JP2017504328A - 二重特異性cd3及びcd19抗原結合構築物 - Google Patents

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Abstract

CD3及びCD19に結合する抗原結合構築物(例えば、抗体)及びその使用方法を開示する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2014年1月15日に出願された米国仮出願第61/927,877号、及び2014年4月11日に出願された米国仮出願第61/978,719号、及び2014年7月17日に出願された米国仮出願第62/025,932号の利益を主張する。本出願は、2014年7月11日に出願された国際出願番号PCT/US2014/046436に対する優先権も主張する。これらの出願のそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、EFS−Webを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ASCIIコピーは、2015年XX月XX日に作製され、名称はXXXXX_CRF_sequencelisting.txtであり、サイズはXXX,XXXバイトである。
技術分野
本技術分野は、CD3抗原結合ポリペプチド構築物(例えばCD3結合性ドメイン)及びCD19抗原結合ポリペプチド構築物(例えばCD19結合性ドメイン)を含む、二重特異性抗原結合構築物(例えば、抗体)である。
発明の背景
治療用タンパク質の領域において、その多価標的結合特性を有する抗体は、薬物候補の設計のための優れた足場である。これらの特性をさらに進展させると、設計される二重特異性抗体及びその他の融合多重特異性治療薬は、二重または多重の標的特異性を呈し、新規作用様式を有する薬物を作製する機会を呈する。好ましい薬物動態及び機能活性を有するそのような多価及び多重特異性治療用タンパク質の開発が課題となっている。
T細胞を腫瘍細胞に誘引することができる二重特異性抗体が同定されており、癌の治療におけるその有効性について試験されている。ブリナツモマブは、再発性B細胞非ホジキンリンパ腫及び慢性リンパ性白血病などのB細胞疾患の治療について同定されているBiTE(商標)(二重特異性T細胞誘導物)と呼ばれる形式の二重特異性抗CD3−CD19抗体の例である(Baeuerle et al(2009)12:4941−4944(非特許文献1))。BiTE(商標)形式は、2つの異なる抗体に由来する可変ドメインを連結している二重特異性一本鎖抗体構築物である。しかしながら、ブリナツモマブが有するインビボでの半減期は乏しく、生産性及び安定性の点で製造が難しい。ゆえに、T細胞を腫瘍細胞に誘引することができ、改善された製造性を有する、改善された二重特異性抗体が必要とされている。
抗原結合構築物は、以下に記載されている:2013年7月13日に出願された"Bispecific Asymmetric Heterodimers Comprising Anti−CD3 Constructs"という名称の国際出願番号PCT/US2013/050411(特許文献1);2014年7月11日に出願された、"Bispecific CD3 and CD19 Antigen Binding Constructs"という名称の国際出願番号PCT/US2014/046436(特許文献2)。
PCT/US2013/050411 PCT/US2014/046436
Baeuerle et al(2009)12:4941−4944
第一の抗原結合ポリペプチド構築物、第二の抗原結合ポリペプチド構築物、及びヘテロ二量体Fcをそれぞれ含む抗原結合構築物を本明細書に記載する。第一のscFvは、第一のVL、第一のscFvリンカー、及び第一のVHを含む。第一のscFvは、CD19抗原に一価で特異的に結合する。第一のscFvは、抗CD19抗体HD37 scFv、修飾HD37 scFv、HD37遮断抗体scFv、及び修飾HD37遮断抗体scFvからなる群より選択され、ここでHD37遮断抗体は、CD19抗原へのHD37の結合を50%以上遮断する。
第二の抗原結合ポリペプチド構築物は、第二のVL、第二のscFvリンカー、及び第二のVHを含む、第二のscFvを含む。第二のscFvは、CD3抗原のイプシロンサブユニットに一価で特異的に結合する。第二のscFvは、OKT3 scFv、修飾OKT3 scFv、OKT3遮断抗体scFv、及び修飾OKT3遮断抗体scFvからなる群より選択され、ここでOKT3遮断抗体は、CD3抗原のイプシロンサブユニットへのOKT3の結合を50%以上遮断する。
ヘテロ二量体Fcは、二量体化CH3ドメインを形成することができる修飾CH3配列をそれぞれ含む第一及び第二のFcポリペプチドを含み、ここで各修飾CH3配列は、ヘテロ二量体Fcの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、二量体化CH3ドメインは、約68℃以上の融解温度(Tm)を有する。第一のFcポリペプチドは、第一のヒンジリンカーにより第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、第二のFcポリペプチドは、第二のヒンジリンカーにより第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている。
抗原結合構築物ポリペプチド配列及びCDR配列、抗原結合構築物をコードする核酸、及びベクター及び細胞も記載する。抗原結合構築物を含む医薬組成物、及び、本明細書に記載の抗原結合構築物を使用して障害(例えば、癌)を治療する方法も記載する。
抗原結合構築物の設計の概略図を示す。図1Aは、エフェクター機能を媒介することができるFcを有する例示的なCD3−CD19抗原結合構築物を図示する。当該抗原結合構築物の抗原結合ドメインは両方ともscFvであり、各scFvのVH及びVL領域はポリペプチドリンカーにより接続されている。各scFvはまた、ヒンジポリペプチドリンカーによりヘテロ二量体Fcの一方のポリペプチド鎖に接続されている。当該抗原結合構築物の当該2つのポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている(破線として示す)。図1Bは、Fcがノックアウトされている例示的なCD3−CD19抗原結合構築物を図示する。このタイプの抗原結合構築物は、FcγR結合を除去するFcのCH2領域への修飾(「X」で示す)を含むことを除き、図1Aに示すものと類似する。 選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図2Aの上方パネルは、変異体10149についてのプロテインA精製後の分取ゲルろ過(GFC)プロファイルを示し、下方パネルは、プールしたGFC画分の分析的SECプロファイルを示す。 選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図2Bの上方パネルは、変異体1661についてのプロテインA精製後の分取ゲルろ過(GFC)プロファイルを示し、下方パネルは、1661についてのプールしたGFC画分の分析的SECプロファイルを示す。 選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図2Cは、変異体875、1661、1653、1666、10149、及び12043の生物物理学的特徴の概要を提供する。 B及びT細胞を架橋して仮足の形成させる変異体875及び1661の能力を示す。左の表は、FACSによる架橋分析及び顕微鏡による架橋分析により測定したこれらの変異体についてのB:T細胞架橋分析の概要を提供し;右の画像は、顕微鏡による架橋分析により測定した、変異体875についての仮足の形成を示す。 300nMの変異体875の、IL2活性化精製CD8T細胞における非CD19発現K562細胞に対するオフターゲット細胞障害性を示す(4人のドナーの平均)。 v1661のADCCまたはCDCを媒介する能力の低減または消失を示す。図5Aは、リツキシマブ対照との比較での変異体1661のRaji細胞におけるADCCを媒介する能力を示す。図5Bは、リツキシマブ対照に対する変異体1661のRaji細胞におけるCDCを媒介する能力を示す。 選択された変異体の、全血アッセイにおける自己B細胞枯渇を媒介する能力を示す。CD20B細胞の存在は、IL2活性化ヒト全血における48時間のインキュベーションの後に決定された(2ドナーの平均、n=4)。 10:1のE:T比率で48時間後のIL−2活性化ヒト全血における濃度依存様式(0.01nM未満のEC50)でのv1661による用量依存的な自己B細胞枯渇を示す。 静止条件下、用量依存的に全血中の自己B細胞を枯渇させる変異体1661及び10149の能力の比較を示す。 一次患者ヒト全血におけるv1661による自己B細胞枯渇を示す。図9Aは、MCL患者からの血液中でのv1661の効果を示す。図9Bは、2人のCLL患者からの血液中でのv1661の効果を示す。残存する悪性B細胞の数は、培地対照に対して正規化されたCD20/CD5B細胞の割合(%)として表される。 v875、1380及び対照の、ヒトPBMCにおけるT細胞増殖を刺激する能力を示す(4日間のインキュベーション、4人のドナーの平均)。 100nMの変異体、ヒトPBMCにおける標的B細胞依存性T細胞増殖を示す(4日間のインキュベーション、4人のドナーの平均)。 選択された変異体の、ヒトG2 ALL腫瘍細胞株に結合する能力を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体875の有効性を示す。図13Aは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体875の有効性を示す。図13Bは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体875の有効性を示す。図13Cは、18日目の、単離された脾臓における生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Aは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Bは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Cは、全身生物発光の画像である。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Dは、18日目に、単離された脾臓で検出された生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける、3mg/kg静脈内注射の24時間後の二重特異性抗CD3−CD19変異体の血清濃度の分析を示す。 マウスHD37 VL及びVH配列をベースとするヒト化CD19 VL及びVH配列を示す。3つのヒト化VL配列を提供している:hVL2、hVL2(D−E)、及びhVL2(D−S)。hVL2(D−E)は、CDR L1におけるDからEへの置換を含有し、hVL2(D−S)は、CDR L1におけるDからSへの置換を含有する。2つのヒト化VH配列hVH2及びhVH3を提供している。CDR配列は、囲みにより確認される。この図において確認されるCDRは単なる例示である。当該技術分野で知られているように、CDRの同定は、それらを同定するために使用する方法に応じて変わり得る。抗CD19 VL及びVH配列についての代替のCDR定義を表S1に示す。野生型マウスHD37抗体配列に関してヒト化されたこれらの配列への修飾は、下線で示す。 抗CD19 HD37抗体に基づく、抗CD19 VL配列に関するKabatに従う番号を示す表を示す。 抗CD19 HD37抗体に基づく、抗CD19 VH配列に関するKabatに従う番号を示す表を示す。
発明の詳細な説明
CD3及びCD19に結合する二重特異性抗原結合構築物(例えば、抗体)(CD3−CD19抗原結合構築物)を本明細書に記載する。これらのCD3−CD19抗原結合構築物は、CD3イプシロンサブユニットに一価で結合する抗原結合ドメイン、CD19に一価で結合する抗原結合ドメイン、及びヘテロ二量体Fc領域を含む。両方の抗原結合ドメインは、scFv形式であり、標準的な抗体製造プロトコルを使用して発現及び精製されたときの、抗体の収率、純度及び安定性により評価される製造性を改善するために遺伝子操作されている。
本明細書に記載のように治療用抗体または抗原結合構築物の開発を成功させるためには、構築物は、十分に高い力価を伴って生成されなければならず、発現された生成物は実質的に純粋でなければならない。抗体またはscFv構築物の精製後力価は、凝集物の形成及びタンパク質分解を最小にするために、発現宿主細胞内のタンパク質フォールディング及びプロセシング、及び精製プロセス中の構築物の安定性により、少なくとも部分的に決定される。
本明細書の他の部分に記載するように、抗原結合構築物は、フォールディング、発現、及び安定性の特定の態様を最適化するためにいくつかの修飾を組み込む。これらの修飾には、例えば、タンパク質フォールディング及び発現を改善するためのリンカー及びVHVLの向きの最適化;発現及び精製中に誤って折りたたまれた凝集物の形成を低減させるためのVHVLのジスルフィド遺伝子操作;及び、フォールディング、発現、のみならず精製プロセス中の安定性も最適化するための既知の安定したフレームワークへのCDR移植が含まれる。
本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物は、CD3発現T細胞とCD19発現B細胞を架橋することができ、それに伴って免疫シナプスが形成される。これらの抗原結合構築物は、インビトロ及びエキソビボアッセイにより測定され、疾患のインビボモデルにおいて評価される、T細胞誘引によるB細胞枯渇(T cell directed B cell depletion)を媒介することができる。従って、本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物は、患者における血中B細胞の数を低減させることが有益となる、リンパ腫及び白血病などの疾患の治療において有用である。
抗CD19 HD37抗体のVL及びVH配列をベースとする、ヒト化抗CD19 VL及びVH(抗CD19 huVLVH)配列も本明細書に記載する。これらの抗CD19 huVLVH配列は、本明細書に記載の二重特異性CD3−CD19抗原結合構築物の抗CD19抗原結合ドメインにおいて使用することができる。
二重特異性抗原結合構築物
CD3及びCD19に結合する二重特異性抗原結合構築物(例えば、抗体)を本明細書に提供する。二重特異性抗原結合構築物は、それぞれscFvでありCD3またはCD19のいずれかに特異的に結合する、2つの抗原結合ポリペプチド構築物(例えば、抗原結合ドメイン)を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、既知の抗体または抗原結合構築物に由来する。より詳細に下記に記載するように、抗原結合ポリペプチド構築物は、scFv(単鎖Fv)であり、Fcを含む。
「抗原結合構築物」という用語は、抗原に結合することができる任意の作用物質(例えば、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体)を指す。いくつかの態様では、抗原結合構築物は、対象となる抗原に特異的に結合するポリペプチドである。抗原結合構築物は、単量体、二量体、多量体、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質またはペプチド複合体;抗体、抗体断片、またはその抗原結合断片;scFv等であることができる。抗原結合構築物は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であるポリペプチド構築物であることができる。いくつかの態様では、抗原結合構築物は、例えば、1つまたは複数のFcに連結された1つまたは複数の抗原結合構成要素(例えば、FabまたはscFv)を含むことができる。抗原結合構築物のさらなる例は、以下に記載され、実施例にて提供される。
「二重特異性」という用語は、それぞれが特有の結合特異性を有する、2つの抗原結合部分を有する任意の作用物質、例えば、抗原結合構築物(例えば、抗原結合ポリペプチド構築物)を含むことが意図される。例えば、第一の抗原結合部分は、第一の抗原上のエピトープに結合し、第二の抗原結合部分は、第二の抗原上のエピトープに結合し、ここで第一の抗原は第二の抗原と異なる。
例えば、いくつかの実施形態では、二重特異性薬剤は、(a)細胞表面標的分子及び(b)エフェクター細胞の表面上のFc受容体に結合し得るまたはそれらと相互作用し得る。別の実施形態では、薬剤は、(a)第一の細胞表面標的分子及び(b)第一の細胞表面標的分子と異なる第二の細胞表面標的分子に結合し得るまたはそれらと相互作用し得る。別の実施形態では、薬剤は、2つの細胞に結合してそれらを架橋し得る、すなわち(a)第一の細胞上の第一の細胞表面標的分子及び(b)第一の細胞の表面標的分子と異なる、第二の細胞上の第二の細胞表面標的分子と相互作用し得る。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、CD3発現T細胞とCD19発現B細胞を架橋して、免疫シナプスを形成させかつ/またはT細胞誘引によるB細胞枯渇を媒介する。
単一特異性抗原結合構築物は、単一の結合特異性を有する抗原結合構築物を指す。言い換えると、両方の抗原結合部分が同じ抗原上の同じエピトープに結合する。単一特異性抗原結合構築物の例には、例えば、抗CD19抗体HD37及び抗CD3抗体OKT3が含まれる。
抗原結合構築物は、抗体またはその抗原結合部分であることができる。本明細書中で用いるとき、「抗体」または「免疫グロブリン」は、分析物(例えば、抗原)に特異的に結合し、それを認識する、1つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチド、またはその断片を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖により所有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM、があり、これらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG、IgG、IgG、IgG、IgA、及びIgAにさらに分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
例示的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、2対のポリペプチド鎖から構成され、各対は1本の「軽」鎖(約25kD)及び1本の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端ドメインは、主に抗原認識を担う約100〜110またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖ドメインを指す。
IgG重鎖は、N末端からC末端に向かってそれぞれVH、CH1、CH2及びCH3ドメインからなる。軽鎖は、N末端からC末端に向かってVL及びCLドメインからなる。IgG重鎖は、CH1とCH2ドメインの間にヒンジを含む。
「超可変領域」または「HVR」という用語は、本明細書で用いる場合、配列において超可変である及び/または構造的に規定されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般に、天然の4本鎖抗体は6つのHVR;VHにおいて3つ(H1、H2、H3)及びVLにおいて3つ(L1、L2、L3)を含む。HVRは、一般的に、超可変ループから及び/または相補性決定領域(CDR)からのアミノ酸残基を含み、後者は、配列変化が最も高く、及び/または抗原認識に関与する。VHにおけるCDR1を除き、CDRは、通常、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域(HVR)は、「相補性決定領域」(CDR)とも称され、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して、本明細書において互換可能に使用される。この特定の領域は、Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)及び by Chothia et al.,J Mol Biol 196:901−917(1987)に記載されており、これらの定義は、互いに比較したときのアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。いずれにせよ、抗体またはその変異体のCDRを指すためにいずれの定義を適用しても、本明細書において定義及び使用される用語の範囲内にあることが意図される。特定のCDRを包含する正確な残基の数は、CDRの配列及びサイズに依存して変化するだろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のCDRを含むかを慣行的に決定できる。
抗体のCDR領域を使用して、抗体、scFv、ダイアボディ等を含むがこれらに限定されない、結合性タンパク質を構築し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、抗体からの少なくとも1つまたは全てのCDR領域を含むだろう。CDR配列は、抗体骨格またはその断片に使用され得、同様にヒト化抗体、またはヒト化配列を含有する抗体を含み得る。抗体のCDR部分を同定する方法は当該技術分野で周知である。Shirai,H.,Kidera,A.,and Nakamura,H.,H3−rules:Identification of CDR−H3 structures in antibodies,FEBS Lett.,455(1):188−197,1999;及び Almagro J C,Fransson,J.Front Biosci.13:1619−33(2008)を参照されたい。
抗原結合ポリペプチド構築物の形式
二重特異性抗原結合構築物は、2つの抗原結合ポリペプチド構築物(例えば、抗原結合ドメイン)を含む。抗原結合ポリペプチド構築物の形式は、二重特異性抗原結合構築物の機能的特徴を決定する。一実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、scFv−scFv形式を有する、すなわち両方の抗原結合ポリペプチド構築物はscFvである。
「単鎖Fv」または「scFv」形式は、抗体のVH及びVLドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一ポリペプチド鎖で存在する。いくつかの実施形態では、scFvポリペプチドは、VHとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの概説には、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer−Verlag,New York,pp.269−315(1994)を参照されたい。
他の抗原結合ポリペプチド構築物形式は、Fab断片またはsdAbを含む。
「Fab断片」(抗原結合断片とも称される)は、軽鎖の定常ドメイン(CL)及び重鎖の第一定常ドメイン(CH1)を、それぞれ軽鎖及び重鎖上の可変ドメインVL及びVHと共に含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ(CDR、超可変領域とも称される)を含む。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの1つまたは複数のシステインを含む、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加により、Fab断片と異なる。
「単一ドメイン抗体」または「sdAb」形式は、個々の免疫グロブリンドメインである。Sdabは、かなり安定しており、抗体のFc鎖との融合パートナーとして容易に発現する(Harmsen MM,De Haard HJ(2007)."Properties,production,and applications of camelid single−domain antibody fragments".Appl.Microbiol Biotechnol.77(1):13−22)。
scFv形式
本明細書に記載の抗原結合構築物は、二重特異性であり、例えば、それらはそれぞれが異なる抗原に特異的に結合することができる、2つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。各抗原結合ポリペプチド構築物は、scFv形式である(すなわち、抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーにより接続される、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成される)。一実施形態では、前記scFvは、ヒトである。別の実施形態では、前記scFv分子は、ヒト化されている。scFvは、下記の修飾により、タンパク質発現及び収率に最適化される。
scFvは、scFvにおける可変ドメインVL及びVHの順序を変更することにより最適化されることができる。本明細書に記載の抗原結合構築物内のscFvのいくつかの実施形態では、軽鎖可変領域のC末端は重鎖可変領域のN末端に接続されてよく、または重鎖可変領域のC末端は軽鎖可変領域のN末端に接続されてよい。
可変領域は、機能的抗原結合部分の形成を可能にする、リンカーペプチド、またはscFvリンカーを介して接続され得る。scFvは、scFvリンカーポリペプチドの組成及び/または長さを変更することによりタンパク質発現及び収率について最適化されることができる。典型的なペプチドリンカーは、約2〜20個のアミノ酸を含み、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で公知である。好適な、非免疫原生リンカーペプチドには、例えば、(GS)、(SG、(GS)、G(SGまたはG(SGリンカーペプチドが含まれ、ここでnは、一般的には、1から10の間、典型的には2から4の間の数である。
いくつかの実施形態では、scFvリンカーは、下記の表から選択される。
(表B)scFvリンカーポリペプチド配列
Figure 2017504328
scFv分子は、例えば、Reiter et al.(Nat Biotechnol 14,1239−1245(1996))に記載のように、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間のジスルフィド架橋の安定化を含むことにより、タンパク質発現及び収率について最適化され得る。従って、一実施形態では、本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、scFv分子を含み、ここで重鎖可変ドメイン内のアミノ酸及び軽鎖可変ドメイン内のアミノ酸は、ジスルフィド架橋が重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間で形成され得るように、システインにより置換されている。特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインの44位のアミノ酸及び重鎖可変ドメインの100位のアミノ酸がシステインにより置換されている(Kabatナンバリング)。
当該技術分野で公知であり、[Miller et al.,Protein Eng Des Sel.2010 Jul;23(7):549−57;Igawa et al.,MAbs.2011 May−Jun;3(3):243−5;Perchiacca & Tessier,Annu Rev Chem Biomol Eng.2012;3:263−86.]に記載されているように、scFvは、CDR配列の変異により安定化されることもできる。
ヒト化CD19 VH及びVL
いくつかの実施形態では、及び本明細書に記載の抗原結合構築物をさらに安定化させるためには、HD37抗CD19抗体の野生型配列は、ヒト化VH及びVLポリペプチド配列を生成するように修飾されることができる。フレームワーク領域及びCDRの両方への修飾は、抗原結合構築物のCD19結合性scFvにおいて使用されるVH及びVLポリペプチド配列を得るために、なされ得る。いくつかの実施形態では、修飾は図16に示されるそれであり、修飾されたCDRの配列、VH及びVLポリペプチド配列は、表S2及びS3に示されるそれである。
scFvの形式及び配列への上記修飾の1つまたは複数が、抗原結合構築物のscFvに適用され得る。
抗原結合ポリペプチド構築物の抗原
本明細書に記載の抗原結合構築物は、CD3抗原及びCD19抗原に特異的に結合する。
