JP2022532534A - ヒト免疫グロブリンヒンジ領域またはそのバリアントである２つの結合ドメイン間のリンカーを含む活性化可能な二重特異性抗体及びその使用 - Google Patents

ヒト免疫グロブリンヒンジ領域またはそのバリアントである２つの結合ドメイン間のリンカーを含む活性化可能な二重特異性抗体及びその使用 Download PDF

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Abstract

患部組織における活性化可能な標的結合を示すタンパク質分子、関連する核酸分子、ベクター及び宿主細胞について本明細書で説明する。そのようなタンパク質分子の医学的用法についても本明細書で説明する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１月２８日に出願の英国特許出願第２００１１９６．１号、２０１９年１２月４日に出願の英国特許出願第１９１７６７８．３号、２０１９年７月１７日に出願の英国特許出願第１９１０２５４．０号、及び２０１９年５月１３日に出願の英国特許出願第１９０６６８５．１号の利益を主張し、これらのそれぞれの開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
電子的に提出されるテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は、参照によりそれら全体が本明細書に援用される：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＵＬＳＬ＿００２＿０４ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、データ記録日：２０２０年５月１１日、ファイルサイズ約３９０キロバイト）。
本発明は、患部組織及びその医学的用途において活性化可能な標的結合を示すタンパク質分子に関する。
疾患を治療する抗体及び他の結合タンパク質の使用において、多くの潜在的な薬物標的が、これまでに説明されてきたが、患部組織でのみ発現するものはほとんどない。実際に、この腔内の潜在的な標的の大部分は非患部組織にも発現する。加えて、がんなどの治療の困難な分野で採用されている薬物作用機序の大部分は、非常に強力な細胞殺傷作用機序を採用している。その結果、非患部組織での薬物による標的への関与は、多くの場合、望ましくない副作用を引き起こす。健康な組織では部分的にあるいは完全に不活性ではあるが、患部組織では非常に活性化される、結合タンパク質の遺伝子操作された形態が必要とされている。
第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列、あるいはヒト免疫グロブリンヒンジ領域と比べると１～約７個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、ペプチドリンカーは患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能であり、第２部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する能力があり、かつペプチドリンカーが切断されない場合、第２部分の患部組織に発現している分子への結合は低減または阻害される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは約５～約１５アミノ酸の長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらで構成される。
いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ヒトカテプシン、ヒトエンテロキナーゼ、ヒトトロンビン、ヒトｔＰＡ、ヒトグランザイムＢ、ヒトｕＰＡまたはヒトＡＤＡＭＴＳ－５である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＭＭＰ切断部位、ヒトカテプシン切断部位、ヒトエンテロキナーゼ切断部位、ヒトトロンビン切断部位、ヒトｔＰＡ切断部位、ヒトグランザイムＢ切断部位、ヒトｕＰＡ切断部位またはヒトＡＤＡＭＴＳ－５切断部位を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＭＭＰは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３またはＭＭＰ１４である。いくつかの実施形態では、患部組織におけるヒトＭＭＰのレベルまたは活性は、非患部組織におけるヒトＭＭＰのレベルまたは活性よりも高い。いくつかの実施形態では、ヒトカテプシンは、カテプシンＡ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＬまたはカテプシンＫである。いくつかの実施形態では、患部組織におけるヒトカテプシンのレベルまたは活性は、非患部組織におけるヒトカテプシンのレベルまたは活性よりも高い。
いくつかの実施形態では、第１部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、またはＴ細胞受容体ドメインである。いくつかの実施形態では、第１部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第１部分は、患部組織に発現している第１分子に特異的に結合し、第２部分は、患部組織に発現している第２分子に特異的に結合する能力があり、ここで、患部組織に発現している第１分子と患部組織に発現している第２分子は異なる分子である。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子と患部組織に発現している第２分子は同じ細胞で発現している。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子と患部組織に発現している第２分子は異なる細胞で発現している。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子及び／または患部組織に発現している第２分子は、細胞の表面に発現している。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子及び／または患部組織に発現している第２分子は、可溶性分子である。
いくつかの実施形態では、第１部分は、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３、ヒトＣＤ１０５、ヒトＣ－ＫＩＴ、ヒトＰＤ１、ヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＰＳＭＡ、ヒトＥｐＣＡＭ、ヒトＴｒｏｐ２、ヒトＥｐｈＡ２、ヒトＣＤ２０、ヒトＢＣＭＡ、ヒトＧＩＴＲ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＳＦ１Ｒ、ヒトＬａｇ３またはヒトｃＭＥＴに特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第２部分は、ヒト免疫細胞で発現している分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ヒト免疫細胞で発現している分子は、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ１６Ｂ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ８９、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＮＫＧ２Ｄ、ヒトＳＩＲＰα、ヒトＳＩＲＰγ、ヒトＰＤ１、ヒトＬａｇ３、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＯＸ４０またはヒトＧＩＴＲである。
いくつかの実施形態では、第１部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第１部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、免疫学的に不活性である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１定常領域、または野生型ヒトＩｇＧ２定常領域である。
いくつかの実施形態では、第２部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはＴ細胞受容体ドメインである。いくつかの実施形態では、第２部分は、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２部分は、ヒトＣＤ３またはヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。
いくつかの実施形態では、第２部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。いくつかの実施形態では、第２部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部を含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、免疫学的に不活性である。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１定常領域、または野生型ヒトＩｇＧ２定常領域である。
いくつかの実施形態では、タンパク質は、１つの免疫エフェクター機能、または２つ、３つもしくはそれ以上の免疫エフェクター機能を有する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰである。
いくつかの実施形態では、第１部分は、第２部分の患部組織に発現している分子への特異的結合を阻止または低減する。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、患部組織の近くまたは患部組織の内部で切断される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、患部組織の近くまたは患部組織の内部で切断され、ここで、第１部分は患部組織の近くまたは患部組織の内部で第２部分から解離し、かつ第２部分は患部組織の近くまたは患部組織の内部で患部組織に発現している分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、患部組織は、腫瘍または炎症組織である。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、ここで、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、ここで、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、ここで、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、ここで、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、ここで、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｂ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｃ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｄ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｅ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｆ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｇ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｈ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号８８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｉ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｊ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｋ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｌ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｍ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｎ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｏ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、第２部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｂ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｃ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｄ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される。
治療剤に連結された本発明のタンパク質を含む免疫複合体を本明細書でさらに提供する。いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞毒、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、細胞増殖抑制酵素、細胞溶解酵素、治療用核酸、抗血管新生剤、抗増殖剤、またはアポトーシス促進剤である。
本発明のタンパク質または本発明の免疫複合体、及び薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む医薬組成物を本明細書でさらに提供する。
本発明のタンパク質またはタンパク質の一部をコードする核酸分子を本明細書でさらに提供する。本発明のタンパク質の第１ポリペプチド鎖、第２ポリペプチド鎖、または第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸分子を本明細書でさらに提供する。
本発明の核酸分子を含む発現ベクターを本明細書でさらに提供する。
本発明の核酸分子または本発明の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を本明細書でさらに提供する。
タンパク質を生成する方法を本明細書でさらに提供するが、この方法は、核酸分子が発現され、それによりタンパク質が生成される条件下で、本発明の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することと、宿主細胞または培養物からタンパク質を単離することと、を含む。
対象における抗がん免疫応答を増強する方法を本明細書でさらに提供するが、この方法は、治療上有効な量の本発明のタンパク質、本発明の免疫複合体、または本発明の医薬組成物を対象へ投与することを含む。
対象におけるがん、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患または線維性疾患を治療する方法を本明細書でさらに提供するが、この方法は、治療上有効な量の本発明のタンパク質、本発明の免疫複合体、または本発明の医薬組成物を対象へ投与することを含む。いくつかの実施形態では、がんは、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織癌である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患は、関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、グレーブス病、橋本甲状腺炎または強直性脊椎炎である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、冠状動脈性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症もしくは脳卒中である。いくつかの実施形態では、線維性疾患は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、嚢胞性線維症、気管支炎または喘息である。
がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患または線維性疾患の治療で用いる、本発明のタンパク質、本発明の免疫複合体、または本発明の医薬組成物を本明細書でさらに提供する。いくつかの実施形態では、がんは、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織癌である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患は、関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、グレーブス病、橋本甲状腺炎または強直性脊椎炎である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症または脳卒中である。いくつかの実施形態では、線維性疾患は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、嚢胞性線維症、気管支炎または喘息である。
医薬品として用いる、本発明のタンパク質、本発明の免疫複合体、または本発明の医薬組成物を本明細書でさらに提供する。
一例として、固形腫瘍への活性抗体薬、抗ＣＤ４７を全身投与する際の課題を示す。この図のＣＤ４７抗体は、血流内のＣＤ４７の発現量が多いといった重要な課題を有する。特に赤血球及び血小板では、「シンク」及び毒性リスク問題が生じる。また、腫瘍は、典型的には、ＩｇＧ分解を加速するＭＭＰなどの酵素の発現量が多い「好ましくない」環境である。 一例として、固形腫瘍への活性抗体薬、抗ＣＤ４７を全身投与する際の課題を示す。この図の本発明の抗ＣＤ４７タンパク質構築物は、ネイティブタンパク質でのＣＤ４７結合を排除し、それにより周辺の活性を取り消すことを目的としていることを示す。次に、腫瘍標的ドメインが、腫瘍環境で高濃度化を促進し、ペプチドリンカー系が腫瘍におけるＭＭＰ活性を利用し、周辺部よりも腫瘍におけるＣＤ４７結合活性を活性化する。 タンパク質構築物ＩｇＧ２の設計及び活性化原理を示す。タンパク質構築物ＩｇＧ２設計（Ａ）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来する配列に基づいてよく、またエフェクター機能能力を有していてもいなくてもよい。この構築物では、４つのポリペプチド鎖は４つのＦａｂドメイン（２個のＦａｂ Ａ、２個のＦａｂ Ｂ）、２つのリンカー配列をコードし、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよい。各Ｆａｂ Ａ－リンカードメインは、Ｆａｂ Ｂの結合活性をブロックする。免疫グロブリンからの下部ヒンジペプチド配列などのリンカー配列の選択により、非患部組織では抑え込まれるが、腫瘍環境における高濃度のプロテアーゼの存在下では素早く切断され、開放される構造体を作る（Ｂ）。リンカーは、順次切断され得、中間の開放された活性化状態を作り、それにより、単一のタンパク質構築物からのＦａｂ Ａ及びＢが、それらの同族の標的に結合することが可能になる。各Ｆａｂ Ａ－Ｆａｂ Ｂタンパク質構築物ユニット中の第２リンカーの潜在的により遅い二次切断により、Ｆａｂ Ａドメインが構造体から完全に解放され、解離した形態となり得る。免疫グロブリンヒンジ配列に基づく切断されたリンカーはまた、内因性抗ヒンジ抗体を介して細胞膜で免疫エフェクター機能の増大を動員する可能性がある。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 タンパク質構築物ＩｇＧ２の設計及び活性化原理を示す。タンパク質構築物ＩｇＧ２設計（Ａ）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来する配列に基づいてよく、またエフェクター機能能力を有していてもいなくてもよい。この構築物では、４つのポリペプチド鎖は４つのＦａｂドメイン（２個のＦａｂ Ａ、２個のＦａｂ Ｂ）、２つのリンカー配列をコードし、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよい。各Ｆａｂ Ａ－リンカードメインは、Ｆａｂ Ｂの結合活性をブロックする。免疫グロブリンからの下部ヒンジペプチド配列などのリンカー配列の選択により、非患部組織では抑え込まれるが、腫瘍環境における高濃度のプロテアーゼの存在下では素早く切断され、開放される構造体を作る（Ｂ）。リンカーは、順次切断され得、中間の開放された活性化状態を作り、それにより、単一のタンパク質構築物からのＦａｂ Ａ及びＢが、それらの同族の標的に結合することが可能になる。各Ｆａｂ Ａ－Ｆａｂ Ｂタンパク質構築物ユニット中の第２リンカーの潜在的により遅い二次切断により、Ｆａｂ Ａドメインが構造体から完全に解放され、解離した形態となり得る。免疫グロブリンヒンジ配列に基づく切断されたリンカーはまた、内因性抗ヒンジ抗体を介して細胞膜で免疫エフェクター機能の増大を動員する可能性がある。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 タンパク質構築物Ｆａｂ２の設計及び活性化原理を示す。タンパク質構築物Ｆａｂ２設計は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来する配列に基づいてよく、またエフェクター機能能力を有していてもいなくてもよい。この構築物では２つのポリペプチド鎖（Ａ）または３つのポリペプチド鎖（Ｂ）は２つのＦａｂドメイン（１個のＦａｂ Ａ、１個のＦａｂ Ｂ）、２つ以上のリンカー配列をコードし、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよいが、この際、ヘテロ二量体のペアリングはＦｃにおける変異によって誘導されてもされなくてもよい。各Ｆａｂ Ａ－リンカードメインは、Ｆａｂ Ｂの結合活性をブロックする。下部ヒンジペプチド配列などのリンカー配列の選択により、非患部組織では抑え込まれるが、腫瘍環境における高濃度のプロテアーゼの存在下では素早く切断され、開放される構造体を作る（Ａ）。リンカーは、順次切断され得、中間の開放された活性化状態を作り、それにより、単一のタンパク質のＦａｂ Ａ及びＢが、それらの同族の標的に結合することが可能になる。各Ｆａｂ Ａ－Ｆａｂ Ｂタンパク質ユニット中の第２リンカーの潜在的により遅い二次切断により、構造体から完全にＦａｂ Ａドメインを解放することができる。免疫グロブリンヒンジ配列に基づく切断されたリンカーはまた、内因性抗ヒンジ抗体を介して細胞膜で免疫エフェクター機能の増大を動員する可能性がある。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 タンパク質構築物Ｆａｂ２の設計及び活性化原理を示す。タンパク質構築物Ｆａｂ２設計は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来する配列に基づいてよく、またエフェクター機能能力を有していてもいなくてもよい。この構築物では２つのポリペプチド鎖（Ａ）または３つのポリペプチド鎖（Ｂ）は２つのＦａｂドメイン（１個のＦａｂ Ａ、１個のＦａｂ Ｂ）、２つ以上のリンカー配列をコードし、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよいが、この際、ヘテロ二量体のペアリングはＦｃにおける変異によって誘導されてもされなくてもよい。各Ｆａｂ Ａ－リンカードメインは、Ｆａｂ Ｂの結合活性をブロックする。下部ヒンジペプチド配列などのリンカー配列の選択により、非患部組織では抑え込まれるが、腫瘍環境における高濃度のプロテアーゼの存在下では素早く切断され、開放される構造体を作る（Ａ）。リンカーは、順次切断され得、中間の開放された活性化状態を作り、それにより、単一のタンパク質のＦａｂ Ａ及びＢが、それらの同族の標的に結合することが可能になる。各Ｆａｂ Ａ－Ｆａｂ Ｂタンパク質ユニット中の第２リンカーの潜在的により遅い二次切断により、構造体から完全にＦａｂ Ａドメインを解放することができる。免疫グロブリンヒンジ配列に基づく切断されたリンカーはまた、内因性抗ヒンジ抗体を介して細胞膜で免疫エフェクター機能の増大を動員する可能性がある。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 クローン１～１５からのタンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。複数の例示的な構築物タンパク質を、ＣＨＯ細胞で出現させ、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。次に、精製したタンパク質を、非還元と還元（ｒ）状態の両方で、分子量標準（Ｍ）と共にＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）は、予想されたサイズの生成物の構成比率が最も高く、高分子量及び低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 タンパク質Ａ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。選択した例示的構築物タンパク質をＳＥＣを使用して分析及び完全に精製した。クローン１（図５Ａ）、２（図５Ｂ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）、６（図５Ｆ）、１２（図５Ｇ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）を分析した。このデータは、クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）の試料では、予想されたサイズの生成物の比率が最も高い（例えば、ハイライトされたピーク、図５Ｉ）ことを示し、かつ高／低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 ＳＥＣ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。タンパク質Ａ親和性精製主要リードタンパク質構築物クローンをＳＥＣを使用して最終的に精製した。次に、クローン１、２、４、５、６からの精製タンパク質、及び非ＳＥＣ精製１５（Ａ）を、非還元状態でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。クローン７、８、１０、１１、１２、１３及び１４からの精製タンパク質（Ｂ）もまた、非還元と還元（ｒ）状態の両方で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。全てのタンパク質をレーンごとに約１μｇロードした。クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）は、予想されたサイズの生成物の構成比率が最も高く、高分子量及び低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 ＳＥＣ精製タンパク質構築物ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。タンパク質Ａ親和性精製主要リードタンパク質構築物クローンをＳＥＣを使用して最終的に精製した。次に、クローン１、２、４、５、６からの精製タンパク質、及び非ＳＥＣ精製１５（Ａ）を、非還元状態でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。クローン７、８、１０、１１、１２、１３及び１４からの精製タンパク質（Ｂ）もまた、非還元と還元（ｒ）状態の両方で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に供した。全てのタンパク質をレーンごとに約１μｇロードした。クローン６、１０及び１４（全てＬＨＬリンカーを含む）は、予想されたサイズの生成物の構成比率が最も高く、高分子量及び低分子量の生成物の構成比率が最も低いことが判明した。 精製したインタクトタンパク質構築物及び対照抗体のヒト標的タンパク質への結合の直接滴定ＥＬＩＳＡを示す。対照抗体Ａ－Ｄ５抗ＣＤ４７、Ａ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃ（Ａ－Ｄ５抗体の一価型）、ＭＨ７．１抗Ｃ－ＭＥＴ、及び抗Ｈｅｒ２トラスツズマブを、全てヒトＩｇＧ１形式で、ヒトＣＤ４７、Ｃ－ＭＥＴ及びＨｅｒ２タンパク質に対して直接結合ＥＬＩＳＡで滴定した（単位μｇ／ｍｌ）。 精製したインタクトタンパク質構築物及び対照抗体のヒト標的タンパク質への結合の直接滴定ＥＬＩＳＡを示す。ＩｇＧ２形式のＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨ及びＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ヒトＣＤ４７、Ｃ－ＭＥＴ及びＨｅｒ２タンパク質に対して直接結合ＥＬＩＳＡで滴定した（単位μｇ／ｍｌ）。 精製したインタクトタンパク質構築物及び対照抗体のヒト標的タンパク質への結合の直接滴定ＥＬＩＳＡを示す。Ｆａｂ２形式のｃＭＥＴＣＤ４７－Ｌ２－Ｌ２及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ヒトＣＤ４７、Ｃ－ＭＥＴ及びＨｅｒ２タンパク質に対して直接結合ＥＬＩＳＡで滴定した（単位μｇ／ｍｌ）。 精製したインタクトタンパク質構築物及び対照抗体のヒト赤血球凝集アッセイを示す。対照抗体抗ＣＤ２３５ａ（マウス）及びＡ－Ｄ５抗ＣＤ４７、Ａ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃ（Ａ－Ｄ５抗体の一価型、「ＦａｂＣＤ４７単独」と記載されている）、ＭＨ７．１抗Ｃ－ＭＥＴ、抗Ｈｅｒ２トラスツズマブ、ＩｇＧ２形式のＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨ及びＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ、ならびにＦａｂ２形式のｃＭＥＴＣＤ４７－Ｌ２－Ｌ２及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ドナー１からの新鮮な赤血球を使用して、ヒト赤血球凝集アッセイで滴定した（単位ｎＭ）。 精製したインタクトタンパク質構築物及び対照抗体のヒト赤血球凝集アッセイを示す。対照抗体抗ＣＤ２３５ａ（マウス）及びＡ－Ｄ５抗ＣＤ４７、Ａ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃ（Ａ－Ｄ５抗体の一価型、「ＦａｂＣＤ４７単独」と記載されている）、ＭＨ７．１抗Ｃ－ＭＥＴ、抗Ｈｅｒ２トラスツズマブ、ＩｇＧ２形式のＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨ及びＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ、ならびにＦａｂ２形式のｃＭＥＴＣＤ４７－Ｌ２－Ｌ２及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ドナー２からの新鮮な赤血球を使用して、ヒト赤血球凝集アッセイで滴定した（単位ｎＭ）。 精製したインタクトタンパク質構築物及び対照抗体のヒト赤血球凝集アッセイを示す。対照抗体抗ＣＤ２３５ａ（マウス）及びＡ－Ｄ５抗ＣＤ４７、Ａ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃ（Ａ－Ｄ５抗体の一価型、「ＦａｂＣＤ４７単独」と記載されている）、ＭＨ７．１抗Ｃ－ＭＥＴ、抗Ｈｅｒ２トラスツズマブ、ＩｇＧ２形式のＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨ及びＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ、ならびにＦａｂ２形式のｃＭＥＴＣＤ４７－Ｌ２－Ｌ２及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ドナー３からの新鮮な赤血球を使用して、ヒト赤血球凝集アッセイで滴定した（単位ｎＭ）。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ３、７及び１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ３、７及び１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ３、７及び１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＣ－ＭＥＴ及びヒトＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の機能分析を示す。Ｆａｂ２形式の抗体Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ１－ＬＨ、Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ２－Ｌ２及びＨｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ＭＭＰ消化を伴わずにＥＬＩＳＡによって分析した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の機能分析を示す。Ｆａｂ２形式の抗体Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ１－ＬＨ、Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ２－Ｌ２及びＨｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ＭＭＰ消化を伴って、または伴わずにフローサイトメトリーによって分析した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の機能分析を示す。Ｆａｂ２形式の抗体Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ１－ＬＨ、Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ２－Ｌ２及びＨｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ＭＭＰ消化を伴って、または伴わずにＣＤ３レポーターアッセイによって分析した。 タンパク質構築物設計及び活性化原理に基づく代替的構造体を示す。図２及び３のＦａｂ２とＩｇＧ２の設計の両方で検討したタンパク質構築物モジュール（１）を改変して、最終の分子機能特性を変えることができる。この場合、タンパク質構築物モジュールの上部結合ユニットもしくは下部ユニット、またはその両方は、免疫グロブリンＦａｂドメインの代替的構造体であってもよく、ペプチドに由来する配列、受容体外部ドメイン、結合ドメイン及び特にＴ細胞受容体などの他の二量体免疫認識受容体に基づく代替的分子を可能にする。これらの構築物は多くの形式を形成することが可能であり、いくつかの例を本明細書で提供する。例えば、４つのポリペプチド鎖（２）は、４つの結合ドメインユニット（１個のＡ、１個のＢ、または２個のＡもしくはＢ）を含む２つの完全なタンパク質構築物モジュール、２つ以上のリンカー配列を含むＩｇＧ２様構造体をコードすることができ、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよいが、この際、ヘテロ二量体のペアリングはＦｃにおける変異によって誘導されてもされなくてもよい。この図または図２もしくは３で概説する構造体のいずれも、任意の種類のポリペプチド鎖のＣ末端融合物のＮ末端を加えることによって、または化学的複合体化によってさらに機能化され得ることに留意されたい。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 タンパク質構築物設計及び活性化原理に基づく代替的構造体を示す。３つのポリペプチドの発現では、Ｆａｂ２設計は、構造体を潜在的な三重特異性にするかまたはその結合価を変更する結合ドメイン（３）またはペプチドを加えることによって補強することができる。三重特異性または変更される結合価はまた、Ｆａｂ２設計で、Ｃ末端にタンパク質構築物リンカーＦａｂ／受容体構造体をさらに１つ（４）または２つ（５）加えることによって実現され得る。この図または図２もしくは３で概説する構造体のいずれも、任意の種類のポリペプチド鎖のＣ末端融合物のＮ末端を加えることによって、または化学的複合体化によってさらに機能化され得ることに留意されたい。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 Ｆａｂ２タンパク質構築物原理に基づく「受動的」構造体を示す。この場合、タンパク質構築物モジュールの上部結合ユニットは、ＦｃドメインのＣ末端に配置されてよい。これらの構築物は、免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよいが、この際、ヘテロ二量体のペアリングはＦｃにおける変異によって誘導されてもされなくてもよい。この構築物では、両方のＦａｂまたは受容体ドメインのそれらの同族標的への結合は、少なくとも１つのリンカーの切断後にのみ完全に活性化状態になる必要がある。この図で概説する構造体のいずれも、任意の種類のポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端融合物を加えることによって、または化学的複合体化によってさらに機能化され得ることにもまた留意されたい。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 Ｆａｂ２タンパク質構築物原理に基づく「活性化可能な」抗体薬物複合体（ＡＤＣ）戦略を示す。この場合、タンパク質構築物モジュールの上部及び下部結合ユニットは、同じ細胞の表面に見られる同じ内部移行受容体標的または２つの異なる標的に対する抗体を含む場合がある。これらの構築物は、毒素または他の活性分子などの「ペイロード」部分と化学的に複合体化するかまたは融合してＡＤＣを形成することができ、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよいが、この際、ヘテロ二量体のペアリングはＦｃにおける変異によって誘導されてもされなくてもよい。この構築物では、上部Ｆａｂまたは受容体ドメインのその同族標的への結合は、構成的に活性であり、その同族標的が発現する組織における抗体の蓄積をもたらす。結合が一価であり、かつ２つ以上の受容体ドメインが二価の抗体結合によって架橋される場合にのみ受容体が有意に内部移行することが知られているように、構築物は、最初は標的細胞への内部移行を促進しない。第２（下部）Ｆａｂまたは受容体ドメインの活性は、疾患関連酵素によるリンカー切断後にのみ起こる必要があり、これにより、続いて多価の受容体結合及びＡＤＣの内部移行が誘導され、（例えば、細胞傷害性または炎症性）ペイロード部分の送達が可能になる。この図で概説する構造体のいずれも、任意の種類のポリペプチド鎖のＮ末端またはＣ末端融合物を加えることによって、さらに機能化され得ることにもまた留意されたい。 精製した、インタクトタンパク質構築物のヒト及びマウス標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。試料を、ヒトＨｅｒ２ならびにヒト及びマウスＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに適用した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ７を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ８を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１０を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１３を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトカテプシンＳを使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 Ａ～Ｂは、精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦのヒト標的タンパク質への結合のＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲアッセイを示す。Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（未消化）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、抗Ｆｃ抗体をコーティングしたＢｉａｃｏｒｅチップ上に捕捉し、ヒトＨｅｒ２（Ａ）またはヒトＣＤ４７（Ｂ）を溶液中に流した。Ｒｍａｘ値をプロットし、分析物タンパク質の最高濃度で観察された最大結合を表示した。 精製した、インタクト及び２４時間ＭＭＰ消化Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦのヒト標的タンパク質への結合のＢｉａｃｏｒｅ ＳＰＲアッセイを示す。Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、２４時間のインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、または陰性対照として酵素を伴わずに２４時間のインキュベーションを行った（「プロテアーゼ処理前」）。次に、試料を、抗Ｆｃ抗体をコーティングしたＢｉａｃｏｒｅチップ上に捕捉し、ヒトＣＤ４７を複数の濃度で溶液中に流した。結合曲線は、ヒトＣＤ４７が４００ｎＭであっても、未消化（インタクト）Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦタンパク質とヒトＣＤ４７との相互作用がないことを示し、その一方で、ＭＭＰ１２活性化後の同じタンパク質では、試験した全ての濃度で強い結合が見られた。 完全なＨｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ ＩｇＧ２構造体の構造的モデリングを示す。Ｈｅｒ２エピトープ（灰色）と接触した上部（トラスツズマブ）Ｆａｂドメインを示したＩｇＧ２分子の完全な構造体の分子モデリングである。この分析は、両方のリンカーがインタクトな場合にはＣＤ４７エピトープが結合できないことを示している。 完全なＨｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ ＩｇＧ２構造体の構造的モデリングを示す。上部（トラスツズマブ）ＦａｂドメインがＨｅｒ２エピトープ（灰色）と接触しているが、ＣＤ４７外部ドメインもまたＡ－Ｄ５下部Ｆａｂの結合可能性のある位置に重なり合っていることを示したＩｇＧ２分子の完全な構造体の分子モデリングである。この分析は、両方のリンカーがインタクトな場合にはＣＤ４７エピトープが結合できないことを示している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。ＬＨＬリンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。ＬＨＬリンカーに対して９回の動力学法を全て６ナノ秒間実行した場合の絶対ＳＡＳＡ値を示す。配列番号２を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。ＬＨＬリンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。６ナノ秒の動力学法実行時間にわたる開始時のＳＡＳＡ値との差を表す正規化結果を示す。配列番号２を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。ＬＨＬリンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。６ナノ秒の動力学法実行のうち最初の２．５ナノ秒にわたる開始時のＳＡＳＡ値との差を表す正規化結果を示す。配列番号２を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。ＬＨＬＦリンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。ＬＨＬＦリンカーに対して９回の動力学法を全て６ナノ秒間実行した場合の絶対ＳＡＳＡ値を示す。配列番号３を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。ＬＨＬＦリンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。６ナノ秒の動力学法実行時間にわたる開始時のＳＡＳＡ値との差を表す正規化結果を示す。配列番号３を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。ＬＨＬＦリンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。６ナノ秒の動力学法実行のうち最初の２．５ナノ秒にわたる開始時のＳＡＳＡ値との差を表す正規化結果を示す。配列番号３を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。Ｌ２リンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。Ｌ２を用いて１０回の動力学法を全て６ナノ秒間実行した場合の絶対ＳＡＳＡ値を示す。配列番号３２を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。Ｌ２リンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。６ナノ秒の動力学法実行時間にわたる開始時のＳＡＳＡ値との差を表す正規化結果を示す。配列番号３２を表している。 異なるリンカーを有するＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。Ｌ２リンカーの場合の得られた溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の結果を示す。ｎｓの動力学法実行のうち最初の２．５ナノ秒にわたる開始時のＳＡＳＡ値との差を表す正規化結果を示す。配列番号３２を表している。 インタクト及び活性化したＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。インタクトなリンカーと活性化した（単一のリンカーがプロテアーゼによって切断された）形態の両方での重なり合ったＦａｂ２構造体を示す。 インタクト及び活性化したＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ Ｆａｂ２構造体の構造的動特性を示す。１つのＬＨＬまたはＬＨＬＦリンカーが切断された状態のＦａｂ２領域の分子動力学シミュレーションから得た２つのポーズを示す。抗ＣＤ４７ Ｆａｂを黒色、抗ＨＥＲ２ Ｆａｂを灰色で示す。図は、Ｈｅｒ２ドメインの最も遠い移動の度合と、その結果として生じる抗ＣＤ４７ Ｆａｂ ＣＤＲの露出を示している。 タンパク質の「Ｔｇ３２」マウス赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を示す。赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用して実施した。抗ヒトＰＥ複合体化二次抗体を使用して結合を測定した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１を０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌで試験した。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌで試験した。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌで試験した。Ｆａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌで試験した。 「Ｔｇ３２」マウス赤血球凝集分析を示す。赤血球の凝集を、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用して実施した。タンパク質を、複数のドナーマウスからのプールされた新鮮な赤血球を使用して滴定した（単位ｎＭ）。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：体重分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。次に、６０日間体重をモニターした。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１の１０ｍｇ／ｋｇの用量では忍容性がなく、１日目にコホートを終了した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５日目の網状赤血球分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、網状赤血球レベルを測定した。２ｍｇ／ｋｇ用量のＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１は、網状赤血球レベルの著しい上昇を示した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、網状赤血球レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、赤血球（ＲＢＣ）レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、ヘモグロビンレベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、赤血球中の平均ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、平均赤血球容積（ＭＣＶ）レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、白血球レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、単球レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、リンパ球レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、好塩基球レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、好酸球レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける忍容性研究：投与後５、２９及び６０日目の血液学的分析を示す。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した忍容性研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。血液試料を採取し、好中球レベルを測定した。 「Ｔｇ３２」マウスにおける薬物動態研究：２つの用量での分子ごとのデータを示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した薬物動態研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１を２ｍｇ／ｋｇ投与した。血清試料を採取し、投与後３０分から最大４２日までヒトＩｇＧレベルを測定した（単位μｇ／ｍｌ）。 「Ｔｇ３２」マウスにおける薬物動態研究：用量ごとのデータを示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した薬物動態研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１を２ｍｇ／ｋｇ投与した。血清試料を採取し、投与後３０分から最大４２日までヒトＩｇＧレベルを測定した（単位μｇ／ｍｌ）。２ｍｇ／ｋｇ用量での濃度をそれぞれプロットした。参照用にＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１の２ｍｇ／ｋｇ用量を分析に含めた。 「Ｔｇ３２」マウスにおける薬物動態研究：用量ごとのデータを示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した薬物動態研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１を２ｍｇ／ｋｇ投与した。血清試料を採取し、投与後３０分から最大４２日までヒトＩｇＧレベルを測定した（単位μｇ／ｍｌ）。１０ｍｇ／ｋｇ用量での濃度をそれぞれプロットした。参照用にＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１の２ｍｇ／ｋｇ用量を分析に含めた。 「Ｔｇ３２」マウスにおける薬物動態研究：用量ごとのＡＵＣデータを示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用した薬物動態研究を、Ｔｇ３２マウスに全てのタンパク質を２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの濃度で投与して実施した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１を２ｍｇ／ｋｇ投与した。血清試料を採取し、投与後３０分から最大４２日までヒトＩｇＧレベルを測定した（単位μｇ／ｍｌ）。経時的な濃度測定値を使用して、用量ごとの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。 ＮＨＰ赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を示す。赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を、Ａ－Ｄ５ ３Ｍ（エフェクターヌル）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びトラスツズマブを使用して実施した。抗ヒトＰＥ複合体化二次抗体を使用して結合を測定した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１は、ＮＨＰ（カニクイザル）赤血球への濃度依存性結合を示した唯一のタンパク質であった。 ヒト赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を示す。赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を、Ａ－Ｄ５ ３Ｍ（エフェクターヌル）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びトラスツズマブを使用して実施した。抗ヒトＰＥ複合体化二次抗体を使用して結合を測定した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１は、ヒト赤血球への濃度依存性結合を示した唯一のタンパク質であった。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ７．４で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ３を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ６．０でのヒトＭＭＰ３を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ７．４で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ７を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ６．０でのヒトＭＭＰ７を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ７．４で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ８を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ６．０でのヒトＭＭＰ８を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ７．４で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１０を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ６．０でのヒトＭＭＰ１０を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ７．４で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ６．０でのヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ７．４で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１３を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ６．０でのヒトＭＭＰ１３を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ７．４で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１４を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化（ｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ６．０でのヒトＭＭＰ１４を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びカテプシン消化（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４またはｐＨ６．０でのヒトカテプシン酵素を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びカテプシン消化（ｐＨ７．４及びｐＨ６．０で消化）タンパク質構築物のヒト標的タンパク質への結合の直接ＥＬＩＳＡを示す。タンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４またはｐＨ６．０でのヒトカテプシン酵素を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 ヒトがん細胞への結合のフローサイトメトリー分析を示す。赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を、抗ＣＤ４７、トラスツズマブ、ＩｇＧ１アイソタイプ、及び、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを使用して実施した。抗ヒトＰＥ複合体化二次抗体を使用して結合を測定した。高Ｈｅｒ２細胞株ＢＴ－４７４での結合を測定した。 ヒトがん細胞への結合のフローサイトメトリー分析を示す。赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を、抗ＣＤ４７、トラスツズマブ、ＩｇＧ１アイソタイプ、及び、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用して実施した。抗ヒトＰＥ複合体化二次抗体を使用して結合を測定した。高Ｈｅｒ２細胞株ＢＴ－４７４での結合を測定した。 ヒトがん細胞への結合のフローサイトメトリー分析を示す。赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を、抗ＣＤ４７、トラスツズマブ、ＩｇＧ１アイソタイプ、及び、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを使用して実施した。抗ヒトＰＥ複合体化二次抗体を使用して結合を測定した。低Ｈｅｒ２ＭＣＦ－７での結合を測定した。 ヒトがん細胞への結合のフローサイトメトリー分析を示す。赤血球への結合のフローサイトメトリー分析を、抗ＣＤ４７、トラスツズマブ、ＩｇＧ１アイソタイプ、及び、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを使用して実施した。抗ヒトＰＥ複合体化二次抗体を使用して結合を測定した。低Ｈｅｒ２ＭＣＦ－７での結合を測定した。 ＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬまたはＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬまたはＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの試料について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。 ＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの質量分析を示す。２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの試料について、質量分析を実施した。インタクトＬＨＬリンカーを示すペプチドの存在を測定した。この図は配列番号１１０を表している。 ＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの質量分析を示す。２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの試料について、質量分析を実施した。ＭＭＰ１２切断リンカーを示すペプチドの存在を測定した。この図は配列番号１１１を表している。 タンパク質Ａ精製Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡタンパク質を、ＣＨＯ細胞で発現させ、ＰｒｏＡカラムによって精製し、かつＳＥＣによって分析した。２つの小さな高ＭＷピーク、及び予想されたサイズの生成物の大きなピーク（１０．３０、約２５０ｋＤａ）が観察された。 Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡのサイズ排除クロマトグラフィーからの精製ピーク画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡの非還元試料について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。レーン１－分子量標準、レーン２－総ＰｒｏＡ溶出タンパク質、レーン３－ブランク、レーン４－ピーク１、レーン５－ピーク２、レーン６－ピーク３（目的の生成物）。 Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡのサイズ排除クロマトグラフィーからの精製ピーク画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡの還元試料について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。レーン１－分子量標準、レーン２－総ＰｒｏＡ溶出タンパク質、レーン３－ブランク、レーン４－ピーク１、レーン５－ピーク２、レーン６－ピーク３（目的の生成物）。 精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化Ｈｅｒ４７ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡタンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡを２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーション（０、２、４、８、２４時間のインキュベーション）も行った。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びマウスＥｐＣＡＭに対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化Ｈｅｒ４７ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡタンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡを２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーション（０、２、４、８、２４時間のインキュベーション）も行った。続いて、消化試料（濃い灰色）及び未消化試料（薄い灰色）について、ヒトＣＤ４７に対するＥＬＩＳＡを実施した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化Ｈｅｒ４７ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡを２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーション（０、２、４、８、２４時間のインキュベーション）も行った。各試料について、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実施した。レーン１－分子量マーカー、レーン２－０時間消化、レーン３－２時間消化、レーン４－８時間消化及びレーン５－２４時間消化。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＥＫからの精製したタンパク質をヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７標的に対して滴定ＥＬＩＳＡにて試験した。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＥＫからの精製したタンパク質を経時的な酵素消化に供し、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７標的に対する結合のＥＬＩＳＡを行った。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｔｈｒからの精製したタンパク質をヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７標的に対して滴定ＥＬＩＳＡにて試験した。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｔｈｒからの精製したタンパク質を経時的な酵素消化に供し、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７標的に対する結合のＥＬＩＳＡを行った。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｔＰＡからの精製したタンパク質をヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７標的に対して滴定ＥＬＩＳＡにて試験した。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｔＰＡからの精製したタンパク質を経時的な酵素消化に供し、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７標的に対する結合のＥＬＩＳＡを行った。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｕＰＡからの精製したタンパク質をヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７標的に対して滴定ＥＬＩＳＡにて試験した。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｕＰＡからの精製したタンパク質を経時的な酵素消化に供し、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７標的に対する結合のＥＬＩＳＡを行った。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＧｒＢからの精製したタンパク質をヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７標的に対して滴定ＥＬＩＳＡにて試験した。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＧｒＢからの精製したタンパク質を経時的な酵素消化に供し、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７標的に対する結合のＥＬＩＳＡを行った。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ａ５からの精製したタンパク質をヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７標的に対して滴定ＥＬＩＳＡにて試験した。 代替的リンカー組成を有する精製した、インタクト及びＭＭＰ１２消化ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の直接ＥＬＩＳＡを示す。クローンＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ａ５からの精製したタンパク質を経時的な酵素消化に供し、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７標的に対する結合のＥＬＩＳＡを行った。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおける反復投与忍容性研究：体重分析を示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを使用した忍容性研究を、全てのタンパク質を５日ごとに合計４回投与して実施した。 タンパク質Ａ精製Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓを、ＣＨＯ細胞で発現させ、ＰｒｏＡカラムによって精製し、ＳＥＣによって分析した。 タンパク質Ａ精製Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓを、ＣＨＯ細胞で発現させ、ＰｒｏＡカラムによって精製し、ＳＥＣによって分析した。 タンパク質Ａ精製Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬを、ＣＨＯ細胞で発現させ、ＰｒｏＡカラムによって精製し、ＳＥＣによって分析した。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬは、低分子量の不純物（ピーク１５．３８）を示した。 タンパク質Ａ精製Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬを、ＣＨＯ細胞で発現させ、ＰｒｏＡカラムによって精製し、ＳＥＣによって分析した。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬは、低分子量の不純物（ピーク１５．３８）を示した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質の低Ｈｅｒ２ ＭＣＦ－７細胞を使用したＣＤ３相互関与バイオアッセイ分析を示す。抗体Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓを、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、標的細胞としてＭＣＦ－７細胞を使用するＰｒｏｍｅｇａジャーカット細胞ＣＤ３レポーターアッセイに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質の低Ｈｅｒ２ ＭＣＦ－７細胞を使用したＣＤ３相互関与バイオアッセイ分析を示す。抗体Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓを、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、標的細胞としてＭＣＦ－７細胞を使用するＰｒｏｍｅｇａジャーカット細胞ＣＤ３レポーターアッセイに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質の高Ｈｅｒ２ ＢＴ－４７４細胞を使用したＣＤ３相互関与バイオアッセイ分析を示す。対照抗体の０．１μｇ／ｍｌを、標的細胞としてＢＴ－４７４細胞を使用するＰｒｏｍｅｇａジャーカット細胞ＣＤ３レポーターアッセイに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質の高Ｈｅｒ２ ＢＴ－４７４細胞を使用したＣＤ３相互関与バイオアッセイ分析を示す。２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓの０．１μｇ／ｍｌを、標的細胞としてＢＴ－４７４細胞を使用するＰｒｏｍｅｇａジャーカット細胞ＣＤ３レポーターアッセイに供した。 精製した、インタクト及びＭＭＰ消化Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２タンパク質の高Ｈｅｒ２ ＢＴ－４７４細胞を使用したＣＤ３相互関与バイオアッセイ分析を示す。２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでｐＨ７．４でのヒトＭＭＰ１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った（時間０）、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓの０．１μｇ／ｍｌを、標的細胞としてＢＴ－４７４細胞を使用するＰｒｏｍｅｇａジャーカット細胞ＣＤ３レポーターアッセイに供した。 ＩｇＧ２及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７タンパク質のチャージバリアント分析を示す。チャージ不均一性分析は、生成物の質及び安定性についての重要な情報が得られるので、モノクローナル抗体の特徴づけに重要である。不均一性は、酵素の翻訳後修飾（グリコシル化、リシン切断）または精製及び保管中の化学修飾（酸化またはアミド分解）によって起こることがある。提供される試験品のチャージバリアントプロファイリングを市販のチャージバリアントアッセイによって実施した。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬのチャージバリアントプロファイルは、１つの主要なアイソフォーム（全体の５０～５７％）、メジャーな酸性アイソフォーム（全体の４０～４８％）及び１つのマイナーな塩基性アイソフォーム（およそ３％）を含む均一性プロファイルを示した。 ＩｇＧ２及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７タンパク質のチャージバリアント分析を示す。チャージ不均一性分析は、生成物の質及び安定性についての重要な情報が得られるので、モノクローナル抗体の特徴づけに重要である。不均一性は、酵素の翻訳後修飾（グリコシル化、リシン切断）または精製及び保管中の化学修飾（酸化またはアミド分解）によって起こることがある。提供される試験品のチャージバリアントプロファイリングを市販のチャージバリアントアッセイによって実施した。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬのチャージバリアントプロファイルは、１つの主要なアイソフォーム（全体の５０～５７％）、メジャーな酸性アイソフォーム（全体の４０～４８％）及び１つのマイナーな塩基性アイソフォーム（およそ３％）を含む均一性プロファイルを示した。 ５回の凍結融解後のＨｅｒ４７タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、５回の凍結融解に供し、続いて、０～５回目の試料に対してＳＥＣを実施した。凝集、断片化、または生成物の損失は、いずれのタンパク質でも観察されなかった。 ５回の凍結融解後のＨｅｒ４７タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、５回の凍結融解に供し、続いて、０～５回目の試料に対してＳＥＣを実施した。凝集、断片化、または生成物の損失は、いずれのタンパク質でも観察されなかった。 代替的タンパク質構築物設計を示す。この図は、タンパク質構築物Ｆａｂ２設計の代表的な例を描いている。この設計は、１．上部可変ドメインを取り除いた配列、２．「ダミー」の非結合可変ドメインを含んだ配列、３．上部Ｆａｂをダイアボディ（すなわち２つのｓｃＦｖ）に置き換えた配列、に基づいてよい。可変領域を白色で示す。定常領域を灰色で示す。 精製した、インタクトＨｅｒ２ＣＤ４７タンパク質の高Ｈｅｒ２ ＢＴ－４７４細胞を使用した細胞増殖分析を示す。トラスツズマブ、アイソタイプ対照ＩｇＧ１、及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、７２時間のインキュベーション期間にわたってＢＴ－４７４細胞に投与し、細胞増殖を測定した。データを、細胞増殖の阻害のパーセントとして示した。 精製した、インタクトＨｅｒ２ＣＤ４７タンパク質の高Ｈｅｒ２ ＢＴ－４７４細胞を使用した細胞増殖分析を示す。トラスツズマブ、アイソタイプ対照ＩｇＧ１、及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、７２時間のインキュベーション期間にわたってＢＴ－４７４細胞に投与し、細胞増殖を測定した。データを、細胞増殖の阻害のパーセントとして示した。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析を示す。トラスツズマブを、ＫＹＳＥ－４１０腫瘍を含有するＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに投与（静脈内で、０、５、１０日目に）した。腫瘍体積の測定を、４、７及び１１日目に実施し、溶媒との比較をプロットした。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析を示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、ＫＹＳＥ－４１０腫瘍を含有するＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに投与（静脈内で、０、５、１０日目に）した。腫瘍体積の測定を、４、７及び１１日目に実施し、溶媒との比較をプロットした。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析を示す。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、ＫＹＳＥ－４１０腫瘍を含有するＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに投与（静脈内で、０、５、１０日目に）した。腫瘍体積の測定を、４、７及び１１日目に実施し、溶媒との比較をプロットした。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析を示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、ＫＹＳＥ－４１０腫瘍を含有するＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに投与（静脈内で、０、５、１０日目に）した。腫瘍体積の測定を、４、７及び１１日目に実施し、溶媒との比較をプロットした。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析を示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、ＫＹＳＥ－４１０腫瘍を含有するＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに投与（静脈内で、０、５、１０日目に）した。腫瘍体積の測定を、４、７及び１１日目に実施し、溶媒との比較をプロットした。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析を示す。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦとＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬは、異なる効力を示した。 ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析を示す。投与した分子が毒性であると見なされることがある体重減少を示した投与群はなかった。
ヒトの患部組織において条件付きで活性化する組換えタンパク質について本明細書にて開示する。場合によっては、タンパク質は、非患部組織ではそのタンパク質の別の部分によってマスクされる結合ドメインを含む。タンパク質はまた、患部組織に発現している１つ以上のプロテアーゼによって切断されるペプチドリンカーを含む。リンカー切断により、患部組織における結合ドメインがアンマスクされ、それにより、患部組織におけるタンパク質の選択的な結合及び／または作用が可能になる。本発明のタンパク質は、患部組織と非患部組織との両方で発現している薬物標的への結合に特に有用である。
いくつかの活性化可能なタンパク質分子及びその医学的用法を本明細書で提供する。いくつかの態様において、標的結合特異性、ネイティブタンパク質における好ましくない活性は効果的に制限するが活性化された形態では完全に活性すること、ヒトと動物試験種（例えば、カニを食べるオナガザルとしても知られているカニクイザル、すなわちＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）の両方からの１つ以上の標的への条件付き親和性の維持、生物物理学的安定性、及び／または研究、臨床及び市販供給で使用されるタンパク質発現プラットホームによる収率を含む、分子の複数の機能的特性について考慮する。
いくつかの態様において、１つ以上のヒト薬物標的に、及び任意選択でそれら標的のカニクイザルオーソログに特異的に結合するタンパク質分子が提供されるが、ここで、タンパク質分子は、下記形式：
Ｖ－Ｃ－リンカー－Ｖ－Ｃ
Ｖ－Ｃ－リンカー－Ｖ－Ｃ
または
Ｃ－リンカー－Ｖ－Ｃ
