JP2019513777A - 免疫療法薬を標的とする多重特異性抗原結合構築物 - Google Patents

免疫療法薬を標的とする多重特異性抗原結合構築物 Download PDF

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Abstract

免疫療法薬を標的とする多重特異性抗原結合構築物について記載する。多重特異性抗原結合構築物は、免疫療法薬（例えばＣＡＲ−Ｔ細胞または二重特異性Ｔ細胞係合子）に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、腫瘍関連抗原に結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む。さらに、腫瘍細胞に対する免疫療法薬の結合の指向性変化または強化をもたらすために多重特異性抗原結合構築物を使用する方法、及び免疫療法薬による処置後に再発したかまたは当該処置が失敗した患者を処置する方法について記載する。

Description

背景
免疫療法は、従来の抗がん化学療法に比べて、腫瘍の遺伝学的耐性機序に打ち勝つための向上した能力、及び低減された健常組織毒性プロファイルを示す。とりわけ、免疫によって媒介される腫瘍細胞溶解を腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）へと指向することは、造血組織及び固形組織の新生物処置プロトコールに革命をもたらし、多くの患者に永続的寛解をもたらした。しかしながら、ＴＡＡ下方制御を含めて、抗原特異的免疫療法への耐性機序が浮上し、改良された処置選択肢の開発が必要になった。
操作されたＴＡＡ特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴリンパ球による自家養子細胞療法は、再発／難治性Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）患者においてとりわけ有効な処置様式であり、現在多くの腫瘍学的効用についての追求がなされている。同様に、二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）生物製剤は、ＴＡＡと、ＴＣＲ ＣＤ３シグナル伝達サブユニットとに共係合することによって標的指向的な細胞傷害性応答を促進するものであり、Ｂ−ＡＬＬ処置において承認されている。これらの手法は、適応免疫能力を抗原特異的細胞傷害性及び長期に及ぶ免疫学的記憶に活用することができるが、ＴＡＡ陰性腫瘍変異型の増殖ゆえに、ＢｉＴＥ及びＣＡＲ−Ｔ療法患者はかなりの割合で再発する。
概要
本明細書では、免疫療法薬を標的とする多重特異性抗原結合構築物、及びそれを使用する方法について記載する。本開示の特定の態様は、免疫療法薬による腫瘍細胞への結合の指向性を変化させる方法であって、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む多重特異性抗原結合構築物に免疫療法薬を接触させることを含み、免疫療法薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該方法に関する。
本開示のいくつかの態様は、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者における免疫療法薬の治療効果を延長する方法であって、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む有効量の多重特異性抗原結合構築物を患者に投与することを含み、免疫療法薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該方法に関する。
本開示のいくつかの態様は、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者のがんを処置する方法であって、有効量の多重特異性抗原結合構築物を当該患者に投与することを含み、多重特異性抗原結合構築物が、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、免疫療法薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該方法に関する。
本開示のいくつかの態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を、ＣＡＲまたはＴＣＲに結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む多重特異性抗原結合構築物に接触させることを含む、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化させる方法であって、ＣＡＲまたはＴＣＲが、第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを含む、当該方法に関する。
本開示のいくつかの態様は、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む多重特異性抗原結合構築物であって、免疫療法薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該多重特異性抗原結合構築物に関する。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸に関する。いくつかの態様は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸を含む宿主細胞に関する。
本開示の特定の態様は、免疫療法薬による腫瘍細胞への結合の指向性を変化させるための、多重特異性抗原結合構築物の使用であって、多重特異性抗原結合構築物が、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、免疫治療薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該使用に関する。
本開示のいくつかの態様は、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者における免疫療法薬の治療効果を延長するための、多重特異性抗原結合構築物の使用であって、多重特異性抗原結合構築物が、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、免疫治療薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該使用に関する。
本開示のいくつかの態様は、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者においてがんを処置するための、多重特異性抗原結合構築物の使用であって、多重特異性抗原結合構築物が、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、免疫治療薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該使用に関する。
本開示のいくつかの態様は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化させるための、多重特異性抗原結合構築物の使用であって、多重特異性抗原結合構築物が、ＣＡＲまたはＴＣＲに結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、ＣＡＲまたはＴＣＲが、第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを含む、当該使用に関する。
本開示のいくつかの態様は、多重特異性抗原結合構築物と薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物であって、多重特異性抗原結合構築物が、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、免疫治療薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該医薬組成物に関する。
本開示のいくつかの態様は、医薬の製造における多重特異性抗原結合構築物の使用であって、多重特異性抗原結合構築物が、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、免疫治療薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該使用に関する。
腫瘍関連抗原として抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ及びＣＤ７９ｂを標的とする多重特異性抗原結合構築物の一実施形態の概略図を描写する。 記載されている多重特異性抗原結合構築物のいくつかの典型的な型を描写する。 抗ＦＬＡＧ×抗メソテリン（ＭＳＬＮ）二重特異性抗体及び抗ＦＭＣ６３ｉｄ×抗ＭＳＬＮ二重特異性抗体はＭＳＬＮ＋ Ａ１８４７細胞に結合するが対照ＲＰＭＩ８２２６細胞には結合せず（Ａ）、抗ＦＬＡＧ×抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体及び抗ＦＭＣ６３ｉｄ×抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体はＢＣＭＡ＋ ＲＰＭＩ８２２６細胞に結合するが対照Ａ１８４７細胞には結合しない（Ｂ）、ということを描写する。 ＨＥＫ２９３細胞（Ａ）または初代ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｂ）において安定的に発現するＦＭＣ６３を含有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物に対する抗ＦＭＣ６３ｉｄ×抗メソテリン及び抗ＦＭＣ６３ｉｄ×抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体の選択的結合を描写する。 （Ａ）ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ細胞との共培養によって堅牢に活性化されるが、ＣＤ１９陰性ＳＫＯＶ３細胞との共培養では活性化されない、ということを示し、また、（Ｂ）ＭＳＬＮ＋ ＳＫＯＶ３細胞の存在下で抗ＦＭＣ６３ｉｄ×抗メソテリン二重特異性抗体がＣＡＲ−Ｔ細胞の指向性を変化させて活性化を増強したこと、及びＢＣＭＡ＋ ＲＰＭＩ８２２６細胞の存在下で抗ＦＭＣ６３ｉｄ×抗ＢＣＭＡ二重特異性抗体がＣＡＲ−Ｔ細胞の指向性を変化させて活性化を増強したことを示す。
詳細な説明
本明細書では、免疫療法薬を標的とする多重特異性抗原結合構築物について記載する。具体的には、多重特異性抗原結合構築物は、免疫療法薬と少なくとも１つの腫瘍関連抗原とに結合することができる。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、腫瘍関連抗原に結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む。いくつかの実施形態では、免疫療法薬は、腫瘍関連抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたエフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、免疫療法薬は、Ｔ細胞と腫瘍関連抗原とに結合することができる治療剤であり得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の標的となる腫瘍関連抗原は、免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原とは異なる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の標的となる腫瘍関連抗原は、免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原と同一であるものの、多重特異性抗原結合構築物と免疫療法薬とが、腫瘍関連抗原上の異なるエピトープに結合する。
本明細書ではさらに、腫瘍細胞に対する免疫療法薬の結合の指向性変化または強化をもたらすために多重特異性抗原結合構築物を使用する方法について記載する。これらの方法によれば、多重特異性抗原結合構築物は第１抗原結合ポリペプチド構築物によって免疫療法薬に結合し、第２抗原結合ポリペプチドによって腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原に結合する。第２抗原結合ポリペプチドは、免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原とは異なる腫瘍関連抗原に結合するかまたは、腫瘍関連抗原上の、免疫療法薬の標的となるエピトープとは異なるエピトープに結合するかのどちらかである。したがって、いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は免疫療法薬の結合の指向性を、免疫療法薬の同族腫瘍関連抗原またはエピトープから、第２抗原結合ポリペプチド構築物の標的となる腫瘍関連抗原またはエピトープへと向け変える。いくつかの実施形態では、免疫療法薬は、腫瘍細胞上のその同族腫瘍関連抗原またはエピトープとの結合を保持し、さらに、多重特異性抗原結合構築物とその同族腫瘍関連抗原またはエピトープとを介して腫瘍細胞に結合する。この実施形態では、かくして、免疫療法薬による腫瘍細胞との結合が強化され得る。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、付加的または補助的な療法として利用され得る。例えば、免疫療法薬による処置を受けているかもしくは以前に受けたことがある患者であって免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の発現の喪失もしくは減少の恐れがある患者、または代替機序を介して免疫療法薬指向性の細胞溶解に対して不応答になり得る患者、または免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の発現の顕著な不均一性を呈する患者のために、利用され得る。
定義
特に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野において通常の技量を有する者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
本明細書中で使用する場合、用語「約」は、所与の値からのおよそ＋／−１０％の変動を指す。具体的に言及されているか否かにかかわらず、本明細書において提供されるいかなる所与の値にもそのような変動が常に含まれることは理解されるべきである。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限値と下限値との間にある、文脈から別段の定めが明白でない限り下限値の１０分の１までの各値が、その範囲内に包含されること、及び間にあるこれらの値の各々が本開示の実施形態を形成することは、理解される。間にあるこれらの値は、言明された範囲の中に含まれるより狭い範囲の上限値及び下限値を表し得、そのようなより狭い範囲の各々も、明記された範囲の中で具体的に除外される何らかの限界値の影響を受けつつ本開示の実施形態を形成する。
単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、本明細書中で用語「含む」と併せて使用する場合、「１つ」を意味し得るが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」及び「１つまたは２つ以上」という意味とも合致する。
本明細書中で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する」ならびに文法上のそれらの変化形は、包括的つまりオープンエンドであり、列挙されていない追加の要素及び／または方法ステップを排除しない。用語「から本質的に構成される」は、本明細書中で組成物、使用または方法に関連して使用される場合、追加の要素及び／または方法ステップが存在していてもよいがこれらの追加は列挙された組成物、方法または使用が機能する様式に対して実質的に影響を与えない、ということを意味する。用語「から構成される」は、本明細書中で組成物、使用または方法に関連して使用される場合、追加の要素及び／または方法ステップの存在を排除する。特定の要素及び／またはステップを含むものとして本明細書中に記載されている組成物、使用または方法は、特定の実施形態ではこれらの要素及び／またはステップから実質的に構成され得、他の実施形態ではこれらの要素及び／またはステップから構成され得、これらの実施形態が具体的に言及されているか否かにかかわらない。
本明細書において記述されるいかなる実施形態も、本明細書において開示される任意の方法、使用または組成物に関して具現化されることができることが企図され、その逆もまた然りである。
多重特異性抗原結合構築物
本明細書では、免疫療法薬と少なくとも１つの腫瘍関連抗原とに結合することができる多重特異性抗原結合構築物について記載する。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、腫瘍関連抗原に結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、各々が腫瘍関連抗原に結合する１つ以上の追加の抗原結合ポリペプチド構築物を含み得る。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいる各抗原結合ポリペプチド構築物は、その標的抗原に特異的に結合する。
用語「抗原結合構築物」は、抗原に結合することができる薬剤、例えばポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。いくつかの態様では、抗原結合構築物は、対象となる標的抗原に特異的に結合するポリペプチドであり得る。抗原結合構築物は、単量体、多量体、タンパク質、ペプチド、タンパク質またはペプチドの複合体、抗体、抗体断片、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＶＨＨなどであり得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、足場に繋げられた１つ以上の抗原結合部分（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ）を含み得る。多重特異性抗原結合構築物の例は、以下に記載されており、また実施例の節で提供されている。多重特異性抗原結合構築物の典型的かつ非限定的ないくつかの型を図１Ｂに示す。
本発明との関連において、抗原結合構築物は多重特異性抗原結合構築物である。用語「多重特異性抗原結合構築物」は、本明細書中で使用される場合、固有の結合特異性を各々が有している２つ以上の抗原結合部分（例えば抗原結合ポリペプチド構築物）を有する、抗原結合構築物である。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は２つの抗原結合部分を含む（つまり二重特異性である）。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は３つの抗原結合部分を含む（つまり三重特異性である）。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は４つ以上の抗原結合部分、例えば４つの抗原結合部分を含む。
本開示の特定の実施形態は、二重特異性抗原結合構築物に関する。用語「二重特異性抗原結合構築物」は、固有の結合特異性を各々が有している２つの抗原結合部分（例えば抗原結合ポリペプチド構築物）を有する、抗原結合構築物を指す。例えば、二重特異性抗原結合構築物は、第１抗原上のエピトープに結合する第１抗原結合部分と、第２抗原上のエピトープに結合する第２抗原結合部分とを含み得るか、または二重特異性抗原結合構築物は、第１抗原上のエピトープに結合する第１抗原結合部分と、第１抗原上の異なるエピトープに結合する第２抗原結合部分とを含み得る。第１抗原結合部分と第２抗原結合部分とが同一抗原上の異なるエピトープに結合する、二重特異性抗原結合構築物を指して、「二重パラトープ性」という用語が使用され得る。二重パラトープ性抗原結合構築物は、単一の抗原分子に、２つのエピトープを介して結合し得るか、またはそれは、２つの異なる抗原分子に、それぞれ異なるエピトープを介して結合し得る。
いくつかの実施形態では、抗原結合構築物は、抗原結合ポリペプチド構築物である抗原結合部分を２つ以上含み、各抗原結合ポリペプチド構築物が、独立して、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは、場合によってラクダ由来（ＶＨＨ）であるｓｄＡｂである。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は足場をさらに含み、抗原結合ポリペプチド構築物が足場によって機能可能に繋げられている。用語「機能可能に繋げられる」は、本明細書中で使用される場合、記載された構成要素同士がそれらの意図された様式でそれらが機能するのを可能にする関係性にあることを意味する。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗体または抗原結合抗体断片であり得る。本明細書において用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子（複数可）または修飾型免疫グロブリン遺伝子によってコードされるポリペプチドであって、分析物（例えば抗原）に対する特異的な結合及び認識をする、当該ポリペプチドを指して互換的に使用される。認知されている免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子ならびに幾多の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖はカッパかまたはラムダかのどちらかに分類される。抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有している定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の主なクラスとしてはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つが存在し、これらのうちのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分割され得る。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２対のポリペプチド鎖からなり、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とを有する。各鎖のＮ末端ドメインは、抗原認識を主として担う約１００アミノ酸〜１１０アミノ酸以上の可変領域を画定している。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語はこれらの軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインをそれぞれ指す。ＩｇＧ１重鎖はそれぞれＮ末端からＣ末端へとＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。軽鎖はＮ末端からＣ末端へとＶＬ及びＣＬドメインを含む。ＩｇＧ１重鎖はＣＨ１とＣＨ２との間にヒンジを含む。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥからの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ダイアボディまたはナノボディなどの免疫グロブリン系構築物からの、またはそれに由来する、１つ以上の免疫グロブリンドメインを含む。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ラクダ抗体などの重鎖抗体からの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ウシ抗体、ヒト抗体、ラクダ抗体、マウス抗体または任意のキメラ抗体などの哺乳動物抗体からの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。
本明細書中で使用する用語「超可変領域」（ＨＶＲ）は、配列が超可変性でありかつ／または構造的に画定されたループ（「超可変ループ」）を形成している、抗体可変ドメインの各領域を指す。総じて、天然の４本鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にある３つのＨＶＲと、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある３つのＨＶＲとの、６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは通常、超可変ループからの、かつ／または相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、配列可変性が最も高くかつ／または抗原認識に関与する。ＶＨにあるＣＤＲ１を除けば、総じてＣＤＲは、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。本明細書において、超可変領域（ＨＶＲ）という用語、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）という用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の一部を指して互換的に使用される。この特定領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されており、その定義は、互いに比較された場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含んでいる。それでもなお、ＣＤＲを指すどちらの定義の適用も、本明細書において定義及び使用される用語の範囲内であることが意図される。
抗原結合ポリペプチド構築物
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物を含み、そのうちの１つは免疫療法薬に結合し（例えば特異的に結合し）、またそのうちの１つ以上は、それぞれ独立して、腫瘍関連抗原に結合する（例えば特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つ以上は免疫グロブリン系構築物、例えば抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つ以上は、非免疫グロブリン系の抗体模倣型、例えば、限定されないが、アンチカリン、フィノマー、アフィマー、アルファボディ、ＤＡＲＰｉｎまたはアビマーであってもよい。
特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、それぞれ独立して、多重特異性抗原結合構築物の意図される用途に応じてＦａｂ、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂであり得る。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、Ｆａｂ断片であり得る。「Ｆａｂ断片」（抗原結合性断片とも呼称される）は、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を、それぞれ軽鎖上及び重鎖上の可変ドメインＶＬ及びＶＨと共に含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与するものであるＣＤＲを含む。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端にある、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含めたいくつかのアミノ酸残基が追加されている、という点でＦａｂとは異なる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つがＦａｂ’であってもよい。
本明細書中で使用する場合、用語「一本鎖」は、ペプチド結合によって直線状に繋げられたアミノ酸モノマーを含む分子を指す。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの１つ以上は、一本鎖Ｆａｂ分子、すなわちＦａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖とがペプチドリンカーによって繋げられて一本のペプチド鎖を形成しているＦａｂ分子であり得る。例えば、多重特異性抗原結合構築物に含まれている抗原結合ポリペプチド構築物が一本鎖Ｆａｂ分子であるいくつかの実施形態では、一本鎖Ｆａｂ分子においてＦａｂ軽鎖のＣ末端がＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されていてもよい。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり得る。「ｓｃＦｖ」は、抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを単一のポリペプチド鎖に含んでいる。ｓｃＦｖは、場合によってさらに、抗原結合のための所望の構造をｓｃＦｖが形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間に含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ポリペプチドリンカーによってＶＬのＣ末端からＶＨのＮ末端へと連結されたＶＬを含み得る。あるいは、ｓｃＦｖは、ポリペプチドの鎖またはリンカーによってＶＨのＣ末端からＶＬのＮ末端へと連結されたＶＨを含み得る。ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）型であり得る。ｓｄＡｂ型は、単一免疫グロブリンドメインを指す。ｓｄＡｂは、例えばラクダ由来のものであってもよい。ラクダ抗体は軽鎖を欠き、その抗原結合部位は、「ＶＨＨ」と称される単一ドメインから構成される。ｓｄＡｂは、抗原結合部位を形成する３つのＣＤＲ／超可変ループ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。ｓｄＡｂは、かなり安定であり、例えば抗体のＦｃ鎖との融合体として発現させることが簡単である（例えば、Ｈａｒｍｓｅｎ ＆ Ｄｅ Ｈａａｒｄ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２（２００７）を参照のこと）。
特定の実施形態では、腫瘍関連抗原に結合する多重特異性抗原結合構築物が含んでいる抗原結合ポリペプチド構築物のうちの少なくとも１つは、腫瘍関連抗原の天然のリガンドまたはそのようなリガンドの機能性断片であり得る。例としては、限定されないが、葉酸（ＦＲαのリガンド）、組換えＥＧＦ（ＥＧＦＲのリガンド）またはＷｎｔ５ａ（ＲＯＲ１のリガンド）が挙げられる。
型
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物モジュールと、任意で足場モジュールとを含む、モジュール構造様式を有するものとみなされ得る。当業者であれば、種々の型を有する多重特異性抗原結合構築物を形成するためにこれらのモジュールが様々に組み合わされ得ることを理解するであろう。これらの型は、当該技術分野において既知の抗体型（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ＭＡＢＳ，９（２）：１８２−２１２（２０１７）による総説、及びＭｕｌｌｅｒ ＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．（２０１４）を参照のこと）に概して基づくものであり、上記の型、及び図１Ｂに示す多重特異性抗原結合構築物の典型的かつ非限定的な型を含む。
