KR20180135460A - 면역치료제를 표적으로 하는 다중-특이적 항원-결합 작제물 - Google Patents

면역치료제를 표적으로 하는 다중-특이적 항원-결합 작제물 Download PDF

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KR20180135460A
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Abstract

면역치료제를 표적하는 다중-특이적 항원-결합 작제물이 기재된다. 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제 (예컨대 CAR-T 세포 또는 이중특이적 T-세포 관여체)에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 종양-관련 항원에 결합하는 제2 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 종양 세포에 면역치료제의 결합을 재유도 또는 향상시키기 위한 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물의 이용 방법, 그리고 면역치료제로부터 재발하거나 상기로 치료에 실패한 환자의 치료 방법이 또한 기재된다.

Description

면역치료제를 표적으로 하는 다중-특이적 항원-결합 작제물
종래의 항-암 화학치료제에 비교하여, 면역치료제는 종양 유전적 저항 기전 및 감소된 건강한 조직 독성 프로파일을 극복하기 위해 향상된 능력을 발휘한다. 특히, 종양-관련 항원 (TAAs)에 대한 면역-매개된 종양 세포용해 유도는, 많은 환자에서 오래 지속되는 차도를 제공하는, 조혈 및 고형 조직 신생물 치료 프로토콜을 혁신시켰다. 그러나, 항원-유도된 면역요법 저항 기전은, 정제된 치료 선택의 개발을 필요로 하는, TAA 하향조절을 포함하여, 부각되었다.
조작된, TAA-특이적, 키메라 항원 수용체 (CARs)를 발현시키는 T 림프구로 자가조직 입양 세포 요법은 재발성/난치성 B 세포 급성 림프아구성 백혈병 (B-ALL) 환자에서 특히 효과적인 치료 양식이고, 수많은 종양학 징후를 현재 추적하고 있다. 유사하게, 이중특이적 T-세포 관여체 (BiTE) 생물학은 TAAs로 TCR CD3 신호전달 서브유닛의 공-관여에 의해 표적된 세포독성 반응을 촉진시키고, B-ALL 치료에 대하여 승인된다. 이들 접근법이 항원-특이적 세포독성 및 장수하는 면역적 메모리에 대하여 적응성 면역 잠재력을 이용할 수 있어도, BiTE 및 CAR-T 요법 환자의 상당한 백분율은 TAA-음성 종양 변이체 결과물로 인해 재발한다.
요약
면역치료제를 표적하는 다중-특이적 항원-결합 작제물 그리고 동일한 것의 사용 방법이 본 명세서에서 기재된다. 본 개시내용의 특정 측면은 면역치료제에 의한 종양 세포 결합의 재유도 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물과 면역치료제의 접촉을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 면역치료제의 치료 효과의 연장 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 암의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 환자에 다중-특이적 항원-결합 작제물의 유효량의 투여를 포함하고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 CAR 또는 TCR에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물과 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR)을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포의 접촉을 포함하는 T-세포 또는 NK 세포의 활성화 방법에 관한 것이고, 상기 CAR 또는 TCR은 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 하기: 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원 결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물에 관한 것이고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일부 측면은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 측면은 면역치료제에 의한 종양 세포 결합을 재유도하기 위한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 용도에 관한 것이고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 면역치료제의 치료 효과를 연장시키기 위한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 용도에 관한 것이고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 암을 치료하기 위한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 용도에 관한 것이고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR)을 발현시키도록 조작되는 T-세포 또는 NK 세포를 활성화시키기 위한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 용도에 관한 것이고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 CAR 또는 TCR에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 CAR 또는 TCR은 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 일부 측면은 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
본 개시내용의 일부 측면은 약제의 제조에서 다중-특이적 항원-결합 작제물의 용도에 관한 것이고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 면역치료제는 하기: i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는 ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프는 상이하다.
도 1은 (A) 종양-관련 항원으로서 항-CD 19 CAR-T 및 CD79b를 표적하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 하나의 구현예의 개략도, 및 (B) 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물용 일부 예시적인 포멧을 도시한다.
도 2는, 대조군 RPMI8226 세포 (A)가 아닌, MSLN+ A1847 세포에 항-FLAG x 항-메소텔린 (MSLN) 이중특이적 항체 및 항-FMC63id x 항-MSLN 이중특이적 항체의 결합, 그리고 대조군 A1847 세포 (B)가 아닌, BCMA+ RPMI8226 세포에 항-FLAG x 항-BCMA 이중특이적 항체 및 항-FMC63id x 항-BCMA 이중특이적 항체의 결합을 도시한다.
도 3은 어느 한쪽 HEK293 (A) 또는 일차 CAR-T 세포 (B)에서 안정적으로 발현되는 FMC63을 함유하는 항-CD 19 CAR 작제물에 항-FMC63id x 항-메소텔린 및 항-FMC63id x 항-BCMA 이중특이적 항체의 선택적 결합을 도시한다.
도 4는 CD19-CAR-T 세포가 (A) CD 19-음성 SKOV3 세포가 아닌, CD 19+ Raji 세포로 공-배양시 확고하게 활성화되고, (B) 항-FMC63id x 항-메소텔린 이중특이적 항체가 CAR-T 세포를 재유도하였고 MSLN+ SKOV3 세포의 존재 하에서 활성화를 강력하게 하였고, 항-FMC63id x 항-BCMA 이중특이적 항체가 CAR-T 세포를 재유도하였고 BCMA+ RPMI8226 세포의 존재 하에서 활성화를 강력하게 하였다는 것을 보여준다.
상세한 설명
면역치료제를 표적하는 다중-특이적 항원-결합 작제물이 본 명세서에서 기재된다. 특이적으로, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 그리고 적어도 하나의 종양-관련 항원에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 종양-관련 항원에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역치료제는, 종양-관련 항원에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작되는 효과기 세포, 예컨대 T-세포 또는 NK 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역치료제는 T-세포에 그리고 종양-관련 항원에 결합할 수 있는 치료제일 수 있다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 표적되는 종양-관련 항원은 면역치료제에 의해 표적되는 종양-관련 항원과 상이하다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 표적되는 종양-관련 항원은 면역치료제에 의해 표적된 종양-관련 항원과 동일하지만, 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 면역치료제는 종양-관련 항원에서 상이한 에피토프에 결합한다.
종양 세포에 면역치료제의 결합을 재유도 또는 향상시키기 위한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 사용 방법이 본 명세서에서 또한 기재된다. 이들 방법에 따르면, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 통해 면역치료제에 결합하고, 제2 항원-결합 폴리펩타이드를 통해 종양 세포에서 종양-관련 항원에 결합한다. 제2 항원-결합 폴리펩타이드는 어느 한쪽 면역치료제에 의해 표적된 상이한 종양-관련 항원에 결합하거나, 면역치료제에 의해 표적된 종양-관련 항원에서 상이한 에피토프에 결합한다. 따라서, 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 그것의 동족 종양-관련 항원 또는 에피토프부터 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 의해 표적된 종양-관련 항원 또는 에피토프까지 면역치료제의 결합을 재유도시킨다. 일부 구현예에서, 면역치료제는 종양 세포에서 그것의 동족 종양-관련 항원 또는 에피토프에 결합을 보유하고, 또한 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 그것의 동족 종양-관련 항원 또는 에피토프를 통해 종양 세포를 결합시킨다. 이러한 구현예에서, 면역치료제에 의한 종양 세포의 결합은 따라서 향상될 수 있다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 후속 또는 부속 요법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역치료제로 치료를 경함하고 있거나, 이전에 경험하였던 그리고 면역치료제 표적 종양-관련 항원의, 발현에서 감소 또는, 손실의 위험에 처한 환자에 대하여, 면역치료제-유도된 세포용해에 대체 기전을 통해 미반응성일 수 있는 환자에 대하여, 또는 면역치료제 표적 종양-관련 항원의 발현에서 상당한 불균질성을 발휘하는 환자에 대하여.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 주어진 값으로부터 대략 +/-10% 변화를 지칭한다. 구체적으로 지칭되든 아니든, 그와 같은 변화가 본 명세서에서 제공된 임의의 주어진 값에서 항상 포함되는 것이 이해되어야 한다.
일정 범위의 값이 제공되는 경우, 문맥이 다르게 명확히 지시하지 않는 한 하한의 단위의 10분의 1까지, 그 범위의 상한과 하한 사이 각각의 개입 값이 그 범위 내에 포괄되는 것 그리고 각각의 이들 개입 값이 본 개시내용의 구현예를 형성한다는 것이 이해되어야 한다. 이들 개입 값은 또한 상기 언급된 범위 내에 포함된 더 작은 범위의 상한 및 하한을 나타낼 수 있고 각각의 그와 같은 더 작은 범위는 또한 본 개시내용의 구현예를 형성하여, 상기 언급된 범위에서 한계를 임의의 특이적으로 배제시키도록 한다.
용어 "포함하는"과 함께 본 명세서에서 사용된 단어 "한" 또는 "그"의 용도는 "하나"를 의미하지만, "하나 이상의", "적어도 하나의" 및 "하나 또는 하나 초과"와 또한 일치한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는", "갖는", "포괄하는" 및 "함유하는", 그리고 이의 문법적 변화는 포괄적이거나 개방형이고 추가의, 미인용된 요소 및/또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 조성물, 용도 또는 방법과 함께 본 명세서에서 사용된 경우 용어 "으로 본질적으로 구성되는"은 추가의 요소 및/또는 방법 단계가 존재할 수 있다는 것, 그러나 인용된 조성물, 방법 또는 용도가 기능하는 방식에 이들 첨가가 물질적으로 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 조성물, 용도 또는 방법과 함께 본 명세서에서 사용된 용어 "으로 구성되는"은 추가의 요소 및/또는 방법 단계의 존재를 배제시킨다. 특정 요소 및/또는 단계를 포함하는 경우 본 명세서에서 기재된 조성물, 용도 또는 방법은 또한, 이들 구현예가 특이적으로 지칭되든 아니든, 특정 구현예에서 본질적으로 그들 요소 및/또는 단계로, 그리고, 다른 구현예에서 그들 요소 및/또는 단계로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 논의된 임의의 구현예가 본 명세서에서 개시된 임의의 방법, 용도 또는 조성물에 관하여 시행될 수 있다는 것이 고려되고, 반대도 마찬가지이다.
다중-특이적 항원-결합 작제물
면역치료제 및 적어도 하나의 종양-관련 항원에 결합할 수 있는 다중-특이적 항원-결합 작제물이 본 명세서에서 기재된다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 종양-관련 항원에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 종양-관련 항원에 결합하는 각각의 하나 이상의 추가의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 각각의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 그것의 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
용어 "항원-결합 작제물"은, 항원에 결합할 수 있는, 제제, 예를 들면 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 지칭한다. 일부 측면에서, 항원-결합 작제물은 관심의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드일 수 있다. 항원-결합 작제물은 단량체, 이량체, 다량체, 단백질, 펩타이드, 단백질 또는 펩타이드 복합체, 항체, 항체 단편, Fab, scFv, 단일 도메인 항체 (sdAb), VHH, 또는 기타 동종일 수 있다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 스캐폴드에 연결된 하나 이상의 항원-결합 모이어티 (예를 들면 Fabs, scFvs, VHHs 또는 sdAbs)를 포함할 수 있다. 다중-특이적 항원-결합 작제물의 예는 아래 기재되고 실시예 섹션에서 제공된다. 다중-특이적 항원-결합 작제물의 일부 예시적인, 비-제한, 포멧은 도 1B에서 보여진다.
본 문맥에서, 항원-결합 작제물은 다중-특이적 항원-결합 작제물이다. 용어 "다중-특이적 항원-결합 작제물"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특유의 결합 특이성을 각각 가진, 둘 이상의 항원-결합 모이어티를 갖는 항원-결합 작제물 (예를 들면 항원-결합 폴리펩타이드 작제물)이다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 2 항원-결합 모이어티를 포함한다 (즉 이중특이적이다). 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 3 항원-결합 모이어티를 포함한다 (즉 삼중특이적이다). 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 3 초과 항원-결합 모이어티, 예를 들어, 4 항원-결합 모이어티를 포함한다.
본 개시내용의 특정 구현예는 이중특이적 항원-결합 작제물에 관한 것이다. 용어 "이중특이적 항원-결합 작제물"은, 특유의 결합 특이성을 각각 가진, 2 항원-결합 모이어티를 갖는 항원-결합 작제물 (예를 들면 항원-결합 폴리펩타이드 작제물)을 지칭한다. 예를 들어, 이중특이적 항원-결합 작제물은 제1 항원에서 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티 그리고 제2 항원에서 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 포함할 수 있거나, 이중특이적 항원-결합 작제물은 제1 항원에서 에피토프에 결합하는 제1 항원-결합 모이어티 그리고 제1 항원에서 상이한 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 모이어티를 포함할 수 있다. 용어 "비파라토픽"은 제1 항원-결합 모이어티 및 제2 항원-결합 모이어티가 동일한 항원에서 상이한 에피토프에 결합하는 이중특이적 항원-결합 작제물을 지칭하는데 사용될 수 있다. 비파라토픽 항원-결합 작제물은 2 에피토프를 거쳐 단일 항원 분자에 결합할 수 있거나, 상이한 에피토프를 통해 2 별개의 항원 분자, 각각에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 항원-결합 작제물은 항원-결합 폴리펩타이드 작제물인 둘 이상의 항원-결합 모이어티를 포함하고, 각각의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은, 임의로 낙타과 기원 (VHH)의, 독립적으로 Fab, scFv 또는 sdAb이다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 추가로 스캐폴드를 포함하고 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 스캐폴드에 작동가능하게 연결된다. 용어 "작동가능하게 연결된"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 기재된 성분이 그것의 의도된 방식으로 이들을 기능하게 하는 관계인 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항체 또는 항원-결합 항체 단편일 수 있다. 용어 "항체" 및 "면역글로불린"은, 폴리펩타이드가 피분석물 (예를 들면 항원)을 특이적으로 결합하고 인식하는, 면역글로불린 유전자 또는 유전자, 또는 면역글로불린 유전자의 변형된 버전에 의해 인코딩된 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 어느 한쪽 카파 또는 람다로서 분류된다. 항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 그것의 중쇄에 의해 소유되는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5 주요 부류가 있고: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 몇 개의 이들은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분할될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 α, δ, ε, γ 및 μ, 각각으로 불리운다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 폴리펩타이드 쇄의 2 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 "경" 쇄 (약 25 kD) 및 하나의 "중" 쇄 (약 50-70 kD)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단 도메인은 항원 인식을 주로 책임지는 약 100 내지 110 또는 초과 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 이들 경쇄 및 중쇄 도메인 각각을 지칭한다. IgG1 중쇄는, N- 내지 C-말단으로부터, VH, CH1, CH2 및 CH3 도메인, 각각을 포함한다. 경쇄는 N- 내지 C-말단으로부터 VL 및 CL 도메인을 포함한다. IgG1 중쇄는 CH1과 CH2 도메인 사이 힌지를 포함한다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로부터 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역글로불린-기반 작제물 예컨대 디아바디 또는 나노바디로부터 또는 상기에서 유래된 하나 이상의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 중쇄 항체 예컨대 낙타과 항체로부터 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 포유류 항체 예컨대 소 항체, 인간 항체, 낙타과 항체, 마우스 항체 또는 임의의 키메라 항체로부터 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "초가변 영역" (HVR)은 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 원상태 4-쇄 항체는 6 HVRs; VH에서 3 (H1, H2, H3), 및 VL에서 3 (L1, L2, L3)을 포함한다. HVRs는 일반적으로 아미노산 잔기를 초가변 루프로부터 및/또는 상보성 결정 영역 (CDRs)로부터 포함하고, 후자는 최고 서열 가변성이고/이거나 항원 인식에서 관여된다. VH에서 CDR1을 예외로, CDRs는 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 용어 초가변 영역 (HVRs) 및 상보성 결정 영역 (CDRs)은 항원-결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분에 관련하여 상호교환적으로 본 명세서에서 사용된다. 이 특정 영역은 하기에 의해 기재되어 있고: Kabat 등, U.S. Dept, of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) 및 Chothia 등, J Mol Biol, 196:901-917 (1987), 여기에서 정의는 서로에 대해 비교된 경우 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브셋을 포함한다. 그럼에도 불구하고, CDR을 지칭하기 위한 어느 한쪽 정의의 적용은 본 명세서에서 정의된 및 사용된 바와 같이 용어의 범위 내인 것으로 의도된다.
항원-결합 폴리펩타이드 작제물
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 이들 중 하나는 면역치료제에 결합 (예를 들면 특이적으로 결합)하고, 이들의 하나 이상은 각각 독립적으로 종양-관련 항원에 결합 (예를 들면 특이적으로 결합)한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 면역글로불린-기반 작제물, 예를 들어, 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은, 비제한적으로, 안티칼린, 파미노머, 아피머, 알파바디, DARPin 또는 아비머를 포함하는, 비-면역글로불린 기반 항체 모방체 포멧일 수 있다.
특정 구현예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 각각 독립적으로, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 의도된 적용에 의존하여, Fab, scFv 또는 sdAb일 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 적어도 하나는 Fab 단편일 수 있다. "단편" (또한 단편 항원-결합으로 칭함)은 경쇄 및 중쇄, 각각에서 가변 도메인 VL 및 VH와 함께 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1) 및 경쇄의 불변 도메인 (CL)을 함유한다. 가변 도메인은, 항원-결합에서 관여되는, CDRs를 포함한다. Fab' 단편은, 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는, 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에서 몇몇 아미노산 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 중 하나는 Fab' 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일-쇄"는 펩타이드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 하나 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 단일-쇄 Fab 분자, 즉 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄가 단일 펩타이드 쇄를 형성하기 위해 펩타이드 링커에 의해 연결되는 Fab 분자일 수 있다. 예를 들어, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 단일-쇄 Fab 분자인 일부 구현예에서에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일-쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결될 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 적어도 하나의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 단일-쇄 Fv (scFv)일 수 있다. "scFv"는 단일 폴리펩타이드 쇄에서 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다. scFv는 항원 결합을 위하여 scFv가 원하는 구조를 형성하게 하는 VH와 VL 도메인 사이 폴리펩타이드 링커를 임의로 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, scFv는 폴리펩타이드 링커에 의해 VH의 그것의 C-말단부터 N-말단까지 연결된 VL을 포함할 수 있다. 대안적으로, scFv는 폴리펩타이드 쇄 또는 링커에 의해 VL의 N-말단에 그것의 C-말단을 통해 연결된 VH를 포함할 수 있다. scFvs의 검토를 위하여 하기 참조: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 적어도 하나의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 단일 도메인 항체 (sdAb) 포멧일 수 있다. sdAb 포멧은 단일 면역글로불린 도메인을 지칭한다. sdAb는, 예를 들어, 낙타과 기원일 수 있다. 낙타과 항체는 경쇄가 부족하고 그것의 항원-결합 부위는 단일 도메인, 일명 "VHH"로 구성된다. sdAb는 3 항원-결합 부위: CDR1, CDR2 및 CDR3을 형성하는 3 CDR/초가변 루프를 포함한다. SdAbs는 상당히 안정하고, 예를 들어, 항체의 Fc 쇄와 융합으로서 발현하기 쉽다 (참조, 예를 들어, Harmsen & De Haard, Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007)).
특정 구현예에서, 종양-관련 항원을 결합시키는 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 적어도 하나의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 종양-관련 항원용 천연 리간드, 또는 그와 같은 리간드의 기능적 단편일 수 있다. 그 예는, 비제한적으로, 폴레이트 (FRalpha용 리간드), 재조합 EGF (EGFR용 리간드) 또는 Wnt5a (ROR1용 리간드)를 포함한다.
포멧
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 모듈 및 선택적인 스캐폴드 모듈을 포함하는 모듈러 구조를 갖는 것으로 간주될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 이들 모듈이 상이한 포멧을 갖는 다중-특이적 항원-결합 작제물을 제공하기 위해 다양한 방식으로 조합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이들 포멧은 일반적으로 기술-공지된 항체 포멧에 기반되고 (참조, 예를 들어, 하기에 의한 검토: Brinkmann & Kontermann, MABS, 9(2): 182-212 (2017), 및 Muller & Kontermann, "Bispecific Antibodies" in Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)), 상기 기재된 것 그리고 도 1B에서 보여진 다중-특이적 항원-결합 작제물의 예시적인, 비-제한, 포멧을 포함한다.
스캐폴드가 부족한 다중-특이적 항원-결합 작제물은 전형적으로 하나 이상의 링커에 의해 작동가능하게 연결된 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 scFvs, Fabs, sdAbs, 또는 이의 조합의 형태일 수 있다. 예를 들어, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물로서 scFvs를 사용하여, 포멧 예컨대 탠덤 scFv ((scFv)2 또는 taFv) 또는 트리플바디 (3 scFvs)는 작제될 수 있고, 여기에서 scFvs는 가요성 링커에 의해 함께 연결된다. scFvs는 또한, 짧은 링커 (일반적으로 길이 약 5 아미노산)에 의해 연결된, 2, 3 및 4 scFvs, 각각을 포함하는, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디 (탠덤 디아바디 또는 TandAbs) 포멧을 작제하는데 사용될 수 있다. 링커의 제한된 길이는 헤드-투-테일 방식으로 scFvs의 이량체화를 초래한다. 임의의 이전의 포멧에서, scFvs는 영역간 디설파이드 결합의 봉입체에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 예를 들어, 디설파이드 결합은 각각의 쇄에서 (예를 들어, VH내 위치 44 및 VL내 100에서) 추가의 시스테인 잔기의 도입을 통해 VL과 VH 사이 도입될 수 있거나 (참조, 예를 들어, Fitzgerald 등, Protein Engineering, 10:1221-1225 (1997)), 디설파이드 결합은 DART 포멧을 갖는 작제물을 제공하기 위해 2 VHs 사이 도입될 수 있다 (참조, 예를 들어, Johnson 등, J Mol. Biol., 399:436-449 (2010)).
유사하게, 적합한 링커를 통해 함께 연결된, 둘 이상의 sdAbs, 예컨대 VHs 또는 VHHs를 포함하는 포멧은 다중-특이적 항원-결합 작제물을 위하여 사용될 수 있다.
스캐폴드가 부족한 다중-특이적 항원-결합 작제물 포멧의 다른 예는, Fab 단편이 링커 또는 IgG 힌지 영역을 통해 연결되는, Fab 단편, 예를 들어, Fab2, F(ab')2 및 F(ab')3 포멧에 기반된 것을 포함한다.