本明細書で用いる場合、「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合して、抗原結合部分−抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子上の部位(例えば、アミノ酸の連続した区間または連続していないアミノ酸の異なる領域からなる立体配座立体配置)を指す。エピトープは、典型的に、少なくとも3個、より一般的には少なくとも5または8〜10個のアミノ酸を、固有の空間立体配座に含む。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドにより有効に遮断されるアミノ酸残基を含み得る;言い換えると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。同じエピトープを認識する抗体は、別の抗体の標的抗原への結合を遮断する1つの抗体の能力を示す簡単なイムノアッセイにおいて確認することができる。
「特異的に結合」、「特異的結合」または「選択的結合」は、結合が抗原に関して選択的であり、望ましくないまたは非特異的な相互作用とは区別されることができることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合構築物の能力は、酵素結合免疫吸着法(ELISA)または当業者に周知のその他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)技術(BIAcore計器で分析される)(Liljeblad et al,Glyco J 17,323−329(2000))、及び伝統的な結合アッセイ(Heeley,Endocr Res 28,217−229(2002))により測定されることができる。一実施形態では、非関連タンパク質への抗原結合部分の結合の程度は、例えばSPRにより測定したとき、抗原への抗原結合構築物の結合の約10%未満である。
ある特定の実施形態では、抗原に結合する抗原結合構築物、またはその抗原結合部分を含む抗原結合分子が有する解離定数(K)は、1μΜ未満、100nM未満、10nM未満、1nM未満、0.1nM未満、0.01nM未満、または0.001nM未満(例えば、10〜8M以下、例えば10〜8Mから10"13M、例えば10"9Mから10"13M)である。
「親和性」は、分子(例えば、受容体)とその結合パートナー(例えば、リガンド)の単一結合部位間の非共有結合的相互作用の総和の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書中で用いるとき、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗原結合部分と抗原、または受容体とそのリガンド)間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYへの親和性は、一般的に、解離及び会合速度定数(それぞれ、koff及びkon)の比である、解離定数(K)により表すことができる。従って、速度定数の比が同じままである限り、等しい親和性は異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載の方法を含む、当該技術分野で公知の十分に確立された方法により測定されることができる。親和性を測定するための具体的な方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)、または対象となる抗原を発現する細胞を用いるホールセル結合アッセイである。
「結合減少」、例えばFc受容体への結合減少は、例えばSPRにより測定したとき、それぞれの相互作用に関する親和性における低減を指す。明確にすると、この用語は、親和性のゼロへの(または分析方法の検出限界より下への)減少、すなわち相互作用の完全消失も含む。逆に、「結合増大」は、それぞれの相互作用に関する結合親和性における増大を指す。
「活性化T細胞抗原」は、本明細書中で用いるとき、抗原結合分子と相互作用するとT細胞活性化を誘導し得る、Tリンパ球(特に細胞障害性Tリンパ球)の表面上で発現される抗原決定基を指す。具体的には、抗原結合分子と活性化T細胞抗原の相互作用は、T細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、T細胞活性化を誘導し得る。特定の実施形態では、活性化T細胞抗原はCD3である。
「T細胞活性化」は、本明細書中で用いるとき、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞障害性エフェクター分子放出、細胞障害活性及び活性化マーカーの発現から選択される、Tリンパ球、特に細胞障害性Tリンパ球の1つまたは複数の細胞性応答を指す。本発明のT細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、T細胞活性化を誘導することができる。T細胞活性化を測定するための好適なアッセイは、本明細書に記載の当該技術分野で公知である。
「標的細胞抗原」は、本明細書中で用いるとき、標的細胞(例えば、癌細胞または腫瘍間質の細胞などの腫瘍内のB細胞)の表面上に提示される抗原決定基を指す。本明細書中で用いるとき、「第一の」及び「第二の」という用語は、抗原結合部分等に関しては、複数の各型の部分が存在する場合、区別を便利にするために用いられる。これらの用語の使用は、明白に記述されない限り、T細胞を活性化させる二重特異性抗原結合分子の具体的順序または方向を付与するようには意図されない。
「異種間結合」または「種間結合」という用語は、本明細書で用いる場合、ヒト及び他の生物、例えば、これ限定されないが、非チンパンジー霊長類、における同一の標的分子への、本明細書に記載の結合性ドメインの結合を意味する。ゆえに、「異種間結合」または「種間結合」は、異なる種において発現される同一の分子「X」(すなわち、ホモログ)に対するが、「X」以外の分子に対するものではない、種間反応性であると理解されたい。例えば、ヒトCD3イプシロンを認識するモノクローナル抗体の、非チンパンジー霊長類のCD3イプシロン(例えば、マカクCD3イプシロン)への異種特異性は、例えば、FACS分析により決定されることができる。FACS分析は、それぞれのモノクローナル抗体が、それぞれ前記ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3イプシロン抗原を発現するヒト及び非チンパンジー霊長類細胞、例えばマカク細胞への結合について試験される方法で実施される。適切なアッセイを以下の実施例で示す。上記内容は、CD19に関して準用される。FACS分析は、それぞれのモノクローナル抗体が、前記ヒト及び非チンパンジー霊長類CD3またはCD19抗原を発現するヒト及び非チンパンジー霊長類細胞(例えば、マカク細胞)への結合について試験される方法で実施される。
CD3
本明細書に記載の抗原結合構築物は、CD3抗原に特異的に結合する。
本明細書で記載されるとき「CD3」または「CD3複合体」は、成熟Tリンパ球中の少なくとも5つの膜結合ポリペプチドの複合体であり、互いに、そしてT細胞受容体と非共有結合的に会合している。CD3複合体は、ガンマ、デルタ、イプシロン、ゼータ鎖(サブユニットとも呼ばれる)を含む。非ヒトモノクローナル抗体は、マウス抗体OKT3、SP34、UCHT1または64.1により例示されるように、これらの鎖のいくつかに対して開発されている(例えば、June,et al.,J.Immunol.136:3945−3952(1986);Yang,et al.,J.Immunol.137:1097−1100(1986);及びHayward,et al.,Immunol.64:87−92(1988)を参照されたい)。T細胞上のCD3の、例えば、固定化抗CD3抗体による、クラスタリングは、T細胞受容体の係合に類似しているが、そのクローン典型的特異性とは独立したT細胞活性化をもたらす。大半の抗CD3抗体は、CD3ε鎖を認識する。
いくつかの実施形態では、抗CD3 scFvは、既知の抗CD3抗体のscFvであるかまたはそれに由来し、例えば、既知の抗CD3抗体のscFvの修飾体である。本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物において採用される可変領域(VH及びVL)を提供するヒトCD3に対して向けられた抗体は、当該技術分野で知られており、OKT3(ORTHOCLONE−OKT3(商標)(ムロモナブCD3)を含む。追加の抗CD3抗体は、CD3抗原のイプシロンサブユニットへのOKT3の結合を50%以上遮断する「OKT3遮断抗体」を含む。例としては、Teplizumab(商標)(MGA031、Eli Lilly);UCHT1(Pollard et al.1987 J Histochem Cytochem.35(11):1329−38);NI0401(WO2007/033230);及びビジリズマブ(US25834597)が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、CD3抗原に一価で特異的に結合するCD3抗原結合ポリペプチド構築物を含み、ここでCD3抗原結合ポリペプチド構築物は、OKT3(ORTHOCLONE−OKT3(商標)(ムロモナブCD3)に由来する。一実施形態では、二重特異性抗原結合構築物は、CD3抗原に一価で特異的に結合するCD3抗原結合ポリペプチド構築物を含み、前記CD3抗原結合ポリペプチドのVH及びVL領域は、CD3イプシロン特異的抗体OKT3に由来する。
いくつかの実施形態では、CD19への第一のscFvの結合親和性は、約0.1nMから約5nMの間、または5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.9、.09、0.9、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3未満または0.2nM未満である。
OKT3抗体が結合するCD3イプシロンサブユニット上のエピトープは、CD3イプシロンに結合したOKT3の結晶構造の分析により同定される(Kjer−Nielsen L.et al.,(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:7675−7680)。CD3イプシロンのポリペプチド配列を下記の表に提供する。
(表F)CD3イプシロン配列
Figure 2017504328
この構造の分析は、表Fの配列に関して、OKT3抗体のCDRが、ヒトCD3イプシロンに残基56−57(SE)、68−70(GE)、及び101−107(RGSKPED)で接触することを示す。これらの残基における結合ホットスポットに下線を引いている。これらの残基は、OKT3が結合するエピトープと考えられる。従って、本明細書に記載の抗原結合構築物は、このエピトープに特異的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
少なくとも1つのCD3発現細胞上のCD3複合体に結合する少なくとも1つのCD3結合性ポリペプチド構築物を含む抗原結合構築物であって、CD3発現細胞がT細胞である、前記構築物を本明細書に提供する。ある特定の実施形態では、CD3発現細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、CD3発現細胞は、非ヒト、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、細胞障害性T細胞である。いくつかの実施形態では、T細胞は、CD4またはCD8T細胞である。
本明細書に提供する抗原結合構築物のある特定の実施形態では、構築物は、B細胞などの標的細胞に対するT細胞の細胞障害活性の活性化および再動員が可能である。特定の一実施形態では、前記再動員は、標的細胞によるMHC媒介性ペプチド抗原提示及び/またはT細胞の特異性とは独立している。
CD19
本明細書に記載の抗原結合構築物は、CD19抗原に結合する抗原結合ポリペプチド構築物(抗CD19 scFv)を含む。
いくつかの実施形態では、抗CD19 scFvは、既知の抗CD19抗体のscFvであるかまたはそれに由来し、例えば、既知の抗CD19抗体のscFvの修飾体である。本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物において採用される可変領域(VH及びVL)を提供する抗CD19に対して向けられた抗体は、当該技術分野で知られており、HD37ハイブリドーマにより提供されるHD37を含む(Pezzutto(1997),J.Immunol.138,2793−9)。追加の抗CD19抗体は、CD19抗原へのHD37の結合を50%以上遮断する「HD37遮断抗体」を含む。例としては、HD237(IgG2b)(Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens,Vienna,Austria,1989;及びPezzutto et al.,J.Immunol.,138(9):2793−2799(1987));4G7(Meecker(1984)Hybridoma 3,305−20);B4(Freedman(1987)Blood 70,418−27);B43(Bejcek(1995)Cancer Res.55,2346−51)及びMor−208(Hammer(2012)Mabs4:5,571−577)が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、前記VH(CD19)及びVL(CD19)領域(またはCDRのような、その一部)は、HD37ハイブリドーマにより提供される、抗CD19抗体HD37に由来する(Pezzutto(1997),J.Immunol.138,2793−9)。
いくつかの実施形態では、CD3のイプシロンサブユニットへの第二のscFvの結合親和性は、約1nMから約100nMの間、または約20nMから約100nMの間、または、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80より大きい、または90nMより大きい。
ある特定の実施形態では、少なくとも1つの抗原結合ポリペプチド構築物は、B細胞上のCD19に結合するscFv構築物である。いくつかの実施形態では、前記scFv構築物は哺乳動物である。一実施形態では、前記scFv構築物はヒトである。別の実施形態では、前記scFv構築物はヒト化されている。なおも別の実施形態では、前記scFv構築物は、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域の少なくとも1つを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、B細胞の表面上に発現された少なくとも1つの抗原への異種間結合を呈する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物は、哺乳動物CD19の少なくとも1つに結合する。ある特定の実施形態では、CD19抗原結合ポリペプチド構築物は、ヒトCD19に結合する。
抗原結合構築物のFc
本明細書に記載の抗原結合構築物は、Fc、例えば、二量体Fcを含む。Fcは、それぞれが修飾CH3配列を含む第一及び第二のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであり、ここで各修飾CH3配列は、ヘテロ二量体Fcの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、二量体化CH3ドメインは、約68℃以上の融解温度(Tm)を有し、ここで第一のFcポリペプチドは第一のヒンジリンカーにより第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、第二のFcポリペプチドは第二のヒンジリンカーにより第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている。
「Fcドメイン」または「Fc領域」という用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc領域及び変異体Fc領域を含む。本明細書で別段の指定がない限り、Fc領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991に記載されるように、EUインデックスとも呼ばれるEUナンバリングシステムに従う。本明細書で用いる場合、二量体Fcの「Fcポリペプチド」は、二量体Fcドメインを形成する2つのポリペプチドのうちの1つ、すなわち、安定的に自己会合できる、免疫グロブリン重鎖のC末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体IgG FcのFcポリペプチドは、IgG CH2及びIgG CH3定常ドメイン配列を含む。
Fcドメインは、CH3ドメインまたはCH3及びCH2ドメインのいずれかを含む。CH3ドメインは、2つのCH3配列を含み、二量体Fcの2つのFcポリペプチドからそれぞれ1つである。CH2ドメインは、2つのCH2配列を含み、二量体Fcの2つのFcポリペプチドからそれぞれ1つである。
いくつかの態様では、Fcは、少なくとも1つまたは2つのCH3配列を含む。いくつかの態様では、Fcは、1つまたは複数のリンカーを伴ってまたは伴わずに、第一の抗原結合構築物及び/または第二の抗原結合構築物と結合する。いくつかの態様では、Fcは、ヒトFcである。いくつかの態様では、Fcは、ヒトIgGまたはIgG1 Fcである。いくつかの態様では、Fcは、ヘテロ二量体Fcである。いくつかの態様では、Fcは、少なくとも1つまたは2つのCH2配列を含む。
いくつかの態様では、Fcは、CH3配列の少なくとも1つにおいて1つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様では、Fcは、CH2配列の少なくとも1つにおいて1つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様では、Fcは、単一ポリペプチドである。いくつかの態様では、Fcは、複数のペプチド、例えば、2つのポリペプチドである。
いくつかの態様では、Fcは、2011年11月4日に出願された特許出願PCT/CA2011/001238、または2012年11月2日に出願された特許出願PCT/CA2012/050780に記載されるFcであり、これらの各々の開示全体は全ての対象となるために参照によって本明細書に組み込まれている。
修飾CH3ドメイン
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、非対称的に修飾されている修飾CH3ドメインを含むヘテロ二量体Fcを含む。ヘテロ二量体Fcは、2つの重鎖定常ドメインポリペプチド:第一のFcポリペプチド及び第二のFcポリペプチドを含むことができ、これは、Fcが1つの第一のFcポリペプチド及び1つの第二のFcポリペプチドを含むならば、互換可能に使用することができる。一般に、第一のFcポリペプチドは、第一のCH3配列を含み、第二のFcポリペプチドは、第二のCH3配列を含む。
非対称様式で導入される1つまたは複数のアミノ酸修飾を含む2つのCH3配列は、概して、2つのCH3配列が二量体化するときに、ホモ二量体よりもむしろ、ヘテロ二量体Fcをもたらす。本明細書で用いる場合、「非対称性アミノ酸修飾」とは、第一のCH3配列上の特定の位置のアミノ酸が、同じ位置の第二のCH3配列上のアミノ酸とは異なり、第一及び第二のCH3配列が、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体を形成するために優先的に対合する、任意の修飾を指す。このヘテロ二量体化は、各配列上の同じそれぞれのアミノ酸位置の2つのアミノ酸のうちの1つのみの修飾;または第一及び第二の各々のCH3配列上の同じそれぞれの位置での各配列上の両方のアミノ酸の修飾の結果であり得る。ヘテロ二量体Fcの第一及び第二のCH3配列は、1つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾を含むことができる。
表Aは、完全長ヒトIgG1重鎖のアミノ酸231〜447に対応する、ヒトIgG1 Fc配列のアミノ酸配列を提供する。アミノ酸231〜238は下方ヒンジとも呼ばれる。CH3配列は、完全長ヒトIgG1重鎖のアミノ酸341〜447を含む。
典型的には、Fcは、二量体化することができる2つの連続した重鎖配列(A及びB)を含むことができる。本明細書に記載の抗原結合構築物に関して、いくつかの実施形態では、第一のscFvは、ヘテロ二量体Fcの鎖Aに連結されており、第二のscFvは、ヘテロ二量体Fcの鎖Bに連結されている。いくつかの実施形態では、第二のscFvは、ヘテロ二量体Fcの鎖Aに連結されており、第一のscFvはヘテロ二量体Fcの鎖Bに連結されている。
いくつかの態様では、Fcのうちの一方または両方の配列は、EUナンバリングを用いた、L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400、及び/またはN390の位置で、1つまたは複数の変異または修飾を含む。いくつかの態様では、Fcは、表Xに示される変異配列を含む。いくつかの態様では、Fcは、変異体1A-Bの変異を含む。いくつかの態様では、Fcは、変異体2A-Bの変異を含む。いくつかの態様では、Fcは、変異体3A-Bの変異を含む。いくつかの態様では、Fcは、変異体4A-Bの変異を含む。いくつかの態様では、Fcは、変異体5A-Bの変異を含む。
(表A)IgG1 Fc配列及び変異体
Figure 2017504328
第一及び第二のCH3配列は、完全長ヒトIgG1重鎖のアミノ酸231〜447に関して本明細書に記載のアミノ酸変異を含むことができる。一実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、F405及びY407の位置でアミノ酸修飾を有する第一のCH3配列、及びT394の位置でアミノ酸修飾を有する第二のCH3配列を有する修飾CH3ドメインを含む。一実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、L351Y、F405A、及びY407Vから選択される1つまたは複数のアミノ酸修飾を有する第一のCH3配列、及びT366L、T366I、K392L、K392M、及びT394Wから選択される1つまたは複数のアミノ酸修飾を有する第二のCH3配列を有する修飾CH3ドメインを含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、L351、F405、及びY407の位置でアミノ酸修飾を有する第一のCH3配列と、T366、K392、及びT394の位置でアミノ酸修飾を有する第二のCH3配列とを有する修飾CH3ドメインを含み、第一または第二のCH3配列のうちの1つは、Q347の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、他方のCH3配列は、K360の位置でアミノ酸修飾をさらに含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、L351、F405、及びY407の位置でアミノ酸修飾を有する第一のCH3配列と、T366、K392、及びT394の位置でアミノ酸修飾を有する第二のCH3配列とを有する修飾CH3ドメインを含み、第一または第二のCH3配列のうちの1つは、Q347の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、他方のCH3配列は、K360の位置でアミノ酸修飾をさらに含み、前記CH3配列の1つまたは両方は、アミノ酸修飾T350Vをさらに含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、L351、F405、及びY407の位置でアミノ酸修飾を有する第一のCH3配列と、T366、K392、及びT394の位置でアミノ酸修飾を有する第二のCH3配列とを有する修飾CH3ドメインを含み、前記第一及び第二のCH3配列のうちの1つは、D399RまたはD399Kのアミノ酸修飾をさらに含み、他方のCH3配列は、T411E、T411D、K409E、K409D、K392E、及びK392Dのうちの1つまたは複数を含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、L351、F405、及びY407の位置でアミノ酸修飾を有する第一のCH3配列と、T366、K392、及びT394の位置でアミノ酸修飾を有する第二のCH3配列とを有する修飾CH3ドメインを含み、前記第一及び第二のCH3配列のうちの1つは、D399RまたはD399Kのアミノ酸修飾をさらに含み、他方のCH3配列は、T411E、T411D、K409E、K409D、K392E、及びK392Dのうちの1つまたは複数を含み、前記CH3配列のうちの1つまたは両方は、アミノ酸修飾T350Vをさらに含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、L351、F405、及びY407の位置でアミノ酸修飾を有する第一のCH3配列と、T366、K392、及びT394の位置でアミノ酸修飾を有する第二のCH3配列とを有する修飾CH3ドメインを含み、前記CH3配列のうちの1つまたは両方は、T350Vのアミノ酸修飾をさらに含む。
一実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、以下のアミノ酸修飾を含む修飾CH3ドメインを含み、「A」は、第一のCH3配列に対するアミノ酸修飾を表し、「B」は、第二のCH3配列に対するアミノ酸修飾を表す:A:L351Y_F405A_Y407V、B:T366L_K392M_T394W、A:L351Y_F405A_Y407V、B:T366L_K392L_T394W、A:T350V_L351Y_F405A_Y407V、B:T350V_T366L_K392L_T394W、A:T350V_L351Y_F405A_Y407V、B:T350V_T366L_K392M_T394W、A:T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V、及び/またはB:T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。
1つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体CH3ドメインが野生型ホモ二量体CH3ドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Fcの形成を促進することができる。一実施形態では、1つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Fcドメインが野生型ホモ二量体Fcドメインに匹敵する安定性を有する、ヘテロ二量体Fcドメインの形成を促進する。一実施形態では、1つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Fcドメインが示差走査熱量測定試験における融解温度(Tm)を介して観察された安定性を有する、ヘテロ二量体Fcドメインの形成を促進し、ここで融解温度は、対応する対称性の野生型ホモ二量体Fcドメインに関して観察されたものの4℃以内である。いくつかの態様では、Fcは、野生型ホモ二量体Fcに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Fcの形成を促進する、CH3配列のうちの少なくとも1つにおける1つまたは複数の修飾を含む。
一実施形態では、CH3ドメインの安定性は、例えば、示差走査熱量測定(DSC)によりCH3ドメインの融解温度を測定することにより評価することができる。従って、さらなる実施形態では、CH3ドメインは、約68℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、CH3ドメインは、約70℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、CH3ドメインは、約72℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、CH3ドメインは、約73℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、CH3ドメインは、約75℃以上の融解温度を有する。別の実施形態では、CH3ドメインは、約78℃以上の融解温度を有する。いくつかの態様では、二量体化CH3配列は、約68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84、または85℃、またはより高い融解温度(Tm)を有する。