Ｃ－リンカー－Ｖ－Ｃ、
の１つまたは複数のポリペプチドで組み立てられた重鎖及び軽鎖領域を含む。
いくつかの態様では、タンパク質分子は、２つのポリペプチド鎖を含み、かつ下記形式：
ＶＨ１－Ｃ－リンカー－ＶＨ２－Ｃ
ＶＬ１－Ｃ－リンカー－ＶＬ２－Ｃ、
を有する。
いくつかの態様では、タンパク質分子は、２つのポリペプチド鎖を含み、かつ下記形式：
ＶＬ１－Ｃ－リンカー－ＶＨ２－Ｃ
ＶＨ１－Ｃ－リンカー－ＶＬ２－Ｃ、
を有する。
「Ｖ」は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体可変領域、または受容体の外部ドメインを指す。「ＶＨ１」及び「ＶＬ１」は、互いに対になって抗原に結合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を指す。「ＶＨ２」及び「ＶＬ２」は、互いに対になって抗原に結合する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を指す。「Ｃ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体定常領域を指す。本発明の態様では、リンカードメインのどちらかの側のＶ－Ｃ及びＶ－Ｃユニットは、上部及び下部免疫グロブリンＦａｂドメインを形成し、ここで、下部Ｆａｂドメインはその同族標的への結合を示すが、下部ＦａｂのＶドメインのそれぞれのＮ末端に融合しているリンカードメインの存在によって、その結合は低減また除去される。別の態様では、上部または下部Ｆａｂドメインは、Ｆｃ断片、１つもしくは２つの受容体外部ドメイン、または任意の特異的結合機能を有するかまたはそれを欠く任意のドメインで置き換えられる場合がある。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、
ここで、ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列、あるいはヒト免疫グロブリンヒンジ領域と比べると１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個（例えば、１から～約７個）のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、
ペプチドリンカーは、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能であり、
第２部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する能力があり、かつ
ペプチドリンカーが切断されない場合、第２部分の患部組織に発現している分子への結合は低減または阻害される。
リンカー部分は、生殖系列から離れた０、１またはそれ以上の変異を伴う免疫グロブリンヒンジ領域に由来するペプチドリンカーをさらに含んでもよい。
いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、ＧＰＡＰＥＬＬ（配列番号１）、ＧＰＡＰＥＬＬＧＧＧＳ（配列番号２）、ＧＰＡＰＬＧＬＧＧＧＳ（配列番号３）、ＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＧＳ（配列番号４）、ＰＰＣＰＡＰＬＧＬＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＰＡＰＬＧＬＧＧＰＳ（配列番号７０）、ＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＰＰＣＰＡＰＬＧＬＧＧＰＳ（配列番号７２）、ＧＰＡＰＥＡＡＧＡＧＳ（配列番号８１）、ＧＰＡＤＤＤＤＫＳＧＳ（配列番号８２）（エンテロキナーゼによって切断可能）、ＧＰＡＬＶＰＲＧＳＧＳ（配列番号８３）（トロンビンによって切断可能）、ＧＰＧＰＦＧＲＳＡＧＧＰ（配列番号８４）（ｔＰＡによって切断可能）、ＧＰＡＰＬＥＡＤＡＧＳ（配列番号８５）（グランザイムＢによって切断可能）、ＧＰＡＰＥＡＲＲＧＧＳ（配列番号８６）（ｕＰＡによって切断可能）、またはＧＰＡＰＥＧＥＡＲＧＳ（配列番号８７）（ＡＤＡＭＴＳ－５によって切断可能）に記述されている配列を含むか、またはそれらで構成される。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、上述の配列のうち２つ、３つもしくは４つを含むか、またはそれらで構成される。
治療剤に連結された本発明のタンパク質を含む免疫複合体もまた提供される。
別の態様において、本発明は、本明細書で定義するようなタンパク質またはその一部をコードする核酸分子を提供する。本発明の核酸分子を含むベクターがさらに提供される。本発明の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供される。
さらなる態様において、本発明の条件付き活性タンパク質を生成する方法が提供されるが、この方法は、タンパク質の発現及び／または生成をもたらす条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞または培養物からタンパク質を単離することと、を含む。
本発明の別の態様において、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の免疫複合体を含む医薬組成物が提供される。
対象における免疫応答を増強する方法がさらに提供されるが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物を投与することを含む。
さらなる態様において、対象におけるがんを治療または予防する方法が提供されるが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物を投与することを含む。
医薬品として用いる、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物がさらに提供される。
がんの治療で用いる、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物がさらに提供される。
第２治療剤、例えば抗がん剤と別々に、連続して、またはそれと組み合わせて同時に用いる、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、免疫複合体、核酸分子、ベクター、医薬組成物がさらに提供される。
さらなる態様において、がんの治療用の医薬品の製造における、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物の使用が提供される。
対象における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療または予防する方法がさらに提供されるが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、本明細書で定義するような医薬組成物を投与することを含む。
自己免疫疾患または炎症性疾患の治療で用いる、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物もまた提供される。
自己免疫疾患または炎症性疾患の治療用の医薬品の製造における、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物の使用がさらに提供される。
対象における心臓血管疾患または線維性疾患を治療または予防する方法がさらに提供されるが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、本明細書で定義するような医薬組成物を投与することを含む。
医薬品として用いる、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物がさらに提供される。心臓血管疾患または線維性疾患の治療で用いる、本明細書で定義するような抗体分子もしくはその抗原結合部分、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物もまた提供される。
自己免疫疾患、炎症性疾患または線維性疾患の治療用の医薬品の製造における、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物の使用がさらに提供される。
いくつかの態様において、本発明は、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を提供するが、ここで、ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列、あるいはヒト免疫グロブリンヒンジ領域と比べるとアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、ペプチドリンカーは患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能であり、第２部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する能力があり、かつペプチドリンカーが切断されない場合、第２部分の患部組織に発現している分子への結合は低減または阻害される。いくつかの態様では、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列、あるいはヒト免疫グロブリンヒンジ領域と比べると１～約７個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列、あるいはヒト免疫グロブリンヒンジ領域と比べると１～２個、１～３個、１～４個、１～５個、１～６個、１～７個、２～３個、２～４個、２～５個、２～６個、２～７個、３～４個、３～５個、３～６個、３～７個、４～５個、４～６個、４～７個、５～６個、５～７個または６～７個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはヒトカテプシンによって切断可能である。場合によっては、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、ヒトエンテロキナーゼ（ＥＫ）、ヒトトロンビン（Ｔｈｒ）、ヒトｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、ヒトグランザイムＢ（ＧｒＢ）、ヒトｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子）、またはヒトＡＤＡＭＴＳ－５（トロンボスポンジン１型モチーフ５を有するディスインテグリン様及びメタロプロテイナーゼ；Ａ５）によって切断可能である。場合によっては、ペプチドリンカーは、ヒトＭＭＰ切断部位またはヒトカテプシン切断部位を含む。場合によっては、ペプチドリンカーは、ヒトエンテロキナーゼ切断部位、ヒトトロンビン切断部位、ヒトｔＰＡ切断部位、ヒトグランザイムＢ切断部位、ヒトｕＰＡ切断部位またはヒトＡＤＡＭＴＳ－５切断部位を含む。場合によっては、ペプチドリンカーは、ＭＭＰ基質配列ＰＬＧＬ（配列番号１２）を含む。場合によっては、ペプチドリンカーは、ＧＰＡＰＥＬＬ（配列番号１）、ＧＰＡＰＥＬＬＧＧＧＳ（配列番号２）、ＧＰＡＰＬＧＬＧＧＧＳ（配列番号３）、ＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＧＳ（配列番号４）、またはＰＰＣＰＡＰＬＧＬＧＧＧＳ（配列番号５）、ＧＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＰＡＰＬＧＬＧＧＰＳ（配列番号７０）、ＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＰＰＣＰＡＰＬＧＬＧＧＰＳ（配列番号７２）、ＧＰＡＰＥＡＡＧＡＧＳ（配列番号８１）、ＧＰＡＤＤＤＤＫＳＧＳ（配列番号８２）、ＧＰＡＬＶＰＲＧＳＧＳ（配列番号８３）、ＧＰＧＰＦＧＲＳＡＧＧＰ（配列番号８４）、ＧＰＡＰＬＥＡＤＡＧＳ（配列番号８５）、ＧＰＡＰＥＡＲＲＧＧＳ（配列番号８６）、またはＧＰＡＰＥＧＥＡＲＧＳ（配列番号８７）のアミノ酸配列を含むか、またはそれらで構成される。
場合によっては、ペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して単一のアミノ酸鎖で融合している、表１のアミノ酸配列のうち２つ、３つもしくは４つを含むか、またはそれらで構成される。場合によっては、ペプチドリンカーは、約５アミノ酸～約１５アミノ酸、約５アミノ酸～約２０アミノ酸、または約５アミノ酸～約２５アミノ酸の長さである。
場合によっては、第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーは、ペプチドリンカー配列のＮ末端におけるＸ１－プロリン－Ｘ２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Ｘ１は、アラニン、グリシン、セリン、プロリンまたはスレオニンである。いくつかの態様では、Ｘ１は、アラニン、グリシン、セリン、プロリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはバリンである。いくつかの態様では、Ｘ２は、アラニン、グリシン、セリン、プロリンまたはスレオニンである。いくつかの態様では、Ｘ２は、アラニン、グリシン、セリン、プロリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギンまたはバリンである。いくつかの態様では、Ｘ１及びＸ２は、同じアミノ酸である。いくつかの態様では、Ｘ１及びＸ２は、異なるアミノ酸である。
場合によっては、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、ヒトＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ４、ＭＭＰ５、ＭＭＰ６、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１８、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２２、ＭＭＰ２３、ＭＭＰ２４、ＭＭＰ２５、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、または、ＭＭＰ２８のうち任意の１つによって切断可能である。場合によっては、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、ヒトＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１２またはＭＭＰ－１３のうち任意の１つによって切断可能である。場合によっては、患部組織におけるヒトＭＭＰのレベルまたは活性は、非患部組織におけるヒトＭＭＰのレベルまたは活性と比べて高い。
場合によっては、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、ヒトカテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ１、カテプシンＶ、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＷ、またはカテプシンＺのうち任意の１つによって切断可能である。場合によっては、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーは、ヒトカテプシンＤ、カテプシンＧ、またはカテプシンＫのうち任意の１つによって切断可能である。場合によっては、患部組織におけるヒトカテプシンのレベルまたは活性は、非患部組織におけるヒトカテプシンのレベルまたは活性よりも高い。場合によっては、ｐＨ７．０未満の組織におけるヒトカテプシンのレベルまたは活性は、ｐＨ７．４以上の組織におけるヒトカテプシンのレベルまたは活性よりも高い。
いくつかの態様では、本発明のタンパク質のうちいずれかの第１部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む。場合によっては、第１部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、またはＴ細胞受容体ドメインである。ＩｇＮＡＲは、サメやその他の軟骨魚類によって生成されるホモ二量体重鎖単独抗体である（Ｆｅｉｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１４，１１１（２２）：８１５５－８１６０）。
場合によっては、第１部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１部分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する。場合によっては、第１部分は、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３、ヒトＣＤ１０５、ヒトＣ－ＫＩＴ、ヒトＰＤ１、ヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＰＳＭＡ、ヒトＥｐＣＡＭ、ヒトＴｒｏｐ２、ヒトＥｐｈＡ２、ヒトＣＤ２０、ヒトＢＣＭＡ、ヒトＧＩＴＲ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＳＦ１Ｒ、ヒトＬａｇ３またはヒトｃＭＥＴに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１部分はまた、これらの分子のいずれかのカニクイザルオーソログに結合する。
いくつかの態様では、第１部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。場合によっては、第１部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部をさらに含む。場合によっては、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである。
いくつかの態様では、本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ＨＥＲ２可変領域配列は、トラスツズマブの可変領域配列である。いくつかの態様では、本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ＣＤ３可変領域配列は、ＯＫＴ３またはＳＰ３４の可変領域配列である。いくつかの態様では、本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ｃＭＥＴ可変領域配列は、ＷＯ２０１９／１７５１８６にて提供されているものである。いくつかの態様では、本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ＣＤ４７可変領域配列は、ＷＯ２０１９／０３４８９５にて提供されているものである。
いくつかの態様では、本発明のタンパク質のうちいずれかの第２部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む。場合によっては、第２部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、またはＴ細胞受容体ドメインである。
場合によっては、第２部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２部分は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する。場合によっては、第２部分は、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する。場合によっては、第２部分は、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する。場合によっては、第２部分は、ヒト免疫細胞で発現している分子に特異的に結合する。場合によっては、ヒト免疫細胞で発現している分子は、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ１６Ｂ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ８９、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＮＫＧ２Ｄ、ヒトＳＩＲＰα、ヒトＳＩＲＰγ、ヒトＰＤ１、ヒトＬａｇ３、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＯＸ４０またはヒトＧＩＴＲである。いくつかの実施形態では、第２部分はまた、これらの分子のいずれかのカニクイザルオーソログに結合する。
いくつかの態様では、第２部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む。場合によっては、第２部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部をさらに含む。場合によっては、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである。
いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、またはＩｇＭである。別の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ１ヌル、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ、またはＩｇＭである。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、免疫学的に不活性な定常領域を含んでもよい。いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、またはアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１定常領域を含む、免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、野生型ヒトＩｇＧ２定常領域または野生型ヒトＩｇＧ４定常領域を含む、免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、表１０のアミノ酸配列のうち任意の１つを含む免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。表１０のＦｃ領域配列は、ＣＨ１ドメインから始まる。いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ１－３Ｍ、またはヒトＩｇＧ１－４ＭのＦｃ領域のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。例えば、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）Ｆｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域と比べると置換：Ｓ２２８Ｐを含む。例えば、ヒトＩｇＧ１－３Ｍ Ｆｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比べると置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含み、その一方で、ヒトＩｇＧ１－４Ｍ Ｆｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域と比べると置換：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含む。いくつかの態様では、免疫グロブリン分子の定常領域におけるアミノ酸残基の位置は、ＥＵの命名法に従って番号が付けられる（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｔｈｅｒａｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：７７－９４）。いくつかの態様では、免疫グロブリン定常領域は、ＲＤＥＬＴ（配列番号６５）モチーフまたはＲＥＥＭ（配列番号６６）モチーフを含んでもよい（表１０の下線部）。ＲＥＥＭ（配列番号６６）アロタイプは、ＲＤＥＬＴ（配列番号６５）アロタイプよりも少ないヒト集団に見られる。いくつかの態様では、本発明の抗体のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、配列番号５６～６２のうち任意の１つを含む免疫グロブリン定常領域を含んでもよい。いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、表３～９のクローンのうち任意の１つの重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列、ならびに表１０のＦｃ領域アミノ酸配列のうち任意の１つを含んでもよい。いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分及び／または第２部分は、表１０のＦｃ領域アミノ酸配列のうち任意の１つを含む免疫グロブリン重鎖定常領域、及びカッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域である免疫グロブリン軽鎖定常領域を含んでもよい。
いくつかの態様では、本発明のタンパク質は、ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を含む。ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域は、全てのＦｃγＲシグナル伝達タイプを強力に活性化し、それによりオプソニン作用エフェクター機能を最大限促進する。
いくつかの態様では、免疫グロブリン定常領域は、ヒンジ領域または切断型ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、野生型ヒトヒンジ領域アミノ酸配列と比べて１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含んでもよい。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ヒンジ領域を含まない。
いくつかの態様では、第１部分は、患部組織に発現している第１分子に特異的に結合し、第２部分は、患部組織に発現している第２分子に特異的に結合する能力があり、ここで、患部組織に発現している第１分子と患部組織に発現している第２分子は異なる分子である。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子と患部組織に発現している第２分子は同じ細胞で発現している。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子と患部組織に発現している第２分子は異なる細胞で発現している。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子、患部組織に発現している第２分子は、または患部組織に発現している第１分子と患部組織に発現している第２分子との両方は、細胞の表面に発現している。いくつかの実施形態では、患部組織に発現している第１分子及び／または患部組織に発現している第２分子は、可溶性分子である。
いくつかの態様では、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合する。いくつかの態様では、第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合する。いくつかの態様では、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合する。いくつかの態様では、第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合する。いくつかの態様では、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、第２部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合する。
いくつかの態様では、本発明のタンパク質は、１つの免疫エフェクター機能、または２つ、３つもしくはそれ以上の免疫エフェクター機能を有する。例えば、免疫エフェクター機能は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）であり得る。
いくつかの態様では、本発明のタンパク質の第１部分は、第２部分の患部組織に発現している分子への特異的結合を阻止または低減する。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質のペプチドリンカーは、患部組織の近くまたは患部組織の内部で切断される。場合によっては、ペプチドリンカーは、患部組織の近くまたは患部組織の内部で切断され、ここで、第１部分は患部組織の近くまたは患部組織の内部で第２部分から解離し、かつ第２部分は患部組織の近くまたは患部組織の内部で患部組織に発現している分子に特異的に結合する。場合によっては、切断されるペプチドリンカーは、抗ヒンジ抗体（例えば、対象の内因性抗ヒンジ抗体）に対する結合部位または標的部位を含むが、その一方で、切断されない（例えば、インタクト）ペプチドリンカーは、抗ヒンジ抗体に対する結合部位または標的部位を含まない。切断されるペプチドリンカーへの抗ヒンジ抗体の結合により、活性化された本発明のタンパク質の存在下でＡＤＣＣ、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＰを増大させることができる（例えば、図２Ｂを参照されたい）。
いくつかの態様では、本発明のタンパク質は、患部組織における炎症性シグナル伝達を刺激する。炎症性シグナル伝達の増加により、患部組織への免疫動員が増加され得る。場合によっては、本発明のタンパク質は、患部組織における抗原提示を増加させる。場合によっては、本発明のタンパク質は、腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞増殖を増加させる。
いくつかの態様では、患部組織は、腫瘍、壊死組織、線維性組織、凝固カスケードを受けている組織、または炎症を起こしている組織である場合がある。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。タンパク質は、第１ポリペプチド鎖の１個のコピーのみ、及び第２ポリペプチド鎖の１個のコピーのみを含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ＬＨＬ配列の２個のコピーを含み（表１を参照）、それぞれがペプチド結合を介して、Ｎ末端で第１部分に、Ｃ末端で第２部分に融合している。このタンパク質は、「Ｆａｂ２ ｃＭｅｔＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ」または「Ｍｅｔ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる。アミノ酸配列を表３に提示する。このタンパク質の構造体を図３Ａに示す。このタンパク質の第２部分は、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号１５）及び切断型ヒンジ領域を介してＫＩＨ ＩｇＧ１－Ｆｃに連結される。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。タンパク質は、第１ポリペプチド鎖の１個のコピーのみ、及び第２ポリペプチド鎖の１個のコピーのみを含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合しているＬＨＬ配列の２個のコピーを含む（表１を参照）。このタンパク質は、「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬ」または「Ｈｅｒ２３－ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる。アミノ酸配列を表４に提示する。このタンパク質の構造体を図３Ａに示す。このタンパク質の第２部分は、Ｇ４Ｓリンカー（配列番号１５）及び切断型ヒンジ領域（３Ｍ）を介してＫＩＨ ＩｇＧ１－Ｆｃに連結される。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。タンパク質は、第１ポリペプチド鎖の２つの同一のコピー及び第２ポリペプチド鎖の２つの同一のコピーを含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合しているＬＨＬ配列の２個のコピーを含む（表１を参照）。このタンパク質は、「ＩｇＧ２ Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ」または「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる。アミノ酸配列を表５に提示する。このタンパク質の構造体を図２Ａに示す。このタンパク質の第２部分は、ヒンジ領域または切断型ヒンジ領域を介してヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列に連結される（表１０を参照）。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。第１ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列をさらに含む（表１０を参照）。第２ポリペプチド鎖は、ヒトカッパ軽鎖アミノ酸配列をさらに含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合しているＬＨＬ配列の２個のコピーを含む（表１を参照）。このタンパク質は、「Ｆａｂ２ ＣＭＥＴ／ＣＤ４７『ワンアーム』型」または「Ｍｅｔ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる。アミノ酸配列を表６に提示する。このタンパク質の構造体を図３Ｂに示す。構築物は、「ノブイントゥホール」ワンアームＦａｂ２構築物であり、ノブ側にＦａｂ２及び反対側に幹のヒンジホールＦｃを有する。この構築物は、エフェクターヌルではないヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列を含む場合がある（表１０を参照）。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。第１ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１－３Ｍアミノ酸配列をさらに含む（表１０を参照）。第２ポリペプチド鎖は、ヒトカッパ軽鎖アミノ酸配列をさらに含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合しているＬＨＬ配列の２個のコピーを含む（表１を参照）。このタンパク質は、「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２／ＣＤ３『ワンアーム』型」または「Ｈｅｒ２３－ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる。アミノ酸配列を表７に提示する。このタンパク質の構造体を図３Ｂに示す。構築物は、「ノブイントゥホール」ワンアームＦａｂ２構築物であり、ノブ側にＦａｂ２及び反対側に幹のヒンジホールＦｃを有する。この構築物はまたエフェクターヌルである（ＩｇＧ１－３Ｍ；表１０を参照）。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。第１ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１－３Ｍアミノ酸配列をさらに含む（表１０を参照）。第２ポリペプチド鎖は、ヒトラムダ軽鎖アミノ酸配列をさらに含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合しているＬＨＬ配列の２個のコピーを含む（表１を参照）。このタンパク質は、「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２／ＣＤ３（３４）『ワンアーム』型」または「Ｈｅｒ２３（３４）－ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる。アミノ酸配列を表８に提示する。このタンパク質の構造体を図３Ｂに示す。構築物は、「ノブイントゥホール」ワンアームＦａｂ２構築物であり、ノブ側にＦａｂ２及び反対側に幹のヒンジホールＦｃを有する。この構築物はまたエフェクターヌルである（ＩｇＧ１－３Ｍ；表１０を参照）。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、第１ポリペプチド鎖、及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＦ－ＬＨＬ」と呼ばれる）、
（ｂ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦ」と呼ばれる）、
（ｃ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＦ－ＬＨＬＦ」と呼ばれる）、
（ｄ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＭ－ＬＨＬＭ」と呼ばれる）、
（ｅ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＭ－ＬＨＬＭＦ」と呼ばれる）、
（ｆ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＭＦ－ＬＨＬＭ」と呼ばれる）、
（ｇ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＭＦ－ＬＨＬＭＦ」と呼ばれる）、
（ｈ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＥＫ」と呼ばれる）、
（ｉ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｔｈｒ」と呼ばれる）、
（ｊ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｔＰＡ」と呼ばれる）、
（ｋ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＧｒＢ」と呼ばれる）、
（ｌ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｕＰＡ」と呼ばれる）、
（ｍ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される（「Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ａ５」と呼ばれる）。これらのタンパク質は、概して「ＩｇＧ２ Ｈｅｒ２／ＣＤ４７」と呼ばれる。アミノ酸配列を表９及び表２０に提示する。このタンパク質の構造体を図２Ａに示す。ＬＨＬＦ、ＬＨＬＭ及びＬＨＬＭＦリンカーのペプチドリンカー配列を表１に提示する。ＥＫ、Ｔｈｒ、ｔＰＡ、ＧｒＢ、ｕＰＡ及びＡ５リンカーのペプチドリンカー配列を表２１に提示する。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつタンパク質は、第１ポリペプチド鎖、及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号８８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡ」と呼ばれる）、
（ｂ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される（「Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡ」と呼ばれる）。これらのタンパク質は、概して「ＩｇＧ２『ＩｇＧ１－ＤＡＡ』Ｈｅｒ２／ＣＤ４７」と呼ばれる。アミノ酸配列を表１９に提示する。これらのタンパク質は、ヒンジにおいて安定化変異を含む。このタンパク質の構造体を図２Ａに示す。ＬＨＬＦ及びＬＨＬリンカーのペプチドリンカー配列を表１に提示する。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。第１ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１－３Ｍ Ｆｃアミノ酸配列（例えば、第２ポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を可能にする「穴」変異を含む）、続いてリンカー配列、第１結合部分のＶＨ及びＣＨ１ドメイン、別のリンカー配列、さらに第２結合部分のＶＨ及びＣＨ１ドメインをさらに含む（表１３を参照）。第２ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１－３Ｍ Ｆｃアミノ酸配列（例えば、第２ポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を可能にする「ノブ」変異を含む）、続いてリンカー配列、第１結合部分のＶＬ及びＣＬドメイン、別のリンカー配列、さらに第２結合部分のＶＬ及びＣＬドメインをさらに含む（表１３を参照）。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合している４つの配列を含み（表１を参照）、Ｆｃと第１部分との間、及び第１結合部分と第２結合部分との間に存在する。このタンパク質は、「Ｆｃ－Ｈｅｒ２／ＣＤ３（３４）」または「Ｆｃ－Ｈｅｒ２３（３４）」と呼ばれる。アミノ酸配列を表１３に提示する。このタンパク質の構造体を図１２に示す。構築物は、「ノブイントゥホール」Ｆｃ－Ｆａｂ２構築物であり、ノブまたはホール側のいずれかに軽鎖ポリペプチド、及び反対側に重鎖ポリペプチドを有する。この構築物はまたエフェクターヌルである（ＩｇＧ１－３Ｍ；表１０を参照）。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、ここで、第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、第２部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、かつタンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む。第１ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ１－３Ｍアミノ酸配列をさらに含む（表１０を参照）。第２ポリペプチド鎖は、ヒトカッパ軽鎖アミノ酸配列をさらに含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合しているＬＨＬ配列の２個のコピーを含む（表１を参照）。このタンパク質は、「Ｆａｂ２ ＣＭＥＴ／ＣＭＥＴ『ワンアーム』型」または「ＭｅｔＭｅｔ－ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる。アミノ酸配列を表１４に提示する。このタンパク質の構造体を図３Ｂに示す。構築物は、「ノブイントゥホール」ワンアームＦａｂ２構築物であり、ノブ側にＦａｂ２及び反対側に幹のヒンジホールＦｃを有する。この構築物は、エフェクターヌルであるか、またはエフェクターヌルではないヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列を含む場合がある（表１０を参照）。
