KR20210137997A - 라비린틴 또는 그의 부분을 표적화하는 구축물 및 그의 용도 - Google Patents

라비린틴 또는 그의 부분을 표적화하는 구축물 및 그의 용도 Download PDF

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마이클 바비치
제임스 에이. 라도세비치
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라비알엑스 이뮤놀로직 테라퓨틱스 (유에스에이) 리미티드
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Abstract

라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 및 이펙터 도메인을 포함하는 구축물이 제공된다. 또한, 이들 구축물 및 그의 조성물의 제조 및 사용 방법이 제공된다.

Description

라비린틴 또는 그의 부분을 표적화하는 구축물 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2019년 1월 8일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/789,871을 우선권 주장하며, 이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일의 하기 제출 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF) (파일명: 185722000240SEQLIST.TXT, 기록된 날짜: 2020년 1월 7일, 크기: 9 KB).
기술 분야
본 출원은 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 및 이펙터 도메인을 포함하는 구축물에 관한 것이다. 또한, 이들 구축물 및 그의 조성물의 제조 및 사용 방법이 제공된다.
역사적으로, 암은, 예를 들어 폐암, 유방암 및 결장암과 같이, 주로 암이 기원하는 조직 유형 또는 기관에 기초하여 특징화되어 왔다. 다수의 암 치료는 또한 암의 조직 또는 기관-기반 분류에 기초한다. 암의 이러한 조직 또는 기관-기반 분류가 효과적인 치료의 선택을 위한 충분한 지침을 제공할 수 없다는 것은 널리 인식되어 있다. 이는, 부분적으로, 단일 조직 유형 또는 기관으로부터 기원하는 암이 고도로 이종성일 수 있고, 이러한 차이가 개별맞춤형 암 치료 접근법을 요구할 수 있다는 사실로 인한 것이다. 예를 들어, 바이오마커에 의해 암을 정의하는 것은, 기원 조직 유형 또는 기관에 의한 경우와는 대조적으로, 개선된 암 치료를 가능하게 할 수 있으며, 예를 들어 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 HER2/neu의 발현이 결여된 삼중 음성 유방암은 이러한 확인된 수용체 중 어느 1종 이상을 표적화하는 전통적인 호르몬-기반 요법에는 반응하지 않고 대안적 치료를 요구한다. 바이오마커에 기초한 암 하위유형의 확인 후에, 이러한 암 하위유형의 효과적인 치료를 위한 신규 작용제를 개발하기 위한 상당한 연구가 요구된다.
하나의 이러한 확인된 암 하위유형은 라비린틴-발현 암이다. 라비린틴은 일부 암, 예컨대 선암종의 형질 막의 세포외 표면 상에서 발현되는 세포 표면 단백질이다. 라비린틴의 세포 표면 발현은 세포 주기 특이적이지 않다. 추가로, 라비린틴은 정상인 또는 종양 보유 환자의 혈청에서 발견되지 않고, 라비린틴 양성 세포주에 의해 배양 배지 내로 유출되지 않는다.
인간에서의 면역요법은 부분적으로 비-인간 모노클로날 항체에 대한 유해 반응으로 인해 제한되어 왔다. 설치류 항체를 사용한 초기 임상 시험은 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 및 인간 항-래트 항체 (HARA) 반응을 밝혀냈으며, 이는 항체의 급속한 클리어런스로 이어졌다. 이후 키메라 항체, 인간화 항체, 프리마티즈드(PRIMATIZED)® 항체 및 트랜스제닉 마우스 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 제조된 인간 항체를 포함한 덜 면역원성인 항체가 개발되었다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA, 81, 1984; 및 Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA, 86, 1989]을 참조한다. HAMA 반응의 회피는 치료 반응을 달성하기 위한 고용량 및 반복 용량 투여를 허용한다.
mAb를 생성하기 위해 파지 디스플레이를 사용하는 것에 있어서의 최근의 진보는 거대 항체 레퍼토리로부터 정의된 에피토프에 대한 정교한 특이성을 갖는 작용제를 선택하는 것을 가능하게 하였다. HLA-A01 및 HLA-A02와 관련하여 고형 종양 항원에 특이적인 다수의 이러한 mAb는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 성공적으로 선택되었다 (Noy et al., Expert Rev Anticancer Ther, 5, 2005; Chames et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97, 2000; Held et al., Eur J Immunol, 34, 2004; Lev et al., Cancer Res, 62, 2002; Klechevsky et al., Cancer Res, 68, 2008). 보다 최근에, 널리 기재된 T 세포 에피토프인 인간 WT1/HLA-A02 복합체에 특이적인 인간 mAb는 세포 검정 및 생체내 모델에서 Fc-매개 이펙터 세포 기능을 통해 다발성 암 세포주 및 원발성 암 세포를 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Dao et al., Sci Transl Med, 5, 2013; Veomett et al., Clin Cancer Res, 2014).
특허 출원 및 공개를 포함한 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다.
한 측면에서, 본 출원은 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 및 이펙터 도메인을 포함하는 단리된 항-라비린틴 구축물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 이펙터 도메인에 접합된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 치료제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료제는 약물, 독소, 방사성동위원소, 단백질, 펩티드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단리된 항-라비린틴 구축물은 항체 약물 접합체 (ADC)이다.
일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 진단제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 진단제는 표지이다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 이펙터 도메인에 융합된다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-라비린틴 구축물은 이펙터 도메인에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이며, 여기서 이펙터 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-라비린틴 구축물은 항-CD3 항체 또는 그의 단편에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 이중특이적 T-세포 연관체 (BiTE)이다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-라비린틴 구축물은 이펙터 도메인에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 T-세포 수용체 (TCR)이며, 여기서 이펙터 도메인은 TCR 서브유닛의 막횡단 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv (scFv)이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 라비린틴 또는 그의 부분에 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 Kd로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 서열식별번호: 2-32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 라비린틴-유래 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 B-세포 및 T-세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 B-세포 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 T-세포 에피토프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 다중특이적이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체 모이어티는 탠덤 scFv, 디아바디 (Db), 단일 쇄 디아바디 (scDb), 이중-친화도 재표적화 (DART) 항체, 이중 가변 도메인 (DVD) 항체, 노브-인투-홀 (KiH) 항체, 독 앤 락 (DNL) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다량체 항체 또는 이종접합체 항체이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체 모이어티는 임의적인 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물을 발현하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 이펙터 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 (a) 표면 상에 라비린틴 또는 그의 부분을 제시하는 세포를 단리된 항-라비린틴 구축물과 접촉시키는 단계이며, 여기서 단리된 항-라비린틴 구축물은 표지를 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 세포 상의 표지의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 표면 상에 라비린틴 또는 그의 부분을 제시하는 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체에게 (a) 유효량의 본원에 기재된 임의의 제약 조성물; 또는 (b) 유효량의 본원에 기재된 임의의 이펙터 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 라비린틴 상태는 치료를 위한 개체를 선택하기 위한 기준으로서 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 (a) 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체에게 유효량의 단리된 항-라비린틴 구축물을 투여하는 단계이며, 여기서 단리된 항-라비린틴 구축물은 표지를 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 개체에서 표지의 수준을 결정하는 단계이며, 여기서 한계 수준을 초과하는 표지의 수준은 개체가 라비린틴-양성 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 (a) 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체로부터 유래된 샘플을 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 샘플에서 단리된 항-라비린틴 구축물과 결합된 1개 이상의 세포를 확인하고, 이에 의해 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 단계를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 라비린틴-양성 질환은 라비린틴-양성 암이다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-양성 암은 선암종이다.