いくつかの実施形態では、修飾CH3配列を含むヘテロ二量体Fcは、発現生成物におけるホモ二量体Fcと比較して少なくとも約75%の純度で形成されることができる。別の実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、約80%超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、約85%超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、約90%超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、約95%超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Fcは、約97%超の純度で形成される。いくつかの態様では、Fcは、発現されるとき、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%超の純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの態様では、Fcは、単一細胞により発現されるとき、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%超の純度で形成されるヘテロ二量体である。
ヘテロ二量体Fcの形成を促進するために単量体Fcポリペプチドを修飾するためのさらなる方法は、国際特許公開番号WO96/027011(ノブ・イントゥ・ホール(knobs into holes))に、Gunasekaran et al.(Gunasekaran K.et al.(2010)J Biol Chem.285,19637−46,electrostatic design to achieve selective heterodimerization)に,Davis et al.(Davis,JH.et al.(2010)Prot Eng Des Sel ;23(4):195−202,strand exchange engineered domain(SEED)technology)に、及びLabrijn et al [Efficient generation of stable bi−specific IgG1 by controlled Fab−arm exchange.Labrijn AF,Meesters JI,de Goeij BE,van den Bremer ET,Neijssen J,van Kampen MD,Strumane K,Verploegen S,Kundu A,Gramer MJ,van Berkel PH,van de Winkel JG,Schuurman J,Parren PW.Proc Natl Acad Sci U S A.2013 Mar 26;110(13):5145−50に記載されている。
CH2ドメイン
上に示すように、いくつかの実施形態では、抗原結合構築物のFcは、CH3ドメインに加えてCH2ドメインを含む。一例として、IgG1 FcのCH2ドメインのアミノ酸配列は、表Aに示す配列のアミノ酸239−340として同定される。FcのCH2ドメインは、Fc受容体及び補体に結合し、ゆえに、エフェクター細胞機能の媒介に関与する。
「Fc受容体」及び「FcR」という用語は、抗体のFc領域に結合する受容体を記述するために使用され、Fcガンマ受容体(FcγR)及び新生児受容体FcRnを含む。
一般に、FcγRは、IgG抗体(ガンマ受容体)に結合するものであり、ヒトにおけるFcγRI、FcγRII、及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含み、対立遺伝子の変異体及びこれらの受容体の選択的スプライス型(alternatively spliced form)を含む。FcγRII受容体は、それらの細胞質ドメインにおいて主に異なる類似のアミノ酸配列を有する、FcγRIIA(「活性化受容体」)及びFcγRIIB(「阻害受容体」)を含む。他のアイソタイプの免疫グロブリンもまた、ある特定のFcRによって結合されることができる(例えば、Janeway et al.,Immuno Biology:the immune system in health and disease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(4th ed.,1999)を参照されたい)。活性化受容体FcγRIIAは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ(ITAM)をその細胞質ドメイン内に含有する。阻害受容体FcγRIIBは、免疫受容体チロシン系阻害モチーフ(ITIM)をその細胞質ドメイン内に含有する(Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203−234(1997)).FcRs are reviewed in Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457−92(1991);Capel et al.,Immunomethods 4:25−34(1994);及び de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330−41(1995)において概説される)。将来的に同定されるものを含む他のFcγRは、本明細書において「FcR」という用語に包含される。FcγRはまた、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含むがこれらに限定されない、他の生物においても見いだされる。マウスFcγRには、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、及びFcγRIII−2(CD16−2)が含まれるがこれらに限定されない。FcγRはNK細胞またはB細胞などのエフェクター細胞によって発現される。
補体活性化は、抗原−抗体複合体への補体タンパク質C1qの結合を要する。FcのCH2ドメイン内の残基は、C1qとFc間の相互作用に関与する。
本明細書に記載の抗原結合構築物は、FcRnと結合することができる。当該技術分野で知られているように、FcRnへの結合は、エンドサイトーシスされた抗体をエンドソームから血流へと戻して再利用する(Raghavan et al.,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181−220;Ghetie et al.,2000,Annu Rev Immunol 18:739−766)。このプロセスは、完全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と合わさって、1〜3週間の範囲の好ましい抗体血清半減期をもたらす。FcRnへのFcの結合はまた、抗体輸送において重要な役割を果たす。FcRnは、胎児への母体IgGの移送を担う(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976);及びKim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。IgGへのFcRnの結合は、FcのCH2及びCH3ドメイン内の残基を必然的に含む。
CH2ドメインにおける修飾は、FcへのFcRの結合に影響を与えることができる。上に示すように、FcのCH2ドメインは、2つのCH2配列を含み、二量体Fcの2つのFcポリペプチド上にそれぞれ1つずつある。典型的には、CH2ドメインへの修飾は対称的であり、ゆえに、Fcポリペプチドの両方のCH2配列上で同一である。しかしながら、非対称性の変異は、ヘテロ二量体化を増強するCH3ドメインへの変異の存在下においても可能である。一実施形態では、CH2ドメインは、FcγRもしくはC1q結合及び/またはエフェクター機能を低減させる修飾を含む。
エフェクター機能を低減させる修飾:
FcγR及び/もしくは補体結合及び/またはエフェクター機能を低減させるFc修飾は、当該技術分野で知られている。近年の刊行物には、エフェクター活性を低減または沈黙させた抗体を遺伝子操作するために使用されている戦略が記載されている(Strohl,WR(2009),Curr Opin Biotech 20:685−691、及びStrohl,WR and Strohl LM,"Antibody Fc engineering for optimal antibody performance"In Therapeutic Antibody Engineering,Cambridge:Woodhead Publishing(2012),pp 225−249を参照されたい)。これらの戦略には、グリコシル化の修飾、IgG2/IgG4骨格の使用、またはFcのヒンジまたはCH2領域における変異の導入を介したエフェクター機能の低減が含まれる。例えば、米国特許公開第2011/0212087号(Strohl)、国際特許公開番号WO2006/105338(Xencor)、米国特許公開第2012/0225058号(Xencor)、米国特許公開第2012/0251531号(Genentech)、及びStropら((2012)J.Mol.Biol.420:204−219)には、FcへのFcγRまたは補体結合を低減させる具体的な修飾が記載されている。
FcへのFcγRまたは補体結合を減少させる、公知の対称的なアミノ酸修飾の具体的で非限定的な例には、以下の表で同定されたものが挙げられる。
(表C)Fcに対するFcγRまたは補体の結合を減少させる修飾
Figure 2017504328
一実施形態では、Fcは、上記の表において同定される少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Fcは、L234、L235、またはD265のうちの少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Fcは、L234、L235及びD265でアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Fcは、アミノ酸修飾L234A、L235A及びD265Sを含む。
いくつかの実施形態では、Fcは、国際特許出願番号PCT/CA2014/050507に記載のように、1つまたは複数の非対称性アミノ酸修飾をFcの下方ヒンジ領域において含む。FcγR結合を減少させるそのような非対称性アミノ酸修飾の例を、表Dに示す。
(表D)FcγR結合を減少させる非対称性変異
Figure 2017504328
ヒンジリンカー
本明細書に記載の抗原結合構築物では、第一のFcポリペプチドは第一のヒンジリンカーにより第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、第二のFcポリペプチドは第二のヒンジリンカーにより第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている。ヒンジリンカー配列の例は、当業者に周知であり、本明細書に記載の抗原結合構築物において使用されることができる。あるいは、既知のヒンジリンカーの修飾体を使用することができる。
ヒンジリンカーポリペプチドは、それらが抗原結合構築物の機能活性を維持するまたは最適化するように選択される。好適なリンカーポリペプチドには、上方のヒンジ配列及びコアヒンジ配列を含む、例えば、IgG、IgG、またはIgGからのものなどのIgGヒンジ領域を含む。上方及びコアヒンジ配列に対応するアミノ酸残基は、IgG型に応じて変わり、当該技術分野で知られているように、当業者は所与のIgG型に関してそのような配列を容易に同定することができるだろう。これらの例示的なリンカーの修飾体も使用することができる。例えば、IgG4ヒンジの安定性を改善するための修飾が当該技術分野で公知である(例えば、Labrijn et al.(2009)Nature Biotechnology 27,767−771を参照されたい)。ヒンジリンカー配列の例は、以下の表に見いだされる。
(表E)ヒンジリンカーポリペプチド配列(SEQ ID NO:351−360)
Figure 2017504328
解離定数(K )及び最大結合(Bmax)
いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、解離定数及び最大結合を含むがこれらに限定されない機能的特徴によって説明される。
本明細書で用いる場合、「解離定数(K)」という用語は、特定のリガンド−タンパク質相互作用の平衡解離定数を指すと意図される。本明細書で用いる場合、リガンド−タンパク質相互作用とは、これらに限定されないが、タンパク質−タンパク質相互作用または抗体−抗原相互作用を指す。Kは、より小さい成分(A+B)へと可逆的に解離するために2つのタンパク質(例えば、AB)の傾向を測定し、「オフ速度(koff)」とも呼ばれる解離速度の会合速度すなわち「オン速度(kon)」に対する比として定義される。従って、Kは、koff/konに等しく、モル濃度(M)として表される。Kが小さくなるほど、結合の親和性は強くなることが分かる。従って、1mMのKは、1nMのKと比較して弱い結合親和性を示す。抗原結合構築物のK値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗原結合構築物のKを決定する1つの方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)を用いること、典型的には、Biacore(登録商標)システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。等温滴定熱量測定(ITC)は、決定に使用することができる別の方法である。
「Bmax」、または最大結合という用語は、抗原結合構築物の飽和濃度での細胞上の最大抗原結合構築物結合レベルを指す。このパラメーターは、相対比較のために任意単位MFIで報告することができ、または標準曲線を利用して細胞に結合した抗原結合構築物の数に対応する絶対値に変換することができる。
抗原結合構築物の結合特徴は、種々の技術で決定することができる。そのうちの1つは、フローサイトメトリー(FACS、蛍光活性化セルソーティング)による抗原を発現する標的細胞への結合の測定である。典型的に、そのような実験では、対象となる抗原を発現する標的細胞を、異なる濃度で抗原結合構築物とインキュベートし、洗浄し、抗原結合構築物を検出するための二次剤とインキュベートし、洗浄し、フローサイトメーターで分析して、細胞上の検出シグナルの強度を表す中央蛍光強度(MFI)を測定し、これが今度は細胞に結合した抗原結合構築物の数に関連する。次いで、抗原結合構築物濃度対MFIデータを飽和結合式に当てはめて、2つの重要な結合パラメーターであるBmaxと見かけのKとを得る。
見かけのK、すなわち見かけの平衡解離定数は、最大半量細胞結合が観察される抗原結合構築物濃度を表す。明らかに、K値が小さいほど、より少ない抗原結合構築物濃度が最大細胞結合に到達するのに必要とされ、ゆえに抗原結合構築物の親和性はより高くなる。見かけのKは、細胞上に発現される異なる受容体レベル及びインキュベーション条件などの、細胞結合実験の条件に依存しており、ゆえに見かけのKは、SPR及びITCなどの無細胞分子実験から決定されたK値とは一般的に異なる。しかしながら、異なる方法の間で良好な一致が一般に得られる。
抗原結合構築物の調製方法
本明細書に記載の抗原結合構築物は、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて生成され得る。
一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物をコードする単離された核酸を提供する。そのような核酸は、抗原結合構築物のVLを含むアミノ酸配列及び/またはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗原結合構築物の軽鎖及び/または重鎖)をコードし得る。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター(例えば、発現ベクター)を提供する。一実施形態では、核酸は、マルチシストロン性ベクターで提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞を提供する。そのような一実施形態では、宿主細胞は:(1)抗原結合構築物のVLを含むアミノ酸配列及び抗原結合ポリペプチド構築物のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または(2)抗原結合ポリペプチド構築物のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び抗原結合ポリペプチド構築物のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクター、を含む(例えば、それらで形質転換されている)。一実施形態では、宿主細胞は、真核性であり、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはヒト胎児腎臓(HEK)細胞、またはリンパ細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施形態では、抗原結合構築物を作製する方法を提供し、前記方法は、抗原結合構築物の発現に好適な条件下で、上記に提供されるように抗原結合構築物をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び任意選択的に宿主細胞(また宿主細胞培養培地)から抗原結合構築物を回収することを含む。
抗原結合構築物の組換え生成に関して、例えば、上記のように、抗原結合構築物をコードする核酸は、単離され、宿主細胞における更なるクローニング及び/または発現のために1つまたは複数のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して(例えば、抗原結合構築物の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)、容易に単離され、配列決定され得る。
抗原結合構築物をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核または真核細胞を含む。
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に用いられる方法、例えば、直接取込み、形質導入、f交配、または当該技術分野で知られている組換え宿主細胞を作製するための他の方法にかかわらず、外来性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター、例えばプラスミドとして維持されてもよく、または代替として、宿主ゲノムに統合されてもよい。
本明細書で用いる場合、「真核生物」という用語は、動物(哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類等を含むが、これらに限定されない)、繊毛虫類、植物(単子葉植物、双子葉植物、藻類等を含むが、これらに限定されない)、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等の系統学的ドメイン(phylogenetic domain)の真核生物(Eucarya)に属する生物を指す。
本明細書で用いる場合、「原核生物」という用語は、原核の生物を指す。例えば、非真核の生物は、真正細菌(大腸菌、サーマス・サーモフィラス、バチルス・ステアロサーモフィルス、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・プチダ等を含むが、これらに限定されない)系統学的ドメイン、または古細菌(メタノコッカス・ジャナスキー(Methanococcus jannaschii)、メタノバクテリウム・サーモアウトトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、ハロフェラックス・ボルカニ(Haloferax volcanii)及びハロバクテリウム種(Halobacterium)NRC−1等のハロバクテリウム属、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、パイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、アエロピラム・ペルニクス(Aeuropyrum pernix)等を含むが、これらに限定されない)系統学的ドメインに属することができる。
例えば、抗原結合構築物は、特にグリコシル化及びFcエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において生成されてもよい。細菌における抗原結合構築物断片及びポリペプチドの発現に関しては、例えば、米国特許第5,648,237号、同第5,789,199号、及び同第5,840,523号を参照されたい(また、大腸菌における抗体断片の発現を記載するCharlton,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245−254も参照されたい)。発現後、抗原結合構築物は、可溶性画分における細菌細胞ペーストから単離され得、さらに精製されることができる。
原核生物に加えて、糸状真菌または酵母などの真核微生物は、抗原結合構築物をコードするベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主であり、それには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗原結合構築物の生成をもたらす真菌株及び酵母株が含まれる。Gerngross,Nat.Biotech.22:1409−1414(2004)、及びLi et al.,Nat.Biotech.24:210−215(2006)を参照されたい。
グリコシル化抗原結合構築物の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物(無脊椎動物及び脊椎動物)にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と合わせて使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物は、宿主としても活用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、及び同第6,417,429号(トランスジェニック植物で抗原結合構築物を生成するためのPLANTIBODIES(商標)技術を記載している)を参照されたい。
脊椎動物細胞も宿主として使用してよい。例えば、懸濁液内での増殖に順化した哺乳動物細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7);ヒト胎児腎臓株(例えば、Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)に記載されるような293または293細胞);幼ハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,Biol.Reprod.23:243−251(1980)に記載されるようなTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO-76);ヒト子宮頸癌細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCK;バッファローラット肝臓細胞(BRL3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(HepG2);マウス乳房腫瘍(MMT060562);例えば、Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44−68(1982)に記載されるようなTRI細胞;MRC5細胞;及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には、DHFR-CHO細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980);及びY0、NS0、及びSp2/0などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗原結合構築物の生成に好適な、ある特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248,(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.),pp.255−268(2003)を参照されたい。
一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、少なくとも1つの安定した哺乳動物細胞に、抗原結合構築物をコードする核酸を所定の比率でトランスフェクトすることと;少なくとも1つの哺乳動物細胞内で核酸を発現させることとを含む方法によって、安定した哺乳動物細胞内で生成される。いくつかの実施形態では、核酸の所定の比率は、発現産物中で最も高い割合(%)の抗原結合構築物をもたらす入力核酸の相対比を決定するための一過的なトランスフェクション実験で決定する。
必要とされる場合、抗原結合構築物は、発現後に精製または単離されることができる。タンパク質は、当業者に公知の様々な方法で単離または精製され得る。標準的な精製方法には、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、及び逆相を含むクロマトグラフィー技術が含まれ、大気圧または高圧でFPLC及びHPLCなどのシステムを使用して実施される。精製方法には、電気泳動、免疫学、沈殿、透析、及びクロマトフォーカシングの技術も含まれる。タンパク質濃縮と合わせて限外濾過及びダイアフィルトレーション技術も有用である。当該技術分野で周知のように、様々な天然タンパク質が、Fc及び抗体と結合し、これらのタンパク質は、抗原結合構築物の精製について本発明において用途を見出し得る。例えば、細菌のプロテインA及びGは、Fc領域に結合する。同様に、細菌のプロテインLは、いくつかの抗体のFab領域に結合する。精製は、しばしば、特定の融合パートナーにより可能にすることができる。例えば、抗体は、GST融合体が採用されている場合にはグルタチオン樹脂を、His−タグが採用されている場合にはNi+2親和性クロマトグラフィーを、flag−タグが使用されている場合には固定化抗flag抗体を使用して、精製され得る。好適な精製技術における一般的な手引きには、例えば、参照によりその全体が組み込まれるProtein Purification:Principles and Practice,3rdEd.,Scopes,Springer−Verlag,NY,1994を参照されたい。必要な精製度は、抗原結合構築物の用途に応じて異なるだろう。いくつかの例では、精製は必要ない。
ある特定の実施形態では、抗原結合構築物は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され、陰イオン交換クロマトグラフィーには、Q−セファロースカラム、DEAEセファロースカラム、ポロスHQカラム、ポロスDEAEカラム、トーヨーパールQカラム、トーヨーパールQAEカラム、トーヨーパールDEAEカラム、リソース/ソースQカラム及びDEAEカラム、Fractogel Qカラム及びDEAEカラムでのクロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製され、陽イオン交換クロマトグラフィーには、SP−セファロースカラム、CMセファロースカラム、ポロスHSカラム、ポロスCMカラム、トーヨーパールSPカラム、トーヨーパールCMカラム、リソース/ソースSカラム及びCMカラム、Fractogel Sカラム及びCMカラム、及びこれらの等価物及び同等物が含まれるが、これらに限定されない。