상이한 형태로 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 조합은 대체 스캐폴드-없는 포멧을 생성하는데 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, scFv 또는 sdAb는 2가 (Fab-scFV/sdAb) 또는 3가 (Fab-(scFv)2 또는 Fab-(sdAb)2) 작제물을 초래하는 Fab 단편의 경쇄 및 중쇄의 어느 한쪽 또는 양쪽의 C-말단에 융합될 수 있다. 유사하게, 1 또는 2 scFvs 또는 sdAbs는 F(ab') 단편의 힌지 영역에서 융합되어 3가 또는 4가 F(ab')2-scFv/sdAb 작제물을 생산할 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 하나 이상의 링커를 포함하고, 스캐폴드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 scFvs, Fabs, sdAbs, 또는 이의 조합인, 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 하나 이상의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 scFvs인, 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 하나 이상의 링커를 포함한다.
스캐폴드를 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물은 적합한 스캐폴드에 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 연결시킴으로써 작제될 수 있다. 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 상기 기재된 형태 (예를 들면 scFvs, Fabs 및/또는 sdAbs)의 하나 또는 조합일 수 있다. 적합한 스캐폴드의 예는 아래에 더 상세히 기재되고, 비제한적으로, 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 알부민 유사체 및 유도체, 이종이량체화 펩타이드 (예컨대 류신 지퍼, Jun 및 Fos에서 유래된 이종이량체-형성 "지퍼" 펩타이드, IgG CH1 및 CL 도메인 또는 바마세-바스타 독소), 사이토카인, 케모카인 또는 성장 인자를 포함한다. 다른 예는 IBC Pharmaceuticals, Inc. 및 Immunomedics에 의해 개발된 DOCK-및-LOCK™(DNL™) 기술에 기반된 다중-특이적 항원-결합 작제물을 포함한다 (참조, 예를 들어, Chang, 등, Clin Cancer Res 13:5586s-5591s (2007)).
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 IgG Fc 영역에서 기반되는 스캐폴드, 알부민 또는 알부민 유사체 또는 유도체를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, CH3 서열, 및 임의로 CH2 서열을 각각 포함하는, 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 이량체 또는 이종이량체 Fc일 수 있는, Fc에 기반되는 스캐폴드를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 Fc를 포함하고, 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제1 Fc 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결되고 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 제2 Fc 폴리펩타이드에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 Fc를 포함하고, 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은, 링커와 함께 또는 링커 없이, 제1 Fc 폴리펩타이드 또는 제2 Fc 폴리펩타이드의 C-말단에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 CH1 및 VH를 포함하는 중쇄 폴리펩타이드 그리고 CL 및 VL을 포함하는 경쇄 폴리펩타이드를 포함하고, 여기에서 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 VL의 N-말단, CL의 C-말단, 또는 VH의 N-말단에, 링커와 함께 또는 링커 없이, 작동가능하게 연결된다.
"항체" 또는 "이중-가변 도메인 면역글로불린" (DVD) 포멧에서 다중-특이적 항원-결합 작제물을 포함하는, 3 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물이 본 명세서에서 또한 고려된다 (참조, 예를 들면 미국 특허 출원 공개 번호 US2006/0025576, 및 Wu 등, Nature Biotechnology 25:1290-1297 (2007)).
특정 구현예는 다중-특이적 항원-결합 작제물이 또한 면역치료제에 뿐만 아니라 상기 표적 종양-관련 항원에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 "이중 작용 FAb"또는 "DAF"를 포함할 수 있다는 것을 고려한다 (참조, 미국 특허 출원 공개 번호 US2008/0069820, 예를 들어).
스캐폴드
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 스캐폴드를 포함한다. 스캐폴드는 펩타이드, 폴리펩타이드, 폴리머, 나노입자 또는 다른 화학 독립체일 수 있다. 스캐폴드가 폴리펩타이드인 경우, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 각각의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 폴리펩타이드 스캐폴드의 N- 또는 C-말단 어느 한쪽에 연결될 수 있다. 하나 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이, 예를 들어, 링커와 함께 또는 링커 없이 아미노산의 측쇄를 통해 N- 또는 C-말단 이외 영역에 연결되는 폴리펩타이드 스캐폴드를 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물은 특정 구현예에서 또한 고려된다.
스캐폴드가 펩타이드 또는 폴리펩타이드인 구현예에서, 항원-결합 작제물은 유전적 융합 또는 화학 콘주게이션에 의해 스캐폴드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 스캐폴드가 폴리머 또는 나노입자인 경우, 항원-결합 작제물은 화학 콘주게이션에 의해 스캐폴드에 연결될 수 있다.
수많은 단백질 도메인은 2 상이한 항원-결합 폴리펩타이드의 선택적 쌍을 포함하는 그리고 스캐폴드를 형성하는데 사용될 수 있는 당해 기술에 공지되어 있다. 일 예는 함께 선택적으로 짝짓기하는 류신 지퍼 도메인 예컨대 Fos 및 Jun이다 (Kostelny, 등, J Immunol, 148:1547-53 (1992); Wranik, 등, J. Biol. Chem., 287: 43331-43339 (2012)). 다른 선택적으로 짝짓기 분자 쌍은, 예를 들어, 바마세 바스타 쌍 (Deyev, 등, Nat Biotechnol, 21:1486-1492 (2003)), DNA 가닥 쌍 (Chaudri, 등, FEBS Letters, 450(1-2):23-26 (1999)) 및 분할 형광 단백질 쌍 (국제 특허 공개 번호 WO 2011/13504)를 포함한다.
단백질 스캐폴드의 다른 예는 면역글로불린 Fc 영역, 알부민, 알부민 유사체 및 유도체, 독소, 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자를 포함한다. 항원-결합 모이어티와 조합으로 단백질 스캐폴드의 용도는, 예를 들어, 하기에서 기재되어 있다:
Figure pct00001
등, J Biol Chem, 282:12650-12660 (2007); McDonaugh 등, Mol Cancer Ther, 11:582-593 (2012); Vallera 등, Clin Cancer Res, 11:3879-3888 (2005); Song 등, Biotech Appl Biochem, 45:147-154 (2006), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US2009/0285816.
예를 들어, 알부민에 항원-결합 모이어티 예컨대 scFvs, 디아바디 또는 단일 쇄 디아바디 융합은 항원-결합 모이어티의 혈청 반감기를 개선하는 것으로 나타났다 (
Figure pct00002
등, 앞에서 언급한 것). 항원-결합 모이어티는, 임의로 링커를 통해, 알부민의 N- 및/또는 C- 말단에 융합될 수 있다.
수송체 폴리펩타이드가 준-원상태 알부민을 형성하기 위해 자가-조립하는 정도로 알부민 단백질의 분절화에 의해 수득된 2 수송체 폴리펩타이드를 포함하는 이종다량체의 형태로 알부민의 유도체는 기재되어 있다 (참조 국제 특허 공개 번호 WO 2012/116453 및 WO 2014/012082). 알부민의 분절화의 결과로서, 이종다량체는 4 말단을 포함하고 따라서, 임의로 링커를 통해, 최대 4 상이한 항원-결합 모이어티에 융합될 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 단백질 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 (아래 기재된 바와 같이) Fc 영역, 알부민 또는 알부민 유사체 또는 유도체에 기반되는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA), 또는 알부민 유사체 또는 유도체에 기반되는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 국제 특허 공개 번호 WO 2012/116453 또는 WO 2014/012082에서 기재된 바와 같이 알부민 유도체에서 기반되는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 scFvs의 형태인 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 국제 특허 공개 번호 WO 2012/116453 또는 WO 2014/012082에서 기재된 바와 같이 알부민 유도체에 기반되는 단백질 스캐폴드를 포함한다.
Fc 영역
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 Fc 영역에 기반되는 스캐폴드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "Fc 영역", "Fc" 또는 "Fc 도메인"은 불변 영역의 적어도 한 부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 지칭한다. 용어는 원상태 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 본 명세서에서 다르게 특정되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은, 하기에서 기재된 바와 같이, EU 지수로 또한 불리우는, EU 넘버링 시스템에 따른 것이다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). 이량체 Fc의 "Fc 폴리펩타이드"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2 폴리펩타이드 중 하나, 즉 안정한 자가-회합할 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 예를 들어, 이량체 IgG Fc의 Fc 폴리펩타이드는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다.
Fc 도메인은 어느 한쪽 CH3 도메인 또는 CH3 및 CH2 도메인을 포함한다. CH3 도메인은, 이량체 Fc의 각각의 2 Fc 폴리펩타이드로부터의 것인, 2 CH3 서열을 포함한다. CH2 도메인은, 이량체 Fc의 각각의 2 Fc 폴리펩타이드로부터의 것인, 2 CH2 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 1 또는 2 CH3 서열을 포함하는 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc는, 하나 이상의 링커와 함께 또는 없이, 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 커플링된다. 일부 구현예에서, Fc는 인간 Fc에 기반된다. 일부 구현예에서, Fc는 인간 IgG Fc, 예를 들어 인간 IgG1 Fc에 기반된다. 일부 구현예에서, Fc는 이종이량체 Fc이다. 일부 구현예에서, Fc는 1 또는 2 CH2 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc는 1 또는 2 CH3 서열을 포함하고 이들 중 적어도 하나는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc는 1 또는 2 CH2 서열을 포함하고, 이들 중 적어도 하나는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc는 단일 폴리펩타이드로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc는 다중 펩타이드, 예를 들면 2 폴리펩타이드로 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 국제 특허 공개 번호 WO 2012/058768 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2013/063702에서 기재된 바와 같이 Fc를 포함한다.
변형된 CH3 도메인
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함하고, 여기서 변형된 CH3 도메인은 비대칭으로 변형된 CH3 도메인이다. 이종이량체 Fc는 2 중쇄 불변 도메인 폴리펩타이드: 상호교환적으로 사용될 수 있는 단 Fc가 하나의 제1 Fc 폴리펩타이드 및 하나의 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 제1 Fc 폴리펩타이드는 제1 CH3 서열을 포함하고 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 CH3 서열을 포함한다.
비대칭 방식으로 도입된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 2 CH3 서열은, 2 CH3 서열이 이량체화하는 경우, 동종이량체 보다는, 이종이량체 Fc를 일반적으로 초래한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비대칭 아미노산 변형"은 제1 CH3 서열상의 특정 위치에서 아미노산이 동일한 위치에서 제2 CH3 서열상의 아미노산과 상이한 변형을 지칭한다. 비대칭 아미노산 변형을 포함하는 CH3 서열에 대하여, 제1 및 제2 CH3 서열은, 동종이량체 보다는, 이종이량체를 형성하기 위해 전형적으로 우선적으로 짝짓기할 것이다. 이들 비대칭 아미노산 변형은 각각의 서열상의 동일한 각각의 아미노산 위치에서 2 아미노산 중 단 하나의 변형, 또는 각각의 제1 및 제2 CH3 서열상의 동일한 각각의 위치에서 각각의 서열상의 양쪽 아미노산의 상이한 변형의 결과일 수 있다. 이종이량체 Fc의 제1 및 제2 CH3 서열은 하나의 또는 하나 초과의 비대칭 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
표 A는, 전장 인간 IgGl 중쇄의 아미노산 231 내지 447에 상응하는, 인간 IgG1 Fc 서열의 아미노산 서열을 제공한다. CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 341-447을 포함한다.
전형적으로, Fc는 이량체화할 수 있는 2 중쇄 폴리펩타이드 서열 (A 및 B)를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc의 한쪽 또는 양쪽 폴리펩타이드 서열은, EU 넘버링을 사용하여, 하나 이상의 하기 위치: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400 및/또는 N390에서 변형을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하는 제1 폴리펩타이드 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함하고, 임의로 추가로 위치 L351에서 아미노산 변형, 및 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하는 제2 폴리펩타이드 서열을 포함하고, 임의로 추가로 위치 K392에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 CH3 도메인의 제1 폴리펩타이드 서열은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하고, 임의로 추가로 위치 L351에서 아미노산 변형을 포함하고, 변형된 CH3 도메인의 제2 폴리펩타이드 서열은 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하고, 임의로 추가로 위치 K392에서 아미노산 변형을 포함하고, 위치 F405에서 아미노산 변형은 F405A, F405I, F405M, F405S, F405T 또는 F405V이고; 위치 Y407에서 아미노산 변형은 Y407I 또는 Y407V이고; 위치 T366에서 아미노산 변형은 T366I, T366L 또는 T366M이고; 위치 T394에서 아미노산 변형은 T394W이고; 위치 L351에서 아미노산 변형은 L351Y이고, 위치 K392에서 아미노산 변형은 K392F, K392L 또는 K392M이다.
일부 구현예에서, Fc의 제1 폴리펩타이드 서열은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하고, 임의로 추가로 위치 L351에서 아미노산 변형을 포함하고, Fc의 제2 폴리펩타이드 서열은 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하고, 임의로 추가로 위치 K392에서 아미노산 변형을 포함하고, 위치 F405에서 아미노산 변형은 F405A, F405I, F405M, F405S, F405T 또는 F405V이고; 위치 Y407에서 아미노산 변형은 Y407I 또는 Y407V이고; 위치 T366에서 아미노산 변형은 T366I, T366L 또는 T366M이고; 위치 T394에서 아미노산 변형은 T394W이고; 위치 L351에서 아미노산 변형은 L351Y이고, 위치 K392에서 아미노산 변형은 K392F, K392L 또는 K392M이고, Fc의 제1 및 제2 폴리펩타이드 서열의 한쪽 또는 양쪽은 추가로 아미노산 변형 T350V를 포함한다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 포함하는 제1 폴리펩타이드 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함하고, 임의로 추가로 위치 L351에서 아미노산 변형을 포함하고, 위치 T366 및 T394에서 아미노산 변형을 포함하는 제2 폴리펩타이드 서열, 및 임의로 추가로 위치 K392에서 아미노산 변형을 포함하고, 제1 폴리펩타이드 서열은 추가로 위치 S400 또는 Q347의 한쪽 또는 양쪽에서 아미노산 변형을 포함하고/하거나 제2 폴리펩타이드 서열은 추가로 위치 K360 또는 N390의 한쪽 또는 양쪽에서 아미노산 변형을 포함하고, 여기에서 위치 S400에서 아미노산 변형은 S400E, S400D, S400R 또는 S400K이고; 위치 Q347에서 아미노산 변형은 Q347R, Q347E 또는 Q347K이고; 위치 K360에서 아미노산 변형은 K360D 또는 K360E이고, 위치 N390에서 아미노산 변형은 N390R, N390K 또는 N390D이다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 표 A에서 나타낸 바와 같이, 변이체 1, 변이체 2, 변이체 3, 변이체 4 또는 변이체 5 중 어느 하나의 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함한다.
Figure pct00003
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열, 및 위치 T394에서 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체 Fc는 L351Y, F405A, 및 Y407V로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열, 및 T366L, T366I, K392L, K392M, 및 T394W로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 가진변형된 CH3 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열, 및 위치 T366, K392, 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열, 그리고 위치 Q347에서 아미노산 변형을 추가로 포함하는 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나, 그리고 위치 K360에서 아미노산 변형을 추가로 포함하는 다른 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열, 및 위치 T366, K392, 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열, 위치 Q347에서 아미노산 변형을 추가로 포함하는 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나, 그리고 위치 K360에서 아미노산 변형을 추가로 포함하는 다른 CH3 서열을 가진 변형된 CH3 도메인을 포함하고 상기 CH3 서열의 한쪽 또는 양쪽은 추가로 아미노산 변형 T350V를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열, 및 위치 T366, K392, 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열 그리고 D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 상기 제1 및 제2 CH3 서열 중 하나 그리고 하나 이상의 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D를 포함하는 다른 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열, 및 위치 T366, K392, 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열, D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 추가로 포함하는 상기 제1 및 제2 CH3 서열 중 하나 그리고 하나 이상의 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D를 포함하는 다른 CH3 서열을 가진 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH3 서열 중 한쪽 또는 양쪽은 추가로 아미노산 변형 T350V를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열, 및 위치 T366, K392, 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함하고, 상기 CH3 서열의 한쪽 또는 양쪽은 추가로 T350V의 아미노산 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 위치 Y407에서 아미노산 변형을 포함하는 제1 폴리펩타이드 서열, 및 위치 T366 및 K409에서 아미노산 변형을 포함하는 제2 폴리펩타이드 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 CH3 도메인의 제1 폴리펩타이드 서열은 위치 Y407에서 아미노산 변형을 포함하고, 변형된 CH3 도메인의 제2 폴리펩타이드 서열은 위치 T366 및 K409에서 아미노산 변형을 포함하고, 위치 Y407에서 아미노산 변형은 Y407A, Y407I, Y407L 또는 Y407V이고; 위치 T366에서 아미노산 변형은 T366A, T366I, T366L, T366M 또는 T366V이거나, 위치 K409에서 아미노산 변형은 K409F, K409I, K409S 또는 K409W이다.
특정 구현예에서, Fc에 의해 포함된 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이량체 CH3 도메인이 야생형 동종이량체 CH3 도메인에 비교할만한 안정성을 갖는 이종이량체 Fc의 형성을 촉진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이량체 Fc 도메인이 야생형 동종이량체 Fc 도메인에 비교할만한 안정성을 갖는 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진시킨다.
일부 구현예에서, CH3 도메인의 안정성은, 예를 들어 시차 주사 열량측정 (DSC)에 의해, CH3 도메인의 용융 온도 (Tm) 측정에 의해 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 CH3 도메인이 상응하는 대칭 야생형 동종이량체 CH3 도메인에 대하여 관측하였던 것의, 약 8℃ 이내, 예를 들어, 약 7℃, 약 6℃, 약 5℃, 또는 약 4℃ 이내인 시차 주사 열량측정 연구에서 용융 온도 (Tm)을 통해 관측된 경우 안정성을 갖는 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진시킨다.
일부 구현예에서, 이종이량체 Fc의 CH3 도메인은 약 68℃ 이상, 약 70℃ 이상, 약 72℃ 이상, 73℃ 이상, 약 75℃ 이상, 약 78℃ 이상, 약 80℃ 이상, 약 82℃ 이상, 또는 약 84℃ 이상의 용융 온도 (Tm)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 CH3 서열을 포함하는 이종이량체 Fc는 발현된 생성물에서 동종이량체 Fc에 비교된 경우 적어도 약 75%의 순도로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종이량체 Fc는 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과 또는 약 97% 초과 순도로 형성된다. 일부 구현예에서, Fc는 발현된 경우 약 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 초과 순도로 형성된 이종이량체이다.
이종이량체 Fc 형성을 촉진시키기 위해 모노머성 Fc 폴리펩타이드의 추가의 변형 방법은 당해 기술에 공지되어 있고, 예를 들어, 하기에서 기재된 것을 포함한다: 국제 특허 공개 번호 WO 96/027011 (놉 인투 홀), Gunasekaran 등. 15 J Biol Chem, 285, 19637-46 (2010) (선택적 이종이량체화를 달성하기 위한 정전 설계), Davis 등, Prot Eng Des Sel, 23(4): 195-202 (2010) (가닥 교환 조작된 도메인 (SEED) 기술), 및 Labrijn 등, Proc Natl Acad Sci USA, 110(13):5145-50 (2013) (Fab-아암 교환).
CH2 도메인
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 CH2 도메인을 포함하는 Fc를 포함한다. Fc의 CH2 도메인의 하나의 예는 표 A에서 보여준 서열의 아미노산 231-340이다. 몇 개의 효과기 기능은, 항체의 Fc에 결합하는, Fc 수용체 (FcRs)에 의해 매개된다.
용어 "Fc 수용체" ("FcR")은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하는데 사용된다. 예를 들어, FcR은 원상태 서열 인간 FcR이다. 일반적으로, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이고, 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태를 포함하는, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는, 이의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함한다. 다른 아이소타입의 면역글로불린은 또한 특정 FcRs에 의해 결합될 수 있다 (참조, 예를 들면, Janeway 등, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)). 용어 "FcR"은 또한, 태아에 모계 IgGs의 전이를 책임지는, 신생아 수용체, FcRn을 특정 구현예에서 포함한다 (Guyer 등, J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim 등, J. Immunol. 24:249 (1994)).
CH2 도메인에서 변형은 Fc에 FcRs의 결합에 영향을 줄 수 있다. Fc 영역에서 수많은 아미노산 변형은 상이한 Fc감마 수용체용 Fc의 친화도의 선택적으로 변경에 대하여 당해 기술에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적 결합을 촉진시키기 위해 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
FcRs에 의해 Fc의 결합을 변경시키는 변형의 비-제한 예는 하기를 포함한다: S298A/E333A/K334A 및 S298A/E333A/K334A/K326A (Lu, 등, J Immunol Methods, 365(1-2): 132-41 (2011)); F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L 및 F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen, 등, Cancer Res, 67(18):8882-90 (2007) 및 Nordstrom JL, 등, Breast Cancer Res, 13(6):R123 (2011)); F243L (Stewart, 등, Protein Eng Des Sel. 24(9):671-8 (2011)); S298A/E333A/K334A (Shields, 등, J Biol Chem, 276(9):6591-604 (2001)); S239D/I332E/A330L 및 S239D/I332E (Lazar, 등, Proc Natl Acad Sci USA, 103(11):4005-10 (2006)); S239D/S267E 및 S267E/L328F (Chu, 등, Mol Immunol, 45(15):3926-33 (2008)). 다른 예는 하기를 포함한다: S239D/D265S/S298A/I332E; S239E/S298A/K326A/A327H; G237F/S298A/A330L/I332; S239D/I332E/S298A;S239D/K326E/A330L/I332E/S298A; G236A/S239D/D270L/I332E; S239E/S267E/H268D; L234F/S267E/N325L; G237F/V266L/S267D, 및 국제 특허 공개 번호 WO 2011/120134에서 기재된 다른 돌연변이.
FcRs에 의해 결합하는 Fc에 영향을 주는 추가의 변형은 하기에서 기재된다: Therapeutic Antibody Engineering (Strohl & Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012, page 283).
FcRs에 의한 결합에 영향을 주는 비대칭 변형을 포함하는 Fc 영역은 국제 특허 공개 번호 WO 2014/190441에서 기재된다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함하는 CH2 도메인을 포함하는 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 비대칭 변형을 포함하지 않는 항원-결합 작제물에 비하여, 우월한 생체물리학적 특성, 예를 들어 안정성 및/또는 제조의 용이성을 제공하는 비대칭 변형을 포함하는 CH2 도메인을 포함하는 Fc를 포함한다.