いくつかの態様において、第１部分及び第２部分、ならびに第１部分と第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質を本明細書で提供するが、第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつタンパク質は、第１ポリペプチド鎖、及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ」と呼ばれる）、
（ｂ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ」と呼ばれる）、
（ｃ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか（「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ」と呼ばれる）、
（ｄ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される（「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓ」と呼ばれる）。このタンパク質は、「Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２／ＣＤ３」と呼ばれる。アミノ酸配列を表２２に提示する。このタンパク質の構造体を図３Ａに示す。タンパク質は、第１ポリペプチド鎖の１個のコピーのみ、及び第２ポリペプチド鎖の１個のコピーのみを含む。このタンパク質のペプチドリンカーは、ペプチド結合を介して融合しているＬＨＬ配列の２個のコピー（表１を参照）、またはＬＨＬ配列の１個のコピーとＬＨＬＦ配列の１個のコピーとを含む。
いくつかの態様において、追加の治療剤に連結された本明細書で定義するような本発明のタンパク質を含む免疫複合体を本明細書で提供する。
好適な治療剤の例としては、細胞毒、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、ならびに細胞増殖抑制及び細胞溶解酵素（例えばリボヌクレアーゼ）が挙げられる。さらに別の治療剤としては、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、またはアポトーシス促進剤をコードする遺伝子などの治療用核酸が挙げられる。これらの薬物の記述子は、互いに排他的ではないので、治療剤は上記の用語のうち１つ以上を使用して説明される場合がある。
免疫複合体に用いる好適な治療剤の例としては、タキサン、メイタイシン、ＣＣ－１０６５、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、他のエンジイン、及びアウリスタチンが挙げられる。他の例としては、葉酸代謝拮抗薬、ビンカアルカロイド、及びアントラサイクリンが挙げられる。植物毒素、他の生物活性タンパク質、酵素（すなわち、ＡＤＥＰＴ）、放射性同位体、光増感剤もまた、免疫複合体に使用してもよい。加えて、複合体は、リポソームまたはポリマー類などの細胞傷害性薬剤として二次担体を使用して形成することができる。好適な細胞毒としては、細胞の機能を阻害または阻止する、及び／または細胞の破壊をもたらす薬剤が挙げられる。代表的な細胞毒としては、抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、ＤＮＡに結合して破壊するアルキル化剤、及びタンパク質合成または必須細胞タンパク質の機能を破壊する薬剤、例えばプロテインキナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素及びサイクリンが挙げられる。
代表的な細胞毒としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピタルビシン、バルルビシン、シタラビン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルジン（ｄｏｘｉｆｌｕｈｄｉｎｅ）、ペントスタチン、ブロクスジン（ｂｒｏｘｕｈｄｉｎｅ）、カペシタビン、クラドビン（ｃｌａｄｈｂｉｎｅ）、デシタビン、フロクスジン（ｆｌｏｘｕｈｄｉｎｅ）、フルダラビン、グウゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフン（ｔｉａｚｏｆｕｈｎ）、アダマイシン（ａｄｈａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、メクロレタミン、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルロウラシル（ｆｌｕｒｏｕｒａｃｉｌ）、エトポシド、タキソール、タキソール類似体、シスプラチン及びカルボプラチンなどのプラチン、マイトマイシン、チオテパ、タキサン、ビンクリスチン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、タモキシフェン、イダルビシン、ドラスタチン／アウリスタチン、ヘミアスタリン、エスペラマイシン及びメイタンシノイドが挙げられるが、これらに限定されない。
好適な免疫調節剤としては、腫瘍に対するホルモン作用をブロックする抗ホルモン類、及びサイトカイン生成を抑制するか、自己抗原発現をダウンレギュレートするか、またはＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤が挙げられる。
本明細書で定義するような本発明のタンパク質またはそのタンパク質の一部をコードする核酸分子もまた提供される。複数の非同一ポリペプチド鎖を含む本発明のタンパク質の第１ポリペプチド鎖、第２ポリペプチド鎖、または第１ポリペプチド鎖と第２ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸分子を本明細書でさらに提供する。いくつかの態様では、本明細書で定義するような核酸分子は単離されてもよい。
本明細書で定義するような本発明の核酸分子を含むベクターがさらに提供される。ベクターは、発現ベクターであってもよい。
本明細書で定義するような本発明の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞もまた提供される。宿主細胞は、組換え宿主細胞であってもよい。
さらなる態様において、本発明のタンパク質を生成する方法が提供されるが、この方法は、タンパク質の発現及び／または生成をもたらす条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、宿主細胞または培養物からタンパク質を単離することと、を含む。
いくつかの態様において、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、または本明細書で定義するような本発明のベクターを含む医薬組成物を本明細書で提供する。
対象における免疫応答を増強する方法がさらに提供されるが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物を対象へ投与することを含む。
さらなる態様において、対象におけるがんを治療または予防するか、対象におけるがんの症状を緩和する方法が提供されるが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物を対象へ投与することを含む。
いくつかの態様では、がんは固形腫瘍である。場合によっては、がんは血液悪性腫瘍である。例えば、がんは、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、皮膚癌（例えば、黒色腫）、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織癌であってもよい。場合によっては、血液組織癌はリンパ腫である。
いくつかの態様において、がんの治療で用いるか、またはがんの症状に用いるかもしくはがんの症状を緩和する、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物を本明細書で提供する。
いくつかの態様において、第２治療剤、例えば抗がん剤と別々に、連続して、またはそれと組み合わせて同時に用いる、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、免疫複合体、核酸分子、もしくはベクター、またはその治療方法を本明細書で提供する。
さらなる態様において、がんの治療用またはがんの症状を緩和するための医薬品の製造における、本明細書で定義するような本発明のタンパク質、本明細書で定義するような本発明の免疫複合体、本明細書で定義するような本発明の核酸分子、本明細書で定義するような本発明のベクター、または本明細書で定義するような本発明の医薬組成物の使用が提供される。
本発明は、対象における自己免疫疾患または炎症性疾患を治療または予防する方法もまた提供するが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物を対象へ投与することを含む。
例えば、自己免疫疾患または炎症性疾患は、関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、グレーブス病、橋本甲状腺炎または強直性脊椎炎である場合がある。
自己免疫疾患または炎症性疾患の治療で用いる、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物もまた提供される。
自己免疫疾患または炎症性疾患の治療用の医薬品の製造における、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物の使用がさらに提供される。
本発明は、対象における心臓血管疾患または線維性疾患を治療または予防する方法もまた提供するが、この方法は、有効な量の本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物を対象へ投与することを含む。
心臓血管疾患または線維性疾患の治療で用いる、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物もまた提供される。
心臓血管疾患または線維性疾患の治療用の医薬品の製造における、本明細書で定義するようなタンパク質、本明細書で定義するような免疫複合体、本明細書で定義するような核酸分子、本明細書で定義するようなベクター、または本明細書で定義するような医薬組成物の使用がさらに提供される。
本発明のいずれかの態様における心臓血管疾患は、例えば、冠状動脈性心疾患、アテローム性動脈硬化症、または脳卒中である場合がある。
例えば、本発明のいずれかの態様における線維性疾患は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、喘息、嚢胞性線維症または気管支炎である場合がある。
いくつかの態様において、本明細書にて開示し、かつ本明細書にて開示する形式でのアミノ酸配列を含む、治療に用いるためのタンパク質を本明細書で提供する。
いくつかの態様では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、二次反応を誘発せず、かつ例えば、本明細書で定義するようなタンパク質の投与の促進、身体内におけるその寿命及び／またはその有効性の向上、または溶液中の溶解度の上昇を可能にする、化合物または医薬組成物に入る化合物類の組み合わせであってもよい。これらの薬学的に許容される溶媒は、良く知られており、本明細書で定義するようなタンパク質の投与様式に応じて当業者によって適合されるであろう。
いくつかの態様では、本明細書で定義するようなタンパク質は、投与前に溶液調製される凍結乾燥の形態で提供されてよい。例えば、凍結乾燥タンパク質分子は、個体への投与前に、滅菌水で溶液調製され、生理食塩水と混合されてよい。
本明細書で定義するようなタンパク質は、通常、医薬組成物の形態で投与されるが、これは、タンパク質分子に加えて少なくとも１つの構成成分を含み得る。したがって、医薬組成物は、本明細書で定義するようなタンパク質に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含んでよい。このような材料は、無毒でなければならず、かつタンパク質の有効性を阻害してはならない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、それは、以下で論じるようにボーラス、注入、注射または任意の他の好適な経路によるものであってよい。
非経口、例えば皮下または静脈内などの例えば注射による投与向けに、本明細書で定義するようなタンパク質を含む医薬組成物は、発熱性物質を含まず、ｐＨ、等張性及び安定性が適切である、非経口で許容可能な水溶液の形態であってよい。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸加リンゲル注射などの等張溶媒を使用して、好適な溶液を適切に調製することができる。リン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメソニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３’－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー類；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物類；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／またはその他の添加剤が必要に応じて使用されてよい。
本明細書で定義するようなタンパク質を含む医薬組成物は、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、治療される病態に応じて同時にまたは連続的に投与されてよい。
本明細書で定義するようなタンパク質は、予防的または防止的治療（例えば、個体で発生する病態のリスクの低減；発症の遅延；発症後のその重症度の低減のための個体における病態の発症前の治療）を含む、ヒトまたは動物の身体の治療方法で使用されてよい。治療方法は、本明細書で定義するようなタンパク質をそれを必要とする個体に投与することを含んでよい。
投与は、通常、「治療上有効な量」で行われ、これは、患者に対する効果を示すのに十分な量である。このような効果は、少なくとも１つの症状の少なくとも寛解であってよい。実際の投与量ならびに投与速度及び投与時間経過は、治療されるものの性質及び重症度、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床病態、疾患の原因、組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医療従事者に既知のその他の要因に依存する。治療剤の処方、例えば投薬量の決定などは、一般開業医及びその他の医師の責任の範囲であり、かつ治療される疾患の症状及び／または進行の重症度に依存する場合がある。抗体分子の適切な用量は、当該技術分野において周知である（Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４７：６５９－６６４；Ｂａｇｓｈａｗｅ Ｋ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ４：９１５－９２２）。投与される医薬品の種類に応じて本明細書またはＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（２００３）にて示される場合がある特定の投与量が使用されてよい。本明細書で定義するようなタンパク質の治療上有効な量または好適な用量は、動物モデルにおけるそのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性及びｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することによって決定されてよい。マウス及びその他の試験動物における有効な投与量をヒトに外挿する方法が知られている。正確な用量は、タンパク質が予防用または治療用のどちらか、治療される領域のサイズ及び位置、タンパク質の正確な性質（例えば、Ｆａｂ２、ＩｇＧ）、ならびにタンパク質に付着したいずれかの検出可能な標識または他の分子の性質を含む、いくつかの因子に依存する。
典型的なタンパク質の用量は、全身投与の場合は１００μｇ～１ｇ、局所投与の場合は１μｇ～１ｍｇの範囲である。最初に高い負荷用量で、それに続いてより少ない用量で１回以上の投与が行われてもよい。いくつかの態様では、タンパク質は、全抗体、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを含む。これは、成人患者の単回治療の用量であり、小児及び幼児に比例して調整することができ、また分子量に比例して他のタンパク質構築物の形式に対しても調整することができる。治療は、医師の判断により、毎日、週に２回、週に１回または月に１回の間隔で繰り返されてよい。個体の治療スケジュールは、タンパク質組成物の薬物動態学的特性及び薬力学的特性、投与経路及び治療される病態の性質に依存する場合がある。
治療は、周期的であってもよく、かつ投与と投与の間の期間は、約２週間以上、例えば、約３週間以上、約４週間以上、約月１回以上、約５週間以上、約６週間以上であってよい。例えば、治療は２～４週間ごと、または４～８週間ごとであってよい。治療剤は、手術前及び／または手術後に与えられてよく、及び／または外科的治療もしくは侵襲的な処置の解剖学的部位に直接投与または適用されてよい。好適な製剤及び投与経路については、上述した通りである。
いくつかの態様では、本明細書で定義するようなタンパク質は、皮下注射として投与されてよい。皮下注射は、例えば長期または短期予防処置／治療の間に自動注入装置を使用して投与されてよい。
いくつかの態様では、本明細書で定義するようなタンパク質の治療効果は、用量に応じて、血清中のタンパク質半減期の数倍の間持続し得る。例えば、本明細書で定義するようなタンパク質の単回投与の治療効果は、個体において１ヶ月以上、２ヶ月以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、または６ヶ月以上持続し得る。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ４７」は、ＩＡＰ（インテグリン会合タンパク質）及びＣＤ４７の生物活性の少なくとも一部を保持するそのバリアントを指す。本明細書で使用される場合、ＣＤ４７は、ヒト、ラット、マウス及びニワトリを含む全ての哺乳類種のネイティブ配列ＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、用語「ＣＤ４７」は、ヒトＣＤ４７のバリアント、アイソフォーム及び種のホモログを含むために使用される。場合によっては、本明細書で使用される場合、ＣＤ４７は、ヒト、サル、ラット、マウス及びニワトリを含む全ての哺乳類種及び非哺乳類種のネイティブ配列ＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、用語「ＣＤ４７」は、野生型ＣＤ４７のみを指す。本発明のタンパク質は、ヒト以外の種に由来するＣＤ４７、特にカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に由来するＣＤ４７と交差反応することがある。ヒトとカニクイザルのＣＤ４７アミノ酸配列の例を表１１に提示する。ある特定の実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトＣＤ４７に完全に特異的であってもよく、非ヒトとの交差反応性を呈さなくてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「ｃＭＥＴ」は、ＭＥＴタンパク質及びｃＭＥＴの生物活性の少なくとも一部を保持するそのバリアントを指す。場合によっては、本明細書で使用される場合、ｃＭＥＴは、ヒト、ラット、マウス及びニワトリを含む全ての哺乳類種のネイティブ配列ｃＭＥＴを含む。いくつかの実施形態では、用語「ｃＭＥＴ」は、ヒトｃＭＥＴのバリアント、アイソフォーム及び種のホモログを含むために使用される場合がある。場合によっては、本明細書で使用される場合、ｃＭＥＴは、ヒト、サル、ラット、マウス及びニワトリを含む全ての哺乳類種及び非哺乳類種のネイティブ配列ｃＭＥＴを含む。いくつかの実施形態では、用語「ｃＭＥＴ」は、野生型ｃＭＥＴのみを指す。本発明の抗体は、ヒト以外の種に由来するｃＭＥＴ、特にカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に由来するｃＭＥＴと交差反応することがある。ヒトとカニクイザルのｃＭＥＴアミノ酸配列の例を表１２に提示する。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトｃＭＥＴに完全に特異的であってもよく、非ヒトとの交差反応性を呈さなくてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「Ｈｅｒ２」は、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質及びＨｅｒ２の生物活性の少なくとも一部を保持するそのバリアントを指す。Ｈｅｒ２は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ２、ｃ－ｅｒｂＢ－２及びヒトＥＧＦ受容体２としても知られている。いくつかの実施形態では、用語「Ｈｅｒ２」は、ヒトＨｅｒ２のバリアント、アイソフォーム及び種のホモログを含むために使用される場合がある。場合によっては、本明細書で使用される場合、Ｈｅｒ２は、ヒト、サル、ラット、マウス及びニワトリを含む全ての哺乳類種及び非哺乳類種のネイティブ配列Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２としても知られている）を含む。いくつかの実施形態では、用語「Ｈｅｒ２」は、野生型Ｈｅｒ２のみを指す。本発明の抗体は、ヒト以外の種に由来するＨｅｒ２、特にカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に由来するＨｅｒ２と交差反応することがある。ヒトとカニクイザルのＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２アミノ酸配列の例を表１５に提示する。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＨｅｒ２に完全に特異的であってもよく、非ヒトとの交差反応性を呈さなくてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３」は、「分化抗原群３」多量体タンパク質複合体及びＣＤ３の生物活性の少なくとも一部を保持するそのバリアントを指す。ＣＤ３複合体は、４つの異なるポリペプチド鎖；イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、デルタ（δ）及びゼータ（ζ）を含む。これらのポリペプチド鎖が集合し、３対の二量体（εγ、εδ、ζζ）として機能する。いくつかの実施形態では、用語「ＣＤ３」は、ヒトＣＤ３のバリアント、アイソフォーム及び種のホモログを含むために使用される場合がある。場合によっては、本明細書で使用される場合、ＣＤ３は、ヒト、サル、ラット、マウス及びニワトリを含む全ての哺乳類種及び非哺乳類種のネイティブ配列ＣＤ３を含む。いくつかの実施形態では、用語「ＣＤ３」は、野生型ＣＤ３のみを指す。本発明の抗体は、ヒト以外の種に由来するＣＤ３、特にカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に由来するＣＤ３と交差反応することがある。ヒトとカニクイザルのＣＤ３イプシロンアミノ酸配列の例を表１６に提示する。ある特定の実施形態では、抗体は、ヒトＣＤ３に完全に特異的であってもよく、非ヒトとの交差反応性を呈さなくてもよい。
本明細書で使用される場合、本発明のタンパク質に関連して使用される「アンタゴニスト」は、患部組織に発現している分子に結合し、その分子の生物活性及び／またはその分子によって媒介される下流経路（複数可）を阻害することができるタンパク質を指す。例えば、「抗ＣＤ４７アンタゴニストタンパク質」（同義的用語「抗ＣＤ４７タンパク質」）は、ＣＤ４７に結合し、ＣＤ４７の生物活性及び／またはＣＤ４７シグナル伝達によって媒介される下流経路（複数可）を阻害することができるタンパク質を指す。抗ＣＤ４７アンタゴニストタンパク質は、受容体結合及び／またはＣＤ４７に対する細胞応答の誘発などのＣＤ４７シグナル伝達によって媒介される下流通路を含む、ＣＤ４７生物活性を（場合によっては著しく）ブロック、拮抗、抑制または低下させることができるタンパク質を包含する。本発明の目的のために、用語「抗ＣＤ４７アンタゴニストタンパク質」は、ＣＤ４７自体、及びＣＤ４７生物活性（限定はされないが、骨髄系の細胞による食作用の活性化を高めるその能力を含む）、または活性もしくは生物活性の結果が、意味のある程度で実質的に無効、低下、中和される、全ての用語、表題、ならびに機能的状態及び特性を包含することが明確に理解されるであろう。
本発明のタンパク質は、そのタンパク質が他の分子と結合するよりも、より大きな親和性、結合活性があり、より容易に及び／またはより長い持続時間で結合する場合、分子（例えば、ヒトＣＤ４７、ヒトＨｅｒ２、ヒトＣＤ３、ヒトｃＭＥＴ、またはヒトＰＤ－Ｌ１）と、「特異的に結合」、「特異的に相互作用」、「優先的に結合」、「結合」または「相互作用」する。
「抗体分子」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合する能力がある免疫グロブリン分子である。本明細書で使用される場合、用語「抗体分子」は、インタクトポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけではなく、任意の抗原結合断片（例えば、「抗原結合部分」）またはその一本鎖、抗体を含む融合タンパク質、及び、例えば制限はされないが、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、サメ及びラクダ抗体）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ及びｂｉｓ－ｓｃＦｖなどの、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を包含する。
「抗体分子」は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を包含し、また抗体はいずれかの特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられる場合がある。免疫グロブリンには５つの主なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ｌｇＡ１及びｌｇＡ２にさらに分けられることがある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造体及び３次元構成が良く知られている。
抗体分子の用語「抗原結合部分」は、本明細書で使用される場合、抗原に特異的に結合する能力を保持するインタクト抗体の１つ以上の断片を指す。抗体分子の抗原結合機能は、インタクト抗体の断片によって行われ得る。抗体分子の用語「抗原結合部分」に包含される結合断片の例としては、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ’）２；ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されるＦｄ断片；抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインで構成されるＦｖ断片；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片、及び単離している相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域である場合がある。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動する場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域の残基のナンバリングは、ＫａｂａｔにあるＥＵインデックスの番号である。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。当技術分野で知られているように、Ｆｃ領域は二量体または単量体形態で存在し得る。
抗体の「可変領域」は、単独でまたは組み合わせた、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野で知られているように、重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、高度可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によってつながれた４つのフレームワーク領域（ＦＲ）で構成され、かつ抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲに隣接するＦＲを選択する場合、例えば、抗体をヒト化または最適化する場合、同じ基準クラスのＣＤＲ配列を含む抗体由来のＦＲが好ましい。
本明細書で使用される場合、用語「保存的置換」は、アミノ酸の、機能的活性を著しく有害に変化させない別のアミノ酸との置換を指す。「保存的置換」の好ましい例は、１つのアミノ酸の、下記のＢＬＯＳＵＭ ６２置換マトリクスで０以上の値を有する別のアミノ酸との置換である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， １９９２， ＰＮＡＳ ８９： １０９１５－１０９１９を参照）。

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用語「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、例えば任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のコピーまたはクローンに由来する抗体、またはその抗原結合部分を指すが、それが生成される方法ではない。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、均一性集団または実質的な均一性集団に存在する。
「ヒト化」抗体分子は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはこれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合部分列）である、非ヒト（例えば、マウス）抗体分子の形態もしくはその抗原結合部分を指す。ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であってよい。
「ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」は、ヒト抗体遺伝子を保有するトランスジェニックマウスまたはヒト細胞に由来する、抗体分子またはその抗原結合部分を指す。
用語「キメラ抗体」は、その可変領域配列がある種に由来し、その定常領域配列は別の種に由来する抗体分子またはその抗原結合部分を指すことが意図され、例えると、その可変領域配列がマウス抗体に由来し、その定常領域配列はヒト抗体に由来する抗体分子を指すことが意図される。
用語「免疫複合体」は、少なくとも１つの細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤または治療剤に複合体化、融合、または連結された本発明のタンパク質を指す。
本発明のタンパク質は、当該技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはそのような技術もしくは当該技術分野において容易に周知の他の技術との組み合わせを使用して生成することができる。
用語「単離している分子」（例えば、分子がポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体である場合）は、その起源またはその誘導源のゆえに、（１）その天然状態で付随する天然で会合している構成成分と会合していない分子、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まない分子、（３）異なる種由来の細胞で発現している分子、または（４）自然界に存在しない分子である。よって、化学的に合成されるか、または天然に発生する細胞とは異なる細胞系で発現している分子は、天然で会合している構成成分から「単離」している。分子はまた、当該技術分野において周知の精製技術を使用して、単離によって天然で会合している構成成分を実質的に含まない状態にすることができる。分子の純度または均一性は、当該技術分野において周知のいくつかの方法によって評価することができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルの染色を使用して、当該技術分野において周知の技術を用いてポリペプチドを視覚化することで評価することができる。特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において周知の精製のための他の方法を使用することによってより高い分解能を得ることが可能である。
用語「エピトープ」は、タンパク質もしくは抗体分子の抗原結合領域の１つ以上において、本発明のタンパク質、抗体分子、またはその抗原結合部分による認識及び結合が可能な分子の部分を指す。エピトープは、一次、二次または三次タンパク質構造体の規定領域で構成される場合があり、タンパク質の抗原結合領域、抗体、またはその抗原結合部分によって認識される標的の二次構造ユニットまたは構造ドメインの組み合わせを含む。それに加えて、エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの限定された化学的に活性な表面上の分子の集団で構成され、特有の３次元構造特性と、特有の荷電特性を有する。本明細書で使用されるような用語「抗原エピトープ」は、当該技術分野において周知の任意の方法によって、例えば従来の免疫学的検定、抗体競合結合アッセイによって、またはＸ線結晶構造解析もしくは関連する構造決定法（例えばＮＭＲ）によって同定されるような、本発明のタンパク質または抗体分子が特異的に結合し得るポリペプチドの一部として定義される。
用語「結合親和性」または「ＫＤ」は、特定の抗原結合タンパク質相互作用または抗原抗体相互作用の解離速度を指す。ＫＤは、「オフレート（ｋｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度と、会合速度すなわち「オンレート（ｋｏｎ）」との比率である。したがって、ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎに等しく、かつモル濃度（Ｍ）として表現される。したがって、ＫＤが小さいほど、結合の親和性が高くなる。したがって、１μＭのＫＤは、１ｎＭのＫＤと比べて結合親和性が低いことを意味する。結合タンパク質または抗体のＫＤ値は、当該技術分野において十分に確立されている方法を使用して算出することができる。結合タンパク質または抗体のＫＤを算出する一方法としては、典型的には、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるものがある。
用語「効力」は、生物活性の測定値であり、またＩＣ５０、すなわち、本明細書に記載されるような活性アッセイで測定される結合パートナー（例えば、患部組織に発現している分子）または結合パートナーの活性を５０％阻害する、抗原もしくは抗原に対する本発明の免疫複合体のタンパク質の有効濃度として表される。
本明細書で使用されるような語句「有効な量」または「治療上有効な量」は、本所望の治療結果を得るために（投与量、ならびに投与期間及び投与方法に対して）必要な量を指す。有効な量は、対象に治療上の利益を与えるために必要な活性薬剤の少なくとも最小量であり、かつ毒性量より少ない量である。
本発明のタンパク質の生物活性に関して本明細書で使用されるような用語「阻害」または「中和」は、例えば限定はされないが患部組織に発現している分子の生物活性または結合相互作用を含む、阻害されることになるものの進行または重症度を実質的に拮抗、妨害、予防、抑制、減速、破壊、排除、停止、低下または反転させるタンパク質の能力を意味する。
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチドインサートを組み込むためのベクター（複数可）のレシピエントであり得るか、またレシピエントであったことがある個々の細胞もしくは細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然、偶発的、または意図的変異に起因して、元の親細胞と完全に同一のもの（形態またはゲノムＤＮＡ補体）であるとは限らないこともある。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド（複数可）でｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトした細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞における目的の１つ以上の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達、及び好ましくは発現する能力がある構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドもしくはファージベクター、カチオン性縮合剤に結合されるＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されるＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、及びプロデューサー細胞などのある特定の真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「治療すること」は、本明細書で使用される場合、特に記載がない限り、そのような用語を適用する疾患もしくは病態、またはそのような疾患もしくは病態の１つ以上の症状を、反転させる、改善する、その進行を阻害する、その進行を遅らせる、その発症を遅らせる、または予防することを意味する。用語「治療」は、本明細書で使用される場合、特に記載がない限り上記で上述したように治療する行為を意味する。用語「治療すること」はまた、対象のアジュバント及びネオアジュバント治療を含む。誤解を避けるために、「治療」に対する本明細書での言及は、治癒的、姑息的、及び予防的治療に対する言及を含む。誤解を避けるために、「治療」に対する本明細書での複数の言及はまた、治癒的、姑息的、及び予防的治療に対する複数の言及を含む。
実施形態が語句「を含む」を用いて本明細書で説明されている場合は常に、「で構成される」及び／または「で本質的に構成される」の用語で説明される他の類似の実施形態も提供されることが理解される。
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の代替の群の用語で説明されている場合、本発明は、全体として列挙された全ての群だけでなく、群の各要素のそれぞれ、及び主要群の全ての可能な亜群、ならびに群の要素のうち１つ以上が欠けている主要群を包括する。本発明はまた、特許請求された発明における群の要素のいずれか１つ以上の明示的な除外を想定している。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門的及び科学的用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合は、定義を含めて本明細書が優先される。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載される整数または整数の群の包含を意味するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを理解されよう。別段文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」に続くいずれの例（複数可）も、網羅的または限定的であることを意味するものではない。
