pM，约200pM至约150pM，约200pM至约100pM，约100pM至约10pM，或约10pM至约1pM。
另一个特定方面，本发明涉及分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
a.第一重链，H1；
b.第二重链，H2；
c.第一轻链，H1；以及
d.第二轻链，L2；
其中H1和L1组成第一臂，包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域，优选人源的第一抗原，H2和L2形成第二抗原结合域的第二臂，该第二抗原结合域特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原，其中
(a)H1和H2各自包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区域；
(b)L1和L2各自包括人κ轻链或人源λ轻链的CL区；
其中H1L1和H2L2各自包含选自下组的氨基酸替代电荷对：
(1)分别为H1的CH1区上的G166D/E，L1的CL区上的S114K/R，H2的CH1区上的G166K/R，以及L2的CL区上的S114D/E；
(2)分别为H1的CH1区上的T187D/E，L1的CL区上的D/N170K/R，H2的CH1区上的T187K/R，以及L2的CL区上的D/N170D/E；
(3)分别为H1的CH1区上的S131D/E，L1的CL区上的P119K/R，H2的CH1区上的S131K/R，以及L2的CL区上的P119D/E；
(4)分别为H1的CH1区上的A129D/E，L1的CL区上的S121K/R，H2的CH1区上的A129K/R，以及L2的CL区上的S121D/E；
(5)分别为H2的CH1区上的G166D/E，L2的CL区上的S114K/R，H1的CH1区上的G166K/R，以及L1的CL区上的S114D/E；
(6)分别为H2的CH1区上的T187D/E，L2的CL区上的D/N170K/R，H1的CH1区上的T187K/R，以及L1的CL区上的D/N170D/E；
(7)分别为H2的CH1区上的S131D/E，L2的CL区上的P119K/R，H1的CH1区上的S131K/R，以及L1的CL区上的P119D/E；
(8)分别为H2的CH1区上的A129D/E，L2的CL区上的S121K/R，H1的CH1区上的A129K/R，以及L1的CL区上的S121D/E；
在某些实施例中，两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中VH区具有不同的氨基酸序列。在某些实施例中，两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中CH1区具有不同的氨基酸序列。在某些实施例中，两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中Fc区具有不同的氨基酸序列。在某些实施例中，两个轻链L1和L2各自包括VL区和CL区，其中VL区具有不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，两个轻链L1和L2各自包括VL区和CL区，其中CL区具有不同的氨基酸序列。
在另一个特定方面，H1和H2形成异源二聚体。
在另一个特定方面，(a)在H1的CH1的G166，T187，S131或A129处引入带负电荷的氨基酸(D或E)(如上所述，在L1的CL中的相应位置引入带正电荷的氨基酸)，在H2的CH1中的相应残基处引入带正电荷的氨基酸(K或R)(如上所述，在L2的CL中的相应位置引入带负电荷的氨基酸)，H1的VH区和L1的VL区分别有Q39E和Q38K替换突变，H2的VH区和L2的VL区分别有Q39K和Q38E替换突变；(b)在H1的CH1的G166，T187，S131或A129引入带正电荷的氨基酸(如上所述，在L1的CL中的相应位置引入带负电荷的氨基酸)，并在H2的CH1中的相应残基处引入带负电荷的氨基酸(D或E)(如上所述，在L2的CL中的相应位置引入带正电荷的氨基酸)，H1的VH区和L1的VL区分别有Q39K和Q38E取代突变，H2的VH区和L2的VL区分别有Q39E和Q38K取代突变。
在另一个特定方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包括两个臂之一的CH1和CL区域，包括对应于氨基酸序列为SEQ ID NO：17、18、19或20(CH1)和SEQ ID NO：21或22(CL)上的氨基酸替换，其中CH1和CL区域中的氨基酸替换选自：
(1)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的F209C和C214X；
(2)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的F209C和C214X；
(3)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的V209C和C214X
(4)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的V209C和C214X；
其中X选自S、A或G。
在另一个特定方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包括抗CD47抗体或抗原结合片段臂和抗TAA抗体或其抗原结合片段臂，其中CD47和TAA在同一细胞上表达，能够与CD47和TAA两者特异性结合，优选人CD47和TAA。分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段可以包含氨基酸序列分别为SEQ ID:23,28,24和29的VH、CH1、VL和CL。
在另一个特定方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包括特异性结合CD47的第一抗原结合域，优选人源CD47，以及特异性结合CLDN18.2的第二抗原结合域，优选人源CLDN18.2。
在另一个特定方面，抗CD47抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，其氨基酸序列包括：
(1)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和29；
(2)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和29；
(3)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和30；
(4)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和30；
(5)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和33；
(6)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和33；
(7)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和34；
(8)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和34；
(9)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和37；
(10)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和37；
(11)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和38；
(12)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和38；
(13)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和41；
(14)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和41；
(15)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和42；
(16)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和42；
(17)分别为SEQ ID NOs:1,43,2和45；
(18)分别为SEQ ID NOs:1,44,2和45；
(19)分别为SEQ ID NOs:1,43,2和46；
(20)分别为SEQ ID NOs:1,44,2和46；
(21)分别为SEQ ID NOs:1,47,2和49；
(22)分别为SEQ ID NOs:1,48,2和49；
(23)分别为SEQ ID NOs:1,47,2和50；
(24)分别为SEQ ID NOs:1,48,2和50；
(25)分别为SEQ ID NOs:1,51,2和53；
(26)分别为SEQ ID NOs:1,52,2和53；
(27)分别为SEQ ID NOs:1,51,2和54；
(28)分别为SEQ ID NOs:1,52,2和54；
(29)分别为SEQ ID NOs:1,55,2和57；
(30)分别为SEQ ID NOs:1,56,2和57；
(31)分别为SEQ ID NOs:1,55,2和58；
(32)分别为SEQ ID NOs:1,56,2和58；
(33)分别为SEQ ID NOs:23,27,24和29；
(34)分别为SEQ ID NOs:23,28,24和29；
(35)分别为SEQ ID NOs:23,27,24和30；
(36)分别为SEQ ID NOs:23,28,24和30；
(37)分别为SEQ ID NOs:25,31,26和33；
(38)分别为SEQ ID NOs:25,32,26和33；
(39)分别为SEQ ID NOs:25,31,26和34；
(40)分别为SEQ ID NOs:25,32,26和34；
(41)分别为SEQ ID NOs:23,35,24和37；
(42)分别为SEQ ID NOs:23,36,24和37；
(43)分别为SEQ ID NOs:23,35,24和38；
(44)分别为SEQ ID NOs:23,36,24和38；
(45)分别为SEQ ID NOs:25,39,26和41；
(46)分别为SEQ ID NOs:25,40,26和41；
(47)分别为SEQ ID NOs:25,39,26和42；
(48)分别为SEQ ID NOs:25,40,26和42；
(49)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和45；
(50)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和45；
(51)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和46；
(52)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和46；
(53)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和49；
(54)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和49；
(55)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和50；
(56)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和50；
(57)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和53；
(58)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和53；
(59)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和54；
(60)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和54；
(61)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和57；
(62)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和57；
(63)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和58；或
(64)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和58。
在另一个特定方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段是抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体，其中第一抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，第二抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，包括以下氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID:1,28,2,29,3,63,4和64；
(2)分别为SEQ ID:1,36,2,37,3,67,4和68；
(3)分别为SEQ ID:1,44,2,45,3,71,4和72；
(4)分别为SEQ ID:1,52,2,53,3,73,4和74；
(5)分别为SEQ ID:1,31,2,34,3,65,4和66；
(6)分别为SEQ ID:1,39,2,42,3,69,4和70；
(7)分别为SEQ ID:1,47,2,50,3,75,4和76；
(8)分别为SEQ ID:1,55,2,58,3,77,4和78；
(9)分别为SEQ ID:23,28,24,29,59,63,60和64；
(10)分别为SEQ ID:23,36,24,37,59,67,60和68；
(11)分别为SEQ ID:23,44,24,45,59,71,60和72；
(12)分别为SEQ ID:23,52,24,53,59,73,60和74；
(13)分别为SEQ ID:25,31,26,34,61,65,62和66；
(14)分别为SEQ ID:25,39,26,42,61,69,62和70；
(15)分别为SEQ ID:25,47,26,50,61,75,62和76；或
(16)分别为SEQ ID:25,55,26,58,61,77,62和78。
在另一特定方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包括抗免疫细胞调节剂(ICM)抗体或其抗原结合片段臂，并且能够特异性结合ICM，优选人源ICM。ICM可以从例如CD3，CD16，CD27，CD28，CD40，CD122，NKp46，OX40，4-1BB，GITR，ICO，CTLA-4，PD-1，LAG-3，TIM-3，VISTA，SIGLEC7，SIGLEC9，KIR，BTLA，B7-H3和其他细胞表面免疫调节分子群中选择。
在另一个特定方面，抗ICM抗体或其抗原结合片段即抗CD3抗体或其抗原结合片段，并且能够与CD3(优选人源CD3)特异性结合。分离的抗CD3抗体或其抗原结合片段包括氨基酸序列分别为SEQ ID:9、10、11和12的VH、CH1、VL和CL区。
在另一特定方面，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段是抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或其抗原结合片段能够使表达DLL3的癌细胞与T细胞结合，并激活T细胞介导的对癌细胞的杀伤作用。在另一个特定方面，第一抗原结合域包括氨基酸序列分别为SEQ ID：9、10、11和12的VH、CH1、VL和CL，第二抗原结合域包括氨基酸序列分别为SEQ ID：13、14、15和16的VH、CH1、VL和CL。
本发明中全长的双特异性抗体可以如下例子所述的方式产生：通过在每个半分子中的重链CH3界面处引入取代物来生成例如两个单特异性二价抗体之间的Fab臂交换(或半分子交换)，以促进在无细胞环境中体外或使用共表达形成具有不同特异性的两个抗体半分子。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离合的结果。亲本单特异性抗体铰链区域中的重链二硫键减少。由此产生的亲本单特异性抗体之一的游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3结构域通过解离合释放和重组。Fab臂的CH3结构域可以设计为有利于异二聚化而不是同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，各自结合不同的表位，即CD3上的表位、DLL3上的表位及其组合，或CD47上的表位、CLDN18.2上的表位及其组合。
本文所用的“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两个重链的相互作用。本文所用的“同源二聚体”是指具有两个具有相同CH3氨基酸序列的重链的抗体。
本文所用的“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两个重链的相互作用。本文所用的“异源二聚体”是指具有两个具有不同CH3氨基酸序列的重链的抗体。
“孔中旋钮”策略(参见例如PCT公布号NO.WO2006/028936)可用于产生全长双特异性抗体。简要的，形成人源IgG中CH3结构域界面的特定氨基酸可以在影响CH3结构域相互作用的位置发生突变，以促进异二聚体的形成。将带有小侧链(旋钮)的氨基酸引入特异性结合第一抗原的抗体的重链中，将带有大侧链(旋钮)的氨基酸引入特异性结合第二抗原的抗体的重链中。两种抗体共表达后，由于带有“旋钮”的重链与带有“旋钮”的重链的优先相互作用从而形成异二聚体。形成旋钮和旋钮CH3替换对示例为(表示为第一重链的第一CH3域中的修改位置/第二重链的第二CH3域中的修改位置)：T366Y/F405A,T366W/F405W,F405W/Y407A,T394W/Y407T,T394S/Y407A,T366W/T394S,F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V.