さらに、本明細書に記載の抗原結合構築物は、当該技術分野で公知の技術を用いて化学合成されることができる(例えば、Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman & Co.,N.Y.及びHunkapiller et al.,Nature,310:105−111(1984)を参照されたい)。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成されることができる。さらに、所望の場合、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、置換または付加としてこのポリペプチド配列に導入されることができる。非古典的アミノ酸には、通常のアミノ酸のD異性体、2,4−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、4−アミノ酪酸、Abu、2−アミノ酪酸、g−Abu、e−Ahx、6−アミノヘキサン酸、Aib、2−アミノイソ酪酸、3−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸(例えば、−メチルアミノ酸)、C−メチルアミノ酸、N−メチルアミノ酸、及び一般のアミノ酸類似体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、D(右旋性)またはL(左旋性)であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、実質的に精製されている。「実質的に精製されている」という用語は、本明細書に記載の構築物またはその変異体が、その天然の環境(すなわち体内に生じた細胞)または組換え生産された抗原結合構築物の場合の宿主細胞において見いだされるタンパク質に通常は付随するかまたはそれと相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まないことを指し、特定の実施形態においては、(乾燥重量で)約30%未満、約25%未満、約20%未満、約15%未満、約10%未満、約5%未満、約4%未満、約3%未満、約2%未満、または約1%未満の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む細胞物質を実質的に含まないことを指す。抗原結合構築物またはその変異体が宿主細胞によって組換え生産される場合、タンパク質は、ある特定の実施形態では、細胞の乾燥重量の、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、約4%、約3%、約2%、または約1%以下で存在する。抗原結合構築物またはその変異体が宿主細胞によって組換え生産される場合、タンパク質は、ある特定の実施形態では、培養培地内に、細胞の乾燥重量の約5g/L、約4g/L、約3g/L、約2g/L、約1g/L、約750mg/L、約500mg/L、約250mg/L、約100mg/L、約50mg/L、約10mg/L、または約1mg/L以下で存在する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で生成された「実質的に精製された」抗原結合構築物は、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、の純度レベル、具体的には、少なくとも約75%、80%、85%の純度レベル、より具体的には、少なくとも約90%の純度レベル、少なくとも約95%の純度レベル、少なくとも約99%またはそれ以上の純度レベルを有し、これは、SDS/PAGE分析、RP−HPLC、SEC、及びキャピラリー電気泳動などの適当な方法によって決定される。
翻訳後修飾:
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、翻訳中または翻訳後に特異的に修飾される。
本明細書で用いる場合、「修飾」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造への変化、ポリペプチドの共翻訳時修飾(co−translational modification)、または翻訳後修飾などの、所与のポリペプチドに対してなされる任意の変更を指す。書式「(修飾)」という用語は、議論されているポリペプチドが任意選択的に修飾される、つまり、議論下にあるポリペプチドが修飾または非修飾であることができることを意味する。
「翻訳後修飾」という用語は、天然または非天然アミノ酸の、ポリペプチド鎖内にそれが組み込まれた後にそのようなアミノ酸に生じる、任意の修飾を指す。この用語は、単に例として、インビボにおける共翻訳時修飾、インビトロにおける共翻訳時修飾(例えば、無細胞翻訳系)、インビボにおける翻訳後修飾、及びインビトロにおける翻訳後修飾を包含する。
いくつかの実施形態では、修飾は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基/ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または抗原結合構築物または他の細胞性リガンドへの結合のうちの少なくとも1つである。いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBHによる特異的化学的切断;アセチル化、ホルミル化、酸化、還元;ツニカマイシンの存在下での代謝合成を含むがこれらに限定されない既知の技術によって化学的に修飾される。
本明細書の抗原結合構築物のさらなる翻訳後修飾としては、例えば、N結合型またはO結合型の糖鎖(N末端またはC末端のプロセシング)、アミノ酸骨格への化学部分の付着、N結合型またはO結合型の糖鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのN末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。本明細書に記載の抗原結合構築物は、タンパク質の検出及び単離を可能にするために、検出可能な標識、例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識、または親和性標識を用いて修飾される。ある特定の実施形態では、好適な酵素標識の例として、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる;好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン/ビオチンが挙げられる;好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる;発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる;生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる;好適な放射活性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、放射性金属イオンと会合する大環状のキレーターに付着する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスによって、または当該技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって、修飾することができる。ある特定の実施形態では、同じタイプの修飾が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で同じ程度または様々な程度で存在し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物からのポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝鎖状であり、いくつかの実施形態では、分枝鎖を含むかまたは含まない環状である。環状、分枝鎖状、及び分枝した環状のポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスから生じ得るか、または合成方法によって作製され得る。修飾には、アセチル化、アシル化、ADP−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的付着、ヘム部分の共有結合的付着、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合的付着、脂質または脂質誘導体の共有結合的付着、ホスファチジルイノシトールの共有結合的付着、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的付着架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、及びユビキチン化が含まれる(例えば、PROTEINS−−STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,2nd Ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993);POST−TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1−12(1983);Seifter et al.,Meth.Enzymol.182:626−646(1990);Rattan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48−62(1992))を参照されたい)。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、固体支持体に付着し、これは、本明細書に記載のタンパク質よって結合されるか、それに結合するか、またはそれと会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリビニルクロライド、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
抗原結合構築物の機能活性のアッセイ
本明細書に記載の抗原結合構築物を、当該技術分野で公知のアッセイを用いて、またはそれを慣例的に修飾して、ならびに本明細書に記載のアッセイを用いて、機能活性(例えば、生物活性)に関してアッセイすることができる。
本明細書に記載の抗原結合構築物の生物活性を試験する方法は、実施例に記載のような様々なアッセイにより測定されることができる。そのような方法には、ヒト全血、またはPBMCを含む際の標的CD19B細胞のT細胞媒介殺傷を測定するインビトロアッセイを含む。そのようなアッセイはまた、精製されたT細胞培養物及び自己標的B細胞または腫瘍B細胞を用いて実施され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、CD19Raji B細胞とJurkat T細胞との間でシナプスを形成させかつ架橋することが可能であり、これはFACS及び/または顕微鏡検査によりアッセイされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、ヒト全血におけるCD20B細胞のT細胞誘引による殺傷(T-cell directed killing)を媒介する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、v875及び/またはv1661と比較して改善された生物物理学的特性を示し;かつ/またはv875及び/またはv1661と比較して、例えば、SEC(サイズ排除クロマトグラフィー)後に10mg/L超で発現される、改善された収率を示し;かつ/または、例えば、95%を超えるヘテロ二量体純度を示す。一実施形態では、アッセイは以下の例に記載するものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合構築物の機能的特徴は、基準の抗原結合構築物のそれと比較される。基準の抗原結合構築物の同一性は、測定される機能的特徴または作製される差異に依存する。例えば、例示的な二重特異性抗原結合構築物の機能的特徴を比較するとき、基準の抗原結合構築物は、抗CD19抗体HD37及び/または抗CD3抗体OKT3であり得る。他の実施形態では、基準の抗原結合構築物は本明細書に記載の構築物、例えば、v875及びv1661である。
OKT3またはHD37への結合を抗体が遮断する程度は、試験抗体が、その標的抗原へのOKT3またはHD37抗体(基準抗体)の特異的結合を阻害または遮断することができる競合アッセイを使用して評価することができる(アッセイの例については、Junghans et al.,Cancer Res.50:1495,1990;Fendly et al.Cancer Research 50:1550−1558;US 6,949,245を参照されたい)。競合結合アッセイにおいて測定されて、過剰量の試験抗体(例えば、少なくとも2倍、5倍、10倍、20倍、または100倍)が、基準抗体の結合を、例えば、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%阻害するまたは遮断する場合に、試験抗体は、基準抗体と競合する。競合アッセイにより同定される試験抗体(遮断抗体)は、基準抗体と同一のエピトープに結合するもの、及び基準抗体により結合されるエピトープに立体障害を生じるのに十分に近位である隣接エピトープに結合する抗体を含む。
例えば、抗原と結合する、または抗原との結合に関して別のポリペプチドと競合するか、またはFc受容体及び/または抗アルブミン抗体と結合する本明細書に記載の抗原結合構築物の能力に関してアッセイする一実施形態では、当該技術分野で公知の種々のイムノアッセイ、例えば、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射能測定アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in situイムノアッセイ(例えば、コロイド金、酵素または放射性同位体標識を使用)、ウェスタン・ブロット、沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイなどの技術を用いる競合及び非競合アッセイ系を用いることができる。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識の検出により検出される。別の実施形態では、一次抗体は、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。さらなる一実施形態では、二次抗体が標識される。イムノアッセイにおける結合を検出するための多数の手段が当該技術分野で公知であり、それらは本発明の範囲内である。
結合パートナー(例えば、受容体またはリガンド)が、本明細書に記載の抗原結合構築物により含まれる抗原結合ドメインに対して同定される、ある実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物によるその結合パートナーへの結合は、例えば、当該技術分野で周知の手段、例えば、還元及び非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、及びアフィニティーブロッティングによりアッセイされる。概して、Phizicky et al.,Microbiol.Rev.59:94−123(1995)を参照されたい。別の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物の基質に結合する抗原結合構築物タンパク質の生理学的相関物の能力は、当該技術分野で公知の技術を用いて慣例的にアッセイすることができる。
抗原結合構築物及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、薬物、例えば、毒素、化学療法剤、免疫モジュレーター、または放射性同位体にコンジュゲートされている。ADC(抗体薬物コンジュゲートまたは抗原結合構築物薬物コンジュゲート)を調製するいくつかの方法が、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第8,624,003号(ポット方法)、同第8,163,888号(一段階)、及び同第5,208,020号(二段階方法)に記載されている。
いくつかの実施形態では、薬物は、マイタンシン、アウリスタチン、カリチェアミシン、またはそれらの誘導体から選択される。他の実施形態では、薬物は、DM1及びDM4から選択されるマイタンシンである。
いくつかの実施形態では、薬物は、SMCCリンカー(DM1)またはSPDBリンカー(DM4)で抗原結合構築物にコンジュゲートされている。
いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、細胞障害剤にコンジュゲートされている。本明細書で用いる場合、「細胞障害剤」という用語は、細胞の機能を阻害するかまたは妨害する、及び/または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、及びLu177)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素などの毒素、その断片及び/またはその変異体を含むと意図される。
コンジュゲートリンカー
いくつかの実施形態では、薬物は、リンカーによって抗原結合構築物(例えば、抗体)に結合される。抗体へのリンカーの付着は、表面リジンを介して、酸化炭水化物への還元カップリング、鎖間ジスルフィド結合を還元することで遊離されるシステイン残基を介してなど様々な方法で達成することができる。ヒドラゾン系、ジスルフィド系、及びペプチド系結合を含む、様々なADC結合系が、当該技術分野で公知である。
好適なリンカーには、例えば、切断可能なリンカー及び切断不可能なリンカーが含まれる。切断可能なリンカーは、典型的には、細胞内条件下で切断を受けやすい。好適な切断可能なリンカーには、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーが含まれる。リンカーは、薬物が放出されるために抗体が細胞内で分解されなければならない程度まで、抗体に共有結合され得る、それは例えば、MCリンカーなどである。
医薬組成物
本明細書に記載の抗原結合構築物を含む医薬組成物も本明細書に提供する。医薬組成物は、当該構築物及び薬学的に許容され得る担体を含む。
「薬学的に許容され得る」という用語は、動物における、より具体的にはヒトにおける使用のために、連邦規制当局または米国政府により承認を受けたか、または米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に列挙されたことを意味する。「担体」という用語は、治療剤とともに投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、水及び油(石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源の油(例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など)を含む)などの滅菌された液体であり得る。いくつかの態様では、担体は、天然では見られない人工の担体である。水は、医薬組成物を静脈内投与する場合に、担体として使用することができる。生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射可能な溶液のための、液体担体としても使用され得る。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望の場合、少量の湿潤剤または乳化剤、またはpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤等の形態を取り得る。組成物は、従来の結合剤及び担体、例えばトリグリセリドとともに、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準担体を含み得る。好適な薬学的担体の例は、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載される。そのような組成物は、患者への適切な投与のための形態を提供するように、治療有効量の化合物を、好ましくは精製された形態で、好適な量の担体とともに含有するだろう。製剤は、投与の様式に適するべきである。
ある特定の実施形態では、構築物を含む組成物は、慣用手順に従って、ヒトへの静脈内投与のために適用された医薬組成物として、製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤及び注射の部位での痛みを緩和するリグノカインのような局部麻酔も含み得る。一般に、成分は、別々にまたは単位投薬形態で一緒に混合してのどちらかで、例えば、一定量の活性薬剤を示すアンプルまたは小袋などの密封された容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入により投与されるべき場合には、組成物は、滅菌した医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入ボトルに分配され得る。組成物が注射により投与される場合、成分が投与の前に混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、中性のまたは塩の形態として製剤化される。薬学的に許容され得る塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどのアニオンとともに形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどのカチオンとともに形成される塩が挙げられる。
治療方法
かかる治療、予防または回復が望まれる対象に、本明細書に記載の抗原結合構築物を、疾患または障害を治療する、予防する、回復させるのに有効な量で投与することを含む疾患または障害を治療する方法も本明細書に記載する。
障害及び疾患は、互換可能に使用され、本明細書に記載の抗原結合構築物または方法を用いる治療から利益を得るだろう任意の状態を指す。これは、哺乳動物を問題の障害に罹らせる病理学的状態を含む慢性及び急性の障害または疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害は癌である。
「対象」という用語は、治療、観察、または実験の対象である動物を指す。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ペット(例えば、イヌ、ネコ等)、家畜(例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等)、または実験動物(例えば、ラット、マウス、モルモット等)であり得る。
本明細書で用いる場合、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタを含むがこれらに限定されない。
「治療」は、治療される個体または細胞の自然経過を変化させることを試みる臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の経過中のいずれかで実施することができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患進行の速度の低減、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、疾患または障害の発症を遅らせるために使用される。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物及び方法は、腫瘍退縮に効果を与える。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合構築物及び方法は、腫瘍/癌増殖の阻害に効果を与える。
治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患進行の速度の低減、疾患状態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の構築構築物は、疾患の発症を遅らせるためまたは疾患の進行を遅らせるために使用される。
本明細書で用いる場合、「有効量」という用語は、投与される構築物の量であり、列挙する方法の目的を達成するだろう量、例えば、治療される疾患、状態、または障害の症状のうちの1つまたは複数をある程度軽減し得る量を指す。治療用タンパク質の異常な発現及び/または活性と関連する疾患または障害の治療、阻害及び予防において効果的であるだろう本明細書に記載の組成物の量は、標準的な臨床技術により決定することができる。さらに、インビトロアッセイは、任意選択的に採用されて、最適な投薬量の範囲を同定するのを助け得る。製剤において使用されるべき正確な用量は、投与の経路、及び疾患または障害の重篤さにも依存し、専門家の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿される。
治療用途
一態様では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、抗原結合構築物、または抗原結合構築物をコードする核酸を、1つまたは複数の疾患、障害、または状態を治療するために患者に投与することを必然的に含む、抗体に基づく治療法において使用される。
ある特定の実施形態では、癌の予防、治療または回復のための方法であって、そのような予防、治療または回復を必要とする対象に本明細書に記載の抗原結合構築物を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。
ある特定の実施形態では、それを必要とする哺乳動物において癌を治療する方法であって、哺乳動物に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を含む組成物を、任意選択的に他の薬学的に活性な分子と組み合わせて投与することを含む、前記方法である。ある特定の実施形態では、癌は、リンパ腫または白血病である。
一実施形態では、癌は、リンパ腫または白血病またはB細胞悪性腫瘍、またはCD19を発現する癌、または非ホジキンリンパ腫(NHL)またはマントル細胞リンパ腫(MCL)または急性リンパ芽球性白血病(ALL)または慢性リンパ性白血病(CLL)またはリツキシマブ−またはCHOP(cytoxan(商標)/Adriamycin(商標)ビンクリスチン/プレドニゾン療法)-耐性B細胞癌である。
さらなる態様では、本明細書に記載の抗原結合構築物は、医薬の製造または調製において使用するためのものである。一実施形態では、医薬は、癌を治療するためのものである。ある特定の実施形態では、医薬は、リンパ腫または白血病を治療するためのものである。他の実施形態では、医薬は、上記の癌を治療するためのものである。別の実施形態では、医薬は、癌を有する患者に有効量の医薬を投与することを含む、癌を治療する方法において使用するためのものである。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及び使用は、患者に有効量の少なくとも1つの追加の治療剤、例えば、細胞障害剤、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、キナーゼ阻害剤、抗血管新生薬、心保護剤、免疫賦活剤、免疫抑制剤、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)阻害剤、他の抗体、Fc融合体または免疫グロブリン、または他の治療剤を投与することをさらに含む。
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、癌を予防及び/または治療するためのものである。そのような併用療法は、併用投与(2つ以上の治療剤が同じまたは別の製剤に含まれている)、及び別々の投与、この場合は、本明細書に記載の抗原結合構築物の投与は、追加の治療剤及び/または補助剤の投与の前、同時、及び/または後に生じることができる、を包含する。
本明細書に記載の抗原結合構築物は、単独またはほかのタイプの治療(例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法及び抗腫瘍剤)と組み合わせて投与され得る。
治療活性または予防活性の実証:
本明細書に記載の抗原結合構築物または医薬組成物は、ヒトに用いる前に、所望の治療活性または予防活性に関して、インビトロで、次いでインビボで試験される。例えば、化合物または医薬組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのインビトロアッセイは、細胞株または患者組織試料に及ぼす化合物の効果を含む。細胞株及び/または組織試料に及ぼす化合物または組成物の効果は、ロゼット形成アッセイ及び細胞溶解アッセイを含むがこれらに限定されない当業者に公知の技術を利用して決定することができる。
治療的/予防的投与及び組成物:
有効量の本明細書に記載の抗原結合構築物または医薬組成物の対象への投与による治療、抑制及び予防の方法を提供する。一実施形態では、抗原結合構築物は、実質的に精製される(例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない)。ある実施形態では、対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含むがこれらに限定されない動物であり、ある特定の実施形態では、哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
様々な送達系が知られており、本明細書に記載の抗原結合構築物製剤を投与するために使用することができ、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、抗原結合構築物を発現することができる組換え細胞中のカプセル化、受容体媒介性エンドサイトーシス(例えば、Wu and Wu,J.Biol.Chem.262:4429−4432(1987)を参照されたい)、レトロウィルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築等である。導入方法としては、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合構築物は、任意の好都合な経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜内層(例えば、口腔粘膜、直腸及び小腸粘膜等)を通した吸収により投与されてよく、他の治療剤と一緒に投与されてよい。投与は、全身的または局所的であることができる。投与の好適な経路には、脳室内及び髄腔内注射が含まれる;脳室内注射は、例えばOmmayaリザーバーなどのリザーバーに取り付けられる脳室内カテーテルにより容易になり得る。例えば、吸入器またはネブライザーの使用、及びエアロゾル化剤を用いた製剤化により、肺内投与も採用することができる。