本発明の手法は、特に記載がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を用いることとし、これらの技法は、当該分野の技能の範囲内である。
本発明の特定の非限定的な実施形態については、添付図面の参照を伴って記載される。
実施例１．最適化された条件付き活性治療抗体の生成
概論
本実施例において、本発明者らは、最適化された条件付き活性抗体のパネルの生成に成功した。これらの条件付き活性抗体は、良好に発現し、生物物理学的に安定で、可溶性が高く、かつより好ましいヒト生殖系列と最大限のアミノ酸配列の同一性がある。
材料及び方法
タンパク質のクローニング、一過性発現、精製及び特性評価
抗体をコードするＤＮＡ配列を、制限酵素－ライゲーションクローニングを介して別々のプラスミドベクター中の別々のヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖コード化発現カセット内にクローニングし、発現のためのＩｇＧまたはＩｇＧ２形式の構築物を作った。類似のカセットもまた、「ノブイントゥホール」ヒトＩｇＧ１ヘテロ二量体化Ｆｃベクターにクローニングし、Ｆａｂ及びＦａｂ２構築物を作った。ノブイントゥホール（ＫＩＨ）重鎖発現ベクター（ＣＨ３ドメインＴ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ変異）を使用して、Ｆａｂ２ ｃＭＥＴＣＤ４７及びＨｅｒ２ＣＤ３タンパク質構築物を作成した。また、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２－ＣＤ３構築物にエフェクター機能切断変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａを含めた。「野生型」ＩｇＧ１重鎖及びカッパ軽鎖発現ベクターを使用して、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ２ＣＤ４７タンパク質構築物を作成した。製造者のプロトコルに従って、エンドトキシンを含まないＩｇＧ発現プラスミド調製物による一過性トランスフェクション後にＩｇＧをＣＨＯ細胞で発現させた。
ＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ １５０ Ｌ ＦＰＬＣシステムでＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ５ｍＬカラムを使用して、生成した抗体を清澄化した上澄みから採取した。溶出したタンパク質Ａのピーク画分をＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラムに直接充填することによって、溶出したタンパク質ピークを直ちに１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中にバッファー交換した。２８０ｎｍの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を同定し、かつ１×トリス／グリシン／ＳＤＳバッファーと共に４～２０％のＴＧＸポリアクリルアミド勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号４５６－１０９３）を使用して、１２０Ｖ電界で１時間分離し、還元及び／または非還元条件下で各精製されたタンパク質の１μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。非共有結合凝集体の存在を試験し、かつＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を補完するために、分析的なサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＳＥＣカラム及びランニングバッファーとして１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して、分析的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってアイソクラティックモードで、選択したクローンの一定分量を分析した。
分取ＳＥＣを使用して、選択したタンパク質をさらに精製した。１ｍｌまでの抗体試料を、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＳＥＣカラムまたはＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラムに充填した。目的のピークの１ｍｌの画分を収集し、メインピーク画分をプールした。サイズ排除クロマトグラフィー後、上述のようにＳＤＳ－ＰＡＧＥによって試料を再度分析した。
赤血球凝集
赤血球（ＲＢＣ）を凝固していない新鮮なヒト血液（最低でも３人の異なるドナー）から分離し、ＰＢＳで２％まで希釈し、ＩｇＧまたはタンパク質構築物と共にＵ底９６ウェルプレートで６０～９０分間インキュベートして滴定した。赤血球凝集がない状態では、細胞はウェルの底に沈殿し、赤いペレットを形成した。赤血球凝集は、沈殿していないＲＢＣ溶液として観察された。各プレートの画像を記録し、赤血球凝集が観察された最後のウェルの力価として試料ごとにデータを表した。
メタロプロテアーゼ消化
５ｍＭのＣａCｌ２を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中で、タンパク質構築物を個々のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）酵素と共に、または活性ＭＭＰ３とＭＭＰ７とＭＭＰ１２（各々が同分量）の混合物と共に、タンパク質構築物に対する総ＭＭＰが１％の比率（ｗｔ／ｗｔ）で、３７℃で１６時間インキュベートした。２０ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって反応を停止し、次いで記載されているように試料の結合または機能活性を試験した。
ＩｇＧ滴定結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートをコーティングするために、標的タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で１μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で一晩、ウェルごとに１００μｌ加えた。コーティングしたプレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、ＰＢＳ（３８０μｌ／ウェル）中の４％のスキムミルクタンパク質で室温にて１時間ブロックし、次に、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で５回洗浄した。次に抗体（１００μｌ／ウェル；ＰＢＳＴで希釈）を加えて、室温で１時間インキュベートした。続いて、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、室温で１時間ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰを加えた（１００μｌ／ウェル）。次に、プレートをＰＢＳＴで３回、ＰＢＳで２回洗浄した後、ウェルごとに１００μｌのＴＭＢを加えた。ウェルごとに１００μｌの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止し、プレートリーダーで４５０ｎｍのＯＤを読み取った。
フローサイトメトリー結合測定
タンパク質構築物（ＭＭＰ３／７／１２による前消化を伴った／伴わない）及び対照ＩｇＧのジャーカット細胞及びＢＴ－４７４細胞への結合をフローサイトメトリーによって評価した。Ｚｏｍｂｉｅ ＵＶ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して生細胞を識別した。ヒトＩｇＧ及びタンパク質構築物の結合を、ＦＩＴＣ複合体化ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）二次抗体を用いて検出した。マウスモノクローナル抗ＣＤ３対照抗体結合を、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ－４８８ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して検出した。ＢＤ ＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターのＦＩＴＣチャネル検出器で生細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することによって生成物を評価した。
Ｔ細胞活性化バイオアッセイ
ＢＴ４７４細胞及びＮＦＡＴ－ＲＥ－ルシフェラーゼジャーカットレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ－ＴＣＲ／ＣＤ３エフェクター細胞ＮＦＡＴ）を使用して、Ｈｅｒ２ＣＤ３タンパク質構築物の機能活性を共培養アッセイにて評価した。１０％ＦＢＳを補充したＨｙｂｒｉ－Ｃａｒｅ培地（ＡＴＣＣ）中で、ＢＴ－４７４細胞（４００００細胞／ウェル）を９６ウェル白色透明底組織培養処理プレートに播種し、ＣＯ２インキュベータ内で、３７℃で一晩インキュベートした。培地を取り除き、アッセイ培地（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ）で作成した対照抗体またはタンパク質構築物（ＭＭＰ３／７／１２による前消化を伴った／伴わない）を細胞に加えた。製造者のプロトコルに従って、ＴＣＲ／ＣＤ３エフェクター細胞（ＮＦＡＴ）を解凍して、希釈し、次いで、アッセイウェルに加えた。３７℃で、ＣＯ２インキュベータ内で６時間インキュベートした後、プレートを室温まで再平衡化し、５～１０分間のＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬の添加及び発光シグナルの測定（ＲＬＵ）によりルシフェラーゼ活性を同定した。抗体が存在しない状態で、バックグラウンド発光シグナルを差し引いた後に、試料のＲＬＵ／ＲＬＵの比率を計算することによって誘導倍率を割り出した。
分子動力学シミュレーション
ＭＯＥのＡＭＢＥＲ１０：ＥＨＴ力場（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ）を使用して、８つの系（リンカー配列Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４、ならびにＧＳ配列位置ＸＣ１、ＸＣ２、ＸＣ３及びＸＣ４でのリンカーの１つで共有結合が切断されている同等の配列）をモデル化し、最適化した。ＭＯＥでＰｒｏｔｏｎａｔｅ３Ｄツールを使用して、ヒスチジン電荷を割り当てた。制約なしに１０，０００ステップを許容する０．００１の最終勾配で３回の連続最小化を実施した。個々の系を再度制約し、ＣＨＡＲＭＭ２７力場と共にＮＡＭＤ２．１３を使用して、徐々に最小化し、連続する３ステップのエネルギー最小化で総ポテンシャルエネルギーを減少させた。最初のステップでは、全ての重原子を拘束し、水素原子のみの移動を可能にした。第２ステップで、側鎖の制約を取り除き、第３ステップで全ての原子を解放し、制約なしでの移動を可能にした。ＣＨＡＲＭＭ２７がＮＡＭＤ分子動力学シミュレーション内で使用される力場であるため、ＣＨＡＲＭＭ２７内の最小化が容易になった。
動力学法の実行には、溶媒効果を記述するためにＧｅｎｅｒａｌｉｓｅｄ Ｂｏｒｎ （ＧＢ）溶媒和を使用した。ＭＤシミュレーションを設定し、その後ＮＡＭＤ２．１３を使用して実施した。４ステップの平衡化を実施し、総平衡化時間５００ピコ秒の間、１２５ピコ秒刻みで調和制約を徐々に弱めた。最初のステップで、４ｋｃａｌ／ｍｏｌの力を加えながら系を３１０Ｋまで加熱し、所定の位置に主鎖を固定した。残りの３ステップで、ＮＶＴアンサンブル（一定の数（Ｎ）、体積（Ｖ）及び温度（Ｔ））を用いて４ｋｃａｌ／ｍｏｌから１ｋｃａｌ／ｍｏｌへと徐々に主鎖の拘束力を解除した。ファン・デル・ワールスポテンシャル関数を縮小するためにスイッチング機能を１０オングストロームで適用した。静電及びｖｄＷカットオフをＮＡＭＤで推奨されているように１４オングストロームに設定した。陰溶媒法と互換性がないため周期境界条件は使用しなかった。抗体複合体の自由なシミュレーションのために平衡化中に加えていた制約を解除した。３１０Ｋで６、１５、２０または１００ナノ秒のいずれかでプロダクションランを行った。移動範囲を完全に調べるために１００ナノ秒ランを切断されたリンカータンパク質ＸＣ１－４に適用したが、切断されていない抗体構築物Ｘ１－４では移動範囲をマップするためには、より短いラン（最大２０ナノ秒）で十分であることが判明した。
ＰＫ及び忍容性のｉｎ ｖｉｖｏ分析
忍容性研究－２８匹の６～８週齢のオスのＢ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ１ＤｃｒＴｇ（ＦＣＧＲＴ）３２ＤｃｒＪ（「Ｔｇ３２」ホモ接合体ヒトＦｃＲｎ遺伝子導入、ＪＡＸストック番号０１４５６５）マウスを、各グループにマウスを４匹ずつ、７つのグループに分けた。抗体を投与する日に体重を測定した。０時間目に、ＩＶ注射として２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで、１０ｍｌ／ｋｇの投与量で試験品を投与した。全部で２００μＬの全血試料を５、２９及び６０日目（最終出血）に、ＥＤＴＡ中に採取した。血液を、白血球、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、ヘモグロビン、赤血球、網状赤血球、ＭＣＨＣ及びＭＣＶを含むＣＢＣ／Ｄｉｆ／Ｒｅｔｉｃ分析に使用した。続いて、最初の月は週に１回、その後実験が終了するまで月に１回、体重をモニタリングした。
薬物動態研究－３２匹の６～８週齢のオスのＢ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ１ＤｃｒＴｇ（ＦＣＧＲＴ）３２ＤｃｒＪ（「Ｔｇ３２」ホモ接合体ヒトＦｃＲｎ遺伝子導入、ＪＡＸストック番号０１４５６５）マウスを、各グループにマウスを４匹ずつ、８つのグループに分けた。試験品を投与する前日に、３匹のＴｇ３２マウスから３５μｌの血液試料をＥＤＴＡ中に採取し、フローサイトメトリーを使用してマウス赤血球への試験品の結合を試験した。抗体を投与する日、及び実験が終了するまで週に１回、体重を測定した。０時間目に、ＩＶ注射として２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで、１０ｍｌ／ｋｇの投与量で試験品を投与した。出血スケジュール：３０分、４時間、１、３、５、７、１０、１４、２１、２８及び４２日目、に従って、各マウスから血液試料を採取した。出血スケジュールに従って各マウスから２５μｌの血液試料を採取した。血液試料をＫ３ＥＤＴＡ中に採取し、血漿に処理し、－２０℃で保存した。次にヒトＩｇＧ濃度の推定のために血漿試料を３回ＥＬＩＳＡによって評価した。
ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおける忍容性研究－ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスを、各グループにマウスを３匹ずつ、４つのグループに分けた。体重を毎日測定した。０日目に、ＩＶ注射として８ｍｇ／ｋｇまたは１４ｍｇ／ｋｇで、その後５日間隔で４または７ｍｇ／ｋｇで３回、試験品を投与した。
サルとヒトの赤血球への結合のフローサイトメトリー分析
赤血球を３匹のＣｙｎｏ（カニクイザル）サル及び３人のヒトドナーから分離した。試料ごとに、５×１０５細胞（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳで希釈）を、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１：０．００３２；０．０１６；０．０３；５０μｇ／ｍＬで１時間、トラスツズマブ：０．００３２；０．０１６；０．０３；５０μｇ／ｍＬで、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ：０．０１６；０．０８；０．４；２；１０；５０μｇ／ｍＬで０時間、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ：０．０１６；０．０８；０．４；２；１０；５０μｇ／ｍＬで０時間、染色した。試験試料の赤血球への結合をＦＩＴＣ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧを使用して測定（１：２００希釈；１時間のインキュベーション時間）し、続いてＦＩＴＣの蛍光強度のフローサイトメトリー測定（ＢＤ ＬＳＲ ＦｏｒｔｅｓｓａＸ－２０細胞分析装置）を行った。
ｐＨ６．０及び７．４でのメタロプロテアーゼ及びカテプシン消化
タンパク質構築物をＴＢＳ（５ｍＭのＣａＣｌ２を含む、ｐＨ６．０または７．４）に入れて、個々のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）またはカテプシン酵素と共に、タンパク質構築物に対する総酵素が１％の比率（ｗｔ／ｗｔ）で、３７℃で０、２、４、８及び２４時間インキュベートした。２０ｍＭのＥＤＴＡを加えることによって反応を停止し、次いで試料を凍結させてから、記載されているように試料の結合または機能活性を試験した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質安定性分析
強制酸化－強制酸化の分析のために、ＰＢＳ内の試験品を０．５％Ｈ２Ｏ２で室温にて２時間処理した後、－８０℃で保存し、その後Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳ ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）でＳＥＣ及びＲＰ分析（インタクト抗体及びサブユニット、トリプシンペプチド）を行った。インタクト抗体還元のために、ＤＴＴを０．３３Ｍの最終濃度まで添加し、試料を２２℃で１時間インキュベートして、直ちにＲＰによって分析した。
ＳＥＣ分析－Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳ ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）に連結されたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム、２００オングストローム、１．７μｍ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｌｓｔｒｅｅ，ＵＫ）及びＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣガードカラム３０×４．６ｍｍ、１．７μｍ、２００オングストローム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｅｌｓｔｒｅｅ，ＵＫ）を使用してクロマトグラフ分離を実施した。この方法は、アイソクラティック溶出を１０分間かけて行うものであり、移動相は０．２Ｍリン酸カリウムｐＨ６．８、０．２Ｍ塩化カリウムであった。流速は０．３５ｍＬ／分であった。検出は２８０ｎｍのＵＶ吸収で行った。
インタクト抗体及びサブユニットの逆相分析－Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳ ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）に連結されたＰＬＲＰ－Ｓ １０００、５μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｏｃｋｐｏｒｔ，ＵＫ）を使用してクロマトグラフ分離を実施した。この方法は、７５％の緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏ中０．０２％ＴＦＡ、７．５％アセトニトリル）から４５％の緩衝液Ｂ（アセトニトリル中０．０２％ＴＦＡ、７．５％Ｈ２Ｏ）までの直線グラジエントを１４分かけて行うものであった。流速は０．５ｍＬ／分であり、分析中の温度は７０℃で維持した。検出は２８０ｎｍのＵＶ吸収で行った。
ＨＩＣ分析－Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳ ＨＰＬＣシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｅｍｅｌ Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，ＵＫ）に連結されたＴＳＫｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲ ４．６ｍｍ×３５ｍｍ ＨＩＣカラム（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）を使用してクロマトグラフ分離を実施した。この方法は、６０％の緩衝液Ａ（１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０、２Ｍ硫酸アンモニウム）から９０％の緩衝液Ｂ（１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０）までの直線グラジエントを９分間かけて行うものであった。流速は１．２ｍＬ／分であった。検出は２８０ｎｍのＵＶ吸収で行った。
チャージバリアント分析－ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｔｏｕｃｈ ＨＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で製造者のプロトコルに従ってタンパク質チャージバリアント分析によって試験品のチャージバリアントプロファイリングを決定した。
ヒトＦｃ受容体に対するＦｃ親和性のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析
抗体タンパク質の相互作用親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ２００測定器を使用して表面プラズモン共鳴により測定した。ほとんどの分析で、Ｈｉｓ６タグ化ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ（１６７Ｒ及び１６７Ｈバリアント）、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ（１７６Ｆ及び１７６Ｖバリアント）、及びＦｃγＲＩＩＩｂ受容体（全てＳｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を、標準的なアミンカップリング法によって、抗ＨＩＳ抗体でコーティングしたＣＭ５センサーチップ上で捕捉した。次に、受容体固有の分析形式を下記のように適用した。
ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１モノマーの高親和性受容体であるため、１：１カイネティック分析を、流速３０μｌ／分を使用した「シングルサイクル」分析、１０μｌ／分（ＨＢＳ－Ｐ＋で０．２５μｇ／ｍｌに希釈）で約３０ＲＵまで受容体タンパク質をロード、会合時間２００秒、解離時間３００秒で０．４１１ｎＭ～３３．３３ｎＭに滴定した精製抗体を５点３倍希釈したものを適用、の条件下で実施した。グリシンｐＨ１．５を２回注入して再生し、１：１フィットを使用して分析した。
単量体ＩｇＧと、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩ受容体との間の相互作用は、比較的低い親和性相互作用であるため、「定常状態」親和性分析を、流速３０μｌ／分、１０μｌ／分（ＨＢＳ－Ｐ＋で０．２５μｇ／ｍｌに希釈）で約６０ＲＵまで受容体タンパク質をロード、会合時間３０秒、解離時間２５秒で３３ｎＭ～２４０００ｎＭに滴定した精製抗体を５点３倍希釈したものを適用、の条件下で実施した。グリシンｐＨ１．５を２回注入して再生し、定常状態親和性算出を使用して分析した。
結果と考察
タンパク質構築物の設計原理
標準的抗がん抗原抗体は、固形腫瘍の治療において重大な薬理学的課題を抱えている。潜在的な薬物のこのクラスにおける有効性を制限する主な問題は、抗体の標的となる抗原が腫瘍にのみ見られるものではなく、腫瘍で高度に過剰発現しているに過ぎないことである。この腫瘍外の標的発現は、治療効果を発揮するように十分な抗体が腫瘍に浸透することを確実にするために大量の抗体を投与しなければならない場合に、用量制限副作用リスク及び抗原「シンク」効果をもたらすことが多い。そのような例の１つは、抗原ＣＤ４７を標的とする抗体のクラス（図１Ａ）であり、この場合の課題としては、血流内での（例えば、特に赤血球及び血小板での）高度発現のＣＤ４７が、静脈内投与抗体によって結合される「シンク」であり、腫瘍へ浸透する薬物の量を最小限に抑える（ＩｇＧが大量投与された場合であっても）ことが挙げられる。抗ＣＤ４７による血球の結合もまた重大な毒性リスクである。実際に、抗ＣＤ４７抗体は、貧血、さらにはヒト赤血球の架橋を引き起こし、患者における赤血球凝集リスクをもたらすことが知られている。加えて、腫瘍は典型的には、ＩｇＧ分解を加速することがあるＭＭＰなどの酵素の発現率が高い「好ましくない」環境である。これらの因子は全て、標的発現が腫瘍環境だけに限らない場合に、抗ＣＤ４７抗体及び多数の他のタイプの抗腫瘍標的抗体の潜在的な安全性及び有効性を最小限に抑えるように共に作用する。
抗ＣＤ４７タンパク質構築物（図１Ｂ）は、ネイティブタンパク質における、高リスクの（しかし潜在的には強力な作用機序）の標的の結合を排除することによって、抗腫瘍抗原ＩｇＧで遭遇する周辺シンク及び毒性の問題を克服することを目的としている。この効果は、低リスクの上部ドメイン（例えば、Ｈｅｒ２などの別の腫瘍抗原を標的とするＦａｂドメイン）、及び高リスク下部ドメイン（ＣＤ４７など）の結合ドメインの上に（Ｎ末端に）リンカーを加えることによって実現される。適切な上部ドメイン／リンカーの組み合わせを用いることにより、下部ＣＤ４７ドメインにおける結合活性を完全にブロックする構成になる。次に、腫瘍標的ドメイン（例えば、Ｈｅｒ２）は、腫瘍環境で高濃度化を促進し、タンパク質構築物リンカー系が腫瘍における上昇したＭＭＰ活性を利用してリンカーペプチドを切断し、ＣＤ４７結合ドメインを露出させ、それにより、周辺部よりも、腫瘍でのＣＤ４７結合活性を条件付きで活性化する。この設計原理は、多くの異なる構造形式に適用できる可能性があり、その例を下記にて概説する。
タンパク質構築物ＩｇＧ２設計（図２Ａ）は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＡに由来する配列に基づいてよく、かつエフェクター機能能力を有していてもいなくてもよい。この構築物では、４つのポリペプチド鎖は４つのＦａｂドメイン（２個のＦａｂ Ａ、２個のＦａｂ Ｂ）、４つのリンカー配列をコードし、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよい。各Ｆａｂ Ａ－リンカードメイン（上部）は、Ｆａｂ Ｂ（下部）の結合活性をブロックする。上部及び下部ドメインの標的結合特異性は、二重特異性機能を促進するために異なるものであるか、多価標的相互作用を促進するために同じものであってもよい。下部ヒンジペプチド配列などのリンカー配列の選択により、非患部組織では抑え込まれるが、腫瘍環境における高濃度のプロテアーゼの存在下では素早く切断され、開放される構造体を作る（図２Ｂ）。タンパク質構築物設計におけるリンカーは、全てタンパク質分解的に切断可能であり、かつ「抑え込まれている」インタクト構造体の最初の「速い」切断が行われ、中間の「開放された」活性化状態を作る状態で順々に切断され得、それにより、単一のタンパク質構築物からのＦａｂ Ａ及びＢが、それらの同族の標的に結合することが可能になる。各Ｆａｂ Ａ－Ｆａｂ Ｂタンパク質構築物ユニット中の第２リンカーの潜在的により遅い二次切断により、Ｆａｂ Ａドメインが構造体から完全に解放され、下部Ｆａｂドメインが標的外の（ただし、依然として局在する）活性向けに完全に遊離する、「解離した」形態を作り出すことができる。免疫グロブリンヒンジ配列に基づく切断されたリンカーはまた、内因性抗ヒンジ抗体を介して細胞膜で、免疫エフェクター機能（ＡＤＣＣ、ＣＤＣ及びＡＤＣＰ）の増大を動員する可能性があり、これは基礎自己反応性疾患を有する（場合によっては有さない）ヒト患者における現象として知られている。
タンパク質構築物Ｆａｂ２設計は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＡに由来する配列に基づいてよく、かつエフェクター機能能力を有していてもいなくてもよい。この構築物では、２つの（図３Ａ）または３つの（図３Ｂ）ポリペプチド鎖が２つのＦａｂドメイン（１個のＦａｂ Ａ、１個のＦａｂ Ｂ）、２つ以上のリンカー配列をコードし、かつ免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃドメインを有していてもいなくてもよいが、この際、ヘテロ二量体のペアリングはＦｃにおける変異によって誘導されてもされなくてもよい。この場合も各Ｆａｂ Ａ－リンカードメインは、Ｆａｂ Ｂの結合活性をブロックし、下部ヒンジペプチド配列などのリンカー配列の選択により、非患部組織では抑え込まれているが、腫瘍環境における高濃度のリンカー切断プロテアーゼの存在下では素早く切断され、開放され、最終的には解離される構造体を作る（図３Ａ）。
タンパク質構築物のクローニング及び発現
異なるリンカードメイン（表１）を有するＦａｂ２またはＩｇＧ２分子として形成される１５個の二重特異性の条件付き活性タンパク質構築物を生成及び精製するために、構築物タイプ（表２）ごとのＤＮＡカセットを合成し、ヒトＩｇＧ１重鎖及び軽鎖、または「ノブイントゥホール」ヘテロ二量体Ｆｃをコードする発現ベクターにクローニングした。タンパク質を、学名（形式）－（標的名［上部ドメイン／下部ドメイン）－（重鎖リンカータイプ）－（軽鎖リンカータイプ）を用いて命名した。ＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションによって全てのタンパク質を生成し、次いで、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製した。
本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ＨＥＲ２可変領域配列は、トラスツズマブの可変領域配列である。本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ＣＤ３可変領域配列は、ＯＫＴ３またはＳＰ３４の可変領域配列である。本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ｃＭＥＴ可変領域配列は、ＷＯ２０１９／１７５１８６にて提供されているものである。本明細書にて開示するタンパク質構築物で使用される抗ＣＤ４７可変領域配列は、ＷＯ２０１９／０３４８９５にて提供されているものである。
タンパク質構築物発現及び精製特性の分析
タンパク質Ａ精製タンパク質を定量化したところ、異なるリンカータイプを用いると発現収率に影響を与えることを示した（表２）。１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のタンパク質調製物もまた、所望の生成物の割合を定量化するために、分析的なサイズ排除クロマトグラフィーで検査した。生成された二重特異性タンパク質の３つのクラスの全て（ｃＭＥＴＣＤ４７、Ｈｅｒ２ＣＤ４７及びＨｅｒ２ＣＤ３）に対する分析的なＳＥＣにより、ＬＨＬリンカーを含む構築物は、所望の生成物の最も高い収率とメインピークの割合の生成との最も最適な組み合わせをもたらした（表２）。タンパク質Ａ精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図４）もまた、短いリンカードメインＬ１及びＬＨに加えて、長いリンカードメインＬ３を含むクローンは、非還元試料ではＨＭＷ及びＬＭＷの生成物の構成比率、ならびに還元試料ではＬＭＷの生成物の構成比率が高い非常に不均一な生成物を生成したことを示した。最適以下のリンカータイプは、望ましくない多量体及び損傷生成物の著しい形成をもたらす可能性があることを示唆している。全ての構築物では、ＨＭＷ不純物は、還元レーンにはほとんど存在せず、これらのＨＭＷ不純物は、ＳＤＳ単独では還元されないジスルフィド結合二量体であるか、それより大きいことを示唆している。ＩｇＧ２設計では、クローン１２及び１４の両方は高収率を示した（表２）が、クローン１４（ＬＨＬリンカーを含む）は、ＳＥＣ（９０％）及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、所望の生成物の最も高い収率と高い均一性を示した（図４）。
次いで、完全に精製された単量体タンパク質を生成するために、クローンのサブセットからの残りのタンパク質試料に対してＳＥＣクロマトグラフィーを実施した。分取ＳＥＣでのクローン１、２、３、４、５、６、１０、１２及び１４のクロマトグラフィートレースを図５に示す。これらの分析は、さらにクローン１（図５Ａ）、３（図５Ｃ）、４（図５Ｄ）、５（図５Ｅ）及び１２（図５Ｇ）は、所望の生成物のメインピーク周辺（図５Ａ～５Ｈでは約０．５～０．５５のＣＶで溶出）で、かなりの割合の高分子量、及びしばしば低分子量の生成物を含んでいることを示した。対照的に、クローン６（図５Ｆ）、１４（図５Ｈ）及び１０（図５Ｉ）は、優勢な明確な主要生成物ピークを呈した。クローン２及び６の場合、非還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって示されているように、主に単量体タンパク質の有効なＳＥＣ精製が可能であった（図６Ａ）。クローン１、４、及び５のＳＥＣ精製の試みは失敗し、依然として不均一な試料が生成された（図６Ａ）。非還元及び還元試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥで証明されているように、Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２クローン７、８及び１０由来のＳＥＣ精製タンパク質は、均一性の改善が見られたが、Ｈｅｒ２ＣＤ４７ ＩｇＧ２クローンのうち、クローン１４のみが、完全な均一性及び単量体状態を達成した（図６Ｂ）。繰り返すが、両鎖にＬＨＬリンカーを含むクローン６、１０及び１４の全ては、最も再現性があり有益な特性を呈したことが、これらの所見により実証された。
下部ＦａｂにおけるＣＤ４７抗体Ｖドメインを含むタンパク質構築物の機能特性評価
対照ＩｇＧ抗体Ａ－Ｄ５抗ＣＤ４７、ＭＨ７．１抗Ｃ－ＭＥＴ、抗Ｈｅｒ２トラスツズマブ、及びＡ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃ（単一のＦａｂドメインを含むＡ－Ｄ５抗体の一価型）を、ヒトＣＤ４７、Ｃ－ＭＥＴ及びＨｅｒ２タンパク質に対して直接結合ＥＬＩＳＡで滴定した（単位μｇ／ｍｌ）（図７Ａ）。ＩｇＧ２形式のＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨ及びＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬクローン（図７Ｂ）、ならびにＦａｂ２形式のｃＭＥＴＣＤ４７－Ｌ２－Ｌ２及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ（図７Ｃ）もまた、同じ方法で分析した。対照抗体は、それらの同族の標的に対して予想された強い結合活性を示したが、最高濃度であってもその他の標的に対するバックグラウンドはほとんど、またはまったくなかった（図７Ａ）。
重要なことに、Ａ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃの非常に強い一価結合は、Ａ－Ｄ５抗ＣＤ４７ドメインの内因的親和性及び重要な効力を示したが（図７Ａ）、これらは、本発明のタンパク質構築物の形式を成功させるためにはそれに抑え込む必要があるものである。タンパク質構築物Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ（図７Ｂ）及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ（図７Ｃ）もまた、同族の標的に対するそれらの上部Ｆａｂドメインの同様の強く高い特異的結合を示したが、このリンカーの組み合わせを使用する場合、ＣＤ４７に対する結合シグナルはなく、ＣＤ４７Ｖドメインの結合活性を確かに完全に阻害したことが実証された。重要なことに、Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨの場合、ヒトＣＤ４７の高バックグラウンドシグナルが観察され、ｃＭＥＴＣＤ４７－Ｌ２－Ｌ２ではその程度は低く、このことは、下部Ｆａｂでの結合親和性の消失は、リンカー選択によって精密にコントロールされることを示唆している。これらの所見は、このアッセイにて試験した、抗体Ａ－Ｄ５の抗ＣＤ４７結合ドメインを含むタンパク質構築物Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ（図７Ｂ）及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ（図７Ｃ）は、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１と比べてＣＤ４７に結合する能力が１０００倍以上低いことを示唆しているが、この際、１．０の結合シグナルＯＤが約１×１０－２μｇ／ｍｌで実現され、その一方で、どちらのタンパク質構築物も、試験した最高濃度の１０μｇ／ｍｌで０．２を超えるシグナルを示さなかった。
赤血球凝集は、抗ＣＤ４７抗体の主要な毒性リスクであるため、ヒト赤血球ベース赤血球凝集アッセイにて、優先付けられたタンパク質構築物を検査した。対照抗体抗ＣＤ２３５ａ（マウス）及びＡ－Ｄ５抗ＣＤ４７、Ａ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃ、ＭＨ７．１抗Ｃ－ＭＥＴ、抗Ｈｅｒ２トラスツズマブ、ＩｇＧ２形式のＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨ及びＨｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ、ならびにＦａｂ２形式のｃＭＥＴＣＤ４７－Ｌ２－Ｌ２及びｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬを、健康なドナー１（図８Ａ）、ドナー２（図８Ｂ）、及びドナー３（図８Ｃ）からの新鮮な赤血球を使用して、ヒト赤血球凝集アッセイで滴定した（単位ｎＭ）。全ての３人のドナーで、対照抗体抗ＣＤ２３５ａ、Ａ－Ｄ５抗ＣＤ４７及びＡ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃは、隣接する赤血球のそれらの対応する表面抗原の架橋に起因する強力な濃度依存性赤血球凝集を示した。Ａ－Ｄ５ Ｆａｂ－Ｆｃ（クローン１５）で観察された低効力赤血球凝集効果は、タンパク質Ａカラムのみで精製され、ＳＥＣによって単量体状態に完全に精製されなかったため、このタンパク質調製物における少量の官能性二量体の存在が原因である可能性がある。重要なことに、いずれのタンパク質構築物試料も、１４０ｎＭの最高濃度であっても、赤血球凝集効果を生じさせる能力を示さなかった。この所見は、このアッセイにて試験した抗体Ａ－Ｄ５の抗ＣＤ４７結合ドメインを含むＩｇＧ２及びＦａｂ２形式のタンパク質構築物は、０．５８ｎＭの力価を示したＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１と比べて凝集作用を生じさせる能力が２４１倍超低いことを示唆している。
優先付けられたタンパク質構築物を、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ３、７及び１２を使用した酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーションも行った。次に、これらの経時的な消化を経た試料を、ヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７（図９Ａ、Ｂ）またはヒトＣ－ＭＥＴ及びＣＤ４７（図９Ｃ）に対する直接結合ＥＬＩＳＡに供した。いずれの場合も、Ｈｅｒ２またはＣ－ＭＥＴのいずれに対しても、結合の喪失は時間経過で観察されず、これはプロテアーゼを加えても、上部Ｆａｂドメインの機能的結合能力が低下しないことを示唆している。対照的に、全ての３つのタンパク質構築物のＣＤ４７結合能力は、ＭＭＰに依存して、経時的に明らかに上昇した。クローンＩｇＧ２ Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨ－ＬＨ（図９Ａ）は、この場合もまた、ＣＤ４７へのバックグラウンド結合が高く、かつ経時的なＣＤ４７結合の増加が最も低いことを示した。対照的に、クローンＩｇＧ２ Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ（図９Ｂ）及びＦａｂ２ ｃＭＥＴＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ（図９Ｃ）は、この場合もまた、ＣＤ４７へのバックグラウンド結合は低く（ＯＤ４５０ｎＭで０．２未満）、かつＭＭＰ７と１２の両方を伴う２時間のインキュベーション以降、ＣＤ４７への結合が急速に増加し、２４時間のインキュベーションでは完全飽和（ＯＤ４５０ｎＭで約４．０）に到達することを示した。ＭＭＰ３は、３つのＭＭＰの中で、活性が最も遅いことが見受けられるが、２４時間後に３つのタンパク質構築物の全ての例でＣＤ４７結合シグナルが増加することを示した。