足場を欠く多重特異性抗原結合構築物は、１つ以上のリンカーによって機能可能に繋げられた２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物を含む。抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｄＡｂまたはそれらの組み合わせの形態であり得る。例えば、ｓｃＦｖを抗原結合ポリペプチド構築物として使用する場合、柔軟なリンカーによってｓｃＦｖ同士が連結され合ったタンデムｓｃＦｖ（（ｓｃＦｖ）２すなわちｔａＦｖ）またはトリプルボディ（ｓｃＦｖが３つ）などの型が構築され得る。ｓｃＦｖは、短い（大抵、約５アミノ酸の長さの）リンカーによって連結された２つ、３つ及び４つのｓｃＦｖをそれぞれ含んでいるダイアボディ型、トリアボディ型及びテトラボディ（タンデムダイアボディすなわちＴａｎｄＡｂ）型を構築するためにも使用され得る。リンカーの長さが制限されていることによってｓｃＦｖの頭−尾様式での二量体化がもたらされる。前述の型のいずれかにおいて、ｓｃＦｖは、ドメイン間ジスルフィド結合を含むことによってさらに安定化され得る。例えば、各鎖に（例えば、ＶＨの位置４４及びＶＬの位置１００に）追加のシステイン残基を導入することによってジスルフィド結合をＶＬとＶＨとの間に導入してもよいし（例えば、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１０：１２２１−１２２５（１９９７）を参照のこと）、またはジスルフィド結合を２つのＶＨの間に導入してＤＡＲＴ型を有する構築物を形成してもよい（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３９９：４３６−４４９（２０１０）を参照のこと）。
同様に、適切なリンカーによって連結され合った２つ以上のｓｄＡｂ、例えばＶＨまたはＶＨＨを含む型を多重特異性抗原結合構築物のために使用してもよい。
足場を欠く多重特異性抗原結合構築物の型のその他の例としては、Ｆａｂ断片に基づくもの、例えば、リンカーまたはＩｇＧヒンジ領域によってＦａｂ断片同士を連結したＦａｂ２型、Ｆ（ａｂ’）２型及びＦ（ａｂ’）３型が挙げられる。
また、代替の無足場型を生じさせるために、形態の異なる抗原結合ポリペプチド構築物の組み合わせを採用してもよい。例えば、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂをＦａｂ断片の重軽鎖のどちらかまたは両方のＣ末端に融合させて二価（Ｆａｂ−ｓｃＦＶ／ｓｄＡｂ）または三価（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２またはＦａｂ−（ｓｄＡｂ）２）構築物を生じさせてもよい。同様に、１つまたは２つのｓｃＦｖまたはｓｄＡｂをＦ（ａｂ’）断片のヒンジ領域に融合させて三価または四価のＦ（ａｂ’）２−ｓｃＦｖ／ｓｄＡｂ構築物を作ってもよい。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と、１つ以上のリンカーとを含み、足場を含まない。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と、１つ以上のリンカーとを含み、抗原結合ポリペプチド構築物がｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｄＡｂまたはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と、１つ以上のリンカーとを含み、抗原結合ポリペプチド構築物がｓｃＦｖである。
足場を含む多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物を適切な足場と繋ぐことによって構築され得る。抗原結合ポリペプチド構築物は、上記の型（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び／またはｓｄＡｂ）のうちの１つまたはその組み合わせであり得る。適する足場の例は以下でより詳しく記載されており、限定されないが、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、アルブミンの類縁体及び誘導体、異種二量体化ペプチド（例えば、ロイシンジッパー、ＪｕｎとＦｏｓに由来する異種二量体形成性「ジッパー」ペプチド、ＩｇＧのＣＨ１ドメイン及びＣＬドメイン、またはバルマーゼ−バルスター毒素）、サイトカイン、ケモカイン、または成長因子を含む。その他の例としては、ＩＢＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．及びＩｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓによって開発されたＤＯＣＫ−ＡＮＤ−ＬＯＣＫ（商標）（ＤＮＬ（商標））技術に基づく多重特異性抗原結合構築物が挙げられる（例えば、Ｃｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３：５５８６ｓ−５５９１ｓ（２００７）を参照のこと）。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と、足場とを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と、ＩｇＧ Ｆｃ領域、アルブミン、またはアルブミンの類縁体もしくは誘導体に基づく足場とを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、各々がＣＨ３配列と任意でＣＨ２配列とを含んでいるＦｃに基づいた足場を含み、当該足場は、二量体型Ｆｃであってもよいし、または第１Ｆｃポリペプチドと第２Ｆｃポリペプチドとを含む異種二量体型Ｆｃであってもよい。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、第１及び第２Ｆｃポリペプチドを含むＦｃを含み、第１抗原結合ポリペプチド構築物は第１Ｆｃポリペプチドに機能可能に繋げられており、第２抗原結合ポリペプチド構築物は第２Ｆｃポリペプチドに機能可能に繋げられている。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、第１及び第２Ｆｃポリペプチドを含むＦｃを含み、第１抗原結合ポリペプチド構築物は、リンカーによって、またはリンカーなしで、第１Ｆｃポリペプチドまたは第２ＦｃポリペプチドのＣ末端に機能可能に繋げられている。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＨ１及びＶＨを含む重鎖ポリペプチドと、ＣＬ及びＶＬを含む軽鎖ポリペプチドとを含み、第１抗原結合ポリペプチド構築物がリンカーによって、またはリンカーなしで、ＶＬのＮ末端、ＣＬのＣ末端、またはＶＨのＮ末端に機能可能に繋げられている。
本発明では、「オクトパス抗体」または「二重可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）型の多重特異性抗原結合構築物を含めた、３つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物を含む多重特異性抗原結合構築物も企図される（例えば、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６号及び、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：１２９０−１２９７（２００７）を参照のこと）。
特定の実施形態は、免疫療法薬にも標的腫瘍関連抗原にも結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含んでいる「二重作用Ｆａｂ」または「ＤＡＦ」を多重特異性抗原結合構築物に含んでもよいことを企図している（例えば米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号を参照のこと）。
足場
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は足場を含む。足場は、ペプチド、ポリペプチド、ポリマー、ナノ粒子またはその他の化学成分であり得る。足場がポリペプチドである場合、多重特異性抗原結合構築物の各抗原結合ポリペプチド構築物はポリペプチド足場のＮ末端またはＣ末端のどちらかに繋げられ得る。特定の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端とは違った領域に抗原結合ポリペプチド構築物の１つ以上が例えばアミノ酸の側鎖を介してリンカーによって、またはリンカーなしで繋げられているポリペプチド足場を含む、多重特異性抗原結合構築物も企図される。
足場がペプチドまたはポリペプチドである実施形態では、抗原結合構築物は、遺伝子融合または化学的複合化によって足場に繋げられ得る。いくつかの実施形態では、足場がポリマーまたはナノ粒子である場合、抗原結合構築物は化学的複合化によって足場に繋げられ得る。
２つの異なる抗原結合ポリペプチドの選択的な対を含み、足場を形成すべく使用され得る、多くのタンパク質ドメインが当該技術分野において既知である。一例は、選択的に対合し合うＦｏｓとＪｕｎなどの、ロイシンジッパードメインである（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：１５４７−５３（１９９２）、Ｗｒａｎｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７：４３３３１−４３３３９（２０１２））。その他の選択的に対合する分子対としては、例えば、バルナーゼ・バルスター対（Ｄｅｙｅｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２１：１４８６−１４９２（２００３））、ＤＮＡ鎖対（Ｃｈａｕｄｒｉ，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５０（ｌ−２）：２３−２６（１９９９））、及び分割型蛍光タンパク質対（国際特許公開第ＷＯ２０１１／１３５０４号）が挙げられる。
その他のタンパク質足場の例としては、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、アルブミンの類縁体及び誘導体、毒素、サイトカイン、ケモカインならびに成長因子が挙げられる。タンパク質足場と抗原結合部分とを組み合わせた使用は、例えば、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８２：１２６５０−１２６６０（２００７）、ＭｃＤｏｎａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，１１：５８２−５９３（２０１２）、Ｖａｌｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１１：３８７９−３８８８（２００５）、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４５：１４７−１５４（２００６）、及び米国特許出願公開第２００９／０２８５８１６号に記載されている。
例えば、ｓｃＦｖ、ダイアボディまたは一本鎖ダイアボディなどの抗原結合部分をアルブミンと融合させることで、抗原結合部分の血清半減期が延びることが示されている（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記）。抗原結合部分を、場合によってリンカーを介して、アルブミンのＮ末端及び／またはＣ末端に融合させてもよい。
アルブミンタンパク質の分割によって得られる２つのトランスポーターポリペプチドであって、自己組織化して天然類似型アルブミンを形成するような、当該トランスポーターポリペプチドを含む、異種多量体の形態のアルブミン誘導体についての記載がある（国際特許公開第ＷＯ２０１２／１１６４５３号及び第ＷＯ２０１４／０１２０８２号を参照のこと）。異種多量体は、アルブミンの分割の結果として４つの末端を含み、それゆえ場合によってリンカーを介して４つまでの異なる抗原結合部分と融合することができる。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物はタンパク質足場を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、（以下に記載するような）Ｆｃ領域、アルブミンまたは、アルブミンの類縁体もしくは誘導体に基づく、タンパク質足場を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または、アルブミンの類縁体もしくは誘導体に基づく、タンパク質足場を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、国際特許公開第ＷＯ２０１２／１１６４５３号または第ＷＯ２０１４／０１２０８２号に記載されているようなアルブミン誘導体に基づくタンパク質足場を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ｓｃＦｖの形態の２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と、国際特許公開第ＷＯ２０１２／１１６４５３号または第ＷＯ２０１４／０１２０８２号に記載されているようなアルブミン誘導体に基づくタンパク質足場とを含む。
Ｆｃ領域
特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、Ｆｃ領域に基づく足場を含む。本明細書中で使用される用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃ」または「Ｆｃドメイン」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。当該用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。本明細書中で特に明記しない限り、Ｆｃ領域または定常領域にあるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されているような、ＥＵ索引とも呼ばれるＥＵ付番方式に従う。二量体型Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体型Ｆｃドメインを形成している２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己組織化ができる免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体型ＩｇＧ ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。
Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインを含むか、またはＣＨ３ドメインとＣＨ２ドメインとを含むかのどちらかである。ＣＨ３ドメインは、二量体型Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドの各々から１つずつである、２つのＣＨ３配列を含む。ＣＨ２ドメインは、二量体型Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドの各々から１つずつである、２つのＣＨ２配列を含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、１つまたは２つのＣＨ３配列を含んでいるＦｃを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、１つ以上のリンカーによって、またはリンカーなしで、第１抗原結合ポリペプチド構築物と第２抗原結合ポリペプチド構築物とに結合している。いくつかの実施形態では、ＦｃはヒトＦｃに基づくものである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ Ｆｃ、例えばＩｇＧ１ Ｆｃに基づくものである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは異種二量体型Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは１つまたは２つのＣＨ２配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃは１つまたは２つのＣＨ３配列を含み、そのうちの少なくとも１つが１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは１つまたは２つのＣＨ２配列を含み、そのうちの少なくとも１つが１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃは単一のポリペプチドからなり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、多数のポリペプチド、例えば２つのポリペプチドからなり得る。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、国際特許公開第ＷＯ２０１２／０５８７６８号または国際特許公開第ＷＯ２０１３／０６３７０２号に記載されているようなＦｃを含む。
修飾ＣＨ３ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含み、当該修飾ＣＨ３ドメインは、非対称的に修飾されたＣＨ３ドメインである。異種二量体型Ｆｃは、第１Ｆｃポリペプチドと第２Ｆｃポリペプチドとの２つの重鎖定常ドメインポリペプチドを含み得、それらは、Ｆｃが１つの第１Ｆｃポリペプチドと１つの第２Ｆｃポリペプチドとを含むことを条件として、互換的に使用されることができる。通常、第１Ｆｃポリペプチドは第１ＣＨ３配列を含み、第２Ｆｃポリペプチドは第２ＣＨ３配列を含む。
非対称的に導入された１つ以上のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は、２つのＣＨ３配列が二量体化したときに通常、同種二量体ではなく異種二量体型Ｆｃをもたらす。本明細書中で使用する場合、「非対称なアミノ酸修飾」は、第１ＣＨ３配列上の特定位置にあるアミノ酸が、同じ位置にある第２ＣＨ３配列上のアミノ酸とは異なっている、修飾を指す。非対称なアミノ酸修飾を含むＣＨ３配列の場合、第１及び第２ＣＨ３配列は、典型的には、同種二量体ではなく異種二量体を形成するように優先的に対合することになる。これらの非対称なアミノ酸修飾は、各配列上の各々同じアミノ酸位置にある２つのアミノ酸のうちの一方のみが修飾された結果であり得るかまたは、第１及び第２ＣＨ３配列の各々においてそれぞれ同じアミノ酸位置にある各配列上の両アミノ酸に異なる修飾がなされた結果であり得る。異種二量体型Ｆｃの第１及び第２ＣＨ３配列は、１つまたは２つ以上の非対称なアミノ酸修飾を含み得る。
表Ａは、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に対応するヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列のアミノ酸配列を示す。ＣＨ３配列は完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。
典型的には、Ｆｃは、二量体化することができる２つの重鎖ポリペプチド配列（Ａ及びＢ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃのポリペプチド配列の一方または両方が、ＥＵ付番を用いて以下の位置：Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００及び／またはＮ３９０のうちの１つ以上に修飾を含み得る。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｌ３５１にアミノ酸修飾を含む第１ポリペプチド配列と、位置Ｔ３６６及びＴ３９４にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｋ３９２にアミノ酸修飾を含む第２ポリペプチド配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＨ３ドメインの第１ポリペプチド配列は位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｌ３５１にアミノ酸修飾を含み、修飾ＣＨ３ドメインの第２ポリペプチド配列は位置Ｔ３６６及びＴ３９４にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｋ３９２にアミノ酸修飾を含み、位置Ｆ４０５のアミノ酸修飾がＦ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖであり、位置Ｙ４０７のアミノ酸修飾がＹ４０７ＩまたはＹ４０７Ｖであり、位置Ｔ３６６のアミノ酸修飾がＴ３６６Ｉ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｍであり、位置Ｔ３９４のアミノ酸修飾がＴ３９４Ｗであり、位置Ｌ３５１のアミノ酸修飾がＬ３５１Ｙであり、位置Ｋ３９２のアミノ酸修飾がＫ３９２Ｆ、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍである。
いくつかの実施形態では、Ｆｃの第１ポリペプチド配列は位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｌ３５１にアミノ酸修飾を含み、Ｆｃの第２ポリペプチド配列は位置Ｔ３６６及びＴ３９４にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｋ３９２にアミノ酸修飾を含み、位置Ｆ４０５のアミノ酸修飾がＦ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５ＴまたはＦ４０５Ｖであり、位置Ｙ４０７のアミノ酸修飾がＹ４０７ＩまたはＹ４０７Ｖであり、位置Ｔ３６６のアミノ酸修飾がＴ３６６Ｉ、Ｔ３６６ＬまたはＴ３６６Ｍであり、位置Ｔ３９４のアミノ酸修飾がＴ３９４Ｗであり、位置Ｌ３５１のアミノ酸修飾がＬ３５１Ｙであり、位置Ｋ３９２のアミノ酸修飾がＫ３９２Ｆ、Ｋ３９２ＬまたはＫ３９２Ｍであり、Ｆｃの第１及び第２ポリペプチド配列の一方または両方がさらにアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｌ３５１にアミノ酸修飾を含む第１ポリペプチド配列と、位置Ｔ３６６及びＴ３９４にアミノ酸修飾を含みかつ場合によってさらに位置Ｋ３９２にアミノ酸修飾を含む第２ポリペプチド配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含み、第１ポリペプチド配列がさらに位置Ｓ４００もしくはＱ３４７のうちの一方もしくは両方にアミノ酸修飾を含みかつ／または第２ポリペプチド配列がさらに位置Ｋ３６０もしくはＮ３９０のうちの一方もしくは両方にアミノ酸修飾を含み、位置Ｓ４００のアミノ酸修飾がＳ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００ＲまたはＳ４００Ｋであり、位置Ｑ３４７のアミノ酸修飾がＱ３４７Ｒ、Ｑ３４７ＥまたはＱ３４７Ｋであり、位置Ｋ３６０のアミノ酸修飾がＫ３６０ＤまたはＫ３６０Ｅであり、位置Ｎ３９０のアミノ酸修飾がＮ３９０Ｒ、Ｎ３９０ＫまたはＮ３９０Ｄである。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、表Ａに示す変異型１、変異型２、変異型３、変異型４または変異型５のいずれか１つの修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含む。
（表Ａ）ＩｇＧ１ Ｆｃ配列
Figure 2019513777
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、位置Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１ＣＨ３配列と、位置Ｔ３９４にアミノ酸修飾を有する第２ＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、異種二量体型Ｆｃは、第１ＣＨ３配列がＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有しておりかつ第２ＣＨ３配列がＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ及びＴ３９４Ｗから選択される１つ以上のアミノ酸修飾を有している、修飾ＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１ＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２ＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含み、第１または第２ＣＨ３配列のうちの一方がさらに位置Ｑ３４７にアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列がさらに位置Ｋ３６０にアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、異種二量体型Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１ＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２ＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、第１または第２ＣＨ３配列のうちの一方がさらに位置Ｑ３４７にアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列がさらに位置Ｋ３６０にアミノ酸修飾を含み、上記ＣＨ３配列のうちの一方または両方がさらにアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１ＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２ＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含み、上記第１及び第２ＣＨ３配列のうちの一方がさらにＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列が、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、異種二量体型Ｆｃは、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１ＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２ＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含み、上記第１及び第２ＣＨ３配列のうちの一方がさらにＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾を含み、他方のＣＨ３配列が、Ｔ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうちの１つ以上を含み、上記ＣＨ３配列のうちの一方または両方がさらにアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖを含む。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７にアミノ酸修飾を有する第１ＣＨ３配列と、位置Ｔ３６６、Ｋ３９２及びＴ３９４にアミノ酸修飾を有する第２ＣＨ３配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含み、上記ＣＨ３配列のうちの一方または両方がさらにＴ３５０Ｖのアミノ酸修飾を含む。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、位置Ｙ４０７にアミノ酸修飾を含む第１ポリペプチド配列と、位置Ｔ３６６及びＫ４０９にアミノ酸修飾を含む第２ポリペプチド配列とを有する修飾ＣＨ３ドメインを含んでいる異種二量体型Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＣＨ３ドメインの第１ポリペプチド配列は位置Ｙ４０７にアミノ酸修飾を含み、修飾ＣＨ３ドメインの第２ポリペプチド配列は位置Ｔ３６６及びＫ４０９にアミノ酸修飾を含み、位置Ｙ４０７のアミノ酸修飾がＹ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７ＬまたはＹ４０７Ｖであり、位置Ｔ３６６のアミノ酸修飾がＴ３６６Ａ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６ＭまたはＴ３６６Ｖであり、位置Ｋ４０９のアミノ酸修飾がＫ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｉ、Ｋ４０９ＳまたはＫ４０９Ｗである。
特定の実施形態では、Ｆｃが含んでいる１つ以上の非対称なアミノ酸修飾は、野生型の同種二量体型ＣＨ３ドメインと同程度の安定性を異種二量体型ＣＨ３ドメインが有している異種二量体型Ｆｃの形成を促進することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の非対称なアミノ酸修飾は、野生型の同種二量体型Ｆｃドメインと同程度の安定性を異種二量体型Ｆｃドメインが有している異種二量体型Ｆｃドメインの形成を促進する。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインの安定性は、ＣＨ３ドメインの融点（Ｔｍ）を例えば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）で測定することによって評価することができる。いくつかの実施形態では、１つ以上の非対称なアミノ酸修飾は、示差走査熱量測定試験でＣＨ３ドメインの融点（Ｔｍ）が対応する対称な野生型の同種二量体型ＣＨ３ドメインについて観測されるそれの約８℃以内、例えば、約７℃以内、約６℃以内、約５℃以内または約４℃以内となることによって認められる安定性をＣＨ３ドメインが有している異種二量体型Ｆｃドメインの形成を促進する。
いくつかの実施形態では、異種二量体型ＦｃのＣＨ３ドメインは、約６８℃以上、約７０℃以上、約７２℃以上、７３℃以上、約７５℃以上、約７８℃以上、約８０℃以上、約８２℃以上または約８４℃以上の融点（Ｔｍ）を有し得る。
いくつかの実施形態では、修飾ＣＨ３配列を含んでいる異種二量体型Ｆｃは、発現産物において、同種二量体型Ｆｃと比較して少なくとも約７５％の純度で形成され得る。いくつかの実施形態では、異種二量体型Ｆｃは、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超または約９７％超の純度で形成される。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、発現したときに、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％より高い純度で形成される異種二量体である。
異種二量体型Ｆｃ形成を促進するために単量体型Ｆｃポリペプチドを修飾するさらなる方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、国際特許公開第ＷＯ９６／０２７０１１号（ノブ・イントゥ・ホール）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２８５，１９６３７−４６（２０１０）（選択的異種二量体化を達成するための静電的設計）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ，２３（４）：１９５−２０２（２０１０）（鎖交換操作ドメイン（ＳＥＥＤ）技術）、及びＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１１０（１３）：５１４５−５０（２０１３）（Ｆａｂアーム交換）に記載されているものを含む。
ＣＨ２ドメイン
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＨ２ドメインを含んでいるＦｃを含む。ＦｃのＣＨ２ドメインの一例は、表Ａに示す配列のアミノ酸２３１〜３４０である。いくつかのエフェクター機能は、抗体のＦｃに結合するものであるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって媒介される。