추가의 변형
일부 구현예에서, Fc 영역을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물은 효과기 기능을 매개하는 그것의 능력을 개선하기 위해 변형을 포함할 수 있다. 그와 같은 변형은 당해 기술에 공지되어 있고 탈푸코실화, 또는 활성화 수용체, 주로 ADCC용 FcγRIIIa에 대한, 그리고 CDC용 Clq에 대한 Fc의 친화도의 조작을 포함한다.
아미노산 서열 변경 없이 Fc 당화 부위 (Asn 297, EU 넘버링)에서 푸코스가 거의 없는 항체의 생산 방법은 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, GlymaX®기술 (ProBioGen AG) (참조 von Horsten 등, Glycobiology, 20(12): 1607-18 (2010)) 및 미국 특허 번호 8,409,572. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 비당화될 수 있다. 이러한 문맥에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 완전하게 탈푸코실화될 수 있거나 (즉 이들이 검출가능한 푸코스를 함유하지 않거나) 또는 이들은 다중-특이적 항원-결합 작제물이 포유류 발현 시스템에 의해 생산된 유사한 작제물에 대하여 정상적으로 검출된 푸코스의 양의 95% 미만, 85% 미만, 75% 미만, 65% 미만, 55% 미만, 45% 미만, 35% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 5% 미만 함유하는 정도로 부분적으로 탈푸코실화될 수 있다.
FcγR 및/또는 보체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 변형은 당해 기술에 공지되어 있고 상기 기재된 것을 포함한다. 다양한 공보는 감소된 또는 침묵화된 효과기 활성으로 항체를 조작하는데 사용되고 있는 전략을 기재한다 (참조, 예를 들어, Strohl, Curr Opin Biotech 20:685-691 (2009), 및 Strohl & Strohl, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249). 이들 전략은 하기를 포함한다: 당화의 변형을 통한 효과기 기능의 감소, IgG2/IgG4 스캐폴드의 용도, 또는 Fc의 힌지 또는 CH2 영역에서 돌연변이의 도입 (참조 또한, 미국 특허 공개 번호 2011/0212087, 국제 특허 공개 번호 WO 2006/105338, 미국 특허 공개 번호 2012/0225058, 미국 특허 공개 번호 2012/0251531 및 Strop 등, J. Mol. Biol. 420: 204-219 (2012)).
Fc에 FcγR 또는 보체 결합을 감소시키기 위한 공지된 아미노산 변형의 특정, 비-제한 예는 표 B에서 확인된 것을 포함한다.
Figure pct00004
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 표 B에서 확인된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 L234, L235, 또는 D265의 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 Fc를 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 L234, L235 및 D265에서 아미노산 변형을 포함하는 Fc이다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 아미노산 변형 L234A, L235A 및 D265S를 포함하는 Fc를 포함한다.
링커
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 둘 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 및 하나 이상의 링커를 포함한다. 링커는, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 2 도메인 (예컨대 scFv 또는 디아바디의 VH 및 VL)을 결합시키는 기능을 할 수 있거나, 이들은 2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 함께 (예컨대 둘 이상의 Fabs 또는 sdAbs)를 결합시키는 기능을 할 수 있거나, 이들은 스캐폴드에 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 결합시키는 기능을 할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 다중 링커 (즉 둘 이상)을 포함할 수 있고, 예를 들어, 스캐폴드에 연결된 다중-특이적 항원-결합 작제물 하나 이상의 scFvs는 scFv의 VH 및 VL을 연결하는 링커 그리고 스캐폴드에 scFv를 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 적절한 링커는 당해 기술에 공지되어 있고 링커의 의도한 용도에 기반하여 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다 (참조, 예를 들어, Muller & Kontermann, "Bispecific Antibodies" in Handbook of Therapeutic Antibodies, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. (2014)).
유용한 링커는, 당해 분야에서 공지되고 다양한 순서로 조합된 글리신 및 세린 유닛을 포함하는, 글리신-세린 (GlySer) 링커를 포함한다. 그 예는, 비제한적으로, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGS)n 및 (GGGGS)n을 포함하고, 여기에서 n은 적어도 하나의 정수, 전형적으로 1 내지 약 10, 예를 들어, 1 내지 약 8, 1 내지 약 6, 또는 1 내지 약 5의 정수이다.
다른 유용한 링커는 면역글로불린 힌지 서열에서 유래된 서열을 포함한다. 링커는 4 IgG 부류 중 어느 하나로부터 힌지 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고 추가의 서열을 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 면역글로불린 힌지 서열 및 글리신-세린 서열의 한 부분을 포함할 수 있다. 비-제한 예는 IgG1 힌지 이어서 GlySer 링커 서열의 대략 제1 15 잔기를 포함하는 링커, 예컨대, 길이 약 10 아미노산인, 상기 기재된 것이다.
링커의 길이는 그것의 적용에 의존하여 다양할 것이다. 적절한 링커 길이는 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 링커가 scFv의 VH 및 VL 도메인을 연결하기 위한 경우, 링커는 전형적으로 길이 약 5 내지 약 20 아미노산, 예를 들어, 길이 약 10 내지 약 20 아미노산, 또는 길이 약 15 내지 약 20 아미노산이다. 링커가 디아바디의 VH 및 VL 도메인을 연결하기 위한 경우, 링커는 동일한 쇄 내에 이들 2 도메인의 회합을 방지하기 위해 충분히 짧아야 한다. 예를 들어, 링커는 길이 약 2 내지 약 12 아미노산, 예컨대, 길이 약 3 내지 약 10 아미노산, 또는 길이 약 5 아미노산일 수 있다.
일부 구현예에서, 링커가 2 Fab 단편을 연결시키기 위한 경우, 링커는 F(ab') 단편의 파라토프의 상대 공간적 형태를 유지하는, 그리고 IgG의 코어 힌지에서 디설파이드 결합에 공유결합 등가물을 형성할 수 있는 정도로 선택될 수 있다. 이러한 문맥에서, 적합한 링커는 IgG 힌지 영역 예컨대, 예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터의 것을 포함한다. 이들 예시적인 링커의 변형된 버전은 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, IgG4 힌지의 안정성을 개선하기 위한 변형은 당해 기술에 공지되어 있다 (참조 예를 들어, Labrijn 등, Nature Biotechnology, 27:767-771 (2009)).
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 스캐폴드에 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 작동가능하게 연결하는 링커를 포함한다. 일부 측면에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 하나 이상의 링커로 하나 이상의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 커플링된 Fc를 포함한다. 일부 측면에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 링커에 의해 각각의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 중쇄에 커플링된 Fc를 포함한다.
면역치료제
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 면역치료제는, 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된, 효과기 세포, 예컨대 T-세포 또는 NK 세포일 수 있거나, 면역치료제는, T-세포에 그리고 종양-관련 항원에 결합할 수 있는, 치료제, 예컨대 항체 또는 항체 단편일 수 있다.
특정 구현예에서, 면역치료제는 조작된 T-세포 또는 NK 세포이다. 전형적으로, T-세포 또는 NK 세포에 의해 포함된 항원-결합 도메인은 조작된 수용체의 일부이다. 일부 구현예에서, 조작된 T-세포 또는 NK 세포에 의해 포함된 항원-결합 도메인은, 예를 들어, 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR), 예컨대 유전자도입 또는 재조합 TCR의 일부일 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 CAR 또는 TCR의 세포외 부분에 결합한다. 다중-특이적 항원-결합 작제물은 CAR 또는 TCR의 항원-결합 도메인에 결합할 수 있거나, 항원 결합에 관여되지 않는 CAR 또는 TCR의 세포외 영역에 결합할 수 있다.
당해 분야에서 공지되는 바와 같이, CAR 및 TCR 작제물은, 항체에 의해 특이적으로 인식되는 전형적으로 짧은 아미노산 서열인, "태그"를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역치료제는 태그를 포함하는 CAR 또는 TCR을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포이다. 그와 같은 구현예의 문맥에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 태그에 결합할 수 있거나 태그 이외 CAR 또는 TCR의 영역에 결합할 수 있다. 면역치료제가 태그를 포함하는 CAR 또는 TCR을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포인 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 태그 이외 CAR 또는 TCR의 영역에 결합한다.
일부 구현예에서, 면역치료제는 태그를 포함하지 않는 CAR 또는 TCR을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 면역치료제는 태그 또는 임의의 이종성 종양-관련 항원 또는 종양-관련 항원의 단편을 포함하지 않는 CAR 또는 TCR을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포이다.
특정 구현예에서, 면역치료제는 CAR을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포이고 다중-특이적 항원-결합 작제물은 CAR의 세포외 일부에 결합한다. 당해 분야에서 공지되는 바와 같이, CAR은 단일 단백질에서 자연적으로 발견되지 않는 조합으로 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하는 세포-표면 수용체이다. 세포외 도메인은, 항체 또는 항체 단편일 수 있는, 항원-결합 도메인을 포함한다. 항체 또는 항체 단편은 인간 항체 또는 단편, 인간화된 항체 또는 단편 또는 비-인간 항체 또는 단편일 수 있다. 전형적으로, 항원-결합 도메인은 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 scFv이다. 가장 전형적으로, 항원-결합 도메인은 scFv이다. 세포외 도메인은 또한 전형적으로 막관통 도메인에 항원-결합 도메인을 연결시키는 스페이서 (또는 힌지) 영역을 포함한다. 스페이서 영역은 면역글로불린, 예컨대 IgGl 또는 IgG4에서 유래될 수 있거나, 비제한적으로, CD4, CD8, 또는 CD28을 포함하는, 대체 세포-표면 단백질에서 유래될 수 있다.
CAR의 막관통 도메인은 세포외 도메인을 세포질 도메인에 연결시킨다. 전형적으로, 막관통 도메인은 유형 I 막 단백질, 예컨대 CD3 제타, CD4, CD8 또는 CD28에서 유래된다. 일부 사례에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과 상호작용을 최소화하기 위해 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 그와 같은 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 막관통 도메인의 다른 예는 T-세포 수용체, CD3 엡실론, CD45, CD5, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 또는 ICOS의 알파, 베타 또는 제타 쇄에서 유래된 것을 포함한다.
CAR의 세포질 도메인은 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하고 CAR이 배치된 면역 세포의 정상 효과기 기능의 적어도 하나의 활성화를 책임진다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특화된 기능을 지칭한다. T-세포의 효과기 기능은, 예를 들어, 사이토카인의 분비를 포함하는 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 특화된 기능을 수행하기 위해 세포를 유도하는 그리고 효과기 기능 신호를 형질도입하는 단백질의 부분을 지칭한다. CARs에서 빈번하게 사용된 세포내 신호전달 도메인의 예는 항원 수용체 참여 이후 신호 형질도입을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 공-수용체 및 TCR의 세포질 서열, 뿐만 아니라 동일한 기능적 능력을 갖는 이들 서열의 유도체 또는 변이체를 포함한다.
TCR 단독을 통해 생성된 신호가 T-세포의 전체 활성화에 불충분하다는 것 그리고 2차 또는 공-자극 신호가 또한 요구되는 것이 공지된다. 따라서, T-세포 활성화는 세포질 신호전달 서열의 하기 2 구별되는 부류에 의해 매개된다고 언급될 수 있다: TCR을 거쳐 항원-의존적 일차 활성화를 개시하는 것 (일차 세포질 신호전달 서열) 및 2차 또는 공-자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립 방식으로 작용하는 것 (2차 세포질 신호전달 서열).
일차 세포질 신호전달 서열은 어느 한쪽 자극 방식으로, 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반된 활성화 모티프 또는 ITAMs로서 공지되는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다.
CARs에서 사용될 수 있는 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD3 제타, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d에서 유래된 것을 포함한다. 전형적으로, CAR에서 세포질 도메인은 CD3 제타에서 유래된 세포질 신호전달 서열을 포함할 것이다.
CAR의 세포질 도메인은 그것만으로 또는 하나 이상의 공-자극 도메인과 조합으로 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM을 포함시킬 수 있다. 공-자극 도메인은 공-자극 분자의 세포내 도메인에서 유래된다. 공-자극 분자는 항원에 림프구의 효율적인 반응을 위하여 요구되는 항원 수용체 이외 세포 표면 분자이다. 그와 같은 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C 및 B7-H3을 포함한다. 전형적으로, CARs는 4-1BB, CD28 또는 OX40에서 유래된 하나 이상의 공-자극 도메인을 포함한다. 제1 세대 CARs는, 예를 들어, CD3 제타-유래된 세포내 신호전달 도메인만을 포함하고, 반면에 제2 세대 CARs는, 어느 한쪽 4-1BB 또는 CD28에서 유래된 공-자극 도메인과 함께, CD3 제타-유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 제3 세대 CARs는, 어느 한쪽 4-1BB 또는 CD28에서 유래된 제1 공-자극 도메인, 및 4-1BB, CD28 또는 OX40에서 유래된 제2 공-자극 도메인인, 2 공-자극 도메인과 함께, CD3 제타-유래된 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
현재 개발 중인 CAR 작제물의 예, 및 그것의 성분 도메인은 표 1에서 제공된다.
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특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 표적된 면역치료제는 CAR (CAR-T)를 발현시키도록 조작된 T-세포이다. 일부 구현예에서, 면역치료제는 CAR-T이고 다중-특이적 항원-결합 작제물의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 CAR의 항원-결합 도메인에 결합한다. 그와 같은 구현예에 따르면, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 항-유전자형 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. CARs에 의해 표적된 항원은 전형적으로 세포 표면 종양-관련 항원이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "종양-관련 항원"은 암 세포에 의해 발현되는 항원을 지칭한다. 종양-관련 항원은 정상 세포에 의해 발현될 수 있거나 아닐 수 있다. 종양-관련 항원이 정상 세포에 의해 발현되지 않는 경우 (즉 종양 세포에 독특한 경우) 또한 "종양-특이적 항원"으로서 지칭될 수 있다. 종양-관련 항원이 종양 세포에 국한되지 않는 경우, 항원에 면역적 내성의 상태를 유도하는데 실패하는 조건 하에서 정상 세포에서 또한 발현된다. 종양에서 항원의 발현은 면역 시스템이 항원에 반응하게 하는 조건 하에 발생할 수 있다. 종양-관련 항원은 면역 시스템이 미성숙하고 반응할 수 없는 경우 태아 발달 동안 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있거나, 이들은 종양 세포에서 훨씬 높은 수준으로 발현되지만 정상 세포에서 낮은 수준으로 정상적으로 존재하는 항원일 수 있다. 가장 큰 임상 관심의 종양-관련 항원은 상응하는 정상 조직에 비교하여 차등적으로 발현되고 특정 T-세포 또는 면역글로불린에 의해 종양 세포의 우선적인 인식을 허용한다.
현재 임상 개발에서 CARs 또는 조작된 TCRs에 의해 표적된 종양-관련 항원의 예는 하기를 포함한다: NY-ESO (뉴욕 식도 편평상피 세포 암종 1), MART-1 (T 세포 1에 의해 인식된 흑색종 항원, 또한 Melan-A로서 공지됨), HPV (인간 유두종 바이러스) E6, BCMA (B-세포 성숙 항원), CD123, CD133, CD171, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CEA (암종배아 항원), EGFR (표피 성장 인자 수용체), EGFRvIII (표피 성장 인자 수용체 변이체 III), EpCAM (상피성 세포 접착 분자), EphA2 (에프린 유형-A 수용체 2), 디시알로강글리오사이드 GD2, GPC3 (글리피칸-3), HER2, IL13Ralpha2 (인터류킨 13 수용체 서브유닛 알파-2), LeY (디푸코실화된 유형 2 혈액형-관련 항원), MAGE-A3 (흑색종-관련 항원 3), 흑색종 당단백질, 메소텔린, MUC1 (뮤신 1), 미엘린, NKG2D (자연 살해 그룹 2D) 리간드, PSMA (전립선 특이적 막 항원), 및 ROR1 (유형 I 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체).
따라서, 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-유전자형 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서 유래된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 여기서 항-유전자형 항체는 NY-ESO-1, MART-1, HPV E6, BCMA, CD123, CD133, CD171, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CEA, EGFR, EGFRvIII, EpCAM, EphA2, 디시알로강글리오사이드 GD2, GPC3, HER2, IL13Ralpha2, LeY, MAGE-A3, 흑색종 당단백질, 메소텔린, MUC1, 미엘린, NKG2D 리간드, PSMA 또는 ROR1의 항-유전자형 항체이다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-CD 19 항체에 특이적인 항개체특이형 항체에서 유래된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 또는 항-유전자형 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-메소텔린 항체에 특이적인 항-유전자형 항체에서 유래된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 또는 항-유전자형 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
수많은 항-유전자형 항체는 당해 기술에 공지되어 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/190273 및 Jena 등 PLOS One, 8:3 e57838 (2013)은, 현행 개발중인 수많은 CAR 작제물에서 사용되는, 항-CD19 scFv FMC63을 인식하는 항-유전자형 항체 (mAh 클론 번호 136.20.1)을 기재한다. mAh 클론 번호 136.20.1의 VH 및 VL의 서열은 표 5에서 제공된다 (서열번호: 1 및 2, 각각).
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-CD 19 항체에 특이적인 항-유전자형 항체에서 유래된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 또는, mAh 클론 번호 136.20.1로서 동일한 CDRs의 하나 이상 (즉 카밧 정의, 초티아 정의, 또는 카밧 및 초티아 정의의 조합을 사용하는, VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3의 하나 이상, 또는 모두)를 가질 수 있는, 항-유전자형 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-CD 19 항체에 특이적인 항-유전자형 항체에서 유래된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 또는, mAh 클론 번호 136.20.1로부터 하나 이상의 (예를 들어, 2) 가변 영역을 가질 수 있는, 항-유전자형 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-CD 19 항체에 특이적인 항-유전자형 항체에서 유래된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 또는, mAh 클론 번호 136.20.1과 동일한 에피토프에 결합하는, 항-유전자형 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
항-유전자형 항체의 다른 예는 AbD Serotec®로부터 상업적으로 입수가능한 것, 국제 특허 공개 번호 WO 2013/188864에서 기재된 항-CD22 항체에 특이적인 항-유전자형 항체, 국제 특허 공개 번호 WO 97/34636에서 기재된 항-CEA 항체에 특이적인 항-유전자형 항체, 미국 특허 번호 5,935,821에서 기재된 항-GD2 항체에 특이적인 항-유전자형 항체, 및 Jakka 등, Anticancer Research, 33:10, 4189-420 (2013)에서 기재된 항-NY-ESO-1 항체에 특이적인 항-유전자형 항체를 포함한다. 주문형 항-유전자형 항체는 또한 AbD Serotec®로부터 수득될 수 있다.
대안적으로, CD19 또는 다른 종양-관련 항원을 표적하는 항-유전자형 항체 내지 CARs는 Jena 등, PLOS One, 8:3 e57838 (2013)에서 기재된 방법에 따라 만들어질 수 있고, 항-유전자형 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 작제에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항원 결합에 관여되지 않는 CAR의 세포외 영역에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 CAR의 힌지 영역에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 의해 표적될 수 있는 네오-에피토프를 포함하는, scFv-CD28 또는 scFv-CD8 접합일 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 의해 표적될 수 있는 돌연변이된 (Fc-결합 무효) IgG CH2/3을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 힌지 영역은 항원-결합 폴리펩타이드 작제물에 의해 표적될 수 있는 Liu 등 (Nature Biotechnology, 34, 430-434 (2016))에 의해 기재된 바와 같이 스페이서 예컨대 Strep-tag II를 포함할 수 있다.
CAR 분자의 힌지 영역에 결합하는 항-CAR 항체의 예는, IgG4 CH2-CH3 힌지 영역에 결합하는, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/190273에서 기재된 2D3 항체이다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 IgG4 CH2-CH3 힌지 영역에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 IgG4 CH2-CH3 힌지 영역에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고 2D3과 동일한 CDRs (즉 VH CDR1, VH CDR2, CH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3의 하나 이상, 또는 모두)의 하나 이상을 갖거나, WO 2014/190273에서 기재된 바와 같이 2D3의 하나 이상의 (예를 들어, 2) 가변 영역을 갖는다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 IgG4 CH2-CH3 힌지 영역에 결합하는 그리고 WO 2014/190273에서 기재된 바와 같이 2D3과 동일한 에피토프에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역치료제는 조작된 TCR을 발현시키는 조작된 T-세포 또는 NK 세포이고 다중-특이적 항원-결합 작제물은 TCR의 세포외 일부를 결합시킨다.
원상태 TCRs는 2 상이한 단백질 쇄, 알파 및 베타 쇄를 포함한다. TCRalpha/베타 쌍은 CD3 엡실론, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 엡실론을 가진 복합체로 T-세포 표면에서 발현된다. 조작된 TCR에서, TCR의 원상태 알파 및 베타 쇄는 종양-관련 항원에 대하여 개선된 또는 신규한 특이성을 도입하도록 변형된다. 조작된 TCR이 알파 및 베타 쇄의 원상태 서열의 대부분을 보유함에 따라, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다중-특이적 항원-결합 작제물이 조작된 TCR 면역치료제를 표적하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 경우, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 전형적으로 TCR의 항원-결합 도메인을 표적할 것이다. 예를 들어, 면역치료제가 조작된 TCR을 포함하는 T-세포 또는 NK 세포인 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은, 상기 기재된 바와 같이, 항-유전자형 항체 또는 이의 단편에서 유래될 수 있다.
조작된 TCR의 비-항원 결합 영역에 결합하는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 일부 구현예에서, 예를 들어, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 표적될 수 있는 비-항원 결합 도메인에서 하나 이상의 비-원상태 서열을 조작된 TCR이 포함하는 경우 또한 고려된다. 일부 구현예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 조작된 TCR Valpha 또는 Vbeta 영역에 표적된다. 그와 같은 구현예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 또한 조작된 TCR V 영역 도메인이 또한 내인성 TCR 레퍼토리에서, 하지만 초저 빈도로 존재할 것임에 따라 원상태 TCRs에 결합할 수 있다.
TCRs가 MHC의 문맥에서 제시된 항원에 결합함에 따라, 조작된 TCRs는 세포내 종양-관련 항원에 표적될 수 있다. 세포내 종양-관련 항원의 예는, 비제한적으로, NY-ESO-1, MART-1, WT-1, HPV E6 또는 HPV E7에서 유래된 펩타이드를 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-TCR 유전자형 항체에서 유래되는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 여기서 TCR은, 예를 들어, NY-ESO, MART-1, WT-1, HPV-E6 또는 HPV-E7, 또는 그와 같은 항-TCR 유전자형 항체의 항원-결합 단편에서 유래된 펩타이드를 함유하는 MHC 복합체를 특이적으로 결합시킨다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 항-TCR 유전자형 (또는 클론형) 항체에서 유래된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 여기서 TCR은 NY-ESO, MART-1 또는 HPV-E6, 또는 그와 같은 항-TCR 유전자형/클론형 항체의 항원-결합 단편에서 유래된 펩타이드를 함유하는 MHC 복합체를 특이적으로 결합시킨다. 항-TCR 유전자형/클론형 항체는 당해 분야에서 공지되고, 비제한적으로, 6B11 (Montoya, 등, Immunology, 122(1): 1-14 (2007)) 및 KJI-26 (Haskins, 등, J Exp Med, 157(4): 1149-69 (1983))을 포함한다.