下部ＦａｂにおけるＣＤ３抗体Ｖドメインを含むタンパク質構築物の機能特性評価
抗体Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ１－ＬＨ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ２－Ｌ２及びＦａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬを、ＥＬＩＳＡ（図１０Ａ）、フローサイトメトリー（図１０Ｂ）及びＣＤ３レポーターアッセイ（図１０Ｃ）によって分析した。ＥＬＩＳＡ分析では、３つのタンパク質の全ては、Ｈｅｒ２（上部Ｆａｂドメイン）に対して予想された強い結合活性を示したが、最高濃度であっても、その他の標的に対するバックグラウンド結合はほとんど、またはまったくなかった（図１０Ａ）。３つのタンパク質構築物Ｆａｂ２タンパク質の全てをＭＭＰ３、７及び１２の混合物と共に、または伴わずに、一晩インキュベートし、その後さらに分析した。ＨＥＲ２＋ヒト細胞株ＢＴ４７４への結合のフローサイトメトリーでは、抗ＨＥＲ２トラスツズマブは、強い結合を示し、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ１－ＬＨ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ２－Ｌ２は、同様に、ＭＭＰ消化前及び消化後で強力な結合を示し、その一方で、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬは、ＭＭＰ消化後、結合が部分的に減少したことを示したが、これは、「解離された」状態で上部Ｆａｂを失ったタンパク質の割合を示唆している（図１０Ｂ）。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬの場合にＭＭＰ消化プロセスが活性化することをこの所見が示唆しているため、同じ試料をレポーターアッセイに適用したが、この際、Ｈｅｒ２＋ＢＴ４７４細胞を、ＣＤ３が活性化した場合に測定可能なシグナルを提供するように遺伝子操作されたヒトＣＤ３＋ジャーカット細胞と混合した。このアッセイからのデータは、予想したように、二価の抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３が、レポーター細胞でのＣＤ３シグナルを直接活性化したことを示した（図１０Ｃ）。タンパク質構築物のそれぞれは、異なるプロファイルを示した。２個のＧ４Ｓリンカー（ＭＭＰプロテアーゼによって切断不可能な）を含むＨｅｒ２ＣＤ３－Ｌ２－Ｌ２タンパク質は、アッセイにて高バックグラウンドを示したが、ＭＭＰ消化後にＣＤ３活性化シグナルの増加は見られず、これは、この構築物の可撓性リンカーが、上部ＦａｂによるＨｅｒ２の結合及びいくつかのバックグラウンドを可能にする下部Ｆａｂの部分的な活性化を可能にするが、ＣＤ３相互ライゲーションは活性化しないことを示唆している（図１０Ｃ）。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－Ｌ１－ＬＨタンパク質は、アッセイにてより低いバックグラウンド活性を示したが、ＭＭＰ消化後にシグナルの穏やかな増加が見られた。Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬは、ＭＭＰ消化が存在しない状態で測定可能なバックグラウンドシグナル伝達がなかったことを示し、未消化試料では陰性対照トラスツズマブ及びＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体に類似したＣＤ３の極小の活性化を示したが、ＭＭＰ消化試料では強力な活性化が見られた。したがって、図１０Ａ～Ｃのデータは、単に発現及び精製したようなＨｅｒ２ＣＤ３－ＬＨＬ－ＬＨＬ Ｆａｂ２形式は、高い固有Ｈｅｒ２結合活性、低バックグラウンドＣＤ３ライゲーション活性、及びＬＨＬリンカーのＭＭＰ切断によって活性化される場合のみにＣＤ３相互ライゲーション活性が高いことを含む、特性の最良の組み合わせを有することを示唆している。
第２世代構築物クローニング及び発現
ＬＨＬリンカーを含む上記の多重特異性Ｆａｂ２及びＩｇＧ２クローンの性能により、別の一連の構築物が想起され、三次構造とリンカー配列内容の両方での潜在的な機能配列空間を実験的に検査した。これらのパラメータをサンプリングするために下記のクローンを合成及び組み立てた。
１．「ワンアーム」型のＦａｂ２タンパク質であるクローン「Ｍｅｔ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ」（表６、図３Ｂ）。
２．「ワンアーム」型の改造型「クローン１０」Ｆａｂ２タンパク質であるクローン「Ｈｅｒ２３－ＬＨＬ－ＬＨＬ」（表７、図３Ｂ）。
３．「ワンアーム」型のＦａｂ２タンパク質であるクローン「Ｈｅｒ２３（３４）－ＬＨＬ－ＬＨＬ」（表８、図３Ｂ）。
４．上部ＦａｂにトラスツズマブのＨｅｒ２結合ドメイン、及び下部ＦａｂにクローンＡ－Ｄ５のＣＤ４７結合ドメインを組み込んだＩｇＧ２タイプの一連のクローン（表９）。これらのクローンは、幅広い一群のＭＭＰによる酵素切断に対して感受性が高い可能性のある変異型ＬＨＬベースリンカー配列（ＬＨＬＦリンカー）、ヒトＩｇＧ１中間ヒンジ配列の一部を加えて適度に伸長したリンカー（ＬＨＬＭリンカー）、またはその両方（ＬＨＬＭＦリンカー）を含んでいた。
５．Ｆａｂ２モジュールが、ＫＩＨ－ＦｃのＣ末端に位置しているＦａｂ２タンパク質であるクローン「Ｆｃ－Ｈｅｒ２３（３４）」（表１３、図１２）。
６．Ｃ－Ｍｅｔ Ｆａｂの２つのコピーを含む「ワンアーム」型のＦａｂ２タンパク質であるクローン「ＭｅｔＭｅｔ－ＬＨＬ－ＬＨＬ」（表１４、図３Ｂ、図１３）。この構造形式では、二価形態でのＭｅｔ受容体への結合は、単一のＬＨＬリンカーがプロテアーゼによって切断された後にのみ発生することができる。
前述したようなタンパク質Ａ及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、これらの構築物を正常に発現及び精製した。
第２世代ＩｇＧ２構築物の分析
上記の精製したＩｇＧ２クローンの性能を、一連のさらなる分析で検査した。例示的クローンＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＦ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７－ＬＨＬＦ－ＬＨＬＦ（表９）のヒトＨｅｒ２、ならびにヒト及びマウスＣＤ４７への結合についてまず調べた（図１４）。この分析は以下の２つを示した。１）Ａ－Ｄ５抗ＣＤ４７ ＩｇＧ１タンパク質は、ｈＣＤ４７とｍＣＤ４７の両方に対して高結合シグナルを示した。２）４つのＩｇＧ２タンパク質の全てはｈＨｅｒ２に対しては高結合シグナルを維持したが、ｈＣＤ４７またはｍＣＤ４７に対してはバックグラウンド結合シグナルがなかった（図１４）。
クローンＩｇＧ２ Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、ヒト腫瘍で過剰発現することで知られている複数のプロテアーゼ、すなわち、ＭＭＰ７（図１５Ａ）、ＭＭＰ８（図１５Ｂ）、及びＭＭＰ１０（図１５Ｃ）を伴うインキュベーションによる（ｐＨ７．４での）酵素活性化に対する感受性について検査し（図１５）、両方のタンパク質は、各酵素によってｈＣＤ４７結合を活性化され得るが、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦは、いずれの場合もより急速に活性化したことを示した。ＭＭＰ１２を伴うインキュベーションは、この酵素の場合、両方のタンパク質が等しい速度でｈＣＤ４７結合を活性化され得ることを示した（図１５Ｄ）。予想外に、ＭＭＰ１３を伴うインキュベーションは、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦがこの酵素によってｈＣＤ４７結合を活性化され得るが、その一方でＩｇＧ２ Ｈｅｒ２ＣＤ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬは活性化されない場合があることを示した（図１５Ｅ）。重要なことに、システインプロテアーゼカテプシンＳを伴うインキュベーションも、この酵素の場合、両方のタンパク質が等しい速度でｈＣＤ４７結合を活性化され得ることを示した（図１５Ｆ）。これらの所見により、ＩｇＧ２タンパク質に含まれるＦａｂ２モジュールのペプチドリンカー含量が、潜在的に活性化する酵素の数を増やすために、さらにより速くタンパク質分解活性化プロセスが行われるように「調整」され得ることが実証された。この潜在力をサンプリングするために、酵素の特定のクラスに対する感度を促進する適切な長さ及び含量でのさらなるリンカー設計、例えば、ＡＤＡＭＳ、システイン、アスパラギン酸及びセリンプロテアーゼなどの他の疾患関連メタロプロテイナーゼの活性に対するタンパク質分解感受性を示すアミノ酸配列を使用し、より広範であるか、またはより多い選択的活性化のいずれかを提供するといった設計を構想した。
ＩｇＧ２結合親和性の活性化の効果を調べるために、Ｈｅｒ２結合とＣＤ４７結合の両方をサンプリングすることができるＢｉａｃｏｒｅアッセイを行った。このアッセイでは、対照抗体及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬＦタンパク質（２、４、８または２４時間、ＭＭＰ１２によって消化されていない、または活性化された）を、抗Ｆｃ抗体を介してチップ表面で捕捉し、次いで、可溶性Ｈｅｒ２及びＣＤ４７外部ドメインタンパク質に対する結合親和性を測定した。トラスツズマブＩｇＧ１及びＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１（酵素消化なし）に対する結合分析を、実験の開始時と終了時に繰り返し行った。このデータを表１７に示す。これらの分析は、抗体ごとに計算したＫＤ値が各分析において非常に類似していることを示した。しかし、重要なことに、Ｒｍａｘ値（最大分析物濃度での最大結合シグナル）は、実験の開始時と終了時の分析で著しく低下し（例えば、トラスツズマブでは開始時はＲｍａｘ２６５．８０ＲＵ、終了時は１４４．１３ＲＵ）、これは抗Ｆｃ抗体の捕捉表面の活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ法固有の何度も繰り返す再生の後に低下することを示唆している。標的反応性に対するＭＭＰ１２活性化の効果を調べるために、Ｈｅｒ２（図１６Ａ、表１８）とＣＤ４７（図１６Ｂ、表１８）の両方のＲｍａｘ及びＫＤ値を計算した。この分析は、Ｈｅｒ２結合及び親和性が、２４時間のＭＭＰ１２活性化にわたって維持されたことを示した。重要なことに、０時間（ＭＭＰ１２消化なし）での試料ではＣＤ４７結合（Ｒｍａｘ＝０）は観察されなかったが、ＣＤ４７に対するＲｍａｘと明らかな親和性の両方は、２時間のインキュベーション以降、経時的な活性化にわたって急速に上昇した（図１６Ｂ、表１８）。これらの所見により、Ｆａｂ２モジュールの下部Ｆａｂは、完全に不活性であり、プロテアーゼ活性化が起こるまで、インタクト分子での標的相互作用を起こす能力がないことが実証された。この観測結果をさらに図１７に示した。ここで、ＣＤ４７分析物の４００ｎＭ濃度でも結合活性は観察されなかったが、ＭＭＰ１２処理の２４時間後のＣＤ４７への高結合は明らかなものであった。
上記の所見により、Ｆａｂ２モジュールにおけるリンカーペプチドの切断（したがって下部Ｆａｂの活性化）は、一時的なものであることも実証された。これは、上部Ｆａｂの標的抗原と下部Ｆａｂを活性化する能力がある酵素の両方が非常に過剰発現している患部組織に向かって活性化が著しく偏るので、Ｆａｂ２モジュールを含む分子にとって薬理学的利益となり得る。これにより、そのような患部組織における急速な薬物蓄積、長時間滞留、及び高レベルの活性化がもたらされる。
Ｆａｂ２モジュール構造及び分子動力学のｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデリング
Ｆａｂ２モジュールが機能する可能性があるメカニズムを理解するために、本発明者らは、構造的モデリング及び分子動力学分析を実施した。ＩｇＧ１ Ｃ４７Ｂ１６１（タンパク質構造データバンク識別子５ＴＺＴ）、ＩｇＧ１ Ｃ４７Ｂ２２２（タンパク質構造データバンク識別子５ＴＺ２）及びＩｇＧ１ Ｂ６Ｈ１２．２（タンパク質構造データバンク識別子５ＴＺＵ）のＦａｂドメインに結合したヒトＣＤ４７ ＥＣＤの結晶構造をテンプレートとして用い、ＭＯＥソフトウエアのタンパク質モデリングスイートを使用してＣＤ４７ ＥＣＤに結合した抗ＣＤ４７ Ａ－Ｄ５ Ｆａｂのモデルを生成した。Ｈｅｒ２細胞外ドメインとの複合体におけるトラスツズマブＦａｂの構造は、ＰＤＢ構造１Ｎ８Ｚから取得した。
次に、上部トラスツズマブＦａｂと下部抗ＣＤ４７ Ｆａｂとの間のＬＨＬ及びＬＨＬＦリンカーを、ＭＯＥソフトウエアのタンパク質モデリングスイートを使用してモデル化した。リンカーのモデリングを支援するために、タンパク質構造データバンクで入手可能なＦａｂ構造体のＣ末端を検査し、トラスツズマブＦａｂの重鎖及び軽鎖ドメインのそれぞれからＬＢリンカーを抜くことができる構造を定義するのに役立てた。モデリングにより、トラスツズマブＦａｂ重鎖及び軽鎖Ｃ末端が、ＩｇＧ１ Ｆａｂドメインに通常存在するネイティブの鎖間ジスルフィド結合を任意に有することができることが予測された。
上述のモデル化した抗ＣＤ４７ Ｆａｂを組み込んだ完全長のＩｇＧ１ベースモデルを、ＩｇＧ１ ｂ１２（タンパク質構造データバンク識別子１ＨＺＨ）の構造体をテンプレートとして使用して構築した。構造的領域の欠落など１ＨＺＨにおける構造的エラーを、再モデル化し、補正した。ＭＯＥソフトウエアのタンパク質モデリングスイートを使用して、ＩｇＧ１ ｂ１２ Ｆａｂを、抗ＣＤ４７ Ｆａｂで置き換え、かつＦｃヒンジを連結させた。このモデルは、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７に基づくＩｇＧ２分子のＩｇＧ１との三次構造の可能性を示した（図１８Ａ）。モデルでは、Ｈｅｒ２エピトープの結合は、構成的に活性であり（図１８Ａ）、その一方で、ＣＤ４７ ＥＣＤの結合は、そのリンカーと抗ＨＥＲ２ Ｆａｂへの抗ＣＤ４７ Ｆａｂの近接性の両方によって完全に閉塞される（図１８Ｂ）。モデルは、障害が観測されることなく上部Ｆａｂを介してＨＥＲ２と結合できるが、リンカーが分解されるまでは下部Ｆａｂを介してＣＤ４７と結合することを阻害するＦａｂ２モジュールと一致している（図１６Ａ、図１６Ｂ）。
Ｆａｂ２モジュールが溶液中でどのように動くかについてさらに洞察を得るために、本発明者らは、ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＬ２Ｌ２（Ｇ４ＳＧ４Ｓ（配列番号３２）アミノ酸配列、表１）を含む複数のリンカー組成物を使用して分子動力学シミュレーションを実施した。各残基のＲＭＳＤを、実行ごとに計算した。加えて、カスタム記述子ｄＳＡＳＡはＳＶＬ言語（ＭＯＥ）で記述されており、各残基及びいずれの場合もリンカー配列のみの凝集体の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）の変化を計算した。そのため、構造的変化の観点から見て異なる未切断リンカーがどう作用するか、及び、配列特異的切断潜在力（図１８）に影響を与えることが予想されるリンカーの溶媒接触性に対する関連影響の比較の基礎を提供する。
図１９Ａ～図１９Ｉは、試験した３つのリンカーに関して取得された対応する溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）結果の９つのグラフを示す。最初の分析では、ＬＨＬ及びＬＨＬＦリンカーのそれぞれに対しては９回、及びＬ２を用いて１０回、動力学法を（６ナノ秒間）実行した場合の絶対ＳＡＳＡ値をサンプリングした（それぞれ、図１９Ａ、図１９Ｄ及び図１９Ｇ）。このデータは、Ｌ２リンカーが経時的な構造的不均一性に対する最大の傾向を有することを明確に示した（図８Ｇ）。開始時のＳＡＳＡ値は、各実行で同じでなかったため、二次分析では、開始時のＳＡＳＡ値から全てのＳＡＳＡ値を減算することによって計算した開始時のＳＡＳＡ値との差を表す結果を正規化した。６ナノ秒の動力学法実行時間（それぞれ、図１９Ｂ、図１９Ｅ及び図１９Ｈ）及び６ナノ秒の動力学法実行のうち最初の２．５ナノ秒（それぞれ、図１９Ｃ、図１９Ｆ及び図１９Ｉ）にわたる結果は、ＬＨＬとＬＨＬＦリンカーは、Ｌ２リンカーよりも構造的動特性が明らかに少ないことを示した。特に、６ナノ秒の分子動力学法の実行は、Ｌ２が最も可動性があることを示すので、異なるリンカー配列は、異なる可動性、ゆえに、Ｆａｂ２モジュールの下部Ｆａｂに対するＣＤＲ溶媒曝露プロファイルを向上させることになるといった構想が強調される。
切断されるリンカーと切断されないリンカーとの比較は、切断されないリンカーに比べて切断されるリンカーの可動性が劇的に増大したことを示し、図１４～１７の生物学的観察結果と一致する。例えば、図２０Ａは、１００ナノ秒の動力学法実行中の、両方のリンカーがインタクトである場合のＦａｂ２モジュールの制限された動きと、それに続く、ＬＨＬリンカー（二次リンカーインタクト）の単一の切断といった状況での上部Ｆａｂドメインの劇的な動きを示している。この分析は、上部Ｆａｂドメインが、大幅に増加した自由度を得、その結果、下部Ｆａｂドメインから完全に離れ、例えばＣＤ４７との自由な相互作用を可能にするそのＣＤＲを完全に曝露するように動くことが可能な複合的配置となったことを示した（図２０Ｂ）。
忍容性及び薬物動態のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ分析
下部ＦａｂドメインのようなＣＤ４７との関係におけるＩｇＧ２及びＦａｂ２の忍容性及び薬物動態を調べるために、複数の例示的分子（Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ）について、６～８週齢のオスＢ６．Ｃｇ－Ｆｃｇｒｔｔｍ１ＤｃｒＴｇ（ＦＣＧＲＴ）３２ＤｃｒＪマウスで研究した。これらの「Ｔｇ３２」マウスは、ヒトＦｃＲｎホモ接合体遺伝子導入動物であり、ヒト及び霊長類のそれを模倣したヒトＩｇＧの薬物動態学的特性を有する。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１に、及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの下部Ｆａｂドメインに含まれるＣＤ４７結合ドメインは、全て、組換えマウスＣＤ４７タンパク質に結合する能力があることが確認されているため、赤血球のマウス膜提示ＣＤ４７に対するそれらの反応性をフローサイトメトリーによって最初に試験した（図２１）。この研究は、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１は０．１μｇ／ｍｌのマウス赤血球ではシグナルを示さないが、１μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌの両方では明確な濃度依存性結合シグナルを示すことを証明した（図２１）。重要なことに、マウス赤血球への結合は、１μｇ／ｍｌでほぼ飽和し（６３％の結合、図２１）、かつ１０μｇ／ｍｌで完全に飽和した（９８％結合、図２１）。対照的に、タンパク質ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、またはＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬのいずれも、どの濃度でも結合を示さず、下部Ｆａｂドメインの抗ＣＤ４７可変ドメインは、マウス赤血球上のＣＤ４７と相互作用する能力がないことを示した（図２１）。
Ｔｇ３２マウスから分離した赤血球を使用して、赤血球凝集アッセイも実施した。この分析は、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１のみがマウス赤血球の濃度依存性凝集を促進する能力があり（３．１２μｇ／ｍｌ超えで）、その一方で、タンパク質ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、またはＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬのいずれも、２００μｇ／ｍｌまでのいずれの濃度でも凝集を示さないことを実証した（図２２）。これらの所見により、前述で概略を述べたヒトＣＤ４７タンパク質及び赤血球結合（すなわち、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１によるヒトＣＤ４７への完全な結合、ただしＩｇＧ２またはＦａｂ２タンパク質では測定可能な結合がない）のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査はマウス系で再現されることが実証され、マウスが薬物動態と忍容性の両方に関するＣＤ４７結合の影響を研究するために実行可能なモデルとなった。
ｉｎ ｖｉｖｏ忍容性研究では、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、それぞれ、Ｔｇ３２マウスに２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの濃度で１回（静脈内）投与した。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧの２ｍｇ／ｋｇ用量は忍容性があるが、１０ｍｇ／ｋｇ用量は忍容性が低く、０日目に明白な毒性を引き起こし、この投与コホートでの研究を終了させた。対照的に、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの２ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量は、６０日間にわたる体重観察で全て忍容性が良好であった（図２３）。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧの２ｍｇ／ｋｇ用量は、全体にわたって忍容性があるが、投与後５日目で、このグループでは網状赤血球が著しくアップレギュレーションを起こすことが観察された（図２４）。対照的に、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦまたはＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ用量は、５日目またはそれ以降の網状赤血球アップレギュレーションとの関連はなかった（図２４、図２５）。網状赤血球アップレギュレーションは、急速な赤血球クリアランスに対する既知の反応であり、これは、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１抗体のＩＶ投与は、高ＣＤ４７赤血球のクリアランスの加速につながることを示唆している。
投与したタンパク質のより広範な影響をサンプリングするために、投与後５、２９及び６０日目に全ての血液学的パネルを検査した（図２５Ａ～図２５Ｋ）。これらの分析は、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１の網状赤血球アップレギュレーション効果が一過性のものであり、２９日目までにベースラインに戻ることを示した（図２５Ａ）。Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬでは、５、２９または６０日目における、赤血球（ＲＢＣ）数、ヘモグロビン、赤血球中の平均ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、白血球、単球、リンパ球、好塩基球、好酸球または好中球水準に関して著しい影響は観察されなかった（図２５Ｂ～図２５Ｋ）。
ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態研究では、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬを、それぞれ、Ｔｇ３２マウスに２または１０ｍｇ／ｋｇの濃度で１回（静脈内）投与し、かつＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１を、先の忍容性があった２ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した。出血スケジュール：３０分、４時間、１、３、５、７、１０、１４、２１、２８及び４２日目、に従って、各マウスから血液試料を採取した。血清抗体濃度の分析は、２ｍｇ／ｋｇのＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１は、血液循環から非常に急速に除去され、５日以内に０．５μｇ／ｍｌを下回る平均濃度に到達することを示した（図２６）。この急速な薬物クリアランス（組織媒介薬物動態またはＴＭＤＤとして知られている）は、先の観察されたマウス赤血球への強い結合に起因する可能性があり、これにより、食作用により系から急速に除去される。この所見はさらに、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１の投与では、２９日目までに網状赤血球レベルが標準に戻り（図２５Ａ）、これは分子が１０日目には本質的に排除される（図２６）ためであったことをさらに説明するものであった。
対照的に、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの全ては、２ｍｇ／ｋｇ用量と１０ｍｇ／ｋｇ用量の両方でクリアランスが遅いことを示した（図２６）。重要なことに、各タンパク質の２ｍｇ／ｋｇ用量は、１．０μｇ／ｍｌを下回る濃度に到達するまでに２５日超かかり（図２７Ａ）、かつ各タンパク質の１０ｍｇ／ｋｇ用量は、４２日目で１．０μｇ／ｍｌを上回る濃度を維持した（図２７Ｂ）。忍容性研究の０日目に、１０ｍｇ／ｋｇのＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１を投与したマウスから採取した単一の試料もまた分析し、達成した最大血清ＩｇＧ濃度（ただし忍容性がない）は、完全に忍容性があったＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質で達成した濃度と類似していることを示した（５０μｇ／ｍｌ超）。
２ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの全ては、（免疫グロブリンのＩＶ投与が血流から組織に素早く分布するときの）標準的な「アルファ」相、続いて抗体が血清中を循環する長い「ベータ」相を示した（図２６、２７Ａ）。これらのタンパク質はまた、１０ｍｇ／ｋｇで標準的な分布プロファイルを呈したが血液循環はより長いものであった（図２６、２７Ｂ）。重要なことに、各タンパク質のベータ相は、両方の濃度で直線的かつ並行する曲線を描き、これらのタンパク質のＣＤ４７ドメインは、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１で観察されたＴＭＤＤに至らないことを示唆している（図２６）。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦまたはＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬタンパク質が周辺部で活性化されていれば、ＴＭＤＤは強く現れたことが予想され、これは活性化により、高親和性赤血球、内皮及び血小板結合がもたらされ、結果としてＡ－Ｄ５ ＩｇＧ１で見られたようなベータ相が鋭い下向きの軌跡に変わるクリアランスとなることによる（図２６）。これらの観測結果は、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの投与では、網状赤血球増幅がないことと合わせて、周辺活性化レベルが低いことを示唆している。これは、これらの分子の薬物動態が長いにもかかわらず、それらが２５日を超える血液循環でＦｃＲｎリサイクルを複数回経たことを意味している。
ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬに関して前述で概略を述べた薬物動態及び忍容性の所見は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを介した標準的なＦｃＲｎ媒介抗体様半減期の延長を示した。この効果により、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１と比べて、これらの３つのタンパク質の曲線下面積（ＡＵＣ）値が有意に増加した（図２８）。２ｍｇ／ｋｇでは、ＡＵＣは、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬは、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１より２５～４０倍増加した。１０ｍｇ／ｋｇでは、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１では安全に到達可能な用量ではなかったが、ＡＵＣは、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＦａｂ２ Ｍｅｔ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬは、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１よりも約１００～２５０倍増加した（図２８）。ＩｇＧ２及びＦａｂ２構造体内でのＣＤ４７結合ドメインの使用は、最初の投与から高濃度で使用することができ、腫瘍組織に向かう分布を最大化することをそれらが示唆しているように、これらのＡＵＣの向上は、非常に有意なことである。
サルとヒトの赤血球への結合のフローサイトメトリー分析
赤血球を３つのｃｙｎｏ ＮＨＰ（サル）及び３人のヒトドナーから分離し、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１、トラスツズマブ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦまたはＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬで染色した。分析の両方のセットは、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１だけが、ｃｙｎｏ（図２９Ａ）またはヒト（図２９Ｂ）赤血球いずれかへの濃度依存性結合を示すことを証明した。これらの所見により、ＩｇＧ２（したがってＦａｂ２）構造体内のＣＤ４７結合ドメインは、マウス、サル及びヒトＣＤ４７との結合を制限されているといった上記の観察結果が確認された。
ｐＨ６．０及び７．４でのＭＭＰ及びカテプシンによる活性化
ＭＭＰ及びカテプシンは、前述で概略を述べたＬＨＬまたはＬＨＬＦリンカーのいずれかに見られるペプチド配列を酵素的に切断する可能性があることを既に示した。ただし、重要なことに、酵素のこれらのクラスの両方は、それらの酵素活性を上げたり下げたりするｐＨ条件の変化に対して感受性を示す場合がある。固形腫瘍のｐＨは、ヒトにおける標準的な生理学的ｐＨであるｐＨ７．４から逸脱することが頻繁に観察されるので、このことは非常に重要である場合がある。特に、固形腫瘍（及び非常に炎症を起こしている組織）は、ｐＨ６．０程度の低い酸性ｐＨ状態に発展することがある。
複数のＭＭＰ酵素はｐＨ７．４での下部Ｆａｂ結合を活性化する能力を有していることが上記のように証明されたので、本発明者らは、複数のＭＭＰ及びカテプシン酵素（これらは全て、固形腫瘍における活性上昇に関連する）の活性をｐＨ６．０と７．４の両方で検査した。ＭＭＰ３（図３０Ａ、Ｂ）、ＭＭＰ７（図３０Ｃ、Ｄ）、ＭＭＰ８（図３０Ｅ、Ｆ）、ＭＭＰ１０（図３０Ｇ、Ｈ）、ＭＭＰ１２（図３０Ｉ、Ｊ）、ＭＭＰ１３（図３０Ｋ、Ｌ）及びＭＭＰ１４（図３０Ｍ、Ｎ）に対するＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、またはＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの活性化を検査した。次に、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦのＭＭＰ処理済み試料を、ヒトＨｅｒ２とヒトＣＤ４７の両方への直接結合に供した。これらの分析は、ｐＨ７．４とｐＨ６．０の両方で、両方のタンパク質がＭＭＰ８、１０及び１２によるＣＤ４７結合の測定可能な活性化を示すことを実証した。対照的に、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦだけが、ｐＨ７．４とｐＨ６．０の両方でＭＭＰ１３によって活性化され（図３０Ｋ、Ｌ）、かつｐＨ６．０でＭＭＰ７によって活性化された（図３０Ｄ）。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦはまた、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬよりも、大部分の時点で、試験したＭＭＰの大部分による比較的高いレベルの活性化を示した（図３０Ａ～Ｎ）。これらの所見により、ＬＨＬＦリンカーを含めることは、ｐＨ６．０及び／またはｐＨ７．４の両方で、より広範のＭＭＰ酵素による下部Ｆａｂの結合のより急速な活性化をもたらすことが確認された。
カテプシンもまた潜在的な活性化酵素として検査した。これらの酵素では、ｐＨと活性との間の明確な関係が観察された。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図３１Ａ）またはＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ（図３１Ｂ）の活性化は両方とも、ｐＨ７．４とｐＨ６．０の両方で、カテプシンＳのみがＣＤ４７結合を活性化する能力があることを示した。対照的に、カテプシンＡ、Ｃ、Ｇ、Ｋ及びＬによる処理では、２４時間後であっても、ｐＨ７．４でのＣＤ４７結合の活性化はわずかであるか、またはまったく見られなかったが、ｐＨ６．０では、強い活性化シグナルが急速に発生した（図３１Ａ、３１Ｂ）。これらの所見は、ＬＨＬ及びＬＨＬＦリンカーは、ＭＭＰによるより急速な活性化を介して、かつ一連のカテプシンによるｐＨ選択的活性化によって、ｐＨ７．４でのものと比較して、酸性化組織における活性化の加速を可能にする可能性があることを示唆している。これにより、下部Ｆａｂ結合の活性化をｐＨ７．４（活性細胞外ＭＭＰ及びカテプシンレベルが低い、非患部組織のｐＨ）では最小化し、かつｐＨ６．０（ＭＭＰ及びカテプシンレベルが高く、カテプシン活性が増強している、患部組織のｐＨ）では最大化することによってＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質の治療指数をさらに向上させることができる。
Ｈｅｒ２／ＣＤ４７＋細胞への下部Ｆａｂ結合の活性化
細胞表面で異なるレベルのＣＤ４７及びＨｅｒ２を発現する細胞に対するＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの結合特性を調べるために、フローサイトメトリーを実施した。トラスツズマブ、抗ＣＤ４７及びアイソタイプ対照ＩｇＧによる染色は、ＢＴ４７４細胞が高レベルのＨｅｒ２及びより低いレベルのＣＤ４７を発現し（図３２Ａ、Ｂ）、その一方で、ＭＣＦ７細胞はより高いレベルのＣＤ４７及び低レベルのＨｅｒ２を発現する（図３２Ｃ、Ｄ）ことを実証した。０、２、８及び２４時間のＭＭＰ１２による活性化後のＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ（図３２Ａ、Ｃ）及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図３２Ｂ、Ｄ）による両方の細胞タイプの染色も実施した。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦとＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの両方は、０、２及び８時間の時点で、ＢＴ４７４細胞でのトラスツズマブと類似の結合プロファイルを示したが、２４時間後の結合はわずかに減少する（図３２Ａ、Ｂ）。対照的に、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの両方は、０時間の活性化では、ＭＣＦ７細胞でのトラスツズマブと類似の低レベル結合プロファイルを示したが、２、８及び２４時間の時点の活性化では、結合が大幅により高く、抗ＣＤ４７対照を模していた（図３２Ｃ、Ｄ）。これらの所見により、Ｈｅｒ２のトラスツズマブのような結合が活性後も維持され、かつＣＤ４７結合プロファイルが活性化後のみ高度に活性化し始めるような、図２Ｂに提示した活性化モデルは有効であることが実験的に確認された。重要なことに、これらの所見はまた、ＩｇＧ２（及びＦａｂ２）タンパク質は、低レベルの上部Ｆａｂ標的（例えば、Ｈｅｒ２）を発現している細胞に対して、下部Ｆａｂ結合ドメイン（例えば、ＣＤ４７）の機能を促進する有益な能力を有する可能性があることを示唆している。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び質量分析によるＭＭＰ１２活性化の分析
ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ及びＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬタンパク質を、０、２、８及び２４時間にわたって、上記のようにＭＭＰ１２で処理した。次に、これらのタンパク質試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図３３）。この分析により、活性化ＥＬＩＳＡ（図１５～１７、３０）とフローサイトメトリー（図３２）の観察結果が明らかに相関するといった所見を得た。つまり０時間で、２つのインタクト鎖、７５ｋＤａマーカーの重鎖及び５０ｋＤａのすぐ下（５０ｋＤａより下）のマーカーの軽鎖が観察された。２時間の時点で、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦとＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの両方で、新たに約２５ｋＤａの生成物、さらに、２５ｋＤａをわずかに上回る、及び約５０ｋＤａの（インタクト軽鎖の上）かすかなバンドが観察された。これらの新しい断片の分子量は、上部Ｆａｂ Ｆｄまたは軽鎖断片（１Ｖドメイン＋１Ｃドメイン＝約２５ｋＤａ）、Ｆｃ（２×Ｃドメイン＋１ｎリンクグリコシル化＝２８～３０ｋＤａ）、及びインタクトＦｄ－ヒンジ－Ｆｃ（標準のＩｇＧ１重鎖＝５０ｋＤａ）に、それぞれ対応する。８時間及び２４時間の時点で、インタクト鎖の段階的な減少、及びインタクト鎖よりおよそ２５ｋＤａ小さい断片の増加が観察された。特に、８時間の時点で、インタクト重鎖（７５ｋＤａ）とインタクト軽鎖（５０ｋＤａより下）の両方の著しい量を残しながら（ただし、０時間の試料と比べて減少した）、２５ｋＤａの（上部Ｆａｂ鎖）生成物は量が圧倒的に多くなった。したがって、このＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析（図３３）は、上部Ｆａｂと下部Ｆａｂの間の両方のリンカーは、ＬＨＬまたはＬＨＬＦ配列に関係なく、ＭＭＰ１２酵素によって活性的に切断されることを示した。
Ｆａｂ２構造体において、ＭＭＰ１２酵素がＩｇＧ２分子を活性化する場所を正確に調べるために、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの０、２、８及び２４時間の試料を用いて質量分析を実行した。ペプチド試料を、トリプシンとＧｌｕ－Ｃの組み合わせを使用して、還元、アルキル化及びタンパク質分解消化によって作成した。これらの試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。ＭＭＰによる切断の効率を、インタクトＭＭＰ切断部位（ＳＣＧＰＡＰＥ（配列番号１１０））に由来するペプチドのＭＳ応答と、切断されたタンパク質（ＳＣＧＰＡＰ（配列番号１１１））に由来するものとを比較することによって割り出した。この分析により、切断されていない（ＳＣＧＰＡＰＥ（配列番号１１０））リンカーと切断された（ＳＣＧＰＡＰ（配列番号１１１））リンカーの両方にマップされているペプチドを識別することに成功し、ＬＨＬリンカーでは、ＭＭＰ１２が第２プロリン（Ｐ）とグルタミン酸（Ｅ）の間を切断することが証明された。切断されていない（ＳＣＧＰＡＰＥ（配列番号１１０））ペプチドの相対シグナルは、０から８、８から２４時間と段階的に減少し（図３４Ａ）、その一方で、切断された（ＳＣＧＰＡＰ（配列番号１１１））ペプチドのシグナルは、段階的に増加した（図３４Ｂ）。
ヒンジ安定化型「ＩｇＧ１－ＤＡＡ」形態のＩｇＧ２の生成及び分析