도 1a-1b는 MCA 44-3A6 마우스 모노클로날 IgG 항체 (도 1a) 및 X373 scFV 유도체 (도 1b)의 시간에 따른 결합 반응 측정치를 보여준다.
도 2는 X509Fab를 사용한 A549 폐 선암종 세포 (양성 대조군) 및 WI38 섬유모세포 (음성 대조군)로부터의 용해물의 웨스턴 이뮤노블롯을 보여준다.
본 출원은, 일부 측면에서, 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 및 이펙터 도메인을 포함하는 단리된 구축물 ("항-라비린틴 구축물" 또는 "항-LAB 구축물"로 지칭됨)을 제공한다. 또한, 이들 구축물 및 그의 조성물의 제조 및 사용 방법이 제공된다.
본 출원은, 부분적으로, 특정 암, 예컨대 선암종이 세포 표면 라비린틴을 선택적으로 발현하고, 라비린틴-양성 암이 라비린틴을 유출시키지 않는다는 발견에 기초한다. 추가로, 정상적인 비-암성 암은 세포 표면 라비린틴을 발현하지 않는다. 따라서, 라비린틴은 라비린틴-양성 암을 정의하기 위한 유용한 마커 및 면역요법 기반 치료를 위한 표적을 나타낸다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 출원은 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 및 이펙터 도메인을 포함하는 단리된 항-라비린틴 구축물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-라비린틴 구축물은 이펙터 도메인에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이며, 여기서 이펙터 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-라비린틴 구축물은 항-CD3 항체 또는 그의 단편에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 이중특이적 T-세포 연관체 (BiTE)이다.
일부 실시양태에서, 단리된 항-라비린틴 구축물은 이펙터 도메인에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 T-세포 수용체 (TCR)이며, 여기서 이펙터 도메인은 TCR 서브유닛의 막횡단 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물을 발현하는 숙주 세포를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 핵산을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 본원에 기재된 임의의 핵산을 포함하는 이펙터 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 (a) 표면 상에 라비린틴 또는 그의 부분을 제시하는 세포를 단리된 항-라비린틴 구축물과 접촉시키는 단계이며, 여기서 단리된 항-라비린틴 구축물은 표지를 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 세포 상의 표지의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 표면 상에 라비린틴 또는 그의 부분을 제시하는 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체에게 (a) 유효량의 본원에 기재된 임의의 제약 조성물; 또는 (b) 유효량의 본원에 기재된 임의의 이펙터 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 (a) 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체에게 유효량의 단리된 항-라비린틴 구축물을 투여하는 단계이며, 여기서 단리된 항-라비린틴 구축물은 표지를 포함하는 이펙터 도메인을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 개체에서 표지의 수준을 결정하는 단계이며, 여기서 한계 수준을 초과하는 표지의 수준은 개체가 라비린틴-양성 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 출원은 (a) 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체로부터 유래된 샘플을 본원에 기재된 임의의 단리된 항-라비린틴 구축물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 샘플에서 단리된 항-라비린틴 구축물과 결합된 1개 이상의 세포를 확인하고, 이에 의해 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 단계를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 구현예의 형태 및 세부사항에서의 변화가 본 개시내용의 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다. 추가로, 다양한 이점, 측면 및 목적이 다양한 구현예와 관련하여 기재되었지만, 본 개시내용의 범주가 이러한 이점, 측면 및 목적을 참조로 제한되어서는 안된다.
정의
용어 "항체 모이어티"는 전장 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 전장 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 두 쇄 내의 가변 영역은 일반적으로, 상보성 결정 영역 (CDR) (LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함한 경쇄 (LC) CDR, HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함한 중쇄 (HC) CDR)으로 불리는 3개의 고도로 가변성인 루프를 함유한다. 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편에 대한 CDR 경계는 카바트(Kabat), 코티아(Chothia) 또는 알-라지카니(Al-Lazikani)의 규정에 의해 정의 또는 확인될 수 있다 (Al-Lazikani 1997; Chothia 1985; Chothia 1987; Chothia 1989; Kabat 1987; Kabat 1991). 중쇄 또는 경쇄의 3개의 CDR은, CDR보다 더 고도로 보존되며 초가변 루프를 지지하기 위해 스캐폴드를 형성하는 프레임워크 영역 (FR)으로 공지된 플랭킹 스트레치 사이에 놓여있다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초한 부류로 배정된다. 항체의 5가지 주요 부류 또는 이소형은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이며, 이들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 한다. 주요 항체 부류 중 몇몇은 하위부류, 예컨대 IgG1 (γ1 중쇄), IgG2 (γ2 중쇄), IgG3 (γ3 중쇄), IgG4 (γ4 중쇄), IgA1 (α1 중쇄) 또는 IgA2 (α2 중쇄)로 나뉜다.
본원에 사용된 용어 "항원-결합 단편"은, 예를 들어 디아바디, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술피드 안정화된 Fv 단편 (dsFv), (dsFv)2, 이중특이적 dsFv (dsFv-dsFv'), 디술피드 안정화된 디아바디 (ds 디아바디), 단일-쇄 항체 분자 (scFv), scFv 이량체 (2가 디아바디), 1개 이상의 CDR을 포함하는 항체의 부분으로부터 형성된 다중특이적 항체, 낙타화 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지는 않는 임의의 다른 항체 단편을 포함한 항체 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편은 모 항체 또는 모 항체 단편 (예를 들어, 모 scFv)이 결합하는 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 단편은 1개 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 그라프트된, 특정한 인간 항체로부터의 1개 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "에피토프"는 항체 또는 항체 모이어티가 결합하는 항원 상의 특정 원자단 또는 아미노산을 지칭한다. 2개의 항체 또는 항체 모이어티는 이들이 항원에 대한 경쟁적 결합을 나타내는 경우에 항원 내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 제1 항체 모이어티는, 제1 항체 모이어티가 제2 항체 모이어티의 표적 라비린틴 결합을 등몰 농도의 제1 항체 모이어티의 존재 하에 적어도 약 50% (예컨대 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 것)만큼 억제하는 경우에, 표적 라비린틴에의 결합에 대해 제2 항체 모이어티와 "경쟁"하며, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 항체를 교차-경쟁에 기초하여 "비닝"하기 위한 고처리량 공정이 PCT 공개 번호 WO 03/48731에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "에 특이적인"은 생물학적 분자를 포함한 분자의 불균질 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정하는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대 표적과 항체 또는 항체 모이어티 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, 표적 (에피토프일 수 있음)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 모이어티는 다른 표적에 결합하는 경우보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속기간 동안 이러한 표적에 결합하는 항체 또는 항체 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 모이어티는 다른 표적에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배인 결합 친화도로 항원의 1종 이상의 항원 결정기 (예를 들어, 라비린틴 또는 그의 부분)와 반응한다.