用語「Ｆｃ受容体」（「ＦｃＲ」）は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表すために使用される。例えば、ＦｃＲは天然配列のヒトＦｃＲであり得る。通常、ＦｃＲは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立変異型及び二者択一的に分割された形態を含む）を含め、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲ（γ受容体）である。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化型受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）が含まれ、それらは類似したアミノ酸配列を有し、主にそれらの細胞質側ドメインが異なる。他のアイソタイプの免疫グロブリンも特定のＦｃＲと結合することができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）を参照のこと）。用語「ＦｃＲ」は、特定の実施形態では、母体ＩｇＧの胎児への輸送を担っている新生児型受容体ＦｃＲｎ（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））も含む。
ＣＨ２ドメイン内の修飾はＦｃに対するＦｃＲの結合性に影響を与え得る。Ｆｃ領域内のアミノ酸修飾の多くは、種々のＦｃγ受容体に対するＦｃの親和性を選択的に変化させることが当該技術分野において知られている。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいるＦｃは、Ｆｃγ受容体の選択的結合を促進する１つ以上の修飾を含み得る。
ＦｃＲによるＦｃへの結合性を変化させる修飾の非限定的な例としては、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６５（１−２）：１３２−４１（２０１１））；Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、及びＦ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７（１８）：８８８２−９０（２００７）及びＮｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１３（６）：Ｒ１２３（２０１１））；Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２４（９）：６７１−８（２０１１））；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６（９）：６５９１−６０４（２００１））；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３（１１）：４００５−１０（２００６））；Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、及びＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４５（１５）：３９２６−３３（２００８））が挙げられる。その他の例としては、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ；Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２；Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ；Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ；Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ；Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ；Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ；Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄ、及び国際特許公開第ＷＯ２０１１／１２０１３４号に記載されているその他の突然変異が挙げられる。
ＦｃＲによるＦｃへの結合性に影響を与えるさらなる修飾は、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｔｒｏｈｌ ＆ Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ １１，ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９，Ｏｃｔ ２０１２，ｐａｇｅ ２８３）に記載されている。
ＦｃＲによる結合性に影響を与える非対称な修飾を含むＦｃ領域は、国際特許公開第ＷＯ２０１４／１９０４４１号に記載されている。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、１つ以上の非対称なアミノ酸修飾を含むＣＨ２ドメインを含んでいるＦｃを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、非対称な修飾を含まない抗原結合構築物に比べて優れた生物物理学的特性、例えば安定性、及び／または製造し易さをもたらす、非対称な修飾を含むＣＨ２ドメインを含んでいるＦｃを含む。
さらなる修飾
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域を含んでいる多重特異性抗原結合構築物は、エフェクター機能を媒介するその能力を向上させる修飾を含み得る。そのような修飾は、当該技術分野において既知であり、非フコシル化、または活性化型受容体（ＡＤＣＣのためには主にＦｃγＲＩＩＩａ、また、ＣＤＣのためにはＣ１ｑ）に対するＦｃの親和性の操作を含む。
アミノ酸配列を変化させることなく、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７、ＥＵ付番）にフコースをほとんどまたは全く有さない抗体を作る方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ＧｌｙｍａＸ（登録商標）技術（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ）（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０（１２）：１６０７−１８（２０１０）を参照のこと）、及び米国特許第８，４０９，５７２号が挙げられる。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、非グリコシル化されていてもよい。これとの関連において、多重特異性抗原結合構築物は、完全に非フコシル化されていてもよいし（つまり、それらは検出可能なフコースを含有しない）、または多重特異性抗原結合構築物は、哺乳動物発現系によって産生される類似構築物において通常検出されるフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満または５％未満を含有するように部分的に非フコシル化されていてもよい。
ＦｃγＲ及び／または補体の結合性、及び／またはエフェクター機能を低下させるＦｃ修飾は当該技術分野において既知であり、上記のものを含む。低減またはサイレンシングされたエフェクター活性を有する抗体を操作するために使用されてきた方策は様々な刊行物に記載されている（例えば、Ｓｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８５−６９１（２００９）、及びＳｔｒｏｈｌ ＆ Ｓｔｒｏｈｌ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ２２５−２４９を参照のこと）。これらの方策は、グリコシル化の修飾、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４足場の使用、またはＦｃのヒンジもしくはＣＨ２領域での突然変異の導入による、エフェクター機能の低減を含む（米国特許公開第２０１１／０２１２０８７号、国際特許公開第ＷＯ２００６／１０５３３８号、米国特許公開第２０１２／０２２５０５８号、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号、及びＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９（２０１２）も参照のこと）。
Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体の結合性を低減する既知のアミノ酸修飾の具体的かつ非限定的な例には、表Ｂにおいて特定されるものが含まれる。
（表Ｂ）Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体の結合性を低減する修飾
Figure 2019513777
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、表Ｂにおいて特定される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含んでいるＦｃを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、Ｌ２３４、Ｌ２３５またはＤ２６５のうちの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含んでいるＦｃを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＤ２６５にアミノ酸修飾を含んでいるＦｃを含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ｓを含んでいるＦｃを含む。
リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と、１つ以上のリンカーとを含む。リンカーは、例えば、抗原結合ポリペプチド構築物の２つのドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはダイアボディのＶＨ及びＶＬ）を繋ぎ合わせるように機能し得るか、またはそれらは、２つの抗原結合ポリペプチド構築物（例えば２つ以上のＦａｂまたはｓｄＡｂ）を繋ぎ合わせるように機能し得るか、またはそれらは、抗原結合ポリペプチド構築物を足場と繋ぎ合わせるように機能し得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、多数の（つまり２つ以上の）リンカーを含んでいてもよく、例えば、１つ以上のｓｃＦｖが足場に繋げられている多重特異性抗原結合構築物は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとを繋ぎ合わせているリンカー、及びｓｃＦｖを足場と繋ぎ合わせているリンカーを含んでいてもよい。適切なリンカーは、当該技術分野において既知であり、当業者であればリンカーの意図された用途に基づいて簡単に選択することができる（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，“Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．（２０１４）を参照のこと）。
有用なリンカーとしては、例えば、当該技術分野においてよく知られておりかつ様々な順番でグリシン単位とセリン単位とを含むものであるグリシン−セリン（ＧｌｙＳｅｒ）リンカーが挙げられる。例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ及び（ＧＧＧＧＳ）ｎが挙げられ、ここで、ｎは、少なくとも１の整数、典型的には１〜約１０、例えば、１〜約８、１〜約６、または１〜約５の整数である。
その他の有用なリンカーとしては、例えば、免疫グロブリンヒンジ配列に由来する配列が挙げられる。リンカーは、４つのＩｇＧクラスのいずれか１つからのヒンジ配列の全体または一部を含んでもよく、場合によってはさらなる配列を含んでもよい。例えば、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ配列の一部と、グリシン−セリン配列とを含み得る。非限定的な例は、ＩｇＧ１ヒンジの最初のおよそ１５残基とそれに続く長さ約１０アミノ酸の上記のようなＧｌｙＳｅｒリンカー配列とを含むリンカーである。
リンカーの長さはその用途に応じて様々であろう。適切なリンカー長は、当業者であれば容易に選択することができる。例えば、ｓｃＦｖのＶＨドメインとＶＬドメインとをリンカーで連結することになる場合、リンカーは、長さが典型的には約５〜約２０アミノ酸、例えば、長さが約１０〜約２０アミノ酸、または長さが約１５〜約２０アミノ酸である。ダイアボディのＶＨドメインとＶＬドメインとをリンカーで連結することになる場合、リンカーは、同一鎖内でのこれら２つのドメインの会合を防止するのに十分に短くなくてはならない。例えば、リンカーは、長さが約２〜約１２アミノ酸、例えば、長さが約３〜約１０アミノ酸、または長さが約５アミノ酸であり得る。
いくつかの実施形態では、２つのＦａｂ断片同士をリンカーで連結することになる場合、リンカーがＦ（ａｂ’）断片のパラトープの相対的な空間的配座を維持しかつＩｇＧのコアヒンジ内のジスルフィド結合と等価な共有結合を形成できるように、リンカーが選択され得る。これとの関連において、適切なリンカーは、ＩｇＧヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４からのＩｇＧヒンジ領域を含む。これらの典型的なリンカーの修飾形態を使用することもできる。例えば、ＩｇＧ４ヒンジの安定性を向上させる修飾は当該技術分野において既知である（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７：７６７−７７１（２００９）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗原結合ポリペプチド構築物を本明細書に記載の足場に機能可能に繋ぐリンカーを含む。いくつかの態様では、多重特異性抗原結合構築物は、１つ以上のリンカーによって１つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物と結合したＦｃを含む。いくつかの態様では、多重特異性抗原結合構築物は、リンカーによって各抗原結合ポリペプチド構築物の重鎖と結合したＦｃを含む。
免疫療法薬
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、免疫療法薬に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。免疫療法薬は、抗原結合ドメインを発現するように操作された、Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞などのエフェクター細胞であり得、または免疫療法薬は、Ｔ細胞と腫瘍関連抗原とに結合することができる、抗体もしくは抗体断片などの治療剤であり得る。
特定の実施形態では、免疫療法薬は、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞である。典型的には、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が含んでいる抗原結合ドメインは、操作された受容体の一部である。いくつかの実施形態では、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞が含んでいる抗原結合ドメインは、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば遺伝子導入ＴＣＲまたは組換えＴＣＲ）の一部であり得る。これらの実施形態によれば、多重特異性抗原結合構築物は、ＣＡＲまたはＴＣＲの細胞外部分に結合する。多重特異性抗原結合構築物は、ＣＡＲまたはＴＣＲの抗原結合ドメインに結合し得るか、またはそれは、抗原結合に関与しないＣＡＲまたはＴＣＲの細胞外領域に結合し得る。
当該技術分野において既知であるように、ＣＡＲ構築物及びＴＣＲ構築物は、抗体によって特異的に認識される短いアミノ酸配列であることが典型的である「タグ」を含むように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、免疫療法薬は、タグを含んだＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞である。そのような実施形態との関連において、多重特異性抗原結合構築物はタグに結合し得るか、またはそれは、タグ以外のＣＡＲまたはＴＣＲの領域に結合し得る。免疫療法薬が、タグを含んでいるＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞である、いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物はタグ以外のＣＡＲまたはＴＣＲの領域に結合する。
いくつかの実施形態では、免疫療法薬は、タグを含んでいないＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫療法薬は、タグまたは何らかの異種の腫瘍関連抗原もしくは腫瘍関連抗原の断片を含んでいないＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞である。
特定の実施形態では、免疫療法薬は、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞であり、多重特異性抗原結合構築物はＣＡＲの細胞外部分に結合する。当該技術分野において既知であるように、ＣＡＲは、単一のタンパク質中に、天然には見受けられない組み合わせで細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質側ドメインを含んでいる細胞表面受容体である。細胞外ドメインは、抗体または抗体断片であり得る抗原結合ドメインを含む。抗体または抗体断片は、ヒト抗体もしくは断片、ヒト化抗体もしくは断片、または非ヒト抗体もしくは断片であり得る。典型的には、抗原結合ドメインは抗体断片、例えばＦａｂまたはｓｃＦｖである。最も典型的には、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。細胞外ドメインはさらに、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに繋げているスペーサー（またはヒンジ）領域を含むのが典型的である。スペーサー領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などの免疫グロブリンに由来するものであり得、またはそれは、限定されないがＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８を含めた代替の細胞表面タンパク質に由来するものであり得る。
ＣＡＲの膜貫通ドメインは細胞外ドメインを細胞質側ドメインに繋ぐ。典型的には、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８などのＩ型膜タンパク質に由来する。ある場合には、そのようなドメインと、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとが結合するのを回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、膜貫通ドメインはアミノ酸置換によって修飾され得る。膜貫通ドメインのその他の例としては、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４またはＩＣＯＳに由来するものが挙げられる。
ＣＡＲの細胞質側ドメインは、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含み、かつＣＡＲを中に配置した免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性または、サイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、かつ特殊な機能を細胞が行うように導く、タンパク質の一部を指す。ＣＡＲにおいて頻繁に使用される細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＴＣＲの細胞質側配列、及び抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始するように協奏的に作用する共受容体の細胞質側配列、ならびに同じ機能的能力を有するこれらの配列の誘導体または変異型が挙げられる。
ＴＣＲ単独によって生成したシグナルはＴ細胞の完全な活性化には不十分であり、副次的または共刺激的なシグナルも必要である、ということが知られている。したがって、抗原依存性の一次活性化をＴＣＲによって開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）と、抗原依存様式で作用して副次的または共刺激的なシグナルを供給するもの（副次細胞質シグナル伝達配列）との２つの別個なクラスの細胞質シグナル伝達配列によってＴ細胞活性化が媒介されると言うことができる。
一次細胞質シグナル伝達配列は、刺激的方法か抑制的方法かのどちらかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激的様式で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフすなわちＩＴＡＭとして知られているシグナル伝達モチーフを含有し得る。
ＣＡＲに使用され得る一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。典型的には、ＣＡＲ内の細胞質側ドメインは、ＣＤ３ζに由来する細胞質シグナル伝達配列を含むであろう。
ＣＡＲの細胞質側ドメインは、一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭ自体を含んでいてもよいし、またはそれを１つ以上の共刺激ドメインと組み合わせて含んでいてもよい。共刺激ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインに由来するものである。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的応答に必要とされる、抗原受容体以外の細胞表面分子である。そのような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ （ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ及びＢ７−Ｈ３が挙げられる。典型的には、ＣＡＲは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０に由来する１つ以上の共刺激ドメインを含む。例えば、第１世代ＣＡＲはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメインのみを含むが、第２世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメインと共に、４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する共刺激ドメインを含む。第３世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達ドメインと共に、２つの共刺激ドメイン、すなわち、４−１ＢＢまたはＣＤ２８に由来する第１共刺激ドメインと、４−１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０に由来する第２共刺激ドメインとを含む。
現在開発中のＣＡＲ構築物の例及びそれらを構成するドメインを表１に示す。
（表１）ＣＡＲ構築物の例
Figure 2019513777
＊出典 Ｂａｔｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１３：２５−４０（２０１６）
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の標的となる免疫療法薬は、ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）である。いくつかの実施形態では、免疫療法薬はＣＡＲ−Ｔであり、多重特異性抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物はＣＡＲの抗原結合ドメインに結合する。そのような実施形態によれば、抗原結合ポリペプチド構築物は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片を含み得る。ＣＡＲの標的となる抗原は、典型的には細胞表面腫瘍関連抗原である。
本明細書中で使用する場合、「腫瘍関連抗原」は、がん細胞によって発現される抗原を指す。腫瘍関連抗原は、正常細胞によって発現されるものであってもなくてもよい。腫瘍関連抗原が、正常細胞によって発現されるものでない場合（つまりそれが腫瘍細胞に固有のものである場合）、それは「腫瘍特異抗原」とも呼称され得る。腫瘍関連抗原が腫瘍細胞に固有のものでない場合、それは、抗原に対する免疫寛容の状態を誘導し損なう条件下で、正常細胞においても発現する。腫瘍での抗原の発現は、抗原に対して免疫系が応答することを可能にする条件下で起こり得る。腫瘍関連抗原は、免疫系が未熟であり応答できない場合に胎児発達中に正常細胞に発現する抗原であり得るか、またはそれは、正常細胞に低レベルで通常存在しているが腫瘍細胞でははるかにより高いレベルで発現している抗原であり得る。臨床上最も関心を集めている腫瘍関連抗原は、対応する正常組織に比べて差次的に発現し、かつ特定のＴ細胞または免疫グロブリンによる腫瘍細胞の優先的認識を可能にするものである。
現在臨床開発中のＣＡＲまたは操作されたＴＣＲの標的とされる腫瘍関連抗原の例としては、ＮＹ−ＥＳＯ（ニューヨーク食道扁平上皮がん１）、ＭＡＲＴ−１（Ｍｅｌａｎ−Ａとしても知られる、Ｔ細胞１によって認識されるメラノーマ抗原）、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）Ｅ６、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＥＡ（がん胎児性抗原）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子受容体変異型ＩＩＩ）、ＥｐＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｐｈＡ２（Ａ型エフリン受容体２）、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＧＰＣ３（グリピカン−３）、ＨＥＲ２、ＩＬ１３Ｒα２（インターロイキン１３受容体サブユニットα−２）、ＬｅＹ（ジフコシル化２型血液型関連抗原）、ＭＡＧＥ−Ａ３（メラノーマ関連抗原３）、メラノーマ糖タンパク質、メソテリン、ＭＵＣ１（ムチン１）、ミエリン、ＮＫＧ２Ｄ（ナチュラルキラー群２Ｄ）リガンド、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、及びＲＯＲ１（１型受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体）が挙げられる。
したがって、特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片に由来する抗原結合ポリペプチド構築物を含み、当該抗イディオタイプ抗体は、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＨＰＶ Ｅ６、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１７１、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ジシアロガングリオシドＧＤ２、ＧＰＣ３、ＨＥＲ２、ＩＬ１３Ｒα２、ＬｅＹ、ＭＡＧＥ−Ａ３、メラノーマ糖タンパク質、メソテリン、ＭＵＣ１、ミエリン、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＳＭＡまたはＲＯＲ１の抗イディオタイプ抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＣＤ１９抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来する、抗原結合ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗メソテリン抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来する、抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
多くの抗イディオタイプ抗体が当該技術分野において既知である。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１９０２７３号及びＪｅｎａ ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，８：３ ｅ５７８３８（２０１３）には、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ ＦＭＣ６３を認識する抗イディオタイプ抗体（ｍＡｂクローン番号１３６．２０．１）が記載されており、それは今日の開発において多くのＣＡＲ構築物に使用されている。ｍＡｂクローン番号１３６．２０．１のＶＨ及びＶＬの配列を表５に示す（それぞれ配列番号１及び２）。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＣＤ１９抗体に対して特異的でありｍＡｂクローン番号１３６．２０．１と同じＣＤＲのうちの１つ以上（すなわち、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、またはＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義との組み合わせを用いて、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のうちの１つ以上または全て）を有し得る抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来する、抗原結合ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＣＤ１９抗体に対して特異的でありｍＡｂクローン番号１３６．２０．１からの１つ以上（例えば２つ）の可変領域を有し得る抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来する、抗原結合ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＣＤ１９抗体に対して特異的でありｍＡｂクローン番号１３６．２０．１と同じエピトープに結合する抗イディオタイプ抗体または抗イディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来する、抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
抗イディオタイプ抗体のその他の例としては、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（登録商標）から商業的に入手できる抗イディオタイプ抗体、国際特許公開第ＷＯ２０１３／１８８８６４号に記載されている抗ＣＤ２２抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３６号に記載されている抗ＣＥＡ抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体、米国特許第５，９３５，８２１号に記載されている抗ＧＤ２抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体、及びＪａｋｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３：１０，４１８９−４２０（２０１３）に記載されている抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体が挙げられる。また、特別注文の抗イディオタイプ抗体をＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ（登録商標）から得てもよい。