米国特許第８８７１２０４Ｂ２号は、ＭＭＰ酵素の存在下で下部ヒンジ及びＦｃ安定性を維持するプロテアーゼ耐性ＩｇＧ１抗体バリアントを教示している。これらの変異型ＩｇＧ１抗体では、ヒンジのＥ２３３－Ｌ２３４－Ｌ２３５－Ｇ２３６（配列番号１１２）の配列がＰ２３３－Ｖ２３４－Ａ２３５によって（Ｇ２３６が削除されて）置き換えられ；ＣＨ２ドメインが、Ｓ２３９Ｄ／１３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／１３３２Ｅ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／１３３２Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／１３３２Ｅ、Ｋ３２６Ａ／１３３２Ｅ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２６７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ及びＧ２３７Ｘ／Ｓ２３９Ｄ／１３３２Ｅ（Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｐ、ＱまたはＳである）から選択される少なくとも１つの置換を含み；アミノ酸残基は、ＥＵナンバリングに従って番号を付けられる。
プロテアーゼ安定型ＩｇＧ１ Ｆｃなどに関連するＦａｂ２構造体の使用を調べるために、２つの例示的構築物を生成した（表１９）。これらの２つの構築物（Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡ及びＨｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡ）は、「２ｈＤＡＡ」構造体をベースにしたＩｇＧ２にＨｅｒ４７ Ｆａｂ２構造体を配置したものである（ＩｇＧ１は、Ｐ２３３－Ｖ２３４－Ａ２３５－ΔＧ２３６及びＳ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ変異を含む）。両方の構築物は一過性ＣＨＯ細胞トランスフェクションで容易に発現し、タンパク質Ａ精製タンパク質は予想された分子量の８０％を超える生成物を示した。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡの分析的ＳＥＣデータの例は、１０．３０ｍｌで８０％の生成物を示した（図３５）。非還元タンパク質Ａ精製タンパク質及びＳＥＣピーク８．４７、９．０３及び１０．３０ｍｌのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は（図３６）、ピーク８．４７及び９．０３は、高分子量凝集体を含み、その一方で、ピーク１０．３０は、予想されたサイズの生成物（約２５０ｋＤａ）を含むことを示した。還元タンパク質Ａ精製タンパク質及びＳＥＣピーク８．４７、９．０３及び１０．３０ｍｌのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は（図３７）、全てのピーク８．４７、９．０３及び１０．３０ｍｌは予想されたサイズの重鎖及び軽鎖生成物（それぞれ、約８０及び５０ｋＤａ）を含むことを示した。Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ ＩｇＧ１－２ｈＤＡＡのインタクトモノマー（２５０ｋＤａ）生成物をＳＥＣによって精製し、２、４、８及び２４時間の経時的なインキュベーションでヒトＭＭＰ１２を使用したｐＨ７．４での酵素消化に供し、それとは別に、陰性対照として酵素が存在しない緩衝液中で２４時間のインキュベーション（０、２、４、８、２４時間のインキュベーション）も行った。ＥＬＩＳＡ分析では、全ての試料は、ヒトＨｅｒ２に対する強い結合シグナルを示したが、対照タンパク質のマウスＥｐＣＡＭへの測定可能な結合はなかった（図３８Ａ）。ＣＤ４７結合ＥＬＩＳＡでは、ＭＭＰ１２酵素の存在下または不存在下にて３７℃での２、４、８及び２４時間のインキュベーション後、結合シグナルが増加したが、ＭＭＰ１２なしの０、２、４、８または２４時間では、バックグラウンドを超えるシグナルは観察されなかった（図３８Ｂ）。
０時間（未消化）ならびに２、８及び２４時間のＭＭＰ１２消化試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析により、精製タンパク質は、予想されたサイズの重鎖及び軽鎖を含むことが確認された。２、８及び２４時間のＭＭＰ１２消化で、２５ｋＤバンドが生成され（図３８Ｃ）、リンカーペプチド切断を示したが、重鎖における損傷は、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬまたはＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦと比べて明らかに少ないことが確認され（図３３）、これは、「２ｈＤＡＡ」変異は、Ｆｃ領域を確かに安定させＭＭＰ１２消化に抵抗することを示した。
代替的な酵素活性化によるＩｇＧ２の生成及び分析
ＬＨＬ及びＬＨＬＦリンカーは複数のＭＭＰ及びカテプシン酵素によって切断されやすいことが上記で示されたので、６つのＦａｂ２構築物タイプをＩｇＧ２形式で検査した（表２０）。これらの構築物には、固形腫瘍及び非常に炎症を起こしている組織におけるアップレギュレーションを起こす活性と関連するいくつかのクラスの酵素、例えば、エンテロキナーゼ（ＥＫ）、トロンビン（Ｔｈｒ）、ｔＰＡ、グランザイムＢ（ＧｒＢ）、ｕＰＡ及びＡＤＡＭＴＳ－５（Ａ５）によって切断されやすい設計である一連のリンカー設計（表２１）を使用した。６つの構築物の全ては、ＣＨＯ細胞によって容易に発現し、ＰｒｏＡクロマトグラフィーによって精製した。
クローンＨｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＥＫ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｔｈｒ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｔＰＡ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｕＰＡ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＧｒＢ及びＨｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ａ５からの精製したタンパク質の全てをヒトＨｅｒ２及びＣＤ４７標的に対して滴定ＥＬＩＳＡにて試験した（図３９Ａ、３９Ｃ、３９Ｅ、３９Ｇ、３９Ｉ、３９Ｋ）。全ての場合において、これらのタンパク質は、試験した全ての濃度で、ＣＤ４７に関しては低／バックグラウンド結合を示した（白色の棒）が、Ｈｅｒ２に対しては濃度依存性結合（灰色の棒）を示した。次に、各タンパク質を、ＭＭＰ１２による経時的な酵素消化に供し、Ｈｅｒ２及びＣＤ４７標的に対する結合のＥＬＩＳＡを行った（図３９Ｂ、３９Ｄ、３９Ｆ、３９Ｈ、３９Ｊ、３９Ｌ）。これらの所見は、全てのタンパク質が経時的な酵素活性化にわたってＨｅｒ２結合を維持し、かつＣＤ４７結合の活性化の増加を示すことを証明した。クローンＨｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＥＫ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｔｈｒ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｔＰＡ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ｕＰＡ、Ｈｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＧｒＢ及びＨｅｒ４７－ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ａ５の機能的活性により、Ｆａｂ２構造体に多種多様のプロテアーゼ認識部位を伴うリンカーペプチド配列を利用して特定の用途に合わせて活性化を調整できることが実証された。例えば、この場合、ＬＨＬリンカーでのＭＭＰ活性化潜在力の保持は、付随するリンカーにおける６つの異なる疾患関連酵素切断モチーフのいずれかと組み合わせて、ＭＭＰ及び／またはカテプシン酵素が活性化している環境に合わせて調整することができ、その結果、エンテロキナーゼ、トロンビン、ｔＰＡ、グランザイムＢ、ｕＰＡ、ＡＤＡＭＴＳ－５または他のプロテアーゼ酵素が疾患状態に関係する場合に活性化潜在力が増大される。
ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ反復投与忍容性
ｉｎ ｖｉｖｏ反復投与忍容性研究では、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、それぞれ、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに４回投与（静脈内）した。ＩｇＧ２タンパク質を、０日目に１４ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に７ｍｇ／ｋｇ投与した。Ｆａｂ２タンパク質を、０日目に８ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に４ｍｇ／ｋｇ投与した。全てのタンパク質は完全に忍容性があり、いずれの個体動物に対しても毒性の臨床的徴候はなく、体重の減少もなかった（図４０）。これらの所見は、前述で概略を述べたＴｇ３２マウスにおける単回投与でのＨｅｒ４７ Ｆａｂ２ベース分子に対する忍容性の所見を確証かつ詳説するものであった。Ｔｇ３２マウス研究では、Ａ－Ｄ５ ＣＤ４７ ＩｇＧの単回投与であっても、１０ｍｇ／ｋｇでは忍容性がなかった。このＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス研究では、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの４つの全ての用量は完全に忍容性があった。この所見により、Ｈｅｒ４７分子のＣＤ４７結合ドメインは、反復投与後であっても血液循環中に活性化しないことが確認された。一方で、著しい活性化があれば、Ａ－Ｄ５ ＩｇＧ１で観察されたＣＤ４７促進毒性シグナルが誘発されたであろう。
追加の２本鎖Ｈｅｒ２ＣＤ３ Ｆａｂ２「ワンアーム」構築物の生成及び分析
さらに、Ｈｅｒ２ＣＤ３構築物を生成し、生成物の均一性及び活性を改善する能力について新規の配列を検討した（表２２）。全てのＨｅｒ２ＣＤ３構築物をＣＨＯ細胞によって発現させ、ＰｒｏＡによって上澄液から精製し、ＳＥＣによって分析した。これらの分析は、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＳとＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓの両方（図４１Ａ、図４１Ｂ）は、高分子量及び低分子量生成物の比率が高いことを示したＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬとＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの両方（図４１Ｃ、図４１Ｄ）よりも主生成物の均一性が高いことを示すことを証明した。これらの所見は、鎖が［ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ－Ｆｃ］及び［ＶＨ－ＣＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＬ－Ｆｃ］となるように、構築物Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－ＳとＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓの上部Ｆａｂの配位を入れ替えたことによって、均一性が改善されたことを示唆している。これは、２つの鎖の両方が、［ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＬ－Ｆｃ］及び［ＶＨ－ＣＨ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ－Ｆｃ］であるＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬＦと対照的である。
次に、対照タンパク質Ｆａｂ２ ｍＥｐＣａｍ３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ及びＦａｂ２ ｍＥｐＣａｍ３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓ（上部Ｆａｂが抗マウスＥｐＣＡＭ抗体Ｇ８．８のＶドメインを含む）も、設計し、発現させた（表２２）。クローンＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ、Ｆａｂ２ ｍＥｐＣａｍ３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ及びＦａｂ２ ｍＥｐＣａｍ３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓの目的のＭＷ生成物を分取ＳＥＣによって分離し、ヒトＨｅｒ２＋標的細胞としてＭＣＦ－７またはＢＴ－４７４を使用して、Ｐｒｏｍｅｇａのジャーカット細胞ベースＣＤ３ライゲーションレポーター細胞バイオアッセイで（製造者の指示に従って）分析した。標的細胞として（Ｈｅｒ２発現が非常に少ない）ＭＣＦ－７を使用した一次分析は、陽性対照Ｈｅｒ２－ＣＤ３ ＢＩＴＥタンパク質とＯＫＴ３ ＩｇＧ１の両方は、強い陽性濃度依存性ＣＤ３活性化シグナルを発生することを示した。２時間ＭＭＰ１２で処理したクローンＦａｂ２ ｍＥｐＣａｍ３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ及びＦａｂ２ ｍＥｐＣａｍ３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓでは、いずれの濃度においてもシグナルが発生しなかった（図４２Ａ、Ｂ）。対照的に、クローンＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ（図４２Ａ）とＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓ（図４２Ｂ）の両方は、０時間では測定可能なシグナルはなかったが、Ｈｅｒ２－ＣＤ３ ＢＩＴＥと類似する濃度範囲で、２、８及び２４時間で徐々にシグナルが増加し、かつどちらの場合も陽性対照で到達したものよりもより高い最大シグナルを示した。
標的細胞としてＨｅｒ２高発現ＢＴ－４７４細胞を使用した二次アッセイでは、上記の試験試料及び対照の全てを０．１μｇ／ｍｌで評価した（図４３Ａ～Ｃ）。陽性対照タンパク質Ｈｅｒ２－ＣＤ３ ＢＩＴＥとＯＫＴ３ ＩｇＧ１の両方は、強いＣＤ３活性化シグナル伝達を誘導したが、その一方で、陰性対照Ｆａｂ２ ｍＥｐＣａｍ３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ及びトラスツズマブではシグナル伝達がなかった。クローンＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬＦ－ＬＨＬ－Ｓ（図４３Ｂ）とＦａｂ２ Ｈｅｒ２３ ＬＨＬ－ＬＨＬ－Ｓ（図４３Ｃ）の両方は、０時間では、測定可能なシグナルを示さなかったが、２時間で徐々にシグナルが増加し、８時間で最大となった。重要なことに、２４時間では、８時間と比べるとシグナルが著しく減少した。この所見は、両方のリンカーを切断する可能性がある段階的な酵素活性は（図３３）、最終的には上部Ｆａｂと下部Ｆａｂとの分離をもたらす可能性があることを示唆している。これは、そのような分子が高度なタンパク質分解腫瘍環境では優先的に活性化するが、そこで徐々に非活性化となり、活性形態で漏れ出て健康な組織に入り込む分子のリスクを最小限に抑えることが理想的であるので、ＣＤ３標的分子にとって有益な特性となり得る。
Ｈｅｒ２－ＣＤ４７ ＩｇＧ２及びＦａｂ２タンパク質の分子安定性のｉｎ ｖｉｔｒｏ測定
歴史的に、遺伝子操作された抗体形式は、しばしば、構造的不均一性に直面し、製造上の問題を引き起こしてきた。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬタンパク質の安定性を調べるために、一連のｉｎ ｖｉｔｒｏ測定を実行した。
強制酸化－トリプトファン及びメチオニンなどの露出したアミノ酸残基の酸化は、ｍＡｂの一般的な分解経路であり、それらの生物活性に影響を与える。この研究では、ＰＢＳ中の０．５％Ｈ２Ｏ２による２時間、室温での強制酸化を、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬタンパク質に対して行った。酸化は、酸化型形態の極性が高まることによって、または構造的変化を介して、抗体の全体的な疎水性を変化させる場合があるので、強制酸化によって起こる潜在的な変化を逆相（ＲＰ）及びサイズ排除（ＳＥＣ）クロマトグラフィーによって分析した。ＳＥＣ分析により、どちらの試験試料も単量体種の比率は変化しないことが明らかとなった（ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬとＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの両方は、酸化前及び酸化後、それぞれ、９９．５及び９７．４％の単量体種を示した）。インタクト抗体のＲＰ分析では、０．５％Ｈ２Ｏ２による強制酸化後のインタクト（非還元）抗体の場合、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの保持時間は０．５分、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの保持時間は０．４分短くなったことが観察された。サブユニットのＲＰ分析では、強制酸化後のＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬでは、重鎖の保持時間は０．５分短くなり、軽鎖の保持時間のシフトはなかったことが観察された。還元Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬは、ＲＰ分析で異なるプロファイルを示し、軽鎖、重鎖及び幹の切断型ヒンジＦｃを表す３つのピークが観察された。酸化後、重鎖及び幹の切断型ヒンジＦｃでは０．４～０．５分のシフトが観察されたが、軽鎖では観察されなかった。保持時間のシフトは、Ｈ２Ｏ２処理後、還元ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬとＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ試料の両方で観察され、これは、露出したアミノ酸の微量な酸化（タンパク質のＦｃ領域に限定された）を示唆している。
チャージバリアント分析－チャージ不均一性分析は、生成物の質及び安定性についての重要な情報が得られるので、モノクローナル抗体の特徴づけに重要である。不均一性は、酵素の翻訳後修飾（グリコシル化、リシン切断）または精製及び保管中の化学修飾（酸化またはアミド分解）によって起こることがある。提供される試験品のチャージバリアントプロファイリングを市販のチャージバリアントアッセイによって実施した。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４４Ａ）とＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４４Ｂ）の両方のチャージバリアントプロファイルは、１つの主要なアイソフォーム（全体の５０～５７％）、メジャーな酸性アイソフォーム（全体の４０～４８％）及び１つのマイナーな塩基性アイソフォーム（およそ３％）を含む均一性プロファイルを示した。
ＨＩＣでの保持－全体的な疎水性は、バイオプロセス中の凝集及び粘度の重大なリスク要因となることがあるタンパク質の自己会合の傾向の指標である。タンパク質はその表面に、疎水性または非極性アミノ酸の側鎖の存在によって生成される疎水性「パッチ」を有する。それらの数、サイズ及び分布に応じて、生じる表面疎水性は、タンパク質ごとに固有の特性となる。ＨＩＣは、タンパク質とＨＩＣ樹脂の疎水性表面との間の可逆性の結合を利用してそれらの表面疎水性の差に基づいてタンパク質を分離する。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬは、それぞれ、５．４及び５．０分のＨＩＣカラム保持時間を示した。これらの値は、アダリムマブ（４．５分）、セツキシマブ（５．９分）、ブレンツキシマブ（６．３分）及びゴリムマブ（８．１分）などの臨床モノクローナル抗体で得られた値と比較して、疎水性のより低い範囲を示している。実際に、これらの値は、凝集傾向及び安定性が、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬとＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの両方のＨｅｒ２結合ドメインが誘導される抗Ｈｅｒ２トラスツズマブの値（５．４分保持）に類似することを示唆している。
凍結融解安定性分析－タンパク質の凝集または断片化の増加は生成物の質の低下のリスクとなるため、凍結融解手順中のタンパク質の不安定性は、製造及びバイオプロセスにおける障害の指標である。Ｆａｂ２構造体を含むタンパク質に対するこのリスクを評価するために、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬタンパク質を、５回の凍結融解に供し、それに続くＳＥＣ分析を各回後に行った。これらの分析は、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４５Ａ）またはＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４５Ｂ）タンパク質のいずれも、５回の凍結にわたって、単分散性の変化を示さないことを証明した（いずれの凝集または損傷生成物も観察されなかった）。
まとめると、これらの所見は、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬとＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬタンパク質の両方は、低凝集リスク、低疎水性、低チャージ不均一性及び酸化に対して低傾向を有することを示唆した。
ヒトＦｃ受容体に対するＩｇＧバリアントの親和性のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析
疾患細胞の受容体を標的とする抗体は、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰ活性を媒介する目的の場合Ｆｃγ受容体に結合する必要がある。これらの結合機能がＦａｂ２ベース構築物で維持されるかどうかを調べるために、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬタンパク質を、表面プラズモン共鳴分析を介して、全てのヒト及びマウスＦｃ受容体に対する結合親和性について検査した。これらの分析は、アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１とＩｇＧ４の両方が、ＦｃγＲＩＩＡ及びＦｃγＲＩＩＩＡの高親和性バリアントと低親和性バリアントの両方を含む全てのヒトＦｃγ受容体に対して（それぞれ）予想された強い結合親和性及び弱い結合親和性を示すことを実証した（表２３）。同様に、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ２及びＩｇＧ１は、マウスＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃγＲＩＶ受容体に対して（それぞれ）予想された強い結合親和性及び弱い結合親和性を示した。ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬの場合、試験したヒトＦｃ受容体及びマウスＦｃ受容体のそれぞれへの結合は、アイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１で観察されたものと非常に類似するものであった。これらのデータは、ＩｇＧ１ ＦｃをベースにしたＩｇＧ２とＦａｂ２タンパク質の両方は、ヒトとマウスの両方において、疾患細胞の表面での結合時にＦｃ受容体に結合する能力があることを示唆している。
さらなるタンパク質構築物の設計
さらなるタンパク質構築物を検討した（図４６）。構築物は以下のものを含んでよい。１．「上部Ｆａｂ」位置に定常ドメインのみ。これは、「下部Ｆａｂ」の活性は、その標的に結合することを阻止されるが、適切なタンパク質分解環境では活性化し始めることができることを意味している。２．「上部Ｆａｂ」のダミー「非結合」可変ドメイン。これらのダミー可変ドメインは、体内のいずれの既知の標的にも結合しないことが証明されるであろう。したがって、「下部Ｆａｂ」のみが潜在的な薬物標的結合能力を示し、かつリンカードメインのうち１つのタンパク質分解による活性化後のみに現れる。３．「上部Ｆａｂ」は４つの可変ドメインを含む「ダイアボディ」構造体によって置き換えられる。このダイアボディ構造体は、「ＤＡＲＴ」タンパク質で見られるようなジスルフィド結合を含んでいてもいなくてもよい。ダイアボディ構造体は、同じ標的もしくは２つの別々の標的の２つのコピーの結合を促進することができ、その結果、適切なタンパク質分解環境で活性化するまで「下部Ｆａｂ」の活性はその標的への結合を阻止される。本明細書において想定されるまたは上記にて示した構築物のうちいずれかでは、Ｆａｂ２構造体は、遊離しているか、別の機能化構造体、例えばＦｃ断片、アルブミン結合部分などの半減期を延長する小さなドメインもしくはペプチドに融合していてもよい。それらはまた、さらなる生物学的機能を媒介する小分子、ペプチドまたはその他のタンパク質に化学的に複合体化していてもよい。
高Ｈｅｒ２ ＢＴ－４７４細胞を使用したＨｅｒ２ＣＤ４７タンパク質の細胞増殖分析
ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７タンパク質の上部ＦａｂのＨｅｒ２結合ドメインは、この受容体のキナーゼ活性の阻害を媒介する能力があるので、細胞増殖分析を実施した。このアッセイでは、Ｈｅｒ２阻害に対する高感度応答が知られている細胞株である、ＢＴ－４７４細胞を使用した。トラスツズマブ、アイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４７Ａ）及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４７Ｂ）を、７２時間のインキュベーション期間にわたってＢＴ－４７４細胞に投与し、細胞増殖を測定した。データを、細胞増殖の阻害のパーセントとして示した（図４７）。これらの分析は、トラスツズマブがＢＴ－４７４細胞増殖の強い濃度依存性阻害を示すが、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４７Ａ）は、わずかに低い効力、かつＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４７Ｂ）もまた低い効力を示す（一価の結合能力を反映している）ことを示した。
腫瘍異種移植片含有ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＫＹＳＥ－４１０モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析
ｉｎ ｖｉｖｏ反復投与有効性研究では、トラスツズマブ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ（図３ＢのようなヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含むＦａｂ２構造体）を、それぞれ、Ｈｅｒ２発現食道癌細胞株ＫＹＳＥ－４１０の皮下接種によって生成された腫瘍を含有するＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに４回投与（静脈内で、０、５、１０、１５日目に）した。１２５ｍｍ２を超える腫瘍ができた後に、投与を開始した。ＩｇＧ２タンパク質を、０日目に１４ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に７ｍｇ／ｋｇ投与した。Ｆａｂ２タンパク質を、０日目に８ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に４ｍｇ／ｋｇ投与した。トラスツズマブを、０日目に８ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に４ｍｇ／ｋｇ投与した。腫瘍体積をキャリパー測定器によって測定した。
３回の投与後、１１日目に、トラスツズマブ（図４８Ａ）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ（図４８Ｂ）、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４８Ｃ）及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ（図４８Ｄ）の全てで、溶媒と比べて、有意な腫瘍増殖の低下を示した（２元配置ＡＮＯＶＡ：それぞれ、ｐ＝０．００５、０．００５、０．０１９及び０．００３）。対照的に、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ（図４８Ｅ）は、１１日目までに腫瘍増殖の有意な低下は見られなかった（２元配置ＡＮＯＶＡ：ｐ＝０．６６）。重要なことに、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの配列は、（上記にて示したように、ＬＨＬリンカーと比べて、プロテアーゼ感度を加速及び強化するＬＨＬＦリンカーの２つの点変異を除いて）同一であるが、効力の著しい差をもたらす（図４８Ｆ）。さらに、図４７のデータは、ワンアームＦａｂ２構造体では、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬとＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの両方で見られるのと同じＨｅｒ２－結合ＶＨ及びＶＬドメイン配列を含むトラスツズマブで観察されたものよりも細胞増殖のＨｅｒ２促進阻害が弱いといった結果となることを示している。結果は以下の通りである。１．トラスツズマブ（図４８Ａ）とＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ（図４８Ｄ）の両方で観察された１１日目のほぼ同等の効力は、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦでの高Ｈｅｒ２キナーゼ活性によっては促進できない。２．したがって、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦの高い効力は、ＫＹＳＥ－４１０腫瘍微小環境でのプロテアーゼ活性化によって促進される可能性が高く、ＣＤ４７阻害及び先天性免疫関与をもたらす。
したがって、前述で概略を述べた所見により、凝集体において、Ｆａｂ２構造体は、例示したようにＣＤ４７とＣＤ３結合ドメインの両方の作用により「下部Ｆａｂ」活性の効率的な消失を可能にすることが実証される。「上部Ｆａｂ」ドメインの結合能力は、完全に維持されるが、下部Ｆａｂドメインの有意な活性は、腫瘍及び線維性組織などの患部組織での高活性に関連するＭＭＰ及びカテプシンなどのプロテアーゼによる活性化後のみに観察される。Ｆａｂ２構造体におけるリンカー配列の調節により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＨｅｒ４７分子の能力測定によって例示したように、疾患微小環境で最大化し、かつ周辺シンク問題と毒性の両方を回避するように下部Ｆａｂ活性化を調整することが可能になる。
ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスにおけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態
ｉｎ ｖｉｖｏ反復投与ＰＫ研究では、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、それぞれ、ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに１回投与（静脈内）する。ＩｇＧ２タンパク質を１４ｍｇ／ｋｇ投与し、Ｆａｂ２タンパク質を８ｍｇ／ｋｇ投与する。血液試料を１５分、３０分、１時間、３時間、６時間及び２４時間で採取し、抗ヒトＩｇＧ１ ＥＬＩＳＡを使用して血清抗体レベルを測定する。
腫瘍異種移植片含有ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＳＫＯＶ－３、ＪＩＭＴ－１及びＮＵＧＣ－４モデル）におけるＨｅｒ４７分子のｉｎ ｖｉｖｏ有効性分析
ｉｎ ｖｉｖｏ反復投与有効性研究では、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ、ＩｇＧ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦ、Ｆａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬ及びＦａｂ２ Ｈｅｒ４７ ＬＨＬ－ＬＨＬＦを、それぞれ、細胞株ＳＫＯＶ－３、ＪＩＭＴ－１及びＮＵＧＣ－４の皮下接種によって生成された腫瘍を含有するＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスに４回投与（静脈内）する。ＩｇＧ２タンパク質を、０日目に１４ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に７ｍｇ／ｋｇ投与する。Ｆａｂ２タンパク質を、０日目に８ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に４ｍｇ／ｋｇ投与する。トラスツズマブを、０日目に８ｍｇ／ｋｇ、ならびに５、１０及び１５日目に４ｍｇ／ｋｇ投与する。腫瘍体積をキャリパー測定器によって測定する。
カニクイザルにおける忍容性及び薬物動態のｉｎ ｖｉｖｏ分析
下部ＦａｂドメインのようなＣＤ４７またはＣＤ３との関係におけるＩｇＧ２及び／またはＦａｂ２の忍容性及び薬物動態を調べるために、複数の例示的分子について、カニクイザルで研究する。例えば、ＩｇＧ２及び／またはＦａｂ２を、それぞれ、２ｍｇ／ｋｇ以上の濃度で、１回、２回または３回投与（静脈内）する場合がある。血液試料を、出血スケジュールに従って、各動物から採取する。ＰＫを計算し、ＴＭＤＤのリスクを評価するために血清抗体濃度の分析を行う。投与したタンパク質のより広範な影響をサンプリングするために、投与後一連の各日に全ての血液学的パネルも検査する。これらの分析では、網状赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、ヘモグロビン、赤血球中の平均ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、白血球、単球、リンパ球、好塩基球、好酸球及び／または好中球レベルを測定する。
標的相互関与のバイオセンサー測定
Ｈｅｒ２とＣＤ４７（またはＣＤ３）の両方へのＦａｂ２結合親和性の活性化の効果を調べるために、Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓの装置など、同じチップ表面上でＨｅｒ２とＣＤ４７（またはＣＤ３）の両方の結合をサンプリングすることができるバイオセンサーアッセイを行う。このアッセイでは、対照抗体及びＩｇＧ２またはＦａｂ２タンパク質（２、４、８または２４時間、ＭＭＰまたはカテプシン酵素によって消化されていない、または活性化された）を、精製したＨｅｒ２及びＣＤ４７（またはＣＤ３）外部ドメインタンパク質で別々に、または異なる密度で一緒に特異的に標識されたセンサーチップ表面に適用する。Ｈｅｒ２及びＣＤ４７（またはＣＤ３）に対する親和性を測定して、両方の標的に対する別々の、かつ同じ表面上の機能的親和性の多価相互作用の影響を確認する。
本発明について好ましいまたは例示的な実施形態に関して説明してきたが、当業者は、同じものに対する種々の変更及び変形が本発明の精神及び範囲から逸脱することなく実施され得、そのような変更は本明細書で明らかに企図されるものであることを理解するであろう。本明細書にて開示される及び添付の特許請求の範囲に記載される特定の実施形態に関する制限は意図されておらず、いかなる推論もされるべきではない。
本明細書にて開示される及び添付の特許請求の範囲に記載される特定の実施形態に関する制限は意図されておらず、いかなる推論もされるべきではない。本明細書で引用される全ての文書、または文書の部分は、限定はされないが、特許、特許出願、記事、書籍、及び論文を含み、任意の目的でそれらの全体が本明細書に明示的に参照として援用される。援用される文書または文書の一部の１つ以上が、ある用語を本出願におけるその用語の定義と矛盾して定義している場合、本出願で記載される定義が優先する。しかし、本明細書で引用されるいずれの言及、記事、出版物、特許、特許公報及び特許出願の記述も、それらが有効な先行技術を構築するか、または世界における任意の国での一般的知識の一部を形成するといった認識またはなんらかの提言ではなく、またはそう受け取られるべきではない。
番号を付した実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号を付した実施形態を記載する。
１． 第１部分及び第２部分、ならびに前記第１部分と前記第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質であって、
前記ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列、あるいはヒト免疫グロブリンヒンジ領域と比べると１～約７個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、
前記ペプチドリンカーは、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能であり、
前記第２部分は、前記患部組織に発現している分子に特異的に結合する能力があり、かつ
前記ペプチドリンカーが切断されない場合、前記第２部分の前記患部組織に発現している前記分子への前記結合は低減または阻害される、前記タンパク質。
２． 前記ペプチドリンカーは、約５～約１５アミノ酸の長さである、実施形態１に記載のタンパク質。
３． 前記ペプチドリンカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらで構成される、実施形態１または２に記載のタンパク質。
４． 前記プロテアーゼは、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ヒトカテプシン、ヒトエンテロキナーゼ、ヒトトロンビン、ヒトｔＰＡ、ヒトグランザイムＢ、ヒトｕＰＡまたはヒトＡＤＡＭＴＳ－５である、実施形態１～３のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
５． 前記ペプチドリンカーは、ヒトＭＭＰ切断部位、ヒトカテプシン切断部位、ヒトエンテロキナーゼ切断部位、ヒトトロンビン切断部位、ヒトｔＰＡ切断部位、ヒトグランザイムＢ切断部位、ヒトｕＰＡ切断部位またはヒトＡＤＡＭＴＳ－５切断部位を含む、実施形態１～４のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
６． 前記ヒトＭＭＰは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３またはＭＭＰ１４である、実施形態１～５のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
７． 前記患部組織における前記ヒトＭＭＰのレベルまたは活性は、非患部組織における前記ヒトＭＭＰのレベルまたは活性と比べて高い、実施形態１～６のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
８． 前記ヒトカテプシンは、カテプシンＡ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＬまたはカテプシンＫである、実施形態１～５のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
９． 前記患部組織における前記ヒトカテプシンのレベルまたは活性は、非患部組織における前記ヒトカテプシンのレベルまたは活性と比べて高い、実施形態１～５及び８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
１０． 前記第１部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む、実施形態１～９のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
１１． 前記第１部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、またはＴ細胞受容体ドメインである、実施形態１０に記載のタンパク質。
１２． 前記第１部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する、実施形態１～１１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