特定の実施形態では、治療を必要とする区域に局所的に本明細書に記載の抗原結合構築物または組成物を投与することが望ましい;これは、限定しないが、例えば手術中の局所注入、例えば、術後の創傷用包帯と合わせた局所適用、注射により、カテーテルにより、坐剤により、または移植により達成され得、前記移植片は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性物質であり、シラスティック膜などの膜または繊維を含む。好ましくは、本発明の、抗体を含む、タンパク質を投与するとき、タンパク質が吸収しない物質を用いるよう注意しなければならない。
別の実施形態では、抗原結合構築物または組成物は、小胞、具体的にはリポソーム中へ送達されることができる(Langer,Science 249:1527−1533(1990);Treat et al.,in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez−Berestein and Fidler(eds.),Liss,New York,pp.353−365(1989);Lopez−Berestein,同書、pp.317−327を参照されたい;一般的に同書を参照されたい)。
なおも別の実施形態では、抗原結合構築物または組成物は、制御放出系において送達されることができる。一実施形態では、ポンプを用いてよい(Langer,上記;Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987);Buchwald et al.,Surgery 88:507(1980);Saudek et al.,N.Engl.J.Med.321:574(1989)を参照されたい)。別の実施形態では、高分子物質を使用することができる(Medical Applications of Controlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984);Ranger and Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)を参照されたい;Levy et al.,Science 228:190(1985);During et al.,Ann.Neurol.25:351(1989);Howard et al.,J.Neurosurg.71:105(1989)も参照されたい)。なおも別の実施形態では、制御放出系が、治療標的、例えば脳の近位に配置されることができるため、全身用量の一部のみを要する(例えば、Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,上記、vol.2,pp.115−138(1984)を参照されたい)。
他の制御放出系は、Langer(Science 249:1527−1533(1990))による概説にて考察されている。
キット及び製品
1つまたは複数の本明細書に記載の抗原結合構築物を含むキットも記載する。キットの個々の構成要素は、個別の容器に入れられ、かかる容器に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定された形式の通知を伴うことができ、この通知は、製造、使用または販売の機関による承認を反映する。キットは、任意選択的に、抗原結合構築物に関する使用の方法または投与レジメンの概要を述べる使用説明書または指示書を含有し得る。
キットの1つまたは複数の構成要素が、溶液、例えば水溶液、または滅菌水溶液として提供されるとき、容器手段はそれ自体が、吸入器、シリンジ、ピペット、点眼びん、またはその他の類似の器具であり得、それから溶液が対象に投与され得るまたはキットの他の構成要素に適用され得る及びキットの他の構成要素と混合され得る。
キットの構成要素はまた、乾燥または凍結乾燥した形態において提供されてよく、キットは、凍結乾燥した構成要素を再構成するための好適な溶媒を追加で含有することができる。容器の数またはタイプにかかわらず、本明細書に記載のキットは、患者への組成物の投与を援助するための器具も含んでよい。そのような器具は、吸入器、鼻内噴霧デバイス、シリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン、点眼びん、または類似の医学的に承認された送達ビヒクルであり得る。
本明細書に記載の別の態様では、上記の障害の治療、予防及び/または診断に有用な物質を含有する製品を提供する。製品は、容器、及び容器上にまたは容器に伴うラベルまたは添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、IV溶液袋等が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成され得る。容器は、単独の組成物、または状態を治療、予防、及び/または診断するために有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、皮下注射針により刺し貫かれ得る栓を有する静脈内溶液袋またはバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性剤は、本明細書に記載のT細胞活性化抗原結合構築物である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択された状態を治療するために使用されるということを示す。さらに、製品は、(a)本明細書に記載の抗原結合構築物を含む組成物を含有する第一容器;及び(b)さらなる細胞障害剤またはそうでなければ治療剤を含む組成物を含有する第二容器を含み得る。本明細書に記載のこの実施形態における製品は、組成物が特定の状態を治療するために使用されることができるということを示す添付文書をさらに含み得る。あるいはまたは加えて、製品は、薬学的に許容され得る緩衝液、例えば注射用静菌性水(BWFI)、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二(または第三)の容器をさらに含み得る。それは、他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの見地から望ましい他の物質をさらに含み得る。
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書に記載の抗原結合構築物は、少なくとも1つのポリペプチドを含む。本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、典型的には単離されている。
本明細書で用いる場合、「単離された」は、その天然細胞培養環境の構成成分から同定され、分離され、及び/または回収されている薬剤(例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド)を意味する。その天然環境の夾雑構成成分は、抗原結合構築物に関する診断的または治療的使用を妨げ得る物質であり、酵素、ホルモン及びその他のタンパク様または非タンパク様溶質を含み得る。単離は、例えば、ヒト介入を介して、合成的に生成されている薬剤も指す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換可能に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。つまり、ポリペプチドに対する記述は、ペプチドの記述及びタンパク質の記述に等しく適用され、その逆もまた同様である。これらの用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー、ならびに1つまたは複数のアミノ酸残基が非天然にコードされるアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書で用いる場合、これらの用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結される。
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、20個の一般的なアミノ酸(アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン(praline)、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン)及びピロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基に結合するα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)、または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸への言及には、例えば、天然に生じるタンパク新生L−アミノ酸;D−アミノ酸、化学的に修飾されたアミノ酸、例えば、アミノ酸変異体及び誘導体;天然に生じる非タンパク新生アミノ酸、例えば、βアラニン、オルニチン等;及びアミノ酸の特徴であると当該技術分野において知られている性質を有する化学的に合成された化合物を含む。非天然に生じるアミノ酸の例としては、αメチルアミノ酸(例えば、αメチルアラニン)、D−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸(例えば、2−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン)、余分なメチレンを側鎖に有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸(例えばシステイン酸)が挙げられるが、これらに限定されない。合成の非天然アミノ酸、置換されたアミノ酸、または1つまたは複数のD−アミノ酸を含む、非天然アミノ酸を本発明のタンパク質に組み込むことは、多くの異なる意味において有利であり得る。D−アミノ酸含有ペプチド等は、L−アミノ酸含有対応物と比較して、インビトロまたはインビボにおいて増加した安定性を呈する。ゆえに、D−アミノ酸を組み込んだ、ペプチドの構築等は、細胞内でのより高い安定性が望まれるか必要とされる場合、特に有用であることができる。より具体的には、D−ペプチド等は、内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性を示し、それにより、このような特性が望ましいときに、分子のバイオアベイラビリティを改善し、インビボにおける寿命を延長する。加えて、D−ペプチド等は、Tヘルパー細胞への、主要組織適合性複合体クラスIIの拘束性提示のために効率良く処理されることができず、従って、全生物において体液性免疫応答を誘導する可能性が低い。
本明細書においてアミノ酸は、IUPAC−IUB生化学命名法委員会が推薦する、それらの一般的に知られた3文字表記または1文字表記のどちらかによって示され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に許容されている1文字コードによって示され得る。
抗原結合構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本明細書に記載する。「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、2つ以上のヌクレオチド分子の連続した区間を示すと意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、cDNA、RNA、半合成または合成起源のもの、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、及び一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然に生じるヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途具体的に限定されない限り、この用語は、PNA(ペプチド核酸)を含むオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術に使用されるDNAの類似体(ホスホロチオエート、ホスホロアミダート等)も指す。別途指示されない限り、特定の核酸配列は、それらの保存的に修飾された変異体(縮重コドン置換体を含むが、これに限定されない)、及び相補的配列、ならびに明確に示された配列も、潜在的に包含する。具体的には、1つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの第3位が、混合された塩基及び/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、縮重コドン置換体が達成され得る(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605−2608(1985);Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91−98(1994))。
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、GCA、GCC、GCG、及びGCUのコドンは全て、アミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、コドンによってアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、記載された対応するコドンのいずれかへコドンを変化させることができる。そのような核酸の変異は「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能性のあるサイレント変異を表している。当業者は、機能的に同一の分子が得られるように、核酸における各コドンが修飾され得ることを理解するだろう(メチオニンに対する通常唯一のコドンであるAUG、及びトリプトファンに対する通常唯一のコドンであるTGGは除く)。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
アミノ酸配列に関しては、コードされた配列内の単一アミノ酸または数%のアミノ酸を変更、付加、または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、その変更が、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似するアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす「保存的に修飾された変異体」であることを当業者は理解するだろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当業者に公知である。そのような保存的に修飾された変異体は、本明細書に記載の多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に加えられるものであり、それらを排除するものではない。
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は当業者に公知である。以下の8群は、それぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、トレオニン(T);及び8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W H Freeman & Co.;2nd edition(December 1993)を参照されたい。
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、2つ以上の配列またはサブ配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズム(または当業者に利用可能な他のアルゴリズム)の1つを使用して測定するか、または手動で整列させて目視検査により測定して、配列を比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大限に対応するように比較及び整列させるときに、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドのある割合(%)を配列が有する(すなわち、特定の領域にわたって約60%同一性、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、または約95%同一性)場合、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補性にも言及する。同一性は、少なくとも約50アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、または75〜100アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって、または、指定されない場合は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列全体にわたって存在することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識されたプローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングする工程と、前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長cDNA及びゲノムクローンを単離する工程とを含むプロセスによって、ヒト以外の種からのホモログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得られ得る。そのようなハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知である。
配列比較については、典型的に、一方の配列を基準配列として、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験配列及び基準配列をコンピューターに入力し、サブ配列の座標を指定し、必要に応じて配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。プログラムのデフォルトのパラメーターを使用することができ、または代替のパラメーターを指定することができる。そして、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメーターに基づいて基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
本明細書で用いる場合、「比較ウィンドウ」は、20〜600、一般的に約50〜約200、より一般的に約100〜約150からなる群より選択される、いくつかの連続する位置のいずれか1つの区分への参照を含み、ここにおいて配列は、2つの配列が最適に整列された後に、連続する位置の同数の基準配列と比較され得る。比較のための配列整列の方法は、当業者に公知である。比較のための最適な配列整列は、これに限定されないが、Smith and Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482cの局所相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444の類似性探索方法により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.の中のGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)により、または手動での整列及び目視の検査(例えば、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1995補遺)を参照されたい)により、行うことができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、それぞれ、Altschul et al.(1997)Nuc.Acids Res.25:3389−3402及びAltschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403−410に記載されているBLAST及びBLAST2.0アルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、www.ncbi.nlm.nih.govにて利用可能である全米バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。BLASTアルゴリズムのパラメーターであるW、T、及びXは、整列の感度及び速度を決定する。(ヌクレオチド配列用の)BLASTNプログラムは、11の語長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=−4、及び両鎖の比較を、規定値として使用する。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムは、3の語長、10の期待値(E)、及びBLOSUM62スコアリングマトリクス(Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915を参照されたい)の50のアライメント(B)、10の期待値(E)、M=5、N=−4、及び両鎖の比較を、規定値として使用する。BLASTアルゴリズムは、典型的に「低複雑性」フィルタをオフにして実施される。
BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計分析も実施する(例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5787を参照されたい)。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の尺度の1つは、最小合計確率(P(N))であり、これは2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間に偶然に一致が生じ得る確率の指標を提供する。例えば、基準核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約0.2未満、または約0.01未満、または約0.001未満であるとき、核酸は基準配列に類似するとみなされる。
「に選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物(細胞全体、ライブラリーDNA、またはRNAを含むが、これらに限定されない)内に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列に対してのみ分子が結合すること、二重鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることを指す。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該技術分野において知られているような低イオン強度及び高温の条件下における、DNA、RNA、または他の核酸の配列、またはそれらの組合せのハイブリダイゼーションを指す。典型的には、ストリンジェントな条件下において、プローブは、核酸の複合混合物(細胞全体、ライブラリーDNA、またはRNAを含むが、これらに限定されない)中のその標的サブ配列とハイブリダイズし得るが、この複合混合物中の他の配列とはハイブリダイゼーションしない。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境においては異なるだろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−−Hybridization with Nucleic Probes,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)に見られる。
本明細書で用いる場合、「遺伝子操作する、遺伝子操作された、遺伝子操作すること」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、または天然に生じるポリペプチドまたは組換えポリペプチドまたはその断片の翻訳後修飾を含むとみなされる。遺伝子操作することは、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、ならびにこれらのアプローチの組合せを含む。遺伝子操作されたタンパク質は、標準的な分子生物学技術により発現及び生成される。
「単離された核酸分子またはポリヌクレオチド」とは、その天然環境から取り出されている核酸分子、DNAまたはRNAを意図する。例えば、ベクター中に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、単離されたと見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞中に保持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の(部分的または実質的に)精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞中に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたRNA分子は、インビボまたはインビトロRNA転写体、ならびにプラス鎖及びマイナス鎖の形態、及び二本鎖形態を含む。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、例えばPCRまたは化学合成を介して合成的に生成されるこのような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ある実施形態では、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントを含む。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」という用語は、一般的に、例えば米国特許第4,683,195号に記載されているように、インビトロでの所望のヌクレオチド配列を増幅するための方法を指す。概して、PCR法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマー伸長合成の反復周期を必然的に含む。
本発明の基準ヌクレオチド配列と、少なくとも、例えば、95%「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチド当たり5つまでの点変異を含み得ることを除いて、当該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が基準配列と同一である、ということを意図する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを獲得するためには、基準配列中のヌクレオチドの5%までが欠失されるか、または別のヌクレオチドで置換されるか、または基準配列中の総ヌクレオチドの5%までの数のヌクレオチドが基準配列中に挿入されてよい。基準配列のこれらの変更は、基準ヌクレオチド配列の5'または3'末端位置で、またはそれらの末端位置間のどこかで起こり得、基準配列中の残基中に個別に散在するかまたは基準配列内の1つまたは複数の連続群内に散在する。実際には、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラム、例えばポリペプチドに関して上記されたもの(例えば、ALIGN−2)を用いて慣用的に決定することができる。
ポリペプチドの誘導体または変異体は、誘導体または変異体のアミノ酸配列が元のペプチドからの100アミノ酸配列と少なくとも50%の同一性を有する場合、そのペプチドと「相同性」を有する、または「相同である」と言われる。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかのものと少なくとも75%同一である。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかのものと少なくとも85%同一である。ある特定の実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも90%同一である。いくつかの実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも95%同一である。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかのものと少なくとも99%同一である。