可以使用其他策略，例如通过替换一个CH3表面上带正电荷的残基和第二个CH3表面上带负电的残基来利用静电相互作用促进重链异二聚化，如在以下专利中所述：美国专利No.2010/0015133；美国专利No.2009/0182127；美国专利No.2010/028637；或美国专利No.2011/0123532。在另一些策略中，异二聚化可以通过以下替换(表示为第一重链第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链第二CH3结构域中的修饰位置)来促进异二聚化：L351Y_F405AY407V/T394W，T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V，T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V，L351Y_Y407A/T366A_K409F，L351Y_Y407A/T366V K409FY407A/T366A_K409F，或T350V_L351Y_F405AY407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如在美国专利No.2012/0149876或美国专利No.2013/0195849中所述。
除上述方法外，本发明的双特异性抗体可以在无细胞环境中体外生成，方法是在两个单特异性同源二聚体抗体的CH3区域中引入不对称突变，并在还原条件下由两个亲本单特异性同源二聚体抗体形成双特异性异二聚体抗体，以允许二硫键异构化，参照PCT专利号No.WO2011/131746中描述的方法。在这些方法中，第一个单特异性二价抗体和第二个单特异性二价抗体被设计为在CH3结构域上有一定的替换，从而促进异二聚体的稳定性；将抗体在足以使铰链区域中的半胱氨酸产生二硫键异构化的还原条件下一起培育；从而通过Fab臂交换产生双特异性抗体。培育条件可以选择性地恢复到非还原条件。可以使用的例如以下的还原剂：2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫代赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、tris(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选从以下组中选择的还原剂：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和tris(2-羧乙基)膦。例如，在至少20℃的温度下，在至少有25mM 2-MEA或至少0.5mM二硫苏糖醇存在的情况下，pH为5-8，例如在pH为7.0或pH为7.4的情况下，培育至少90分钟。
本发明的全长双特异性抗体可以使用上述异二聚化方法和如下几种方法的组合来生成：(a)移动双特异性抗体一个臂上的HC/LC链间二硫键(参见例如WO2021/126538，其通过引用全部并入本文)；(b)将电荷对引入VH/VL界面；(c)将电荷对引入CH1/CL界面；或(d)将(a)-(c)中所述的部分或全部方法组合。
在另一个一般方面，本发明涉及编码本发明在的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离核酸。如本领域技术人员可以理解的，蛋白质的编码序列可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下(例如，替换、删除、插入等)改变。因此，本领域技术人员可以理解，编码本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸序列可以在不改变蛋白质的氨基酸序列的情况下被改变。
在另一个一般方面，本发明涉及一种编码本发明的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离核酸的载体。本领域技术人员已知的任何载体都可以使用，例如质粒、粘粒、噬菌体载体或病毒载体。在一些实施例中，载体是重组表达载体，例如质粒。载体可以包括任何建立表达载体的常规功能的元素，例如启动子、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记和复制起始点。启动子可以是构成性的、诱导性的或可抑制的启动子。许多能够向细胞递送核酸的表达载体是本领域已知的，可用于在细胞中产生抗体或抗原结合片段。常规的克隆技术或人工合成基因可用于生成本发明实施例中的重组表达载体。在本公开中，这种技术为本领域技术人员所熟知。
在另一个一般方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码本发明的双特异性抗体或抗原结合片段的分离的核酸载体。本领域技术人员已知的任何宿主细胞均可在本公开中用于重组表达本发明的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，宿主细胞是大肠杆菌TG1或BL21细胞(用于表达例如scFv或Fab抗体)、CHO-DG44或CHO-K1细胞或HEK293细胞(用于表达，例如全长IgG抗体)。根据具体实施例，重组表达载体通过化学转染、热休克或电穿孔等常规方法转化进宿主细胞，稳定地整合到宿主细胞基因组中，使得重组核酸得到高效表达。
在另一个一般方面，本发明涉及生产本发明中的双特异性抗体或抗原结合片段的方法，包括在生产本发明的双特异性抗体或抗原结合片段的条件下培养包含编码双特异性抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从细胞或细胞培养物(例如上清液)中回收双特异性抗体或抗原结合片段。表达的双特异性抗体或抗原结合片段可以从细胞中获得，并根据本领域已知的常规技术和本文所述的方法进行纯化。
药物成分
在另一个一般方面，本发明涉及一种药物组合物，包括分离的双特异性抗体其抗原结合片段和药学上可接受的载体。本文所用的术语“药物组合物”是指包含本发明抗体与药学上可接受的载体的产品。本发明的抗体和包含它们的组合物也可用于制造用于本文提及的用于治疗的药物。
本文所用的术语“载体”是指任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、脂质、含脂质的囊泡、微球、脂质体包封或本领域公知的用于药物制剂的其它材料。应当被理解的是，载体、赋形剂或稀释剂的特性将取决于特定应用的给药途径。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指不干扰本发明组合物的有效性或生物活性的无毒材料。根据具体实施例，在本公开中，任何适用于抗体的药物组合物的药学上可接受的载体都可以用于本发明中。
具有药学上可接受的载体的药物活性成分的配制是本领域已知的，例如，Remington：药学科学与实践(如第21版(2005年)，以及任一更新版本)。附加成分的例子包括但不限于缓冲液、稀释剂、溶剂、张力调节剂、防腐剂、稳定剂和螯合剂。一种或多种药学上可接受的载体可用于配制本发明的药物组合物。
在本发明的一个实施例中，所述药物组合物为液体制剂。液体制剂的优选例是水性制剂，即包含水的制剂。液体制剂可以包含溶液、悬浮液、乳液、微乳液、凝胶等。水性制剂通常包含至少50％w/w水，或至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％w/w水。
在一个实施例中，药物组合物可以配制成可注射剂，其可以通过注射装置(例如注射器或输液泵)进行注射。注射可以通过皮下、肌肉内、腹膜内、玻璃体内或静脉内给药。
在另一个实施例中，药物组合物是固体制剂，例如，冷冻干燥或喷雾干燥的组合物，其可以按原样使用，或者在使用前医生或患者可添加溶剂和/或稀释剂。固体剂型可以包括片剂，例如压缩片剂和/或包衣片剂，以及胶囊(例如硬的或软的明胶胶囊)。药物组合物还可以是用于复溶小袋、糖衣丸、粉末、颗粒、锭剂或粉末的形式。
在包含水溶性或可分散载体的情况下，剂型可以是速释的，或者在包含水不溶性聚合物可调节胃肠道或皮下溶解速率的情况下，它们可以是延迟释放、持续释放或缓释的。
在其它实施例中，药物组合物可以鼻内、颊内或舌下递送。
水性制剂中的pH值可以在pH 3到pH 10之间。在本发明的一个实施例中，制剂的pH为约7.0至约9.5。在本发明的另一个实施例中，制剂的pH为约3.0至约7.0。
在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含缓冲液。缓冲液的例子包括但不限于：精氨酸、天冬氨酸、N-二甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸氢二钠、延胡索酸、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、顺丁烯二酸、苹果酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、琥珀酸、酒石酸、两性离子缓冲剂和tris(羟甲基)-氨基甲烷及上述混合物。缓冲液可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。每一种包含这些特定缓冲液的药物组合物构成本发明的替代实施例。
在本发明的另一个实施例中，所述药物组合物包含防腐剂。防腐剂的例子包括但不限于：苄索氯铵、苯甲酸、苯甲醇、溴硝醇、4-羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、氯甲酚、氯己定、氯苯甘醚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、4-羟基苯甲酸乙酯、亚胺脲、4-羟基苯甲酸甲酯、苯酚、2-苯氧基乙醇、2-苯乙醇、4-羟基苯甲酸丙酯、脱氢乙酸钠、硫柳汞及其混合物。防腐剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。每一种包含这些特定防腐剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。
在本发明的另一个实施例中，所述药物组合物包含等渗剂。等渗剂的例子包括但不限于盐(如氯化钠)、氨基酸(如甘氨酸、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸)、醛二醇(如甘油、1，2-丙二醇丙二醇)、1，3-丙二醇和1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物。等渗剂的另一个例子包括糖。糖的例子包括但不限于可以是单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、α和β-HPCD、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。等渗剂的另一个例子是糖醇，其中术语“糖醇”被定义为具有至少有一个-OH基团的C(4-8)烃。糖醇的例子包括但不限于甘露醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、乌尔西醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。药物组合物包含本段所列各等渗剂，构成本发明的替代实施例。等渗剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。每一种包含这些特定等渗剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。
在本发明的另一个实施例中，所述药物组合物包含螯合剂。螯合剂的例子包括但不限于柠檬酸、天冬氨酸、乙二胺四乙酸盐(EDTA)及其混合物。螯合剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。每一种包含这些特定螯合剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。
在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含稳定剂。稳定剂的例子包括但不限于一种或多种聚集抑制剂、一种或多种氧化抑制剂、一种或多种表面活性剂和/或一种或多种蛋白酶抑制剂。
在本发明的另一个实施例中，药物组合物包含稳定剂，所述稳定剂是羧基/羟基纤维素及其衍生物(如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、2-甲硫代乙醇、聚乙二醇(如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、盐(如氯化钠)、含硫物质如单硫代甘油或巯基乙酸。稳定剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.01mg/ml至约50mg/ml，例如约0.1mg/ml至约20mg/ml。每一个包含这些特定稳定剂的药物组合物构成本发明的替代实施例。
在本发明的进一步实施例中，药物组合物包含一种或多种表面活性剂，优选一种表面活性剂、至少一种表面活性剂或两种不同的表面活性剂。术语“表面活性剂”是指由水溶性(亲水性)部分和脂溶性(亲脂性)部分组成的任意分子或离子。举例而言，表面活性剂可以选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂。表面活性剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定表面活性剂中每一种的药物组合物构成本发明的替代实施例。
在本发明的进一步实施例中，药物组合物包含一种或多种蛋白酶抑制剂，例如EDTA和/或苯甲脒盐酸(HCl)。蛋白酶抑制剂可以单独存在或聚集存在，浓度为约0.1mg/ml至约20mg/ml。包含这些特定蛋白酶抑制剂中的每一个的药物组合物构成本发明的替代实施例。
在另一个一般方面，本发明涉及一种包含本发明中双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的生产方法，包括将双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体结合以获得该药物组合物。
使用方法
在一般方面，本发明涉及一种靶向CD47和TAA(诸如CLDN18.2)的方法，它们都通过激活巨噬细胞介导的癌细胞吞噬作用在有需要的受试者的癌细胞表面上表达，包括向有需要的受试者施用本发明中的抗TAA/抗CD47双特异性抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
在一般方面，本发明涉及一种靶向DLL3的方法，该方法通过接合T细胞使其在有需要的受试者的癌细胞表面上表达；该方法包括向有需要的受试者施用本发明中的抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