본원에 사용된 "단리된" 항-라비린틴 구축물은 (1) 자연에서 발견되는 단백질과 회합되지 않거나, (2) 동일한 공급원으로부터의 다른 단백질이 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 자연에서 발생하지 않는 항-라비린틴 구축물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "단리된 핵산"은 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 핵산 또는 그의 일부 조합을 의미하는 것으로 의도되며, 그의 기원에 의해 "단리된 핵산"은 (1) "단리된 핵산"이 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 모두 또는 부분과 회합되지 않거나, (2) 자연에서 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) 보다 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다의 가변 영역 내에서 발견되는 비-연속 항원 결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이들 특정한 영역은 문헌 [Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 의해 기재되었으며, 여기서 정의는 서로에 대해 비교하였을 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그라프트된 항체 또는 그의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 각각의 상기 인용된 참고문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 아미노산 잔기가 비교로서 하기 표 1에 제시된다.
표 1: CDR 정의
Figure pct00001
1잔기 넘버링은 상기 문헌 [Kabat et al.]의 명명법을 따른다
2잔기 넘버링은 상기 문헌 [Chothia et al.]의 명명법을 따른다
3잔기 넘버링은 상기 문헌 [MacCallum et al.]의 명명법을 따른다
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동이고, 한편 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동인 항체, 뿐만 아니라 본 발명의 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 지칭한다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조).
항체 또는 항체 모이어티와 관련하여 용어 "반합성"은 항체 또는 항체 모이어티가 1개 이상의 자연 발생 서열 및 1개 이상의 비-자연 발생 (즉, 합성) 서열을 갖는다는 것을 의미한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인이 단단하게 비-공유 회합된 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인의 폴딩으로부터 6개의 초가변 루프 (중쇄 및 경쇄로부터 각각 3개의 루프)가 발생하며, 이는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR 만을 포함하는 Fv의 절반)도, 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도로이긴 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단일-쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 전형적으로 VH 및 VL 도메인 사이의 짧은 링커 (예컨대 약 5 내지 약 10개의 잔기)로 scFv 단편 (상기 단락 참조)을 구축하여 V 도메인들의 쇄내 쌍형성이 아닌 쇄간 쌍형성이 달성되도록 하여 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 생성함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄 상에 존재하는 2개의 "교차" scFv 단편의 이종이량체이다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 보다 상세하게 기재되어 있다.
비-인간 (예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이며, 여기서 수용자의 초가변 영역 (HVR)으로부터의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 것이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 정밀화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재하는 것으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 FcR은 IgG 항체 (γ 수용체)에 결합하고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체 (이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태 포함)를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에 있어서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (문헌 [M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 검토 참조). 용어는 동종이형, 예컨대 FcγRIIIA 동종이형: FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131을 포함한다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 향후 확인될 것을 포함한 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포괄된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
용어 "FcRn"은 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 지칭한다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체 (MHC)와 구조적으로 유사하고, β2-마이크로글로불린에 비공유 결합된 α-쇄로 이루어진다. 신생아 Fc 수용체인 FcRn의 다수의 기능은 문헌 [Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766]에서 검토된다. FcRn은 모체로부터 태아로의 이뮤노글로불린 IgG의 수동 전달 및 혈청 IgG 수준의 조절에서 소정의 역할을 한다. FcRn은 샐비지 수용체로서 작용하여, 세포 내에서 및 세포를 가로질러 둘 다로 무손상 형태의 음세포작용된 IgG에 결합하여 이를 수송하고, 이를 디폴트 분해 경로로부터 구제할 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인" ("H1" 도메인의 "C1"로도 지칭됨)은 통상적으로 약 아미노산 118에서 약 아미노산 215 (EU 넘버링 시스템)에 이른다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216에서 Pro230에 이르는 것으로 정의된다 (Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 동일한 위치에 배치함으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("H2" 도메인의 "C2"로도 지칭됨)은 통상적으로 약 아미노산 231에서 약 아미노산 340에 이른다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 밀접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 특유하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 놓여있다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대안을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추측되었다. 문헌 [Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)].
"CH3 도메인" ("C2" 또는 "H3" 도메인으로도 지칭됨)은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기의 스트레치 (즉, 항체 서열의 약 아미노산 잔기 341에서 C-말단 단부, 전형적으로 IgG의 아미노산 잔기 446 또는 447까지)를 포함한다.
"기능적 Fc 단편"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구하고, 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성이 "변경된" 변이체 IgG Fc를 갖는 항체는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 증진 또는 감소된 FcR 결합 활성 (예를 들어, FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체 Fc는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 IgG Fc보다 더 높은 친화도 (예를 들어, 더 낮은 겉보기 Kd 또는 IC50 값)로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. 일부 실시양태에 따르면, 모 폴리펩티드와 비교하여 결합 개선은 약 3배, 예컨대 약 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200 또는 최대 500배 중 어느 것 또는 약 25% 내지 1000%의 결합 개선이다. FcR에 대한 "감소된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 낮은 친화도 (예를 들어, 더 높은 겉보기 Kd 또는 더 높은 IC50 값)로 적어도 1개의 FcR에 결합한다. 모 폴리펩티드와 비교하여 결합 감소는 약 40% 또는 그 초과의 결합 감소일 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는, 특정 세포독성 세포 (예를 들어 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합된 분비된 Ig에 의해 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하고 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"시키고 이러한 사멸에 절대적으로 요구된다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 것이 수행될 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
인간 이펙터 세포의 존재 하에 야생형 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 매개하거나 또는 "증가된 ADCC를 나타내는" 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 검정에서 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 및 야생형 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드 (또는 모 폴리펩티드)의 양이 본질적으로 동일한 경우에, 시험관내 또는 생체내에서 ADCC를 매개하는데 실질적으로 더 효과적인 것이다. 일반적으로, 이러한 변이체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 시험관내 ADCC 검정, 예컨대, 예를 들어 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하기 위한 검정 또는 방법을 사용하여 확인될 것이다. 일부 실시양태에서, 변이체는 야생형 Fc (또는 모 폴리펩티드)보다 ADCC를 매개하는데 있어서 약 5배 내지 약 100배, 예를 들어 약 25배 내지 약 50배 더 효과적이다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 전형적 보체 경로의 활성화는 보체계의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위부류의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합 능력이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 번호 6,194,551B1 및 WO99/51642에 기재되어 있다. 이들 특허 공개의 내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다. 또한, 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축중성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 어구 단백질 또는 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 또한 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결로 후자의 발현을 유발하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 위치할 때 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에, 동일한 리딩 프레임 내에 있다.
