JP2024507937A - Ｃｄ１２３及びガンマデルタｔ細胞受容体に結合する抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトＣＤ１２３に結合することができ、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合することができる抗体に関する。本発明は更に、本発明の抗体を含む医薬組成物、及び医学的治療のための本発明の抗体の使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトＣＤ１２３に結合することができ、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合することができる、新規の多重特異性抗体に関する。本発明は更に、本発明の抗体を含む医薬組成物、及び医学的治療のための本発明の抗体の使用に関する。

ＣＤ１２３、またはインターロイキン－３（ＩＬ３）受容体α鎖は、血液細胞産生に関与するサイトカインであるＩＬ３によるシグナル伝達を伝達する膜タンパク質である。ＣＤ１２３は、共通β鎖ＣＤ１３１とヘテロ二量体を形成する。ＣＤ１２３は、通常、形質細胞様樹状細胞または単球等のいくつかのタイプの血液細胞、及び正常な骨髄前駆細胞のサブセットによって発現される。しかしながら、ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病を有する患者の白血病幹細胞上で強く過剰発現される。したがって、ＣＤ１２３は、急性骨髄性白血病を含むいくつかの血液悪性腫瘍における潜在的な治療標的である。

いくつかの二重特異性ＣＤ１２３－ＣＤ３ Ｔ細胞係合抗体が記載されている（Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｔ １０：５６１、Ａｌ－Ｈｕｓｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ １２７：１２２）。二重特異性Ｔ細胞係合抗体は、腫瘍標的結合特異性及びＴ細胞結合特異性を有し、したがって、Ｔ細胞細胞毒性を悪性細胞に再誘導することによって有効性を高める、例えば、Ｈｕｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９３：２９０、Ｅｌｌｅｒｍａｎ（２０１９）Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５４：１０２、ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７（１）：ｅ１３７５６４１及びＷＯ２０１５１５６６７３を参照されたい。しかし、結果は大きく異なる。例えば、ＣＤ３結合部分を８つの異なるＢ細胞標的（ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１３８及びＨＬＡ－ＤＲ）に対する結合部分と組み合わせた１つの研究では、異なる腫瘍標的を標的とする二重特異性抗体は、標的細胞細胞毒性を誘導する能力において強い変動を示し、細胞毒
性は抗原発現レベルと相関しないことが見出された。例えば、ＨＬＡ－ＤＲまたはＣＤ１３８を標的とするＣＤ３ベースの二重特異性抗体は、中間～高ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ１３８発現レベルにもかかわらず、細胞毒性を誘導することができなかった（Ｅｎｇｅｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ｅｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ５２：１０２６２５）。Ｔ細胞リダイレクト療法のほとんどは、おそらく著しい毒性、製造上の問題、免疫原性、狭い治療期間及び低応答に起因して、後期臨床開発に到達していない。特に、毒性は、Ｔ細胞エンゲージャーがＣＤ３結合アームを含む場合に生じ得、制御されていない、誇張された、免疫活性化及びサイトカイン放出をもたらす。

したがって、有意な進歩がなされているが、治療上有効であるが、許容される毒性、ならびに安定性及び製造可能性を有する新規のＣＤ１２３標的化抗体が依然として必要である。

本発明は、ＣＤ１２３ベースの治療のための新規抗体を提供する。単一ドメインＣＤ１２３結合領域を、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合し、したがってγδＴ細胞に係合することができる結合領域と組み合わせた二重特異性抗体を構築した。驚くべきことに、二重特異性抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を媒介し、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下でＣＤ１２３発現細胞株ならびに患者由来腫瘍細胞の死滅を誘導することにおいて非常に強力であった。

したがって、第１の態様では、本発明は、ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域と、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合することができる第２の抗原結合領域とを含む多重特異性抗体を提供する。

更なる主な態様では、本発明は、ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域を含む抗体であって、上記第１の抗原結合領域が単一ドメイン抗体であり、
（ｉ）配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、上記第１の抗原結合領域が、配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列、もしくは配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列と、少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉ）配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、上記第１の抗原結合領域が、配列番号９に記載の配列、もしくは上記配列番号９に記載の配列と、少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなる、抗体を提供する。

本発明の更なる態様及び実施形態を以下に記載する。

全ての異なる二重特異性ＶＨＨの、ＣＤ１２３、Ｖγ９Ｖδ２（ＧＤＴ）ＴＣＲ及びＢＳＡへの結合を示すＥＬＩＳＡ（陰性対照として）を示す。ＯＤ値が示され、値が二連測定の平均であり、エラーバーが平均値の標準誤差を示す。一価の抗Ｖδ２ ＶＨＨをＴＣＲ染色の対照として使用し（「ＴＣＲ対照」）、市販の抗ＣＤ１２３抗体（「抗ＣＤ１２３」）をＣＤ１２３抗原コーティングの対照として使用した。「ＡＢなし」は、一次抗体なしの陰性対照を示す。 フローサイトメトリーを使用した二重特異性ＶＨＨの結合の特異性を示す。蛍光シグナルの幾何平均を、使用される抗体及び細胞型の関数としてプロットする。２９３Ｆ細胞によって内因的に発現されるＥＧＦＲを認識するＶＨＨを、陽性対照として含めた。一価抗Ｖδ２ ＶＨＨを陰性対照ＶＨＨとして用いた。 フローサイトメトリーを使用した、ＣＤ１２３への結合に対する１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の見かけの親和性の決定を示す。精製された１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の希釈シリーズを、ＣＤ１２３もしくはＣＤ１３１、またはＣＤ１２３及び－１３１の両方を一過性に発現する２９３Ｆ細胞への結合について試験した。蛍光強度の幾何平均を、使用される抗体濃度の関数としてプロットする。ＥＣ５０値は、曲線当てはめによって決定した。 ＣＤ１２３への１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の結合の代表的なＢＬＩ解析を示す。タンパク質質量結合を表す光反射のシフト（ｎｍで測定）を時間の関数としてプロットする。０～３００秒：会合期、３００～９００秒：解離期。 Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ標的細胞依存性、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１媒介Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を示す。ＣＤ１０７Ａ発現（脱顆粒）を示すＣＤ３＋－Ｖγ９＋ Ｔ細胞の割合を、使用される抗体の濃度の関数としてプロットする。２つの異なるドナーを使用する実験が描かれている。 １Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１誘導、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞媒介性Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ標的細胞細胞毒性を示す。生体Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ標的細胞の割合を、使用される二重特異性ＶＨＨの濃度の関数としてプロットする。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の２つの異なるドナーで得られたデータを示す。 二重特異性ＶＨＨ誘導、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞媒介性ＴＨＰ－１標的細胞細胞毒性を示す。生存ＴＨＰ－１標的細胞の割合を、使用される濃度二重特異性ＶＨＨの関数としてプロットする。 二重特異性ＶＨＨ媒介性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化及び患者由来のプライマリーＡＭＬサンプルの二重特異性ＶＨＨ媒介性Ｔ細胞誘導溶解を示す。上部パネルは、ＣＤ１０７Ａ発現によって測定されるＴ細胞活性化を示す。下側のパネルは、二重特異性ＶＨＨと併せたＴ細胞によるＡＭＬ芽球の溶解を示す。 精製された抗ＣＤ１２３×Ｖγ９Ｖδ２ ＴＣＲ二重特異性抗体１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－ＦｃのＨＰ－ＳＥＣプロファイルを示す。 １Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃは、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を誘導することを示す。典型的な実験を示す。ＣＤ１０７ａ－（リソソーム関連タンパク質－１、またはＬＡＭＰ－１）陽性Ｖγ９Ｖδ２細胞の割合は、使用される化合物の濃度の関数として示される。ＥＣ５０値（ｐＭ単位、曲線当てはめにより決定）をグラフの下に示す。データポイントは３回の測定の平均値である。エラーバーは標準偏差を表す。 １Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃ誘導Ｔ細胞媒介性標的細胞溶解を示す。典型的な実験を示す。グラフは、使用される化合物の濃度の関数として、２４時間の共培養後に死滅した標的細胞の割合を示す。ＥＣ５０値（ｐＭ単位、曲線当てはめにより決定）をグラフの下に示す。データポイントは３回の測定の平均値である。エラーバーは標準偏差を表す。 形質細胞様樹状細胞（上部パネル）及びＴＨＰ－１細胞株（下部パネル）上のＣＤ１２３発現レベルを示す。典型的な染色を示す。非染色細胞を示すヒストグラム、アイソタイプ対照染色（左重複ヒストグラム）、及びＣＤ１２３の染色（右ピーク）を示す。事象の数（Ｙ軸）は、蛍光強度（Ｘ軸）の関数として示される。 １Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃは、ｐＤＣと比較して、ＴＨＰ－１細胞の優先的な死滅を誘導する。代表的な結果が示される。死滅された標的細胞の割合は、標的細胞集団（すなわち、ＴＨＰ－１またはｐＤＣ）当たりに使用される化合物の濃度の関数として示される。ＥＣ５０値（ｐＭ単位、曲線当てはめにより決定）をグラフの下に示す。データポイントは３回の測定の平均値である。エラーバーは標準偏差を表す。 全長ヒトＣＤ１２３の一次アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受配列番号ＮＭ＿００２１８３．４）（配列番号２３）を示す。１Ｄ２抗体に架橋されていることが見出された残基は太字であり、下線が引かれている。斜体の残基（発見された反応性残基に隣接）も、認識されたエピトープの一部であり得る。 ＣＤ１２３のＣαトレースモデル（ＩＬ－３受容体α鎖：Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８ ２０１８ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ９：３８６）、抗体に架橋されていることが見出された残基を示す。膜貫通螺旋は、図の左側に位置する。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、紫外線吸収（ＳＥＣ－ＵＶ）によって検出されたサイズ排除クロマトグラフィー、よって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、紫外線吸収（ＳＥＣ－ＵＶ）によって検出されたサイズ排除クロマトグラフィー、よって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、紫外線吸収（ＳＥＣ－ＵＶ）によって検出されたサイズ排除クロマトグラフィー、よって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、紫外線吸収（ＳＥＣ－ＵＶ）によって検出されたサイズ排除クロマトグラフィー、よって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、紫外線吸収（ＳＥＣ－ＵＶ）によって検出されたサイズ排除クロマトグラフィー、よって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、キャピラリーゲル電気泳動によって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、キャピラリーゲル電気泳動によって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、キャピラリーゲル電気泳動によって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、キャピラリーゲル電気泳動によって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の、キャピラリーゲル電気泳動によって測定した凝集体及び断片によって決定されるストレス誘発性変化を示す。 フローサイトメトリーを介してＣＤ１０７ａ（リソソーム関連タンパク質－１、またはＬＡＭＰ－１）陽性細胞の割合を測定することによって、４時間後に脱顆粒を分析することを示す。 ＣＤ２５陽性細胞の割合を測定することによって分析したＴ細胞活性化を示す。 フローサイトメトリーを介して２４時間後の生体標的細胞の割合を決定することによって分析される細胞毒性を示す。

定義
「ヒトＣＤ１２３」という用語は、本明細書で使用される場合、インターロイキン－３受容体α鎖（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１８３．４、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００２１７４．１）とも呼ばれるヒトＣＤ１２３タンパク質を指す。ヒトＣＤ１２３の配列は、配列番号２３に記載されている。ＩＬ３受容体は、共通β鎖であるＣＤ１３１を有するＣＤ１２３のヘテロ二量体である（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０００３８６．１）。ＣＤ１３１は、配列番号２４に記載される。