특정 구현예에서, 면역치료제는, T-세포에 그리고 종양-관련 항원에 결합할 수 있는, 치료제, 예컨대 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 치료제는 전형적으로 적어도 2 항원-결합 도메인을 포함하고, 이들 중 하나는 T-세포의 세포외 부분에 결합하고 다른 것은 종양-관련 항원에 결합한다. 그와 같은 치료제의 예는, 예를 들어, 이중특이적 T-세포 관여체 (BiTEs), 예컨대, CD3 및 CD 19를 표적하는, 블리노투무맙, 그리고 CD3 및 EpCAM을 표적하는, 솔리토맙, 그리고 다른 "T-세포 관여" 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 이들 구현예에 따르면, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 치료제의 항원-결합 도메인에 전형적으로 결합시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은, 상기 기재된 바와 같이, 항-유전자형 항체 또는 이의 단편에서 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 항-CD 19 항체 또는 항-EpCAM 항체에 특이적인 항-유전자형 항체, 또는 항-유전자형 항체의 항원-결합 단편에서 유래된다. 그와 같은 항-유전자형 항체의 예는 상기 기재된 것을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 면역치료제 표적된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은, 예를 들어, Fab 포멧, scFv 포멧 또는 sdAb 포멧을 포함하는, 다양한 공지된 포멧의 어느 하나일 수 있다. 특정 구현예에서, 면역치료제 표적된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab 또는 scFv 포멧일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역치료제 표적된 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 상기 기재된 바와 같이 비-면역글로불린 기반 항체 모방체 포멧일 수 있다.
종양-관련 항원
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 종양-관련 항원 (TAA)에 결합하는 적어도 하나의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 둘 이상의 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 다중-특이적 항원-결합 작제물이 둘 이상의 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 경우, 각각의 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물은 상이한 TAA를 결합시킬 수 있거나, TAA-결합 폴리펩타이드 작제물의 둘 이상은 동일한 TAA에서 상이한 에피토프를 결합시킬 수 있다. TAAs는 상기 정의되고 종양 세포 (종양-특이적 항원)에 의해서만 발현되는 항원, 뿐만 아니라 양쪽 종양 세포 및 정상 세포에서 발현되지만, 전형적으로 정상 세포에서 더 낮은 수준인 항원을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물용 표적으로서 TAA의 선택은 다중-특이적 항원-결합 작제물의 의도한 용도에 의존적일 것이다. 상기 기재된 바와 같이, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 TAA를 표적하는 면역치료제에 결합하고, TAA에 또한 자체 결합한다. 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 결합된 TAA 에피토프는 면역치료제에 의해 결합된 TAA 에피토프와 상이하다. 따라서, 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 면역치료제는 모두 동일한 TAA를 표적할 수 있지만 항원 분자에서 상이한 에피토프에 결합할 수 있거나, 이들은 상이한 TAAs를 표적할 수 있다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 면역치료제는 상이한 TAAs를 표적한다. 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 면역치료제에 의해 표적된 TAAs가 상이한 경우, 상이한 항원은 전형적으로 모두 동일한 유형의 암과 관련될 것이다. 그러나, 상이한 유형의 암과 관련되는 TAAs 표적화는 특정 구현예에서 또한 고려된다.
다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 표적될 수 있는 TAAs의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 17-1A-항원, 알파-태아단백 (AFP), 알파-악티닌-4, A3, A33 항체에 특이적인 항원, ART-4, B7, Ba 733, BAGE, bcl-2, bcl-6, BCMA, BrE3-항원, CA125, CAMEL, CAP-1, 탄산탈수소효소 IX (CAIX), CASP-8/m, CCL19, CCL21, CD1, CDla, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD70L, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD83, CD95, CD123, CD126, CD132, CD133, CD 138, CD 147, CD 154, CD171, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CEA, CEACAM5, CEACAM6, 보체 인자 (예컨대 C3, C3a, C3b, C5a 및 C5), 결장-특이적 항원-p (CSAp), c-Met, CTLA-4, CXCR4, CXCR7, CXCL12, DAM, 딕콥프-관련 단백질 (DKK), ED-B 파이브로넥틴, EGFR, EGFRvIII, EGP-1 (TROP-2), EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, EphA2, EphA3, 섬유모세포 활성화 단백질 (FAP), 섬유모세포 성장 인자 (FGF), Flt-1, Flt-3, 폴레이트 결합 단백질, 폴레이트 수용체, G250 항원, 강글리오사이드 (예컨대 GC2, GD3 및 GM2), GAGE, GD2, gplOO, GPC3, GRO-13, HLA-DR, HM1.24, 인간 융모성 성선자극호르몬 (HCG) 및 그것의 서브유닛, HER2, HER3, HMGB-1, 저산소증 유도성 인자 (HIF-1), FIF-1a, HSP70-2M, HST-2, Ia, IFN-감마, IFN-알파, IFN-베타, IFN-X, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL13Ralpha2, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-23, IL-25, ILGF, ILGF-1R, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), IGF-1R, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, KC4-항원, 살해-세포 면역글로불린-유사 수용체 (KIR), Kras, KS-1-항원, KS1-4, LDR/FUT, Leγ, 대식세포 이동 억제 인자 (MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, mCRP, MCP-1, 흑색종 당단백질, 메소텔린, MIP-1A, MIP-1B, MIF, 뮤신 (예컨대 MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5ac, MUC13, MUC16, MUM-1/2 및 MUM-3), NCA66, NCA95, NCA90, NY-ESO-1, PAM4 항원, 췌장 암 뮤신, PD-1, PD-L1, PD-1 수용체, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 전립선 산 포스파타제, PSA, PRAME, PSMA, P1GF, RS5, RANTES, SAGE, 5100, 서바이빈, 서바이빈-2B, T101, TAC, TAG-72, 테나스신, Thomson-Friedenreich 항원, Tn 항원, TNF-알파, 종양 괴사 항원, TRAG-3, TRAIL 수용체, VEGF, VEGFR 및 WT-1 (참조, 예를 들면, Sensi 등, Clin Cancer Res, 12:5023-32 (2006); Parmiani 등, J Immunol, 178:1975-79 (2007); Novellino 등, Cancer Immunol Immunother, 54:187-207 (2005)).
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 표적된 TAA는 혈액 암과 관련된 항원이다. 그와 같은 항원의 예는, 비제한적으로, BCMA, C5, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD38, CD40, CD45, CD52, CD56, CD66, CD74, CD79a, CD79b, CD80, CD138, CTLA-4, CXCR4, DKK, EphA3, GM2, HLA-DR 베타, 인테그린 αVβ3, IGF-R1, IL6, KIR, PD-1, PD-L1, TRAILR1, TRAILR2, 트랜스페린 수용체 및 VEGF를 포함한다. 일부 구현예에서, TAA는 악성 B 세포에 의해 발현된 항원, 예컨대 CD19, CD20, CD22, CD25, CD38, CD40, CD45, CD74, CD80, CTLA-4, IGF-R1, IL6, PD-1, TRAILR2 또는 VEGF이다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 표적된 TAA는 고형 종양과 관련된 항원이다. 그와 같은 항원의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: CAIX, 카드헤린, CEA, c-MET, CTLA-4, EGFR 패밀리 일원, EpCAM, EphA3, FAP, 폴레이트-결합 단백질, FR-알파, 강글리오사이드 (예컨대 GC2, GD3 및 GM2), HER2, HER3, IGF-1R, 인테그린 αVβ3, 인테그린 α5β1, Leγ, Liv1, 메소텔린, 뮤신, NaPi2b, PD-1, PD-L1, PD-1 수용체, pgA33, PSMA, RANKL, ROR1, TAG-72, 테나스신, TRAILR1, TRAILR2, VEGF, VEGFR, 및 상기 열거된 다른 것.
다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 표함된 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물(들)은, 예를 들어, Fab 포멧, scFv 포멧 또는 sdAb 포멧을 포함하여, 다양한 공지된 포멧의 어느 하나일 수 있다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물은 TAA용 천연 리간드, 또는 천연 리간드의 기능적 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 1 초과 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함한다. 그와 같은 구현예에서, TAA-결합 폴리펩타이드 작제물은, 도 1B에서 나타낸 바와 같이, 예를 들어, Fab-Fab, scFv-scFv 또는 Fab-scFv로서, 함께 연결될 수 있다. 다른 포멧은 예를 들어, 항원 결합 폴리펩타이드 작제물이 Fc의 상이한 부분에 연결되는 TAA를 표적하는 둘 이상의 항원 결합 폴리펩타이드 작제물 각각 및 Fc를 포함하는 다중-특이적 항원 결합 작제물을 포함하여, 또한 고려된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물은 Fab 또는 scFv 포멧, 또는 이의 조합이다.
특정 구현예에서, 항원-결합 폴리펩타이드 작제물은 TAA 또는 그것의 결합 도메인에 관한 공지된 항체 또는 항체의 단편에서 유래될 수 있다. 결합 도메인의 유형의 예는 Fab 단편, scFvs, 및 sdAbs를 포함한다. 게다가, 공지된 항-TAA 항체 또는 결합 도메인의 항원-결합 모이어티가 Fab이면, Fab는 scFv로 전환될 수 있다. 마찬가지로, 공지된 항-TAA 항체 또는 결합 도메인의 항원-결합 모이어티가 scFv이면, scFv는 Fab로 전환될 수 있다. 항원-결합 도메인의 유형 사이 전환의 방법은 당해 기술에 공지되어 있다 (참조, 예를 들어, Zhou 등, Mol Cancer Ther, 11:1167-1476 (2012)에서 기재된 scFv를 Fab 포멧으로 전환시키는 방법).
TAAs에 관한 공지된 항체는 수많은 공지된 공급원으로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 여러가지의 항체 분비 하이브리도마 주는 미국 종균 협회 (ATCC, Manassas, Va.)로부터 이용가능하다. 다양한 TAAs에 대한 수많은 항체는 ATCC에서 침착되어 왔고/왔거나 공개된 가변 영역 서열을 갖고 다중-특이적 항원-결합 작제물을 특정 구현예에서 제조하는데 사용될 수 있다. 숙련가는 다양한 TAAs에 대한 항체 서열 또는 항체-분비 하이브리도마가 ATCC, NCBI 및/또는 USPTO 데이터베이스의 단순 검색에 의해 수득될 수 있다는 것을 인정할 것이다.
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물 제조에서 사용될 수 있는 특정 TAA-표적된 항체는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: LL1 (항-CD74), LL2 또는 RFB4 (항-CD22), 벨투주맙 (hA20, 항-CD20), 리툭수맙 (항-CD20), 오비누투주맙 (GA101, 항-CD20), 다라투무맙 (항-CD38), 람브롤리주맙 (항-PD-1 수용체), 니볼루맙 (항-PD-1 수용체), 이필리무맙 (항-CTLA-4), RS7 (항-TROP-2), PAM4 또는 KC4 (둘 모두 항-뮤신), MN-14 (항-CEA), MN-15 또는 MN-3 (항-CEACAM6), Mu-9 (항-결장-특이적 항원-p), Immu 31 (항-알파-태아단백), R1 (항-IGF-1R), A19 (항-CD 19), TAG-72 (예를 들면, CC49), Tn, J591 또는 HuJ591 (항-PSMA), AB-PG1-XG1-026 (항-PSMA 이량체), D2/B (항-PSMA), G250 (항-탄산탈수소효소 IX), L243 (항-HLA- DR) 알렘투주맙 (항-CD52), 베바시주맙 (항-VEGF), 세툭시맙 (항-EGFR), 젬투주맙 (항-CD33), 이브리투모맙 티욱세탄 (항-CD20); 파니투무맙 (항-EGFR); 토시투모맙 (항-CD20); PAM4 (클리바투주맙으로도 불림, 항-뮤신), 트라스투주맙 (항-HER2), 페르투주맙 (항-HER2), 폴라투주맙 (항-CD79b) 및 아네투맙 (항-메소텔린).
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원 결합 작제물에 의해 포함된 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물은 공지된 항체의 인간화된, 또는 키메라 버전에서 유래된다.
비-인간 (예를 들면 설치류) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수령체의 초가변 영역으로부터 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터 잔기에 의해 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다. 일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개량하기 위해 만들어진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 및 전형적으로 둘의, 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이고, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FRs는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함할 수 있다. 추가 세부사항에 대하여, 참조 Jones 등, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
대안적으로, 관심의 특정 표적 TAA에 대한 항체는 표준 기술에 의해 생성될 수 있고 다중-특이적 항원-결합 작제물의 TAA-결합 폴리펩타이드 작제물(들)의 제조용 기초로서 사용될 수 있다.
다중-특이적 항원-결합 작제물의 제조 방법
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 당해 분야에서 공지된 표준 재조합 방법을 사용하여 생산될 수 있다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 4,816,567 및 "Antibodies: A Laboratory Manual", 2nd Edition, Ed. Greenfield, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2014).
전형적으로, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 재조합 생산을 위하여, 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산은 단리되고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터 속에 삽입된다. 그와 같은 핵산은 쉽게 단리될 수 있고 종래의 절차를 이용하여 (예를 들면 다중-특이적 항원-결합 작제물의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 서열분석될 수 있다.
항원-결합 작제물-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현용 적합한 숙주 세포는 본 명세서에서 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는, 삽입을 위하여 사용된 방법, 예를 들어, 직접적인 흡수, 형질도입, f-메이팅, 또는 재조합 숙주 세포를 창출하기 위해 당해 분야에서 공지된 다른 방법과 무관하게, 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 비통합된 벡터, 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 대안적으로, 숙주 게놈 속에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "진핵생물"은 계통발생적 도메인 유카리아 예컨대 동물 (비제한적으로, 포유동물, 곤충, 파충류 및 새 포함), 섬모체, 식물 (비제한적으로, 외떡잎식물, 쌍떡잎식물 및 조류 포함), 진균, 효모, 플라겔레이트, 마이크로스포리디아, 원생생물, 및 기타 동종에 속하는 유기체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "원핵생물"은 원핵 유기체를 지칭한다. 예를 들어, 비-진핵 유기체는 진정박테리아 (비제한적으로, 에스케리치아 콜라이, 테르무스 써모필루스, 바실러스 스테아로테르모필루스, 슈도모나스 플루오레스센스, 슈도모나스 에어루기노사, 슈도모나스 푸티다, 및 기타 동종 포함) 계통발생적 도메인, 또는 고세균 (비제한적으로, 메타노코커스 얀나쉬이, 메타노박테리움 써모아우토트로피쿰, 할로박테리움 예컨대 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아차에오글로버스 풀기더스, 파이로코쿠스 푸리오서스, 파이로코쿠스 호리코쉬이, 아에우로피룸 페르닉스, 및 기타 동종 포함) 계통발생적 도메인에 속할 수 있다.
예를 들어, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 특히 당화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서 항원-결합 작제물 단편 및 폴리펩타이드의 발현을 위하여, 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523. (참조 또한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254, E. 콜리에서 항체 단편의 발현 기재). 발현후, 항원-결합 작제물은 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물 예컨대 사상균 또는 효모는, 부분적으로 또는 완전하게 인간 당화 패턴을 가진 항원-결합 작제물의 생산을 초래하는, 당화 경로가 "인간화된" 진균 및 효모 균주를 포함하여, 다중-특이적 항원-결합 작제물-인코딩 벡터용 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조 Gemgross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li 등, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
당화된 항원-결합 작제물의 발현용 적합한 숙주 세포는 다중세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)에서 또한 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루지페르다 세포의 형질감염을 위하여 사용될 수 있는 수많은 바큘로바이러스 균주는 확인되어 왔다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항원-결합 작제물 생산용 PLANTIBODIES™ 기술 기재).
척추동물 세포는 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주는 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는 하기이다: SV40 (COS-7)에 의해 전환된 원숭이 신장 CV1 주; 인간 배아 신장 주 (예를 들면, Graham 등, J. Gen Virol., 36:59 (1977)에서 기재된 바와 같이, 293 또는 293 세포); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, Biol Reprod, 23:243-251 (1980)에서 기재된 바와 같이, TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 갯과 신장 세포 (MDCK); 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들면, Mather 등, Annals N.Y. Acad Sci, 383:44-68 (1982)에서 기재된 바와 같이, TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는, DHFR CHO 세포 (Urlaub 등, Proc Natl Acad Sci USA, 77:4216 (1980))을 포함하는, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주 예컨대 YO, NSO 및 Sp2/0을 포함한다. 항원-결합 작제물 생산에 적합한 특정 포유류 숙주 세포주의 검토를 위하여, 참조, 예를 들면, Yazaki & Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003).
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 예정된 비로, 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산으로 적어도 하나의 안정한 포유류 세포의 형질감염, 및 적어도 하나의 포유류 세포에서 핵산의 발현을 포함하는 방법에 의해 안정한 포유류 세포에서 생산된다. 일부 구현예에서, 핵산의 예정된 비는 발현된 생성물에서 다중-특이적 항원-결합 작제물의 최고 백분율을 초래하는 투입 핵산의 상대 비를 결정하기 위해 일시적 형질감염 실험에서 결정된다.
일부 구현예에서, 안정한 포유류 세포에서 다중-특이적 항원-결합 작제물의 생산 방법에서, 안정한 포유류 세포의 발현 생성물은 모노머성 중쇄 또는 경쇄 폴리펩타이드, 또는 다른 항체와 비교된 경우 원하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 더 큰 백분율을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 당화된다.
일부 구현예에서, 안정한 포유류 세포에서 다중-특이적 항원-결합 작제물의 생산 방법에서, 상기 방법은 추가로 원하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 확인 및 정제를 포함한다. 일부 구현예에서, 확인은 액체 크로마토그래피 및 질량 분광분석법의 한쪽 또는 양쪽에 의한 것이다.
필요하다면, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 발현 후 정제 또는 단리될 수 있다. 단백질은 당해 분야의 숙련가에 공지된 여러가지의 방식으로 단리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은, 시스템 예컨대 FPLC 및 HPLC를 이용하여 대기압에서 또는 고압에서 수행된, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화도, 크기조정 또는 겔 여과, 및 역상을 포함하는, 크로마토그래피 기술을 포함한다. 정제 방법은 또한 전기영동, 면역학적, 침전, 투석, 및 크로마토포커싱 기술을 포함한다. 단백질 농도와 함께, 한외여과 및 정용여과 기술은 또한 유용하다. 당해 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 여러가지의 천연 단백질은 Fc 및 항체를 결합시키고, 이들 단백질은 항원-결합 작제물의 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 단백질 A 및 G는 Fc 영역에 결합한다. 마찬가지로, 박테리아 단백질 L은 일부 항체의 Fab 영역에 결합한다. 정제는 종종 특정 융합 파트너에 의해 가능해질 수 있다. 예를 들어, 항체는 GST 융합이 이용되면 글루타티온 수지, His-태그가 이용되면 Ni+2 친화도 크로마토그래피, 또는 플래그-태그가 사용되면 고정된 항-플래그 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술에서 일반적인 안내를 위하여, 참조, 예를 들면, Protein Purification: Principles and Practice, 3rdEd., Scopes, Springer-Verlag, NY (1994). 필요한 정제의 정도는 항원-결합 작제물의 사용에 의존하여 다양할 것이다. 일부 사례에서, 정제는 필요없을 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 비제한적으로, Q-세파로스, DEAE 세파로스, poros HQ, poros DEAF, Toyopearl Q, Toyopearl QAE, Toyopearl DEAE, Resource/Source Q 및 DEAE, Fractogel Q 또는 DEAE 칼럼, 또는 그것의 등가물 또는 비교할만한 것에서 크로마토그래피를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 비제한적으로, SP-세파로스, CM 세파로스, poros HS, poros CM, Toyopearl SP, Toyopearl CM, Resource/Source S 또는 CM, 또는 Fractogel S 또는 CM 칼럼, 또는 그것의 등가물 또는 비교할만한 것에서 크로마토그래피를 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 실질적으로 순수하다. 용어 "실질적으로 순수한" (또는 "실질적으로 정제된")은, 그것의 자연 발생 환경에서, 즉 원상태 세포, 또는 재조합으로 생산된 작제물의 경우에 숙주 세포에서 발견된 경우 단백질을 정상적으로 동반하거나 상기와 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없을 수 있는, 본 명세서에서 기재된 작제물, 또는 이의 변이체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 세포 물질이 실질적으로 없는 작제물은 오염 단백질의 (건조 중량 기준으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만을 가진 단백질의 제제를 포함한다. 작제물이 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은 특정 구현예에서 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 또는 미만 존재한다. 작제물이 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되는 경우, 단백질은, 특정 구현예에서, 배양 배지에서 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L, 또는 약 1 mg/L 또는 미만으로 존재한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 이종이량체 Fc를 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물에 적용된 경우 용어 "실질적으로 정제된"은 이종이량체 Fc가 적절한 방법 예컨대 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, 크기-배제 크로모타그래피 (SEC) 및 모세관 전기영동에 의해 결정된 바와 같이 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%의 순도 수준, 특이적으로, 적어도 약 75%, 80%, 85%의 순도 수준, 및 더욱 특이적으로, 적어도 약 90%의 순도 수준, 적어도 약 95%의 순도 수준, 적어도 약 99% 또는 초과의 순도 수준을 갖는 것을 의미한다.
다중-특이적 항원-결합 작제물은 또한 당해 분야에서 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (참조, 예를 들면, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y (1983), 및 Hunkapiller 등, Nature, 310:105-111 (1984)). 예를 들어, 폴리펩타이드의 단편에 상응하는 폴리펩타이드는 펩타이드 합성기의 사용으로 합성될 수 있다. 게다가, 요망하는 경우, 비고전적 아미노산 또는 화학 아미노산 유사체는 폴리펩타이드 서열 속에 치환 또는 부가로서 도입될 수 있다. 비-고전적 아미노산은, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4-디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, 4아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플루오로-아미노산, 맞춤 아미노산 예컨대 α-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체 일반.
본 개시내용의 특정 구현예는 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 그와 같은 핵산은 다중-특이적 항원-결합 작제물 (예를 들면 항원-결합 작제물의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다.