"상동"은 2개의 폴리펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 서열 둘 다에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유되는 경우에, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유된다면, 분자는 그 위치에서 상동이다. 2개의 서열 사이의 상동성 퍼센트는 2개의 서열에 의해 공유되는 매칭 또는 상동 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나눈 것 곱하기 100의 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열에서의 위치 10개 중 6개가 매칭되거나 상동이면, 2개의 서열은 60% 상동이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 2개의 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬된 경우에 이루어진다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 상동인"은 참조 서열과 비교하여 본원에 개시된 서열의 서열 유사성을 지칭하며, 여기서 서열은 참조 또는 그의 부분과 적어도 약 85% 유사성 (예를 들어, 상동성), 예컨대 적어도 약 86% 유사성, 87% 유사성, 88% 유사성, 89% 유사성, 90% 유사성, 91% 유사성, 92% 유사성, 93% 유사성, 94% 유사성, 95% 유사성, 96% 유사성, 97% 유사성, 98% 유사성, 99% 유사성 또는 100% 유사성 중 어느 것을 갖는다. 서열 유사성을 결정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Pearson, W. R., Curr Protoc Bioinformatics, 2013]에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 경우의 용어 "표지"는 항-라비린틴 항체 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소적 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원에 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함한 유익하거나 목적하는 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 목적하는 임상 결과는 하기 중 1가지 이상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 질환으로부터 발생하는 1종 이상의 증상을 완화시키는 것, 질환의 정도를 감소시키는 것, 질환을 안정화시키는 것 (예를 들어, 질환의 악화를 방지 또는 지연시키는 것), 질환의 확산 (예를 들어, 전이)을 방지 또는 지연시키는 것, 질환의 재발생을 방지 또는 지연시키는 것, 질환의 진행을 지연 또는 둔화시키는 것, 질환 상태를 호전시키는 것, 질환의 (부분 또는 전체) 완화를 제공하는 것, 질환을 치료하는데 요구되는 1종 이상의 다른 의약의 용량을 감소시키는 것, 질환의 진행을 지연시키는 것, 삶의 질을 증가 또는 개선시키는 것, 체중 증가를 증가시키는 것 및/또는 생존을 연장시키는 것. 또한, "치료"에는 암의 병리학적 결과 (예컨대, 예를 들어 종양 부피)의 감소가 포괄된다. 본 발명의 방법은 치료의 이들 측면 중 어느 1가지 이상을 고려한다.
용어 "재발생", "재발" 또는 "재발된"은 질환 소멸의 임상 평가 후 암 또는 질환의 복귀를 지칭한다. 원격 전이 또는 국부 재발생의 진단은 재발로 간주될 수 있다.
용어 "불응성" 또는 "저항성"은 암 또는 질환이 치료에 반응하지 않은 것을 지칭한다.
T 세포와 관련하여 본원에 사용된 "활성화"는 검출가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 시토카인 생산 및 검출가능한 이펙터 기능과 연관될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 명시된 장애, 상태 또는 질환을 치료하기에, 예컨대 장애, 상태 또는 질환의 1종 이상의 증상을 호전, 완화, 경감 및/또는 지연시키기에 충분한 화합물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암과 관련하여, 유효량은, 예를 들어 종양이 축소되도록 유발하고/거나 종양의 성장 속도를 감소시키거나 (예컨대 종양 성장을 억제함) 또는 암에서 다른 원치않는 세포 증식을 방지하거나 지연시키기에 충분한 양을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유효량은 암의 발달을 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 유효량은 재발생을 방지하거나 지연시키기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 암의 경우에, 약물 또는 조성물의 유효량은 (i) 암성 세포의 수를 감소시킬 수 있고/거나; (ii) 종양 크기를 감소시킬 수 있고/거나; (iii) 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 어느 정도까지 억제, 지체, 둔화, 바람직하게는 정지시킬 수 있고/거나; (iv) 종양 전이를 억제할 수 있고/거나 (예를 들어, 어느 정도까지 둔화, 바람직하게는 정지시킴); (v) 종양 성장을 억제할 수 있고/거나; (vi) 종양의 발생 및/또는 재발생을 방지 또는 지연시킬 수 있고/거나; (vii) 암과 연관된 증상 중 1종 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는" 또는 "약리학상 상용성인"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 예를 들어 물질은 임의의 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 또는 물질이 함유된 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 제약 조성물에 혼입될 수 있다. 제약상 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학적 및 제조 시험의 요구되는 표준을 충족시키고/거나 미국 식품 의약품국에 의해 작성된 불활성 성분 지침에 포함된다.
본원에 사용된 암의 발달을 "지연시키는 것"은 질환의 발달을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화 및/또는 미루는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 질환 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 유의한 지연은 사실상 개체에서 질환이 발달하지 않는다는 점에서 예방을 포괄할 수 있다. 암의 발달을 "지연시키는" 방법은, 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여, 주어진 시간 프레임에서 질환 발달의 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 질환의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 수의 대상체를 사용하는 임상 연구에 기초한다. 암 발달은 컴퓨터 축 단층촬영 (CAT 스캔), 자기 공명 영상화 (MRI), 복부 초음파, 응고 시험, 동맥조영 또는 생검을 포함하나 이에 제한되지는 않는 표준 방법을 사용하여 검출가능할 수 있다. 발달은 또한 초기에 검출불가능할 수 있는 암 진행을 지칭할 수 있고, 발생, 재발생 및 발병을 포함한다.
용어 "개체"는 포유동물을 지칭하며, 인간, 소, 말, 고양이, 개, 설치류 또는 영장류를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "에 기초한" 또는 "에 대한 기준"은 본원에 기재된 바와 같은 개체 또는 그 안의 암의 1가지 이상의 특징을 평가, 결정, 수득 또는 측정하고, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 기재된 바와 같은 치료를 받기에 적합한 개체를 선택하는 것을 포함한다. 예를 들어, 암의 라비린틴 상태가 본원의 치료 방법을 위한 개체를 선택하기 위한 기준으로서 사용되는 경우에, 라비린틴 상태를 평가 (또는 평가 보조), 측정, 수득 또는 결정하는 것은 본원에 기재된 바와 같은 치료 방법에 포함될 수 있으며, 예를 들어 라비린틴 상태는 치료 전 및/또는 치료 동안 및/또는 치료 후에 측정되고, 수득된 값은 임상의에 의해 하기 중 어느 것을 평가하는데 사용된다: (a) 개체가 초기에 치료(들)를 받을 개연성 또는 가능성 있는 적합성; (b) 개체가 초기에 치료(들)를 받을 개연성 또는 가능성 있는 부적합성; (c) 치료에 대한 반응성; (d) 개체가 치료(들)를 계속 받을 개연성 또는 가능성 있는 적합성; (e) 개체가 치료(들)를 계속 받을 개연성 또는 가능성 있는 부적합성; (f) 투여량의 조정; 또는 (g) 임상 이익의 예측 가능성.