本明細書で用いる場合、「修飾」という用語は、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造への変化、ポリペプチドの共翻訳時修飾、または翻訳後修飾などの、所与のポリペプチドに対してなされる任意の変更を指す。書式「(修飾)」という用語は、議論されているポリペプチドが任意選択的に修飾される、つまり、議論下にあるポリペプチドが修飾または非修飾であることができることを意味する。
いくつかの態様では、抗原結合構築物は、本明細書に開示の表またはアクセッションナンバーに記載した関連するアミノ酸配列またはその断片と少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、単離された抗原結合構築物は、本明細書に開示の表またはアクセッションナンバーに記載した関連するヌクレオチド配列またはその断片に少なくとも80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100%同一であるポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、特許請求対象物が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書中の用語に関して複数の定義が存在する事象では、本節における定義が優勢である。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化し得、インターネット上の特定情報は移り変わり得るが、インターネット検索により等価の情報が見出され得ることが理解されたい。それを参照することは、このような情報の利用可能性及び公的普及を立証する。本明細書において明らかに異なるように定義されない限り、抗体技術分野の当業者により理解される用語は、当該技術分野で獲得された意味をそれぞれ与えられる。
一般的記述及び以下の詳細な記述は、単に例示的及び解説的なものであって、特許請求されるいかなる対象物をも限定するものではないことを理解されたい。
この出願において、単数形の使用は、特に別段の記載がない限り、複数形を含む。
本発明の記述において、任意の濃度範囲、割合(%)範囲、比率範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を、そして適切な場合には、その分数(例えば、整数の10分の1及び100分の1)を含むことを理解されたい。本明細書で用いる場合、「約」は、別段の指示がない限り、指示される範囲、値、配列または構造の±10%を意味する。「a」及び「an」という用語は、本明細書で用いる場合、別段の指示がない限り、またはその文脈により指図されない限り、列挙された構成成分のうちの「1つまたは複数」を指すことを理解されたい。選択肢(例えば「または」)の使用は、選択肢のうちの1つ、両方、またはその任意の組合せを意味することが理解されたい。本明細書で用いる場合、「含む(include)」及び「含む(comprise)」という用語は、同義的に用いられる。加えて、本明細書に記載される構造及び置換基の種々の組合せに由来する個々の一本鎖ポリペプチドまたは免疫グロブリン構築物は、各一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体が個別に記述されるのと同程度に、本出願により開示されることが理解されたい。従って、個々の一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成するための特定の構成成分の選択は、本発明の開示の範囲内である。
本明細書で用いられる節の見出しは、系統化を目的とするに過ぎず、記載される対象物を限定すると意図されるべきでない。
本明細書に記載の方法及び組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、構築物及び試薬に限定されず、それ自体変化し得ることが理解されたい。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載することを目的とするに過ぎず、本明細書に記載の方法及び組成物の範囲を限定することを意図せず、これは、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるということも理解されたい。
本出願中で引用される全ての文書または文書の一部には、これらに限定されないが、特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル及び学術論文が含まれ、任意の目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。本出願において言及される全ての刊行物及び特許は、例えば、本明細書に記載の方法、組成物及び化合物とともに使用され得る刊行物中に記載の構築物及び方法論を記載及び開示する目的のために、それらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書において何事も、本明細書に記載の発明人が先行発明のために、または任意の他の理由のために、かかる開示に先行する権利がないという承認として解釈されるべきではない。
以下の具体的及び非限定的な例は、単なる例証として解釈されるものであって、いかなる点においても本発明の開示を限定するものではない。さらなる詳細な検討の必要もなく、本明細書中の記載に基づいて、当業者は本発明の開示を最大限利用することができると考えられる。本明細書で引用される刊行物はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。URLまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変化し得、インターネット上の特定情報は移り変わり得るが、等価情報はインターネット検索により見出され得ることが理解されたい。それを参照することは、このような情報の利用可能性及び公的普及を立証する。
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示を目的とするに過ぎず、それに鑑みて、種々の修正または変更が当業者に示唆され得、本出願の精神及び範囲内に、及び添付の特許請求の範囲内に含まれるべきものであることが理解されたい。
実施例1.抗原結合構築物及び対照の設計、発現及び精製
図1は、抗原結合構築物の設計の概略図を示す。図1Aは、エフェクター機能を媒介することができるFcを有する例示的なCD3−CD19抗原結合構築物を図示する。当該抗原結合構築物の抗原結合ドメインは両方ともscFvであり、各scFvのVH及びVL領域はポリペプチドリンカーにより接続されている。各scFvはまた、ヒンジポリペプチドによりヘテロ二量体Fcの一方のポリペプチド鎖に接続されている。当該抗原結合構築物の当該2つのポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている(破線として示す)。図1Bは、Fcがノックアウトされている例示的なCD3−CD19抗原結合構築物を図示する。このタイプの抗原結合構築物は、FcγR結合を除去するFcのCH2領域への修飾を含むことを除き、図1Aに示すものと類似する。ゆえに、これらの構築物は、治療上妥当な濃度でFcエフェクター機能を媒介することができない。
いくつかの二重特異性抗CD3−CD19抗体を、表1に記載するように調製した。抗CD3または抗CD19 scFvの説明がBiTEへの参照を含む場合、これは、抗CD3または抗CD19 scFvが、下記に示すように、可変重鎖及び軽鎖の向き(例えばVH−VL)への修飾を伴ってまたは伴わずに、抗CD3抗CD19BiTE(商標)分子(ブリナツモマブ)のVH及びVLの配列と同一のアミノ酸配列を有することを示す。別段の指示がない限り、αCD19_HD37 scFv及びαCD3_OKT3 scFvについては、N末端からC末端へのVL及びVH領域の順序はVLVHである。
(表1)変異体、鎖A、鎖B、Fc
Figure 2017504328
Figure 2017504328
−Het Fc1=鎖A:L351Y_F405A_Y407V;鎖B:T366L_K392M_T394W(IgG1 Fcに対するEUナンバリングシステム)
−Het Fc2=鎖A:T350V_L351Y_F405A_Y407V;鎖B:T350V_T366L_K392L_T394W
−FcγR KO1=鎖A:L234A_L235A;鎖B:L234A_L235A
−FcγR KO2=鎖A:D265S_L234A_L235A;鎖B:D265S_L234A_L235A
−αCD19_HD37 scFv−別段の指示がない限り、可変領域のNからC末端への順序はVL/VHである。
−αCD3_OKT3 scFv−別段の指示がない限り、可変領域のNからC末端への順序はVL/VHである。VLVHは、(GGGGS)3リンカーにより接続されている。
−αCD3_BiTE scFv−可変領域のNからC末端への順序はVH/VLであり、リンカー及び組成はブリナツモマブと同一である。
−(VLVH SS)または(VHVL SS)は、scFvのVHとVL間にジスルフィド連結を導入するために、Kabatナンバリングシステムに準じ、公表されたVH44位及びVL100位を活用するジスルフィド安定化scFvを示す[Reiter et al.,Nat.Biotechnol.14:1239−1245(1996)]。
−(CDRC→S)−下記に参照されるようにOKT3のH3 CDRにおける変異を示す。
−(VHVLリンカー)−リンカー
Figure 2017504328
により接続されるVH及びVLを示す。
Fcナンバリングは、EU抗体のナンバリングを参照するKabatのように、EUインデックスに準じる(Edelman et al.,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78−85);Fabまたは可変ドメインナンバリングは、Kabat(Kabat and Wu,1991;Kabat et al,Sequences of proteins of immunological interest.5th Edition−US Department of Health and Human Services,NIH publication no.91−3242,p 647(1991)))に準じる。
表1に記載の変異体は、初期設計である変異体875を含み、これは改善された収率及び生物物理学的特性を有する抗原結合構築物を生成するための開始点として使用した。修飾は、VLVHジスルフィド遺伝子操作及び/または安定化CDR変異の付加によるscFvの安定化を含む。全ての変異体は、ヘテロ二量体Fc(Het Fc1またはHet Fc2)を含み、Fcエフェクター活性を消すためのCH2ドメインにおける変異(FcγR KO1またはFcγR KO2)を有するまたは有さずに発現されることができる。Fcへのこの修飾を含む変異体は、FcノックアウトまたはFc KOを有すると称される。
変異体875、1661、1653、1662、1660、1666、1801、及び1380は、開発されたCD3−CD19抗原結合構築物の初期設計であり、一方で変異体6747、10149、及び12043は、CD3−CD19抗原結合構築物の収率及び生物物理学的特性をさらに改善するように設計された修飾を含む設計を例示する。変異体N1、N3及びN10も設計されており、これらの変異体の生物物理学的及び機能的特徴は本明細書に提供するデータから予測することができる。
CD3及びCD19 scFvの両方についてのVHVLジスルフィド遺伝子操作戦略は、scFvのVHとVLの間にジスルフィド連結を導入するために、Kabatナンバリングシステムに準じて、公表されたVH44位及びVL100位を活用した[Reiter et al.,Nat.Biotechnol.14:1239−1245(1996)]。αCD3 OKT3 scFvのH3 CDRにおけるCからSへの変異は、Kipryanov et al.,in Protein Engineering 10:445−453(1997)に記載されるように生成された。
表1から選択された変異体を調製し、これらの変異体の対応する配列組成を表2に示す。
(表2)二重特異性CD3−CD19抗原結合構築物及び対照の配列組成
Figure 2017504328
クローニング及び発現
抗体及び抗体対照を、以下のようにクローニングし、発現した。抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子は、ヒト/哺乳動物発現に最適化されたコドンを使用する遺伝子合成を介して構築された。scFv−Fc配列は、既知の抗CD3及びCD19 scFv BiTE(商標)抗体(Kipriyanov et.al.,1998,Int.J Cancer:77,763−772)、抗CD3モノクローナル抗体OKT3(Drug Bank参照番号:DB00075)から生成された。
最終遺伝子産物を哺乳動物発現ベクターpTT5(NRC−BRI,カナダ)へとサブクローニングし、CHO細胞において発現した(Durocher,Y.,Perret,S.& Kamen,A.High−level and high−throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension−growing CHO cells.Nucleic acids research 30,E9(2002))。
CHO細胞を、対数増殖期(1.5から2百万細胞/mL)に水溶性の1mg/mLの25kDaポリエチレンイミン(PEI,Polysciences)と、2.5:1のPEI:DNA比率でトランスフェクトした(Raymond C.et al.A simplified polyethylenimine−mediated transfection process for large−scale and high−throughput applications.Methods.55(1):44−51(2011))。ヘテロ二量体を形成するための最適濃度範囲を決定するために、DNAを、ヘテロ二量体形成を可能にする最適DNA比率の重鎖A(HC−A)と重鎖B(HC−B)でトランスフェクトした(例えば、HC−A/HC−B/比率=50:50%)。トランスフェクトした細胞を、4000rpmでの遠心分離後に収集された培養培地と共に5〜6日後に回収し、0.45μmフィルタを使用して清澄化した。
清澄化培養培地をMabSelect SuRe(GE Healthcare)プロテインAカラムに充填し、10カラム体積のPBS緩衝液、pH7.2で洗浄した。抗体を10カラム体積のクエン酸緩衝液、pH3.6で溶出し、抗体を含有するプール画分をpH11のTRISで中和した。次いで、Econo−Pac 10DGカラム(Bio−Rad)を使用してタンパク質を脱塩した。
いくつかの場合では、タンパク質をゲル濾過によってさらに精製し、3.5mgの抗体混合物を1.5mLに濃縮し、1mL/分の流速でAKTA Express FPLCを介してSuperdex 200HiLoad 16/600 200pgカラム(GE Healthcare)に充填した。pH7.4のPBS緩衝液を1mL/分の流速で用いた。精製抗体に対応する画分を収集し、約1mg/mLに濃縮し、−80℃で保存した。
プロテインAによる精製後に、プロテインLクロマトグラフィーを使用する追加の精製工程が以下のような方法によって実施され得る。Capto L樹脂をPBSで平衡化し、変異体を該樹脂に添加して室温で30分間インキュベートした。樹脂をPBSで洗浄し、結合タンパク質を0.5mlの0.1Mグリシン、pH3で溶出した。この追加の工程は、図2Cの結果を得るために使用された製造方法には含まれなかった。
最終産物の純度及び収率は、下記のようにLC/MS及びUPLC−SECにより推測された。
ヘテロ二量体純度のLC−MS分析
精製試料を、37℃で6時間、PNGase Fで脱グリコシル化した。MS分析の前に、試料をPoros R2カラム上に注射して、20〜90%ACN、0.1%FAを用いた勾配にて3分間溶出して、1つの単一ピークを結果得た。
LCカラムのピークを、以下の設定を用いてLTQ−Orbitrap XL質量分光計で分析した:Cone電圧:50V'Tubeレンズ:215V;FT解像度:7,500。質量スペクトルを、ソフトウェアPromassまたはMax Ent.で積分して、分子量プロファイルを作成した。
UPLC−SEC分析
0.4ml/分で30℃に設定したWaters BEH200 SECカラム(2.5mL、4.6×150mm、ステンレススチール、1.7μm粒子)を使用して、UPLC−SEC分析を行った。実行時間は7分で構成され、1回注入当たりの総体積は2.8mLで、実行緩衝液は、25mMリン酸ナトリウム、150mM酢酸ナトリウム、pH7.1;及び150mMリン酸ナトリウム、pH6.4〜7.1であった。吸光度による検出を190〜400nmで行い、蛍光による検出は280nmで励起し300〜360nmから発光を収集して行った。ピーク積分を、Empower 3ソフトウェアにより分析した。
全ての変異体は発現され、ホモ二量体を汚染することなく、95%超のヘテロ二量体純度まで精製された。
変異体875、1661、1653、1666、10149、及び12043の収率及びヘテロ二量体純度を図2Cに示す。
変異体10149についてのプロテインA精製後のゲルろ過(GFC)プロファイルを図2Aの上方パネルに示し、一方で下方パネルは、プールしたGFC画分のSECプロファイルを示す。図2Bの上方パネルは、変異体1661についてのプロテインA精製後のゲルろ過(GFC)プロファイルを示し、一方で、下方パネルは1661についてのプールしたGFC画分のSECプロファイルを示す。図2Cは、1661と比較して10149の改善された収率及びヘテロ二量体純度を示す。
示差走査熱量測定による安定性の評価
CD3−CD19抗原結合構築物の安定性は、示差走査熱量測定(DSC)により融解温度(Tm)を決定することにより評価した。全てのDSC実験は、GE VP−毛細管計器を用いて実施された。タンパク質をPBS(pH7.4)中に緩衝液交換して0.3〜0.7mg/mLに希釈し、0.137mLを試料細胞中に充填し、1℃/分の走査速度にて20〜100℃で測定した。PBS緩衝液バックグラウンドを差し引いて、Originソフトウェア(GE Healthcare)を使用してデータを分析した。
変異体875、1661、1666、10149、及び12043についての結果を図2Cに示す。
初期変異体1661は、pA後のGFCプロファイルにおいて明らかなように、低い発現及びプロテインA後収率、及び大量の高分子量凝集物示した(図2B及び2C)。より低い発現及び高分子量凝集物の傾向は、種々の方法を使用するscFv安定性遺伝子操作により最適化され、その方法はリンカーの最適化、VHVLの向き、ジスルフィド遺伝子操作及びCDR移植によるscFv安定化を含み、それはscFv発現及び安定性の異なる態様を扱う。
変異体1666及び1380に例示されるようなscFvリンカー及びVHVLの向きの違いは、発現及び収率における有意な改善をもたらさなかった。ジスルフィド遺伝子操作によるscFvの安定化は、発現及びプロテインA後収率を改善しなかったが、変異体10149についてのGFCプロファイルに示すように(図2B及び2C)高分子量凝集物の量を有意に減少させ、最終収率を増加させた。
CD19 scFvのヒト化及びCDR移植による安定化は、全体的に改善された発現及びプロテインA後力価及びscFv熱安定性をもたらし、これは図2Cに示される変異体12043についてのデータにより示される。
初期変異体1661は、pA後のGFCプロファイルにおいて明らかなように、低い発現及びプロテインA後収率、及び大量の高分子量凝集物を示した(図2B及び2C)。より低い発現及び高分子量凝集物の傾向は、種々の方法を使用するscFv安定性遺伝子操作により最適化され、その方法はリンカーの最適化、VHVLの向き、ジスルフィド遺伝子操作及びCDR移植によるscFv安定化を含み、それはscFv発現及び安定性の異なる態様を扱う。
変異体1666及び1380に例示されるようなscFvリンカー及びVHVLの向きの違いは、発現及び収率における有意な改善をもたらさなかった。ジスルフィド遺伝子操作によるscFvの安定化は、発現及びプロテインA後収率を改善しなかったが、変異体10149についてのGFCプロファイルに示すように(図2B及び2C)高分子量凝集物の量を有意に減少させ、最終収率を増加させた。
CD19 scFvのヒト化及びCDR移植による安定化は、全体的に改善された発現及びプロテインA後力価及びscFv熱安定性をもたらし、これは図2Cに示される変異体12043についてのデータにより示される。
図2Cにまとめられているように、scFvの精製後収率、ヘテロ二量体純度及び熱安定性の分析は、ジスルフィド遺伝子操作(v10149)、及びCD19 scFvのヒト化及び安定化(v12043)による安定化は、収率及び熱安定性における有意な改善をもたらし、一方でVL−VHの向き及びリンカー組成の変更は効果がなかったことを示す。
実施例2:Raji及びJurkat細胞へのCD3−CD19抗原結合構築物の結合
CD19−及びCD3−発現細胞に結合する二重特異性変異体875及び1661の能力を、下記のようにFACSにより評価した。
FACSプロトコルによるホールセル結合:
2×10細胞/mlの細胞(80%超の生存力)を、L10+GS1培地中に再懸濁して、抗体希釈液と混合し、氷上で1時間インキュベートした。10mlの冷却R−2緩衝液を添加することにより細胞を洗浄し、4℃で10分間、233×gで遠心分離した。細胞ペレットを100μl(L10+GS1培地中の1/100希釈液)の蛍光標識化抗マウスまたは抗ヒトIgGとともに再懸濁して、室温で1時間インキュベートした。次いで、上記のように10mlの冷却R−2を添加することにより細胞を洗浄し、細胞ペレットを400μlの冷却L−2と再懸濁し、試料を、Nitexを通して濾過し、4μlのヨウ化プロピジウムを含有する試験管に添加した。
試料を、フローサイトメトリーにより分析した。
表3は、このアッセイにおいて試験された全ての変異体が同等の親和性でCD19Raji B細胞に結合すること、及び同等の親和性でCD3Jurkat T細胞に結合することを示す、結果の概要を提供する。全ての変異体は、高い親和性でRaji B細胞に結合し、より低い親和性でJurkat T細胞に結合した。低いT細胞親和性は、1つのT細胞が複数の標的細胞を殺傷することを可能にする一連のTCR誘発プロセスにとって重要である可能性が非常に高い。
実施例3:FACS及び顕微鏡検査によるT細胞及びB細胞の架橋及びシナプス(仮足)形成の分析
T細胞シナプス及び仮足の形成を媒介する例示的な変異体の能力を以下のように評価した。このアッセイにおいて試験された変異体は、875及び1661を含んだ。
FACSによるホールセル架橋:
RPMI中に懸濁された1×10細胞/mlを、0.3μMの適切なCellTrace標識で標識して、混合し、37℃で25分間、水浴中でインキュベートした。
ペレットを2mlのL10+GS1+NaN中に再懸濁して、最終濃度を5×10細胞/mlとした。細胞懸濁液をフローサイトメトリーにより分析して(1/5希釈液)、適切な細胞標識及びレーザー設定を確認した。Flow−check及びflow−set Fluorospheresを使用して、計器標準化、光学的アラインメント及び流体工学を確認した。フローサイトメトリー確認後、及び架橋前に、各細胞株を所望の比率で、最終濃度1×10細胞/mlで混合した。Jurkat−バイオレット+RAJI−FarRedによりT:B架橋を評価した。
抗体を室温でL10+GS1+NaN中で二倍に希釈し、次いで、細胞に添加し、その後、静かに混合して、30分間インキュベートした。30分間のインキュベーションの後、2μlのヨウ化プロピジウムを添加し、ゆっくり混合して、フローサイトメトリーにより直ちに分析した。B:T架橋率(%)は、バイオレット及びFar−Redの同時標識事象の割合(%)として算出され、バックグラウンドに対する倍率は、培地のみの場合の架橋率(%)に対する変異体による架橋率(%)の割合として算出された。
顕微鏡検査によるシナプス(仮足)形成の分析:
標識したRaji B細胞及び標識したJurkat T細胞を、室温で30分間、3nMのヒトIgGまたは変異体とともにインキュベートした。細胞懸濁液を遠心分離により濃縮し、その後180μlの上清を除去した。細胞を残りの体積中に再懸濁して、200倍及び400倍で撮像した。Openlabソフトウェアを使用して、顕微鏡検査画像(200倍)を獲得し、疑似色付けし、オーバーレイし、TIFFに変換した。次いで、Image Jソフトウェアのセルカウンターを使用して細胞を計数し、5つの異なる集団に分類した。
1.T単独(T:Tも含む)
2.Bと会合するT(仮足無し)
3.Bと会合するT(仮足有り、すなわち三日月のような構造を示すT細胞)
4.B単独(B:Bも含む)
5.Tと会合するB
いくつかの細胞について、Openlabソフトウェアにおける元画像及び位相画像の見直しが適切な分類に必要だった。次いで、B細胞と会合する総T細胞の割合(%)、仮足を有するB細胞と会合する総T細胞の割合(%)、仮足を有するB細胞と会合するT細胞の割合(%)、T細胞と会合するB細胞の割合(%)及び全体的なB:T率(%)が決定され得る。
結果は図3に示され、3nMで、変異体875及び1661が、1:1の化学量論でCD19Raji B細胞及びJurkat T細胞を架橋してT細胞シナプス(仮足)を形成させることができたことを実証した。架橋されたT:B細胞の80%超が、シナプス形成を示す仮足を呈した。このデータは、変異体875及び1661がRajiリンパ腫B細胞及びJurkat T細胞を架橋し、T細胞媒介性標的細胞溶解の前提条件及び指標としてT:B細胞シナプスを誘発することができることを示す。
実施例4:CD3−CD19抗原結合構築物の存在下での活性化ヒトCD8 T細胞のオフターゲット細胞障害性の決定
CD3−CD19抗原結合構築物の存在下での活性化ヒトCD8T細胞の潜在的なオフターゲット細胞障害性を、CD19またはCD3を発現しない標的細胞株であるK562に対して測定した。この場合は変異体875を試験し、アッセイを以下のように実施した。
個々の試験のために、選択されたドナーからヒト血液(120〜140mL)を採取した。PBMCを、リンパ球勾配分離(lymphocyte gradient separation)(Cedarlane,カタログ番号CL5020)を使用してドナーから新たに単離した。IL2活性化のために、PBMCを1000〜3000単位/mLのIL−2とともに一晩インキュベーションして活性化した。静止及びIL−2活性化PBMCをCD4及びCD8の濃縮のために、EasySep(STEMCELL Technologies Inc.)カラムに通した。IL−2活性化CD8をエフェクター細胞として、及びK562赤白血病細胞を標的細胞として、15:1のE:T比率で使用した。試験品と細胞を20〜26時間インキュベートした後、Promega LDH酵素キットを使用したLDH分析のために50μLの細胞培養上清を収集した。Molecular Devices Emaxを使用して各ウェルの490nmでの光学密度(OD)を決定した。データ分析はLibreOffice Calcソフトウェアを使用して行った。
結果を表3及び図4に示す。表3は、0日目の精製CD8T細胞中の活性化T細胞の割合(%)を示す。図4は、300nM及び15:1のE:T比率において、IL−2活性化ヒトCD8T細胞を用いた場合のK562赤白血病細胞の枯渇が観察されなかったことを示す。このように、飽和濃度及び高い標的対エフェクター細胞比率でIL−2活性化ヒトCD8T細胞を用いた場合のK562赤白血病細胞のオフターゲットバイスタンダー細胞障害が観察されなかった。
(表3)0日目の精製CD8T細胞中の活性化T細胞の割合(%)
Figure 2017504328
実施例5:Raji細胞において用量依存性ADCC及びCDCを媒介する変異体1661の能力
実施例1に記載したように、変異体1661は、Fc媒介性エフェクター活性を無効にするCH2変異を有するFc(Fc KO)を含む。この変異体に関するエフェクター機能の欠如を確認するために、それを下記のようにADCC及びCDCアッセイにおいて試験した。
用量反応性試験を1000〜0.01nMの抗体濃度範囲で行った。リツキシマブを陽性対照として使用した。ADCCアッセイは以下のように実施した。標的Raji細胞を試験抗体と30分間プレインキュベーションし、その後、5:1のNKエフェクター細胞対標的細胞比率でエフェクター細胞を添加し、インキュベーションを5%COインキュベーター中37℃で6時間継続した。LDH放出及び標的溶解率(%)を、LDHアッセイキットを使用して測定した。CDCアッセイについては、最終濃度10%の正常ヒト血清(NHS)を、Raji標的細胞及びそれぞれの抗体と、5%COインキュベーター中37℃で2時間インキュベートした。LDH放出及び標的溶解率(%)を、LDHアッセイキットを使用して測定した。
結果を図5に示す。図5Aは、変異体1661が、予測通り、10μMまでの濃度でADCCを媒介することができなかったことを示す。それに比べて、陽性対照リツキシマブはADCCを媒介した。図5Bは、変異体1661が、500nMを超えるEC50の観察を伴って、これも予想通り、CDCの誘発における効力がリツキシマブより10倍超弱かったことを示す。これらの結果は、1661が、最大標的B細胞殺傷媒介濃度(配列例を参照されたい)でADCC及びCDCを媒介しそうにないことを示す。