结合靶抗原(例如，如CD3的ICM)的单克隆抗体或抗原结合片段的功能活性，或结合TAA(例如，DLL3)和T细胞靶抗原(例如，如CD3的ICM)或在同一细胞上结合TAA和CD47的双特异性抗体及抗原结合片段的功能活性可以通过本领域已知的方法和本文所述的方法来表征。表征同时结合TAA(例如DLL3)和T细胞靶抗原(例如CD3)的双特异性抗体及抗原结合片段的方法包括但不限于基于细胞结合的交联测定或T细胞活化测定，以及包括Biacore，ELISA，FACS和OctetRed分析的亲和力和特异性测定。表征在同一细胞上同时结合TAA(例如CLDN18.2)和CD47的双特异性抗体及抗原结合片段的方法包括但不限于亲和力和特异性测定，包括Biacore，ELISA，FACS和OctetRed分析。根据具体实施例，表征结合DLL3和CD3的双特异性抗体及其抗原结合片段的方法包括下述的方法。结合ICM的单克隆抗体或抗原结合片段的功能活性，或结合TAA(例如DLL3)和CD3以外的ICM的双特异性抗体及其抗原结合片段的功能活性可以通过类似于上述的方法进行表征。
在另一个一般方面，本发明涉及靶向在有需要的受试者的癌细胞表面上表达的一种或两种抗原的方法，包括使用CD3介导的T细胞活化，和/或治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用包含分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体的药物组合物。任选地，所述癌症选自肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓系白血病(AML)和其他液体肿瘤。
在另一个一般方面，本发明涉及生产双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码该双特异性抗体或抗原结合片段的核酸的细胞，以及从细胞或培养物中回收该双特异性抗体或抗原结合片段。
在另一个一般方面，本发明涉及一种生产包含双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将双特异性抗体或抗原结合片段与药学上可接受的载体结合以获得该药物组合物。
在另一个一般方面，本发明涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向有需要的受试者施用分离的人源化双特异性抗体或其抗原结合片段，例如本发明的抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体，或抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或药物组合物。所述癌症可以是任何液体肿瘤或实体肿瘤，例如，它可以选自但不限于，肺癌，胃癌，食道癌，胆管癌，胆管癌，结肠癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱尿路上皮癌，转移性黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓系白血病(AML)和其他液体肿瘤。
根据本发明的实施例，所述药物组合物包含治疗有效量的抗CD47/抗CLDN18.2或抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或其抗原结合片段。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在受试者中引起所需生理性或药物性反应的活性成分或组分的量。治疗有效量可以根据与所述目的相关的经验和常规方式确定。
如本文中用于的抗CD47/抗CLDN18.2或抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指抗CD47/抗CLDN18.2或抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或其抗原结合片段的量，调节有需要的受试者的免疫应答。本文中关于抗CD47/抗CLDN18.2或抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或其抗原结合片段，治疗有效量是指治疗疾病、紊乱或病症的抗CD47/抗CLDN18.2或抗CD3/抗DLL3双特异性抗体或其抗原结合片段的量；预防或减缓疾病、紊乱或病症的进展；或减轻或完全缓解与疾病、紊乱或病症相关的症状。
根据具体实施例，要治疗的疾病、紊乱或病症是指癌症，优选自以下癌症：肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓系白血病(AML)和其他液体肿瘤。根据其它具体实施例，要治疗的疾病、紊乱或病症是炎症性疾病、代谢性疾病或可用双特异性抗体治疗的任何其它疾病。
根据具体实施例，治疗有效量是指足以达到以下一种、两种、三种、四种或多种效果的治疗量：(i)减轻或改善要治疗的疾病、紊乱或病症的严重程度或与之相关的症状；(ii)减少要治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)防止要治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的进展；(iv)导致要治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状消退；(v)防止要治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的发展或发作；(vi)防止要治疗的疾病、紊乱或病症或与之相关的症状复发；(vii)减少患有待治疗疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)缩短患有待治疗疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)增加患有待治疗疾病、紊乱或病症或与之相关的症状的受试者的生存率；(xi)抑制或减少受试者要治疗的疾病、紊乱或病症，或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。
治疗有效量或剂量可以根据各种因素而变化，例如要治疗的疾病、紊乱或病症、给药方式、靶部位、受试者的生理状态(包括，例如，年龄、体重、健康)、受试者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性还是治疗性的。治疗剂量经过最佳滴定，以提高安全性和有效性。
根据具体实施例，本文中描述的组合物被配制成适合于受试者的目标给药途径。例如，本文描述的组合物可以配制成适合于静脉、皮下或肌肉给药。
如本文所用，术语“治疗”、“治疗”和“治疗”都指改善或逆转与癌症相关的至少一个可测量物理参数，该参数不是一定在受试者中被识别，但在受试者中可以被识别。术语“治疗”、“治疗”和“治疗”也可以指导致消退、阻止或至少减缓疾病、紊乱或病症的进展。在特定实施例中，“治疗”、“治疗”和“治疗”是指减轻、预防与疾病、紊乱或病症相关的一种或多种症状的持续时间，例如肿瘤，更优选癌症。在特定实施例中，“治疗”、“治疗”和“治疗”是指预防疾病、病症或病症的复发。在特定实施例中，“治疗”、“治疗”和“治疗”是指增加患有该疾病、紊乱或病症的受试者的生存率。在特定实施例中，“治疗”、“治疗”和“治疗”是指消除受试者中的疾病、紊乱或病症。
根据具体实施例，所提供的是用于治疗癌症的组合物。在癌症治疗中，该组合物可与另一种治疗方法联合使用，包括但不限于化疗、抗TIM-3单克隆抗体、抗LAG-3单克隆抗体、抗CD73单克隆抗体、抗apelin单克隆抗体、抗CTLA-4抗体、抗EGFR单克隆抗体、抗HER-2单克隆抗体、抗CD19单克隆抗体、抗CD20单克隆抗体、抗CD33单克隆抗体、抗TIP-1单克隆抗体、抗CLDN18.2单克隆抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、PD-1/PD-L1疗法、其他免疫肿瘤药物、抗血管生成药物、放射治疗、抗体-药物偶联物(ADC)、靶向治疗或其他抗癌药物。
如本文所用，术语“组合”，在向受试者施用两种或多种疗法的上下文中，是指使用一种以上的疗法。术语“组合”的使用并不限制受试者进行治疗的顺序。例如，第一种治疗(例如，本文描述的组合物)可以在(例如，5分钟，15分钟，30分钟，45分钟，1小时，2小时，4小时，6小时，12小时，16小时，24小时，48小时，72小时，96小时，1周，2周，3周，4周，5周，6周，8周或12周前)伴随或之后(例如，5分钟，15分钟，30分钟，45分钟，1小时，2小时，4小时，6小时，12小时，16小时，24小时，48小时，72小时，96小时，1周，2周，3周，4周，5周，6周，8周或12周后)对受试者进行第二种治疗。
具体实施例
本发明提供包括但不限制于以下的实施例。
实施例1是分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括：
a.第一重链，H1；
b.第二重链，H2；
c.第一轻链，H1；以及
d.第二轻链，L2；
其中H1和L1组成第一臂，包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域，优选人源的第一抗原，H2和L2形成第二抗原结合域的第二臂，该第二抗原结合域特异性结合第二抗原，优选人源的第二抗原，其中
(a)H1和H2各自包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区域；
(b)L1和L2各自包括人κ轻链或人λ轻链的CL区；
其中H1L1和H2L2各自包含选自以下氨基酸替代组成的组的电荷对：
(1)分别为H1的CH1区上的G166D/E，L1的CL区上的S114K/R，H2的CH1区上的G166K/R，以及L2的CL区上的S114D/E；
(2)分别为H1的CH1区上的T187D/E，L1的CL区上的D/N170K/R，H2的CH1区上的T187K/R，以及L2的CL区上的D/N170D/E；
(3)分别为H1的CH1区上的S131D/E，L1的CL区上的P119K/R，H2的CH1区上的S131K/R，以及L2的CL区上的P119D/E；
(4)分别为H1的CH1区上的A129D/E，L1的CL区上的S121K/R，H2的CH1区上的A129K/R，以及L2的CL区上的S121D/E；
(5)分别为H2的CH1区上的G166D/E，L2的CL区上的S114K/R，H1的CH1区上的G166K/R，以及L1的CL区上的S114D/E；
(6)分别为H2的CH1区上的T187D/E，L2的CL区上的D/N170K/R，H1的CH1区上的T187K/R，以及L1的CL区上的D/N170D/E；
(7)分别为H2的CH1区上的S131D/E，L2的CL区上的P119K/R，H1的CH1区上的S131K/R，以及L1的CL区上的P119D/E；
(8)分别为H2的CH1区上的A129D/E，L2的CL区上的S121K/R，H1的CH1区上的A129K/R，以及L1的CL区上的S121D/E；
实施例2是实施例1中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于
(a)两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中VH区具有不同的氨基酸序列
(b)两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中CH1区具有不同的氨基酸序列。
(c)两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中Fc区具有不同的氨基酸序列。
(d)两个轻链L1和L2各自包括VL区和CL区，其中VL区具有不同的氨基酸序列。
(e)两个轻链L1和L2各自包括VL区和CL区，其中CL区具有不同的氨基酸序列。
实施例3是实施例2中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中H1和H2形成异二聚体。
实施例4是实施例1至3中任一项的分离双特异性抗体或其抗原结合片段，其中分离的抗体或其抗原结合片段包括：
(a)H1的CH1中的G166、T187、S131或A129处的带负电荷的氨基酸(D或E)，H1上的VH区和L1上的VL区分别有Q39E和Q38K替换突变，H2上的VH区和L2上的VL区分别有Q39K和Q38E替换突变；
(b)H1的CH1上的G166,T187,S131或A129处的带正电荷的氨基酸(K或R)，H1上的VH区和L1上的VL区分别有Q39K和Q38E替换突变，H2上的VH区和L2上的VL区分别有Q39E和Q38K替换突变。
实施例5是实施例1至4中任一项中的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中两个臂之一的CH1和CL区域包括对于CH1，对应于SEQ ID NO：17、18、19或20和对于CL，对应于SEQ ID NO：21或22的氨基酸位置的氨基酸残基上的氨基酸取代；
其中CH1和CL区域中的氨基酸取代选自：
(1)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的F209C和C214X；
(2)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的F209C和C214X；
(3)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的V209C和C214X；
(4)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的V209C和C214X；
其中X选自S，A或G。
实施例6是实施例1至5中任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合域特异性结合CD47，优选人CD47，第二抗原结合域特异性结合与CD47在同一细胞上表达的TAA，优选人TAA。
实施例7是实施例6中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第二抗原结合域特异性结合与CD47在同一细胞上表达的CLDN18.2，优选人CLDN18.2。
实施例8是实施例6或7中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中抗CD47抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，包括以下氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和29；
(2)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和29；
(3)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和30；
(4)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和30；
(5)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和33；
(6)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和33；