「ヒトＶδ２」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（配列番号４８）の再配列δ２鎖を指す。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０ＪＤ３６（Ａ０ＪＤ３６＿ＨＵＭＡＮ）は、可変ＴＲＤＶ２配列の一例を示す。

「ヒトＶγ９」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｖγ９Ｖδ２－Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の再配列ｙ９鎖を指す。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｑ９９６０３＿ＨＵＭＡＮは、可変ＴＲＧＶ９配列の一例を示す。

「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン分子の断片、またはそれらのいずれかの誘導体を指すことが意図され、これは、典型的な生理学的条件下で、重要な期間、例えば、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約８時間、少なくとも約１２時間、約２４時間以上、約４８時間以上、約３、４、５、６、７日、もしくはそれ以上などの半減期、または任意の他の関連する機能的に定義される期間（例えば、抗原に結合する抗体に関連する生理学的応答を誘導、促進、増強、及び／または調節するのに十分な時間、及び／または抗体がエフェクター活性を獲得するのに十分な時間）で、抗原に特異的に結合する能力を有する。抗原と相互作用する抗原結合領域は、免疫グロブリン分子の重鎖及び軽鎖の両方の可変領域を含み得るか、または単一ドメイン抗原結合領域、例えば、重鎖可変領域のみを含み得るか、またはそれからなり得る。抗体の定常領域は、存在する場合、免疫系の様々な細胞（エフェクター細胞及びＴ細胞など）、ならびに補体活性化の古典的経路における第１の構成要素であるＣ１ｑなどの補体系の構成要素を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、本抗体のＦｃ領域は不活性になるように修飾されており、「不活性」とは、個々の抗体の２つのＦｃ領域を介して、任意のＦｃγ受容体に結合したり、ＦｃＲのＦｃ媒介性架橋を誘導したり、または標的抗原のＦｃＲ媒介性架橋を誘導することが少なくともできないＦｃ領域を意味する。更なる実施形態では、不活性Ｆｃ領域は、加えて、Ｃ１ｑに結合することができない。一実施形態では、抗体は、２３４位及び２３５位に変異（Ｃａｎｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９１）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：１４８３）、例えば、２３４位にＬｅｕからＰｈｅへの変異、及び２３５位にＬｅｕからＧｌｕへの変異を含有する（ＥＵ付番に従う、以下を参照されたい）。別の実施形態では、抗体は、２３４位にＬｅｕからＡｌａへの変異、２３５位にＬｅｕからＡｌａへの変異、及び３２９位にＰｒｏからＧｌｙへの変異を含有する。別の実施形態では、抗体は、２３４位にＬｅｕからＰｈｅへの変異、２３５位にＬｅｕからＧｌｕへの変異、及び２６５位にＡｓｐからＡｌａへの変異を含有する。

免疫グロブリンのＦｃ領域は、典型的には、免疫グロブリンの２つのＣＨ２－ＣＨ３領域及び接続領域（例えば、ヒンジ領域）を含むパパインによる抗体の消化後に生成される抗体の断片として定義される。抗体重鎖の定常ドメインは、抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥを定義する。Ｆｃ領域は、補体系のＦｃ受容体及びタンパク質と呼ばれる細胞表面受容体とともに、抗体のエフェクター機能を媒介する。

本明細書で使用される「ヒンジ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域を指すことを意図している。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジ領域は、ＥＵ付番に従うアミノ酸２１６～２３０に対応する。

本明細書で使用される「ＣＨ２領域」または「ＣＨ２ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２領域は、ＥＵ付番に従うアミノ酸２３１～３４０に対応する。しかしながら、ＣＨ２領域はまた、本明細書に記載の他のサブタイプのいずれであってもよい。

本明細書で使用される「ＣＨ３領域」または「ＣＨ３ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ３領域を指すことが意図される。したがって、例えば、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ３領域は、ＥＵ付番に従うアミノ酸３４１～４４７に対応する。しかしながら、ＣＨ３領域はまた、本明細書に記載の他のサブタイプのいずれであってもよい。

本発明におけるＦｃ領域／Ｆｃドメインにおけるアミノ酸位置への言及は、ＥＵ番号付けによるものである（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９６９ Ｍａｙ；６３（１）：７８－８５、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ－１９９１ ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）。

上記に示されるように、本明細書で使用される抗体という用語は、別段の記載がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の断片を含む。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されてきた。「抗体」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ’またはＦａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片、またはＷＯ２００７０５９７８２に記載されている一価抗体；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから本質的になるＦｄ断片；ならびに（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖ断片が挙げられる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を使用して、それらが単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって接合することができ、ＶＬ及びＶＨ領域は対となって、一価の分子（一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３－４２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５，５８７９－５８８３（１９８８）参照）。かかる一本鎖抗体は、文脈によって明らかに示されない限り、抗体という用語に包含される。抗体という用語は、別途指定されない限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体及びヒト化抗体、ならびに酵素切断、ペプチド合成、及び組換え技術などの任意の既知の技術によって提供される抗体断片も含む。

本発明の抗体のいくつかの実施形態では、第１の抗原結合領域または第２の抗原結合領域、またはその両方は、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）とも呼ばれる、またはＶＨＨ）は、当業者に周知であり、例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６、Ｒｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ９：３２７及びＫｒａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ ３８：２１を参照されたい。単一ドメイン抗体は、単一のＣＤＲ１、単一のＣＤＲ２及び単一のＣＤＲ３を含む。単一ドメイン抗体の例は、重鎖のみの抗体、軽鎖を天然に含まない抗体、従来の抗体に由来する単一ドメイン抗体、及び操作された抗体の可変断片である。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含む任意の種に由来し得る。例えば、天然由来のＶＨＨ分子は、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ、及びグアナコにおいて産生される、抗体に由来し得る。全抗体と同様に、単一ドメイン抗体は、特異的抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体は、免疫グロブリン鎖の可変ドメイン、すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ならびにフレームワーク領域のみを含み得る。

本明細書で使用される「免疫グロブリン」という用語は、典型的には、２対のポリペプチド鎖、１対の軽（Ｌ）鎖、及び１対の重（Ｈ）鎖からなる構造的に関連する糖タンパク質のクラスを指すことを意図しており、４つ全ては、ジスルフィド結合によって潜在的に相互接続されているが、一部の哺乳動物種は、軽鎖を生成せず、重鎖抗体のみを作製する。本明細書で使用される「免疫グロブリン重鎖」、「免疫グロブリンの重鎖」または「重鎖」という用語は、免疫グロブリンの鎖のうちの１つを指すことが意図されている。重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）と、免疫グロブリンのアイソタイプを定義する重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略される）とからなる。重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。重鎖定常領域は、更に、ヒンジ領域を更に含む。免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の構造内では、２つの重鎖は、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を介して相互接続される。重鎖と同様に、各軽鎖は、典型的には、いくつかの領域、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。更に、ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変性の領域（または、配列において超可変であり得る及び／または構造的に画定されたループを形成し得る超可変領域）、また相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称され、より保存性の高い領域が散在し、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される超可変性の領域に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、典型的には、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配列されている３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ、すなわちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。ＣＤＲ配列は、様々な方法、例えば、Ｃｈｏｉｔｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１またはＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ．ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎによって提供される方法を使用して決定され得る。ＣＤＲ決定及びアミノ酸番号付けのための様々な方法は、ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ（ＵＣＬ）上で比較することができる。

本明細書で使用される「アイソタイプ」という用語は、免疫グロブリン（サブ）クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ）、または重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＩｇＧ１ｍ（ｚａ）及びＩｇＧ１ｍ（ｆ）などのその任意のアロタイプを指す。各重鎖アイソタイプは、カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかと組み合わせることができる。本発明の抗体は、任意のアイソタイプを有することができる。

「親抗体」という用語は、本発明に従う抗体と同一であるが、親抗体が特定の変異のうちの１つ以上を有しない抗体として理解されるべきである。本発明の「変異体」または「抗体変異体」または「親抗体の変異体」は、「親抗体」と比較して１つ以上の変異を含む抗体分子である。アミノ酸置換は、天然アミノ酸を別の天然に存在するアミノ酸、または天然に存在しないアミノ酸誘導体と交換し得る。アミノ酸置換は保存的であっても非保存的であってもよい。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の３つの表のうちの１つ以上に反映されるアミノ酸のクラス内の置換によって画定され得る。

本発明の文脈において、変異体における置換は、以下のように示されている：
元のアミノ酸－位置－置換アミノ酸
アミノ酸残基を示すために、コードＸａａ及びＸを含む３文字コード、または１文字コードが使用される。したがって、表記「Ｔ３６６Ｗ」は、変異体が、親抗体における３６６位のアミノ酸に対応する変異体アミノ酸位置において、トリプトファンによるスレオニンの置換を含むことを意味する。

更に、「置換」という用語は、他の１９個の天然アミノ酸のいずれか１つへの置換、または非天然アミノ酸等の他のアミノ酸への置換を含む。例えば、３６６位のアミノ酸Ｔの置換は、以下の置換のそれぞれを含む：３６６Ａ、３６６Ｃ、３６６Ｄ、３６６Ｇ、３６６Ｈ、３６６Ｆ、３６６Ｉ、３６６Ｋ、３６６Ｌ、３６６Ｍ、３６６Ｎ、３６６Ｐ、３６６Ｑ、３６６Ｒ、３６６Ｓ、３６６Ｅ、３６６Ｖ、３６６Ｗ、及び３６６Ｙ。

「全長抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、そのアイソタイプの野生型抗体に通常見出されるものに対応する全ての重鎖及び軽鎖定常及び可変ドメインを含む抗体を指す。

「キメラ抗体」という用語は、可変領域が非ヒト種（例えば、げっ歯類に由来する）に由来し、定常領域がヒトなどの異なる種に由来する抗体を指す。キメラ抗体は、遺伝子工学によって生成され得る。治療用途のためのキメラモノクローナル抗体は、抗体免疫原性を低減するために開発される。

「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体定常ドメイン、及びヒト可変ドメインと高レベルの配列相同性を含有するように改変された非ヒト可変ドメインを含有する遺伝子操作された非ヒト抗体を指す。これは、一緒に抗原結合部位を形成する６つの非ヒト抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）を相同ヒトアクセプターフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することによって達成することができる。親抗体の結合親和性及び特異性を完全に再構築するために、親抗体（すなわち、非ヒト抗体）からのフレームワーク残基のヒトフレームワーク領域への置換（逆変異）が必要とされ得る。構造相同性モデリングは、抗体の結合特性に重要なフレームワーク領域内のアミノ酸残基を同定するのに役立ち得る。したがって、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ配列、主に、非ヒトアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸逆変異を任意選択で含むヒトフレームワーク領域、及び任意選択で完全ヒト定常領域を含んでもよい。任意選択で、必ずしも逆変異ではない追加のアミノ酸修飾を導入して、親和性及び生化学的特性等の好ましい特性を有するヒト化抗体を得ることができる。非ヒト治療抗体のヒト化は、ヒトにおけるその免疫原性を最小限に抑えるために行われるが、そのようなヒト化抗体は同時に、非ヒト由来の抗体の特異性及び結合親和性を維持する。

「多重特異性抗体」という用語は、２つ以上の抗原結合領域の存在に起因する、少なくとも２つの異なる、例えば少なくとも３つの、典型的には重複しないエピトープに対する特異性を有する抗体を指す。そのようなエピトープは、同じ標的抗原上にあっても、異なる標的抗原上にあってもよい。エピトープが異なる標的上にある場合、そのような標的は同じ細胞上にある場合もあれば、異なる細胞または細胞型上にある場合もある。