実施例6:ヒト全血における自己B細胞枯渇
二重特異性抗CD19−CD3抗原結合構築物を、IL2活性化下のヒト全血初代細胞培養物において自己B細胞を枯渇させるそれらの能力について分析した。このアッセイにおいて試験された変異体は、875、1661、及び10149であった。非特異性対照として、Fab結合性アームを有さないホモ二量体Fc(Fc遮断)を使用した。
簡潔には、変異体を、ヘパリン処置したヒト全血内、IL2の存在下で2日間インキュベートした。各対照及び実験条件について四連のウェルにプレーティングされ、培養物を5%CO、37℃でインキュベートし、48時間で停止した。培養物を回収した後に赤血球細胞を溶解し、収集した初代細胞をCD45、CD20及び7−AAD FACS検出のために染色した。CD45、CD45/CD20及びCD45/CD20/7AAD+/−集団のFACS分析を、InCyte/FlowJoにより以下のように実施した:FSC/SSC及び補正ウェルについての5,000事象から実験ウェルについての30,000事象をサイトメトリーにより分析した。デブリとRBCをスキップするように閾値を設定した。リンパ球、CD45、CD20、及び7AAD細胞についてゲーティングを実施した。
図6は、IL2活性化下のヒト全血内の自己B細胞濃度に及ぼす変異体875及び1661の細胞障害効果を示す。両変異体は、このアッセイにおいてCD20B細胞を枯渇させることができた。最大インビトロ有効性は、0.1nM未満で観察され、強い濃度依存性効果があり、EC50は約0.001nMであった。
図7は、変異体1661が、10:1のE:T比率で48時間後に濃度依存性様式(0.01nM未満のEC50)で、IL−2活性化ヒト全血内で用量依存性自己B細胞枯渇を媒介することができたことを示す。結果は、培地対照に対して正規化されたCD20B細胞の割合(%)として示す。図8は、静止条件下(すなわちIL2刺激の不存在下)での変異体1661と10149の間の比較を示し、これは両方の変異体が用量依存的様式でB細胞を枯渇させることができたことを示す。ジスルフィド安定化変異体10149は、静止全血において親変異体v1661と同等の効力を示した。
実施例7:例示的なCD3−CD19抗原結合構築物の、一次CLL(慢性リンパ性白血病)及びMCL(マントル細胞リンパ腫)患者試料における自己B細胞を枯渇させる能力
一次CLL及びMCL患者全血試料において自己B細胞を枯渇させる変異体1661の能力を以下のように決定した。
3人の患者から一次患者血液試料を採取した。血液試料を血液採取の当日に以下のように処理した:ヘパリン処置した患者全血内で変異体を直接インキュベートした。各対照及び実験条件について四連のウェルにプレーティングされ、培養物を5% CO中、37℃でインキュベートし、4日目で停止した。培養物を回収した後に赤血球細胞を溶解し、収集した初代細胞をCD45、CD20、CD5、CD3、CD19及び7−AAD FACS検出のために染色した。FACS分析を、InCyte/FlowJoにて実施した。アッセイを実施する前に、各患者のベースのリンパ球数も、CD45、CD20、CD5、CD3、CD19及び7−AADについて染色することにより決定した。ベースのリンパ球数は下記表4に示す。図9A及びBは、枯渇アッセイの結果を示す。結果は、培地対照に対して正規化されたCD20/CD5B細胞の割合(%)として示す。
(表4)ベースのリンパ球数:Z34 KOインキュベーション前の患者全血におけるT細胞及びB細胞の割合(%)
Figure 2017504328
患者は、試料採取時に標準リツキサン+プレドニゾン処置を受けている
$ RAI:CLLの病期分類及び診断のための国際RAIシステム
MCL患者全血におけるE:T比率は、T細胞対B細胞が1:1.3であった。CCL患者全血におけるE:T比率は、T細胞対B細胞が1:1〜1:5であった。変異体1661は、CLL一次患者全血においてT細胞を活性化させることができ、これは4日間のインキュベーションの後のCD69T細胞のレベルの上昇により示される(データは図示されず)。図9Bは、変異体1661が、未処置及びリツキサン前処置一次患者全血試料において同等の程度まで濃度依存的にCLL B細胞を枯渇させたことを示す。図9Aは、変異体1661が未処置一次患者全血試料において濃度依存的なMCL B細胞枯渇を示したことを示す。
実施例8:例示的なCD3−CD19抗原結合構築物の存在下でのヒトPBMCにおける自己T細胞増殖の評価
例示的なCD3−CD19抗原結合構築物の、ヒトPBMCにおいて自己T細胞増殖を刺激する能力を評価した。試験変異体は875及び1380(変異体1661と同様にFc KOを有する)であった。試験対照は、野生型OKT3抗体、ヒトIgG、及びブリナツモマブ(変異体891)であった。アッセイは下記のように実施した。
細胞増殖アッセイ:1日目に、4人の各ドナーから血液を採取し、PBMCを新たに単離した。ドナーリンパ球プロファイルを実施例6に記載するようにFACSにより決定した。4人のドナーのドナープロファイルを下記表5に示す。
(表5)ドナーPBMCプロファイル
Figure 2017504328
増殖アッセイについては、試験物を最終濃度0.3nM及び100nMにて調製し、PBMCと混合して、250,000細胞/ウェルでプレーティングした。混合物を3日間インキュベートし、その後、トリチウムで標識したチミジンを細胞含有ウェルに添加して最終濃度0.5μCiチミジン/ウェルとした。プレートをさらに18時間インキュベートし、その後、プレートを凍結した。総インキュベーション時間は4日間であった。プレートを濾過して、β計数器を使用して計数した(CPM)。平均値から、刺激指数(SI)を以下のように算出し、データを表にした:試験物の平均CPM/培地のみの平均CPM。アッセイの結果を図10に示す。図10は、OKT3が0.3nMにてv891(ブリナツモマブ)>v875及びv1380のランク降順で最大T細胞増殖を媒介したことを示す。患者の血清中0.3nMの濃度で、OKT3及びブリナツモマブは有害作用と関連する[Bargou et al.Science(2008);Klinger et al.Blood(2010)]。v1380は、OKT3及びブリナツモマブより有意に低い程度にT細胞増殖を誘導した。変異体1661のようにFcエフェクター機能を媒介しない変異体であるV1380は、最大B細胞枯渇のために十分なT細胞増殖(しかし、ベンチマークよりもはるかに低いレベル)を誘導することができた(実施例5及び6を参照されたい)。
実施例9:例示的なCD3−CD19抗原結合構築物により媒介されるヒトPBMCにおけるT細胞増殖に関する標的B細胞依存性の決定
CD3−CD19抗原結合構築物により媒介されるT細胞増殖が標的B細胞の存在に依存していることの確認は、B細胞及び/またはNKエフェクター細胞の不在下または存在下でのPBMCにおけるT細胞増殖を刺激するCD3−CD19抗原結合構築物の能力を評価することにより得られた。アッセイは、変異体1380、対照ブリナツモマブ(v891)、及びヒトIgGを使用して下記のように実施された。
細胞増殖アッセイ:PBMC由来のサブ集団は、PBMC、B細胞を有さないPBMC(PBMC−B)、NK細胞を有さないPBMC(PBMC−NK)、NK及びB細胞を有さないPBMC(PBMC−NK−B)を含む。1日目に、4人の各ドナーから約135mLの血液を採取した。PBMCを新たに単離し、当該PBMCを、正の選択によるCD19及び/またはCD56枯渇用のEasySepカラム(STEMCELL Technologies Inc.)に通した(1日目)。PBMCの白血球プロファイルを実施例6に記載するようにFACSにより決定した。PBMCプロファイルを表6に示す。
(表6)PBMCプロファイル
Figure 2017504328
T細胞増殖アッセイを以下のように実施した。試験物を最終濃度100nMにて調製し、PBMCと混合し、250,000細胞/ウェルでプレーティングした。混合物を3日間インキュベートし、その後、トリチウム標識したチミジンを細胞含有ウェルに添加して最終的に0.5μCiチミジン/ウェルとした;プレートをさらに18時間インキュベートし、その後プレートを凍結した。総インキュベーション時間は4日間であった。プレートを濾過して、β計数器を使用して計数した(CPM)。平均値から、刺激指数(SI)を以下のように算出し、データを表にした:試験物の平均CPM/培地のみの平均CPM。
結果を図11に示す。健常ドナーから採取されたヒトPBMCにおける平均E:T比率は、CD3T細胞対CD19B細胞が約10:1であった(データは図示されず)。
図11は、変異体1380が、PBMC及びPBMC−NK細胞(PBMCマイナスNK細胞)においてはT細胞増殖を示したが、B細胞を欠くPBMC及びB細胞及びNK細胞を欠くPBMCにおいてはほとんどから全くT細胞増殖を示さなかったことを示し、これは、標的B細胞への依存性を示す。ブリナツモマブは、T細胞活性化について同様の標的B細胞依存性を示したが、1380より高いT細胞増殖を誘導した。
これらの結果は、変異体1380が、最大B細胞枯渇を媒介する濃度で厳密に標的依存性のT細胞増殖を呈することを示す(実施例5及び6を参照されたい)。これらの結果はまた、変異体1380及びエフェクター機能を媒介することができないFcを有する他のCD3−CD19抗原結合構築物がブリナツモマブより高い治療指数を有する可能性が高いことも示す。1380は、1661と同一のCDR配列及び等しいT及びB細胞親和性を有し、抗CD3 scFv VH−VLの向き及びscFvリンカーにおいてのみ1661と異なる(表1を参照されたい)。
実施例10:IL2活性化ヒトPBMC及びG2白血病細胞を移植されたNSGマウスにおけるCD3−CD19抗原結合構築物のインビボ有効性
インビボマウス白血病モデルにおける例示的なCD3−CD19抗原結合構築物の有効性を決定した。このモデルでは、PBMCヒト化NSG(NOD scidガンマ)マウスに化学療法抵抗性のG2 ALL(急性リンパ芽球性白血病)細胞を移植し、CD3−CD19抗原結合構築物875及び1661がG2白血病細胞の生着レベルに及ぼす効果を観察した。このモデルは、Ishii et al.Leukemia 9(1):175−84(1995)、及びNervi et al,Exp Hematol 35:1823−1838(2007)に記載されている。
予備実験として、選択された変異体のG2白血病細胞株への結合能を試験した。
ヒトG2 ALL腫瘍細胞株へのインビトロFACS結合:
前もって冷却したG2細胞(1×10生存細胞/管)を、10%加熱不活性化ウシ胎児血清及び1%ヤギ血清(L−10+GS1)を最終容量200μL/管で含有するLeibovitz L15緩衝液中、0、0.1、0.3、1、3、10、30、及び100nMの濃度の氷冷した二重特異性試薬huCD3×huCD19と、3連で、氷上で2時間、CO不在下でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を4mlの氷冷Leibovitz L15中で洗浄し、ペレットを、L−10+GS1中1/100に希釈した100μLの氷冷Alexa fluor488タグ付き抗ヒト抗体(Jackson Immunoresearch)に再懸濁した。15分以上暗所に置いた後、4mlのLeibovitz L15を添加し、細胞をペレット状にし、次いでフローサイトメトリーによる分析の前に2μg/mlの7AADを含有する200μLの氷冷フローサイトメトリーランニングバッファー(running buffer)に再懸濁した。平均蛍光強度を使用して、結合曲線を確立し、そこから各細胞株に関する各二重特異性試薬についてのKdを決定した。
図12は、例示的な変異体である875及び1661が、875では1.9nMのKdで、1661では2.6nMのKdで、G2 ALL細胞に結合できたことを示す。
IL2活性化ヒトPBMC及びG2白血病細胞を移植されたNSGマウスにおけるインビボ有効性:
3×10個の活性化(抗CD3/抗CD28[1ビーズ/CD3細胞]+50UのIL2/ml(5dにつき))ヒトPBMCと混合した1×10個のG2−CBRluc/eGFP細胞を、NOD/SCID/ null(NSG)マウス(n=5/群)の静脈内に移植した。全マウス群の細胞源として単一のドナーを使用した。ヒトT細胞:G2 B細胞の比率は10:1であった。フローサイトメトリーを使用して、T細胞の活性化状態(CD3、CD4、CD8、CD25、CD69、CD45RO、CD62L、及びCCR7)及び生存力(7AAD)を評価した。
マウスは、PBMC及びG2の移植の1時間後に二重特異性変異体の最初の投与を受容した(n=5/群):3mg/kgで0、2、及び4日目に投薬され、5日目に終了した。D−ルシフェリン(150μg/体重(g))をマウスに注射し、ベースラインで10分後及び移植の9、14、18日後の全身生物発光イメージング(BLI)により腫瘍進行を追跡した。18日目に動物を屠殺し、脾臓をエキソビボBLI(生物発光イメージング)のために回収した。結果を図13及び14に示す。「ブランク」は、G2を移植されていない対照群を示す。
さらに、平均血清濃度(1mLあたりのマイクログラム)を決定するために、最初の3mg/kg静脈内投薬の24時間後に1コホートあたり2動物について血液試料を採取した。結果を図15に示す。
図13Aは、18日間にわたる、腹臥位で測定したときの変異体875の全身BLIを示し、図13Bは、仰臥位での同じ変異体の全身BLIを示す。図13Cは、18日目における変異体875及び対照の脾臓BLIを示す。
図14Aは、18日間にわたる、腹臥位で測定したときの変異体1661の全身BLIを示し、図14Bは、仰臥位での同じ変異体の全身BLIを示す。図14Cは、IgGで処置された対照群及びv1661で処置された群からの2匹の代表的なマウスの全身走査画像を示す。図は、v1661で処置された動物ではG2生着を示さず、IgGで処置された群においては高度な生着及びALL疾患の進行を示す。図14Dは、18日目における変異体1661及び対照の脾臓BLIを示す。
図15は、3mg/kg静脈内投薬の24時間後に達成された、変異体875及び1661の平均血清濃度を示す。
これらの結果は、Fcノックアウト変異体1661が、G2 ALL細胞の完全な枯渇を示し、有意なG2生着を示さないことを示す。これらの条件下で、活性なFcを含有する変異体875は、類似するが、変異体1661と比較すると低減したレベルのG2枯渇を示す。
(表S1)CD3及びCD19抗原結合構築物のCDR配列(289〜386)
Figure 2017504328
Figure 2017504328
(表S2)CD19ヒト化VL配列(SEQ ID NO:337、338)
Figure 2017504328
(表S3)CD19ヒト化VH配列(SEQ ID NO:339〜342)
Figure 2017504328
(表S4)変異体及びクローン
Figure 2017504328
(表S5)SEQ ID NO(1〜288)ごとのクローンの配列
Figure 2017504328
Figure 2017504328
Figure 2017504328
Figure 2017504328
Figure 2017504328
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Figure 2017504328
Figure 2017504328
配列表
本出願は、EFS−Webを介して提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ASCIIコピーは、2015年1月30日に作製され、名称は28515_PCT_CRF_sequencelisting.txtであり、サイズは332,144バイトである。
抗原結合構築物ポリペプチド配列及びCDR配列、抗原結合構築物をコードする核酸、及びベクター及び細胞も記載する。抗原結合構築物を含む医薬組成物、及び、本明細書に記載の抗原結合構築物を使用して障害(例えば、癌)を治療する方法も記載する。
[本発明1001]
以下を含む、抗原結合構築物:
第一のVL、第一のscFvリンカー、及び第一のVHを含む第一のscFvを含む第一の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第一のscFvが、CD19抗原に一価で特異的に結合し、前記第一のscFvが、抗CD19抗体HD37 scFv、修飾HD37 scFv、HD37遮断抗体scFv、及び修飾HD37遮断抗体scFvからなる群より選択され、前記HD37遮断抗体が、前記CD19抗原へのHD37の結合を50%以上遮断する、第一の抗原結合ポリペプチド構築物;
第二のVL、第二のscFvリンカー、及び第二のVHを含む第二のscFvを含む第二の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第二のscFvが、CD3抗原のイプシロンサブユニットに一価で特異的に結合し、前記第二のscFvが、OKT3 scFv、修飾OKT3 scFv、OKT3遮断抗体scFv、及び修飾OKT3遮断抗体scFvからなる群より選択され、前記OKT3遮断抗体が、前記CD3抗原の前記イプシロンサブユニットへのOKT3の結合を50%以上遮断する、第二の抗原結合ポリペプチド構築物;
二量体化CH3ドメインを形成することができる修飾CH3配列をそれぞれ含む第一及び第二のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであって、各修飾CH3配列が、ヘテロ二量体Fcの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、前記二量体化CH3ドメインが、約68℃またはそれより高い融解温度(Tm)を有し、前記第一のFcポリペプチドが、第一のヒンジリンカーにより前記第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、かつ前記第二のFcポリペプチドが、第二のヒンジリンカーにより前記第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている、ヘテロ二量体Fc。
[本発明1002]
v12043、v10149、またはv1661からなる、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1003]
前記第一のscFvが、
Figure 2017504328
から選択されるCDR配列のセットに100%同一であるCDR配列を含む、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1004]
前記第一のscFvが、本発明1003のCDRの前記セットに95%同一であるCDR配列を含む、本発明1003の抗原結合構築物。
[本発明1005]
前記第一のVHのポリペプチド配列が、野生型HD37のVHのポリペプチド配列、hVH2ポリペプチド配列、及びhVH3ポリペプチド配列から選択され、前記第一のVLのポリペプチド配列が、野生型HD37 VLのポリペプチド配列及びhVL2ポリペプチド配列から選択される、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1006]
前記第一のVHのポリペプチド配列が、野生型HD37のVHのポリペプチド配列、hVH2ポリペプチド配列、またはhVH3ポリペプチド配列に95%同一であり、前記第一のVLのポリペプチド配列が、野生型HD37 VLのポリペプチド配列またはhVL2ポリペプチド配列に95%同一である、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1007]
前記HD37遮断抗体が、4G7、B4、B3、HD237、及びMor−208から選択される、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1008]
前記第二のscFvが、
Figure 2017504328
から選択されるCDRのセットを含む、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1009]
前記第二のscFvが、本発明1008のCDRの前記セットに少なくとも95%同一であるCDRのセットを含む、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1010]
前記第二のVHのポリペプチド配列が、野生型OKT3のVHのポリペプチド配列であるか、または野生型OKT3のVHのポリペプチド配列に95%同一であるポリペプチド配列であり、前記第二のVLのポリペプチド配列が、野生型OKT3のVLのポリペプチド配列であるか、または野生型OKT3のVLのポリペプチド配列に95%同一であるポリペプチド配列である、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1011]
前記OKT3遮断抗体が、Teplizumab(商標)、UCHT1、及びビジリズマブから選択される、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1012]
前記第二のscFvが前記OKT3のCD3エピトープに結合する、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1013]
前記第一のVL、第一のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第一のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVL−リンカー−VHとして配列されている、本発明1001〜1012のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1014]
前記第一のVL、第一のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第一のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVH−リンカー−VLとして配列されている、本発明1001〜1012のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1015]
前記第二のVL、第二のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第二のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVL−リンカー−VHとして配列されている、本発明1001〜1014のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1016]
前記第二のVL、第二のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第二のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVH−リンカー−VLとして配列されている、本発明1001〜1014のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1017]
一方または両方のscFvが、VL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含む、本発明1001〜1016のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1018]
前記第一または第二のscFvリンカーが、表Bから選択される、本発明1001及び1003〜1017のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1019]
前記第一または第二のヒンジポリペプチドリンカーが、表Eから選択される、本発明1001及び1003〜1018のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1020]
前記第一のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記第一のVL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVL−リンカー−VHとして配列されており、前記第二のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記第二のVL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVH−リンカー−VLとして配列されている、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1021]
前記第一のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記VL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVL−リンカー−VHとして配列されており、前記第二のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記VL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVL−リンカー−VHとして配列されている、本発明1001の抗原結合構築物。
[本発明1022]
前記ヘテロ二量体Fcが、FcγRまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Fcの能力を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つのCH2ドメインを含む、本発明1020または1021の抗原結合構築物。
[本発明1023]
CD19に対する前記第一のscFvの結合親和性が、約0.1nM〜約5nMであり、CD3の前記イプシロンサブユニットに対する前記第二のscFvの結合親和性が、約1nM〜約100nMである、本発明1001〜1022のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1024]
前記ヘテロ二量体Fcが、
a.ヒトFcであり;かつ/または
b.ヒトIgG1 Fcであり;かつ/または
c.表Aに記載のように前記CH3ドメインのうち少なくとも1つに1つまたは複数の修飾を含み;かつ/または
d.少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
e.1つまたは複数の修飾を含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
f.表Bに記載のように前記CH2ドメインの少なくとも1つに1つまたは複数の修飾を含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
g.表Cに記載のようにFcγRまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Fcの能力を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
h.アミノ酸置換N297A、もしくはL234A_L235A、もしくはL234A_L235A_D265Sを含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含む、
本発明1001〜1023のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1025]
前記二量体化CH3ドメインが、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84、または85℃またはより高い融解温度(Tm)を有する、本発明1001〜1024のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1026]
前記抗原結合構築物が、
a)FACS及び/もしくは顕微鏡検査によりアッセイされるようなCD19 Raji B細胞及びJurkat T細胞の間のシナプス形成及び架橋が可能であり;かつ/または
b)ヒト全血またはPBMCにおけるCD19発現B細胞のT細胞誘引による殺傷(T-cell directed killing)を媒介し;かつ/または
c)v875またはv1661と比較して改善した生物物理学的特性を示し;かつ/または
d)v875またはv1661と比較して改善したタンパク質発現及び収率、例えば、同様の条件下で発現及び精製された場合にSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)後に4〜10mg/L超での発現を示し;かつ/または
e)例えば95%を超えるヘテロ二量体純度を示す、
本発明1001〜1025のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1027]
薬物にコンジュゲートされている、本発明1001〜1026のいずれかの抗原結合構築物。