(7)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和34；
(8)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和34；
(9)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和37；
(10)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和37；
(11)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和38；
(12)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和38；
(13)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和41；
(14)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和41；
(15)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和42；
(16)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和42；
(17)分别为SEQ ID NOs:1,43,2和45；
(18)分别为SEQ ID NOs:1,44,2和45；
(19)分别为SEQ ID NOs:1,43,2和46；
(20)分别为SEQ ID NOs:1,44,2和46；
(21)分别为SEQ ID NOs:1,47,2和49；
(22)分别为SEQ ID NOs:1,48,2和49；
(23)分别为SEQ ID NOs:1,47,2和50；
(24)分别为SEQ ID NOs:1,48,2和50；
(25)分别为SEQ ID NOs:1,51,2和53；
(26)分别为SEQ ID NOs:1,52,2和53；
(27)分别为SEQ ID NOs:1,51,2和54；
(28)分别为SEQ ID NOs:1,52,2和54；
(29)分别为SEQ ID NOs:1,55,2和57；
(30)分别为SEQ ID NOs:1,56,2和57；
(31)分别为SEQ ID NOs:1,55,2和58；
(32)分别为SEQ ID NOs:1,56,2和58；
(33)分别为SEQ ID NOs:23,27,24和29；
(34)分别为SEQ ID NOs:23,28,24和29；
(35)分别为SEQ ID NOs:23,27,24和30；
(36)分别为SEQ ID NOs:23,28,24和30；
(37)分别为SEQ ID NOs:25,31,26和33；
(38)分别为SEQ ID NOs:25,32,26和33；
(39)分别为SEQ ID NOs:25,31,26和34；
(40)分别为SEQ ID NOs:25,32,26和34；
(41)分别为SEQ ID NOs:23,35,24和37；
(42)分别为SEQ ID NOs:23,36,24和37；
(43)分别为SEQ ID NOs:23,35,24和38；
(44)分别为SEQ ID NOs:23,36,24和38；
(45)分别为SEQ ID NOs:25,39,26和41；
(46)分别为SEQ ID NOs:25,40,26和41；
(47)分别为SEQ ID NOs:25,39,26和42；
(48)分别为SEQ ID NOs:25,40,26和42；
(49)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和45；
(50)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和45；
(51)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和46；
(52)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和46；
(53)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和49；
(54)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和49；
(55)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和50；
(56)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和50；
(57)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和53；
(58)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和53；
(59)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和54；
(60)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和54；
(61)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和57；
(62)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和57；
(63)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和58；或
(64)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和58。
实施例9是实施例8中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，第二抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，包括以下氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID:1,28,2,29,3,63,4和64；
(2)分别为SEQ ID:1,36,2,37,3,67,4和68；
(3)分别为SEQ ID:1,44,2,45,3,71,4和72；
(4)分别为SEQ ID:1,52,2,53,3,73,4和74；
(5)分别为SEQ ID:1,31,2,34,3,65,4和66；
(6)分别为SEQ ID:1,39,2,42,3,69,4和70；
(7)分别为SEQ ID:1,47,2,50,3,75,4和76；
(8)分别为SEQ ID:1,55,2,58,3,77,4和78；
(9)分别为SEQ ID:23,28,24,29,59,63,60和64；
(10)分别为SEQ ID:23,36,24,37,59,67,60和68；
(11)分别为SEQ ID:23,44,24,45,59,71,60和72；
(12)分别为SEQ ID:23,52,24,53,59,73,60和74；
(13)分别为SEQ ID:25,31,26,34,61,65,62和66；
(14)分别为SEQ ID:25,39,26,42,61,69,62和70；
(15)分别为SEQ ID:25,47,26,50,61,75,62和76；或
(16)分别为SEQ ID:25,55,26,58,61,77,62和78。
实施例10是实施例1至5中任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包括抗免疫细胞调节剂(ICM)抗体或其抗原结合片段臂，并且能够与ICM特异性结合。
实施例11是实施例10中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中ICM选自CD3、CD16、CD27、CD28、CD40、CD122、NKp46、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、KIR、BTLA、B7-H3等细胞表面免疫调节分子。
实施例12是实施例1至5和10至11中任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合域特异性结合CD3，优选人源CD3，并且其VH、CH1、VL和CL分别包含SEQ ID为9、10、11和12的氨基酸序列。
实施例13是实施例1至5和10至12中任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合域特异性结合CD3，优选人CD3，第二抗原结合域特异性结合DLL3，优选人DLL3。
实施例14是实施例13中分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，分别包含SEQ ID：9、10、11和12的氨基酸序列，第二抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，包括SEQ ID：13、14、15和16的氨基酸序列。
实施例15是编码实施例1至14中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的分离的核酸。
实施例16是包含实施例15的分离的核酸的载体。
实施例17是包含实施例16的载体的宿主细胞。
实施例18为药物组合物，包含实施例1至14中任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
实施例19是一种靶向DLL3的方法，DLL3通过接合T细胞在有需要的受试者的癌细胞表面上表达，包括向受试者施用实施例18的药物组合物。
实施方案20是靶向在有需要的受试者的癌细胞表面上表达的一种或两种抗原的方法，包括使用CD47阻隔剂诱导的巨噬细胞介导的吞噬作用的激活或CD3介导的T细胞活化，和/或治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用包含实施例1至14中任意一种的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物。以及可选地包括药学上可接受的载体，癌症选自肺癌，胃癌，食道癌，胆管癌，胆管癌，结肠癌，肝细胞癌，肾细胞癌，膀胱尿路上皮癌，转移性黑色素瘤，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，头颈癌，胰腺癌，胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓系白血病(AML)和其他液体肿瘤。
实施例21是生产实施方案1至14中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培育包含编码该双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从细胞或培养物中回收该双特异性抗体或其抗原结合片段。
实施例22是生产包含实施方案1至14中任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的方法，包括将双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体结合以获得该药物组合物。
实施例
实施例1：带电荷对的双特异性抗体的构建
图1展示了在H1H2的异二聚体中具有两条不同重链(H1和H2)和两条不同轻链(L1和L2)的双特异性抗体(bsAb)，其可以通过常见的方法(如孔中旋钮和电荷对)来促进形成。可以在双特异性抗体每个臂的CH1和CL区中引入带相反电荷的氨基酸，以增强每个重链与其相应的轻链(H1L1和H2L2)的正确同源配对。带相反电荷对可以更好地区分bsAb和生产过程中细胞表达的潜在杂质的物理性质，促进色谱中目标bsAb与其杂质的分离，从而纯化和生产目标的bsAb，并且可以使用常见的mAb制造平台(通常涉及蛋白A亲和力，阴离子交换和阳离子交换色谱步骤)来制造双特异性抗体。以下例子显示了人源IgG1重链CH1和κ轻链CL序列中的双特异性抗体(图2A-2B和表5)。该概念也可以应用于使用人源IgG2、IgG3或IgG4重链的CH1构建双特异性抗体(图2A和表5)，以及存在保守的敲入位点的人源λ轻链的CL(图2B和表5)。每当敲入位点恰好是与目标带电荷氨基酸相同的天然电荷残基时，它可以直接用于形成目标的电荷对。设计的电荷对列于表1中(如WO2021/126538中首次描述，全文通过引用并入本文)。在描述电荷对时，G166D/E表示用D或E替换位置166(欧盟编号)处的G，在这种情况下G166是敲入位点；D170D/E表示将D保持在位置170或用E替换位置170的D；所有其他替换都遵循相同的命名规则。用于构建双特异性抗体的几种mAb的VH和VL序列如图2C-2F和表2所示。
使用抗CD47和抗CLDN18.2 mAb(图2C-2D和表2)构建双特异性抗体，并引入了各种电荷对设计。表3列出了抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体中使用的电荷对设计。bsAb的VH和VL区分别融合到人源IgG1重链(HC)和κ轻链(LC)的恒定区。采用一种将mAb 1(抗CD47)臂上的HC和LC之间的链间二硫键转移到HC上的K133和LC上的F209的策略。这些步骤按照WO2021/126538中所述进行，其全文通过引用并入本文。bsAb的人源IgG1重链和κ轻链的主链上(VH和VL区域的用Kabat编号；CH1和CL区域的用欧盟编号)，mAb 1(抗CD47)的HC具有T366W(CH2和CH3区域用欧盟编号)突变从而形成“旋钮”，mAb 2(抗CDN18.2)的HC具有T366S，L368A和Y407V突变从而形成“旋钮”，因此两条重链倾向于由异二聚体HC(mAb 1HC/mAb 2HC)形成bsAb。此外，在mAb 1HC上引入S354C半胱氨酸突变，在mAb 2HC上引入Y349C半胱氨酸突变，以稳定异二聚体重链的异二聚体配对(Merchant et al.Nat.Biotechnol.
16(7):677-81(1998))。带有不同的电荷对的抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体被转染进ExpiCHO-S细胞中(表3)，并且在同一细胞中同时表达两条重链和两条轻链，使目标的bsAb和某些杂质进行表达和组装。双特异性抗体使用蛋白A亲和层析法进行纯化。
使用抗CD3单克隆抗体和人源化抗DLL3单克隆抗体(在国际专利号WO2019217145中描述，全文引用并入本文)构建抗CD3/抗DLL3 bsAb(图2E-2F和表2)。bsAb的VH和VL区分别融合到人源IgG1重链(HC)和κ轻链(LC)的恒定区。电荷对HC(Q39E，T187E)/LC(Q38K，D170K)被引入到bsAb的抗DLL3臂中；电荷对HC(Q39K，T187K)/LC(Q38E，D170E)被引入bsAb的抗CD3臂中。当两个HC和两个LC被共转染进细胞时，采用一种将mAb 2(抗DLL3)臂上的HC和LC上的链间二硫键转移到HC上的K133和LC上的F209的策略，以促进表达、纯化和/或生产bsAb，并提高目标bsAb的稳定性。这些步骤按照WO2021/126538中所述进行，全文通过引用并入本文。最终bsAb(命名为bsAb_33)的VH、CH1、VL和CL序列列于表4中。