「二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合領域の存在に起因して、２つの異なる、典型的には重複しないエピトープに対する特異性を有する抗体を指す。そのようなエピトープは、同じ標的上にあっても、異なる標的上にあってもよい。エピトープが異なる標的上にある場合、そのような標的は同じ細胞上にある場合もあれば、異なる細胞または細胞型上にある場合もある。

異なるクラスの二重特異性抗体の例としては、以下に限定するものではないが、（ｉ）ヘテロ二量体化を強制するための相補性ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子、（ｉｉ）組換えＩｇＧ様二重標的分子であって、分子の２つの側面がそれぞれ、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂ断片またはＦａｂ断片の一部を含有する、組換えＩｇＧ様二重標的分子、（ｉｉｉ）ＩｇＧ融合分子であって、全長ＩｇＧ抗体が余分なＦａｂ断片またはＦａｂ断片の一部に融合される、ＩｇＧ融合分子、（ｉｖ）Ｆｃ融合分子であって、単鎖Ｆｖ分子または安定化ダイアボディが重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域またはその一部に融合される、Ｆｃ融合分子、（ｖ）Ｆａｂ融合分子であって、異なるＦａｂ断片が一緒に融合され、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域またはその一部に融合される、Ｆａｂ融合分子、及び（ｖｉ）ｓｃＦｖ及び二重鎖抗体ベースの抗体及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））であって、異なる単鎖Ｆｖ分子もしくは異なる二重特異性抗体もしくは異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））が互いに融合され、または重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域もしくはその一部に融合される別のタンパク質もしくは担体分子に融合される、ｓｃＦｖ及び二重特異性抗体ベースの抗体及び重鎖抗体が挙げられる。

相補的なＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子の例としては、限定されないが、Ｔｒｉｏｍａｂ（登録商標）（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的にマッチングした（Ａｍｇｅｎ，Ｃｈｕｇａｉ，Ｏｎｃｏｍｅｄ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｗｒａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２８７（５２）：４３３３１－９，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１２．３９７８６９．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １）、ＤＩＧ－ｂｏｄｙ ａｎｄ ＰＩＧ－ｂｏｄｙ（Ｐｈａｒｍａｂｃｉｎｅ，ＷＯ２０１０１３４６６６，ＷＯ２０１４０８１２０２）、Ｓｔｒａｎｄ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｄｏｍａｉｎ ｂｏｄｙ（ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ（Ｍｅｒｕｓ，ＷＯ２０１３１５７９５３）、ＦｃΔＡｄｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、二重特異性ＩｇＧ１及びＩｇＧ２（Ｐｆｉｚｅｒ／Ｒｉｎａｔ），Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ／Ｍｅｒｃｋ）、ｍＡｂ－Ｆｖ（Ｘｅｎｃｏｒ）、二価の二重特異性抗体（Ｒｏｃｈｅ，ＷＯ２００９０８０２５４）及びＤｕｏＢｏｄｙ（登録商標）分子（Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられる。

組換えＩｇＧ様二重標的分子の例として、限定されないが、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ、ＷＯ２００９０５８３８３）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｂｏｓｔｒｏｍ，ｅｔ ａｌ ２００９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２３，１６１０－１６１４）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ｚｙｎｇｅｎｉａ，ＬａＦｌｅｕｒ ｅｔ ａｌ．ＭＡｂｓ．２０１３ Ｍａｒ－Ａｐｒ；５（２）：２０８－１８）、一般的な軽鎖を用いたアプローチ（ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）、κλＢｏｄｉｅｓ（ＮｏｖＩｍｍｕｎｅ，ＷＯ２０１２０２３０５３）、及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（登録商標）（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ，Ｄｏｐｐａｌａｐｕｄｉ，Ｖ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ ２００７．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１７，５０１－５０６）が挙げられる。

ＩｇＧ融合分子の例として、限定されないが、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、二重ドメイン二重ヘッド抗体（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ、Ｓａｎｏｆｉ Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＩｇＧ様二重特異性（ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ，Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（２）：１９１－８）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ，Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｏｃｔ ３０；３９３（３）：６７２－９２）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＷＯ２０１０１１１６２５）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ｓｃＦｖ融合（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｓｃＦｖ融合（Ｃｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｄａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ）、及びＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。

Ｆｃ融合分子の例として、限定されないが、ｓｃＦｖ／Ｆｃ融合（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ，Ｐｅａｒｃｅ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔ．１９９７ Ｓｅｐ；４２（６）：１１７９），ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．ＡＡＣＲ １００ｔｈ Ａｎｎｕａｌ ｍｅｅｔｉｎｇ ２００９（Ａｂｓｔｒａｃｔ ＃５４６５）、Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ，ＷＯ２０１０１１１６２５）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｆｃ－ＤＡＲＴＴＭ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）及びＤｕａｌ（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｃｈｉｎａ）が挙げられる。

Ｆａｂ融合二重特異性抗体の例として、限定されないが、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｂｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（登録商標）（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。

ｓｃＦｖベース、二重特異性抗体ベースの抗体、及びドメイン抗体の例として、限定されないが、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ（登録商標））（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ，Ｔａｎｄｅｍ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＤＡＲＴＴＭ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｄｉａｂｏｄｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８ Ａｐｒ ３；４２５（３）：４７９－８４）、ＴＣＲ－ｌｉｋｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＡＩＴ，ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ＳｃＦｖ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ，ＷＯ２０１００５９３１５）及びＣＯＭＢＯＤＹ分子（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ａｕｇ；８８（６）：６６７－７５）、ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ａｂｌｙｎｘ，Ｈｍｉｌａ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１０）、デュアルターゲティング重鎖単独ドメイン抗体が挙げられる。いくつかの実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、ＶＨＨ－Ｆｃフォーマットであり、すなわち、抗体は、ヒトＦｃ領域二量体を介して互いに連結されている２つ以上の単一ドメイン抗原結合領域を含む。このフォーマットでは、各単一ドメイン抗原結合領域は、Ｆｃ領域ポリペプチドに融合され、２つの融合ポリペプチドは、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋を介して二量体二重特異性抗体を形成する。かかる構築物は、典型的には、完全な、または任意のＣＨ１または軽鎖配列を含有しない。ＷＯ０６０６４１３６の図１２Ｂは、本実施形態の一例の例示を提供する。

抗原に結合する抗体の文脈では、「結合する」または「特異的に結合する」という用語は、例えば、本明細書の実施例に記載されるフローサイトメトリーを使用して決定される場合、典型的には、約１０^－６Ｍ以下、例えば、１０^－７Ｍ以下、例えば、約１０^－８Ｍ以下、例えば、約１０^－９Ｍ以下、約１０^－１０Ｍ以下、または約１０^－１１Ｍ以下のＫ_Ｄに対応する親和性を有する、所定の抗原または標的（例えば、ヒトＣＤ１２３またはＶδ２）への抗体の結合を指す。あるいは、Ｋ_Ｄ値は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅＴ２００の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術、またはＯｃｔｅｔＲＥＤ９６機器のバイオ層干渉法（ＢＬＩ）を使用して、抗原をリガンドとして、結合部分または結合分子を分析物として使用して決定することができる。特異的結合とは、抗体が、所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）との結合に対する親和性よりも少なくとも１０倍低い、例えば、少なくとも１００倍低い、例えば、少なくとも１，０００倍低い、例えば、少なくとも１０，０００倍低い、例えば、少なくとも１００，０００倍低い、Ｋ_Ｄに対応する親和性で所定の抗原と結合することを意味する。親和性が低い程度は、結合部分または結合分子のＫ_Ｄに依存するため、結合部分または結合分子のＫ_Ｄが非常に低い場合（すなわち、結合部分または結合分子が非常に特異的である場合）、抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性よりも低い程度は、少なくとも１０，０００倍であり得る。「Ｋ_Ｄ」（Ｍ）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原と結合部分または結合分子との間の特定の相互作用の解離平衡定数を指す。

本発明の文脈では、「競合」または「競合できる」または「競合する」とは、結合パートナーに結合する別の分子（例えば、異なるＣＤ１２３抗体）の存在下で、特定の結合分子（例えば、ＣＤ１２３抗体）が特定の結合パートナー（例えば、ＣＤ１２３）に結合する傾向が検出可能に有意に低下することを指す。典型的には、競合とは、例えば、十分な量の２つ以上の競合分子、例えば、抗体を使用したＥＬＩＳＡ分析またはフローサイトメトリーによって決定される、抗体などの別の分子の存在によって引き起こされる、少なくとも約２５％の低下、例えば、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも９０％の結合の低下を意味する。競合阻害によって結合特異性を決定するための追加の方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ，ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，５８９－６０１（１９８３））に見出すことができる。一実施形態では、本発明の抗体は、抗体１Ｄ２または１Ａ３と同じＣＤ１２３上のエピトープ、及び／または抗体５Ｃ８、６Ｈ４、６Ｃ１、５Ｄ３（ＷＯ２０１５１５６６７３）または５Ｃ８ｖａｒ１（ＷＯ２０２００６０４０５）と同じＶδ２上のエピトープに結合する。５Ｃ８のエピトープは、残基Ｓ３３、Ｓ４３及びＫ４５（配列番号４８）を含むことが決定されている。６Ｈ４のエピトープは、残基Ｒ１３９、Ｋ１５２、Ｓ１８９及びＳ１９１（配列番号４８）を含むことが決定されている。エピトープの一部であるペプチドの同定を可能にする架橋結合質量分析、及びエピトープを形成する抗原上の個々の残基を同定するＸ線結晶学を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で知られている標的抗原上の抗体エピトープをマッピングするために利用可能ないくつかの方法がある。エピトープ残基は、抗体由来の５Å以下の少なくとも１つの原子を有する全てのアミノ酸残基であると決定することができる。ファン・デル・ワールス半径内の原子及び水を媒介する可能性のある水素結合を考慮して、５Åをエピトープカットオフ距離として選択した。次に、エピトープ残基は、少なくとも１つの原子が８Å以下である全てのアミノ酸残基であると決定することができる。８Å以下が、伸長されたアルギニンアミノ酸の長さを考慮するためのエピトープカットオフ距離として選択される。架橋結合質量分析は、抗体及び抗原を質量標識された化学架橋剤で結合することから始まる。次に、複合体の存在を、高質量ＭＡＬＤＩ検出を使用して確認する。化学的に架橋した後、Ａｂ／Ａｇ複合体は非常に安定であるため、多くの様々な酵素及び消化条件を複合体に適用して、多くの異なる重複するペプチドを提供することができる。これらのペプチドの同定は、高分解能質量分析及びＭＳ／ＭＳ技術を使用して行われる。架橋ペプチドの同定は、架橋試薬に連結された質量タグを使用して決定される。ＭＳ／ＭＳ断片化及びデータ解析後、架橋され、抗原に由来するペプチドはエピトープの一部であり、抗体に由来するペプチドはパラトープの一部である。発見された個々の架橋ペプチドからの最もＮ末端及びＣ末端の架橋残基間の全ての残基は、エピトープまたはパラトープの一部であるとみなされる。

「第１の」及び「第２の」抗原結合領域という用語は、本明細書で使用される場合、抗体におけるそれらの向き／位置を指さず、すなわち、それらは、Ｎ末端またはＣ末端に関して意味を持たない。「第１の」及び「第２の」という用語は、特許請求の範囲及び説明における２つの異なる抗原結合領域を正確かつ一貫して指すようにのみ機能する。