라비린틴 상태와 같이 본 출원의 방법에서 사용하기 위한 본원에 개시된 기준 또는 기초는 일부 측면에서 대조군과의 비교에 기초할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대조군은 문헌으로부터 수득된 공지된 표준 (예를 들어, 공지된 유전자 서열, RNA 서열, 단백질 서열, 유전자 발현 수준)이다. 일부 실시양태에서, 대조군은 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료되는 또는 치료될 개체로부터 수득된 대조군 샘플 (예를 들어, 비-암성 조직으로부터의 대조군 샘플)이다. 일부 실시양태에서, 대조군은 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료되는 또는 치료될 개체 이외의 개체로부터 수득된 대조군 샘플 (예를 들어, 건강한 지원자 또는 암을 갖지 않는 지원자로부터의 대조군 샘플)이다. 일부 실시양태에서, 대조군은 주어진 환자 집단으로부터 수득된다. 예를 들어, 유전자 발현 수준 또는 효소 활성 수준과 관련하여, 대조군 수준은 환자 집단에 대한 그 유전자의 중앙 발현 수준 또는 그 효소의 중앙 효소 활성 수준일 수 있다. 그리고, 예를 들어 단일 환자에 대한 관심 유전자의 발현 수준이 환자 집단의 중앙 발현 수준 초과인 것으로 결정되는 경우에, 그 환자는 관심 유전자의 높은 발현을 갖는 것으로 결정된다. 대안적으로, 단일 환자에 대한 관심 유전자의 발현 수준이 환자 집단의 중앙 발현 수준 미만인 것으로 결정되는 경우에, 그 환자는 관심 유전자의 낮은 발현을 갖는 것으로 결정된다. 일부 실시양태에서, 단일 환자는 질환 (예컨대 암)을 갖고, 환자 집단은 질환을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 단일 환자 및 환자 집단은 동일한 조직학적 유형의 질환을 갖는다. 집단은 측정된 개체의 수의 관점에서 약 또는 대안적으로 적어도 약 하기 중 어느 것일 수 있다: 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 60, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500. 바람직하게는, 통계적으로 유의한 집단을 제공하기에 충분한 수의 개체가 측정되며, 이는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 집단은 임상 시험에 참여하는 군이다.
본원에 사용된 용어 "포함하는", "갖는", "함유하는" 및 "포함한" 및 다른 유사한 형태 및 그의 문법적 등가물은 의미상 등가인 것으로 의도되고, 이들 단어 중 어느 하나에 이어지는 항목 또는 항목들이 이러한 항목 또는 항목들의 완전한 목록이 아닌 것으로 의도되거나 또는 열거된 항목 또는 항목들에만 제한되지는 않는 것으로 의도된다는 점에서 개방형인 것으로 의도된다. 예를 들어, 성분 A, B 및 C를 "포함하는" 항목은 성분 A, B 및 C로 이루어질 수 있거나 (즉, 단지 이들만을 함유할 수 있거나), 또는 성분 A, B 및 C뿐만 아니라 하나 이상의 다른 성분을 함유할 수 있다. 따라서, "포함하다" 및 그의 유사한 형태 및 그의 문법적 등가물은 "본질적으로 이루어진" 또는 "이루어진"의 실시양태의 개시내용을 포함하는 것으로 의도되고 이해된다.
값의 범위가 제공되는 경우에, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의 하한치 단위의 1/10까지의 각각의 개재 값 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급된 값 또는 개재 값은, 언급된 범위 내의 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라, 본 개시내용 내에 포괄되는 것으로 이해된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우에, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 배제하는 범위가 또한 본 개시내용에 포함된다.
본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 변동을 포함 (및 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
첨부된 청구범위를 포함한 본원에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
항-LAB 구축물
본 출원은 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 및 이펙터 도메인을 포함하는 항-라비린틴 구축물 (본원에서 "항-LAB 구축물"로 지칭됨), 예컨대 단리된 항-LAB 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 이펙터 도메인에 접합된다. 예를 들어, 이펙터 도메인은 치료제 또는 표지일 수 있는 이펙터 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료제는 약물, 독소, 방사성동위원소, 단백질, 펩티드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 진단제, 예컨대 표지이다. 이펙터 분자의 접합은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 공유 접합 (예를 들어, 화학 결합을 통해 또는 링커를 통해) 또는 비-공유 상호작용 (예를 들어, 비오틴/스트렙타비딘 및 다른 단백질-단백질 상호작용 쌍을 통해)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-라비린틴 구축물은 융합 단백질이다. 예를 들어, 항-라비린틴 항체 모이어티는 CAR (키메라 항원 수용체), 조작된 TCR 또는 이중특이적 T 세포 연관체 분자의 일부일 수 있다. 이들 다양한 구축물은 하기 섹션에서 보다 상세하게 논의된다.
항-LAB CAR
본 출원은 한 측면에서 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR) (본원에서 "항-LAB CAR"로 지칭됨)를 제공한다. 또한, 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 CAR을 포함하는 CAR 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포) (본원에서 "항-LAB CAR 이펙터 세포", 예를 들어 "항-LAB CAR T 세포"로도 지칭됨)가 제공된다.
항-LAB CAR은 (a) 라비린틴에 특이적으로 결합하는 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 (b) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 막횡단 도메인은 세포외 도메인과 세포내 도메인 사이에 존재할 수 있다. 항-LAB CAR의 세포외 도메인과 막횡단 도메인 사이에 또는 항-LAB CAR의 세포내 도메인과 막횡단 도메인 사이에, 링커 또는 스페이서 도메인이 존재할 수 있다. 링커 또는 스페이서 도메인은 막횡단 도메인을 폴리펩티드 쇄 내의 세포외 도메인 또는 세포내 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드일 수 있다. 스페이서 도메인은, 예를 들어 약 10 내지 약 100개 또는 약 25 내지 약 50개의 아미노산을 포함한, 약 300개 이하의 아미노산을 포함할 수 있다.
막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 특히 유용한 막횡단 영역은 T-세포 수용체의 α, β, δ 또는 γ 쇄, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154로부터 유래될 수 있다 (즉, 적어도 그의 막횡단 영역(들)을 포함할 수 있음). 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우에 이는 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 우세하게 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체는 합성 막횡단 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 약 2 내지 약 10개 (예컨대 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 중 어느 것)의 아미노산 길이의 길이를 갖는 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커는 항-LAB CAR의 막횡단 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 글리신-세린 이중체이다.