１３． 前記第１部分は、患部組織に発現している第１分子に特異的に結合し、前記第２部分は、患部組織に発現している第２分子に特異的に結合する能力があり、前記患部組織に発現している第１分子と前記患部組織に発現している第２分子は異なる分子である、実施形態１～１２のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
１４． 前記患部組織に発現している第１分子と前記患部組織に発現している第２分子は、同じ細胞で発現している、実施形態１３に記載のタンパク質。
１５． 前記患部組織に発現している第１分子と前記患部組織に発現している第２分子は、異なる細胞で発現している、実施形態１３に記載のタンパク質。
１６． 前記患部組織に発現している第１分子及び／または前記患部組織に発現している第２分子は、細胞の表面に発現している、実施形態１３に記載のタンパク質。
１７． 前記患部組織に発現している第１分子及び／または前記患部組織に発現している第２分子は、可溶性分子である、実施形態１３に記載のタンパク質。
１８． 前記第１部分は、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３、ヒトＣＤ１０５、ヒトＣ－ＫＩＴ、ヒトＰＤ１、ヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＰＳＭＡ、ヒトＥｐＣＡＭ、ヒトＴｒｏｐ２、ヒトＥｐｈＡ２、ヒトＣＤ２０、ヒトＢＣＭＡ、ヒトＧＩＴＲ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＳＦ１Ｒ、ヒトＬａｇ３またはヒトｃＭＥＴに特異的に結合する、実施形態１～１７のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
１９． 前記第２部分は、ヒト免疫細胞で発現している分子に特異的に結合する、実施形態１～１７のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
２０． 前記ヒト免疫細胞で発現している分子は、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ１６Ｂ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ８９、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＮＫＧ２Ｄ、ヒトＳＩＲＰα、ヒトＳＩＲＰγ、ヒトＰＤ１、ヒトＬａｇ３、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＯＸ４０またはヒトＧＩＴＲである、実施形態１９に記載のタンパク質。
２１． 前記第１部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、実施形態１～２０のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
２２． 前記第１部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部を含む、実施形態１～２１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
２３． 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである、実施形態２２に記載のタンパク質。
２４． 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である、実施形態２２に記載のタンパク質。
２５． 前記免疫グロブリン定常領域は、免疫学的に不活性である、実施形態２２に記載のタンパク質。
２６． 前記免疫グロブリン定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１定常領域、または野生型ヒトＩｇＧ２定常領域である、実施形態２２に記載のタンパク質。
２７． 前記第２部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む、実施形態１～２６のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
２８． 前記第２部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはＴ細胞受容体ドメインである、実施形態２７に記載のタンパク質。
２９． 前記第２部分は、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する、実施形態１～２８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
３０． 前記第２部分は、ヒトＣＤ３またはヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、実施形態１～２８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
３１． 前記第２部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、実施形態１～３０のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
３２． 前記第２部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部を含む、実施形態１～３１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
３３． 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである、実施形態３２に記載のタンパク質。
３４． 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である、実施形態３２に記載のタンパク質。
３５． 前記免疫グロブリン定常領域は、免疫学的に不活性である、実施形態３２に記載のタンパク質。
３６． 前記免疫グロブリン定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１定常領域、または野生型ヒトＩｇＧ２定常領域である、実施形態３２に記載のタンパク質。
３７． 前記タンパク質は、１つの免疫エフェクター機能、または２つ、３つもしくはそれ以上の免疫エフェクター機能を有する、実施形態１に記載のタンパク質。
３８． 前記免疫エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰである、実施形態３７に記載のタンパク質。
３９． 前記第１部分は、前記第２部分の前記患部組織に発現している前記分子への特異的結合を阻止または低減する、実施形態１～３８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
４０． 前記ペプチドリンカーは、前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で切断される、実施形態１～３９のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
４１． 前記ペプチドリンカーは、前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で切断され、前記第１部分は前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で前記第２部分から解離し、かつ前記第２部分は前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で前記患部組織に発現している前記分子に特異的に結合する、実施形態１～４０のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
４２． 前記患部組織は、腫瘍または炎症組織である、実施形態１～４１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
４３． 前記第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
４４． 前記第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
４５． 前記第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
４６． 前記第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
４７． 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
４８． 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
４９． 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｂ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｃ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｄ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｅ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｆ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｇ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｈ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号８８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｉ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｊ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｋ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｌ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｍ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｎ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｏ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される、実施形態１に記載のタンパク質。
５０． 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
５１． 前記第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、前記第２部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、実施形態１に記載のタンパク質。
５２． 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
（ａ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｂ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｃ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
（ｄ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される、実施形態１に記載のタンパク質。
５３． 治療剤に連結された実施形態１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、免疫複合体。
５４． 前記治療剤は、細胞毒、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、細胞増殖抑制酵素、細胞溶解酵素、治療用核酸、抗血管新生剤、抗増殖剤、またはアポトーシス促進剤である、実施形態５３に記載の免疫複合体。
５５． 実施形態１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、または実施形態５３もしくは５４に記載の免疫複合体、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
５６． 実施形態１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質または前記タンパク質の一部をコードする、核酸分子。
５７． 実施形態４３～５２のいずれか１項に記載のタンパク質の、前記第１ポリペプチド鎖、前記第２ポリペプチド鎖、または前記第１ポリペプチド鎖と前記第２ポリペプチド鎖の両方をコードする、核酸分子。
５８． 実施形態５６または５７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
５９． 実施形態５６もしくは５７に記載の核酸分子、または実施形態５８に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
６０． タンパク質を生成する方法であって、
前記核酸分子が発現され、それにより前記タンパク質が生成される条件下で、実施形態５７に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することと、
前記宿主細胞または培養物から前記タンパク質を単離することと、を含む、前記方法。
６１． 対象における抗がん免疫応答を増強する方法であって、治療上有効な量の実施形態１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、実施形態５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または実施形態５５に記載の医薬組成物を前記対象へ投与することを含む、前記方法。
６２． 対象における、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患、または線維性疾患抗を治療する方法であって、治療上有効な量の実施形態１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、実施形態５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または実施形態５５に記載の医薬組成物を前記対象へ投与することを含む、前記方法。
６３． 前記がんは、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織癌である、実施形態６２に記載の方法。
６４． 前記自己免疫疾患または前記炎症性疾患は、関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、グレーブス病、橋本甲状腺炎または強直性脊椎炎である、実施形態６２に記載の方法。
６５． 前記心臓血管疾患は、冠状動脈性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症もしくは脳卒中である、実施形態６２に記載の方法。
６６． 前記線維性疾患は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、嚢胞性線維症、気管支炎または喘息である、実施形態６２に記載の方法。
６７． がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患または線維性疾患の治療で用いるための、実施形態１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、実施形態５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または実施形態５５に記載の医薬組成物。
６８． 前記がんは、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織癌である、実施形態６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
６９． 前記自己免疫疾患または前記炎症性疾患は、関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、グレーブス病、橋本甲状腺炎または強直性脊椎炎である、実施形態６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
７０． 前記心臓血管疾患は、冠状動脈性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症もしくは脳卒中である、実施形態６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
７１． 前記線維性疾患は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、嚢胞性線維症、気管支炎または喘息である、実施形態６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
７２． 医薬品として用いるための、実施形態１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、実施形態５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または実施形態５５に記載の医薬組成物。
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カニクイザルｃＭＥＴ配列
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Claims (72)

  1. 第１部分及び第２部分、ならびに前記第１部分と前記第２部分との間のペプチドリンカーを含むタンパク質であって、
    前記ペプチドリンカーは、ヒト免疫グロブリンヒンジ領域由来のアミノ酸配列、またはアミノ酸配列、あるいはヒト免疫グロブリンヒンジ領域と比べると１～約７個のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含み、
    前記ペプチドリンカーは、患部組織に発現しているプロテアーゼによって切断可能であり、
    前記第２部分は、前記患部組織に発現している分子に特異的に結合する能力があり、かつ
    前記ペプチドリンカーが切断されない場合、前記第２部分の前記患部組織に発現している前記分子への前記結合は低減または阻害される、前記タンパク質。
  2. 前記ペプチドリンカーは、約５～約１５アミノ酸の長さである、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 前記ペプチドリンカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、または配列番号８７のアミノ酸配列を含むか、またはそれらで構成される、請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. 前記プロテアーゼは、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ヒトカテプシン、ヒトエンテロキナーゼ、ヒトトロンビン、ヒトｔＰＡ、ヒトグランザイムＢ、ヒトｕＰＡまたはヒトＡＤＡＭＴＳ－５である、請求項１～３のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  5. 前記ペプチドリンカーは、ヒトＭＭＰ切断部位、ヒトカテプシン切断部位、ヒトエンテロキナーゼ切断部位、ヒトトロンビン切断部位、ヒトｔＰＡ切断部位、ヒトグランザイムＢ切断部位、ヒトｕＰＡ切断部位またはヒトＡＤＡＭＴＳ－５切断部位を含む、請求項１～４のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  6. 前記ヒトＭＭＰは、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１０、ＭＭＰ－１２、ＭＭＰ－１３またはＭＭＰ１４である、請求項１～５のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  7. 前記患部組織における前記ヒトＭＭＰのレベルまたは活性は、非患部組織における前記ヒトＭＭＰのレベルまたは活性と比べて高い、請求項１～６のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  8. 前記ヒトカテプシンは、カテプシンＡ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＧ、カテプシンＬまたはカテプシンＫである、請求項１～５のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  9. 前記患部組織における前記ヒトカテプシンのレベルまたは活性は、非患部組織における前記ヒトカテプシンのレベルまたは活性と比べて高い、請求項１～５及び８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  10. 前記第１部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む、請求項１～９のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  11. 前記第１部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、またはＴ細胞受容体ドメインである、請求項１０に記載のタンパク質。
  12. 前記第１部分は、患部組織に発現している分子に特異的に結合する、請求項１～１１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  13. 前記第１部分は、患部組織に発現している第１分子に特異的に結合し、前記第２部分は、患部組織に発現している第２分子に特異的に結合する能力があり、前記患部組織に発現している第１分子と前記患部組織に発現している第２分子は異なる分子である、請求項１～１２のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  14. 前記患部組織に発現している第１分子と前記患部組織に発現している第２分子は、同じ細胞で発現している、請求項１３に記載のタンパク質。
  15. 前記患部組織に発現している第１分子と前記患部組織に発現している第２分子は、異なる細胞で発現している、請求項１３に記載のタンパク質。
  16. 前記患部組織に発現している第１分子及び／または前記患部組織に発現している第２分子は、細胞の表面に発現している、請求項１３に記載のタンパク質。
  17. 前記患部組織に発現している第１分子及び／または前記患部組織に発現している第２分子は、可溶性分子である、請求項１３に記載のタンパク質。
  18. 前記第１部分は、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、ヒトＨＥＲ３、ヒトＣＤ１０５、ヒトＣ－ＫＩＴ、ヒトＰＤ１、ヒトＰＤ－Ｌ１、ヒトＰＳＭＡ、ヒトＥｐＣＡＭ、ヒトＴｒｏｐ２、ヒトＥｐｈＡ２、ヒトＣＤ２０、ヒトＢＣＭＡ、ヒトＧＩＴＲ、ヒトＯＸ４０、ヒトＣＳＦ１Ｒ、ヒトＬａｇ３またはヒトｃＭＥＴに特異的に結合する、請求項１～１７のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  19. 前記第２部分は、ヒト免疫細胞で発現している分子に特異的に結合する、請求項１～１７のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  20. 前記ヒト免疫細胞で発現している分子は、ヒトＣＤ３、ヒトＣＤ１６Ａ、ヒトＣＤ１６Ｂ、ヒトＣＤ２８、ヒトＣＤ８９、ヒトＣＴＬＡ４、ヒトＮＫＧ２Ｄ、ヒトＳＩＲＰα、ヒトＳＩＲＰγ、ヒトＰＤ１、ヒトＬａｇ３、ヒト４－１ＢＢ、ヒトＯＸ４０またはヒトＧＩＴＲである、請求項１９に記載のタンパク質。
  21. 前記第１部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、請求項１～２０のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  22. 前記第１部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部を含む、請求項１～２１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  23. 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである、請求項２２に記載のタンパク質。
  24. 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である、請求項２２に記載のタンパク質。
  25. 前記免疫グロブリン定常領域は、免疫学的に不活性である、請求項２２に記載のタンパク質。
  26. 前記免疫グロブリン定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１定常領域、または野生型ヒトＩｇＧ２定常領域である、請求項２２に記載のタンパク質。
  27. 前記第２部分は、抗体、抗体の抗原結合部分または受容体外部ドメインを含む、請求項１～２６のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  28. 前記第２部分は、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはＴ細胞受容体ドメインである、請求項２７に記載のタンパク質。
  29. 前記第２部分は、ヒトＣＤ４７に特異的に結合する、請求項１～２８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  30. 前記第２部分は、ヒトＣＤ３またはヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する、請求項１～２８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  31. 前記第２部分は、重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域を含む、請求項１～３０のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  32. 前記第２部分は、免疫グロブリン定常領域または免疫グロブリン定常領域の一部を含む、請求項１～３１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  33. 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹである、請求項３２に記載のタンパク質。
  34. 前記免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２である、請求項３２に記載のタンパク質。
  35. 前記免疫グロブリン定常領域は、免疫学的に不活性である、請求項３２に記載のタンパク質。
  36. 前記免疫グロブリン定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むヒトＩｇＧ４定常領域、野生型ヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３７Ａを含むヒトＩｇＧ１定常領域、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ及びＰ３３１Ｓを含むヒトＩｇＧ１定常領域、または野生型ヒトＩｇＧ２定常領域である、請求項３２に記載のタンパク質。
  37. 前記タンパク質は、１つの免疫エフェクター機能、または２つ、３つもしくはそれ以上の免疫エフェクター機能を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  38. 前記免疫エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰである、請求項３７に記載のタンパク質。
  39. 前記第１部分は、前記第２部分の前記患部組織に発現している前記分子への特異的結合を阻止または低減する、請求項１～３８のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  40. 前記ペプチドリンカーは、前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で切断される、請求項１～３９のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  41. 前記ペプチドリンカーは、前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で切断され、前記第１部分は前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で前記第２部分から解離し、かつ前記第２部分は前記患部組織の近くまたは前記患部組織の内部で前記患部組織に発現している前記分子に特異的に結合する、請求項１～４０のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  42. 前記患部組織は、腫瘍または炎症組織である、請求項１～４１のうちいずれか１項に記載のタンパク質。
  43. 前記第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  44. 前記第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  45. 前記第１部分はヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号３４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  46. 前記第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  47. 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  48. 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号４０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号４１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  49. 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ４７に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
    （ａ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｂ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｃ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｄ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号４９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｅ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号５１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｆ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号５３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｇ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号５５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｈ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号８８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｉ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｊ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｋ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｌ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｍ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｎ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｏ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９７のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される、請求項１に記載のタンパク質。
  50. 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号７３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  51. 前記第１部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、前記第２部分はヒトｃＭＥＴに特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、配列番号７５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第１ポリペプチド鎖、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  52. 前記第１部分はヒトＨｅｒ２に特異的に結合し、前記第２部分はヒトＣＤ３に特異的に結合し、かつ前記タンパク質は、第１ポリペプチド鎖及び第２ポリペプチド鎖を含み、ここで、
    （ａ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号９８のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号９９のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｂ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号１００のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｃ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成されるか、
    （ｄ）前記第１ポリペプチド鎖は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成され、前記第２ポリペプチド鎖は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むか、またはそれで構成される、請求項１に記載のタンパク質。
  53. 治療剤に連結された請求項１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、免疫複合体。
  54. 前記治療剤は、細胞毒、放射性同位体、化学療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、細胞増殖抑制酵素、細胞溶解酵素、治療用核酸、抗血管新生剤、抗増殖剤、またはアポトーシス促進剤である、請求項５３に記載の免疫複合体。
  55. 請求項１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、または請求項５３もしくは５４に記載の免疫複合体、ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、医薬組成物。
  56. 請求項１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質または前記タンパク質の一部をコードする、核酸分子。
  57. 請求項４３～５２のいずれか１項に記載のタンパク質の、前記第１ポリペプチド鎖、前記第２ポリペプチド鎖、または前記第１ポリペプチド鎖と前記第２ポリペプチド鎖の両方をコードする、核酸分子。
  58. 請求項５６または５７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  59. 請求項５６もしくは５７に記載の核酸分子、または請求項５８に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
  60. タンパク質を生成する方法であって、
    前記核酸分子が発現され、それにより前記タンパク質が生成される条件下で、請求項５７に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することと、
    前記宿主細胞または培養物から前記タンパク質を単離することと、を含む、前記方法。
  61. 対象における抗がん免疫応答を増強する方法であって、治療上有効な量の請求項１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または請求項５５に記載の医薬組成物を前記対象へ投与することを含む、前記方法。
  62. 対象における、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患、または線維性疾患抗を治療する方法であって、治療上有効な量の請求項１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または請求項５５に記載の医薬組成物を前記対象へ投与することを含む、前記方法。
  63. 前記がんは、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織癌である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記自己免疫疾患または前記炎症性疾患は、関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、グレーブス病、橋本甲状腺炎または強直性脊椎炎である、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記心臓血管疾患は、冠状動脈性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症もしくは脳卒中である、請求項６２に記載の方法。
  66. 前記線維性疾患は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、嚢胞性線維症、気管支炎または喘息である、請求項６２に記載の方法。
  67. がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患または線維性疾患の治療で用いるための、請求項１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または請求項５５に記載の医薬組成物。
  68. 前記がんは、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮または子宮内膜癌、口腔または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、または血液組織癌である、請求項６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
  69. 前記自己免疫疾患または前記炎症性疾患は、関節炎、喘息、多発性硬化症、乾癬、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、グレーブス病、橋本甲状腺炎または強直性脊椎炎である、請求項６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
  70. 前記心臓血管疾患は、冠状動脈性心疾患、またはアテローム性動脈硬化症もしくは脳卒中である、請求項６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
  71. 前記線維性疾患は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、嚢胞性線維症、気管支炎または喘息である、請求項６７に係る使用のためのタンパク質または医薬組成物。
  72. 医薬品として用いるための、請求項１～５２のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項５３もしくは５４に記載の免疫複合体、または請求項５５に記載の医薬組成物。
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