「ヒトＣＤ１２３に結合することができる」とは、抗体が、別個の分子として、及び／またはＣＤ１２３／ＣＤ１３１複合体の一部として、ヒトＣＤ１２３に結合することができることを意味する。しかしながら、抗体は、別個の分子としてＣＤ１３１に結合しない。

「Ｖγ９Ｖδ２－ＴＣＲのＶδ２鎖に結合することができる」とは、抗体が別個の分子として、及び／またはＶγ９Ｖδ２－ＴＣＲの一部として、Ｖδ２鎖に結合することができることを意味する。しかしながら、抗体は、別個の分子としてＶγ９鎖と結合しない。

「％の配列同一性」は、本明細書で使用する場合、異なる配列が共有する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸位置の数（すなわち、％の同一性＝同一の位置の＃／位置の総＃×１００）を指し、最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮する。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、例えば、ＰＡＭ１２０重み残基表（ＰＡＭ１２０ ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長さペナルティ及び４のギャップペナルティを使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ ４，１１－１７（１９８８）のアルゴリズムを用いて決定してもよい。

本発明の更なる態様及び実施形態
上記のように、第１の主な態様では、本発明は、ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域と、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合することができる第２の抗原結合領域とを含む多重特異性抗体に関する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。他の実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体である。他の実施形態では、第１の抗原結合領域は、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変領域からなる単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、第２の抗原結合領域は、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変領域からなる単一ドメイン抗体である。更なる実施形態では、第１の抗原－抗原結合領域及び第２の抗原結合領域の両方は、単一ドメイン抗体、例えば、それぞれが重鎖可変領域からなる単一ドメイン抗体である。

更なる実施形態において、多重特異性抗体は二重特異性抗体であり、第１の抗原結合領域は単一ドメイン抗体であり、第２の抗原結合領域は単一ドメイン抗体である。上記二重特異性抗体は、リンカー及び／または免疫グロブリンＦｃ領域等の更なる配列を任意選択で含んでもよい。

一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトＣＤ１２３への結合のために、配列番号１に記載の配列を有する抗体と競合する（すなわち、競合することができる）、好ましくは、多重特異性抗体は、配列番号１に記載の配列を有する抗体とヒトＣＤ１２３上の同じエピトープに結合する。一実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書の実施例１１に記載されるように決定される、Ｓ２０３～Ｒ２７３の領域内に完全に含まれるエピトープ等の、Ｓ２０３～Ｒ２７３の領域内の１つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

別の実施形態では、多重特異性抗体は、領域Ｓ２０３～Ｔ２１４内の１つ以上の残基と、領域Ｈ２２１～Ｋ２２７内の１つ以上の残基と、領域Ｙ２３８～Ｋ２４４内の１つ以上の残基と、領域Ｙ２６８～Ｒ２７３内の１つ以上の残基とを含むヒトＣＤ１２３上のエピトープに結合する（図１４）。

別の実施形態では、多重特異性抗体は、残基Ｓ２０３、Ｔ２０９、Ｔ２１４、Ｈ２２１、Ｈ２２５、Ｋ２２７、Ｙ２３８、Ｋ２４４、Ｙ２６８、Ｔ２６９及びＲ２７３のうちの１つ、複数、全てを含むヒトＣＤ１２３上のエピトープに結合する（図１４）。

一実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含む。

一実施形態では、配列番号２において、Ｘ_１はＧである。別の実施形態では、Ｘ_１はＳである。

一実施形態では、配列番号３において、Ｘ_２はＡである。別の実施形態では、Ｘ_２はＴである。

一実施形態では、配列番号４において、Ｘ_３はＹである。別の実施形態では、Ｘ_３はＦである。

一実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＦである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＦである。

一実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＦである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＦである。

一実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号１に記載の配列、または配列番号１に記載の配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。

別の実施形態において、第１の抗原結合領域は、配列番号２５～３４に記載の配列の群から選択される配列、または配列番号２５～３４に記載の配列の群から選択される配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなる。

別の実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号９に記載の配列を有する抗体と、ヒト3ＣＤ１２３への結合のために競合し、好ましくは、多重特異性抗体は、配列番号９に記載の配列を有する抗体とヒトＣＤ１２３上の同じエピトープに結合する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書の実施例１１に記載されるように決定される、Ｈ２２５～Ｔ２６７の領域内に完全に含まれるエピトープ等の、Ｈ２２５～Ｔ２６７の領域内の１つ以上の残基を含むエピトープに結合する。

別の実施形態では、多重特異性抗体は、領域Ｈ２２５及びＲ２３４に１つ以上の残基、ならびに領域Ｔ２５１～Ｔ２６７に１つ以上の残基を含むヒトＣＤ１２３上のエピトープに結合する。

別の実施形態では、多重特異性抗体は、残基Ｈ２２５、Ｈ２３１、Ｒ２３４、Ｔ２５１、Ｒ２５５、及びＴ２６７のうちの１つ、複数、全てを含むヒトＣＤ１２３上のエピトープに結合する。

一実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含む。

一実施形態では、第１の抗原結合領域は、配列番号９に記載の配列、または配列番号９に記載の配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなる。

上述のように、本発明の多重特異性抗体は、ヒトＶγ９Ｖδ２－Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合することができる第２の抗原結合領域を含む。Ｖδ２は、Ｖγ９Ｖδ２－ＴＣＲのデルタ鎖の一部である。ヒトＶδ２に結合することができる抗体は、Ｖδ２領域内に完全に位置するエピトープに結合するか、またはＶδ２領域とデルタ鎖の定常領域との残基の組み合わせであるエピトープに結合し得る。一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を活性化することができる。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化は、遺伝子発現及び／または（表面）マーカー発現（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、またはＣＤ１０７ａなどの活性化マーカー）及び／または分泌タンパク質（例えば、サイトカインまたはケモカイン）プロファイルによって測定され得る。好ましい実施形態では、多重特異性抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による、ＣＤ１０７ａ発現の増加（本明細書の実施例を参照）及び／またはサイトカイン産生（例えば、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）によって特徴付けられる脱顆粒をもたらす活性化（例えば、ＣＤ６９及び／またはＣＤ２５発現の上方調節）を誘導することができる。好ましくは、本発明の多重特異性抗体は、本明細書の実施例に記載されるように試験した場合、ＣＤ１０７ａ陽性細胞の数を少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍増加させることができる。別の好ましい実施形態において、本発明の多重特異性抗体は、本明細書の実施例に記載のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞及びＣ１Ｒ－ｎｅｏ標的細胞を使用して試験した場合、ＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合を、５０ｐＭ以下、例えば、２５ｐＭ以下、例えば、２０ｐＭ以下、例えば、１５ｐＭ以下、例えば、１０ｐＭ以下、増加させるためのＥＣ５０値を有する。

Ｖδ２に結合するいくつかの抗体が、ＷＯ２０１５１５６６７３に記載されており、それらの抗原結合領域または少なくともそのＣＤＲ配列を、本発明の多重特異性抗体に組み込むことができる。

一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号１７に記載の配列を有する抗体と、ヒトＶδ２への結合のために競合し、式中、Ｘ_４はＹである。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号１７に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号３６に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２への結合のために競合し、好ましくは、多重特異性抗体は、配列番号３６に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号３７に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２への結合のために競合し、好ましくは、多重特異性抗体は、配列番号３７に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合する。

一実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号３８に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２への結合のために競合し、好ましくは、多重特異性抗体は、配列番号３８に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合する。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含む。一実施形態では、配列番号２０のＸ_４はＹである。別の実施形態では、配列番号２０のＸ_４はＦである。別の実施形態では、配列番号２０のＸ_４はＳである。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号４０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列及び配列番号４１に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列、または配列番号３６に記載の配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号４２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号４３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列、または配列番号３７に記載の配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号４５に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号４６に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４７に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列、または配列番号３８に記載の配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。

本発明の多重特異性抗体の一実施形態では、第２の抗原結合領域はヒト化される。

更なる実施形態では、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列または配列番号１７に記載の配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、配列番号１７のＸ_４はＹである。別の実施形態では、配列番号１７のＸ_４はＦである。別の実施形態では、配列番号１７のＸ_４はＳである。

本発明の多重特異性抗体の好ましい実施形態において、
（ｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、第２の抗原結合領域は、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含む、または
（ｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、第２の抗原結合領域は、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含む。

本発明の多重特異性抗体の更なる好ましい実施形態では、
（ｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号１に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択で、Ｘ_４はＹであり、または
（ｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２５に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｉｖ）第１の抗原結合領域は、配列番号２６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｖ）第１の抗原結合領域は、配列番号２７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択的にＸ_４はＹであり、または
（ｖｉ）第１の抗原結合領域は配列番号２８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択的にＸ_４はＹであり、または
（ｖｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｖｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３０に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｉｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３１に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３２に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｘｉ）第１の抗原結合領域は配列番号３３に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹであり、または
（ｘｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３４に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号１７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、任意選択でＸ_４はＹである。

本発明の多重特異性抗体の更なる好ましい実施形態では、
（ｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号１に示される配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２５に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｖ）第１の抗原結合領域は、配列番号２６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域が、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖ）第１の抗原結合領域が、配列番号２７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３０に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３１に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３２に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３３に示される配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３４に示される配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなる。

本発明の多重特異性抗体の更なる好ましい実施形態では、
（ｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号１に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２５に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｖ）第１の抗原結合領域は、配列番号２６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖ）第１の抗原結合領域が、配列番号２７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３０に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３１に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３２に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３３に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３４に示される配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなる。

本発明の多重特異性抗体の更なる好ましい実施形態では、
（ｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号１に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２５に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｖ）第１の抗原結合領域は、配列番号２６に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖ）第１の抗原結合領域は、配列番号２７に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号２９に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｖｉｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３０に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３１に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘ）第１の抗原結合領域は、配列番号３２に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３３に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｘｉｉ）第１の抗原結合領域は、配列番号３４に記載の配列を含むか、もしくはそれからなり、第２の抗原結合領域は、配列番号３８に記載の配列を含むか、もしくはそれからなる。

多重特異性抗体中の第１及び第２の抗原結合領域は、様々な方法で配置され得る。一実施形態では、抗原結合領域は、共有結合リンカーなどのリンカーを介して互いに接続される。一実施形態では、第１の抗原結合領域及び第２の抗原結合領域は、ペプチドリンカー、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または１０個のアミノ酸など、１～２０個のアミノ酸、例えば、１～１０個のアミノ酸の長さを有するリンカーを介して、互いに共有結合している。一実施形態では、ペプチドリンカーは、セリンに続く４つのグリシンの配列を含むか、またはそれからなる。

いくつかの実施形態では、ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域は、ヒトＶδ２鎖に結合することができる第２の抗原結合領域のＮ末端に位置する。別の実施形態では、ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域は、ヒトＶδ２鎖に結合することができる第２の抗原結合領域のＣ末端に位置する。

二重特異性抗体などの本発明の多重特異性抗体は、第１及び第２の抗原結合領域を超える更なる分子、ドメインまたはポリペプチド配列を含有し得る。一実施形態では、多重特異性抗体は、半減期延長ドメイン、すなわち、ヒト患者の循環中の分子の半減期を延長するドメインを更に含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、ヒト対象に投与された場合に約１６８時間よりも長い末端半減期を有する。最も好ましくは、末端半減期は３３６時間以上である。本明細書で使用される場合、抗体の「末端半減期」は、排除の最終段階でインビボで、ポリペプチドの血清濃度が５０％減少するのにかかる時間を指す。