일부 실시양태에서, 항-LAB CAR의 세포내 도메인 내의 서열 중 하나와 자연적으로 회합되는 막횡단 도메인이 사용된다 (예를 들어, 항-LAB CAR 세포내 도메인이 CD28 공동-자극 서열을 포함하는 경우에, 항-LAB CAR의 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인으로부터 유래됨). 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 결합하는 것을 피하여 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하도록 선택되거나 또는 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다.
항-LAB CAR의 세포내 신호전달 도메인은 항-LAB CAR이 위치한 면역 세포의 정상 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어 시토카인의 분비를 포함한 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질의 부분을 지칭한다. 통상적으로 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단된 부분이 사용되는 정도로, 이러한 말단절단된 부분은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한 무손상 쇄 대신에 사용될 수 있다. 용어 "세포내 신호전달 서열"은 따라서 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 말단절단된 부분을 포함하는 것으로 의도된다.
본 발명의 항-LAB CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예는, T 세포 수용체 (TCR) 및 항원 수용체 연관 후 신호 전달을 개시하기 위해 함께 작용하는 보조-수용체의 세포질 서열, 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서 TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하고, 2차 또는 공동-자극 신호가 또한 요구될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, T 세포 활성화는 일부 실시양태에서 다음 2가지 별개의 부류의 세포내 신호전달 서열에 의해 매개될 수 있다: TCR을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것 (1차 신호전달 서열) 및 항원-비의존성 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 것 (공동-자극 신호전달 서열). 1차 신호전달 서열은 자극 방식으로 또는 억제 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-LAB CAR 구축물은 1개 이상의 ITAM을 포함한다. 본 발명에서 특히 유용한 1차 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-LAB CAR은 CD3ζ로부터 유래된 1차 신호전달 서열을 포함한다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 그 자체로 또는 본 발명의 항-LAB CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 목적하는 세포내 신호전달 서열(들)과 조합하여 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-LAB CAR의 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 공동자극 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 공동자극 신호전달 서열은, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한 공동자극 분자의 세포내 도메인의 부분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-LAB CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포내 신호전달 서열 및 CD28의 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포내 신호전달 서열 및 4-1BB의 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포내 신호전달 서열 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 신호전달 서열을 포함한다.
따라서, 예를 들어 일부 실시양태에서, (a) 라비린틴에 특이적으로 결합하는 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, (b) 막횡단 도메인 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 항-LAB CAR이 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 서열 및 공동-자극 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 신호전달 서열은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 서열은 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다.
항-LAB TCR
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 T-세포 수용체 (TCR) 서브유닛의 N-말단에 융합되어 항-LAB T-세포 수용체 (본원에서 "항-LAB TCR"로 지칭됨)를 형성한다.
본원에 사용된 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 MHC 분자에 결합된 특이적 항원 펩티드에 결합하는 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 내인성 또는 재조합 T 세포 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, TCR은 TCRα 폴리펩티드 쇄 및 TCRβ 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR은 TCRγ 폴리펩티드 쇄 및 TCRδ 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR은 종양 항원에 특이적으로 결합한다. "TCR-T"는 재조합 TCR을 발현하는 T 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 "TCR 복합체"는 TCR 및 CD3의 복합체를 지칭한다. 본원에 사용된 "TCR 서브유닛"은, 예를 들어 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ를 포함하는 TCR 복합체의 서브유닛을 지칭한다. 항-LAB 항체 모이어티는 임의의 TCR 서브유닛의 N-말단에 융합될 수 있다.
따라서, 예를 들어 일부 실시양태에서, (a) 라비린틴에 특이적으로 결합하는 항-LAB 항체 모이어티 및 (b) TCR 서브유닛을 포함하는 조작된 TCR이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 TCR 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 일부 실시양태에서, TCR 서브유닛은 TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD3ε, CD3γ, CD3δ 및 CD3ζ로 이루어진 군으로부터 선택된다.
항-라비린틴 이중특이적 항체
일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 다중-특이적 항체이다. 상이한 특이성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 화학적으로 가교되어 다중-특이적 이종접합체 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 각각 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 2개의 F(ab')2 분자는 화학적으로 연결될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 다중특이적이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체 모이어티는 탠덤 scFv, 디아바디 (Db), 단일 쇄 디아바디 (scDb), 이중-친화도 재표적화 (DART) 항체, 이중 가변 도메인 (DVD) 항체, 노브-인투-홀 (KiH) 항체, 독 앤 락 (DNL) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다량체 항체 또는 이종접합체 항체이다. 일부 실시양태에서, 다중특이적 항체 모이어티는 임의적인 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 항체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 2개의 scFv를 융합시켜, 예컨대 이들을 펩티드 링커를 통해 융합시켜, 탠덤 scFv를 생성함으로써 조작될 수 있다. 탠덤 scFv의 한 예는 이중특이적 T 세포 연관체이다. 이중특이적 T 세포 연관체는 항-CD3 scFv를 표적 세포의 표면 항원, 예컨대 종양-연관 항원 (TAA)에 특이적인 scFv에 연결시킴으로써 제조되며, 이는 T 세포의 표적 세포로의 재지시를 유발한다.
따라서, 예를 들어 일부 실시양태에서, (a) 라비린틴에 특이적으로 결합하는 항-LAB 항체 모이어티 및 (b) CD3에 특이적으로 결합하는 항-CD3 항체 모이어티를 포함하는 이중특이적 T 세포 연관체가 제공된다. 일부 실시양태에서, (a) 라비린틴에 특이적으로 결합하는 scFv 및 (b) CD3에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함하는 이중특이적 T 세포 연관체가 제공된다.
항-LAB 항체-약물 접합체 (ADC) 또는 다른 접합체
항-LAB 구축물은, 일부 실시양태에서, 이펙터 분자에 부착된 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 면역접합체 (본원에서 "항-LAB 면역접합체"로도 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 세포독성, 세포증식억제성이거나 또는 달리 일부 치료 이익을 제공하는 치료제, 예컨대 암 치료제이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지이다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티 및 치료제를 포함하는 항-LAB 면역접합체 (본원에서 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로도 지칭됨)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료제는 세포독성, 세포증식억제성이거나 또는 달리 표적 세포가 분열하는 능력을 방지하거나 감소시키는 독소이다. 중요하게는, 대부분의 정상 세포는 그의 표면 상에 LAB를 제시하지 않기 때문에, 이들은 항-LAB 면역접합체에 결합할 수 없고, 독소 또는 다른 치료제의 사멸 효과로부터 보호된다.