특정 구현예는 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들면 발현 벡터)에 관한 것이다. 핵산은 단일 벡터에 의해 포함될 수 있거나 1 초과 벡터에 의해 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 멀티시스트론성 벡터에 의해 포함된다.
특정 구현예는 그와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포 또는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다 (예를 들면 상기로 형질전환되어 왔다). 일부 구현예에서, 숙주 세포는 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항원-결합 폴리펩타이드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들면 상기로 형질전환되어 왔다). 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵성, 예를 들면 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 또는 림프양 세포 (예를 들면 Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
특정 구현예는 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산이, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 발현에 적합한 조건 하에서, 도입된 숙주 세포를 배양하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 제조 방법, 및 임의로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 다중-특이적 항원-결합 작제물의 회수 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 특정 구현예는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 T-세포 또는 NK-세포에서 CAR 또는 조작된 TCR의 공-발현에 관한 것이다. T-세포에서 항체 및 CAR의 공-발현 방법은 당해 기술에 공지되어 있다 (참조, 예를 들어, 국제 특허 공개 번호 WO 2014/011988).
따라서, 일부 구현예는 CAR 또는 조작된 TCR을 인코딩하는 핵산, 및 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T-세포 또는 NK-세포에 관한 것이다. 일부 구현예는, 세포 속에 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산 그리고 CAR 또는 조작된 TCR을 인코딩하는 핵산의 도입, 및 CAR 또는 조작된 TCR 및 다중-특이적 항원-결합 작제물의 발현에 적합한 조건 하에서 세포의 배양을 포함하는, T-세포 또는 NK-세포에서 CAR 또는 조작된 TCR 그리고 본 명세서에서 기재된 바와 같이 다중-특이적 항원-결합 작제물의 공-발현 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, CAR 또는 조작된 TCR을 인코딩하는 핵산, 및 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산은 각각 벡터의 형태이다.
번역후 변형
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 번역후 또는 동안 차등적으로 변형될 수 있다.
용어 "변형된"은, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 주어진 폴리펩타이드에 실시된 임의의 변화, 예컨대 폴리펩타이드의 길이, 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 화학 구조, 공-번역 변형, 또는 번역후 변형에 대한 변화를 지칭한다.
용어 "번역후에 변형된"은 폴리펩타이드 쇄 속에 편입된 후 그와 같은 아미노산에 발생하는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 상기 용어는, 단지 예로써, 공-번역 생체내 변형, (예컨대 무세포 번역 시스템에서) 공-번역 시험관내 변형, 번역후 생체내 변형, 및 번역후 시험관내 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 변형 예컨대 당화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 항체 분자 또는 항원-결합 작제물 또는 다른 세포 리간드에 대한 단백분해 절단 또는 연결, 또는 이들 변형의 조합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 비제한적으로, 시아노겐 브로마이드, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제 또는 NaBH4에 의한 특정 화학 절단; 아세틸화; 포르밀화; 산화; 투니카마이신의 존재 하에서 환원 또는 대사성 합성을 포함하는 공지된 기술에 의해 화학적으로 변형될 수 있다.
항원-결합 작제물의 추가의 선택적인 번역후 변형은, 예를 들어, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 쇄, N-말단 또는 C-말단 단부의 가공, 아미노산 골격에 화학 모이어티의 부착, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 쇄의 화학 변형, 및 원핵 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 또는 결실을 포함한다. 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 임의로 단백질의 검출 및 단리를 허용하기 위해 검출가능한 표지, 예컨대 효소, 형광, 동위원소 또는 친화도 표지로 변형될 수 있다. 적합한 효소 표지의 예는 홀스래디쉬 페록시다아제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결기 복합체의 예는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 예는 엄벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린을 포함하고; 발광성 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라아제, 루시페린 또는 에쿼린을 포함하고; 적합한 방사선활성 물질의 예는 요오드, 탄소, 황, 삼중수소, 인듐, 테크네튬, 탈륨, 갈륨, 팔라듐, 몰리브데늄, 크세논 또는 불소를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 라디오메탈 이온과 회합하는 거대환형 킬레이터에 부착될 수 있다.
다중-특이적 항원-결합 작제물이, 어느 한쪽 자연적 과정, 예컨대 번역후 가공에 의해, 또는 화학 변형 기술에 의해, 변형되는 구현예에서, 동일한 유형의 변형은 임의로 주어진 폴리펩타이드에서 몇 개의 부위에 동일한 또는 가변 정도로 존재할 수 있다. 변형은 하기를 포함한다: 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합, 헴 모이어티의 공유결합, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합, 포스포티딜이노시톨의 공유결합, 교차-가교, 고리화, 디설파이드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 교차-결합의 형성, 시스테인의 형성, 파이로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카복실화, 당화, GPI 앵커 형성, 하이드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길화, 단백분해 가공, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 아미노산의 전달-RNA 매개된 첨가 예컨대 아르기닐화, 및 유비퀴틴화 (참조, 예를 들면, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); Post-Translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter 등, Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan 등, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 본 명세서에서 기재된 단백질에 의해 결합되거나, 상기에 결합하거나, 상기와 회합하는 폴리펩타이드의 정제 또는 면역검정에 특히 유용할 수 있는, 고형 지지체에 부착될 수 있다. 그와 같은 고형 지지체는, 비제한적으로, 유리, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리염화비닐 또는 폴리프로필렌을 포함한다.
다중-특이적 항원-결합 작제물 시험
다중-특이적 항원 결합 작제물은 당해 분야에서 공지된 프로토콜 및 표준 검정을 사용하여 상기 표적 면역치료제 및 종양-관련 항원(들)에 결합하는 그것의 능력에 대하여 시험될 수 있다. 그와 같은 검정 및 프로토콜은, 예를 들어, ELISA-기반된 검정 및 표면-플라즈몬 공명 (SPR) 기술을 포함한다. 표적 CAR 또는 재조합 TCR을 발현시키는 세포는 (예를 들어, ProMab Biotechnologies Inc., Richmond, CA로부터, 또는 Creative Biolabs, Shirley, NY로부터) 상업적으로 구매될 수 있거나 표준 기술에 의해 제조될 수 있다 (참조, 예를 들어, Yam 등, Mol. Ther. 5:479 (2002); 및 국제 특허 공개 번호 WO 2015/095895). 다양한 표적 종양-관련 항원을 발현시키는 세포주는 상업적으로 또한 이용가능하다.
다중-특이적 항원-결합 작제물은 상기 표적 종양-관련 항원을 발현시키는 종양 세포에 상기 표적 면역치료제를 재유도하는 그것의 능력에 대하여 추가로 시험될 수 있다. 예를 들어, 면역치료제가 조작된 T-세포 또는 NK 세포를 포함하는 경우, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 접촉된 후 T-세포 또는 NK 세포의 기능적 반응은 당해 분야에서 공지된 표준 검정을 사용하여 시험관내 평가될 수 있다. 일부 예시적인 검정은 실시예에서 제공되고 아래 기재된다.
예를 들어, 조작된 T-세포 또는 NK 세포로부터 사이토카인 방출은 다중-특이적 항원-결합 작제물의 존재 또는 부재 하에서 종양-관련 항원-발현을 가진 조작된 세포 및 대조군 세포의 인큐베이션 이후 평가될 수 있다. 적절한 시간 동안 공-배양된 세포의 인큐베이션 후, 상청액은 수집될 수 있고 IFN-γ, TNF-알파 및/또는 IL-2의 수준은, 예를 들어 다양한 사이토카인 면역검정 (Luminex®) 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다. T-세포 또는 NK 세포에 의한 사이토카인 방출은 세포 활성화의 지표이고 세포독성과 상관관계하기 위해 당해 분야에서 공지된다 (참조, 예를 들어, Kochenderfer, 등, J Immunother, 32(7):689-702 (2009); Lanitis, 등, Molec Ther, 20(3):633-643 (2012) 및 Mardiros, 등, Blood, 122(18):3138-3148 (2013)).
T-세포 또는 NK 세포의 세포용해 활성은 또한 임의로, 예를 들어, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 가변 농도의 존재 및 부재 하에서 상기 표적 종양 세포 및 조작된 T-세포 또는 NK 세포의 인큐베이팅에 의해 평가될 수 있다. 인큐베이션 이후, 표적 종양 세포의 용해는 다양한 기술, 예컨대 유세포측정, 51Cr 방출, 형광측정법, 또는 동력학 생존력 플랫폼 (예컨대 Xcelligence (Acea))로 모니터링될 수 있다.
조작된 T-세포 또는 NK 세포의 증식은 또한 표적 종양-관련 항원 및 다중-특이적 항원-결합 작제물을 발현시키는 모든 세포로 인큐베이션 이후 평가될 수 있다. 예를 들어, 조작된 T-세포 또는 NK 세포는 적절한 표지, 예컨대 카복시플루오레신 석신미딜 에스테르 (CFSE)로 표지될 수 있고, T-세포 또는 NK 세포의 증식은 유세포측정에 의해 평가될 수 있다.
다중-특이적 항원-결합 작제물의 생체내 효과는 또한 표준 기술로 평가될 수 있다. 예를 들어, 조작된 세포의 입양 전달 및 환자-유래된 이종이식 (PDX) 종양 모델 동물 대상체에 다중-특이적 항원-결합 작제물의 투여 이후 종양 모니터링에 의해. 다양한 PDX 종양 모델은 상업적으로 이용가능하고 적절한 모델은 이용되는 상기 표적 종양-관련 항원에 기반하여 숙련가에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 조작된 T-세포 또는 NK 세포는 종양 생착후 동물에 투여될 수 있고 그 다음 다중-특이적 항원-결합 작제물은 적절한 기간 후 투여될 수 있다. 다중-특이적 항원-결합 작제물은 정맥내로 (i.v.), 복강내로 (i.p.) 또는 피하로 (s.c.) 투여될 수 있다. 투약 계획 및 양은 다양하지만, 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 예시적인 투약량은 매주 1회 10 mg/kg일 것이다. 종양 성장은 표준 절차로 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 표지된 종양 세포가 사용된 경우, 종양 성장은 적절한 이미지형성 기술로 모니터링될 수 있다. 고형 종양에 대하여, 종양 크기는 또한 캘리퍼스로 측정될 수 있다.
T-세포 및 종양-관련 항원, 예컨대 이중특이적 T-세포 관여체 (BiTEs)에 결합할 수 있는 치료제인 면역치료제를 재유도하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 능력은 제제가 T-세포를 관여시키기 위해 치료제로 T-세포의 제1 사전-치료, 그 다음 다중-특이적 항원-결합 작제물과 세포의 접촉에 의해 시험될 수 있다. 세포독성, 사이토카인 방출 및 T-세포의 증식은 그 다음 상기 기재된 바와 같이 동일한 방법을 사용하여 분석될 수 있다.
약제학적 조성물
특정 구현예는 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되되는 것 또는 미국 약전 또는 동물에서, 그리고 더 상세하게는 인간에서 사용을 위하여 다른 일반적으로 인식된 약전에서 열거되는 것을 의미한다.
용어 "캐리어"는, 작제물이 투여되는 것과 함께, 희석제, 아쥬반트, 부형제, 비히클, 또는 이의 조합을 지칭한다. 그와 같은 약제학적 캐리어는, 석유, 동물, 야채 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 광유, 참께 오일 및 기타 동종을 포함하는, 멸균된 액체, 예컨대 물 및 오일일 수 있다. 일부 측면에서, 캐리어는 자연에서 발견되지 않는 인조 캐리어이다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우 캐리어로서 사용될 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한, 특히주사가능 용액용, 액체 캐리어로서 이용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 기타 동종을 포함한다. 조성물은, 요망하는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 적합한 약제학적 캐리어의 예는 E. W. Martin 저 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에서 기재된다.
약제학적 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속-방출 제형 및 기타 동종의 형태일 수 있다. 조성물은, 전통적 결합제 및 캐리어 예컨대 트리글리세라이드와, 좌약으로서 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 캐리어 예컨대 약품 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산마그네슘, 및 기타 동종을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은, 환자에게 적절한 투여용 형태를 제공하기 위해 캐리어의 적합한 양과 함께, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제형은 투여의 방식을 적합하게 할 수 있다.
특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물을 포함하는 조성물은 인간에게 정맥내 투여에 적합한 약제학적 조성물로서 일상적인 절차에 따라 제형화된다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균된 등장의 수성 완충액에서 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위해 가용화제 및 국부 마취약 예컨대 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 어느 한쪽 별도로 공급되거나 단위 투약 형태에서, 예를 들어, 활성제의 양을 나타내는 용융밀봉된 컨테이너 예컨대 앰풀 또는 샤세트에서 무수 농축물 또는 건조 동결건조된 분말로서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 멸균된 약품 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 염수의 앰풀은 성분이 투여에 앞서 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 조성물은 중성 또는 염 형태로서 제형화된다. 약제학적으로 허용가능한 염은 음이온으로 형성된 것 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 등에서 유래된 것, 그리고 양이온으로 형성된 것 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제이철 하이드록사이드 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인, 및 기타 동종에서 유래된 것을 포함한다.
다중-특이적 항원-결합 작제물의 사용 방법
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 그것의 동족 항원 또는 에피토프와 상이한 에피토프 또는 종양 세포 항원에 결합하도록 표적 면역치료제를 재유도하는데 사용될 수 있다. 이러한 문맥에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물에 의해 포함된 종양-관련 항원 표적된 항원-결합 도메인은 면역치료제에 의해 포함된 항원-결합 도메인에 대체 항원-결합 도메인을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 표적 종양 세포는 면역치료제에 의해 표적된 종양-관련 항원의 발현을 손실, 돌연변이, 번역후에 변형 또는 하향-조절되었을 수 있고, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 따라서 면역치료제가 종양 세포에 결합할 수 있는 대체 항원-결합 도메인을 제공한다. 대체 항원-결합 도메인은 상기 표적 종양 세포에서 상이한 종양-관련 항원에 결합할 수 있거나, 상이한 에피토프에서 동일한 종양-관련 항원에 결합할 수 있다.
특정 구현예는, 따라서, 대체 종양 항원에 대한 종양-관련 항원 특정 면역치료제의 재유도 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 그와 같은 재유도는 항원 하향조절 및/또는 신생물성 세포 불균질성을 포함하는 종양 세포에서 공통 치료 저항 기전을 극복하는데 도움이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 종양 세포에 결합하기 위한 상기 표적 면역치료제의 능력을 증가시키는데 사용될 수 있다. 이러한 문맥에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 상기 표적 종양 세포에서 종양-관련 항원을 결합시키는 추가의 항원-결합 도메인을 제공한다. 추가의 항원-결합 도메인은 상기 표적 종양 세포에서 상이한 종양-관련 항원에 결합할 수 있거나, 상이한 에피토프에서 동일한 종양-관련 항원에 결합할 수 있다.
특정 구현예는 면역치료제의 치료 효과를 연장시키기 위한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 사용 방법에 관한 것이다. 특정 구현예는 면역치료제의 치료 효과를 개선시키기 위한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 사용 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 효과적인 면역치료제 치료의 가능성을 증가시키기 위해 면역치료제로 치료를 현재 경험하는 환자에게 투여될 수 있다. 그와 같은 치료로부터 유익할 환자는, 예를 들어, 저 수준의 면역치료제 표적 종양-관련 항원을 나타내는 환자, 또는 면역치료제 표적 종양-관련 항원의, 손실의 위험, 변형 또는 발현에서 감소가 있는 환자, 또는 면역치료제 표적 종양-관련 항원의 발현에서 상당한 불균질성을 나타내는 환자를 포함할 것이다. 이러한 문맥에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 면역치료제와 동시에 투여될 수 있거나 면역치료제의 투여에 후속적으로 투여될 수 있다. 다중-특이적 항원-결합 작제물의 그와 같은 후속적인 투여는 면역치료제의 투여를 의미하고 다중-특이적 항원-결합 작제물은, (예를 들어 분 또는 시간의 정도로) 짧을 수 있거나 (예를 들어 일 또는 주의 정도로) 연장될 수 있는, 정의된 기간만큼 분리된다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은, 예를 들어 면역치료제 표적 종양-관련 항원의 발현의 저 수준 또는 손실로 인해, 치료에 반응하는데 실패하였거나 재발하였던 환자 그리고 면역치료제로 치료를 이전에 경험하였던 환자에 투여될 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물의 투여에 의한 면역치료제의 재유도는 면역치료제의 치료 효과를 개시 또는 재개하는 것으로 기대된다.
특정 구현예는, 환자에게 다중-특이적 항원-결합 작제물 투여를 포함하는, 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 암의 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 환자는 면역치료제로 사전 치료를 받았다. 그와 같은 구현예에서, 환자는 면역치료제로 사전 치료를 실패하였을 수 있거나 상기로부터 재발하였을 수 있다.
일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물로 치료에 가장 반응할 것 같은 환자는 면역치료제에 의해 표적된 종양-관련 항원의 발현 평가 및/또는 사전 면역요법의 지속성을 나타내는 적절한 바이오마커의 존재 평가에 의해 확인될 수 있다. 적절한 바이오마커의 평가는, 예를 들어, T-세포 또는 NK 세포에서 CAR 또는 유전자도입 TCR의 직접 검출, 증가된 활성화된 메모리 T-세포의 검출, 또는 B 세포-표적된 면역요법에서 약동학적 마커 예컨대 적은 건강한 B 세포 수의 검출을 포함할 수 있다. 면역치료제에 의해 표적된 종양-관련 항원의 감소된 신생물성 세포 발현 및 사전 면역요법 지속성의 증거를 갖는 환자는 다중-특이적 항원-결합 작제물로 치료에 더욱 반응할 것 같다.
많은 현행 면역요법은 혈액 암의 치료에서 사용된다. 따라서, 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 혈액 암의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 혈액 암의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 급성 백혈병, 예를 들어, B-세포 급성 림프양 백혈병 (BALL), T-세포 급성 림프양 백혈병 (TALL), 소림프구성 백혈병 (SLL), 급성 림프양 백혈병 (ALL) 또는 급성 골수성 백혈병 (AML); 만성 백혈병, 예를 들어, 만성 골수성 백혈병 (CML) 또는 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 맨틀 세포 림프종 (MCL), B 세포 전림프구성 백혈병, 아구성 형질세포양 수지상 세포 신생물, 버킷 림프종, 미만성 큰 B 세포 림프종 (DLBCL) (예를 들면 T-세포/조직구 풍부 큰 B-세포 림프종, CNS의 일차 DLCBL, 일차 피부 DLBCL 다리 유형, 또는 노인성 EBV+ DLBCL), 만성 염증과 관련된 DLBCL, 여포성 림프종, 소아 여포성 림프종, 털이 많은 세포 백혈병, 소 세포- 또는 대 세포-여포성 림프종, 악성 림프증식성 병태, 맥아 림프종 (점막-관련 림프양 조직의 결절외 변연부 림프종), 변연부 림프종, 다발성 골수종, 골수이형성증 및 골수이형성 증후군, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 형질모세포 림프종, 형질세포양 수지상 세포 신생물, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 비장 변연부 림프종, 비장 림프종/백혈병 (예를 들면 분류불능), 비장 확산 적색 속질 소 B-세포 림프종, 털이 많은 세포 백혈병-변이체, 림프형질세포 림프종, 중쇄 질환 (예를 들면 알파 중쇄 질환, 감마 중쇄 질환, 또는 뮤 중쇄 질환), 혈장 세포 골수종, 단독골 형질세포종, 골외적 형질세포종, 결절 변연부 림프종, 소아 결절 변연부 림프종, 일차 피부 소포 중심 림프종, 림프종모양 육아종증, 일차 종격 (흉선) 대 B-세포 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, ALK+ 대 B-세포 림프종, HHV8-관련 다중심 캐슬만 질환에서 발생하는 대 B-세포 림프종, 일차 삼출 림프종, B-세포 림프종, 또는 (예를 들면, DLBCL과 버킷 림프종 사이 피쳐 중간체 또는 DLBCL과 고전적 호지킨 림프종 사이 중간체를 가진) 분류불능 혈액 암.
면역요법은 또한 고형 종양의 치료에서 증가 용도를 찾는 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 고형 종양의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 통상적으로 발생하는 고형 종양의 예는, 비제한적으로, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장, 두경부, 신장, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 위 및 자궁의 암, 뿐만 아니라 비-소 세포 폐 암 및 결장직장 암을 포함한다. 다양한 형태의 림프종은 또한 고형 종양의 형성을 초래할 수 있고, 따라서, 또한 고형 종양인 것으로 종종 간주된다.
특정 구현예는 CAR 또는 TCR을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포를 활성화시키기 위해 종양-관련 항원 그리고 CAR 또는 TCR에 결합하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 사용 방법에 관한 것이다. T-세포 또는 NK 세포의 활성화는 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, TNF-알파 및/또는 IL-2의 방출, 및/또는 종양-관련 항원을 발현시키는 세포에 대한 세포독성을 초래할 수 있다. 상기 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 수행될 수 있다.
투여
다양한 투여 방식, 예를 들어, 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식 또는 이식은 환자에게 다중-특이적 항원-결합 작제물의 투여에 적합하다. 다중-특이적 항원-결합 작제물의 투여의 적절한 방식 및 경로는 치료되는 병태 및 환자를 고려하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 환자에게 피하로, 진피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내, 근육내로, 정맥내로 (i.v.) 또는 복강내로 투여될 수 있다. 전형적으로, 암의 치료에서, 치료 화합물은, 예를 들어, 환자의 혈류 속에 볼러스 주사 또는 연속 주입으로, 환자에게 전신으로 투여된다.
다중-특이적 항원-결합 작제물이 CAR 또는 조작된 TCR로 T-세포 또는 NK 세포에서 공-발현되는 특정 구현예에서, 하기 중 적어도 하나는 환자에게 세포 투여에 앞서 시험관내 발생한다: i) 세포의 팽창, ii) CAR 또는 TCR을 인코딩하는 핵산 그리고 세포 속에 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산의 도입, 및/또는 iii) 세포의 동결보존. 그와 같은 생체외 절차는 당해 기술에 공지되어 있다. 간단히, 단리된 T-세포 또는 NK 세포는 CAR 또는 TCR 및 다중-특이적 항원-결합 작제물을 발현시키는 벡터를 도입하기 위해 표준 시험관내 형질도입 또는 형질감염 기술로 유전자적으로 변형된다. 전형적으로, 세포는 치료받는 환자로부터 단리된다 (즉 세포는 자가조직성이다). 그러나, 특정 구현예는 환자에 관하여 동종이계, 동계의 또는 이종발생성인 세포의 용도를 고려한다.