一実施形態では、多重特異性抗体は、Ｆｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域を含む。一実施形態では、多重特異性抗体は、ＶＨＨ－Ｆｃフォーマットであり、すなわち、抗体は、ヒトＦｃ領域二量体を介して互いに連結される２つ以上の単一ドメイン抗原結合領域を含み、各単一ドメイン抗原結合領域は、Ｆｃ領域ポリペプチド（ＣＨ１または軽鎖配列を含まない）に融合され、２つの融合ポリペプチドは、ヒンジ領域内のジスルフィド架橋を介して二量体二重特異性抗体を形成する。

二重特異性抗体を作製するための様々な方法が当該技術分野で説明されており、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ（２０１７）ＭＡｂｓ ９：１８２及びＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １８：５８５で考察されている。本発明の一実施形態では、Ｆｃ領域は、２つのＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体であり、第１の抗原結合領域は第１のＦｃポリペプチドに融合され、第２の抗原結合領域は第２のＦｃポリペプチドに融合され、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成を促進する非対称アミノ酸変異を含む（例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：６１７を参照されたい）。本明細書の更なる実施形態では、ＦｃポリペプチドのＣＨ３領域は、上記非対称アミノ酸変異を含み、好ましくは、第１のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、かつ第２のＦｃポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含むか、またはその逆を含み、ここでのアミノ酸位置は、ＥＵ付番システムによるヒトＩｇＧ１に対応する。更なる実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドの２２０位のシステイン残基は、欠失または置換されており、アミノ酸位置は、ＥＵ付番システムによるヒトＩｇＧ１に対応する。更なる実施形態では、当該領域は、配列番号３５に記載の配列を含む。

いくつかの実施形態では、第１及び／または第２のＦｃポリペプチドは、Ｆｃ領域を不活性にする、すなわちエフェクター機能を媒介することができない変異を含有する。一実施形態では、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、２３４位及び／または２３５位に変異を含み、好ましくは、第１及び第２のＦｃポリペプチドは、Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅ置換を含み、アミノ酸位置は、ＥＵ付番システムによるヒトＩｇＧ１に対応する。

好ましい実施形態では、
第１の抗原結合領域は、配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、第２の抗原結合領域は、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、
第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２１に記載の配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２２に記載の配列を含むか、またはその逆を含む。

別の好ましい実施形態では、
第１の抗原結合領域は、配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、第２の抗原結合領域は、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、
第１のＦｃポリペプチドは、配列番号２１に記載の配列を含み、第２のＦｃポリペプチドは、配列番号２２に記載の配列を含むか、またはその逆を含む。

更に好ましい実施形態では、本発明の抗体は以下からなる：
（ｉ）配列番号１、９、及び２５～３４に記載の配列、配列番号３５に記載の配列、及び配列番号２１に記載の配列からなる群から選択される配列からなる第１の抗原結合領域からなる第１のポリペプチド鎖、及び
（ｉ）配列番号１７に記載の配列（Ｘ_４はＹであり、配列番号３５に記載の配列、及び配列番号２２に記載の配列）からなる第２の抗原結合領域からなる第２のポリペプチド鎖。

更に好ましい実施形態では、本発明の抗体は以下からなる：
（ｉ）配列番号１、９、及び２５～３４に記載の配列、配列番号３５に記載の配列、及び配列番号２２に記載の配列からなる群から選択される配列からなる第１の抗原結合領域からなる第１のポリペプチド鎖、及び
（ｉ）配列番号１７に記載の配列（Ｘ_４はＹであり、配列番号３５に記載の配列、及び配列番号２１に記載の配列）からなる第２の抗原結合領域からなる第２のポリペプチド鎖。

一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞によるＣＤ１２３発現細胞、例えば、Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ細胞またはＴＨＰ－１細胞の死滅を媒介することが可能である。

好ましくは、抗体は、本明細書の実施例５に記載されるように試験した場合、５０ｐＭ以下、例えば、２５ｐＭ以下、例えば、２０ｐＭ以下、例えば、１５ｐＭ以下、例えば、１０ｐＭ以下、または５ｐＭ以下、例えば、２ｐＭ以下のＥＣ５０値を有するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化によってＣ１Ｒ－ｎｅｏ細胞の死滅を誘導することができる。

別の実施形態では、本抗体は、本明細書の実施例５に記載されるように試験した場合、１００ｐＭ以下、例えば、５０ｐＭ以下、例えば、２５ｐＭ以下、例えば、２０ｐＭ以下、例えば、１５ｐＭ以下、例えば、１０ｐＭ以下、または更には５ｐＭ以下、例えば、２ｐＭ以下のＥＣ５０値を有するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化によって、ＴＨＰ－１細胞の死滅を誘導することができる。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、ヒト患者由来ＣＤ１２３発現骨髄由来ＡＭＬ腫瘍細胞の死滅を媒介することができる。そのような死滅は、例えば、本明細書の実施例６に記載されるように決定され得る。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、本明細書の実施例６に記載のアッセイにおいて決定される１００ｆＭの濃度において、２５％超、例えば５０％超の特異的細胞死を媒介することができる。

更なる実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＤ１２３陰性ヒト細胞等のＣＤ１２３陰性細胞の死滅を媒介することができない。

更なる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、本明細書の実施例３に記載されるように試験される場合、５０ｎＭ以下、例えば、２０ｎＭ以下、例えば、１０ｎＭ以下、例えば、５ｎＭ以下のＥＣ５０で一過性ＣＤ１２３発現２９３Ｆ細胞に結合することができる。

更なる実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、本明細書の実施例４に記載されるように試験される場合、５０ｎＭ以下、例えば２０ｎＭ以下、例えば１０ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下のＥＣ５０を有する組換えＣＤ１２３－Ｆｃ融合タンパク質に結合することができる。

更なる主な態様では、本発明は、ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域を含む抗体であって、上記第１の抗原結合領域が単一ドメイン抗体であり、
（ｉ）配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、上記第１の抗原結合領域が、配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列、もしくは配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなり、または
（ｉｉ）配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、上記第１の抗原結合領域が、配列番号９に記載の配列、もしくは上記配列番号９に記載の配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなる、抗体に関する。

一実施形態では、配列番号２において、Ｘ_１はＧである。別の実施形態では、Ｘ_１はＳである。

一実施形態では、配列番号３において、Ｘ_２はＡである。別の実施形態では、Ｘ_２はＴである。

一実施形態では、配列番号４において、Ｘ_３はＹである。別の実施形態では、Ｘ_３はＦである。

一実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＦである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＧであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＦである。

一実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＡであり、Ｘ_３はＦである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＹである。

別の実施形態では、Ｘ_１はＳであり、Ｘ_２はＴであり、Ｘ_３はＦである。

更なる主な態様では、本発明は、本明細書に記載される本発明による多重特異性抗体等の抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物に関する。

抗体は、（Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２０１２ Ｊｕｎｅ，ＩＳＢＮ ９７８０８５７１１０２７５）に開示されているような従来の技術に従って、薬学的に許容される賦形剤を用いて製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤、ならびに任意の他の担体、希釈剤またはアジュバントは、抗体及び選択された投与様式に好適であるべきである。賦形剤及び薬学的組成物の他の成分に対する適合性は、本発明の選択された抗体または薬学的組成物の所望の生物学的特性に対する有意な悪影響（例えば、抗原結合に対する実質的な影響（１０％以下の相対的阻害、５％以下の相対的阻害等）未満）の欠如に基づいて決定される。

薬学的組成物は、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０またはＴｗｅｅｎ－８０などの非イオン性洗剤）、安定剤（例えば、糖またはタンパク質を含まないアミノ酸）、防腐剤、組織固定剤、可溶化剤、及び／または薬学的組成物に包含するのに適した他の材料を含み得る。更なる薬学的に許容される賦形剤としては、本発明の抗体と生理学的に互換性のある任意の及び全ての好適な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張性剤、酸化防止剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。

更なる主な態様では、本発明は、薬剤として使用するための本明細書に記載の本発明に従う多重特異性抗体に関する。

本発明による多重特異性抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による腫瘍細胞、特にＣＤ１２３陽性腫瘍細胞の死滅に有益な微小環境を作製することを可能にする。

したがって、更なる主な態様では、本発明は、がんの治療に使用するための本明細書に記載の本発明にかかる多重特異性抗体に関する。更なる主な態様では、本発明は、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、芽細胞性形質細胞様樹状突起腫瘍、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ増殖性障害または骨髄異形成症候群の治療に使用するための、本明細書に記載の本発明に従う多重特異性抗体に関する。

同様に、本発明は、本明細書に記載の本発明による多重特異性抗体を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、疾患の治療方法に関する。一実施形態では、疾患は、がん、例えば、急性骨髄性白血病である。

いくつかの実施形態では、抗体は、単剤療法として投与される。しかしながら、本発明の抗体も、併用療法、すなわち、治療する疾患または状態に関連する他の治療剤と併用して投与してもよい。

「治療する」または「治療すること」は、症状または疾患状態を緩和、改善、阻止、根絶（硬化）または予防する目的で、本発明にかかる有効量の抗体を投与することを指す。「有効な量」は、所望の治療結果を達成するために必要な用量及び期間に有効な量を指す。抗体等の有効量のポリペプチドは、疾患の病期、年齢、性別、及び個体の体重、ならびに抗体が個体において所望の応答を誘発する能力等の要因に応じて変化し得る。有効量はまた、治療上有益な効果によって抗体の任意の毒性または有害な効果を上回るものである。本発明の抗体の有効量の例示的な非限定的な範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．５、約０．３、約１、約３、約５、または約８ｍｇ／ｋｇである。投与は、任意の好適な経路によって行われ得るが、典型的には、静脈内、筋肉内、または皮下等の非経口である。

本発明の多重特異性抗体は、典型的には、組換えで、すなわち、適切な宿主細胞において抗体をコードする核酸構築物の発現、続いて、細胞培養物から産生された組換え抗体の精製によって産生される。核酸構築物は、当該技術分野で周知の標準的な分子生物学的技法によって産生され得る。構築物は、典型的には、発現ベクターを使用して宿主細胞に導入される。好適な核酸構築物及び発現ベクターは当該技術分野で既知である。抗体の組換え発現に好適な宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、ＣＨＯ、ＨＥＫ－２９３、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、ＰＥＲ－Ｃ６、ＮＳ／０及びＳｐ２／０細胞を含む。

したがって、更なる態様では、本発明は、本発明の抗体、例えば、本発明にかかる多重特異性抗体をコードする核酸構築物に関する。一実施形態では、構築物は、ＤＮＡ構築物である。別の実施形態では、構築物はＲＮＡ構築物である。

更なる態様では、本発明は、本発明にかかる多重特異性抗体をコードする核酸構築物を含む発現ベクターに関する。

更なる態様において、本発明は、本発明にかかる多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸構築物または本発明にかかる多重特異性抗体をコードする核酸構築物を含む発現ベクターを含む宿主細胞に関する。

本明細書で引用される全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書で引用されるいずれの参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願の言及も、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国で共通の一般知識の一部を形成するという承認または何らか形態の示唆ではなく、そのようにみなされるべきではない。