항-LAB 면역접합체에 사용되는 치료제는, 예를 들어 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트 및 빈데신을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Rowland et al., Cancer Immunol Immunother, 21, 1986] 참조). 항-LAB 면역접합체에 사용되는 독소는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신, 메이탄시노이드 및 칼리케아미신을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 메카니즘에 의해 그의 세포독성 및 세포증식억제성 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합되는 경우에 불활성이거나 덜 활성인 경향이 있다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 종양 사전-표적화에 이용하기 위한 "수용체" (예컨대 스트렙타비딘)에 접합될 수 있으며, 여기서 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여한 후, 제거제를 사용하여 미결합 접합체를 순환으로부터 제거한 다음, 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 접합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
본 출원은 이펙터 분자가 간접적으로 또는 직접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지인, 이펙터 분자에 부착된 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 항-LAB 면역접합체를 추가로 제공한다. 이들 항-LAB 면역접합체는 연구 또는 진단 적용분야, 예컨대 암의 생체내 검출에 사용될 수 있다. 표지는 바람직하게는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, 표지는 방사선-비투과성 또는 방사성동위원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 131I; 형광 (형광단) 또는 화학발광 (발색단) 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민 또는 루시페린; 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제; 영상화제; 또는 금속 이온일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 면역접합체는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들어, 항-LAB 면역접합체에 특이적이고 검출가능한 표지를 함유하는 2차 항체가 항-LAB 면역접합체를 검출하는데 사용될 수 있다.
따라서, 예를 들어 일부 실시양태에서, (a) 라비린틴에 특이적으로 결합하는 항-LAB 항체 모이어티; 및 (b) 이펙터 분자를 포함하는 항-LAB 면역접합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 분자는 표지이다.
항-LAB 항체 모이어티
본 출원은 한 측면에서 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 (본원에서 "항-LAB 항체 모이어티"로 지칭됨)를 제공한다. 항-라비린틴 구축물은 항-LAB 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 세포의 표면 상에 존재하는 라비린틴에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 고형 종양 내, 예컨대 전이성 암 세포이다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 전장 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 항원-결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 디술피드 안정화된 Fv 단편 (dsFv) 및 단일-쇄 항체 분자 (scFv)로 이루어진 군으로부터 선택된 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 인간, 인간화 또는 반합성이다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴-유래 펩티드 또는 그의 부분에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 라비린틴 (서열식별번호: 1; 표 2 참조)의 부분으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴-유래 펩티드를 면역원으로서 사용함으로써 생산된 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드가 면역원으로서 사용되는 경우에, 라비린틴-유래 펩티드는 담체, 예컨대 알부민 또는 KLH에 접합된다.
일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 라비린틴 (서열식별번호: 1)의 부분에 대해 적어도 약 60% 유사성, 예컨대 적어도 약 65% 유사성, 70% 유사성, 75% 유사성, 80% 유사성, 85% 유사성, 90% 유사성 또는 95% 유사성 중 어느 것의 서열 유사성을 갖는 펩티드이며, 여기서 라비린틴-유래 펩티드는 말단 프롤린 잔기를 포함하지 않고, 여기서 라비린틴-유래 펩티드는 적어도 1개의 프롤린 잔기, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개의 프롤린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 라비린틴 (서열식별번호: 1)의 부분에 대해 적어도 약 60% 유사성, 예컨대 적어도 약 65% 유사성, 70% 유사성, 75% 유사성, 80% 유사성, 85% 유사성, 90% 유사성 또는 95% 유사성 중 어느 것의 서열 유사성을 갖는 펩티드이며, 여기서 라비린틴-유래 펩티드의 한 말단은 말단 프롤린 잔기를 포함하지 않고, 여기서 라비린틴-유래 펩티드는 적어도 1개의 프롤린 잔기, 예컨대 2, 3, 4 또는 5개의 프롤린 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 7 내지 50개 아미노산 길이, 예컨대 7 내지 25개 아미노산 길이, 7 내지 13개 아미노산 길이, 또는 21 내지 25개 아미노산 길이 중 어느 것이다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산 길이이다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 라비린틴 (서열식별번호: 1)의 부분에 실질적으로 상동이다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 라비린틴 (서열식별번호: 1)의 부분에 대해 적어도 약 60% 유사성, 예컨대 적어도 약 65% 유사성, 70% 유사성, 75% 유사성, 80% 유사성, 85% 유사성, 90% 유사성 또는 95% 유사성 중 어느 것의 서열 유사성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드 또는 그의 유도체는 라비린틴 (서열식별번호: 1)의 부분에 대해 적어도 약 60% 유사성의 서열 유사성을 가지며, 여기서 라비린틴-유래 펩티드의 서열의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산은 라비린틴-유래 펩티드에 대해 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되고, 여기서 치환, 삽입 및/또는 부가가 존재하는 경우에, 모이어티가 서열에 치환, 삽입 및/또는 부가된다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 부가되는 모이어티는 천연 아미노산 (예를 들어, α-아미노산 또는 L-아미노산 또는 D-아미노산) 또는 비-천연 아미노산이다. 일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 부가되는 모이어티는 아미노산 치환체 또는 링커이다. 일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 T-세포 에피토프 및/또는 B-세포 에피토프를 포함한다.
일부 실시양태에서, 라비린틴-유래 펩티드는 서열식별번호: 2-32 (표 2)로부터 선택된 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 2-32 (표 2)로부터 선택된 서열 또는 그의 변이체를 포함하는 라비린틴-유래 펩티드는 1 또는 2개의 플랭킹 아미노산 서열을 포함하며, 이러한 1 또는 2개의 플랭킹 아미노산 서열은 서열식별번호: 2-32에 제공된 코어 서열의 말단 단부에 부가된다. 일부 실시양태에서, 1 또는 2개의 플랭킹 아미노산 서열을 포함하는 라비린틴-유래 펩티드는 라비린틴 (서열식별번호: 1)의 부분에 대해 적어도 약 60% 유사성, 예컨대 적어도 약 65% 유사성, 70% 유사성, 75% 유사성, 80% 유사성, 85% 유사성, 90% 유사성 또는 95% 유사성 중 어느 것의 서열 유사성을 갖는 펩티드이다. 일부 실시양태에서, 플랭킹 아미노산 서열은 라비린틴 (서열식별번호: 1)의 부분의 서열에 기초하고, 서열식별번호: 2-32에 제공된 각각의 코어 서열로부터, 예컨대 코어 서열의 1 또는 2개의 말단 단부로부터의 각각의 연속적인 라비린틴 서열이다. 예를 들어, 서열식별번호: 3의 경우, 서열식별번호: 3의 좌측에 2개의 아미노산의 제1 플랭킹 아미노산 서열은 Pro-Ala일 것이고, 서열식별번호: 3의 우측에 2개의 아미노산의 제2 플랭킹 아미노산 서열은 Glu-Ala일 것이다.
표 2. 라비린틴 및 라비린틴-유래 펩티드의 아미노산 서열.