あるいは、ＣＤ１９またはその他の腫瘍関連抗原を標的とするＣＡＲに対する抗イディオタイプ抗体を、Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，８：３ ｅ５７８３８（２０１３）に記載されている方法に従って作ってもよく、抗イディオタイプ抗原結合ポリペプチド構築物の構築に使用してもよい。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗原結合に関与しないＣＡＲの細胞外領域に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。例えば、特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物はＣＡＲのヒンジ領域に結合し得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、抗原結合ポリペプチド構築物の標的となり得るネオエピトープを含んでいるｓｃＦｖ−ＣＤ２８またはｓｃＦｖ−ＣＤ８連結部であり得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、抗原結合ポリペプチド構築物の標的となり得る突然変異（Ｆｃ結合性ｎｕｌｌ）ＩｇＧ ＣＨ２／３を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３４，４３０−４３４（２０１６））によって記載されているＳｔｒｅｐタグＩＩなどの、抗原結合ポリペプチド構築物の標的となるスペーサーを含み得る。
ＣＡＲ分子のヒンジ領域に結合する抗ＣＡＲ抗体の一例は、国際特許出願公開第ＷＯ２０１４／１９０２７３号に記載されている２Ｄ３抗体であり、それは、ＩｇＧ４ ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域に結合するものである。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＩｇＧ４ ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域に結合する抗原結合ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＩｇＧ４ ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域に結合しかつ２Ｄ３と同じＣＤＲのうちの１つ以上（すなわち、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＣＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のうちの１つ以上または全て）を有するかまたはＷＯ２０１４／１９０２７３に記載の２Ｄ３の１つ以上（例えば２つ）の可変領域を有する、抗原結合ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、ＩｇＧ４ ＣＨ２−ＣＨ３ヒンジ領域に結合しかつＷＯ２０１４／１９０２７３に記載の２Ｄ３と同じエピトープに結合する、抗原結合ポリペプチド構築物を含む。
特定の実施形態では、免疫療法薬は、操作されたＴＣＲを発現する操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞であり、多重特異性抗原結合構築物は、ＴＣＲの細胞外部分に結合する。
天然のＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖であるα鎖とβ鎖とを含む。ＴＣＲα／β対は、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εとの複合体になってＴ細胞表面上に発現する。操作されたＴＣＲでは、ＴＣＲの天然のα鎖及びβ鎖は、腫瘍関連抗原に対する増進したかまたは新しい特異性を導入するために修飾されている。操作されたＴＣＲはα鎖及びβ鎖の天然配列の大部分を保持しているため、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物が、操作されたＴＣＲ免疫療法薬を標的とする抗原結合ポリペプチド構築物を含む場合には、抗原結合ポリペプチド構築物は、典型的にはＴＣＲの抗原結合ドメインを標的とすることになる。例えば、免疫療法薬が、操作されたＴＣＲを含んでいるＴ細胞またはＮＫ細胞である、特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物は、上記のような抗イディオタイプ抗体またはその断片に由来するものであり得る。
いくつかの実施形態、例えば、操作されたＴＣＲが非抗原結合ドメインに、抗原結合ポリペプチド構築物の標的となることができるであろう１つ以上の非天然配列を含んでいる場合においては、操作されたＴＣＲの非抗原結合領域に結合する抗原結合ポリペプチド構築物も企図される。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、操作されたＴＣＲのＶαまたはＶβ領域を標的とする。そのような実施形態では、操作されたＴＣＲのＶ領域ドメインが内因性ＴＣＲレパートリーにも存在しているであろうことから、抗原結合ポリペプチド構築物は天然ＴＣＲにも結合し得るが、頻度は非常に低い。
ＴＣＲは、ＭＨＣと関連付けて提示された抗原に結合するので、操作されたＴＣＲは、細胞内腫瘍関連抗原を標的とし得る。細胞内腫瘍関連抗原の例としては、限定されないが、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＷＴ−１、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドが挙げられる。したがって、特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＴＣＲイディオタイプ抗体またはそのような抗ＴＣＲイディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来する、抗原結合ポリペプチド構築物を含み、当該ＴＣＲは、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭＡＲＴ−１、ＷＴ−１、ＨＰＶ−Ｅ６またはＨＰＶ−Ｅ７に由来するペプチドを含有するＭＨＣ複合体に特異的に結合するものである。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、抗ＴＣＲイディオタイプ（またはクロノタイプ）抗体またはそのような抗ＴＣＲイディオタイプ／クロノタイプ抗体の抗原結合断片に由来する、抗原結合ポリペプチド構築物を含み、当該ＴＣＲは、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭＡＲＴ−１またはＨＰＶ−Ｅ６に由来するペプチドを含有するＭＨＣ複合体に特異的に結合するものである。抗ＴＣＲイディオタイプ／クロノタイプ抗体は、当該技術分野においてよく知られており、限定されないが、６Ｂ１１（Ｍｏｎｔｏｙａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２２（１）：１−１４（２００７））及びＫＪＩ−２６（Ｈａｓｋｉｎｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１５７（４）：１１４９−６９（１９８３））を含む。
特定の実施形態では、免疫療法薬は、Ｔ細胞と腫瘍関連抗原とに結合することができる、抗体または抗体断片などの治療剤であり得る。これらの実施形態によれば、治療剤は典型的には少なくとも２つの抗原結合ドメインを含み、そのうちの一方はＴ細胞の細胞外部分に結合し、他方は腫瘍関連抗原に結合する。そのような治療剤の例としては、例えば、ＣＤ３とＣＤ１９とを標的とするブリノツムマブ（ｂｌｉｎｏｔｕｍｕｍａｂ）などの二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）及び、ＣＤ３とＥｐＣＡＭとを標的とするソリトマブ、ならびにその他の「Ｔ細胞係合性」抗体または抗体断片が挙げられる。これらの実施形態によれば、多重特異性抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物は、典型的には治療剤の抗原結合ドメインに結合する。例えば、いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の抗原結合ポリペプチド構築物は、上記のような抗イディオタイプ抗体またはその断片に由来するものであり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、抗ＣＤ１９抗体または抗ＥｐＣＡＭ抗体に対して特異的な抗イディオタイプ抗体またはイディオタイプ抗体の抗原結合断片に由来するものである。そのような抗イディオタイプ抗体には、上記のものが含まれる。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物が含んでいる、免疫療法薬を標的とする抗原結合ポリペプチド構築物は、例えばＦａｂ型、ｓｃＦｖ型またはｓｄＡｂ型を含めた様々な既知の型のうちのいずれか１つであり得る。特定の実施形態では、免疫療法薬を標的とする抗原結合ポリペプチド構築物は、Ｆａｂ型またはｓｃＦｖ型であり得る。いくつかの実施形態では、免疫療法薬を標的とする抗原結合ポリペプチド構築物は、上記のような非免疫グロブリン系抗体模倣型であり得る。
腫瘍関連抗原
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する少なくとも１つの抗原結合ポリペプチド構築物を含む。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上のＴＡＡ結合ポリペプチド構築物を含む。多重特異性抗原結合構築物が２つ以上のＴＡＡ結合ポリペプチド構築物を含む場合、各ＴＡＡ結合ポリペプチド構築物が、異なるＴＡＡに結合し得るか、またはＴＡＡ結合ポリペプチド構築物のうちの２つ以上が、同じＴＡＡ上の異なるエピトープに結合し得る。ＴＡＡは、上に定義がなされており、腫瘍細胞によってのみ発現される抗原（腫瘍特異抗原）及び、腫瘍細胞にも正常細胞にも発現するが正常細胞には通常はより低いレベルで発現する抗原を含む。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物の標的としてのＴＡＡの選択は、多重特異性抗原結合構築物の意図される用途に依拠することになる。上記のとおり、多重特異性抗原結合構築物は、ＴＡＡを標的とする免疫療法薬に結合し、さらに、多重特異性抗原結合構築物自体がＴＡＡに結合する。多重特異性抗原結合構築物が結合するＴＡＡエピトープは、免疫療法薬が結合するＴＡＡエピトープとは異なる。したがって、多重特異性抗原結合構築物及び免疫療法薬は、どちらも同じＴＡＡを標的としつつ抗原分子上の異なるエピトープに結合し得るか、またはそれらは、異なるＴＡＡを標的とし得る。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物と免疫療法薬とは、異なるＴＡＡを標的とする。多重特異性抗原結合構築物と免疫療法薬とで標的とするＴＡＡが異なる場合、当該異なる抗原はどちらも同じ種類のがんに関連していることが典型的であろう。しかしながら、特定の実施形態では、異なる種類のがんに関連しているＴＡＡを標的とすることも企図される。
多重特異性抗原結合構築物の標的となり得るＴＡＡの例としては、限定されないが、１７−１Ａ抗原、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）、α−アクチン−４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ−４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、ＢＣＭＡ、ＢｒＥ３抗原、ＣＡ１２５、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、炭酸脱水素酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、ＣＡＳＰ−８／ｍ、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤｌａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２３、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤ１７１、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ−４／ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、補体因子（例えば、Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ及びＣ５）、結腸特異抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、ＤＡＭ、ディックコップ関連タンパク質（ＤＫＫ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ−１（ＴＲＯＰ−２）、ＥＧＰ−２、ＥＬＦ２−Ｍ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、線維芽活性化タンパク質（ＦＡＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸結合タンパク質、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、ガングリオシド（例えば、ＧＣ２、ＧＤ３及びＧＭ２）、ＧＡＧＥ、ＧＤ２、ｇｐｌ００、ＧＰＣ３、ＧＲＯ−１３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導性因子（ＨＩＦ−１）、ＨＩＦ−１ａ、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、Ｉａ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−Ｘ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ−１Ｒ、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−１Ｒ、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１、ＫＣ４抗原、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｋｒａｓ、ＫＳ−１抗原、ＫＳ１−４、ＬＤＲ／ＦＵＴ、Ｌｅγ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＲＴ−２、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、メラノーマ糖タンパク質、メソテリン、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ムチン（例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ−１／２及びＭＵＭ−３）、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＡＭ４抗原、膵臓がんムチン、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１ＧＦ、ＲＳ５、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＡＧＥ、５１００、サバイビン、サバイビン−２Ｂ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、トムゼン−フリーデンライヒ抗原、Ｔｎ抗原、ＴＮＦ−α、腫瘍壊死抗原、ＴＲＡＧ−３、ＴＲＡＩＬ受容体、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、及びＷＴ−１が挙げられる（例えば、Ｓｅｎｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１２：５０２３−３２（２００６）、Ｐａｒｍｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７８：１９７５−７９（２００７）、Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５４：１８７−２０７（２００５）を参照のこと）。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の標的となるＴＡＡは、血液がんに関連する抗原である。そのような抗原の例としては、限定されないが、ＢＣＭＡ、Ｃ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６６、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ−４、ＣＸＣＲ４、ＤＫＫ、ＥｐｈＡ３、ＧＭ２、ＨＬＡ−ＤＲβ、インテグリンαＶβ３、ＩＧＦ−Ｒ１、ＩＬ６、ＫＩＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、トランスフェリン受容体、及びＶＥＧＦが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＡＡは、悪性Ｂ細胞によって発現される抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４、ＩＧＦ−Ｒ１、ＩＬ６、ＰＤ−１、ＴＲＡＩＬＲ２またはＶＥＧＦである。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の標的となるＴＡＡは、固形腫瘍に関連する抗原である。そのような抗原の例としては、限定されないが、ＣＡＩＸ、カドヘリン、ＣＥＡ、ｃ−ＭＥＴ、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲファミリーメンバー、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ＦＡＰ、葉酸結合タンパク質、ＦＲ−α、ガングリオシド（例えば、ＧＣ２、ＧＤ３及びＧＭ２）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ−１Ｒ、インテグリンαＶβ３、インテグリンα５β１、Ｌｅγ、Ｌｉｖ１、メソテリン、ムチン、ＮａＰｉ２ｂ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１受容体、ｐｇＡ３３、ＰＳＭＡ、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、及びその他の上に列挙したものが挙げられる。
多重特異性抗原結合構築物が含んでいるＴＡＡ結合ポリペプチド構築物（複数可）は、例えばＦａｂ型、ｓｃＦｖ型またはｓｄＡｂ型を含めた様々な既知の型のうちのいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいるＴＡＡ結合ポリペプチド構築物は、ＴＡＡの天然リガンドまたは天然リガンドの機能性断片であり得る。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、２つ以上のＴＡＡ結合ポリペプチド構築物を含む。そのような実施形態では、ＴＡＡ結合ポリペプチド構築物同士が、例えば図１Ｂに示すようにＦａｂ−Ｆａｂ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、またはＦａｂ−ｓｃＦｖとして繋ぎ合わされていてもよい。その他の型も企図され、例えば、Ｆｃと、ＴＡＡを各々が標的とする２つ以上の抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、抗原結合ポリペプチド構築物がＦｃの別個の部分に繋げられている、多重特異性抗原結合構築物が挙げられる。特定の実施形態では、ＴＡＡ結合ポリペプチド構築物のうちの１つ以上は、Ｆａｂ型もしくはｓｃＦｖ型、またはそれらの組み合わせである。
特定の実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、ＴＡＡを指向する既知の抗体、またはそれらの結合ドメインもしくは当該抗体の断片に由来するものであり得る。結合ドメインのタイプの例としては、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ及びｓｄＡｂが挙げられる。さらに、既知の抗ＴＡＡ抗体の抗原結合部分または結合ドメインがＦａｂである場合、ＦａｂをｓｃＦｖに変換することができる。同様に、既知の抗ＴＡＡ抗体の抗原結合部分または結合ドメインがｓｃＦｖである場合、ｓｃＦｖをＦａｂに変換することができる。抗原結合ドメインをタイプ間で変換する方法は当該技術分野において既知である（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ，１１：１１６７−１４７６（２０１２）に記載されている、ｓｃＦｖをＦａｂ型に変換する方法を参照のこと）。
ＴＡＡを指向する既知の抗体は、多くの既知の供給元から商業的に入手され得る。例えば、様々な抗体分泌性ハイブリドーマ株をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ）から入手することができる。様々なＴＡＡに対する多くの抗体は、ＡＴＣＣに寄託されておりかつ／または公開済みの可変領域配列を有し、特定の実施形態において多重特異性抗原結合構築物を作製するために使用され得る。当業者であれば、様々なＴＡＡに対する抗体配列または抗体分泌性ハイブリドーマがＡＴＣＣ、ＮＣＢＩ及び／またはＵＳＰＴＯデータベースの簡単な検索によって得られ得ることを認識するであろう。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物を作製するのに役立ち得る特定のＴＡＡ指向性抗体としては、限定されないが例えば、ＬＬ１（抗ＣＤ７４）、ＬＬ２またはＲＦＢ４（抗ＣＤ２２）、ベルツズマブ（ｈＡ２０、抗ＣＤ２０）、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、オビヌツズマブ（ＧＡ１０１、抗ＣＤ２０）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）、ランブロリズマブ（抗ＰＤ−１受容体）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１受容体）、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＲＳ７（抗ＴＲＯＰ−２）、ＰＡＭ４またはＫＣ４（どちらも抗ムチン）、ＭＮ−１４（抗ＣＥＡ）、ＭＮ−１５またはＭＮ−３（抗ＣＥＡＣＡＭ６）、Ｍｕ−９（抗結腸特異抗原−ｐ）、Ｉｍｍｕ３１（抗α−フェトタンパク質）、Ｒ１（抗ＩＧＦ−ｌＲ）、Ａ１９（抗ＣＤ１９）、ＴＡＧ−７２（例えばＣＣ４９）、Ｔｎ、Ｊ５９１またはＨｕＪ５９１（抗ＰＳＭＡ）、ＡＢ−ＰＧ１−ＸＧ１−０２６（抗ＰＳＭＡダイマー）、Ｄ２／Ｂ（抗ＰＳＭＡ）、Ｇ２５０（抗炭酸脱水素酵素ＩＸ）、Ｌ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アレムツズマブ（抗ＣＤ５２）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、ゲムツズマブ（抗ＣＤ３３）、イブリツモマブ チウキセタン（抗ＣＤ２０）；パニツムマブ（抗ＥＧＦＲ）；トシツモマブ（抗ＣＤ２０）；ＰＡＭ４（別名クリバツズマブ、抗ムチン）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２）、ポラツズマブ（抗ＣＤ７９ｂ）及びアネツマブ（抗メソテリン）が挙げられる。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物が含んでいるＴＡＡ結合ポリペプチド構築物は、既知の抗体のヒト化形態またはキメラ形態に由来する。
非ヒト（例えば齧歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体のほとんどは、レシピエントの超可変領域からの残基をマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基で置き換えた、所望の特異性、親和性及び能力を有するヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換わっている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見受けられない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含むものであり、超可変領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。場合によってヒト化抗体はさらに、免疫グロブリン、典型的にはヒト免疫グロブリンの、定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）、及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
あるいは、対象となる特異的標的ＴＡＡに対する抗体を、標準的技術によって生じさせてもよく、多重特異性抗原結合構築物のＴＡＡ結合ポリペプチド構築物（複数可）を作製するための基礎として使用してもよい。
多重特異性抗原結合構築物を作製する方法
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、当該技術分野において知られている標準的な組換え方法を用いて作られ得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号及び“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１４を参照のこと）。
典型的には、組換えによって多重特異性抗原結合構築物を作るには、多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸を単離し、宿主細胞でのさらなるクローニング及び／または発現のために１つ以上のベクターの中に挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて（例えば、多重特異性抗原結合構築物の重軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離及び配列決定され得る。
抗原結合構築物をコードするベクターのクローニング及び発現に適する宿主細胞としては、例えば、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞が挙げられる。
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入のために用いる方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ接合、または組換え宿主細胞を作出するための当該技術分野において知られているその他の方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含んでいる細胞を指す。外因性ポリヌクレオチドは、非融合型ベクター、例えばプラスミドとして維持されてもよいし、あるいは宿主ゲノム中に融合されてもよい。
本明細書中で使用する場合、用語「真核生物」は、系統発生ドメインＥｕｃａｒｙａに属する生物、例えば、動物（限定されないが、哺乳動物、昆虫、爬虫類及び鳥類を含む）、繊毛虫、植物（限定されないが、単子葉類、双子葉類及び藻類を含む）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などを指す。
本明細書中で使用する場合、用語「原核生物」は、原核の生物を指す。例えば、非真核生物は真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ）（限定されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）など）系統発生ドメインまたは古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）（限定されないが、例えば、メタノコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、ハロバクテリウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、例えばハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ）及びハロバクテリウムの種ＮＲＣ−１、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス・ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）など）系統発生ドメインに属し得る。
例えば、多重特異性抗原結合構築物は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に、細菌内で産生し得る。細菌内での抗原結合構築物断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号及び第５，８４０，５２３号を参照されたい（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体断片の発現について記載しているＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照のこと）。発現後、抗原結合構築物を可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、さらに精製することができる。
原核生物の他にも、糸状菌または酵母などの真核微生物は、そのグリコシル化経路が「ヒト化」された真菌系統及び酵母系統を含めて、多重特異性抗原結合構築物をコードするベクターのためのクローニングまたは発現の適切な宿主であり、部分的または完全にヒトグリコシル化パターンを有する抗原結合構築物の産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
グリコシル化された抗原結合構築物の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。とりわけヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのための、昆虫細胞と併せて使用され得る数々のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養物も宿主として使用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、第６，０４０，４９８号、第６，４２０，５４８号、第７，１２５，９７８号及び第６，４１７，４２９号（遺伝子導入植物において抗原結合構築物を産生させるためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載している）を参照されたい。