実施例１：Ｃ１Ｒ－ＣＤ１ｄ細胞で免疫化した動物から作製したファージディスプレイライブラリーからの抗ＣＤ１２３ ＶＨＨの選択及び同定
ラマグラマ（２匹の動物）を、ＣＤ１２３発現Ｃ１Ｒ－ＣＤ１ｄ細胞で免疫化し、その後、「免疫」ＶＨＨファージ抗体ライブラリーを記載通りに作製した（Ｌａｍｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９：１１１）。これらのライブラリーを、捕捉された組換えヒトＣＤ１２３または直接コーティングされたＣＤ１２３抗原（細胞外ドメイン、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）上のファージ選択に使用した。１回または２回の連続した選択ラウンドを実施した。ファージ選択の１回及び２回のラウンドの後、単一のファージクローンをＥＬＩＳＡで組換え捕捉された抗原への結合についてスクリーニングした。結合に対して陽性と評価されたこれらのクローンを配列決定し、次いで、異なる配列を有する全てのクローンを、フローサイトメトリーにおいて免疫化に使用される細胞株への結合について試験した。次いで、ＦＡＣＳに結合を示すＶＨＨクローンを、更なる特性評価のために選択した。８つの異なるクローンを特定し、以下と称した：１Ｅ２、１Ｂ４、１Ａ３、２Ｄ１１、１Ｄ２、１Ｅ４、１Ｈ１、及び１Ｆ１。

実施例２：二重特異性ＶＨＨの合成遺伝子合成、産生及び精製
次いで、ＣＤ１２３特異的ＶＨＨドメイン抗体の配列を、Ｖδ２特異的ＶＨＨ（５Ｃ８ｖａｒ１；配列番号１７、式中、Ｘ_４はＹ）を配向させた二重特異的ＶＨＨに再形成した：Ｎ末端－抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ－リンカー－抗Ｖδ２ ＶＨＨ－Ｃタグ。使用されるＶδ２特異的ＶＨＨは、配列番号１７（式中、Ｘ_４はＹである）に記載される。２つのＶＨＨドメイン間のリンカーは、配列Ｇ４Ｓを有するグリシン（Ｇ）－セリン（Ｓ）ストレッチであった。これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔでの合成遺伝子合成によって作製し、次いで、方向性クローニングによって真核発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１＋（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。タンパク質を、Ｈｅｋ２９３Ｅ細胞中で一過性トランスフェクションによって発現させ、次いで（発現の５日後に）サプライヤーのプロトコルに従って、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ｃ－ｔａｇ親和性マトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、条件付け細胞培養上清から精製した。精製二重特異性ＶＨＨは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色を使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定されるように、常に＞９５％純粋であり、非常に低レベルのエンドトキシン（＜０．５ＥＵ／ｍｇ）を含有した。

実施例３：ＥＬＩＳＡにおける二重特異性抗ＣＤ１２３×Ｖδ２ ＶＨＨの結合の特異性
組換え精製ＣＤ１２３抗原（細胞外ドメイン；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、またはＣＤ１２３抗原のＦｃ融合物（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、ＰＢＳ中のＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルに、２μｇ／ｍｌの濃度でコーティングした。陰性対照として、ウェルを１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡでコーティングした。ヒトＦｃに融合したヒトＶγ９及びＶδ２ ＴＣＲ鎖の細胞外ドメインの、自社で設計、産生、及び精製した組換え形態も、２μｇ／ｍｌで抗原としてコーティングした。２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡでウェルをコーティング及びブロックした後、二重特異性ＶＨＨタンパク質を５０ｎＭの飽和濃度での結合について試験し、結合したＶＨＨを、ＨＲＰ標識抗ＶＨＨ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて検出し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）／Ｈ２Ｏ２を用いて染色した。

図１は、ＥＬＩＳＡにおいて、１Ａ３－５Ｃ８ｖａｒ１及び１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１のみが、ＣＤ１２３及びγδ－ＴＣＲ（γδＴ細胞受容体）の両方に対して強力かつ特異的な結合を示したことを示す。他の二重特異性は、ＣＤ１２３に弱く結合したか、または結合しなかった。

実施例４：フローサイトメトリーを使用した二重特異性抗ＣＤ１２３×Ｖδ２ ＶＨＨの結合の特異性
ヒトＣＤ１２３及び受容体の共通β鎖（ＣＤ１３１）の発現構築物をＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。プラスミドを化学的に能力のあるＤＨ５α細菌に形質転換し、選択的培地上で増殖する単一のコロニーを使用して５０ｍｌ培養物を接種し、両方の構築物を増幅した。次いで、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、精製ＤＮＡをフリースタイル２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。プラスミド単独、または２つのプラスミドの混合物のいずれかをトランスフェクションに使用した。陰性対照として、トランスフェクションしていない細胞もフローサイトメトリーに使用した。トランスフェクションの１日後、細胞を使用して、ＦＡＣＳでの染色を使用して二重特異性ＶＨＨの結合を試験した。手短に言えば、飽和濃度が１００ｎＭの二重特異性ＶＨＨのトランスフェクト細胞への結合を、ＡＦ６４７標識抗ＶＨＨ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）抗体で検出し、ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（Ｂｅｃｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して染色を視覚化した。

図２は、１Ａ３－５Ｃ８ｖａｒ１及び１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の両方が、抗原が単独で発現されたとき、またはＣＤ１３１と併せて発現されたときに、ＣＤ１２３を強くかつ特異的に認識したことを示す。１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１は、フローサイトメトリーにおいて最も強いシグナルを与えた。

フローサイトメトリーを用いてＣＤ１２３に対する１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の見かけの親和性を決定するために、この二重特異性ＶＨＨの濃度範囲を、ＣＤ１２３、ＣＤ１３１またはＣＤ１２３及び－１３１の両方を発現する一過性にトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞への結合について試験した。前者の細胞（ＣＤ１３１を発現する）を陰性対照として用いた。

図３は、ＣＤ１２３を（一過性に）発現する細胞のみが認識されたが、ＣＤ１３１は認識されなかったため、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１がＣＤ１２３に対して絶妙に特異的であったことを再び示す。更に、データは、フローサイトメトリーを使用して決定された、ＣＤ１２３への１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１結合の見かけの親和性が、約３ｎＭであったことを示す。この値は、ＣＤ１２３単独への結合、または共発現ＣＤ１２３及び－１３１への結合について同等であった。

実施例５：バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用したＣＤ１２３を結合するための１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の親和性決定
１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１のＣＤ１２３への結合の動態を決定するために、組換え精製ＣＤ１２３－Ｆｃ融合タンパク質（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）機器用の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅセンサー（５μｇ／ｍｌの濃度を使用して）に１ｎｍの密度までロードした。次いで、異なるセンサーを異なる濃度の１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１に浸し、供給者によって提供される１０倍の速度論的緩衝液（１０×ＫＢ）中で希釈を行った。得られたセンサーグラムから、速度論的な結合速度定数と解離速度定数をカーブフィッティングによって決定した。

図４は、カーブフィッティングに使用された実際のセンサーグラムを示している。後者は、図中で直線として示される。これを使用して、速度論的な結合速度定数及び解離速度定数を決定し、それによって抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ １Ｄ２の親和性を決定した。測定を２回実施し、ＣＤ１２３に対する１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の親和性を３～５ｎＭの間で測定した。

実施例６：ＣＤ１２３依存性、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１媒介性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化及びＴ細胞媒介性標的細胞細胞毒性
バフィーコートをＳａｎｑｕｉｎ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。説明された手順を使用して、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって、ＰＢＭＣをこれらのバフィーコートから単離した。高純度のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、Ｖδ２特異的抗体を使用してＭＡＣＳによって得て、これらを、公開されている方法を使用して増殖した（ｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１２８）。ＣＤ１２３陽性Ｂリンパ芽細胞、ＥＢＶ形質転換Ｃ１Ｒ ｎｅｏ細胞株（ＣＲＬ－２３６９）及びＣＤ１２３陽性ＡＭＬ由来ＴＨＰ－１細胞株（ＴＩＢ－２０２）をアメリカ型培養物収集物から入手し、供給者の指示に従って培養した。標的細胞を、細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）により、３７℃で２０分間標識した。Ｔ細胞活性化を測定するために、細胞を、細胞が脱顆粒すると細胞表面に露出する活性化マーカーＣＤ１０７ａ（またはＬＡＭＰ－１、リソソーム関連膜タンパク質－１）について染色した。二重特異性抗体の濃度範囲を、ＰＥ標識抗ＣＤ１０７Ａ抗体の存在下で、標的細胞及び増殖したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（各５０，０００細胞）の１：１の混合物を用いて、最終体積１００μｌで４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、蛍光標識された抗ＣＤ３及び抗Ｖγ９抗体の混合物で染色して、Ｔ細胞及び生／死染色を同定した（７－ＡＡＤ）。サンプルを、ＦＡＣＳ Ｃｅｌｅｓｔａ（Ｂｅｃｋｔｏｎ ａｎｄ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。Ｔ細胞が媒介する標的細胞細胞毒性を評価するために、本質的に同じ設定を使用し、抗ＣＤ１０７Ａ抗体のみを添加せず、ＣＴＶ標識された標的細胞及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を二重特異性ＶＨＨの存在下で２４時間インキュベートした。アッセイの終わりに、細胞を再びＣＤ３及びＶγ９について染色し、生／死染色（７－ＡＡＤ）の存在下でフローサイトメトリーを使用して分析した。

図５は、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１が、ｐＭ範囲内のＥＣ５０で強力なＴ細胞活性化を引き起こしたことを示す。標的細胞の非存在下では、高濃度の１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１は、バックグラウンド活性化のみを引き起こした（データ割愛）。Ｔ細胞活性化を誘導する１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の効力は、使用されるＴ細胞ドナーにわずかに依存した；ＥＣ５０値は、３～１３ｐＭの範囲であった。

観察されたＴ細胞の活性化が標的細胞の溶解ももたらすかどうかを決定するために、１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）の比及び２４時間の時点を使用して、細胞毒性アッセイを実行した。図６は、増殖したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下で、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１がＣ１Ｒ－ｎｅｏ標的細胞の溶解を強力に誘導したことを示す。細胞毒性のＥＣ５０は、使用されるＴ細胞ドナーに依存して、１～２ｐＭの間のカーブフィッティングによって決定した（２人のドナーのデータが示されている）。

同じ細胞毒性アッセイをＣＤ１２３陽性ＡＭＬ細胞株、ＴＨＰ－１、で繰り返した。ＴＨＰ－１標的細胞溶解を誘導する１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の効力は、非常に同等であった。ＥＣ５０は１ｐＭと測定した。対照的に、標的細胞溶解を誘導するための１Ａ３－５Ｃ８ｖａｒ１の効力は、約５０ｐＭ と測定された。図７。

実施例７：二重特異性ＶＨＨ媒介性、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化及びＴ細胞誘導による原発性ＡＭＬ細胞の溶解
ＡＭＬ患者に由来する２５，０００個の骨髄由来の単核細胞を、健康なドナーに由来する増殖したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と１：１の比率で一晩共培養した。細胞を、ＰＥ標識ＣＤ１０７ａ抗体の存在下、及び１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１の濃度範囲（１０ｆＭ～１００ｎＭの範囲）で培養した。細胞を採取し、洗浄し、蛍光標識された抗ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ３４、ＣＤ３３及びＣＤ２抗体を含有する抗体混合物を用いて４℃で３０秒間標識した。洗浄後、細胞を生／死染色（７ＡＡＤ）及び１２３カウントビーズの混合物中に再懸濁し、続いてＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して分析した。

図８は、両方の二重特異性ＶＨＨ化合物が、ＣＤ１２３陽性原発性ＡＭＬ芽球に依存して、強力なＴ細胞活性化を誘導することが可能であったことを示す。加えて、化合物は、高レベルの腫瘍細胞溶解を引き起こし、両方とも、この細胞毒性において有意な効力を示した。ＥＣ５０値は、得られたカーブから明確に決定することができなかったが、ｆＭ範囲内（１ｐＭ未満）であった。