[本発明1028]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物及び薬学的担体の医薬組成物。
[本発明1029]
前記担体が、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む、本発明1028の医薬組成物。
[本発明1030]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を含む、医療において使用するための医薬組成物。
[本発明1031]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を含む、癌の治療において使用するための医薬組成物。
[本発明1032]
対象における癌を治療する方法であって、有効量の本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
[本発明1033]
前記対象がヒトである、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記癌が、リンパ腫または白血病またはB細胞悪性腫瘍、またはCD19を発現する癌、または非ホジキンリンパ腫(NHL)またはマントル細胞リンパ腫(MCL)または急性リンパ芽球性白血病(ALL)または慢性リンパ性白血病(CLL)またはリツキシマブもしくはCHOP(cytoxan(商標)/Adriamycin(商標)ビンクリスチン/プレドニゾン療法)に耐性のB細胞癌である、本発明1032の方法。
[本発明1035]
以下の工程を含む、本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物を製造する方法:本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を前記抗原結合構築物の発現に好適な条件下で培養する工程、及び、前記抗原結合構築物を精製する工程。
[本発明1036]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物の少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。
[本発明1037]
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがcDNAである、本発明1036の単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1038]
本発明1036のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットの1つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセットであって、任意選択的に、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、前記ベクターまたはベクターのセット。
[本発明1039]
本発明1036のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットまたは本発明1038のベクターもしくはベクターのセットを含む単離された細胞であって、任意選択的に、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはHEK293細胞から選択される、前記単離された細胞。
[本発明1040]
本発明1001〜1027のいずれかの抗原結合構築物及び使用説明書を含む、キット。
抗原結合構築物の設計の概略図を示す。図1Aは、エフェクター機能を媒介することができるFcを有する例示的なCD3−CD19抗原結合構築物を図示する。当該抗原結合構築物の抗原結合ドメインは両方ともscFvであり、各scFvのVH及びVL領域はポリペプチドリンカーにより接続されている。各scFvはまた、ヒンジポリペプチドリンカーによりヘテロ二量体Fcの一方のポリペプチド鎖に接続されている。当該抗原結合構築物の当該2つのポリペプチド鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている(破線として示す)。図1Bは、Fcがノックアウトされている例示的なCD3−CD19抗原結合構築物を図示する。このタイプの抗原結合構築物は、FcγR結合を除去するFcのCH2領域への修飾(「X」で示す)を含むことを除き、図1Aに示すものと類似する。 選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図2Aの上方パネルは、変異体10149についてのプロテインA精製後の分取ゲルろ過(GFC)プロファイルを示し、下方パネルは、プールしたGFC画分の分析的SECプロファイルを示す。 選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図2Bの上方パネルは、変異体1661についてのプロテインA精製後の分取ゲルろ過(GFC)プロファイルを示し、下方パネルは、1661についてのプールしたGFC画分の分析的SECプロファイルを示す。 選択された変異体に関する精製法の分析を示す。図2Cは、変異体875、1661、1653、1666、10149、及び12043の生物物理学的特徴の概要を提供する。 B及びT細胞を架橋して仮足の形成させる変異体875及び1661の能力を示す。左の表は、FACSによる架橋分析及び顕微鏡による架橋分析により測定したこれらの変異体についてのB:T細胞架橋分析の概要を提供し;右の画像は、顕微鏡による架橋分析により測定した、変異体875についての仮足の形成を示す。 300nMの変異体875の、IL2活性化精製CD8T細胞における非CD19発現K562細胞に対するオフターゲット細胞障害性を示す(4人のドナーの平均)。 v1661のADCCまたはCDCを媒介する能力の低減または消失を示す。図5Aは、リツキシマブ対照との比較での変異体1661のRaji細胞におけるADCCを媒介する能力を示す。図5Bは、リツキシマブ対照に対する変異体1661のRaji細胞におけるCDCを媒介する能力を示す。 選択された変異体の、全血アッセイにおける自己B細胞枯渇を媒介する能力を示す。CD20B細胞の存在は、IL2活性化ヒト全血における48時間のインキュベーションの後に決定された(2ドナーの平均、n=4)。 10:1のE:T比率で48時間後のIL−2活性化ヒト全血における濃度依存様式(0.01nM未満のEC50)でのv1661による用量依存的な自己B細胞枯渇を示す。 静止条件下、用量依存的に全血中の自己B細胞を枯渇させる変異体1661及び10149の能力の比較を示す。 一次患者ヒト全血におけるv1661による自己B細胞枯渇を示す。図9Aは、MCL患者からの血液中でのv1661の効果を示す。図9Bは、2人のCLL患者からの血液中でのv1661の効果を示す。残存する悪性B細胞の数は、培地対照に対して正規化されたCD20/CD5B細胞の割合(%)として表される。 v875、1380及び対照の、ヒトPBMCにおけるT細胞増殖を刺激する能力を示す(4日間のインキュベーション、4人のドナーの平均)。 100nMの変異体、ヒトPBMCにおける標的B細胞依存性T細胞増殖を示す(4日間のインキュベーション、4人のドナーの平均)。 選択された変異体の、ヒトG2 ALL腫瘍細胞株に結合する能力を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体875の有効性を示す。図13Aは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体875の有効性を示す。図13Bは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体875の有効性を示す。図13Cは、18日目の、単離された脾臓における生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Aは、腹臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Bは、仰臥位における全身の生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Cは、全身生物発光の画像である。 インビボマウス白血病モデルにおける対照と比較した変異体1661(FcγRノックアウト変異体)の有効性を示す。図14Dは、18日目に、単離された脾臓で検出された生物発光の量を示す。 インビボマウス白血病モデルにおける、3mg/kg静脈内注射の24時間後の二重特異性抗CD3−CD19変異体の血清濃度の分析を示す。 マウスHD37 VL及びVH配列をベースとするヒト化CD19 VL及びVH配列(それぞれSEQ ID NO:367及び371)を示す。3つのヒト化VL配列を提供している:hVL2(SEQ ID NO:368)、hVL2(D−E)(SEQ ID NO:369)、及びhVL2(D−S)(SEQ ID NO:370)。hVL2(D−E)は、CDR L1におけるDからEへの置換を含有し、hVL2(D−S)は、CDR L1におけるDからSへの置換を含有する。2つのヒト化VH配列hVH2(SEQ ID NO:372)及びhVH3(SEQ ID NO:373)を提供している。CDR配列は、囲みにより確認される。この図において確認されるCDRは単なる例示である。当該技術分野で知られているように、CDRの同定は、それらを同定するために使用する方法に応じて変わり得る。抗CD19 VL及びVH配列についての代替のCDR定義を表S1に示す。野生型マウスHD37抗体配列に関してヒト化されたこれらの配列への修飾は、下線で示す。 抗CD19 HD37抗体に基づく、抗CD19 VL配列(SEQ ID NO:367)に関するKabatに従う番号を示す表を示す。 抗CD19 HD37抗体に基づく、抗CD19 VH配列(SEQ ID NO:371)に関するKabatに従う番号を示す表を示す。
可変領域は、機能的抗原結合部分の形成を可能にする、リンカーペプチド、またはscFvリンカーを介して接続され得る。scFvは、scFvリンカーポリペプチドの組成及び/または長さを変更することによりタンパク質発現及び収率について最適化されることができる。典型的なペプチドリンカーは、約2〜20個のアミノ酸を含み、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で公知である。好適な、非免疫原生リンカーペプチドには、例えば、(GS) (SEQ ID NO:363)、(SG (SEQ ID NO:364)、(GS) (SEQ ID NO:363)、G(SG (SEQ ID NO:365)またはG(SG (SEQ ID NO:366)リンカーペプチドが含まれ、ここでnは、一般的には、1から10の間、典型的には2から4の間の数である。
(表B)scFvリンカーポリペプチド配列
Figure 2017504328
この構造の分析は、表Fの配列に関して、OKT3抗体のCDRが、ヒトCD3イプシロンにSEQ ID NO:350の残基56−57(SE)、68−70(GE)、及び101−107(RGSKPED)で接触することを示す。これらの残基における結合ホットスポットに下線を引いている。これらの残基は、OKT3が結合するエピトープと考えられる。従って、本明細書に記載の抗原結合構築物は、このエピトープに特異的に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
(表1)変異体、鎖A、鎖B、Fc
Figure 2017504328
Figure 2017504328
−Het Fc1=鎖A:L351Y_F405A_Y407V;鎖B:T366L_K392M_T394W(IgG1 Fcに対するEUナンバリングシステム)
−Het Fc2=鎖A:T350V_L351Y_F405A_Y407V;鎖B:T350V_T366L_K392L_T394W
−FcγR KO1=鎖A:L234A_L235A;鎖B:L234A_L235A
−FcγR KO2=鎖A:D265S_L234A_L235A;鎖B:D265S_L234A_L235A
−αCD19_HD37 scFv−別段の指示がない限り、可変領域のNからC末端への順序はVL/VHである。
−αCD3_OKT3 scFv−別段の指示がない限り、可変領域のNからC末端への順序はVL/VHである。VLVHは、(GGGGS)3リンカー(SEQ ID NO:5)により接続されている。
−αCD3_BiTE scFv−可変領域のNからC末端への順序はVH/VLであり、リンカー及び組成はブリナツモマブと同一である。
−(VLVH SS)または(VHVL SS)は、scFvのVHとVL間にジスルフィド連結を導入するために、Kabatナンバリングシステムに準じ、公表されたVH44位及びVL100位を活用するジスルフィド安定化scFvを示す[Reiter et al.,Nat.Biotechnol.14:1239−1245(1996)]。
−(CDRC→S)−下記に参照されるようにOKT3のH3 CDRにおける変異を示す。
−(VHVLリンカー)−リンカー
Figure 2017504328
(SEQ ID NO:344)により接続されるVH及びVLを示す。

Claims (40)

  1. 以下を含む、抗原結合構築物:
    第一のVL、第一のscFvリンカー、及び第一のVHを含む第一のscFvを含む第一の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第一のscFvが、CD19抗原に一価で特異的に結合し、前記第一のscFvが、抗CD19抗体HD37 scFv、修飾HD37 scFv、HD37遮断抗体scFv、及び修飾HD37遮断抗体scFvからなる群より選択され、前記HD37遮断抗体が、前記CD19抗原へのHD37の結合を50%以上遮断する、第一の抗原結合ポリペプチド構築物;
    第二のVL、第二のscFvリンカー、及び第二のVHを含む第二のscFvを含む第二の抗原結合ポリペプチド構築物であって、前記第二のscFvが、CD3抗原のイプシロンサブユニットに一価で特異的に結合し、前記第二のscFvが、OKT3 scFv、修飾OKT3 scFv、OKT3遮断抗体scFv、及び修飾OKT3遮断抗体scFvからなる群より選択され、前記OKT3遮断抗体が、前記CD3抗原の前記イプシロンサブユニットへのOKT3の結合を50%以上遮断する、第二の抗原結合ポリペプチド構築物;
    二量体化CH3ドメインを形成することができる修飾CH3配列をそれぞれ含む第一及び第二のFcポリペプチドを含むヘテロ二量体Fcであって、各修飾CH3配列が、ヘテロ二量体Fcの形成を促進する非対称性アミノ酸修飾を含み、前記二量体化CH3ドメインが、約68℃またはそれより高い融解温度(Tm)を有し、前記第一のFcポリペプチドが、第一のヒンジリンカーにより前記第一の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されており、かつ前記第二のFcポリペプチドが、第二のヒンジリンカーにより前記第二の抗原結合ポリペプチド構築物に連結されている、ヘテロ二量体Fc。
  2. v12043、v10149、またはv1661からなる、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  3. 前記第一のscFvが、
    Figure 2017504328
    から選択されるCDR配列のセットに100%同一であるCDR配列を含む、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  4. 前記第一のscFvが、請求項3に記載のCDRの前記セットに95%同一であるCDR配列を含む、請求項3に記載の抗原結合構築物。
  5. 前記第一のVHのポリペプチド配列が、野生型HD37のVHのポリペプチド配列、hVH2ポリペプチド配列、及びhVH3ポリペプチド配列から選択され、前記第一のVLのポリペプチド配列が、野生型HD37 VLのポリペプチド配列及びhVL2ポリペプチド配列から選択される、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  6. 前記第一のVHのポリペプチド配列が、野生型HD37のVHのポリペプチド配列、hVH2ポリペプチド配列、またはhVH3ポリペプチド配列に95%同一であり、前記第一のVLのポリペプチド配列が、野生型HD37 VLのポリペプチド配列またはhVL2ポリペプチド配列に95%同一である、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  7. 前記HD37遮断抗体が、4G7、B4、B3、HD237、及びMor−208から選択される、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  8. 前記第二のscFvが、
    Figure 2017504328
    から選択されるCDRのセットを含む、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  9. 前記第二のscFvが、請求項8に記載のCDRの前記セットに少なくとも95%同一であるCDRのセットを含む、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  10. 前記第二のVHのポリペプチド配列が、野生型OKT3のVHのポリペプチド配列であるか、または野生型OKT3のVHのポリペプチド配列に95%同一であるポリペプチド配列であり、前記第二のVLのポリペプチド配列が、野生型OKT3のVLのポリペプチド配列であるか、または野生型OKT3のVLのポリペプチド配列に95%同一であるポリペプチド配列である、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  11. 前記OKT3遮断抗体が、Teplizumab(商標)、UCHT1、及びビジリズマブから選択される、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  12. 前記第二のscFvが前記OKT3のCD3エピトープに結合する、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  13. 前記第一のVL、第一のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第一のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVL−リンカー−VHとして配列されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  14. 前記第一のVL、第一のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第一のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVH−リンカー−VLとして配列されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  15. 前記第二のVL、第二のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第二のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVL−リンカー−VHとして配列されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  16. 前記第二のVL、第二のscFvリンカーポリペプチド配列、及び第二のVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かってVH−リンカー−VLとして配列されている、請求項1〜14のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  17. 一方または両方のscFvが、VL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  18. 前記第一または第二のscFvリンカーが、表Bから選択される、請求項1及び3〜17のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  19. 前記第一または第二のヒンジポリペプチドリンカーが、表Eから選択される、請求項1及び3〜18のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  20. 前記第一のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記第一のVL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVL−リンカー−VHとして配列されており、前記第二のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記第二のVL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVH−リンカー−VLとして配列されている、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  21. 前記第一のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記VL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVL−リンカー−VHとして配列されており、前記第二のVL、scFvリンカー、及びVHのポリペプチド配列が、N末端からC末端に向かって、前記VL及びVHのポリペプチド配列の間にジスルフィド結合を含むVL−リンカー−VHとして配列されている、請求項1に記載の抗原結合構築物。
  22. 前記ヘテロ二量体Fcが、FcγRまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Fcの能力を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つのCH2ドメインを含む、請求項20または21に記載の抗原結合構築物。
  23. CD19に対する前記第一のscFvの結合親和性が、約0.1nM〜約5nMであり、CD3の前記イプシロンサブユニットに対する前記第二のscFvの結合親和性が、約1nM〜約100nMである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  24. 前記ヘテロ二量体Fcが、
    a.ヒトFcであり;かつ/または
    b.ヒトIgG1 Fcであり;かつ/または
    c.表Aに記載のように前記CH3ドメインのうち少なくとも1つに1つまたは複数の修飾を含み;かつ/または
    d.少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
    e.1つまたは複数の修飾を含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
    f.表Bに記載のように前記CH2ドメインの少なくとも1つに1つまたは複数の修飾を含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
    g.表Cに記載のようにFcγRまたは補体に結合する前記ヘテロ二量体Fcの能力を低減させる1つまたは複数のアミノ酸置換を含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含み;かつ/または
    h.アミノ酸置換N297A、もしくはL234A_L235A、もしくはL234A_L235A_D265Sを含む少なくとも1つのCH2ドメインをさらに含む、
    請求項1〜23のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  25. 前記二量体化CH3ドメインが、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84、または85℃またはより高い融解温度(Tm)を有する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  26. 前記抗原結合構築物が、
    a)FACS及び/もしくは顕微鏡検査によりアッセイされるようなCD19Raji B細胞及びJurkat T細胞の間のシナプス形成及び架橋が可能であり;かつ/または
    b)ヒト全血またはPBMCにおけるCD19発現B細胞のT細胞誘引による殺傷(T-cell directed killing)を媒介し;かつ/または
    c)v875またはv1661と比較して改善した生物物理学的特性を示し;かつ/または
    d)v875またはv1661と比較して改善したタンパク質発現及び収率、例えば、同様の条件下で発現及び精製された場合にSEC(サイズ排除クロマトグラフィー)後に4〜10mg/L超での発現を示し;かつ/または
    e)例えば95%を超えるヘテロ二量体純度を示す、
    請求項1〜25のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  27. 薬物にコンジュゲートされている、請求項1〜26のいずれか一項に記載の抗原結合構築物。
  28. 請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物及び薬学的担体の医薬組成物。
  29. 前記担体が、緩衝液、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、糖質、脂質、キレート剤、安定剤、または賦形剤を含む、請求項28に記載の医薬組成物。
  30. 請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を含む、医療において使用するための医薬組成物。
  31. 請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を含む、癌の治療において使用するための医薬組成物。
  32. 対象における癌を治療する方法であって、有効量の請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を前記対象に投与する工程を含む、前記方法。
  33. 前記対象がヒトである、請求項32に記載の方法。
  34. 前記癌が、リンパ腫または白血病またはB細胞悪性腫瘍、またはCD19を発現する癌、または非ホジキンリンパ腫(NHL)またはマントル細胞リンパ腫(MCL)または急性リンパ芽球性白血病(ALL)または慢性リンパ性白血病(CLL)またはリツキシマブもしくはCHOP(cytoxan(商標)/Adriamycin(商標)ビンクリスチン/プレドニゾン療法)に耐性のB細胞癌である、請求項32に記載の方法。
  35. 以下の工程を含む、請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物を製造する方法:請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を前記抗原結合構築物の発現に好適な条件下で培養する工程、及び、前記抗原結合構築物を精製する工程。
  36. 請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物の少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドのセット。
  37. 前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがcDNAである、請求項36に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  38. 請求項36に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットの1つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセットであって、任意選択的に、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、及び組換え発現ベクターからなる群より選択される、前記ベクターまたはベクターのセット。
  39. 請求項36に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットまたは請求項38に記載のベクターもしくはベクターのセットを含む単離された細胞であって、任意選択的に、ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはHEK293細胞から選択される、前記単離された細胞。
  40. 請求項1〜27のいずれか一項に記載の抗原結合構築物及び使用説明書を含む、キット。
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