표준 방법을 사용하여 생체외 팽창된 변형된 세포는 당해 기술에 공지되어 있다 (참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,199,942에서 기재된 조혈 줄기 및 선조 세포의 팽창용 절차). 전형적으로, T-세포의 생체외 배양 및 팽창은 PBMCs 수집 및, 임의로, 대상체로부터 T-세포 정제를 포함한다. T-세포는 미토겐성 및, 임의로, 분화 자극제의 조합, 예를 들어 외인성 사이토카인 예컨대 IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21을 가진 항-CD3/CD28 비드를 사용하여 팽창된다 (Singh, 등, Cancer Res, 71 (10):3516-27 (2011)). 일부 경우에, CD34+ 조혈 줄기 및 선조 세포는 말초 혈액 수확 또는 골수 외식편에서 포유동물로부터 단리되고, 그와 같은 세포는, 미국 특허 번호 5,199,942에서 기재된 바와 같이, 적절한 세포 성장 인자를 포함하는 배지에서 생체외 팽창된다. 다른 인자 예컨대 Flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-키트 리간드는 세포의 배양 및 팽창에 임의로 사용될 수 있다.
변형된 및 팽창된 세포는 그 다음 종양 또는 림프절 속에 적합한 경로로, 예를 들어, 진피내 주사, 피하 주사, i.v. 주사, 또는 직접 주사로 환자에게 투여된다.
환자에게 투여되는 상기 치료의 투약량은 치료될 환자 및 정확한 병태의 본성에 따라 다양할 것이다. 인간 투여용 투약량의 스케일링은 종래기술-허용된 실시에 따라 수행될 수 있다.
키트 및 제조 물품
하나 이상의 다중-특이적 항원-결합 작제물을 포함하는 키트 그리고 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트가 본 명세서에서 또한 포괄된다. 본 키트가 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있는 벡터의 형태로 제공될 수 있다.
키트의 개별 구성요소는 별개의 용기에서 포장될 것이고, 그와 같은 컨테이너와 관련되어, 통지가 제조, 사용 또는 판매의 대리인에 의한 승인을 반영하는, 의약품 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 처방된 형태로 통지일 수 있다. 본 키트는 임의로 다중-특이적 항원-결합 작제물 또는 폴리뉴클레오타이드용 투여 레지멘 또는 사용 방법을 약술하는 지침 또는 지시를 함유할 수 있다.
키트의 하나 이상의 성분이 용액, 예를 들어 수용액, 또는 멸균된 수용액으로서 제공되는 경우, 컨테이너 수단 자체는, 용액이 대상체에 투여될 또는 키트의 다른 구성요소에 적용 및 상기와 혼합될, 흡입제, 주사기, 피펫, 점안기, 또는 다른 그와 같은 유사 장치일 수 있다.
본 키트의 성분은 또한 건조된 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있고 키트는 추가로 동결건조된 성분의 재구성에 적합한 용매를 함유할 수 있다. 컨테이너의 수 또는 유형과 무관하게, 본 명세서에서 기재된 키트는 또한 환자에게 조성물의 투여를 돕기 위한 기기를 포함할 수 있다. 그와 같은 기기는 흡입제, 비강 스프레이 디바이스, 주사기, 피펫, 겸자, 측정된 스푼, 점안기 또는 유사한 의료적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다.
특정 구현예는 본 명세서에서 기재된 바와 같이 환자의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품에 관한 것이다. 제조 물품은 컨테이너 그리고 컨테이너에서 또는 상기와 관련된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 컨테이너는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백, 등을 포함한다. 컨테이너는 여러가지의 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 컨테이너는 그것만으로이거나 환자 치료에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되는 다중-특이적 항원-결합 작제물을 포함하는 조성물을 보유하고 멸균된 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 컨테이너는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 제조 물품은 하기를 포함할 수 있다: (a) 거기에 함유된 조성물을 가진 제1 컨테이너, 여기서 조성물은 본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물을 포함함; 및 (b) 거기에 함유된 조성물을 가진 제2 컨테이너, 여기서 제2 컨테이너에서 조성물은 추가로 세포독성제 또는 달리 치료제를 포함한다. 그와 같은 구현예에서, 제조 물품은 추가로 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 제조 물품은 추가로 약제학적으로-허용가능한 완충액, 예컨대 정균 주사용 물 (BWFI), 포스페이트-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 컨테이너를 포함할 수 있다. 제조 물품은 임의로 추가로, 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여, 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 포함할 수 있다.
폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드
본 명세서에서 기재된 바와 같이, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 구현예는 본 명세서에서 기재된 그와 같은 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 명세서에서 기재된 다중-특이적 항원-결합 작제물, 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 단리된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단리된"은 그것의 천연 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인되고 분리된 및/또는 회수된 제제 (예를 들면, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)를 의미한다. 그것의 천연 환경의 오염물질 성분은 항원-결합 작제물용 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된은 또한, 예를 들면, 인간 개입을 통해, 합성으로 생산된 제제를 지칭한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩타이드에 관한 설명은 펩타이드의 설명 및 단백질의 설명에 동등하게 적용하고, 그 반대도 그러하다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 폴리머 뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-자연 인코딩된 아미노산인 아미노산 폴리머에 적용한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는, 전장 단백질을 포함하는, 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포괄하고, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩타이드 결합으로 연결된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 비-자연 발생 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산에 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 인코딩된 아미노산은 20 공통 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프랄린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 피롤리신 및 셀레시노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카복실 기, 아미노 기, 및 "R" 기, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄에 결합되는 탄소를 갖는 화합물이다. 그와 같은 유사체는 변형된 R 기 (예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 참조는, 예를 들어, 자연 발생 조기형성 L-아미노산; D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산 예컨대 아미노산 변이체 및 유도체; 자연 발생 비-조기형성 아미노산 예컨대 β-알라닌, 오르니틴, 및 기타 동종, 그리고 아미노산의 특징이도록 당해 분야에서 공지된 특성을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비-자연 발생 아미노산의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: α-메틸 아미노산 (예를 들면 α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘-유사 아미노산 (예를 들면, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘), 측쇄에서 추가의 메틸렌을 갖는 아미노산 ("호모" 아미노산), 및 측쇄에서 카복실산 작용기가 설폰산 기 (예를 들면, 시스테인산)으로 대체되는 아미노산. 본 명세서에서 기재된 항원-결합 작제물 속에 합성 비-원상태 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는, 비-천연 아미노산의 편입은 수많은 상이한 방식에서 유리할 수 있다. D-아미노산-함유 펩타이드, 등은 L-아미노산-함유 대응물에 비교하여 시험관내 또는 생체내 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산을 편입시키는, 펩타이드, 등의 작제는 더 큰 세포내 안정성이 원해지거나 요구되는 경우 특히 유용할 수 있다. D-펩타이드는, 예를 들어, 내인성 펩티다아제 및 프로테아제에 전형적으로 저항성이고, 그렇게 함으로써 분자의 개선된 생체이용률, 그리고 그와 같은 특성이 바람직한 경우 생체내 장기적인 수명을 제공한다. 추가로, D-펩타이드는 T 헬퍼 세포에 주조직 적합성 복합체 부류 II-제한된 제시를 위하여 효율적으로 가공될 수 없고, 따라서,전체의 유기체에서 체액성 면역 반응을 덜 유도할 것 같다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에 의해 권고된 1-문자 기호에 의해 또는 그것의 통상적으로 공지된 3개의 글자 기호에 의해 어느 한쪽 본 명세서에서 지칭될 수 있다. 뉴클레오타이드는, 마찬가지로, 그것의 통상적으로 허용된 단일-문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
다중-특이적 항원-결합 작제물의 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 또한 포함된다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 서열"은 둘 이상의 뉴클레오타이드 분자의 연속적인 스트레치를 나타내도록 의도된다. 뉴클레오타이드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 기원, 또는 이의 임의의 조합일 수 있고, 어느 한쪽 단일- 또는 이중-가닥 형태로, 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 폴리머를 포함할 수 있다. 특이적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 폴리뉴클레오타이드와 유사한 결합 특성을 갖는 그리고 자연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사작용되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다. 달리 특이적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 또한 PNA (펩티도핵산)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 유사체 그리고 안티센스 기술에서 사용된 DNA의 유사체 (포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 및 기타 동종)을 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 뉴클레오타이드 서열은 또한 전적으로 (비제한적으로, 축퇴 코돈 치환을 포함하는) 이의 보존적으로 변형된 변이체 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명백하게 나타낸 서열을 포괄한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열 생성에 의해 달성될 수 있다 (Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini 등, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
"보존적으로 변형된 변이체"는 양쪽 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열에 적용한다. 특정 뉴클레오타이드 서열에 관하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 뉴클레오타이드 서열이 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 암호의 축퇴 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 지정되는 모든 위치에서, 코돈은 인코딩된 폴리펩타이드의 변경 없이 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 그와 같은 핵산 변화는, 보존적으로 변형된 변화의 하나의 종인, "침묵의 변화"이다. 당해 분야의 숙련가는 (통상적으로 메티오닌용 유일 코돈인, AUG, 및 통상적으로 트립토판용 유일 코돈인, TGG를 제외하고) 뉴클레오타이드 서열에서 각각의 코돈이 기능적으로 동일한 분자를 산출하기 위해 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 각각의 침묵의 변화는 각각의 기재된 서열에서 암시된다.
아미노산 서열에 관하여, 당해 분야의 숙련가는 인코딩된 서열에서 아미노산의 작은 백분율 또는 단일 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열의 개별 치환, 결실 또는 부가가 변경이 아미노산의 결실, 아미노산의 부가, 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 초래하는 "보존적으로 변형된 변이체"인 것을 인식할 것이다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야의 숙련가에 공지된다. 하기 8 그룹 각각은 서로에 대하여 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 [0139] 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (참조, 예를 들면, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)).
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 용어 "동일한"은 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열은 이들이, 비교 윈도우에 대해 최대 관련성으로 비교된 및 정렬된 경우, 동일한 (즉, 지정된 영역에 대해 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성)인 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 백분율, 또는 하기 서열 비교 알고리즘 (또는 당해 분야의 숙련가에 이용가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사로 측정된 경우 지정된 영역을 갖는다면 "실질적으로 동일한"이다. 이러한 정의는 또한 시험 서열의 보체를 지칭한다. 동일성은 길이 적어도 약 50 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐, 또는 길이 75-100 아미노산 또는 뉴클레오타이드인 영역에 걸쳐, 또는, 지정되지 않은 경우, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 서열을 거쳐 실재할 수 있다. 인간 이외 종으로부터 동족체를 포함하는, 본 명세서에서 기재된 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 갖는 표지된 프로브로 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 라이브러리 스크리닝의 단계, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 게놈 클론 및 전장 cDNA 단리의 단계를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다. 그와 같은 하이브리드화 기술은 숙련가에 잘 알려진다.
서열 비교를 위하여, 전형적으로 하나의 서열은, 시험 서열이 비교되는, 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨팅하기 시작하고, 하위서열 좌표는 지정되고, 필요하면, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터는 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터는 사용될 수 있거나, 대체 파라미터는 지정될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 그 다음, 프로그램 파라미터에 기반하여, 참조 서열에 비해 시험 서열에 대하여 퍼센트 서열 동일성이 계산될 수 있다.
"비교 윈도우"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 2 서열이 최적으로 정렬된후 인접 위치의 동일한 수의 참조 서열에 서열이 비교될 수 있는 20 내지 600, 일반적으로 약 50 내지 약 200, 더 일반적으로 약 100 내지 약 150으로 구성되는 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 어느 하나의 분절 참조를 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당해 분야의 숙련가에 공지된다. 비교용 서열의 최적의 정렬은, 비제한적으로, Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c의 국부 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘 (예를 들어, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터화된 실행에 의해, 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 수행될 수 있다 (참조, 예를 들면, Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).
퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성 결정에 적합한 알고리즘의 하나의 예는, Altschul 등, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1997), 및 Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), 각각에서 기재되는, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터의 웹사이트를 통해 공공연하게 이용가능하다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감수성 및 속도를 결정한다. (뉴클레오타이드 서열용) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 단어길이 (W), 기대 (E) 또는 10, M=5, N=-4 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이, 및 10의 기대 (E), 그리고 50의 BLOSUM62 평점 매트릭스 (참조 Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)) 정렬 (B), 10의 기대 (E), M=5, N=-4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 작동되지 않은 "저 복잡성" 필터로 전형적으로 수행된다.
BLAST 알고리즘은 또한 2 서열 사이 유사성의 통계적인 분석을 수행한다 (참조, 예를 들면, Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993)). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 하나의 측정치는, 2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이 매치가 우연히 발생할 개연성의 징후를 제공하는, 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 참조 핵산에 시험 핵산의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만이면 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
일부 측면에서, 다중-특이적 항원-결합 작제물은 본 명세서에서 개시된 수탁 번호 또는 표에서 제시된 관련된 아미노산 서열 또는 이의 단편에 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 단리된 다중-특이적 항원-결합 작제물은 본 명세서에서 개시된 수탁 번호 또는 표에서 제시된 관련된 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편에 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 본 발명의 더 나은 이해를 얻기 위해, 하기 실시예는 제시된다. 이들 실시예가 본 발명의 실례가 되는 구현예를 기재하도록 의도되고 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는 것이 이해될 것이다.
실시예
실시예 1: 이중특이적 항체 변이체
이중특이적 항원-결합 작제물은 하기 포멧으로 제조되었다:
a) 하나의 항원-결합 도메인이 scFv이고 다른 것이 Fab인 하이브리드 항체 포멧. 이들 이중특이적 항원-결합 작제물은 추가로 2 성분 Fc 폴리펩타이드, HetFcA 및 HetFcB의 이종이량체 회합을 구동시키는 CH3 도메인 아미노산 치환을 갖는 IgGl 이종이량체 Fc를 포함한다.
HetFcA는 하기 아미노산 치환을 갖는다: T350V/L351Y/F405A/Y407V
HetFcB는 하기 아미노산 치환을 갖는다: T350V/T366L/K392L/T394W
Fc 영역에서 아미노산 잔기는 EU 항체의 넘버링을 참조로 카밧에서 처럼 EU 지수에 따라 확인된다 (Edelman 등, Proc Natl Acad Sci USA, 63:78-85 (1969)). 하이브리드 항체 포멧 작제물은 3 폴리펩타이드 쇄를 포함한다: 제1 표적을 결합시키는 scFv에 융합된 제1 Fc 폴리펩타이드, VH-CH1 도메인, 및 경쇄에 융합된 제2 Fc 폴리펩타이드, 여기에서 VH-CH1 도메인 및 경쇄는 제2 표적에 결합하는 Fab 영역을 형성한다.
b) 제1 표적에 결합하는 제1 VL-VH 서열이 GlySer 기반 스페이서에 의해 제2 표적에 결합하는 제2 VL-VH 서열에 연결되는 탠덤 scFv 포멧. 탠덤 ScFv 작제물은 또한 6xHis-태그를 함유하였다.
여기에서 제조된 이중특이적 항원-결합 작제물은 표 C에서 기재된다. "항-FMC63id"는 항-CD19 scFv이다 (참조, Immunology and Cell Biology (1991) 69:411-422, 및 국제 특허 공개 번호 WO 2014/190273). "FLAG"는 본 명세서에서 기재된 일부 예시적인 작제물에서 음성 대조군 아암으로서 사용된 공지된 아미노산 모티프 "DYKDDDDK"이다 (Hopp, 등, Bio/Technology, 6 (10): 1204-10 (1988))이다. BCMA 및 메소텔린은 종양-관련 항원 (TAAs)이다. scFv 및 Fab 서열은, 표 4에서 확인된, 공지된 항체의 서열로부터 생성되었다 (참조 실시예 7). 표 C에서 열거된 각각의 변이체에 대하여 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 표 6에서 제공된다. 탠덤 scFv 서열은 6xHis 태그 없이 제공된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
실시예 2: 이중특이적 항체 생산
실시예 1에서 기재된 as 변이체 # 16443 (FLAG-메소텔린), 16445 (FMC63id-BCMA), 16446 (FMC63id-메소텔린) 및 16448 (FLAG-BCMA)로서 지정된 이중특이적 항원-결합 작제물은 아래와 같이 제조되었다.
항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자는 인간/포유류 발현에 최적화된 코돈을 사용하는 유전자 합성을 통해 작제되었다. 이중특이적 항체는 실시예 7에서 설명된 일반적인 절차에 따라 클로닝 및 발현되었다. 이종이량체 종은 단백질 A 친화도 크로마토그래피 이어서 크기-배제 크로마토그래피를 통해 >90% 순도로 단리되었다. 모든 제제는 비-환원 SDS-PAGE 및 SEC에 의해 확인된 바와 같이 <5% 다량체 종을 가졌다.
실시예 3: 종양 세포에 이중특이적 항체의 결합
방법
Raji 세포 (ATCC CCL-86) 및 RPMI8226 세포 (ATCC CCL-155)는 10% FBS를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 배양되었다. A1847 세포는 10% FBS를 함유하는 DMEM에서 배양되었다. 각각의 3 세포주는 원심분리되었고 차가운 FACS 완충액 (PBS + 2 mM EDTA pH 7.4 + 0.5% BSA)내 5 백만 세포/ml로 현탁되었다. 시험 항체는 0.3 mg/ml로 PBS로 희석되었다. 항체는 그 다음 0.1 mg/ml, 30 ug/ml, 10 ug/ml, 3 ug/ml, 1 ug/ml 및 0.3 ug/ml로 PBS로 연속으로 희석되었다. 10 마이크로리터의 희석된 항체는 얼음상의 96-웰 플레이트에서 90 ul의 세포와 혼합되었고, 플레이트는 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 그 다음 원심분리되었고, 상청액은 경사분리로 제거되었고, 세포 펠릿은 200 ul의 차가운 FACS 완충액에 현탁되었다. 플레이트는 재차 원심분리되었고, 상청액은 경사분리로 제거되었고, 세포는 1 ug의 Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 및 0.1 ug의 7-아미노악티노마이신 D (7-AAD)를 함유하는 100 ul의 차가운 FACS 완충액에 현탁되었다. 플레이트는 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션되었고, 그 다음 상기와 같이 린스되었고 세포는 1% 파라포름알데하이드를 함유하는 200 ul의 차가운 FACS 완충액에 현탁되었다. 플레이트는 4 ℃에서 밤새 인큐베이션되었고 세포는 다음 날 BD LSR Fortessa X20 흐름 세포측정기에서 획득되었다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (FlowJo, LLC, Ashland, OR)로 분석되었다. 세포는 정방향 광 산란검출기 대 7-AAD 염색에 의해 먼저 플롯팅되었고, 그 다음 살아있는 세포 (7-AAD-음성)은 게이팅되었고 Alexa Fluor 488 염색용 히스토그램으로서 플롯팅되었다. 평균 형광은 그 다음 기록되었고 Prism 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)에 붙이고, 이와 함께 평균 형광은 항체 농도에 대해 플롯팅되었다.
결과
도 2에서 나타낸 바와 같이, 대조군 RPMI8226 세포가 아닌, MSLN+ A1847 세포에 결합된 이중특이적 메소텔린 (MSLN)-유도된 작제물 (vl6443 및 vl6446). 유사하게, 대조군 A1847 세포가 아닌, BCMA+ RPMI8226 세포에 결합된 이중특이적 BCMA-유도된 작제물 (vl6448 및 vl6445).
실시예 4: CAR-발현 T-세포에 이중특이적 항체의 결합
방법
인간 T-세포는 ProMab Biotechnologies, Inc., Richmond, CA에 의해 생산된 (세포외 항-CD 19 (FMC63) scFv, FLAG, CD28 "힌지" 및 막관통, 이어서 세포내 CD28 및 CD3-제타 신호전달 도메인을 함유하는) CD 19에 특이적인 FLAG-태깅된 제2 세대 CARs를 발현시키도록 조작되었다. 간단히, PBMC는 피콜에 대해 밀도 침강을 사용하여 건강한 개체의 말초 혈액으로부터 단리되었고, PBMC는 동결보존되었다. CAR 서열을 함유하는 렌티바이러스 입자는 CAR-인코딩 벡터 및 제3 세대 패키징 작제물과 HEK293 세포의 공-형질감염에 의해 생산되었다. 렌티바이러스 입자는 초원심분리에 의해 배양 배지로부터 수집되었고, qRT-PCR로 적정되었고 냉동되었다. PBMC는 해동되었고 5% 인간 AB 혈청, CD3/CD28 항체-코팅된 자기 비드 및 IL-2를 함유하는 AIM-V® 배지에서 밤새 배양되었다. 세포는 5 ug/ml DEAE-덱스트란의 존재 하에서 5:1의 다수의 감염으로 다음 날 렌티바이러스 제제로 형질도입되었다. 다음 2주의 배양에 걸쳐, 세포는 매 2-3 일 카운트되었고 추가의 배지는 0.5 내지 3 백만/mL 밀도에서 세포를 유지시키기 위해 첨가되었다. CAR 발현은, FLAG에 특이적인 항체를 사용하여, 배양의 9 일째에 유세포측정으로 평가되었다.
CAR-T 세포에 결합하는 항체를 측정하기 위해, 어느 한쪽 CD19 CAR을 안정적으로 발현시키는 HEK293 세포 또는 CAR-T 세포 제제는 원심분리되었고 2.5 백만 세포/ml로 차가운 FACS 완충액에 현탁되었다. 시험 항체는 0.4 mg/ml로 PBS에서 희석되었고, 그 다음 120 ug/ml 및 40 ug/ml로 PBS에서 연속으로 희석되었다. 25 마이크로리터의 항체는 얼음상의 96-웰 플레이트에서 75 ul의 세포로 3중으로 혼합되었고, 플레이트는 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 플레이트는 그 다음 원심분리되었고, 상청액은 경사분리로 제거되었고, 세포 펠릿은 200 ul의 차가운 FACS 완충액에 현탁되었다. 플레이트는 재차 원심분리되었고, 상청액은 경사분리로 제거되었고, 세포는 1 ug의 Alexa Fluor 488-접합된 염소 항-인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) 및 0.1 ug의 7-AAD를 함유하는 100 ul의 차가운 FACS 완충액에 현탁되었다. 플레이트는 얼음에서 30 분 동안 인큐베이션되었고, 그 다음 상기와 같이 린스되었고 1% 파라포름알데하이드를 함유하는 200 ul의 차가운 FACS 완충액에 현탁되었다. 플레이트는 4 ℃에서 밤새 인큐베이션되었고 세포는 BD FACSCalibur™ 흐름 세포측정기 (BD Biosciences, San Jose, CA)에서 다음 날 획득되었다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (FlowJo, LLC, Ashland, OR)로 분석되었다. 세포는 정방향 관 산란검출기 대 7-AAD 염색에 의해 먼저 플롯팅되었고, 그 다음 살아있는 세포 (7-AAD-음성)은 게이팅되었고 Alexa Fluor 488 염색 대 더미 채널에 의해 플롯팅되었다.