脊椎動物細胞を宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で増殖するのに適応した哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株のその他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚性腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７）に記載されているような２９３すなわち２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されているような、ＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；マウス乳がん（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ，３８３：４４−６８（１９８２）に記載されるようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。その他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、例えば、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及び骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０が挙げられる。抗原結合構築物産生に適する特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ＆ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、所定比率で多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸で、安定な少なくとも１つの哺乳動物細胞にトランスフェクトすることと、少なくとも１つの哺乳動物細胞において核酸を発現させることとを含む方法によって、安定な哺乳動物細胞において産生する。いくつかの実施形態では、核酸の所定比率は、発現産物中の多重特異性抗原結合構築物の割合を最も高くする導入核酸の相対比を決定する一過的トランスフェクション実験において決定される。
いくつかの実施形態では、安定な哺乳動物細胞で多重特異性抗原結合構築物を産生させる方法において、安定な哺乳動物細胞の発現産物は、単量体型の重鎖もしくは軽鎖のポリペプチドまたはその他の抗体と比べてより大きい割合で所望の多重特異性抗原結合構築物を含む。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物はグリコシル化されている。
いくつかの実施形態では、安定な哺乳動物細胞で多重特異性抗原結合構築物を産生させる方法において、方法はさらに、所望の多重特異性抗原結合構築物を同定及び精製することを含む。いくつかの実施形態では、同定は、液体クロマトグラフィー及び質量分析の一方または両方によって行われる。
必要な場合には、多重特異性抗原結合構築物を発現後に精製または単離することができる。タンパク質は、当業者に知られている様々な方法で単離または精製され得る。標準的な精製方法としては、例えば、クロマトグラフィー技術、例えば、ＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して大気圧または高圧で行う、イオン交換、疎水的相互作用、親和性、サイズ分類またはゲル濾過、及び逆相が挙げられる。精製方法としてはさらに、電気泳動技術、免疫学的技術、沈降技術、透析技術及びクロマトフォーカシング技術も挙げられる。タンパク質濃縮と併せた限外濾過及びダイアフィルトレーションの技術も有用である。当該技術分野においてよく知られているように、様々な天然タンパク質がＦｃ及び抗体と結合し、これらのタンパク質は、抗原結合構築物の精製のために使用することができる。例えば、細菌性のプロテインＡ及びＧはＦｃ領域に結合する。同様に、細菌性プロテインＬはいくつかの抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は、特定の融合相手によって可能になることが多い。例えば、ＧＳＴ融合を採用する場合にはグルタチオン樹脂を使用して、またはＨｉｓタグを採用する場合にはＮｉ＋２親和性クロマトグラフィーを用いて、またはｆｌａｇタグを使用する場合には固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して、抗体の精製が行われ得る。適する精製技術の一般的な手引きについては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９９４）を参照されたい。必要な精製の程度は、抗原結合構築物の用途に応じて様々であろう。ある場合には、精製が必要でないことがある。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、アニオン交換クロマトグラフィー、例えば、限定されないが、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、多孔質ＨＱ、多孔質ＤＥＡＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ及びＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＱもしくはＤＥＡＥカラム、またはそれらの等価物もしくは同等物でのクロマトグラフィーを用いて精製され得る。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、カチオン交換クロマトグラフィー、例えば、限定されないが、ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、多孔質ＨＳ、多孔質ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ ＳもしくはＣＭ、またはＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＳもしくはＣＭカラム、またはそれらの等価物もしくは同等物でのクロマトグラフィーを用いて精製され得る。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は実質的に純粋である。用語「実質的に純粋」（または「実質的に精製された」は、本明細書に記載の構築物またはその変異型が、タンパク質に通常付随するかまたはそれと相互作用する、その天然の存在環境（すなわち天然細胞、または組換えによって産生する構築物の場合には宿主細胞）において見受けられる成分を、実質的または本質的に含み得ないことを指す。特定の実施形態では、細胞性物質を実質的に含まない構築物は、（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満の汚染タンパク質を含んでいるタンパク質調製物を含む。構築物が宿主細胞によって組換えにより産生する場合、タンパク質は、特定の実施形態では、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％以下で存在する。構築物が宿主細胞によって組換えにより産生する場合、タンパク質は、特定の実施形態では、培地中に約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌまたは約１ｍｇ／Ｌ以下で存在する。
特定の実施形態では、本明細書に記載の異種二量体型Ｆｃを含む多重特異性抗原結合構築物に対して適用される用語「実質的に精製された」は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法によって測定した場合に異種二量体型Ｆｃが少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度レベルを有することを意味する。
多重特異性抗原結合構築物は、当該技術分野において知られている技術を用いて化学的に合成してもよい（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ（１９８３）、及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポリペプチドの断片に相当するポリペプチドをペプチド合成装置の使用によって合成することができる。さらに、望まれる場合には、非古典的アミノ酸または化学アミノ酸類縁体をポリペプチド配列中に置換または追加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定されないが例えば、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばα−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及びアミノ酸類縁体全般が挙げられる。
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物をコードする単離核酸に関する。そのような核酸は、多重特異性抗原結合構築物のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（すなわち抗原結合構築物の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。
特定の実施形態は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸を含むベクター（例えば発現ベクター）に関する。核酸は、単一のベクターに含まれていてもよいし、またはそれは、２つ以上のベクターに含まれていてもよい。いくつかの実施形態では、核酸は多シストロン性ベクターに含まれている。
特定の実施形態は、そのような核酸または当該核酸を含んでいる１つ以上のベクターを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、抗原結合ポリペプチド構築物のＶＬを含むアミノ酸配列と、抗原結合ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列とをコードする核酸を含んでいるベクターを含む（例えば、当該ベクターによって形質転換されている）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、抗原結合ポリペプチド構築物のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んでいる第１ベクターと、抗原結合ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んでいる第２ベクターとを含む（例えば、当該ベクターによって形質転換されている）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
特定の実施形態は、多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸が中に導入されている宿主細胞を、多重特異性抗原結合構築物の発現に適した条件下で培養し、場合によって多重特異性抗原結合構築物を宿主細胞（または宿主細胞培地）から回収する、多重特異性抗原結合構築物を作る方法に関する。
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物と、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲとをＴ細胞またはＮＫ細胞において共発現させることに関する。ＣＡＲと抗体とをＴ細胞において共発現させる方法は、当該技術分野において既知である（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１４／０１１９８８号を参照のこと）。
したがって、いくつかの実施形態は、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲをコードする核酸と、多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸とを含んでいる、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物と、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲとをＴ細胞またはＮＫ細胞において共発現させる方法であって、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲをコードする核酸、及び多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸を、細胞内に導入することと、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ、及び多重特異性抗原結合構築物の発現に適した条件下で、細胞を培養することとを含む、当該方法に関する。特定の実施形態では、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲをコードする核酸、及び多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸はそれぞれ、ベクターの形態である。
翻訳後修飾
特定の実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、翻訳の最中または後に差次的に修飾され得る。
本明細書中で使用される用語「修飾される」は、所与のポリペプチドに対してなされる任意の変更、例えば、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造に対する変更、ポリペプチドの翻訳時修飾または翻訳後修飾を指す。
用語「翻訳後修飾される」は、天然または非天然のアミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後にそのようなアミノ酸に起こる、天然または非天然のアミノ酸の任意の修飾を指す。当該用語は、単なる例として、生体内での翻訳時修飾、試験管内（例えば無細胞翻訳系中）での翻訳時修飾、生体内での翻訳後修飾、及び試験管内での翻訳後修飾を包含する。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基の誘導体化、タンパク質分解的切断、または抗体分子もしくは抗原結合構築物もしくはその他の細胞性リガンドとの結合、またはこれらの修飾の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、既知の技術、例えば、限定されないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼまたはＮａＢＨ４による特異的な化学的切断；アセチル化；ホルミル化；酸化；還元、またはツニカマイシン存在下での代謝合成によって、化学的に修飾されてもよい。
抗原結合構築物の、さらなる任意選択の翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭化水素鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型の炭化水素鎖の化学修飾、及び原形宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の追加または欠失が挙げられる。本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、場合により、タンパク質の検出及び単離を可能にするために、検出可能な標識、例えば、酵素標識、蛍光標識、同位体標識または親和性標識で修飾されてもよい。適する酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適する補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、及びアビジン／ビオチンが挙げられ、適する蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセイン イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンが挙げられ、発光物質の一例はルミノールであり、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンまたはイクオリンが挙げられ、適する放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、三重水素、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノンまたはフッ素が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物に、放射性金属イオンと会合する大環状キレート化剤を結合させてもよい。
多重特異性抗原結合構築物が翻訳後プロセシングなどの天然のプロセスかまたは化学修飾技術かのどちらかによって修飾されているそれらの実施形態では、場合によって、同じタイプの修飾が所与のポリペプチドのいくつかの部位に同程度または様々な程度で存在していてもよい。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンとの共有結合、ヘム部分との共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体との共有結合、脂質または脂質誘導体との共有結合、ホスフォチジルイノシトールとの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、転移ＲＮＡによって媒介されるタンパク質へのアミノ酸の付加、例えばアルギニル化、及びユビキチン化が挙げられる（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｐｏｓｔ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質による結合を受ける、つまりそれと結合または会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用となり得る固体担体に、多重特異性抗原結合構築物を結合させてもよい。そのような固体担体としては、限定されないが例えば、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
多重特異性抗原結合構築物の試験
多重特異性抗原結合構築物は、標的免疫療法薬及び腫瘍関連抗原（複数可）に結合するその能力について、当該技術分野において知られている標準的なアッセイ及びプロトコールを用いて試験され得る。そのようなアッセイ及びプロトコールとしては、例えば、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術が挙げられる。標的となるＣＡＲまたは組換えＴＣＲを発現する細胞は、商業的に（例えば、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡから、またはＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓｈｉｒｌｅｙ，ＮＹから）購入してもよいし、または標準的技術（例えば、Ｙａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：４７９（２００２）、及び国際特許公開第ＷＯ２０１５／０９５８９５号を参照のこと）によって調製してもよい。様々な標的腫瘍関連抗原を発現する細胞株も、商業的に入手することができる。
多重特異性抗原結合構築物はさらに、標的腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞に対する標的免疫療法薬の指向性を変化させるその能力について試験され得る。例えば、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を免疫療法薬が含む場合、多重特異性抗原結合構築物と接触した後のＴ細胞またはＮＫ細胞の機能的応答を試験管内で、当該技術分野において知られている標準的アッセイを用いて評価してもよい。いくつかの典型的なアッセイは、実施例において示されており、また、以下に記載する。
例えば、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を多重特異性抗原結合構築物の存在下または非存在下で腫瘍関連抗原発現細胞及び対照細胞と共にインキュベートした後、当該操作された細胞からのサイトカイン放出を評価してもよい。共培養細胞の適切な時間にわたるインキュベーションの後、上清を採取することができ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−２のレベルが例えば多重サイトカイン免疫アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））またはＥＬＩＳＡによって決定され得る。Ｔ細胞またはＮＫ細胞によるサイトカイン放出は、細胞活性化の指標であり、細胞傷害性と相関することが当該技術分野において既知である（例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，３２（７）：６８９−７０２（２００９）、Ｌａｎｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒ，２０（３）：６３３−６４３（２０１２）、及びＭａｒｄｉｒｏｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２２（１８）：３１３８−３１４８（２０１３）を参照のこと）。
場合によって、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の細胞溶解活性も、例えば操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞と標的腫瘍細胞とを様々な濃度の多重特異性抗原結合構築物の存在下及び非存在下でインキュベートすることによって評価され得る。インキュベーション後、標的腫瘍細胞の溶解は様々な技術、例えば、フローサイトメトリー、５１Ｃｒ放出、蛍光測定、または速度論的生存能プラットフォーム（例えばＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（Ａｃｅａ））によってモニタリングされ得る。
操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞の増殖も、標的腫瘍関連抗原を発現する両細胞と多重特異性抗原結合構築物とのインキュベーション後に評価され得る。例えば、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を適切な標識、例えばカルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識することができ、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖がフローサイトメトリーによって評価され得る。
生体内での多重特異性抗原結合構築物の効果も標準的技術によって評価され得る。それは例えば、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍モデル動物被験体に対する、操作された細胞の養子移入及び多重特異性抗原結合構築物の投与の後に、腫瘍をモニタリングすることによって行われる。様々なＰＤＸ腫瘍モデルが商業的に入手可能であり、当業者であれば、採用されている標的腫瘍関連抗原に基づいて適切なモデルを容易に選択することができる。腫瘍生着後、操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞が動物に投与され得、次いで適切な期間の後に多重特異性抗原結合構築物が投与され得る。多重特異性抗原結合構築物は、静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）に投与され得る。投薬のスケジュール及び量は様々であるが、当業者であれば容易に決定することができる。典型的な投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇを週に１回であろう。腫瘍成長は、標準的手順によってモニタリングすることができる。例えば、標識された腫瘍細胞を使用している場合には、腫瘍成長は適切なイメージング技術によってモニタリングされ得る。固形腫瘍の場合には、キャリパーによって腫瘍の大きさも測定され得る。
Ｔ細胞と腫瘍関連抗原とに結合することができる治療剤である免疫療法薬、例えば二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）の指向性を変化させる多重特異性抗原結合構築物の能力は、まずＴ細胞を当該治療剤で前処理して当該薬剤をＴ細胞と係合させ、その後に細胞を多重特異性抗原結合構築物と接触させることにより、検査され得る。その後、上記と同じ方法を用いてＴ細胞の細胞傷害性、サイトカイン放出及び増殖が評価され得る。
医薬組成物
特定の実施形態は、本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物と薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物に関する。
用語「薬学的に許容できる」は、連邦政府または州政府の規制当局によって承認されていること、または米国薬局方もしくは一般的に認知されているその他の薬局方に動物、より詳しくはヒトにおける使用についての記載があることを意味する。
用語「担体」は、構築物と共に投与され得る希釈剤、佐剤、賦形剤、ビヒクルまたはそれらの組み合わせを指す。そのような医薬担体は、無菌の液体、例えば水及び油、例えば、石油、動物、植物または合成に由来する油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などとすることができる。いくつかの態様では、担体は、天然に存在しない人工の担体である。水は、医薬組成物を静脈内に投与する場合に担体として使用することができる。生理食塩水溶液ならびに、デキストロース及びグリセロールの水溶液も、とりわけ注射用液のために、液体担体として採用することができる。適する医薬賦形剤としては、例えば、デンプン、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、望まれる場合には少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。適する医薬担体の例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。
医薬組成物は、液体、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態であり得る。組成物は、従来の結合剤及びトリグリセライドなどの担体と共に坐剤として製剤化されてもよい。経口製剤は、標準的な担体、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。
医薬組成物は、適切な投与のための形態を患者に提供すべく治療上有効な量の多重特異性抗原結合構築物を適切な量の担体と共に含有することになる。製剤は、投与形態に適合すべきである。
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物を含む組成物は、慣例的手順に従って、人間に対する静脈内投与に適合した医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は無菌の等張緩衝水溶液である。必要ならば、組成物は、可溶化剤及び、注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔剤も含み得る。通常、成分は、活性剤の量を表示したアンプルまたは小袋などの密閉容器に入った単位剤形、例えば凍結乾燥粉末または水不含濃縮物として、個別に供給されるかまたは混ぜ合わされるかのどちらかである。組成物を輸注によって投与することになる場合には、それを、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水の入った輸注ボトルを使用して分注することができる。組成物を注射によって投与する場合には、投与前に成分が混合され得るように、無菌の注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、中性または塩の形態として製剤化される。薬学的に許容できる塩としては、例えば、アニオン、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンと共に形成された塩及び、カチオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンと共に形成された塩が挙げられる。
多重特異性抗原結合構築物を使用する方法
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物は、標的免疫療法薬がその同族抗原またはエピトープとは異なる腫瘍細胞抗原またはエピトープに結合するように標的免疫療法薬の指向性を変化させるために、使用され得る。これとの関連において、多重特異性抗原結合構築物が含んでいる、腫瘍関連抗原を標的とする抗原結合ドメインは、免疫療法薬が含んでいる抗原結合ドメインに対して代替の抗原結合ドメインを提供する。いくつかの実施形態では、標的腫瘍細胞は、免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の発現の喪失、突然変異、翻訳後修飾または下方制御を有するものであり得、多重特異性抗原結合構築物は、かくして代替の抗原結合ドメインを提供し、それを介して免疫療法薬は腫瘍細胞と結合し得る。代替の抗原結合ドメインは、標的腫瘍細胞上の異なる腫瘍関連抗原に結合し得るか、またはそれは、異なるエピトープにて同じ腫瘍関連抗原に結合し得る。
したがって、特定の実施形態は、腫瘍関連抗原特異的な免疫療法薬の指向性を代替の腫瘍抗原へと向け変える方法に関する。いくつかの実施形態では、そのような指向性変化は、抗原下方制御及び／または新生物細胞不均一性を伴う腫瘍細胞の一般的な処置耐性機序を克服するのに役立ち得る。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、腫瘍細胞に結合する標的免疫療法薬の能力を向上させるために使用され得る。これとの関連において、多重特異性抗原結合構築物は、標的腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原に結合する追加の抗原結合ドメインを提供する。追加の抗原結合ドメインは、標的腫瘍細胞上の異なる腫瘍関連抗原に結合し得るか、またはそれは、異なるエピトープにて同じ腫瘍関連抗原に結合し得る。
特定の実施形態は、免疫療法薬の治療効果を延長するために多重特異性抗原結合構築物を使用する方法に関する。特定の実施形態は、免疫療法薬の治療効果を向上させるために多重特異性抗原結合構築物を使用する方法に関する。例えば、いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、免疫療法薬処置が有効となる可能性を高めるために、免疫療法薬による処置を現在受けている患者に投与され得る。そのような処置による恩恵を受けるであろう患者には、例えば、免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原を低レベルで呈している患者、または免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の発現の喪失、修飾もしくは減少の恐れがある患者、または免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の発現の顕著な不均一性を呈する患者が含まれるであろう。これとの関連において、多重特異性抗原結合構築物は、免疫療法薬と並行して投与され得るか、またはそれは、免疫療法薬の投与の後に投与され得る。そのような後からの多重特異性抗原結合構築物の投与は、免疫療法薬と多重特異性抗原結合構築物の投与が、短期間（例えば数分または数時間程度）または長期間（例えば数日または数週間程度）であり得る規定された期間だけ隔てられていることを意味する。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、以前に免疫療法薬による処置を受けたことがある患者であって、例えば免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の低レベルの発現または発現喪失が原因で、再発したかまたは処置に対して応答しなかった、当該患者に対して投与され得る。そのような実施形態では、多重特異性抗原結合構築物の投与による免疫療法薬の指向性変化は免疫療法薬の治療効果を開始または再開させると予想される。
特定の実施形態は、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者のがんを処置する方法であって、多重特異性抗原結合構築物を患者に投与することを含む、当該方法に関する。いくつかの実施形態では、患者は、免疫療法薬による前処置を受けたことがある。そのような実施形態では、患者は、免疫療法薬による前処置後に再発したかまたは当該前処置が失敗した者であり得る。
いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物による処置に応答する可能性が最も高い患者は、免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の発現を評価すること、及び／または以前の免疫療法の持続を指し示す適切なバイオマーカーの存在を評価することによって、識別され得る。適切なバイオマーカーの評価は、例えば、Ｔ細胞上またはＮＫ細胞上のＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲの直接的検出、増加した活性化メモリーＴ細胞の検出、またはＢ細胞指向免疫療法での少ない健常Ｂ細胞数などの薬力学的マーカーの検出を含み得る。免疫療法薬の標的となる腫瘍関連抗原の新生物細胞発現及び以前の免疫療法の持続の形跡が減少した患者は、多重特異性抗原結合構築物による処置に応答する可能性がより高い。
多くの現在通用している免疫療法薬が血液がんの処置に使用される。それゆえ、特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、血液がんを処置する方法において使用され得る。血液がんの例としては、限定されないが、急性白血病、例えば、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、または急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；慢性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）または慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（例えば、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＣＮＳの原発ＤＬＣＢＬ、皮膚原発ＤＬＢＣＬ下肢型、または加齢性ＥＢＶ＋ ＤＬＢＣＬ）、慢性炎症に関連するＤＬＢＣＬ、濾胞性リンパ腫、小児濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞型または大細胞型の濾胞性リンパ腫、悪性リンパ増殖状態、ＭＡＬＴリンパ腫（粘膜関連リンパ様組織の節外性辺縁帯リンパ腫）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成及び骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞新生物、ワルデンストレームマクログロブリン血症、脾辺縁帯リンパ腫、脾臓リンパ腫／白血病（例えば分類不可能なもの）、脾臓びまん性赤脾髄小細胞型Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病変異型、リンパ形質細胞性リンパ腫、重鎖疾患（例えば、α重鎖疾患、γ重鎖疾患またはμ重鎖疾患）、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、節性辺縁帯リンパ腫、小児節性リンパ腫、原発性皮膚濾胞中心リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、縦隔（胸腺）原発大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＡＬＫ＋大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病において生じる大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、または分類不可能な血液がん（例えば、ＤＬＢＣＬとバーキットリンパ腫との中間またはＤＬＢＣＬと古典的ホジキンリンパ腫との中間の特徴を有するもの）が挙げられる。
免疫療法薬は、固形腫瘍の処置において使用される機会も増えている。したがって、いくつかの実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は、固形腫瘍を処置する方法において使用され得る。一般的に存在する固形腫瘍の例としては、限定されないが、脳、乳房、子宮頚部、結腸、頭頸部、腎臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、胃及び子宮のがん、ならびに非小細胞肺がん及び大腸がんが挙げられる。様々な形態のリンパ腫も固形腫瘍の形成を招き得、よってそれらも固形腫瘍とみなされることが多い。
特定の実施形態は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化させるために、ＣＡＲまたはＴＣＲと腫瘍関連抗原とに結合する多重特異性抗原結合構築物を使用する、方法に関する。Ｔ細胞またはＮＫ細胞の活性化は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−２などのサイトカインの放出及び／または、腫瘍関連抗原を発現する細胞に対する細胞傷害性をもたらし得る。当該方法は、試験管内、生体外または生体内で行われ得る。
投与
様々な投与形態、例えば、エアゾール吸入、注射、内服、輸液、埋植または移植が、患者への多重特異性抗原結合構築物の投与に適する。多重特異性抗原結合構築物の適切な投与形態及び投与経路は、技能を有する実施者であれば処置する症状及び患者を考慮して決定することができる。特定の実施形態では、多重特異性抗原結合構築物は患者に対して皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔内に投与され得る。典型的には、がんの処置において治療化合物は患者に対して全身的に、例えば患者の血流中へのボーラス注射または連続輸注によって、投与される。
Ｔ細胞またはＮＫ細胞において多重特異性抗原結合構築物をＣＡＲまたは操作されたＴＣＲと共に発現させる特定の実施形態では、細胞を患者に投与する前に以下のうちの少なくとも１つを試験管内で起こす：ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする核酸及び多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸の細胞内への導入、及び／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。そのような生体外での手順は当該技術分野においてよく知られている。手短に述べると、単離したＴ細胞またはＮＫ細胞を試験管内での標準的な形質導入技術またはトランスフェクション技術によって遺伝子改変して、ＣＡＲまたはＴＣＲと多重特異性抗原結合構築物とを発現するベクターを導入する。典型的には、処置する患者から細胞を単離する（つまり、細胞は自家である）。しかしながら、特定の実施形態は、患者に関して同種異系、同系または異種である細胞の使用を企図している。
改変した細胞を、当該技術分野において知られている標準的方法を用いて生体外で増殖させる（例えば、米国特許第５，１９９，９４２号に記載されている造血幹細胞及び造血前駆細胞の増殖のための手順を参照のこと）。典型的には、生体外でのＴ細胞の培養及び増殖は、ＰＢＭＣを採集すること、及び場合によって対象からのＴ細胞を精製することを含む。Ｔ細胞は、組み合わせたマイトジェン刺激及び任意で分化刺激、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及び／またはＩＬ−２１などの外因性サイトカインを有する抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを使用して増殖させる（Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７１（１０）：３５１６−２７（２０１１））。ある場合には、ＣＤ３４＋の造血幹細胞及び造血前駆細胞を哺乳動物からの末梢血採取物または骨髄外植体から単離し、米国特許第５，１９９，９４２号において記載されているように、適切な細胞成長因子を含む培地中でそのような細胞を生体外で増殖させる。場合によってはその他の因子、例えば、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−１、ＩＬ−３及びｃ−ｋｉｔリガンドを細胞の培養及び増殖のために使用してもよい。
改変し増殖させた細胞は、その後、適切な経路、例えば、皮内注射、皮下注射、ｉ．ｖ．注射、または腫瘍内もしくはリンパ節内への直接注射によって患者に投与される。
患者に投与する上記処置剤の投薬量は、処置する症状及び患者の厳密な性質によって様々であろう。ヒトへの投与のための投薬量の加減は、当該技術分野において容認されている実務に従って行うことができる。
キット及び製造品
本発明には、１つ以上の多重特異性抗原結合構築物を含むキット、及び多重特異性抗原結合構築物をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むキットも包含される。キットが１つ以上のポリヌクレオチドを含んでいる特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞を形質転換するために使用され得るベクターの形態で提供され得る。
キットの個々の構成要素は別個の容器内に包装されることになり、また、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式の、製造、使用または販売の当局による承認を反映した通知書をそのような容器に添付することができる。キットは、場合によって、多重特異性抗原結合構築物またはポリヌクレオチドの使用方法または投与計画について概説する説明書または指示書を含んでいてもよい。
キットの１つ以上の構成要素が溶液、例えば水溶液または無菌水溶液として提供される場合、容器手段自体は、吸入器、シリンジ、ピペット、点眼器または、溶液を対象に投与し得るかもしくはキットの他の構成要素に添加及び混合し得るその他の装置のようなものであり得る。
キットの構成要素はまた、乾燥状態または凍結乾燥状態で提供されてもよく、キットはさらに、凍結乾燥した構成要素を再構成するための適切な溶媒を含むことができる。容器の数または種類にかかわらず、本明細書に記載のキットは、組成物を患者に投与するのを支援する器械をさらに含んでいてもよい。そのような器械は、吸入器、鼻内噴霧装置、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼器、または医学的に承認されている同様の送達用運搬媒体であり得る。
特定の実施形態は、本明細書に記載の患者の処置に有用な物質を含有する製造品に関する。製造品は、容器と、容器に貼付または添付されたラベルまたはパッケージ添付文書とを含む。適する容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で作られ得る。容器は、多重特異性抗原結合構築物を含む組成物であって、それ自体または別の組成物との組み合わせが患者の処置に有効である、当該組成物を保持するものであり、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺できる栓を有する静注溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたはパッケージ添付文書は、好適とされる症状を処置するために組成物が使用されることを表示する。いくつかの実施形態では、製造品は、（ａ）本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物を含んでいる組成物が中に入っている第１容器；及び（ｂ）さらなる細胞傷害性薬剤あるいは治療剤を含んでいる組成物が中に入っている第２容器を含み得る。そのような実施形態では、製造品は、特定の症状を処置するために組成物を使用することができることを表示しているパッケージ添付文書をさらに含み得る。あるいは、またはさらに、製造品は、薬学的に許容できる緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含んでいる第２（または第３）容器をさらに含み得る。製造品は、場合によってさらに、商業及び利用者の見地から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含んでいてもよい。
ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書に記載されているように、多重特異性抗原結合構築物は少なくとも１つのポリペプチドを含む。特定の実施形態は、本明細書に記載のそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
本明細書に記載の多重特異性抗原結合構築物、ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、典型的には単離されている。本明細書中で使用する場合、「単離されている」は、同定されかつその天然の細胞培養環境の構成要素から分離及び／または回収された薬剤（例えばポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を意味する。その天然環境の混入物成分は、抗原結合構築物の診断用途または治療用途を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質を含み得る。単離されているとは、薬剤が合成によって、例えば人間の介入によって製造されていることも指す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に使用される。つまり、ポリペプチドに関する記載は、ペプチドについての記載及びタンパク質についての記載に同様に当てはまり、その逆もまた然りである。当該用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーにも、１つ以上のアミノ酸残基が天然にコードされないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書中で使用する場合、当該用語は、アミノ酸残基が共有結合性のペプチド結合によって繋げられた、完全長タンパク質を含めた任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類縁体及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０種の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）ならびにピロリジン及びセレノシステインである。アミノ酸類縁体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素に結合した炭素、カルボキシル基、アミノ基及び「Ｒ」基を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのような類縁体は、修飾Ｒ基を有する（例えばノルロイシン）かまたは修飾ペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸への言及は、例えば、天然に存在するタンパク新生Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学修飾アミノ酸、例えばアミノ酸の変異型及び誘導体；天然に存在する非タンパク新生アミノ酸、例えば、β−アラニン、オルニチンなど、ならびに当該技術分野においてアミノ酸に特徴的であると知られている特性を有する化学合成化合物を含む。天然に存在しないアミノ酸の例としては、限定されないが、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシル−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖内のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置き換わっているアミノ酸（例えばシステイン酸）が挙げられる。合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸または１つ以上のＤ−アミノ酸を含めた非天然アミノ酸を、本明細書に記載の抗原結合構築物に組み込むことは、多種多様な点において有益であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチドなどは、Ｌ−アミノ酸含有対応物に比べて向上した、試験管内または生体内での安定性を呈する。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み込んでペプチドなどを構築することは、より高い細胞内安定性が望まれるかまたは必要とされる場合に特に有用となり得る。例えばＤ−ペプチドは通常、内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性であり、それゆえ、分子の向上した生物学的利用能及び生体内での延長された寿命を、そのような特性が望まれる場合にもたらす。さらに、Ｄ−ペプチドは、主要組織適合性複合体クラスＩＩによって制限されるＴヘルパー細胞への提示のために効率的にプロセシングされることができず、それゆえ、生物全体に体液性免疫応答を誘導する可能性がより低い。
本明細書においてアミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字記号かまたはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって勧告されている１文字記号かのどちらかによって呼称される。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって呼称され得る。
本発明には、多重特異性抗原結合構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。用語「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続的範囲を指し示すことが意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム由来、ｃＤＮＡ由来、ＲＮＡ由来、半合成由来もしくは合成由来のもの、またはそれらの任意の組み合わせであり得、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチド、及びそれらの一本鎖形態または二本鎖形態のポリマーを含み得る。具体的に限定されない限り、当該用語は、基準ポリヌクレオチドと同様の結合特性を有しかつ天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知の類縁体を含有するポリヌクレオチドを包含する。具体的に別段の限定がなされない限り、当該用語は、アンチセンス技術で使用されるＰＮＡ（ペプチド核酸）を含めたオリゴヌクレオチド類縁体及びＤＮＡの類縁体（ホスホロチオエート、ホスホロアミダートなど）も指す。別段の定めがない限り、特定のヌクレオチド配列は、明確に示された配列だけでなく、保存的に修飾されたそれらの変異型（限定されないが、縮重コドン置換体を含む）及び相補的配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換体は、選択された１つ以上（または全て）のコドンの３番目の位置が混合塩基及び／またはデオキシイノシン残基で置き換わった配列を生じさせることによって得られ得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
「保守的に修飾された変異型」は、アミノ酸配列にも核酸配列にも適用される。特定のヌクレオチド配列に関して、「保守的に修飾された変異型」は、同一であるかもしくは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指すか、またはヌクレオチド配列がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一である配列を指す。遺伝子コードの縮重のために、機能的に同一である多くの核酸が何らかの所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸アラニンをコードする。それゆえ、アラニンがコドンによって指定されるどの位置でも、コードされるポリペプチドを変更することなく、当該コドンを対応する記載のコドンのいずれかに変更することができる。そのような核酸変異は、「サイレント変異」であり、それは保守的に修飾された変異の一種である。当該技術分野において通常の技量を有する者であれば、ヌクレオチド配列中の各コドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して機能的に同一の分子を得ることができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の各サイレント変異は、記載の各配列において暗に示されている。
アミノ酸配列に関して、コードされた配列における単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸の変化、追加または欠失をもたらす、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または追加が、変化によってアミノ酸の欠失、アミノ酸の追加またはアミノ酸の化学的類似アミノ酸による置換をもたらす「保守的に修飾された変異型」であることは、当該技術分野において通常の技量を有する者であれば認識するであろう。
機能的に類似したアミノ酸をもたらす保守的置換の一覧は、当該技術分野において通常の技量を有する者に知られている。以下の８つの群はそれぞれ、互いに保守的置換であるアミノ酸を含んでいる：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照のこと）。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列との関連において用語「同一」は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。比較窓にわたって、つまり以下の配列比較アルゴリズム（または当該技術分野において通常の技量を有する者が入手できるその他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して測定されるかまたは手作業でのアラインメント及び目視検査によって測定される指定領域にわたって、配列同士を一致が最大となるように比較及びアラインメントしたとき、配列が、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドをある割合で（つまり、指定領域にわたって約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％の同一性で）有しているならば、配列は「実質的に同一」である。この定義は、試験配列の相補体に関するものでもある。同一性は、長さが少なくとも約５０アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、または長さが７５〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチドである領域にわたって、または明記のない場合にはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列全体にわたって存在し得る。ヒト以外の種からの同族体を含めて、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識プローブでライブラリーをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でスクリーニングするステップと、上記ポリヌクレオチド配列を含んでいる完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するステップとを含む工程によって得られ得る。そのようなハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られている。
配列比較のために典型的には１つの配列が基準配列としての役割を果たし、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよいし、または代替パラメータを指定してもよい。その後、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて基準配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。
「比較窓」は、本明細書中で使用される場合、２０個から６００個まで、一般的には約５０個から約２００個まで、より一般的には約１００個から約１５０個までからなる群から選択されるいずれか１つの個数分の連続位置を有するセグメントであって、配列と、同じ個数の連続位置を有する基準配列とを最適にアラインメントした後に当該セグメント内で２つの配列同士が比較され得る、当該セグメントに対する言及を含む。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野において通常の技能を有する者に知られている。比較のための最適な配列アラインメントは、限定されないが例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）または、手作業でのアラインメント及び目視検査によって、行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ 補遺）を参照のこと）。
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するのに適するアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それらは各々、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターのウェブサイトから公的に入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定付ける。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして１１のワード長さ（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長さ及び１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５ （１９９２）を参照のこと）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは通常、「低複雑性」フィルターを外した状態で実施する。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列同士の類似性についての統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間での一致を偶然起こす確率の表示を提供するものである。例えば、試験核酸と基準核酸との比較において最小合計確率が約０．２未満または約０．０１未満または約０．００１未満である場合に核酸は基準配列と類似しているとみなされる。
いくつかの態様において、多重特異性抗原結合構築物は、表中に示されるかまたは本明細書において開示される受託番号で示される関連アミノ酸配列またはその断片と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離されている多重特異性抗原結合構築物は、表中に示されるかまたは本明細書において開示される受託番号で示される関連ヌクレオチド配列またはその断片と少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載の本発明についてのよりよい理解を得るために以下の実施例を示す。これらの実施例が、本発明の例示的実施形態を記載することを意図されたものであり、本発明の範囲を限定することが決して意図されない、ということは理解されよう。
実施例１：二重特異性抗体変異型
以下の型の二重特異性抗原結合構築物を作製した：
ａ）一方の抗原結合ドメインがｓｃＦｖであり他方がＦａｂであるハイブリッド抗体型。これらの二重特異性抗原結合構築物はさらに、ＨｅｔＦｃＡとＨｅｔＦｃＢとの２成分のＦｃポリペプチドの異種二量体型会合を促すＣＨ３ドメインアミノ酸置換を有するＩｇＧ１異種二量体型Ｆｃを含む。
ＨｅｔＦｃＡは、アミノ酸置換：Ｔ３５０Ｖ／Ｌ３５１Ｙ／Ｆ４０５Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む。
ＨｅｔＦｃＢは、アミノ酸置換：Ｔ３５０Ｖ／Ｔ３６６Ｌ／Ｋ３９２Ｌ／Ｔ３９４Ｗを含む。
Ｆｃ領域内のアミノ酸残基は、ＥＵ抗体の付番に関するＫａｂａｔと同様のＥＵ索引に従って識別される（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，６３：７８−８５（１９６９））。ハイブリッド抗体型構築物は３つのポリペプチド鎖：第１標的に結合するｓｃＦｖに融合させた第１Ｆｃポリペプチドと、ＶＨ−ＣＨ１ドメインに融合させた第２Ｆｃポリペプチドと、軽鎖とを含み、ＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び軽鎖は、第２標的に結合するＦａｂ領域を形成している。
ｂ）第１標的に結合する第１ＶＬ−ＶＨ配列がＧｌｙＳｅｒ系スペーサーによって、第２標的に結合する第２ＶＬ−ＶＨ配列に連結されている、タンデムｓｃＦｖ型。タンデムＳｃＦｖ構築物は６ｘＨｉｓタグも含有していた。
これによって作製した二重特異性抗原結合構築物を表Ｃに記載する。「抗ＦＭＣ６３ｉｄ」は抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）６９：４１１−４２２、及び国際特許公開第ＷＯ２０１４／１９０２７３号を参照のこと）。「ＦＬＡＧ」は、本明細書に記載のいくつかの典型的な構築物において陰性対照アームとして使用される、よく知られたアミノ酸モチーフ「ＤＹＫＤＤＤＤＫ」（Ｈｏｐｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６（１０）：１２０４−１０（１９８８））である。ＢＣＭＡ及びメソテリンは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ｓｃＦｖ配列及びＦａｂ配列は、表４において識別される既知の抗体の配列から生じさせた（実施例７を参照のこと）。表Ｃに列挙する各変異型のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を表６に示す。タンデムｓｃＦｖ配列は６ｘＨｉｓタグのない状態で示されている。
（表Ｃ）二重特異性抗原結合構築物
Figure 2019513777
Figure 2019513777
Figure 2019513777
実施例２：二重特異性抗体の産生
実施例１に記載の変異型番号１６４４３（ＦＬＡＧ−メソテリン）、１６４４５（ＦＭＣ６３ｉｄ−ＢＣＭＡ）、１６４４６（ＦＭＣ６３ｉｄ−メソテリン）及び１６４４８（ＦＬＡＧ−ＢＣＭＡ）で表される二重特異性抗原結合構築物を以下のとおりに作製した。
ヒト／哺乳動物における発現のために最適化されたコドンを使用する遺伝子合成によって、抗体重軽鎖をコードする遺伝子を構築した。実施例７で概説する一般的手順に従って二重特異性抗体をクローニングし発現させた。異種二量体種は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー及びそれに続くサイズ排除クロマトグラフィーによって、９０％を上回る純度で単離された。全ての調製物は、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＳＥＣによって検証したところ多量体種が５％未満であった。
実施例３：腫瘍細胞に対する二重特異性抗体の結合
方法