実施例８：ＣＤＲグラフティングを使用した抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ １Ｄ２のヒト化
１Ｄ２ ＶＨＨ抗体断片を、ＣＤＲグラフティング技術を使用してヒト化した（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、及びＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌｕｍｅ １，Ｃｈａｐｔｅｒ ２１を参照）。まず、ＩｇＢＬＡＳＴを使用してヒト生殖細胞系列配列を特定した（Ｙｅ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１３， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１：Ｗ３４－４０）。最も近いヒト生殖細胞系列配列として、Ｖ遺伝子ＩＧＶＨ３－２３^＊０４を特定した（７８．４％同一性）。この生殖細胞系列配列を使用して、ラマＣＤＲ（ヒト生殖細胞系列ＩＧＶＨ３－２３^＊０４と９１．８％の同一性）を直接移植し、以下のｃＤＮＡ構築物を得た。配列番号３１である。次に、ＮＣＢＩ ＮＲデータベース（２０２０年９月２７日にダウンロード）をＢＬＡＳＴＰ（バージョン２．１０．０＋）を使用してクエリして、１Ｄ２配列との最も高い同一性を示したヒト鋳型配列を同定した。７０％以上の類似性スコアを示し、好ましくは、それぞれ１Ｄ２ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のものと同一である、類似のＣＤＲ長を示した２つのＶＨ配列が同定された。ＧｅｎＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１（Ｄ１）：Ｄ３６－４２）受託＃ＣＡＤ６０３５７．１、及びＡＫＵ３８５６７．１によってコードされるフレームワークを、１Ｄ２ ＣＤＲのグラフト化のためのテンプレートとして選択し、以下のｃＤＮＡ構築物を得た：各々、配列番号２８及び３２である。フレームワーク及びＣＤＲの定義は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって決定されるものである（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３））。ＶＨＨの構造に対するヒト化フレームワーク残基の効果を理解するために、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ ４．２．１５６（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）内の「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（抗体予測）」ツール（デフォルトパラメータ）を使用して、１Ｄ２ ＶＨＨの相同性モデルを作製した。相同性モデルは、ＰＤＢ ＩＤ ６ＧＫＵに基づいて構築した。ＣＤＲをシリコーでグラフトして、ＣＤＲのループコンフォメーション、表面の疎水性、及び構造的完全性（例えば、剛性の増加）としての特徴に対するヒト残基の効果を研究した。得られた構築物をこれらの特徴についてチェックし、追加の構築物の設計をもたらした。配列番号２５、２６、２７、２９、３０、３３、及び３４。次いで、これらのヒト化１Ｄ２－ＶＨＨの配列を、Ｖδ２特異的ＶＨＨ（５Ｃ８ｖａｒ１；配列番号１７、式中、Ｘ_４はＹ）を配向させた二重特異的ＶＨＨに再形成した：Ｎ末端－ヒト化－抗１Ｄ２ ＶＨＨ－リンカー－抗Ｖδ２ ＶＨＨ－Ｃタグ。次いで、これらの分子をコードするｃＤＮＡを合成し、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における発現のための発現ベクターにクローニングした。タンパク質を細胞の一過性トランスフェクションによって作製し、Ｃタグ親和性クロマトグラフィーを使用して培養上清から精製し、続いて分取サイズ排除クロマトグラフィーを使用した。

実施例９：バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用したＣＤ１２３を結合するためのヒト化１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）変異体の親和性決定
ヒト化１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１変異体のＣＤ１２３への結合の動態を決定するために、組換え精製ＣＤ１２３－Ｆｃ融合タンパク質（Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６ｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）機器用の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅセンサー（５μｇ／ｍｌの濃度を使用して）に１ｎｍの密度までロードした。次いで、異なるセンサーを、５０ｎＭ及びその２倍希釈から開始して、異なる濃度のヒト化１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１変異体に浸した。希釈は、供給者によって提供される１０倍速度論的緩衝液（１０×ＫＢ）中で行った。得られたセンサーグラムから、速度論的な結合速度定数と解離速度定数をカーブフィッティングによって決定した。適合が可能な場合、結合速度定数及び解離速度定数を使用して、ＣＤ１２３への結合についてのヒト化１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１変異体の親和性を算出した。測定を２回実施し、ＣＤ１２３に対する異なるヒト化１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１変異体の親和性は、表２に示されるように、親１Ｄ２と比較して類似した２．６ｎＭから非結合変異体までの範囲であった。参照のために、非ヒト化（親）１Ｄ２をこれらの実験に含めた。

実施例１０：半減期延長（Ｆｃ含有）二重特異性構築物
１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１二重特異性ＶＨＨを、ヒトＦｃドメインを含有する治療用抗体フォーマットに再フォーマットした。両方のＶＨＨドメインを、以下の特徴を有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（すなわち、ＣＨ２及びＣＨ３）ドメインにカップリングした：ＶＨＨを修飾ヒンジ（ＡＡＡ、続いてＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ）、及びヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインにカップリングした。ＣＨ２ドメインは、ＬＦＬＥ変異対（Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ）によってＦｃサイレンシングされ、ＣＨ３ドメインは、同じ細胞内の２つの鎖の共発現時に、ヘテロ二量体化を強制する、「ノブ－イントゥ－ホール」変異（ノブ：Ｔ３６６Ｗ及びホール：Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ）により変異された。この変異対は、科学文献に記載されている（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ９：６１７）。抗Ｖγ９Ｖδ２重鎖のＣ末端に、精製目的のＣ末端タグを装備した（ＡＡＡＥＰＥＡ（配列番号５３））。構築物の配列は、配列番号４９及び配列番号５０に記載されている。結果として得られた抗体構築物を１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃと称した。

タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞における２つの発現ベクターをコードする共トランスフェクションをすることと、Ｃ－ｔａｇ親和性クロマトグラフィー、続いて分取サイズ排除クロマトグラフィーによって培養上清から精製することとを介して作製した。これにより、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの高単量体タンパク質調製物が得られた。図９。

実施例１１：１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃは、標的依存性Ｔ細胞活性化を誘導し、二重特異性ＶＨＨと同等の効力を有するＴ細胞媒介性標的細胞細胞毒性を引き起こす
次いで、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞とＴＨＰ－１腫瘍細胞との共培養（１：１の比率で）において、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃが標的依存性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を誘導する能力について試験した。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、当該技術分野で既知の手順を使用して、健康なドナーの血液から増殖させた。ＴＨＰ－１細胞株（ＡＴＣＣカタログ番号Ｎｒ．ＴＩＢ－２０２）をサプライヤーの推奨に従って培養した。両方の細胞型の４時間の共培養において、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を、ＣＤ１０７ａを染色し、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合を測定することによって測定した。図１０は、１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃが標的依存性Ｔ細胞活性化を誘導したことを示す（化合物の非存在下でのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と腫瘍細胞の共培養において活性化は観察されなかった、データ割愛）。ＥＣ５０は、典型的には、ｐＭの範囲であり、４～１６ｐＭの範囲であった（使用されるドナーに依存する）。

注目すべきは、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を誘導するＦｃ含有分子の効力は、二重特異性ＶＨＨとは測定可能に異なるものではなかった。これは、３つの異なる独立したＴ細胞ドナーについて観察された。このＴ細胞の活性化が標的細胞の溶解ももたらしたかどうかを決定するために、ＴＨＰ－１標的細胞の生存率を、抗体の存在下でのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との２４時間の共培養（１：１の比）後に測定した。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を健康なドナーの血液から単離し、標準化されたプロトコルを用いて増殖させた。アッセイの前日に、ＴＨＰ－１標的細胞株を、フローサイトメトリーでエフェクター細胞集団と区別することができるように、細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識した。増加した濃度の化合物の存在下での２４時間の共培養後、生体標的細胞の割合を決定した。図１１。

図１１は、二重特異性ＶＨＨ及びＦｃ含有対応物が両方とも強力なＴ細胞媒介性標的細胞細胞毒性を誘導し、標的細胞溶解を引き起こす際の両方の分子の効力が測定可能に異なるわけではないことを示す。ＥＣ５０値は、使用されるドナーに応じて、１～３ｐＭの範囲であった。化合物の非存在下での共培養では、標的細胞溶解は観察されなかった（データ割愛）。２４時間後、アッセイ中の全ての標的細胞を死滅させた。

実施例１２：１Ｄ２－５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃは、標的陽性正常細胞よりも腫瘍細胞の優先的な殺傷を引き起こす
抗体がＣＤ１２３陽性正常細胞の死滅をどの程度誘導したかを決定するために、ＣＤ１２３を発現することが知られている形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）（Ｃｏｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４０，１：２２－３０）を、ＭＡＣＳ選別（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｒ．１３０－０９７－４１５）を用いて２人の健康なドナーの血液から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分から濃縮した。ＴＨＰ－１細胞株を、ＣＤ１２３を発現する腫瘍細胞株として使用した。ＣＤ１２３の染色及びフローサイトメトリーによる分析を使用して、ＣＤ１２３の発現レベルがｐＤＣ上でＴＨＰ－１細胞株よりも約１０倍高いことが示された。図１２。

次いで、ＴＨＰ－１細胞株、ｐＤＣ、及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の共培養において、標的細胞の混合物に対するＣＤ１２３標的化合物とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との併用による細胞傷害効果を、１：１：２の比率で決定した。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を健康なドナーの血液から単離し、標準化されたプロトコルを用いて増殖させた。アッセイの前日に、ＴＨＰ－１標的細胞株を、フローサイトメトリーでエフェクター細胞集団及び他の標的細胞と区別することができるように、細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識した。増加する濃度の化合物の存在下での２４時間の共培養後、Ｖγ９（Ｔ細胞）、ＣＤ３０３（ｐＤＣ）、ＣＴＶ（ＴＨＰ－１）及びＣＤ１２３（ＴＨＰ－１及びｐＤＣ）を染色することによって、生体標的細胞の割合を決定し、フローサイトメトリーによって分析した。

図１３は、二重特異性抗体が、約１ｐＭの効力（ＥＣ５０）で予想されるＴＨＰ－１標的細胞溶解（図１１）を誘導したことを示す。しかし驚くべきことに、ｐＤＣ上のＣＤ１２３標的分子の１０倍高い発現レベルにもかかわらず（図１２）、これらの細胞は、はるかに少ない影響を受けた。観察された最大溶解は、より低く、アッセイで見出されたＥＣ５０は、ＴＨＰ－１細胞溶解で見出されたものよりもほぼ１０倍高かった。ドナー番号２の結果は類似していた（ＴＨＰ－１及びｐＤＣのそれぞれについて１及び１１ｐＭのＥＣ５０値、データ割愛）。これらのデータは、化合物及びＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞による標的陽性正常細胞よりも腫瘍細胞の溶解の優先的な誘導を示す。

実施例１３：エピトープマッピングは、膜近位エピトープに結合するための１Ｄ２ ＶＨＨを明らかにする
ＣＤ１２３上のどのエピトープが抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ １Ｄ２によって認識されたかを決定するために、このエピトープを、質量分析に基づく方法を使用してマッピングした（Ｐｉｍｅｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．４３（２）：１８５－９５）。ＣＤ１２３分子内のいくつかの残基が、抗体に架橋されていることが見出された。図１４。

図１４は、ヒトＣＤ１２３のアミノ酸２０３～２７３の領域に存在する１Ｄ２のエピトープを同定する。これらの残基を分子の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ ５ＵＶ８：Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８ Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ９：３８６）でハイライトすると、これは、最も近位の膜であり、１０１１Å^２の表面積をカバーする第２のドメインにマッピングされる。