如上所述，bsAb_33位于人IgG1重链和κ轻链(VH和VL区用Kabat编号；CH1和CL区用欧盟编号)。mAb 1(抗CD3)的HC具有T366W(CH2和CH3区的欧盟编号)突变形成的“旋钮”，mAb2(抗DLL3)的HC具有T366S，L368A和Y407V突变形成的“旋钮”，因此两条重链倾向于与异二聚体HC(mAb 1HC/mAb 2HC)而不是同源二聚体HC(mAb 1HC/mAb 1HC或mAb 2HC 2HC)形成bsAb。此外，在mAb 1HC上引入S354C半胱氨酸突变，在mAb 2HC上引入Y349C半胱氨酸突变，以稳定异二聚体重链的异二聚体配对(Merchant et al.Nat.Biotechnol.16(7):677-81(1998))。此外，L234A和L235A突变被引入H1和H2的CH2区。
在ExpiCHO-S细胞中转染双特异性抗体bsAb_33，在同一细胞中同时表达两条重链和两条轻链，使目标双特异性抗体和某些杂质进行表达和组装。bsAb用蛋白A色谱法进行纯化。
表1：CH1和CL区中用于形成电荷对的氨基酸残基
注：CH1和CL区用欧盟编号法。
表2：抗CD47/抗CLDN18.2和抗CD3/抗DLL3双特异性抗体中不同区域的序列
表3：抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体中的电荷对设计
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注：bsAb即双特异性抗体。Kabat编号用于VH和VL区；欧盟编号用于CH1和CL区；空白表示没有引入突变。
表4：抗CD3/抗DLL3双特异性抗体bsAb_33中各个区域的序列
注：氨基酸替换产生的残基以粗体和下划线的形式出现。
表5：IgG1 CH1、IgG2 CH1、IgG3 CH1、IgG4 CH1、Kappa CL和Lambda CL区域的序列
实施例2：带电荷对的抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体的性质
通过双臂比例为1：1(标准比例)的DNA转染ExpiCHO-S细胞，产生各带一个电荷对中的一个电荷的抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体。WT和PAC12(表3)被用作对照。来自这些转染的蛋白A纯化样品用桥连ELISA法分析，以确定目标双特异性抗体的形成(图3A-3B)。桥连ELISA法是使用ExpiCHO-S细胞在板上稳定表达人源CLDN18.2以捕获双特异性抗体。然后加入生物酰化的人源CD47蛋白与捕获的双特异性抗体结合，并使用HRP偶联的链霉亲和素进行检测。用CEX-HPLC分析了蛋白A纯化后的样品及其中主要杂质标样(图3C-3N)。CEX-HPLC运行使用线性盐梯度[缓冲液A：25mM磷酸钠(pH 6.0)和2％乙腈；缓冲液B：25mM磷酸钠(pH 6.0)，1M NaCl和2％乙腈]。与WT、PAC12、ek或ke样品(图3C-3F)相比，2X抗CD47 LC错配杂质与“EK”bsAb样品中的主峰分离[(包括EK(gs)、EK(td)、EK(5)和EK(9)；表3](图3G-3J)。此外，2X抗CD47和2X抗CLDN18.2 LC错配杂质均从“KE”bsAb样品中的主峰分离[(包括KE(gs)、KE(td)、KE(5)和KE(9)；表3](图3K-3N)。这些数据表明，“EK”和“KE”电荷对可以使用线性盐梯度的阳离子交换(CEX)色谱将一种或两种LC错配杂质与bsAb的物理性质区分开，可以在CEX色谱中促进将bsAb与一种或两种LC错配杂质分离。该特性可以促进bsAb在制造环境中的纯化和生产。蛋白A纯化后的样品在液相色谱/质谱(LC/MS)上进行分析。结果表明每个样品中都存在目标的bsAb，并且在这些样品中检测到2X抗CD47和2X抗CLDN18.2 LC错配杂质(图3O-3Q)，除了在EK(9)中，2X抗CD47 LC错配几乎检测不到(图3P)。
通过抗CD47 LC DNA和抗CLDN18.2 LC DNA的比例为2：1的比例(anti-CD47 LCDNA:anti-CLDN18.2 LC DNA＝2:1；有偏向的DNA比率)转染ExpiCHO-S细胞，产生各带有“EK”电荷对中的一个电荷的抗CD47/抗CLDN18.2双特异性抗体(表3)。WT和PAC12(表3)用作对照。蛋白A纯化后的“EK”双特异性抗体转染样品用桥连ELISA法分析，以确认目标双特异性抗体的形成(图4A)。如上所述，还用CEX-HPLC法利用线性盐梯度分析了蛋白A纯化的样品及其主要杂质标样。与以偏向性DNA比例转染两种不同LC一样，2X抗CD47 LC错配杂质(图4B)被相对较多地产生。使用LC/MS分析主要杂质的存在(图4C-4D)。在CEX-FPLC上用线性pH梯度[缓冲液A：25mM磷酸钠(pH5.8)和50mM NaCl；缓冲液B：25mM磷酸钠(pH 8.0)和50mMNaCl]分离蛋白A纯化样品。与WT、PAC12、ek或ke样品显示为单个峰(图4E)不同，“EK”样品具有主峰分离(存在bsAb的峰1)和一个LC失配杂质物种(图4F)。使用上述相同的桥接ELISA测定法分析从峰中收集的级分(图4G)。结果表明，bsAb位于每个样品的峰1中(图4G)。不同于WT、PAC12、ek或ke样品显示为单峰(图4E)，“EK”样品具有主峰分离(表示bsAb的峰1)和一个LC错配的杂质种类(图4F)。使用上述相同的桥连ELISA法分析从峰中收集的样品(图4G)。结果表明，bsAb位于每个样品的峰1中(图4G)。与在CEX-FPLC之后bsAb未与2X抗CD47 LC错配杂质分离(图4H)不同，每个CEX-FPLC纯化的“EK”样品中的峰1以目标bsAb为主要产物(图4I-4L)。这些数据表明，通过将电荷对引入“EK”bsAb的设计，可以使用线性pH梯度将主要的bsAb与CEX-FPLC上的2X抗CD47 LC错配杂质分离，表明电荷对在促进bsAb纯化方面具有优越性。
如上所述，使用桥连ELISA法(图3B)、CEX-HPLC(图3K-3N)和LC/MS(图3Q)分析了用标准DNA比例转染后的蛋白A纯化的bsAb样品。这些样品也在CEX-FPLC上使用线性pH梯度[缓冲液A：25mM磷酸钠(pH 5.8)和50mM NaCl；缓冲液B：25mM磷酸钠(pH 8.0)和50mM NaCl]分离。与WT、PAC12、ek或ke样品显示为单峰(图4E)不同，“KE”样品具有主峰分离(表示bsAb的峰1)和两种LC错配杂质物种(图5A)。使用桥连ELISA法(图5B)和LC/MS(图5C-5F)分析从峰中收集的样品。结果表明，bsAb位于每个样品的峰1中(图5A)。与WT、PAC12、ek和ke样品在CEX-FPLC后bsAb未与2X抗CD47 LC错配杂质分离(图4H)不同，每个CEX-FPLC纯化的“KE”样品中的峰1以目标bsAb为主要产物(图5C-5F)。这些数据表明，通过将电荷对引入“KE”bsAb设计中，可以使用线性pH梯度将主要的bsAb与CEX-FPLC上的2X抗CD47 LC和2X抗CLDN18.2LC错配杂质分离，表明电荷对在促进bsAb纯化方面具有优越性。
使用分步洗脱法纯化来自偏向性DNA比例的转染的蛋白A纯化“EK”bsAb样品[缓冲液A：25mM磷酸钠(pH 5.8)和80mM NaCl；缓冲液B：25mM磷酸钠(pH 8.0)和40mM NaCl]。针对每种bsAb样品对方法进行了优化。纯化“EK”双特异性抗体，将主bsAb峰(峰1)与杂质峰分离(图6A)。使用桥接ELISA测定(图6B)和LC/MS分析(图6C-6F)确认主峰中存在目标的bsAb。这些数据表明，使用逐步洗脱法可以在CEX-FPLC上纯化带有电荷对的双特异性抗体。
包含“ekEK”或“keKE”电荷对的双特异性抗体设计(表3)在以两个臂的DNA比例为标准的1：1的比例转染的ExpiCHO-S细胞中产生。在桥连ELISA法中测试来自这些设计的蛋白A纯化样品，以确认双特异性活性(图7A)。上述相同的样品在CEX-HPLC上使用线性盐梯度进行分析，包括其各自的主要杂质标样(图7B-7I)，以及LC/MS(图7J-7K)。如上所述，使用线性pH梯度[缓冲液A：25mM磷酸钠(pH 5.8)和50mM NaCl；缓冲液B：25mM磷酸钠(pH 8.0)和50mM NaCl]在CEX-FPLC上分离蛋白A纯化的“ekEK”bsAb样品。与WT、PAC12、ek和ke样品(图4E)相比，“ekEK”bsAb样品能更好地从一种LC错配杂质物中分离出主峰(表示bsAb的峰1)(图8A)。使用相同的桥连ELISA分析(图8B)和LC/MS分析(图8C-8F)从峰中收集的样品，确认bsAb位于峰1中。同样，与WT、PAC12、ek和ke样品(图4E)相比，“keKE”bsAb样品能更好地从一种或两种LC错配杂质物(图8G)中分离出主峰(存在bsAb的峰1)。使用相同的桥连ELISA分析(图8H)和LC/MS分析(图8I-8L)从峰中收集的样品，以确认bsAb位于峰1中。将双特异性抗体“keKE(gs)”和“keKE(td)”从2X抗CD47 LC和2X CLDN18.2 LC错配种类中分离出来(图8I-8J)。将双特异性抗体“keKE(5)”和“keKE(9)”(图8K-8L)从2X抗CD47 LC错配中分离出；未检测到2X CLDN18.2LC错配。
使用定制的逐步洗脱方法[缓冲液A：25mM磷酸钠(pH 5.8)和80mM NaCl；缓冲液B：25mM磷酸钠(pH 8.0)和40mM NaCl]在CEX-FPLC上纯化两种“ekEK”(图9A)和四种“keKE”双特异性抗体(图9E)，并通过桥连ELISA分析(图9B和9F)和LC/MS分析(图9C-9D和9G-9J)确认纯化的双特异性抗体的活性。这些结果表明，表1中的电荷对可以通过与其他电荷对结合(ek或ke设计；表3)以促进CEX-FPLC上bsAb的纯化。具有不同电荷对设计的抗CD47抗体臂和抗CLDN18.2抗体中各个区域的序列列于表6中。这些抗CD47抗体序列可用于与另一个抗体组(如抗CLDN18.2)构建双特异性抗体，可以根据表3中的设计向其引入相应的电荷对。
表6：带电荷对的抗CD47抗体臂和抗CLDN18.2抗体臂的各个区域的序列
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注：氨基酸替换产生的残基以粗体和下划线形式展示。
实施例3：带电荷对的抗CD3/抗DLL3双特异性抗体的性质
将抗CD3/抗DLL3 bsAb的蛋白A纯化样品调节pH至最终pH值5.5，并直接上样到用25mM磷酸钠(pH 5.8)+210mM NaCl预平衡的多孔XS(Thermo)CEX色谱柱上。用线性梯度洗脱样品[缓冲液A–25mM磷酸钠(pH 5.8)+210mM NaCl；缓冲液B–25mM磷酸钠(pH 8)+115mMNaCl]。通过强阳离子交换(SCX)HPLC分析洗脱组分，将表示完全消除2X抗DLL3 LC错配(两臂上匹配的抗DLL3LC匹配的HC异二聚体)的组分混合。将(NH4)2SO4加入到混合组分中，最终浓度为700mM，并将样品直接上样到与50mM tris(pH 7.5)+700mM(NH4)2SO4+3％甘油预平衡的丁基琼脂糖高性能(Cytiva)HIC(疏水相互作用色谱)色谱柱上。使用线性梯度洗脱样品[缓冲液A–50mM tris(pH 7.5)+700mM(NH4)2SO4+3％甘油；缓冲液B–50mM三重(pH7.5)+10％甘油]。通过HIC HPLC分析洗脱的组分，并将显示完全消除2x抗CD3 LC错配(两臂上匹配的抗DLL3 LC的HC异二聚体)的组分混合为纯化后的蛋白。
纯化的双特异性抗体采用HIC HPLC、SCX HPLC和SEC HPLC进行分析(图10A-10C)。使用瞬时转染仅有给定杂质的组分生成潜在杂质的标准品，(即为了产生2X抗CD3 LC错配，转染中仅使用抗DLL3 HC，抗CD3 HC和抗CD3 LC以强制形成抗CD3 LC错配标准品；同源二聚体/半分子通过转染仅含有给定臂的HC和LC的细胞产生)，用蛋白A纯化并用作分析中的参考(图10A-10B)。数据表明，纯化的bsAb_33具有很高的纯度。
为了评估bsAb_33同时结合DLL3和CD3的活性，将纯化的bsAb用不同荧光标记物标记的SHP-77细胞和Jurkat细胞一起培育。bsAb_33诱导的双染情况通过流式细胞术检测并定量。简要地，根据制造商的方案，Jurkat细胞用紫色增殖染料450(BD，Cat：562158)染色，SHP-77细胞用CFSE(ThermoFisher，Cat：34554)染色。然后将标记的SHP-77和Jurkat细胞以1：1的比例与2μg/ml bsAb_33一起孵育。对于mAb封闭，SHP-77细胞在室温下用4.5μM抗DLL3封闭mAb处理10分钟，然后与终浓度为1.5μM抗DLL3封闭mAb的Jurkat细胞培育，或Jurkat细胞在室温下用4.5μM抗CD3封闭mAb处理10分钟，然后与终浓度为1.5μM抗CD3封闭mAb的SHP-77细胞培育。在37℃的CO2培养箱中培育1小时后，用2％甲醛固定细胞，用TBS洗涤一次，重悬于FACS缓冲液(HBSS，0.1％BSA，0.05％叠氮化钠)中，然后通过流式细胞术(Attune NxT)进行分析。在FACS上检测到两种细胞类型在存在bsAb_33下的交联，并且信号被抗DLL3或抗CD3封闭mAb抑制(图11A)。这些数据表明，bsAb_33具有双特异性抗体的功能。
双特异性抗体bsAb_33还用于激活功能性T细胞活化测定中的T细胞。使用JurkatNFAT荧光素酶报告细胞系(BPS Bioscience)，其在激活时有条件地表达萤火虫荧光素酶，包括CD3介导的激活。将报告细胞与SHP-77靶细胞在bsAb_33存在下，有或没有抗DLL3阻断抗体在CO2培养箱中以37℃的生长培养基中培育22小时。然后通过荧光素酶检测试剂和光度计测定细胞的活化。当与靶细胞SHP-77一起培育时，双特异性抗体bsAb_33诱导报告细胞的剂量依赖性活化，并且该信号被抗DLL3阻断抗体(抗DLL3臂的mAb版本)抑制(图11B)，证明了bsAb_33的T细胞接合器功能。
应当被本领域技术人员理解的是，在不背离其广泛的发明概念的情况下可以对上述实施例进行更改。因此可以理解为，本发明不限于所公开的特定实施例，而是可以在不脱离如本说明书中描述的本发明的精神和范围内进行修改和变更。
序列表
<110> 凡恩世制药公司
<120> 带电荷对的双特异性抗体及其应用
<130> 065799.11231/35WO1
<150> US 63/146,334
<151> 2021-02-05
<150> US 63/260,463
<151> 2021-08-20
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 VH
<400> 1