１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中でＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）及びＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５５）を培養した。１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中でＡ１８４７細胞を培養した。３つの細胞株の各々を遠心分離し、冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．４＋０．５％のＢＳＡ）中に５００万細胞／ｍｌで懸濁させた。試験抗体をＰＢＳで０．３ｍｇ／ｍｌに希釈した。次いで抗体をＰＢＳで０．１ｍｇ／ｍｌ、３０ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、３ｕｇ／ｍｌ、１ｕｇ／ｍｌ及び０．３ｕｇ／ｍｌに段階希釈した。氷上の９６ウェルプレート内で１０マイクロリットルの希釈抗体を９０ｕｌの細胞と混合し、プレートを氷上で３０分間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離し、上清をデカンテーションによって除去し、細胞ペレットを２００ｕｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。プレートを再び遠心分離し、上清をデカンテーションによって除去し、１ｕｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と０．１ｕｇの７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）とを含有する１００ｕｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を懸濁させた。プレートを氷上で３０分間インキュベートし、その後、上記のようにすすぎ、１％のパラホルムアルデヒドを含有する２００ｕｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を懸濁させた。プレートを４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｘ２０フローサイトメータで細胞を得た。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で解析した。細胞をまず、７−ＡＡＤ染色に対する前方光散乱によってプロットし、その後、生細胞（７−ＡＡＤ陰性）に絞り、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８染色について度数分布図としてプロットした。次いで平均蛍光光度を記録し、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に貼り付け、それによって平均蛍光光度を抗体濃度に対してプロットした。
結果
図２に示すとおり、二重特異性メソテリン（ＭＳＬＮ）指向性構築物（ｖ１６４４３及びｖ１６４４６）は、ＭＳＬＮ＋ Ａ１８４７細胞に結合したが、対照ＲＰＭＩ８２２６細胞には結合しなかった。同様に、二重特異性ＢＣＭＡ指向性構築物（ｖ１６４４８及びｖ１６４４５）は、ＢＣＭＡ＋ ＲＰＭＩ８２２６細胞に結合したが、対照Ａ１８４７細胞には結合しなかった。
実施例４：ＣＡＲ発現Ｔ細胞に対する二重特異性抗体の結合
方法
ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡによって製造された、ＣＤ１９に対して特異的なＦＬＡＧタグ付き第２世代ＣＡＲ（細胞外の抗ＣＤ１９（ＦＭＣ６３）ｓｃＦｖ、ＦＬＡＧ、ＣＤ２８「ヒンジ」及び膜貫通部分ならびにそれに続く細胞内のＣＤ２８及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有するＣＡＲ）を発現するように、ヒトＴ細胞を操作した。手短に述べると、Ｆｉｃｏｌｌによる密度沈降を用いて健常個体の末梢血からＰＢＭＣを単離し、凍結保存した。ＣＡＲコードベクターと第三世代パッケージング構築物とによるＨＥＫ２９３細胞の共トランスフェクションによって、ＣＡＲ配列を含有するレンチウイルス粒子を作った。レンチウイルス粒子を超遠心分離によって培地から採集し、ｑＲＴ−ＰＣＲによって力価測定し、冷凍した。ＰＢＭＣを解凍し、５％のヒトＡＢ血清と、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体被覆磁気ビーズと、ＩＬ−２とを含有するＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地中で一晩培養した。翌日、５ｕｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランの存在下で細胞をレンチウイルス調製剤によって５：１の感染多重度で形質導入した。翌２週間の培養にわたって２〜３日毎に細胞数を数え、細胞密度を５０万〜３００万個／ｍｌに保つために追加の培地を添加した。培養９日目に、ＦＬＡＧに対して特異的な抗体を使用してＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって評価した。
ＣＡＲ−Ｔ細胞に対する抗体結合性を測定するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞調製物かまたはＣＤ１９ ＣＡＲを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞かのどちらかを遠心分離して冷ＦＡＣＳ緩衝液中に２５０万細胞／ｍｌで懸濁させた。試験抗体をＰＢＳで希釈して０．４ｍｇ／ｍｌにし、次いで、ＰＢＳで１２０ｕｇ／ｍｌ及び４０ｕｇ／ｍｌに段階希釈した。氷上の９６ウェルプレート内で２５マイクロリットルの抗体を３反復で７５ｕｌの細胞と混合し、プレートを氷上で３０分間インキュベートした。その後、プレートを遠心分離し、上清をデカンテーションによって除去し、細胞ペレットを２００ｕｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。プレートを再び遠心分離し、上清をデカンテーションによって除去し、１ｕｇのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と０．１ｕｇの７−ＡＡＤとを含有する１００ｕｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液中に細胞を懸濁させた。プレートを氷上で３０分間インキュベートし、その後、上記のようにすすぎ、１％のパラホルムアルデヒドを含有する２００ｕｌの冷ＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。プレートを４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で細胞を得た。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で解析した。細胞をまず、７−ＡＡＤ染色に対する前方光散乱によってプロットし、その後、生細胞（７−ＡＡＤ陰性）に絞り、ダミーチャンネルに対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８染色によってプロットした。
結果
図３に示すとおり、抗ＦＭＣ６３イディオタイプ含有二重特異性構築物（ｖ１６４４６及びｖ１６４４５）は、ＨＥＫ２９３細胞または初代ＣＡＲ−Ｔ細胞において安定的に発現したＦＭＣ６３を含有する抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物に対して、選択的に結合した。
この実施例で使用したＣＡＲ構築物は細胞外ＦＬＡＧ配列を含有していたが、抗ＦＬＡＧドメインを含む変異型によるＦＬＡＧとの結合は認められなかった。これはおそらく配座の制限のためである。というのも、ＦＬＡＧタグはＣＡＲ構築物のｓｃＦｖとＣＤ２８ヒンジとの間に位置しているからである。この結合の欠如によって、これらの変異型の抗ＦＬＡＧドメインを陰性対照係合ドメインとして使用することが可能となった。
実施例５：二重特異性抗体によるＣＡＲ−Ｔ細胞機能の調節
方法
抗体をＰＢＳで０．４ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで、ＲＰＭＩ−１６４０培地で１２０ｕｇ／ｍｌ及び４０ｕｇ／ｍｌに段階希釈した。ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞（実施例４を参照のこと）を遠心分離し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に２００万細胞／ｍｌで懸濁させた。Ｒａｊｉ、ＲＰＭＩ８２２６及びＳＫＯＶ３標的細胞を遠心分離し、ＲＰＭＩ−１６４０培地中に２０万細胞／ｍｌで懸濁させた。９６ウェルプレート内で５０マイクロリットルの標的細胞を３反復で５０ｕｌのＣＡＲ−Ｔ細胞及び１００ｕｌの抗体と混合した。プレートを６時間または１８時間培養し、遠心分離によって細胞をペレット化した。上清を新しい９６ウェルプレートへ移して冷凍した。上清のＩＦＮ−γレベルをサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。
結果
図４に示すとおり、ＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ Ｒａｊｉ細胞との共培養によって堅牢に活性化されたが、ＣＤ１９陰性ＳＫＯＶ３細胞との共培養では活性化されなかった。他方、ＭＳＬＮ＋ ＳＫＯＶ３細胞の存在下で抗ＦＭＣ６３ｉｄ×ＭＳＬＮ構築物（ｖ１６４４６）はＣＡＲ−Ｔ細胞の指向性を変化させて堅牢な活性化を増強した。同様に、抗ＦＭＣ６３ｉｄ×ＢＣＭＡ構築物（ｖ１６４４５）の存在下で共培養開始から６時間後にＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞応答の指向性はＢＣＭＡ発現ＲＰＭＩ８２２６標的細胞へと向け変えられた。ＲＰＭＩ８２２６細胞のサブセットにおける低レベルのＣＤ１９発現（Ｍａｔｓｕｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３（６）：２３３２−２３３６（２００４）を参照のこと）と一致して、共培養開始から１８時間後にＲＰＭＩ８２２６細胞は単独で中等度のＣＤ１９−ＣＡＲ−Ｔ細胞活性化を誘導し、それは、抗ＦＭＣ６３ｉｄ×ＢＣＭＡ構築物の添加によってさらに強化されたが、対照構築物の添加では強化されなかった。
実施例３〜５に記載されている知見は、標的間及び／または細胞種間で速度論が様々であり得るとはいえ、ＣＡＲに係合する多重特異性抗原結合構築物が、操作されたＴＡＡ特異的な細胞の指向性を代替抗原へと向け変えることができ、かつ低レベルの同族標的発現によって誘導される中等度の細胞活性化を強化することができる、ということを示唆している。ＣＡＲ構築物は、天然のＴＣＲ／ＣＤ３シグナルを模倣するように設計される（但し、共刺激潜在能が追加される）。このように、操作されているかまたは内因性であるＴＣＲによって媒介されるＴ細胞応答の指向性を代替ＴＡＡ標的へと向け変えるために、（抗ＴＣＲイディオタイプ、Ｖ領域またはその他の同様の結合ドメインを使用して）ＴＣＲを指向しかつＴＡＡを指向する多重特異性抗原結合構築物を使用することは、これらの知見によって支持される。
これらの実施例で使用した多重特異性抗原結合構築物は二重特異性抗体型であるが、ＣＤ３×ＴＡＡ結合を介するＴ細胞係合は当該技術分野において多種多様な生物製剤基盤を使用して十分に確立されており、それゆえこれらの知見は、Ｔ細胞の指向性を代替ＴＡＡへと向け変えるために代替足場型の多重特異性抗原結合構築物（本明細書中に記載されているようなＢｉＴＥ、ＤＡＲＴなど）を使用することを支持している。
実施例６：二重特異性抗体変異型の説明
以下の典型的な型の二重特異性抗原結合構築物を作製する：
ａ）実施例１のａ）に記載されているようなハイブリッド抗体型。
ｂ）抗原結合ドメインが両方ともＦａｂである、フルサイズ抗体（ＦＳＡ）型。
これらの二重特異性抗原結合構築物は、実施例１に記載の異種二量体型Ｆｃも含む。フルサイズ抗体型構築物は、４本のポリペプチド鎖：第１ＶＨ−ＣＨ１ドメインに融合させた第１Ｆｃポリペプチドと、第１軽鎖であって、第１ＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び第１軽鎖が、第１標的に結合するＦａｂ領域を形成している、当該第１軽鎖と、第２ＶＨ−ＣＨ１ドメインに融合させた第２Ｆｃポリペプチドと、第２軽鎖であって、第２ＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び軽鎖が、第２標的に結合するＦａｂ領域を形成している、当該第２軽鎖とを含む。
ｃ）ある標的に結合するあるＶＬ−ＶＨ配列が（ＧＧＧＧＳ）５スペーサーによって、第２の標的に結合する第２のＶＬ−ＶＨ配列に連結されている、タンデムｓｃＦｖ型。
上記のハイブリッド型及びＦＳＡ型で作製される二重特異性抗原結合構築物の説明を表２に示す。作製されるタンデムｓｃＦｖ構築物の説明を表３に示す。「ＦＭＣ６３」は抗ＣＤ１９ｓｃＦｖである（実施例１の「ＦＭＣ６３ｉｄ」を参照のこと）。
（表２）ハイブリッド型及びＦＳＡ型の二重特異性抗体
Figure 2019513777
（表３）二重特異性タンデムｓｃＦｖ構築物
Figure 2019513777
実施例７：二重特異性抗体の産生
実施例６に記載の二重特異性抗原結合構築物は以下のとおりに作製される。
抗体重軽鎖をコードする遺伝子は、ヒト／哺乳動物における発現のために最適化されたコドンを使用して遺伝子合成によって構築される。ｓｃＦｖ及びＦａｂ配列は、表４において識別される既知の抗体の配列から生じさせる。配列を表５に示す。
（表４）抗体配列の基準
Figure 2019513777
ｓｃＦｖを含んでいる構築物の場合、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合は、Ｋａｂａｔ付番方式による位置ＶＨ４４及びＶＬ１００に導入する（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１４：１２３９−１２４５（１９９６）を参照のこと）。
最終遺伝子産物を哺乳動物発現ベクターの中へサブクローニングし、ＣＨＯ細胞（または機能的等価体）において発現させる（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，３０：Ｅ９（２００２））。
ＣＨＯ細胞は指数増殖期にトランスフェクトされる。異種二量体を形成するのに最適な濃度範囲を決定するためにＤＮＡは、異種二量体形成を可能にするＦｃＡ、軽鎖（ＬＣ）及びＦｃＢの様々なＤＮＡ比でトランスフェクトされ得る。トランスフェクトされた細胞培地を数日後に採集し、４０００ｒｐｍで遠心分離し、０．４５ミクロンのフィルターを使用して清澄化する。
二重特異性抗原結合構築物は、確立された方法によって培地から精製する。例えば、清澄化した培地をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムに装填してｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、ｐＨ３．６のクエン酸塩緩衝液で溶離し、画分をまとめ合わせ、ｐＨ１１のＴＲＩＳで中和する。最後に、Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ １０ＤＧカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質を脱塩する。ある場合には、タンパク質をプロテインＬクロマトグラフィーまたはゲル濾過によってさらに精製する。
実施例８：試験管内でのＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞による標的細胞の選択的溶解を媒介する二重特異性抗原結合構築物の能力
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞による標的細胞の溶解を媒介する実施例６に記載の二重特異性抗原結合構築物の能力を、以下に概説するとおりに評価する。様々なＣＡＲを発現する遺伝子操作されたヒトＴ細胞を商業的に入手することができる。例えば、ｓｃＦｖ ＦＭＣ６３を含むＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＰｒｏＭａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡから入手することができる。
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞及び標的細胞を、様々な濃度の実施例６に記載の二重特異性抗体の存在下または非存在下、多様な比（およそ２０：１が最適）で、３反復でインキュベートする。標的細胞としては、例えば、親すなわち対照ＨｅＬａ細胞及び、ＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＢＣＭＡまたはメソテリンを安定的に発現させる周知の方法によって操作されたＨｅＬａ細胞が挙げられる。標的細胞には、内因性のＣＤ１９、ＣＤ７９ｂ、ＢＣＭＡ及び／またはメソテリンの発現を有する細胞株（例えば、Ｒａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ＲＰＭＩ８２２６及びＡ１８４７）または初代腫瘍試料も含まれ得る。インキュベーション後、標的細胞の溶解をフローサイトメトリー、５１Ｃｒ放出、蛍光測定、または速度論的生存能プラットフォーム（例えばＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ（Ａｃｅａ））によってモニタリングする。
種々のアッセイプラットフォームからの標的細胞溶解値（実験溶解値）は、イベント／期間（フローサイトメトリー）、５１Ｃｒ放出数、相対発光単位または相対蛍光単位である。自然溶解を測定するには標的細胞をエフェクター細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）なしでインキュベートし、最大溶解は、標的細胞と細胞傷害性洗浄剤とのインキュベーションの後に決定される。
特異的溶解パーセントは、
［（実験溶解値−自然溶解値）／（最大溶解値−自然溶解値）］×１００
として算出される。
結果
ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＤ１９発現標的細胞（ＨｅＬａ−ＣＤ１９またはＲａｊｉ）を効率的に溶解させることができるがＣＤ１９陰性標的細胞種（ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−ＣＤ７９ｂ、ＨｅＬａ−ＢＣＭＡ、ＲＰＭＩ８２２６（ＣＤ１９−ｌｏｗ／陰性）、ＨｅＬａ−メソテリン、またはＡ１８４７）を効率的に溶解させることはできない、と予想される。同様に、メソテリン特異的ＣＡＲは、メソテリン発現標的細胞（ＨｅＬａ−メソテリンまたはＡ１８４７）を溶解させることができるが、メソテリン陰性標的細胞種（ＨｅＬａまたはＨｅＬａ−ＣＤ１９）を溶解させない。これらの結果からは、同族ＣＡＲ主導の選択性プロファイルが明らかである。
同族ＣＡＲ主導の選択性プロファイルは、ＣＡＲエピトープと代替ＴＡＡとに相互作用する多重特異性結合分子をＣＡＲ−Ｔ細胞と共にインキュベートすることによって変更される。ＣＡＲ ｓｃＦｖイディオタイプとＴＡＡとを標的とする二重特異性抗体を、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞と共にインキュベートすることで、細胞傷害性応答の指向性を代替ＴＡＡへと向け変えることができる。例えば、
ａ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型３、６または９（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／メソテリン）の存在下でＨｅＬａ−メソテリンまたはＡ１８４７標的細胞を溶解させ；
ｂ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型１、４または７（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／ＣＤ７９ｂ）の存在下でＨｅＬａ−ＣＤ７９ｂ標的細胞を溶解させ；
ｃ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型２、５または８（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／ＢＣＭＡ）の存在下でＨｅＬａ−ＢＣＭＡまたはＲＰＭＩ８２２６標的細胞を、向上した有効性で溶解させる。
実施例９：試験管内での標的細胞とＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞との共培養においてサイトカイン産生を刺激する二重特異性抗原結合構築物の能力
ＣＡＲ発現細胞と抗原発現標的細胞または対照標的細胞とを二重特異性抗原結合分子の存在下または非存在下でインキュベートした後でのサイトカイン放出を評価した。標的細胞は、実施例７に記載のそれと同じである。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的細胞とを最適なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（およそ２：１）で共培養する。共培養された細胞を約２４時間インキュベートし、多重サイトカイン免疫アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標））またはＥＬＩＳＡを用いるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−２の測定のために上清を採取する。
結果
ＣＡＲ ｓｃＦｖイディオタイプとＴＡＡとを標的とする二重特異性抗体を、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞と共にインキュベートすることで、サイトカイン産生応答の指向性が代替ＴＡＡへと向け変えられると予想される。例えば、
ａ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型３、６または９（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／メソテリン）の存在下でＨｅＬａ−メソテリンまたはＡ１８４７標的細胞に応答してＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２を産生し；
ｂ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型１、４または７（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／ＣＤ７９ｂ）の存在下でＨｅＬａ−ＣＤ７９ｂ標的細胞に応答してＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２を産生し；
ｃ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型２、５または８（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／ＢＣＭＡ）の存在下でＨｅＬａ−ＢＣＭＡまたはＲＰＭＩ８２２６標的細胞に応答してＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２をより効率的に産生する。
実施例１０：標的細胞の存在下でＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を刺激する二重特異性抗原結合構築物の能力
ＣＤ１９発現標的細胞とのインキュベーション後でのＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによって評価する。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、洗浄し、外因性サイトカインを含んでいない血清含有培地中で標的細胞と共に７２時間インキュベートする。標的細胞は、実施例７に記載のそれと同じである。生Ｔ細胞の分裂は、フローサイトメトリーで評価されるＣＦＳＥの薄弱によって指し示される。
結果
ＣＡＲ ｓｃＦｖイディオタイプとＴＡＡとを標的とする二重特異性抗体を、ＣＤ１９特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞と共にインキュベートすることで、増殖応答の指向性が代替ＴＡＡへと向け変えられると予想される。例えば、
ａ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型３、６または９（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／メソテリン）の存在下でＨｅＬａ−メソテリンまたはＡ１８４７標的細胞に応答して増殖し；
ｂ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型１、４または７（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／ＣＤ７９ｂ）の存在下でＨｅＬａ−ＣＤ７９ｂ標的細胞に応答して増殖し；
ｃ）ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団は、変異型２、５または８（抗ＣＤ１９ｓｃＦｖイディオタイプ／ＢＣＭＡ）の存在下でＨｅＬａ−ＢＣＭＡまたはＲＰＭＩ８２２６標的細胞に応答して効率的に増殖する。
実施例１１：生体内でＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の指向性を代替ＴＡＡへと向け変える二重特異性抗原結合構築物の能力
生体内でＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の指向性を代替ＴＡＡへと向け変える二重特異性抗原結合構築物の能力を、以下に記載するとおり患者由来異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍モデルにおいてＣＡＲ−Ｔ細胞の養子移入及び二重特異性抗原結合構築物の投与の後での腫瘍成長をモニタリングすることによって評価する。これらの試験を容易にするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介される遺伝子編集によって（例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪからの利用可能なサービスを用いて）、またはフローサイトメトリーでのＣＤ１９−ｌｏｗ集団選別のサイクルの繰り返し、限界希釈及び娘細胞株増殖によって、ＣＤ１９陰性Ｒａｊｉ変異型（１９ｎｅｇＲａｊｉ）を生じさせる。
６〜８週齢の雌のＮＯＤ．Ｃｇ．ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ／Ｗｉ／／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの群に、以下：
ａ）ホタルルシフェラーゼでトランスフェクトされたＲａｊｉリンパ腫腫瘍細胞；
ｂ）ホタルルシフェラーゼでトランスフェクトされたＣＤ１９陰性Ｒａｊｉ（１９ｎｅｇＲａｊｉ）リンパ腫腫瘍細胞；
ｃ）ホタルルシフェラーゼでトランスフェクトされたＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞（ＣＤ１９陰性／ｌｏｗ、ＢＣＭＡ陽性）腫瘍細胞
のうちの１つを静脈内（ｉ．ｖ．）注射する。
マウスへの投与に適する細胞個数は、例えば、０．５×１０６細胞である。腫瘍の生着は、約６日間かけて起こさせ、生物発光イメージングを用いて確かめる。
７日目にマウスを最適未満用量（典型的な用量は１×１０６個）のＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射に供する。
ＣＡＲ−Ｔ細胞生着後の様々な日（一般的には７日目）に、実施例１に記載の二重特異性抗体をｉ．ｖ．、腹腔内または皮下に投与する。投薬のスケジュール及び量は様々であるが、典型的な試験では１０ｍｇ／ｋｇを週に１回投与する。
マウスにおける腫瘍成長を、腫瘍細胞生着後の様々な時点、一般的には４、７、１４、２１、２７、３４及び４１日目に生物発光イメージングによってモニタリングする。
生物発光イメージングのためには、マウスをＰＢＳ中のルシフェリン物質（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射に供する（典型的な用量は約１５μｇ／ｇ体重）。マウスを麻酔し、イメージングを本質的には国際特許公開第ＷＯ２０１５／０９５８９５号の実施例７に記載されているとおりに行い、平均放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ／ｓｒ）を決定する。
結果
対照マウス腫瘍は、標的細胞指向性でないＣＡＲ−Ｔ細胞の養子移入後に試験の間にわたって成長し続けると予想され、他方、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、形質導入されていないＴ細胞の増殖集団と比較してＣＤ１９＋ 腫瘍の成長を弱めると予想される。具体的には、
− １９ｎｅｇＲａｊｉ及びＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫腫瘍は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与後にマウス内で通常どおり成長すると予想され、
− ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与は、Ｒａｊｉ腫瘍成長を弱めると予想される。
試験管内での結果に類似して、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲエピトープと代替ＴＡＡとに結合する二重特異性抗原結合構築物の投与によってマウスにおけるＣＤ１９陰性腫瘍の成長を弱めると予想される。具体的には、
− 変異型１、４または７（抗ＣＡＲ／ＣＤ７９ｂ）の投与は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が１９ｎｅｇＲａｊｉ及びＲＰＭＩ−８２２６腫瘍を制御するのを可能にすると予想され；
− ＲＰＭＩ−８２２６腫瘍の成長はまた、変異型２、５または８（抗ＣＡＲ／ＢＣＭＡ）の存在下でＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ集団によって弱められると予想される。
本明細書中で言及されるあらゆる特許、特許出願、刊行物及びデータベース登録事項は、そのような個々の特許、特許出願、刊行物及びデータベース登録事項の各々が具体的かつ個別に参照によって援用されると示されるのと同じ程度に、参照によってそれらの全体が本明細書に援用される。
本明細書に記載の具体的な実施形態の、当業者にとって明白であろう改変は、以下の請求項の範囲内に含まれることが意図される。
（表５）配列
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（表６）配列
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本開示のいくつかの態様は、医薬の製造における多重特異性抗原結合構築物の使用であって、多重特異性抗原結合構築物が、免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、免疫治療薬が、ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤であり、第１腫瘍関連抗原エピトープと第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、当該使用に関する。
[本発明1001]
免疫療法薬による腫瘍細胞への結合の指向性を変化させる方法であって、
前記免疫療法薬に結合する第1抗原結合ポリペプチド構築物と、第1腫瘍関連抗原エピトープに結合する第2抗原結合ポリペプチド構築物とを含む多重特異性抗原結合構築物に前記免疫療法薬を接触させること
を含み、前記免疫療法薬が、
ｉ）第2腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
ｉｉ）Ｔ細胞と第2腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
であり、
前記第1腫瘍関連抗原エピトープと前記第2腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記方法。
[本発明1002]