図１５は、リード抗ＣＤ１２３抗体によって認識されるエピトープが膜の近くに位置することを示す。スパンした距離は約４０Åであり、これはエピトープにとって珍しいことではない。１Ｄ２ ＶＨＨの全てのＣＤＲ領域は、ＣＤＲ３に対して特に強いシグナルを伴って、抗原に架橋されていることが見出された。

同様の実験を行って、ＣＤ１２３上のどのエピトープが抗ＣＤ１２３ ＶＨＨ １Ａ３によって認識されたかを決定した。ＣＤ１２３の残基Ｈ２２５、Ｈ２３１、Ｒ２３４、Ｔ２５１、Ｒ２５５及びＴ２６７は、１Ａ３抗体に架橋していることが見出された。

実施例１４：１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃは、良好な安定性プロファイルを示す
１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの熱安定性を、ナノ微分走査蛍光測定法（ｎａｎｏ－ＤＳＦ）によって分析した。タンパク質は、＞６０℃のアンフォールディング温度で高い熱安定性を示した（表３）。更に、１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃを加速ストレス試験に供した。サンプルを、高温（４０℃）及び酸性（５０ｍＭ酢酸塩緩衝液、ｐＨ５．０）及び塩基性（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．５）条件下で１週間、ならびに酸化条件下（リン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４及び０．０５％Ｈ_２Ｏ_２）で、６時間及び２４時間インキュベートした。任意のストレス誘発性変化を、変性（ＳＤＳ）条件下（ＣＥ－ＳＤＳ）及び還元後の（Ａ）紫外線吸収（ＳＥＣ－ＵＶ）によって検出されたサイズ排除クロマトグラフィー及び（Ｂ）キャピラリーゲル電気泳動によって凝集体及び断片を測定することによって分析した（図１６）。非ストレス基準サンプルと比較して、ストレスタンパク質サンプルの検出可能な分解は観察されなかった。タンパク質は非常に安定であることが見出された。

実施例１５：Ｖδ２－ＣＤ１２３二重特異性抗体１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）は、Ｔ細胞活性化及びＴ細胞媒介性腫瘍細胞細胞毒性の誘導において、７Ａ５ベースのＶγ９－ＣＤ１２３二重特異性抗体よりも強力である
Ｖδ２－ＣＤ１２３二重特異性抗体１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃの効力を、Ｖγ９結合Ｆａｂ抗体７Ａ５に基づくＶγ９－ＣＤ１２３－Ｆｃ二重特異性抗体と比較した。７Ａ５の配列は、Ｋａｂｅｌｉｔｚ教授の好意により提供された。抗体は、Ｏｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４（５）：１３４９に特徴付けられている。抗体７Ａ５の変異体は、Ｇａｎｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２１）Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３５（８）：２２７４－２２８４及びＷＯ２０２０／２２７４５７に記載されている。Ｆａｂ７Ａ５の配列を、ＣＨ３におけるノブ－イントゥ－ホール変異、及びＦｃサイレンシング変異Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅを含むヒトＣＨ２及びＣＨ３配列に融合させた。次いで、このＶγ９結合「半ＩｇＧ」（配列番号５１及び５２）を、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞においてＣＤ１２３特異的ＶＨＨ－Ｆｃ融合物と共発現させて、二重特異性Ｖγ９×ＣＤ１２３二重特異性抗体を形成した。タンパク質を、Ｖγ９結合アーム内のＣＨ３のＣ末端に存在するＣ末端タグを介して精製し、次いで調製サイズ除外を介して更に精製した。これにより、純粋で本質的にエンドトキシンを含まないタンパク質が得られた。１Ｄ２×Ｆａｂ ７Ａ５－Ｆｃは、１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃと同じＣＤ１２３結合ＶＨＨアームを有する。アッセイのために、５０，０００個の増殖したＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、５０，０００個のＫａｓｕｍｉ－３またはＴＨＰ１標的細胞、及び２つの化合物の希釈系列と共培養した。結果が図１７に示される。（Ａ）脱顆粒を、フローサイトメトリーを介してＣＤ１０７ａ（リソソーム関連タンパク質－１、またはＬＡＭＰ－１）陽性細胞の割合を測定することによって、４時間後に分析した。（Ｂ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を、ＣＤ２５陽性細胞の割合を測定することにより分析し、（Ｃ）細胞毒性をフローサイトメトリーを介して２４時間後の生体標的細胞の割合を分析することにより、分析した。１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃは、ＣＤ１０７ａ陽性細胞ならびにＣＤ２５陽性細胞の割合が高く、Ｖγ９標的化化合物を使用したときに観察されたものよりも低いＥＣ５０値によって証明されるように、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のより強力な活性化及び脱顆粒を誘導した。細胞毒性におけるより高い効力は、有意に低いＥＣ５０値によって証明されるように、１Ｄ２×Ｆａｂ７Ａ５－Ｆｃと比較して、１Ｄ２×５Ｃ８ｖａｒ１（Ｙ１０５Ｆ）－Ｆｃを使用して観察された。

Claims (22)

1. ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域と、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞受容体のＶδ２鎖に結合することができる第２の抗原結合領域とを含む、多重特異性抗体。
2. 前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１に記載の多重特異性抗体。
3. 前記第１の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体であり、及び／または前記第２の抗原結合領域が、単一ドメイン抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
4. 前記多重特異性抗体が、配列番号１に記載の配列を有する抗体と、ヒトＣＤ１２３への結合のために競合し、好ましくは、前記多重特異性抗体が、前記配列番号１に記載の配列を有する抗体とヒトＣＤ１２３上の同じエピトープに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
5. 前記第１の抗原結合領域が、配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合領域が、配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列、または配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
6. 前記多重特異性抗体が、配列番号９に記載の配列を有する抗体と、ヒトＣＤ１２３への結合のために競合し、好ましくは、前記多重特異性抗体が、前記配列番号９に記載の配列を有する抗体とヒトＣＤ１２３上の同じエピトープに結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
7. 前記第１の抗原結合領域が、配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合領域が、前記配列番号９に記載の配列、または前記配列番号９に記載の配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる、請求項６に記載の多重特異性抗体。
8. 前記多重特異性抗体が、ヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を活性化することが可能である、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
9. 前記多重特異性抗体が、配列番号１７に記載の配列を有する抗体と、ヒトＶδ２への結合のために競合し、式中、Ｘ_４がＹであり、好ましくは、前記多重特異性抗体が、前記配列番号１７に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合し、式中、Ｘ_４がＹであり、
   または
   前記多重特異性抗体が、配列番号３６に記載の配列を有する抗体と、ヒトＶδ２への結合のために競合し、好ましくは、前記多重特異性抗体が、前記配列番号３６に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合し、
   または
   前記多重特異性抗体が、配列番号３７に記載の配列を有する抗体と、ヒトＶδ２への結合のために競合し、好ましくは、前記多重特異性抗体が、前記配列番号３７に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合し、
   または
   前記多重特異性抗体が、配列番号３８に記載の配列を有する抗体と、ヒトＶδ２への結合のために競合し、好ましくは、前記多重特異性抗体が、前記配列番号３８に記載の配列を有する抗体とヒトＶδ２上の同じエピトープに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
10. 前記第２の抗原結合領域が、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第２の抗原結合領域が、前記配列番号１７に記載の配列、もしくは前記配列番号１７に記載の配列と少なくとも９０％、例えば、少なくとも９２％、例えば、少なくとも９４％、例えば、少なくとも９６％、例えば、少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなり、
    または
    前記第２の抗原結合領域が、配列番号３９に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号４０に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４１に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第２の抗原結合領域が、前記配列番号３６に記載の配列、もしくは前記配列番号３６に記載の配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなり、
    または
    前記第２の抗原結合領域が、配列番号４２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号４３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第２の抗原結合領域が、前記配列番号３７に記載の配列、もしくは前記配列番号３７に記載の配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなり、
    または
    前記第２の抗原結合領域が、配列番号４５に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号４６に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４７に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第２の抗原結合領域が、前記配列番号３８に記載の配列、もしくは前記配列番号３８に記載の配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなる、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
11. （ｉ）前記第１の抗原結合領域が、配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含む、または
    （ｉｉ）前記第１の抗原結合領域が、配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、前記第２の抗原結合領域が、配列番号１８に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１９に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号２０に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
12. ヒトＣＤ１２３に結合することができる前記第１の抗原結合領域が、前記ヒトＶδ２鎖に結合することができる前記第２の抗原結合領域のＮ末端に位置する、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
13. 前記多重特異性抗体が、Ｆｃ領域、好ましくはヒトＦｃ領域などの半減期延長ドメインを更に含む、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
14. 前記Ｆｃ領域が、２つのＦｃポリペプチドを含むヘテロ二量体であり、前記第１の抗原結合領域が、第１のＦｃポリペプチドに融合され、前記第２の抗原結合領域が、第２のＦｃポリペプチドに融合され、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、ホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成を促進する非対称アミノ酸変異を含み、好ましくは、前記第１のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｗ置換を含み、かつ前記第２のＦｃポリペプチドが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含むか、またはその逆を含み、前記アミノ酸位置が、ＥＵ付番システムによるヒトＩｇＧ１に対応する、請求項１３に記載の多重特異性抗体。
15. 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドの２２０位のシステイン残基が欠失または置換されており、前記アミノ酸位置が、前記ＥＵ付番システムによるヒトＩｇＧ１に対応する、請求項１３または１４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
16. 前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、２３４位及び／または２３５位に変異を更に含み、好ましくは、前記第１及び第２のＦｃポリペプチドが、Ｌ２３４Ｆ及びＬ２３５Ｅ置換を含み、前記アミノ酸位置が、前記ＥＵ付番システムによるヒトＩｇＧ１に対応する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
17. 前記第１のＦｃポリペプチドが配列番号２１に記載の配列を含み、前記第２のＦｃポリペプチドが、配列番号２２に記載の配列を含むか、またはその逆を含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
18. 前記多重特異性抗体が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞によるＣＤ１２３発現細胞、例えば、Ｃ１Ｒ－ｎｅｏ細胞またはＴＨＰ－１細胞の殺傷を媒介することが可能である、先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
19. ヒトＣＤ１２３に結合することができる第１の抗原結合領域を含む抗体であって、前記第１の抗原結合領域が単一ドメイン抗体であり、
    （ｉ）配列番号２に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号４に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合領域が、配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列、もしくは配列番号１、２５～３４に記載の配列の群から選択される配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなり、または、
    （ｉｉ）配列番号１０に記載のＶＨ ＣＤＲ１配列、配列番号１１に記載のＶＨ ＣＤＲ２配列、及び配列番号１２に記載のＶＨ ＣＤＲ３配列を含み、好ましくは、前記第１の抗原結合領域が、配列番号９に記載の配列、または前記配列番号９に記載の配列と少なくとも９０％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくはそれからなる、前記抗体。
20. 先行請求項のいずれか１項に記載の多重特異性抗体、または請求項１９に記載の抗体と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
21. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の多重特異性抗体、または医薬として、好ましくはがんの治療に使用するため、より好ましくは急性骨髄性白血病、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、芽細胞性形質細胞様樹状突起腫瘍、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞慢性リンパ増殖性疾患または骨髄異形成症候群の治療に使用するための請求項１９に記載の抗体。
22. 請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列、または請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体をコードする１つ以上の核酸構築物を含む宿主細胞を含む、核酸構築物。