결과
도 3에서 나타낸 바와 같이, 어느 한쪽 HEK293 또는 일차 CAR-T 세포에서 안정적으로 발현된 FMC63을 함유하는 항-CD19 CAR 작제물에 선택적으로 결합된 항-FMC63개체특이형-함유 이중특이적 작제물 (v16446 및 v16445).
이 실시예에서 사용된 CAR 작제물이 세포외 FLAG 서열을 함유하였어도, 항-FLAG 도메인을 포함하는 변이체에 의한 FLAG 결합은 관측되지 않았다. 이것은 아마 FLAG 태그가 CAR 작제물의 scFv와 CD28 힌지 사이 위치함에 따라 형태적 제한 때문이다. 결합의 이러한 부족은 이들 변이체의 항-FLAG 도메인을 음성 대조군 결합 도메인으로서 사용되도록 한다.
실시예 5: 이중특이적 항체에 의한 CAR-T 세포 기능의 조절
방법
항체는 0.4 mg/ml로 PBS에서 희석되었고, 그 다음 120 ug/ml 및 40 ug/ml로 RPMI-1640 배지에서 연속으로 희석되었다. CD19 CAR-T 세포 (참조 실시예 4)는 원심분리되었고 2 백만 세포/ml로 RPMI-1640 배지에 현탁되었다. Raji, RPMI8226 및 SKOV3 표적 세포는 원심분리되었고 0.2 백만 세포/ml로 RPMI-1640 배지에 현탁되었다. 50 마이크로리터의 표적 세포는 96-웰 플레이트에서 50 ul의 CAR-T 세포 및 100 ul의 항체로 3중으로 혼합되었다. 플레이트는 6 또는 18 시간 배양되었고, 세포는 원심분리를 통해 펠릿화되었다. 상청액은 신선한 96-웰 플레이트에 전달되었고 냉동되었다. 상청액 IFN-γ 수준은 샌드위치 ELISA로 정량화되었다.
결과
도 4에서 나타낸 바와 같이, CD19-CAR-T 세포는, CD19-음성 SKOV3 세포가 아닌, CD19+ Raji 세포로 공-배양시 강력하게 활성화되었다. 그러나, 항-FMC63id x MSLN 작제물 (vl6446)은 CAR-T 세포를 재유도시켰고 MSLN+ SKOV3 세포의 존재 하에서 강력한 활성화를 강력하게 하였다. 유사하게, CD19-CAR-T 세포 반응은 공-배양 개시 이후 6 시간에서 항-FMC63id x BCMA 작제물 (vl6445)의 존재 하에서 BCMA-발현 RPMI8226 표적 세포에 재유도되었다. 사후-공-배양 개시 18 시간에서, RPMI8226 세포는 RPMI8226 세포의 서브셋에서 저-수준 CD19 발현과 일치하는, 중간 정도 CD19-CAR-T 세포 활성화를 단독 유도하였고 (참조, Matsui, 등, Blood, 103(6):2332-2336 (2004)), 이는, 대조군이 아닌, 항-FMC63id x BCMA 작제물의 첨가로 추가로 향상되었다.
실시예 3-5에서 기재된 발견은, 동력학이 표적 및/또는 세포 유형 사이 다양할 수 있는 한편, CAR-관여 다중-특이적 항원-결합 작제물이 대체 항원에 대해 TAA-특이적 조작된 세포를 재유도하는데, 그리고 저-수준 동족 표적 발현에 의해 유도된 중간 정도 세포 활성화를 향상시키는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다. CAR 작제물은 (하지만 첨가된 공-자극 포텐셜을 가진) 천연 TCR/CD3 신호를 모방하도록 설계된다. 이와 같이, 이들 발견은 (항-TCR 유전자형, V-영역, 또는 다른 유사한 결합 도메인을 사용하는) TCRs에 그리고 대체 TAA 표적에 대한 조작된 또는 내인성 TCR-매개된 T-세포 반응을 재유도하기 위한 TAAs에 관한 다중-특이적 항원-결합 작제물의 용도를 뒷받침한다.
이들 실시예에서 사용된 다중-특이적 항원-결합 작제물이 이중특이적 항체 포멧인 한편, CD3 x TAA 결합을 통한 T-세포 참여는 다양한 생물학 플랫폼을 사용하는 당해 분야에서 잘 확립되고, 따라서 이들 발견은 대체 TAAs에 대한 T-세포 재유도화를 위하여 대체 스캐폴드 포멧 (본 명세서에서 기재된 바와 같이, BiTE, DART, 및 기타 동종)의 다중-특이적 항원-결합 작제물의 용도를 뒷받침한다.
실시예 6: 이중특이적 항체 변이체의 설명
이중특이적 항원-결합 작제물은 하기 예시적인 포멧으로 제조된다:
a) 실시예 1 a)에서 기재된 바와 같은 하이브리드 항체 포멧.
b) 양쪽 항원-결합 도메인이 Fabs인 전체-크기 항체 (FSA) 포멧. 이들 이중특이적 항원-결합 작제물은 또한 실시예 1에서 기재된 이종이량체 Fc를 포함한다. 전체-크기 항체 포멧 작제물은 4 폴리펩타이드 쇄를 포함한다: 제1 VH-CH1 도메인, 및 제1 경쇄에 융합된 제1 Fc 폴리펩타이드, 여기에서 제1 VH-CH1 도메인 및 제1 경쇄는 제1 표적에 결합하는 Fab 영역을 형성함; 및 제2 VH-CH1 도메인, 및 제2 경쇄에 융합된 제2 Fc 폴리펩타이드, 여기에서 제2 VH-CH1 도메인 및 경쇄는 제2 표적에 결합하는 Fab 영역을 형성함.
c) 하나의 표적에 결합하는 하나의 VL-VH 서열이 제2 표적에 결합하는 제2 VL-VH 서열에 (GGGGS)5 스페이서에 의해 연결되는 탠덤 scFv 포멧.
상기 기재된 FSA 포멧 및 하이브리드에서 제조되는 이중특이적 항원-결합 작제물의 설명은 표 2에서 제공된다. 제조되는 탠덤 scFv 작제물의 설명은 표 3에서 제공된다. "FMC63"은 항-CD19 scFv (참조 실시예 1, "FMC63id")이다.
Figure pct00009
실시예 7: 이중특이적 항체 생산
실시예 6에서 기재된 이중특이적 항원-결합 작제물은 아래와 같이 제조된다.
항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자는 인간/포유류 발현에 최적화된 코돈을 사용하는 유전자 합성을 통해 작제된다. scFv 및 Fab 서열은, 표 4에서 확인된, 공지된 항체의 서열로부터 생성된다. 서열은 표 5에서 제공된다.
Figure pct00010
scFvs를 포함하는 작제물을 위하여, scFv의 VH와 VL 사이 디설파이드 결합은, 카밧 넘버링 시스템에 따라, 위치 VH 44 및 VL 100에서 도입된다 (참조 Reiter 등, Nat Biotechnol, 14:1239-1245 (1996)).
최종 유전자 생성물은 포유류 발현 벡터 속에 서브-클로닝되고 CHO 세포 (또는 기능적 등가물)에서 발현된다 (Durocher, 등, Nucl Acids Res, 30:E9 (2002)).
CHO 세포는 지수 성장기에서 형질감염된다. 이종이량체 형성을 위하여 최적의 농도 범위를 결정하기 위해, DNA는 이종이량체 형성을 허용하는 FcA, 경쇄 (LC), 및 FcB의 다양한 DNA 비로 형질감염될 수 있다. 형질감염된 세포 배양 배지는 며칠후 수집되고, 4000rpm에서 원심분리되고 0.45 마이크론 필터를 사용하여 정화된다.
이중특이적 항원-결합 작제물은 확립된 방법을 통해 배양 배지로부터 정제된다. 예를 들어, 정화된 배양 배지는 MabSelect SuRe (GEHealthcare) 단백질-A 칼럼에 장입되고 pH 7.2에서 PBS 완충액으로 세정되고, pH 3.6에서 시트레이트 완충액으로 용출되고, 풀링된 분획은 pH 11에서 TRIS로 중화된다. 단백질은 Econo-Pac 10DG 칼럼 (Bio-Rad)을 사용하여 마지막으로 탈염된다. 일부 경우에, 단백질은 단백질 L 크로마토그래피 또는 겔 여과로 추가로 정제된다.
실시예 8: 시험관내 CD 19-특이적 CAR-T 세포에 의한 표적 세포의 선택적 용해를 매개하는 이중특이적 항원-결합 작제물의 능력
CD19-특이적 CAR-T 세포에 의한 표적 세포의 용해를 매개하는 실시예 6에서 기재된 이중특이적 항원-결합 작제물의 능력은 아래에서 요약한 바와 같이 평가된다. 다양한 CARs를 발현시키는 유전자적으로 조작된 인간 T 세포는 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, scFv FMC63을 포함하는 CD 19-특이적 CAR-T 세포는 ProMab Biotechnologies Inc., Richmond, CA로부터 이용가능하다.
CD 19-특이적 CAR-발현 T 세포 및 표적 세포는, 실시예 6에서 기재된 이중특이적 항체의 가변 농도의 존재 또는 부재 하에서, 다중 비 (최적으로 대략 20:1)로 3중으로 인큐베이션된다. 표적 세포는 하기를 포함한다: 친계 또는 대조군 HeLa 세포, 및 CD19, CD79b, BCMA 또는 메소텔린을 안정적으로 발현시키는 공지된 방법을 통해 조작된 HeLa 세포. 표적 세포는 또한 내인성 CD19, CD79b, BCMA 및/또는 메소텔린 발현을 가진 세포주 (예컨대 Raji, Ramos, RPMI8226, 및 A1847), 또는 일차 종양 샘플을 포함할 수 있다. 인큐베이션 이후, 표적 세포의 용해는 유세포측정, 51Cr 방출, 형광측정법, 또는 동력학 생존력 플랫폼 (예컨대 Xcelligence (Acea))를 통해 모니터링된다.
상이한 검정 플랫폼으로부터 표적 세포 용해 값 (실험적 용해 값)은 사건/기간 (유세포측정), 51Cr 방출 카운트, 상대 발광 단위 또는 상대 형광 단위이다. 자발적인 용해를 측정하기 위해, 표적 세포는 효과기 세포 (CAR-T 세포) 없이 인큐베이션되고, 최대 용해는 세포독성 세제 없이 표적 세포의 인큐베이션 이후 결정된다.
퍼센트 특정 용해는 하기와 같이 계산된다:
[(실험적 용해 값 - 자발적인 용해 값)/ (최대 용해 값 - 자발적인 용해 값)] x 100.
결과
CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포는, CD19-음성 표적 세포 유형 (HeLa, HeLa-CD79b, HeLa-BCMA, RPMI8226 (CD 19-저/음성), HeLa-메소텔린, 또는 A1847)이 아닌, CD 19-발현 표적 세포 (HeLa-CD19 또는 Raji)를 효율적으로 용해시킬 수 있는 것으로 기대된다. 유사하게, 메소텔린-특이적 CARs는 메소텔린-발현 표적 세포 (Hela-메소텔린 또는 A1847)을 용해시킬 수 있지만, 메소텔린-음성 표적 세포 유형 (HeLa 또는 HeLa-CD19)를 용해시키지 않는다. 이들 결과는 동족 CAR-유도된 선택성 프로파일을 정의한다.
동족 CAR-유도된 선택성 프로파일은 CAR 에피토프 및 대체 TAAs와 상호작용하는 다중-특이적 결합 분자로 CAR-T 세포의 인큐베이션시 변경된다. CAR scFv 유전자형 및 TAA를 표적하는 이중특이적 항체로 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T 세포의 인큐베이션은 대체 TAAs에 세포독성 반응을 재유도할 수 있다. 예를 들어:
a) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 변이체 3, 6 또는 9 (항-CD19scFv 유전자형/메소텔린)의 존재 하에서 HeLa-메소텔린 또는 A1847 표적 세포를 용해시키고;
b) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 변이체 1, 4 또는 7 (항-CD 19scFv 유전자형/CD79b)의 존재 하에서 HeLa-CD79b 표적 세포를 용해시키고;
c) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 변이체 2, 5 또는 8 (항-CD 19scFv 유전자형/BCMA)의 존재 하에서 증가된 효능으로 HeLa-BCMA 또는 RPMI8226 표적 세포를 용해시킨다.
실시예 9: 시험관내 표적 세포 및 CD19-특이적 CAR-T 세포의 공-배양에서 사이토카인 생산을 자극시키는 이중특이적 항원-결합 작제물의 능력
사이토카인 방출은 이중특이적 항원 결합 분자의 존재 또는 부재 하에서 항원-발현 또는 대조군 표적 세포로 CAR-발현 세포의 인큐베이션 이후 평가된다. 표적 세포는 실시예 7에서 기재된 것과 동일한 것이다. CD 19-특이적 CAR-T 세포는 최적의 효과기 대 표적 (E:T) 비 (대략 2:1)에서 표적 세포로 공-배양된다. 공-배양된 세포는 약 24 시간 동안 인큐베이션되고, 상청액은 다중 사이토카인 면역검정 (Luminex®) 또는 ELISA를 사용하여 IFN-γ, TNF-α, 또는 IL-2의 측정을 위하여 수집된다.
결과
CAR scFv 유전자형 및 TAA를 표적하는 이중특이적 항체로 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T-세포의 인큐베이션은 대체 TAAs에 사이토카인 생산 반응을 재유도하는 것으로 기대된다 . 예를 들어:
a) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 변이체 3, 6 또는 9 (항-CD 19scFv 유전자형/메소텔린)의 존재 하에서 HeLa-메소텔린 또는 A1847 표적 세포에 반응하여 IFN-γ, TNF-α, 또는 IL-2를 생산하고;
b) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 변이체 1, 4 또는 7 (항-CD 19scFv 유전자형/CD79b)의 존재 하에서 HeLa-CD79b 표적 세포에 반응하여 IFN-γ, TNF-α, 또는 IL-2를 생산하고;
c) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 더욱 효율적으로 변이체 2, 5 또는 8 (항-CD 19scFv 유전자형/BCMA)의 존재 하에서 HeLa-BCMA 또는 RPMI8226 표적 세포에 반응하여 IFN-γ, TNF-α, 또는 IL-2를 생산한다.
실시예 10: 표적 세포의 존재 하에서 CD 19-특이적 CAR-T 세포의 증식을 자극시키는 이중특이적 항원-결합 작제물의 능력
CD 19-발현 표적 세포로 인큐베이션 이후 CD19-특이적 CAR-T 세포의 증식은 유세포측정에 의해 평가된다. CD19-특이적 CAR-T 세포는 카복시플루오레신 석신미딜 에스테르 (CFSE)로 표지되고, 세정되고 외인성 사이토카인 없이 혈청-함유 배지에서 표적 세포로 72 시간 동안 인큐베이션된다. 표적 세포는 실시예 7에서 기재된 것과 동일한 것이다. 살아있는 T-세포의 분할은, 유세포측정에 의해 평가된 바와 같이, CFSE 희석으로 지시된다.
결과
CAR scFv 유전자형 및 TAA를 표적하는 이중특이적 항체로 CD19-특이적 CARs를 발현시키는 T-세포의 인큐베이션은 대체 TAAs에 증식 반응을 재유도하는 것으로 기대된다. 예를 들어:
a) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 변이체 3, 6 또는 9 (항-CD 19scFv 유전자형/메소텔린)의 존재 하에서 HeLa-메소텔린 또는 A1847 표적 세포에 반응하여 증식하고;
b) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 변이체 1, 4 또는 7 (항-CD 19scFv 유전자형/CD79b)의 존재 하에서 HeLa-CD79b 표적 세포에 반응하여 증식하고;
c) CD19-특이적 CAR-T 모집단은 효율적으로 변이체 2, 5 또는 8 (항-CD 19scFv 유전자형/BCMA)의 존재 하에서 HeLa-BCMA 또는 RPMI8226 표적 세포에 반응하여 증식한다.
실시예 11: 생체내 대체 TAAs에 CD 19-특이적 CAR-T 세포를 재유도하는 이중특이적 항원-결합 작제물의 능력
생체내 대체 TAAs에 대한 CD19-특이적 CAR-T 세포를 재유도하는 이중특이적 항원-결합 작제물의 능력은 아래 기재된 바와 같이 이중특이적 항원-결합 작제물의 투여 및 CAR-T 세포의 입양 전달 이후 종양 성장 모니터링에 의해 환자-유래된 이종이식 (PDX) 종양 모델에서 평가된다. 이들 연구를 용이하게 하기 위해, CD19-음성 Raji 변이체 (19negRaji)는 (예를 들어, GenScript, Piscataway, NJ로부터 이용가능한 서비스를 사용하는) CRISPR/Cas9-매개된 유전자 편집, 또는 유동-혈구계산 CD19-저 모집단 분류, 제한 희석, 및 딸 라인 팽창의 반복된 사이클을 통해 생성된다.
6- 내지 8-주령 암컷 NOD.Cg.PrkdcscldIL2rgtm/Wl//SzJ (NSG) 마우스의 그룹은 하기 중 하나로 정맥내로 (i.v.) 주사된다:
a) 개똥벌레 루시퍼라아제로 형질감염된 Raji 림프종 종양 세포;
b) 개똥벌레 루시퍼라아제로 형질감염된 CD19-음성 Raji (19negRaji) 림프종 종양 세포;
c) 개똥벌레 루시퍼라아제로 형질감염된 RPMI-8226 다발성 골수종 세포 (CD 19-음성/저, BCMA-양성) 종양 세포.
마우스에 투여를 위하여 세포의 적합한 수는, 예를 들어, 0.5 x 106 세포이다. 종양 생착은 약 6 일 동안 발생하게 되고 생물발광 이미지형성을 사용하여 확인된다.
7 일째에, 마우스는 CD19-특이적 CAR-T 세포의 하위-최적의 용량 (예시적인 용량은 1 x 106이다)의 단일 정맥내 (i.v.) 주사를 받는다.
CAR-T 세포 생착후 다양한 일에 (통상적으로 7 일째), 실시예 1에서 기재된 이중특이적 항체는 i.v., 복강내로 또는 피하로 투여된다. 투약 계획 및 양은 다양하지만, 예시적인 연구는 매주 1회 10 mg/kg 투여한다.
마우스에서 종양 성장은 종양 세포 생착후 다양한 시점에서, 통상적으로 4, 7, 14, 21, 27, 34 및 41 일째에서 생물발광 이미지형성으로 모니터링된다.
생물발광 이미지형성을 위하여, 마우스는 PBS에서 루시페린 기질 (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA)의 복강내 (i.p.) 주사를 받는다 (예시적인 용량은 약 15 μg/g 체중이다). 마우스는 마취되고 국제 특허 공개 번호 WO 2015/095895의 실시예 7에서 기재된 바와 같이 본질적으로 이미지화되고 평균 복사 (p/s/cm/sr)은 결정된다.
결과
대조군 마우스 종양은 비-표적 세포 지향된 CAR-T 세포의 입양 전달 이후 연구의 과정에 걸쳐 계속 성장하는 것으로 기대되고, 반면 CD19-특이적 CAR-T 세포는 팽창된, 비-형질도입된 T-세포 모집단에 비교하여 CD 19+ 종양 성장을 감소하는 것으로 기대된다. 특이적으로:
- 19negRaji 및 RPMI-8226 다발성 골수종 종양은 CD19-특이적 CAR-T 세포의 투여 이후 마우스에서 정상적으로 성장하는 것으로 기대되고
- CD19-특이적 CAR-T 세포의 투여는 Raji 종양 성장을 감소시키는 것으로 기대된다
시험관내 결과와 유사하게, CD19-특이적 CAR-T 세포는 CAR 에피토프 및 대체 TAAs를 결합시키는 이중특이적 항원-결합 작제물의 투여시 마우스에서 CD 19-음성 종양 성장을 감소시키는 것으로 기대된다. 특이적으로:
- 변이체 1, 4 또는 7 (항-CAR/CD79b)의 투여는 19negRaji 및 RPMI-8226 종양의 CD19-특이적 CAR-T 세포 제어를 가능하게 하는 것으로 기대되고;
- RPMI-8226 종양 성장은 변이체 2, 5 또는 8 (항-CAR/BCMA)의 존재 하에서 CD19-특이적 CAR-T 모집단에 의해 감소되는 것으로 또한 기대된다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공보 및 데이터베이스 입력물의 개시내용은 각각의 그와 같은 개별 특허, 특허 출원, 공보 및 데이터베이스 입력물이 참고로 편입되도록 특이적으로 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 그 전문이 참고로 이로써 특이적으로 편입된다.