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Gly Thr Asp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 VL
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 抗-CLDN18.2 VH
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Thr Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 VL
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Asn
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Ala Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
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Lys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
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Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 抗-CD3 VL
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
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Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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Ser Met Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Arg Pro Glu Trp Ile
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Leu Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Pro Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-DLL3 VL
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 抗-CD3 VH_33
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Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
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Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD3 CH1_33
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Lys Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 抗-CD3 VL_33
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Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
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Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
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Asn Trp Tyr Gln Glu Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
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Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
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Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD3 CL_33
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Glu Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Glu Val Arg Leu Ser Gln Ser Gly Gly Gln Met Lys Lys Pro Gly Glu
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Ser Met Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Val Met His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Arg Arg Pro Glu Trp Ile
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Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Ala Thr Lys Tyr Ala Arg Lys Phe
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Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Tyr Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Arg Gly Ala
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Pro Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-DLL3 CH1_33
<400> 14
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> 抗-DLL3 VL_33
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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Leu Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
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Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-DLL3 CL_33
<400> 16
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Lys Ser
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Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
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Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG1 CH1
<400> 17
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 18
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG2 CH1
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
100
<210> 19
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG3 CH1
<400> 19
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly
100 105
<210> 20
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IgG4 CH1
<400> 20
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
100
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Kappa CL
<400> 21
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 22
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lambda CL
<400> 22
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys
100
<210> 23
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 VH Q39E
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Thr Asp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 VL Q38K
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 VH Q39K
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Thr Asp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 VL Q38E
<400> 26
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 G166D
<400> 27
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Asp Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 28
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 G166E
<400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Glu Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL S114K
<400> 29
Arg Thr Val Ala Ala Pro Lys Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL S114R
<400> 30
Arg Thr Val Ala Ala Pro Arg Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 31
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 G166K
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Lys Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 32
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 G166R
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Arg Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL S114D
<400> 33
Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL S114E
<400> 34
Arg Thr Val Ala Ala Pro Glu Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 35
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 T187D
<400> 35
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Asp Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 36
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 T187E
<400> 36
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL D170K
<400> 37
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Lys Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL D170R
<400> 38
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Arg Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 39
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 T187K
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Lys Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 40
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 T187R
<400> 40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Arg Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL D170D
<400> 41