免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者における前記免疫療法薬の治療効果を延長する方法であって、
前記免疫療法薬に結合する第1抗原結合ポリペプチド構築物と、第1腫瘍関連抗原エピトープに結合する第2抗原結合ポリペプチド構築物とを含む有効量の多重特異性抗原結合構築物を前記患者に投与すること
を含み、前記免疫療法薬が、
ｉ）第2腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
ｉｉ）Ｔ細胞と第2腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
であり、
前記第1腫瘍関連抗原エピトープと前記第2腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記方法。
[本発明1003]
免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者のがんを処置する方法であって、
有効量の多重特異性抗原結合構築物を前記患者に投与すること
を含み、前記多重特異性抗原結合構築物が、前記免疫療法薬に結合する第1抗原結合ポリペプチド構築物と、第1腫瘍関連抗原エピトープに結合する第2抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、前記免疫療法薬が、
ｉ）第2腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
ｉｉ）Ｔ細胞と第2腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
であり、
前記第1腫瘍関連抗原エピトープと前記第2腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記方法。
[本発明1004]
前記患者が、前記免疫療法薬による前処置を受けたことがある、本発明1002または本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記患者が、前記前処置後に再発したかまたは前記前処置に応答しなかった、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記患者が、前記第2腫瘍関連抗原エピトープの減少または発現喪失が原因で前記前処置後に再発したかまたは前記前処置に応答しなかった、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記患者が、前記第2腫瘍関連抗原エピトープの発現の不均一性が原因で前記前処置後に再発したかまたは前記前処置に応答しなかった、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記患者が前記免疫療法薬による処置を受けており、前記多重特異性抗原結合構築物が前記免疫療法薬に対する補助的処置として投与される、本発明1002または本発明1003の方法。
[本発明1009]
前記免疫療法薬が、操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞であり、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞が前記多重特異性抗原結合構築物を共発現するようにさらに操作されている、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記免疫療法薬が、操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞が、前記抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されている、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記免疫療法薬が、Ｔ細胞と第2腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記治療剤が二重特異性抗体である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記治療剤が二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）である、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記第1抗原結合ポリペプチド構築物が前記免疫療法薬の前記抗原結合ドメインに結合する、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記第1抗原結合ポリペプチド構築物が、前記免疫療法薬の抗原結合に関与しない領域に結合する、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を、前記ＣＡＲまたはＴＣＲに結合する第1抗原結合ポリペプチド構築物と、第1腫瘍関連抗原エピトープに結合する第2抗原結合ポリペプチド構築物とを含む多重特異性抗原結合構築物に接触させること
を含む、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化させる方法であって、
前記ＣＡＲまたはＴＣＲが、第2腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを含む、前記方法。
[本発明1018]
前記細胞がＴ細胞である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記Ｔ細胞が、ＣＡＲを発現するように操作されている、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記第1及び第2腫瘍関連抗原エピトープが、同一抗原のエピトープである、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記第1腫瘍関連抗原エピトープと前記第2腫瘍関連抗原エピトープとが、異なる抗原のエピトープである、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記第1腫瘍関連抗原エピトープが血液がんに関連している、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記第2腫瘍関連抗原エピトープが血液がんに関連している、本発明1001〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記第1腫瘍関連抗原エピトープが悪性Ｂ細胞によって発現される、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記第2腫瘍関連抗原エピトープが悪性Ｂ細胞によって発現される、本発明1001〜1021及び本発明1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記第1腫瘍関連抗原エピトープが固形腫瘍に関連している、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記第2腫瘍関連抗原エピトープが固形腫瘍に関連している、本発明1001〜1021及び本発明1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記多重特異性抗原結合構築物が足場をさらに含み、前記第1及び第2抗原結合ポリペプチド構築物が前記足場に繋げられている、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記足場がＦｃを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記Ｆｃが、ＣＨ3配列を各々含む第1Ｆｃポリペプチドと第2Ｆｃポリペプチドとを含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記第1抗原結合ポリペプチド構築物が前記第1Ｆｃポリペプチドに繋げられており、前記第2抗原結合ポリペプチド構築物が前記第2Ｆｃポリペプチドに繋げられている、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記Ｆｃが、少なくとも1つのＣＨ3配列にアミノ酸修飾を含む異種二量体型Ｆｃである、本発明1030または本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記第1及び第2抗原結合ポリペプチド構築物がリンカーによって繋ぎ合わされている、本発明1001〜1027のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記第1及び第2抗原結合ポリペプチド構築物が、各々独立して、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、本発明1001〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記多重特異性抗原結合構築物が、1つ以上の追加の抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む、本発明1001〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
免疫療法薬に結合する第1抗原結合ポリペプチド構築物と、
第1腫瘍関連抗原エピトープに結合する第2抗原結合ポリペプチド構築物と
を含む、多重特異性抗原結合構築物であって、
前記免疫療法薬が、
ｉ）第2腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
ｉｉ）Ｔ細胞と第2腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
であり、前記第1腫瘍関連抗原エピトープと前記第2腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1037]
前記第1及び第2腫瘍関連抗原エピトープが、同一抗原のエピトープである、本発明1036の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1038]
前記第1腫瘍関連抗原エピトープと前記第2腫瘍関連抗原エピトープとが、異なる抗原のエピトープである、本発明1036の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1039]
前記免疫療法薬と前記第1腫瘍関連抗原エピトープとに対する前記多重特異性抗原結合構築物の結合が、前記操作されたＴ細胞もしくは操作されたＮＫ細胞、または前記治療剤に結合したＴ細胞を活性化させる、本発明1036〜1038のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1040]
前記免疫療法薬が、操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞である、本発明1036〜1039のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1041]
前記操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞が、前記抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されている、本発明1040の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1042]
前記免疫療法薬が、Ｔ細胞と第2腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤である、本発明1036〜1039のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1043]
前記治療剤が二重特異性抗体である、本発明1042の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1044]
前記治療剤が二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）である、本発明1042の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1045]
前記第1抗原結合ポリペプチド構築物が前記免疫療法薬の前記抗原結合ドメインに結合する、本発明1036〜1044のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1046]
前記第1抗原結合ポリペプチド構築物が、前記免疫療法薬の抗原結合に関与しない領域に結合する、本発明1036〜1044のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1047]
前記多重特異性抗原結合構築物が足場をさらに含み、前記第1及び第2抗原結合ポリペプチド構築物が前記足場に繋げられている、本発明1036〜1046のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1048]
前記足場がＦｃである、本発明1047の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1049]
前記Ｆｃが、ＣＨ3配列を各々含む第1Ｆｃポリペプチドと第2Ｆｃポリペプチドとを含む、本発明1048の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1050]
前記第1抗原結合ポリペプチド構築物が前記第1Ｆｃポリペプチドに繋げられており、前記第2抗原結合ポリペプチド構築物が前記第2Ｆｃポリペプチドに繋げられている、本発明1049の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1051]
前記Ｆｃが、少なくとも1つのＣＨ3配列にアミノ酸修飾を含む異種二量体型Ｆｃである、本発明1049または本発明1050の多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1052]
前記第1及び第2抗原結合ポリペプチド構築物がリンカーによって繋ぎ合わされている、本発明1036〜1046のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1053]
前記第1及び第2抗原結合ポリペプチド構築物が、各々独立して、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、本発明1036〜1052のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1054]
1つ以上の追加の抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む、本発明1036〜1053のいずれかの多重特異性抗原結合構築物。
[本発明1055]
本発明1036〜1053のいずれかの多重特異性抗原結合構築物と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
[本発明1056]
本発明1036〜1053のいずれかの多重特異性抗原結合構築物をコードする、核酸。
[本発明1057]
本発明1036〜1053のいずれかの多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸を含む、宿主細胞。
[本発明1058]
医薬の製造における本発明1036〜1053のいずれかの多重特異性抗原結合構築物の、使用。
[本発明1059]
前記医薬が、免疫療法薬による腫瘍細胞への結合の指向性を変化させるためのものである、本発明1058の使用。
[本発明1060]
前記医薬が、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者における前記免疫療法薬の治療効果を延長するためのものである、本発明1058の使用。
[本発明1061]
前記医薬が、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者においてがんを処置するためのものである、本発明1058の使用。
[本発明1062]
前記医薬が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化させるためのものである、本発明1058の使用。

Claims (62)

  1. 免疫療法薬による腫瘍細胞への結合の指向性を変化させる方法であって、
    前記免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む多重特異性抗原結合構築物に前記免疫療法薬を接触させること
    を含み、前記免疫療法薬が、
    ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
    ｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
    であり、
    前記第１腫瘍関連抗原エピトープと前記第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記方法。
  2. 免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者における前記免疫療法薬の治療効果を延長する方法であって、
    前記免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む有効量の多重特異性抗原結合構築物を前記患者に投与すること
    を含み、前記免疫療法薬が、
    ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
    ｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
    であり、
    前記第１腫瘍関連抗原エピトープと前記第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記方法。
  3. 免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者のがんを処置する方法であって、
    有効量の多重特異性抗原結合構築物を前記患者に投与すること
    を含み、前記多重特異性抗原結合構築物が、前記免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含み、前記免疫療法薬が、
    ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
    ｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
    であり、
    前記第１腫瘍関連抗原エピトープと前記第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記方法。
  4. 前記患者が、前記免疫療法薬による前処置を受けたことがある、請求項２または請求項３に記載の方法。
  5. 前記患者が、前記前処置後に再発したかまたは前記前処置に応答しなかった、請求項４に記載の方法。
  6. 前記患者が、前記第２腫瘍関連抗原エピトープの減少または発現喪失が原因で前記前処置後に再発したかまたは前記前処置に応答しなかった、請求項５に記載の方法。
  7. 前記患者が、前記第２腫瘍関連抗原エピトープの発現の不均一性が原因で前記前処置後に再発したかまたは前記前処置に応答しなかった、請求項５に記載の方法。
  8. 前記患者が前記免疫療法薬による処置を受けており、前記多重特異性抗原結合構築物が前記免疫療法薬に対する補助的処置として投与される、請求項２または請求項３に記載の方法。
  9. 前記免疫療法薬が、操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞であり、前記Ｔ細胞またはＮＫ細胞が前記多重特異性抗原結合構築物を共発現するようにさらに操作されている、請求項８に記載の方法。
  10. 前記免疫療法薬が、操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞が、前記抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されている、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記免疫療法薬が、Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記治療剤が二重特異性抗体である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記治療剤が二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）である、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記第１抗原結合ポリペプチド構築物が前記免疫療法薬の前記抗原結合ドメインに結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記第１抗原結合ポリペプチド構築物が、前記免疫療法薬の抗原結合に関与しない領域に結合する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
  17. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を、前記ＣＡＲまたはＴＣＲに結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物とを含む多重特異性抗原結合構築物に接触させること
    を含む、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化させる方法であって、
    前記ＣＡＲまたはＴＣＲが、第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを含む、前記方法。
  18. 前記細胞がＴ細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記Ｔ細胞が、ＣＡＲを発現するように操作されている、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第１及び第２腫瘍関連抗原エピトープが、同一抗原のエピトープである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記第１腫瘍関連抗原エピトープと前記第２腫瘍関連抗原エピトープとが、異なる抗原のエピトープである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記第１腫瘍関連抗原エピトープが血液がんに関連している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記第２腫瘍関連抗原エピトープが血液がんに関連している、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記第１腫瘍関連抗原エピトープが悪性Ｂ細胞によって発現される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記第２腫瘍関連抗原エピトープが悪性Ｂ細胞によって発現される、請求項１〜２１及び請求項２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記第１腫瘍関連抗原エピトープが固形腫瘍に関連している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記第２腫瘍関連抗原エピトープが固形腫瘍に関連している、請求項１〜２１及び請求項２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記多重特異性抗原結合構築物が足場をさらに含み、前記第１及び第２抗原結合ポリペプチド構築物が前記足場に繋げられている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記足場がＦｃを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記Ｆｃが、ＣＨ３配列を各々含む第１Ｆｃポリペプチドと第２Ｆｃポリペプチドとを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記第１抗原結合ポリペプチド構築物が前記第１Ｆｃポリペプチドに繋げられており、前記第２抗原結合ポリペプチド構築物が前記第２Ｆｃポリペプチドに繋げられている、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記Ｆｃが、少なくとも１つのＣＨ３配列にアミノ酸修飾を含む異種二量体型Ｆｃである、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
  33. 前記第１及び第２抗原結合ポリペプチド構築物がリンカーによって繋ぎ合わされている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記第１及び第２抗原結合ポリペプチド構築物が、各々独立して、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記多重特異性抗原結合構築物が、１つ以上の追加の抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 免疫療法薬に結合する第１抗原結合ポリペプチド構築物と、
    第１腫瘍関連抗原エピトープに結合する第２抗原結合ポリペプチド構築物と
    を含む、多重特異性抗原結合構築物であって、
    前記免疫療法薬が、
    ｉ）第２腫瘍関連抗原エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するように操作されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、または
    ｉｉ）Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤
    であり、前記第１腫瘍関連抗原エピトープと前記第２腫瘍関連抗原エピトープとが異なる、前記多重特異性抗原結合構築物。
  37. 前記第１及び第２腫瘍関連抗原エピトープが、同一抗原のエピトープである、請求項３６に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  38. 前記第１腫瘍関連抗原エピトープと前記第２腫瘍関連抗原エピトープとが、異なる抗原のエピトープである、請求項３６に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  39. 前記免疫療法薬と前記第１腫瘍関連抗原エピトープとに対する前記多重特異性抗原結合構築物の結合が、前記操作されたＴ細胞もしくは操作されたＮＫ細胞、または前記治療剤に結合したＴ細胞を活性化させる、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  40. 前記免疫療法薬が、操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  41. 前記操作されたＴ細胞または操作されたＮＫ細胞が、前記抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されている、請求項４０に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  42. 前記免疫療法薬が、Ｔ細胞と第２腫瘍関連抗原エピトープとに結合することができる治療剤である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  43. 前記治療剤が二重特異性抗体である、請求項４２に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  44. 前記治療剤が二重特異性Ｔ細胞係合子（ＢｉＴＥ）である、請求項４２に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  45. 前記第１抗原結合ポリペプチド構築物が前記免疫療法薬の前記抗原結合ドメインに結合する、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  46. 前記第１抗原結合ポリペプチド構築物が、前記免疫療法薬の抗原結合に関与しない領域に結合する、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  47. 前記多重特異性抗原結合構築物が足場をさらに含み、前記第１及び第２抗原結合ポリペプチド構築物が前記足場に繋げられている、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  48. 前記足場がＦｃである、請求項４７に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  49. 前記Ｆｃが、ＣＨ３配列を各々含む第１Ｆｃポリペプチドと第２Ｆｃポリペプチドとを含む、請求項４８に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  50. 前記第１抗原結合ポリペプチド構築物が前記第１Ｆｃポリペプチドに繋げられており、前記第２抗原結合ポリペプチド構築物が前記第２Ｆｃポリペプチドに繋げられている、請求項４９に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  51. 前記Ｆｃが、少なくとも１つのＣＨ３配列にアミノ酸修飾を含む異種二量体型Ｆｃである、請求項４９または請求項５０に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  52. 前記第１及び第２抗原結合ポリペプチド構築物がリンカーによって繋ぎ合わされている、請求項３６〜４６のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  53. 前記第１及び第２抗原結合ポリペプチド構築物が、各々独立して、Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）である、請求項３６〜５２のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  54. １つ以上の追加の抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む、請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物。
  55. 請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物と、薬学的に許容できる担体とを含む、医薬組成物。
  56. 請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物をコードする、核酸。
  57. 請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物をコードする核酸を含む、宿主細胞。
  58. 医薬の製造における請求項３６〜５３のいずれか１項に記載の多重特異性抗原結合構築物の、使用。
  59. 前記医薬が、免疫療法薬による腫瘍細胞への結合の指向性を変化させるためのものである、請求項５８に記載の使用。
  60. 前記医薬が、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者における前記免疫療法薬の治療効果を延長するためのものである、請求項５８に記載の使用。
  61. 前記医薬が、免疫療法薬による処置を受けているかまたは受けたことがある患者においてがんを処置するためのものである、請求項５８に記載の使用。
  62. 前記医薬が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作されたＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化させるためのものである、請求項５８に記載の使用。
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