당해 분야의 숙련가에 분명할 본 명세서에서 기재된 특정 구현예의 변형은 하기 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
표 5: 서열
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SEQUENCE LISTING <110> ZYMEWORKS INC. <120> MULTI-SPECIFIC ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS TARGETING IMMUNOTHERAPEUTICS <130> 30712-37015/PCT <140> PCT/CA2017/050463 <141> 2017-04-13 <150> 62/323,432 <151> 2016-04-15 <160> 350 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Leu Lys Pro Arg Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 1 5 10 15 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp 20 25 30 Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr 50 55 60 Thr Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 65 70 75 80 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Val 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Phe Gln Gly Ala His Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 29 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Lys Val Ala 1 <210> 30 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Ala Lys Gln Ala Ala Gly Ala Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Asn Ala Ala Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Ala 1 5 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala 1 5 <210> 34 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp 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ggatcggata catcgccccc 540 gccgccggag ccgccgccta taatgccgcc tttaagggca aggccaccct ggccgccgat 600 aagtcctcta gcacagcata catggccgcc gccgccctga ccagcgagga tagcgccgtg 660 tactattgcg caagggccgc cgccgccgga gccgactatt ggggccaggg caccacactg 720 acagtgtcct ctggcggcgg cggcagcgag gtgcagctgg tggagtccgg aggaggcctg 780 gtgcagcctg gaggctccct gaggctgtct tgtgcagcca gcggctacac ctttagctcc 840 tattggatcg agtgggtgcg ccaggccccc ggcaagggcc tggagtggat cggagagatc 900 ctgcctggag gaggcgatac aaactacaat gagatcttca agggcagagc caccttttcc 960 gccgacacct ctaagaacac agcctatctg cagatgaata gcctgcgggc cgaggatacc 1020 gccgtgtact attgcacacg gagagtgcca atcagactgg actactgggg ccagggcacc 1080 ctggtgacag tgtctagcgt ggagggaggc tccggaggct ctggaggcag cggaggctcc 1140 ggaggcgtgg acgatatcca gctgacccag agcccatcct ctctgtccgc ctctgtgggc 1200 gaccgggtga ccatcacctg taaggccagc cagtccgtgg actacgaggg cgattccttc 1260 ctgaactggt atcagcagaa gcctggcaag gccccaaagc tgctgatcta cgcagccagc 1320 aatctggagt ccggagtgcc atctagattc tctggcagcg gctccggcac agactttacc 1380 ctgacaatca gctccctgca gcccgaggat tttgccacct actattgtca gcagagcaac 1440 gaggaccctc tgacattcgg acaggggact aaggtggaaa tcaag 1485 <210> 44 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 44 Asp Val Leu Met Thr Gln Ala Pro Leu Thr Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ala Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ala Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ala His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Gln Ala Ile Val His Ala Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 46 <211> 9 <212> PRT 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Ala 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Tyr 1 5 10 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala 1 5 <210> 52 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu 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atccactggg caaagcaggc cgccggggca gggctggagt ggatcggata catcgccccc 540 gccgccggag ccgccgccta taatgccgcc tttaagggca aggccaccct ggccgccgac 600 aagtcctcta gcacagcata catggccgcc gccgccctga ccagcgagga ctccgccgtg 660 tactattgcg caagggccgc cgccgccgga gccgattatt ggggccaggg caccacactg 720 acagtgtcct ctggaggagg aggctctgag gtgcagctgg tggagagcgg aggaggcctg 780 gtgaagcctg gaggctctct gagactgagc tgtgccgcct ccggcttcac ctttggcgac 840 tacgccctgt cctggttcag gcaggcccca ggcaagggcc tggagtgggt gggcgtgtcc 900 cgctctaagg catacggagg caccacagat tatgccgcct ccgtgaaggg ccggtttaca 960 atctctagag acgatagcaa gtccaccgcc tacctgcaga tgaacagcct gaagaccgag 1020 gacacagccg tgtactattg cgccagctcc ggctactcta gcggctggac accttttgat 1080 tactggggac agggcaccct ggtgacagtg tcctctgtgg agggaggctc tggaggcagc 1140 ggaggctccg gcggctctgg aggagtggac cagtccgtgc tgacccagcc accttctgcc 1200 agcggaaccc caggccagcg ggtgacaatc tcctgttctg gcagctcctc taacatcggc 1260 tctaacacag tgaattggta ccagcagctg ccaggaaccg cccctaagct gctgatcttc 1320 aattatcacc 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Synthetic polypeptide <400> 78 Asp Val Leu Met Thr Gln Ala Pro Leu Thr Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ala Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ala Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ala His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Met Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Ala 145 150 155 160 Ile His Trp Ala Lys Gln Ala Ala Gly Ala Gly Leu Glu Trp Ile Gly 165 170 175 Tyr Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Asn Ala Ala Phe Lys 180 185 190 Gly Lys Ala Thr Leu Ala Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 195 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 81 Gln Ala Ile Val His Ala Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 82 Phe Gln Gly Ala His Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 83 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 83 Lys Val Ala 1 <210> 84 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Ala Lys Gln Ala Ala Gly Ala Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Asn Ala Ala Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 128 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Asn Tyr His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 129 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 130 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 130 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val 1 5 10 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 000 <210> 133 <400> 133 000 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Synthetic peptide <400> 148 Ile Asp Pro Gly Asp Ser Arg Thr 1 5 <210> 149 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 149 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Ile Glu 85 90 95 Ser Ala Thr Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 150 Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr Asn Ser 1 5 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 208 gatattgcac tgacacagcc cgcctctgtg agcggctccc ctggacagag catcaccatc 60 tcctgcaccg gcacaagctc cgacatcggc ggctacaact ctgtgagctg gtatcagcag 120 caccccggca aggcccctaa gctgatgatc tacggcgtga acaataggcc atccggcgtg 180 tctaaccgct tctccggctc taagagcggc aataccgcct ctctgacaat cagcggcctg 240 caggcagagg acgaggcaga ttactattgc tctagctacg atatcgagag cgccaccccc 300 gtgtttggag gaggaaccaa gctgacagtg ctgggcggcg gcggctctgg aggaggaggc 360 agcggcggag gaggctccca ggtggagctg gtgcagtccg gagccgaggt gaagaagcct 420 ggcgagtccc tgaagatctc ttgtaagggc agcggctact ccttcacatc ttattggatc 480 ggatgggtgc ggcaggcccc aggcaagggc ctggagtgga tgggcatcat cgacccaggc 540 gatagccgga ccagatactc cccctctttt cagggccagg tgaccatctc cgccgacaag 600 agcatctcca cagcctatct gcagtggtcc tctctgaagg ccagcgatac agccatgtac 660 tattgcgcca gaggccagct gtacggagga acctatatgg acggatgggg acagggcacc 720 ctggtgacag tgagctccgg aggaggaggc tctgaggtgc 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209 Asp Ile Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Asp Ile Glu 85 90 95 Ser Ala Thr Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 210 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 210 Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr Asn Ser 1 5 <210> 211 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 211 Ser Ser Tyr Asp Ile Glu Ser Ala Thr Pro Val 1 5 10 <210> 212 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 212 Gly Val Asn 1 <210> 213 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Gly Asp Ser Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gln Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Met Asp Gly Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 214 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 214 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 215 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 215 Ala Arg Gly Gln Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Met Asp Gly 1 5 10 <210> 216 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 216 Ile Asp Pro Gly Asp Ser Arg Thr 1 5 <210> 217 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 217 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Ala Lys Gln Ala Ala Gly Ala Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Asn Ala Ala Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ala Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Ala Ala Ala Ala Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 218 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 218 Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr Ala 1 5 <210> 219 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 219 Ala Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ala Asp Tyr 1 5 10 <210> 220 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 220 Ile Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala 1 5 <210> 221 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Asp Val Leu Met Thr Gln Ala Pro Leu Thr Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ala Ile Val His Ala 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Ala Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ala Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ala 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gacagggcac cctggtgaca 720 gtgagctccg gaggaggagg cagcgaggtg aagctggtgg agtccggagg aggcctggtg 780 cagcctggag gctctctgaa gctgagctgt gccgcctccg gcttcgattt ttccaggtat 840 tggatgtctt gggtgcgcca ggcccctggc aagggcctgg aatggatcgg cgagatcaac 900 ctggactcta gcaccatcaa ttacacacca tctctgaagg acaagttcat catcagccgg 960 gataacgcca agaataccct gtatctgcag atgtctaagg tgagaagcga ggatacagcc 1020 ctgtactatt gcgccaggcg ctacgacgcc atggattatt ggggccaggg caccagcgtg 1080 acagtgtcct ctgtggaggg aggcagcgga ggctccggag gctctggagg cagcggagga 1140 gtggacgata tcgtgctgac ccagtcccca gcctctctgg ccgtgtccct gggccagcgg 1200 gccacaatct cttgtagagc ctccgagtct gtggacgatt acggcatctc cttcatgaac 1260 tggtttcagc agaagcccgg ccagccccct aagctgctga tctatgccgc ccctaatcag 1320 ggcagcggag tgccagccag gttcagcggc tccggctctg gaaccgactt ttccctgaat 1380 atccacccta tggaggagga cgatacagcc atgtactttt gtcagcagag caaggacgtg 1440 aggtggagac atcaggcagg cgaccagaca gga 1473 <210> 227 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 227 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu 20 25 30 Gly Asp Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 228 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 228 Gln Ser Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Phe 1 5 10 <210> 229 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 229 Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Leu Thr 1 5 <210> 230 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 230 Ala Ala Ser 1 <210> 231 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 231 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Glu Ile Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Phe Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 232 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 232 Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 233 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 233 Thr Arg Arg Val Pro Ile Arg Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 234 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 234 Ile Leu Pro Gly Gly Gly Asp Thr 1 5 <210> 235 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 235 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 236 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 236 Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr Trp 1 5 <210> 237 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 237 Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 238 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 238 Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Ile 1 5 <210> 239 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 239 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Pro Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser 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cctctagcgg ctactcctct ggctggaccc cattcgatta ttggggccag 720 ggcaccctgg tgacagtgag ctccggagga ggaggctctg aggtgaagct ggtggagagc 780 ggaggaggcc tggtgcagcc aggaggctcc ctgaagctgt cctgcgccgc cagcggcttc 840 gactttagcc ggtactggat gtcctgggtg agacaggccc ctggcaaggg cctggaatgg 900 atcggcgaga tcaacctgga ttctagcacc atcaattaca caccaagcct gaaggacaag 960 tttatcatct cccgggataa cgccaagaat accctgtatc tgcagatgtc caaggtgaga 1020 tctgaggaca cagccctgta ctattgcgcc cggagatacg acgccatgga ctactggggc 1080 cagggcacct ccgtgacagt gtcctctgtg gagggaggct ccggaggctc tggaggcagc 1140 ggcggctccg gcggcgtgga cgatatcgtg ctgacccagt ctcctgccag cctggccgtg 1200 tctctgggcc agagggccac aatcagctgt agagcctctg agagcgtgga cgattacggc 1260 atcagcttca tgaactggtt tcagcagaag ccaggccagc cacccaagct gctgatctat 1320 gccgccccaa atcagggctc cggagtgccc gcccggttct ccggctctgg cagcggcacc 1380 gatttttctc tgaacatcca ccctatggag gaggacgata cagccatgta cttttgtcag 1440 cagagcaagg acgtgcgctg gagacatcag gcaggagacc agacagga 1488 <210> 245 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 245 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Phe Asn Tyr His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 246 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 246 Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr 1 5 <210> 247 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 247 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val 1 5 10 <210> 248 <211> 3 <212> PRT <213> 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Synthetic peptide <400> 268 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 269 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 269 Ala Arg Gly Gln Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Met Asp Gly 1 5 10 <210> 270 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 270 Ile Asp Pro Gly Asp Ser Arg Thr 1 5 <210> 271 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 271 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Leu Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Lys Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 290 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 291 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 291 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Leu Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ser Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Asp 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gaatggctgg 720 gtgtttggcg gcggcaccaa gctgactgtc ctggctgctg aaccaaaatc atccgataag 780 acccacactt gcccaccctg cccggcgcca gaggcagcag gaggaccaag cgtgttcctg 840 tttccaccca agcccaaaga caccctgatg attagccgaa cccctgaagt cacatgcgtg 900 gtcgtgtccg tgtctcacga ggacccagaa gtcaagttca actggtacgt ggatggcgtc 960 gaggtgcata atgccaagac aaaaccccgg gaggaacagt acaacagcac ctatagagtc 1020 gtgtccgtcc tgacagtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaggaata taagtgcaaa 1080 gtgtccaata aggccctgcc cgctcctatc gagaaaacca tttctaaggc aaaaggccag 1140 cctcgcgaac cacaggtcta cgtgctgcct ccatcccggg acgagctgac aaagaaccag 1200 gtctctctgc tgtgcctggt gaaaggcttc tatccatcag atattgctgt ggagtgggaa 1260 agcaatgggc agcccgagaa caattacctg acttggcccc ctgtgctgga ctctgatggg 1320 agtttctttc tgtattctaa gctgaccgtg gataaaagta ggtggcagca gggaaatgtc 1380 tttagttgtt cagtgatgca tgaagccctg cataaccact acacccagaa aagcctgtcc 1440 ctgtcccccg ga 1452 <210> 293 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 293 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Ala Leu Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ser Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Thr Pro Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 294 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 294 Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr Ala 1 5 <210> 295 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 295 Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Thr Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 296 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 299 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val 1 5 10 <210> 300 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 300 Asn Tyr His 1 <210> 301 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 301 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 302 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 302 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 303 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 303 Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asp Pro Gly Asp Ser Arg Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser 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Synthetic polynucleotide <400> 334 gaggtcaagc tgcaggagag cggaccaggc ctggtggccc cctcccagtc tctgagcgtg 60 acctgcacag tgtctggcgt gagcctgccc gactacggcg tgtcttggat cagacagccc 120 cctagaaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctggggct ccgagacaac atactataac 180 tctgccctga agagcagact gaccatcatc aaggacaact ccaagtctca ggtgttcctg 240 aagatgaaca gcctgcagac cgacgataca gccatctact attgtgccaa gcactactat 300 tacggcggca gctatgccat ggattactgg ggccagggca cctccgtgac agtgagctcc 360 gtggagggag gctccggagg ctctggaggc agcggcggct ccggcggcgt ggacgatatc 420 cagatgaccc agaccacatc tagcctgagc gcctccctgg gcgacagggt gacaatctcc 480 tgccgcgcct ctcaggatat cagcaagtat ctgaattggt accagcagaa gcctgatggc 540 accgtgaagc tgctgatcta tcacacatcc cggctgcact ctggcgtgcc aagcaggttt 600 tctggcagcg gctccggaac cgactactcc ctgacaatct ctaacctgga gcaggaggat 660 atcgccacct atttctgtca gcagggcaat accctgcctt acacatttgg cggcggcaca 720 aagctggaaa tcaccgcagc agaaccaaaa tcctccgata aaactcacac ttgcccccct 780 tgcccggcgc cagaggcagc aggaggacca agcgtgttcc tgtttccacc caagcccaaa 840 gacaccctga tgattagccg aacccctgaa gtcacatgcg tggtcgtgtc cgtgtctcac 900 gaggacccag aagtcaagtt caactggtac gtggatggcg tcgaggtgca taatgccaag 960 acaaaacccc gggaggaaca gtacaacagc acctatagag tcgtgtccgt cctgacagtg 1020 ctgcaccagg attggctgaa cggcaaggaa tataagtgca aagtgtccaa taaggccctg 1080 cccgctccta tcgagaaaac catttctaag gcaaaaggcc agcctcgcga accacaggtc 1140 tacgtgctgc ctccatcccg ggacgagctg acaaagaacc aggtctctct gctgtgcctg 1200 gtgaaaggct tctatccatc agatattgct gtggagtggg aaagcaatgg gcagcccgag 1260 aacaattacc tgacttggcc ccctgtgctg gactctgatg ggagtttctt tctgtattct 1320 aagctgaccg tggataaaag taggtggcag cagggaaatg tctttagttg ttcagtgatg 1380 catgaagccc tgcataacca ctacacccag aaaagcctgt ccctgtcccc cgga 1434 <210> 335 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 335 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr 20 25 30 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 339 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 100 105 <210> 340 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 340 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 1 5 <210> 341 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 341 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 342 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 342 His Thr Ser 1 <210> 343 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 343 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 344 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 344 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 345 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 345 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 346 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 346 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 347 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 347 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 348 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 348 His His His His His His 1 5 <210> 349 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 349 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 350 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 350 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25

Claims (62)

  1. 면역치료제에 의한 종양 세포 결합의 재유도 방법으로서, 상기 방법이 상기 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물과 상기 면역치료제의 접촉을 포함하고, 상기 면역치료제가 하기:
    i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는
    ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고,
    상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상이한, 방법.
  2. 상기 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 면역치료제의 상기 치료 효과의 연장 방법으로서, 상기 방법이 상기 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물의 유효량을 상기 환자에 투여하는 것을 포함하고, 상기 면역치료제가 하기:
    i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는
    ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고,
    상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상이한, 방법.
  3. 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 암의 치료 방법으로서, 상기 방법이 상기 환자에 다중-특이적 항원-결합 작제물의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물이 상기 면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하고, 상기 면역치료제가 하기:
    i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는
    ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고,
    상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상이한, 방법.
  4. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 환자가 상기 면역치료제로 사전 치료를 받았던, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 환자가 상기 사전 치료로부터 재발하였거나 상기에 반응하는데 실패하였던, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 환자가 상기 제2 종양-관련 항원 에피토프에서 감소, 또는 상기의 발현의 손실로 인해 상기 사전 치료로부터 재발하였거나 상기에 반응하는데 실패하였던, 방법.
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 환자가 상기 제2 종양-관련 항원 에피토프의 발현의 불균질성으로 인해 상기 사전 치료로부터 재발하였거나 상기에 반응하는데 실패하였던, 방법.
  8. 청구항 2 또는 3에 있어서, 상기 환자가 상기 면역치료제로 치료를 받고 있고 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물이 상기 면역치료제에 부속 치료로서 투여되는, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 면역치료제가 조작된 T-세포 또는 조작된 NK 세포이고 상기 T-세포 또는 NK 세포가 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물을 공-발현시키도록 추가로 조작되는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제가 조작된 T-세포 또는 조작된 NK 세포인, 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 조작된 T-세포 또는 조작된 NK 세포가 상기 항원-결합 도메인을 포함하는 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키도록 조작되는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제가 T-세포 및 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제인, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 치료제가 이중특이적 항체인, 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 치료제가 이중특이적 T-세포 관여체 (BiTE)인, 방법.
  15. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 면역치료제의 상기 항원-결합 도메인에 결합하는, 방법.
  16. 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 항원-결합에 관여되지 않는 상기 면역치료제의 영역에 결합하는, 방법.
  17. 상기 CAR 또는 TCR에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는 다중-특이적 항원-결합 작제물과 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR)을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포의 접촉을 포함하는 T-세포 또는 NK 세포의 활성화 방법으로서, 상기 CAR 또는 TCR이 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 세포가 T-세포인, 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 T-세포가 CAR을 발현시키도록 조작되는, 방법.
  20. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상기 동일한 항원의 에피토프인, 방법.
  21. 청구항 1 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상이한 항원의 에피토프인, 방법.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 종양-관련 항원 에피토프가 혈액 암과 관련되는, 방법.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양-관련 항원 에피토프가 혈액 암과 관련되는, 방법.
  24. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 종양-관련 항원 에피토프가 악성 B-세포로 표현되는, 방법.
  25. 청구항 1 내지 21 및 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양-관련 항원 에피토프가 악성 B-세포로 표현되는, 방법.
  26. 청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 종양-관련 항원 에피토프가 고형 종양과 관련되는, 방법.
  27. 청구항 1 내지 21 및 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 종양-관련 항원 에피토프가 고형 종양과 관련되는, 방법.
  28. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-특이적 항원 결합 작제물이 추가로 스캐폴드를 포함하고 상기 제1 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 스캐폴드에 연결되는, 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 스캐폴드가 Fc를 포함하는, 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 Fc가, CH3 서열을 각각 포함하는, 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 방법.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 제1 Fc 폴리펩타이드에 연결되고 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결되는, 방법.
  32. 청구항 30 또는 31에 있어서, 상기 Fc가 적어도 하나의 CH3 서열에서 아미노산 변형을 포함하는 이종이량체 Fc인, 방법.
  33. 청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 링커에 의해 연결되는, 방법.
  34. 청구항 1 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 각각 독립적으로 Fab, scFv 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)인, 방법.
  35. 청구항 1 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물이 추가로 하나 이상의 추가의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 방법.
  36. 하기를 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 작제물로서:
    면역치료제에 결합하는 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물, 그리고 제1 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 제2 항원 결합 폴리펩타이드 작제물,
    상기 면역치료제가 하기:
    i) 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합하는 항원-결합 도메인을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포, 또는
    ii) T-세포에 그리고 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제이고,
    상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상이한, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  37. 청구항 36에 있어서, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상기 동일한 항원의 에피토프인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  38. 청구항 36에 있어서, 상기 제1 및 제2 종양-관련 항원 에피토프가 상이한 항원의 에피토프인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  39. 청구항 36 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제 및 상기 제1 종양-관련 항원 에피토프에 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물의 결합이 상기 조작된 T-세포 또는 조작된 NK 세포, 또는 상기 치료제에 의해 결합된 T-세포를 활성화시키는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  40. 청구항 36 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제가 조작된 T-세포 또는 조작된 NK 세포인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  41. 청구항 40에 있어서, 상기 조작된 T-세포 또는 조작된 NK 세포가 상기 항원-결합 도메인을 포함하는 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 발현시키도록 조작되는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  42. 청구항 36 내지 39 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역치료제가 T-세포 및 제2 종양-관련 항원 에피토프에 결합할 수 있는 치료제인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  43. 청구항 42에 있어서, 상기 치료제가 이중특이적 항체인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  44. 청구항 42에 있어서, 상기 치료제가 이중특이적 T-세포 관여체 (BiTE)인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  45. 청구항 36 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 면역치료제의 상기 항원-결합 도메인에 결합하는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  46. 청구항 36 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 항원-결합에 관여되지 않는 상기 면역치료제의 영역에 결합하는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  47. 청구항 36 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물이 추가로 스캐폴드를 포함하고 상기 제1 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 스캐폴드에 연결되는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  48. 청구항 47에 있어서, 상기 스캐폴드가 Fc인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  49. 청구항 48에 있어서, 상기 Fc가, CH3 서열을 각각 포함하는, 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 제1 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 제1 Fc 폴리펩타이드에 연결되고 상기 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 상기 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결되는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  51. 청구항 49 또는 50에 있어서, 상기 Fc가 적어도 하나의 CH3 서열에서 아미노산 변형을 포함하는 이종이량체 Fc인, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  52. 청구항 36 내지 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 링커에 의해 연결되는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  53. 청구항 36 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원-결합 폴리펩타이드 작제물이 각각 독립적으로 Fab, scFv 또는 단일 도메인 항체 (sdAb)인, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  54. 청구항 36 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물이 추가로 하나 이상의 추가의 항원-결합 폴리펩타이드 작제물을 포함하는, 다중-특이적 항원-결합 작제물.
  55. 청구항 36 내지 53 중 어느 한 항에 따른 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물, 및 약제학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는, 약제학적 조성물.
  56. 청구항 36 내지 53 중 어느 한 항에 따른 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는, 핵산.
  57. 청구항 36 내지 53 중 어느 한 항에 따른 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 숙주 세포.
  58. 약제의 상기 제조에서 청구항 36 내지 53 중 어느 한 항에 따른 상기 다중-특이적 항원-결합 작제물의, 용도.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 약제가 면역치료제에 의한 종양 세포 결합 재유도용인, 용도.
  60. 청구항 58에 있어서, 상기 약제가 상기 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 면역치료제의 상기 치료 효과의 연장용인, 용도.
  61. 청구항 58에 있어서, 상기 약제가 면역치료제로 치료를 받고 있거나 받았던 환자에서 암의 치료용인, 용도.
  62. 청구항 58에 있어서, 상기 약제가 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체 (TCR)을 발현시키도록 조작된 T-세포 또는 NK 세포의 활성화용인, 용도.
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