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL D170E
<400> 42
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 43
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 S131D
<400> 43
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Asp Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 44
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 S131E
<400> 44
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL P119K
<400> 45
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Lys Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL P119R
<400> 46
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Arg Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 47
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 S131K
<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Lys Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 48
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 S131R
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Arg Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL P119D
<400> 49
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Asp Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL P119E
<400> 50
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Glu Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 51
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Asp Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 52
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 A129E
<400> 52
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 53
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1 5 10 15
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20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL S121R
<400> 54
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1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 55
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 A129K
<400> 55
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Lys Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
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<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CH1 A129R
<400> 56
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Arg Pro Ser Ser Cys
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Ser
100
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL S121D
<400> 57
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CD47 CL S121E
<400> 58
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Cys Asn Arg Gly Glu Ser
100 105
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 VH Q39K
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Thr Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 VL Q38E
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 61
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 VH Q39E
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Glu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Thr Met Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Phe Tyr Gly Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 62
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 VL Q38K
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Asn
85 90 95
Ala Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 63
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CH1 G166K
<400> 63
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Lys Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 64
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CL S114E
<400> 64
Arg Thr Val Ala Ala Pro Glu Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 65
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CH1 G166E
<400> 65
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1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Glu Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CL S114K
<400> 66
Arg Thr Val Ala Ala Pro Lys Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 67
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CH1 T187K
<400> 67
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Lys Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CL D170E
<400> 68
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Glu Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 69
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CH1 T187E
<400> 69
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Glu Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 70
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗- CLDN18.2 CL D170K
<400> 70
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Lys Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 71
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CH1 S131K
<400> 71
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Lys Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CL P119E
<400> 72
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Glu Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 73
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CH1 A129K
<400> 73
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Lys Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CL S121E
<400> 74
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Glu Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 75
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CH1 S131E
<400> 75
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 76
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CL P119K
<400> 76
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Lys Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 77
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CH1 A129E
<400> 77
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Glu Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗-CLDN18.2 CL S121K
<400> 78
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (22)

1.一种分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，包括
a.第一重链，H1；
b.第二重链，H2；
c.第一轻链，L1；和
d.第一轻链，L2；
其中，所述H1和L1形成第一臂，包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域，优选人源的第一抗原
所述H2和L2形成第二臂，包括特异性结合第二抗原的第二抗原结合域，优选人源的第二抗原，其中
(a)H1和H2分别包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH1区域；和
(b)L1和L2分别包括人κ轻链或人源λ轻链的CL区；
其中H1L1和H2L2各自包含选自由以下氨基酸取代组成的组的电荷对：
(1)分别为H1的CH1区上的G166D/E，L1的CL区上的S114K/R，H2的CH1区上的G166K/R，以及L2的CL区上的S114D/E；
(2)分别为H1的CH1区上的T187D/E，L1的CL区上的D/N170K/R，H2的CH1区上的T187K/R，以及L2的CL区上的D/N170D/E；
(3)分别为H1的CH1区上的S131D/E，L1的CL区上的P119K/R，H2的CH1区上的S131K/R，以及L2的CL区上的P119D/E；
(4)分别为H1的CH1区上的A129D/E，L1的CL区上的S121K/R，H2的CH1区上的A129K/R，以及L2的CL区上的S121D/E；
(5)分别为H2的CH1区上的G166D/E，L2的CL区上的S114K/R，H1的CH1区上的G166K/R，以及L1的CL区上的S114D/E；
(6)分别为H2的CH1区上的T187D/E，L2的CL区上的D/N170K/R，H1的CH1区上的T187K/R，以及L1的CL区上的D/N170D/E；
(7)分别为H2的CH1区上的S131D/E，L2的CL区上的P119K/R，H1的CH1区上的S131K/R，以及L1的CL区上的P119D/E；
(8)分别为H2的CH1区上的A129D/E，L2的CL区上的S121K/R，H1的CH1区上的A129K/R，以及L1的CL区上的S121D/E。
2.根据权利要求1所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于
(a)两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中VH区具有不同的氨基酸序列
(b)两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中CH1区具有不同的氨基酸序列。
(c)两个重链H1和H2各自包括VH区、CH1区和Fc区(包含CH2和CH3区)，其中Fc区具有不同的氨基酸序列。
(d)两个轻链L1和L2各自包括VL区和CL区，其中VL区具有不同的氨基酸序列。
(e)两个轻链L1和L2各自包括VL区和CL区，其中CL区具有不同的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，其中H1和H2形成异二聚体。
4.根据权利要求1至3任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述分离的双特异性抗体包括：
(a)H1的CH1中G166、T187、S131或A129处的带负电荷的氨基酸(D或E)，H1上的VH区和L1上的VL区分别有Q39E和Q38K替换突变，H2上的VH区和L2上的VL区分别有Q39K和Q38E替换突变；
(b)H1的CH1上G166,T187,S131或A129处的带正电荷的氨基酸(K或R)，H1上的VH区和L1上的VL区分别有Q39K和Q38E替换突变，H2上的VH区和L2上的VL区分别有Q39E和Q38K替换突变。
5.根据权利要求1至4任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，
其中两个臂之一的CH1和CL区域包括对于CH1而言，对应于SEQ ID NO：17、18、19或20和对于CL而言，对应于SEQ ID NO：21或22的氨基酸位置的氨基酸残基处的氨基酸取代；
其中CH1和CL区域中的氨基酸取代选自：
(1)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的F209C和C214X；
(2)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的F209C和C214X；
(3)CH1上的R133C和C131X，以及CL上的V209C和C214X；
(4)CH1上的K133C和C220X，以及CL上的V209C和C214X；
其中X选自S，A或G。
6.根据权利要求1至5任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一抗原结合域特异性结合CD47，优选人CD47，所述第二抗原结合域特异性结合与CD47在同一细胞上表达的TAA，优选人TAA。
7.根据权利要求6所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第二抗原结合域特异性结合与CD47在同一细胞上表达的CLDN18.2，优选人CLDN18.2。
8.根据权利要求6或7所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗CD47抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，包括以下氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和29；
(2)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和29；
(3)分别为SEQ ID NOs:1,27,2和30；
(4)分别为SEQ ID NOs:1,28,2和30；
(5)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和33；
(6)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和33；
(7)分别为SEQ ID NOs:1,31,2和34；
(8)分别为SEQ ID NOs:1,32,2和34；
(9)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和37；
(10)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和37；
(11)分别为SEQ ID NOs:1,35,2和38；
(12)分别为SEQ ID NOs:1,36,2和38；
(13)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和41；
(14)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和41；
(15)分别为SEQ ID NOs:1,39,2和42；
(16)分别为SEQ ID NOs:1,40,2和42；
(17)分别为SEQ ID NOs:1,43,2和45；
分别为SEQ ID NOs:1,44,2和45；
分别为SEQ ID NOs:1,43,2和46；
分别为SEQ ID NOs:1,44,2和46；
分别为SEQ ID NOs:1,47,2和49；
分别为SEQ ID NOs:1,48,2和49；
分别为SEQ ID NOs:1,47,2和50；
分别为SEQ ID NOs:1,48,2和50；
分别为SEQ ID NOs:1,51,2和53；
分别为SEQ ID NOs:1,52,2和53；
分别为SEQ ID NOs:1,51,2和54；
分别为SEQ ID NOs:1,52,2和54；
分别为SEQ ID NOs:1,55,2和57；
分别为SEQ ID NOs:1,56,2和57；
分别为SEQ ID NOs:1,55,2和58；
分别为SEQ ID NOs:1,56,2和58；
分别为SEQ ID NOs:23,27,24和29；
分别为SEQ ID NOs:23,28,24和29；
分别为SEQ ID NOs:23,27,24和30；
分别为SEQ ID NOs:23,28,24和30；
分别为SEQ ID NOs:25,31,26和33；
分别为SEQ ID NOs:25,32,26和33；
分别为SEQ ID NOs:25,31,26和34；
分别为SEQ ID NOs:25,32,26和34；
分别为SEQ ID NOs:23,35,24和37；
分别为SEQ ID NOs:23,36,24和37；
分别为SEQ ID NOs:23,35,24和38；
分别为SEQ ID NOs:23,36,24和38；
分别为SEQ ID NOs:25,39,26和41；
分别为SEQ ID NOs:25,40,26和41；
(47)分别为SEQ ID NOs:25,39,26和42；
(48)分别为SEQ ID NOs:25,40,26和42；
(49)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和45；
(50)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和45；
(51)分别为SEQ ID NOs:23,43,24和46；
(52)分别为SEQ ID NOs:23,44,24和46；
(53)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和49；
(54)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和49；
(55)分别为SEQ ID NOs:25,47,26和50；
(56)分别为SEQ ID NOs:25,48,26和50；
(57)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和53；
(58)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和53；
(59)分别为SEQ ID NOs:23,51,24和54；
(60)分别为SEQ ID NOs:23,52,24和54；
(61)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和57；
(62)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和57；
(63)分别为SEQ ID NOs:25,55,26和58；或
(64)分别为SEQ ID NOs:25,56,26和58。
9.根据权利要求8所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，第一抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，第二抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，包括以下氨基酸序列：
(1)分别为SEQ ID:1,28,2,29,3,63,4和64；
(2)分别为SEQ ID:1,36,2,37,3,67,4和68；
(3)分别为SEQ ID:1,44,2,45,3,71,4和72；
(4)分别为SEQ ID:1,52,2,53,3,73,4和74；
(5)分别为SEQ ID:1,31,2,34,3,65,4和66；
(6)分别为SEQ ID:1,39,2,42,3,69,4和70；
(7)分别为SEQ ID:1,47,2,50,3,75,4和76；
(8)分别为SEQ ID:1,55,2,58,3,77,4和78；
(9)分别为SEQ ID:23,28,24,29,59,63,60和64；
(10)分别为SEQ ID:23,36,24,37,59,67,60和68；
(11)分别为SEQ ID:23,44,24,45,59,71,60和72；
(12)分别为SEQ ID:23,52,24,53,59,73,60和74；
(13)分别为SEQ ID:25,31,26,34,61,65,62和66；
(14)分别为SEQ ID:25,39,26,42,61,69,62和70；
(15)分别为SEQ ID:25,47,26,50,61,75,62和76；或
(16)分别为SEQ ID:25,55,26,58,61,77,62和78。
10.根据权利要求1至5任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，分离的双特异性抗体或其抗原结合片段包括抗免疫细胞调节剂(ICM)抗体或其抗原结合片段臂，并且能够与ICM特异性结合。
11.根据权利要求10所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述ICM选自CD3、CD16、CD27、CD28、CD40、CD122、NKp46、OX40、4-1BB、GITR、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、VISTA、SIGLEC7、SIGLEC9、KIR、BTLA、B7-H3和其它细胞表面免疫调节分子。
12.根据权利要求1至5和10至11任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中第一抗原结合域特异性结合CD3，优选人CD3，并且VH、CH1、VL和CL分别包含SEQ ID为9、10、11和12的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至5和10至12任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一抗原结合域特异性结合CD3，优选人CD3，所述第二抗原结合域特异性结合DLL3，优选人DLL3。
14.根据权利要求13所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述第一抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，分别包含SEQ ID：9、10、11和12的氨基酸序列，第二抗原结合域包括VH、CH1、VL和CL，分别包含SEQ ID：13、14、15和16的氨基酸序列。
15.一种分离的核酸，编码如权利要求1至14任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段。
16.一种载体，包含如权利要求15所述的分离核酸。
17.一种宿主细胞，包含如权利要求16所述的载体。
18.一种药物组合物，包含如权利要求1至14中任一项所述的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的运载体。
19.一种靶向DLL3的方法，DLL3通过接合T细胞在有此需要的受试者的癌细胞表面上表达，包括向受试者施用如权利要求18所述的药物组合物。
20.一种靶向在有此需要的受试者的癌细胞表面表达的一种或两种抗原的方法，包括采用CD47阻断诱导的巨噬细胞介导的吞噬作用的活化或CD3介导的T细胞活化，和/或治疗有此需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用包含如权利要求1至14中所述任一项的分离的双特异性抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的运载体的药物组合物，任选地，所述癌症选自肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、胆管癌、结肠癌、肝细胞癌、肾细胞癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、头颈癌、宫颈癌、头颈癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤和其他实体瘤，以及非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、急性髓系白血病(AML)和其他液体肿瘤。
21.一种生产如权利要求1至14任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在产生该双特异性抗体或其抗原结合片段的条件下培养包含编码该双特异性抗体或其抗原结合片段的核酸的细胞，以及从该细胞或培养物中回收该双特异性抗体或其抗原结合片段。
22.一种包含如权利要求1至14任一项的双特异性抗体或其抗原结合片段的药物组合物的制造方法，包括将该双特异性抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的运载体结合，以获得该药物组合物。
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