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Figure pct00003
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티 (또는 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 항-LAB 구축물)는 라비린틴 또는 그의 부분에 약 0.1 pM 내지 약 500 nM (예컨대 약 0.1 pM, 1.0 pM, 10 pM, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM 또는 500 nM 중 어느 것 (이들 값 사이의 임의의 범위 포함))의 Kd로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티 (또는 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 항-LAB 구축물)는 라비린틴 또는 그의 부분의 1개 이상, 예컨대 2 또는 3개의 에피토프에 결합한다.
항-LAB 항체 모이어티는 일부 실시양태에서 특이적 서열 또는 이러한 서열의 특정 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변이체 서열 내의 아미노산 치환은 항-LAB 항체 모이어티가 라비린틴 또는 그의 부분에 결합하는 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, 라비린틴 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 변경이 이루어질 수 있다. 라비린틴 결합 친화도를 실질적으로 개선시키거나 또는 일부 다른 특성, 예컨대 특이성 및/또는 라비린틴의 관련 변이체와의 교차-반응성에 영향을 미치는 변경이 또한 고려된다.
항-라비린틴 항체는 관련 기술분야에, 예를 들어 미국 특허 번호 6,166,176, 미국 특허 번호 7,635,759 및 국제 공개 번호 WO2011116014에 개시되어 있으며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴에 결합하는 MCA44-3A6 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 MCA44-3A6이다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴에 결합하는 MCA44-3A6 또는 그의 부분과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 MCA44-3A6으로부터의 1개 이상의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴에 결합하는 X373 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 X373이다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴에 결합하는 X373 또는 그의 부분과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴에 결합하는 X509 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 X509이다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 라비린틴에 결합하는 X509 또는 그의 부분과 경쟁한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 및 서열식별번호: 35에 제시된 가변 중쇄 도메인 상보성-결정 영역 (CDR) 중 1개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37 및 서열식별번호: 38에 제시된 가변 경쇄 도메인 상보성-결정 영역 (CDR) 중 1개 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티는 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 및 서열식별번호: 35에 제시된 가변 중쇄 도메인 상보성-결정 영역 (CDR) 중 1개 이상 및 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37 및 서열식별번호: 38에 제시된 가변 경쇄 도메인 상보성-결정 영역 (CDR) 중 1개 이상을 포함한다.
표 3. CDR 서열.
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핵산 및 이펙터 세포
항-LAB 구축물 또는 항-LAB 항체 모이어티를 코딩하는 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 전장 항-LAB 항체를 코딩하는 핵산 (또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 다중-특이적 항-LAB 분자 (예를 들어, 다중-특이적 항-LAB 항체, 이중특이적 항-LAB 항체 또는 이중특이적 T-세포 연관체 항-LAB 항체), 또는 그의 폴리펩티드 부분을 코딩하는 핵산 (또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티를 코딩하는 핵산 (또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 면역접합체 또는 그의 폴리펩티드 부분을 코딩하는 핵산 (또는 핵산 세트)이 제공된다.
본 출원은 또한 이들 핵산 서열에 대한 변이체를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 적어도 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건 하에 본 출원의 항-LAB 구축물 또는 항-LAB 항체 모이어티를 코딩하는 핵산 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 삽입된 벡터를 제공한다.
간략하게 요약하면, 항-LAB 구축물 (예를 들어, 항-LAB CAR) 또는 그의 폴리펩티드 부분을 코딩하는 천연 또는 합성 핵산에 의한 항-LAB 구축물 또는 그의 폴리펩티드 부분의 발현은, 핵산이 예를 들어 프로모터 (예를 들어, 림프구-특이적 프로모터) 및 3' 비번역 영역 (UTR)을 포함한 5' 및 3' 조절 요소에 작동가능하게 연결되도록 핵산을 적절한 발현 벡터 내로 삽입함으로써 달성될 수 있다. 벡터는 진핵 숙주 세포에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 및 발현 벡터는 목적하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 번역 종결인자, 개시 서열 및 프로모터를 함유한다.
본 발명의 핵산은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드를 포함하나 이에 제한되지는 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열분석 벡터를 포함한다.
추가로, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)] 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 1종의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 1종 이상의 선택 마커를 함유한다 (예를 들어, WO 01/96584; WO 01/29058; 및 미국 특허 번호 6,326,193 참조).
다수의 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고, 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징된다. 이어서, 재조합 바이러스는 단리되고, 생체내에서 또는 생체외에서 대상체의 세포로 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 이들이 트랜스진의 장기간 안정한 통합 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능하게 하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하는데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 이들이 비-증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입시킬 수 있다는 점에서 종양-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가의 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성이라는 추가의 이점을 갖는다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 개시 부위의 30-110 bp 상류 영역에 위치하며, 다수의 프로모터가 또한 개시 부위의 하류에 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소들 사이의 간격은 빈번하게 유연하므로, 프로모터 기능은 요소들이 서로 뒤바뀌거나 이동하는 경우에 보존된다. 티미딘 키나제 (tk) 프로모터에서, 프로모터 요소들 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 50 bp 간격까지 증가할 수 있다.
적합한 프로모터의 한 예는 극초기 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 그에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준의 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 또 다른 예는 신장 성장 인자-1α (EF-1α)이다. 그러나, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 긴 말단 반복부 (LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바르 바이러스 극초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 뿐만 아니라 인간 유전자 프로모터, 예컨대 비제한적으로 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아틴 키나제 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용에 제한되지 않아야 한다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요구되는 경우 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켤 수 있거나 또는 발현이 요구되지 않는 경우 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오네인 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라시클린 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
폴리펩티드 또는 그의 부분의 발현을 평가하기 위해, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키고자 하는 세포의 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위해 선택 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 함유할 수 있다. 다른 측면에서, 선택 마커는 DNA의 개별 조각 상에 운반되고 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기 위해 적절한 조절 서열과 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택 마커는, 예를 들어 항생제-내성 유전자, 예컨대 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고, 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소적 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비 알칼리성 포스파타제를 코딩하는 유전자 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ui-Tel et al., FEBS Letters, 479, 2000]). 적합한 발현 시스템은 널리 공지되어 있고, 공지된 기술을 사용하여 제조되거나 또는 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최고 수준의 발현을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 구축물이 프로모터로서 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되고, 프로모터-구동 전사를 조정하는 능력에 대해 작용제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 관련 기술분야의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 인산칼슘 형질감염에 의해 수행된다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 1, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,350,674 및 5,585,362를 참조한다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로스피어, 비드 및 지질-기반 시스템, 예컨대 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜 (예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포솜이다. 지질 제제의 사용은 숙주 세포 내로의 핵산의 도입 (시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 또 다른 측면에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화될 수 있거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 산재될 수 있거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오티드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착될 수 있거나, 리포솜 내에 포획될 수 있거나, 리포솜과 복합체화될 수 있거나, 지질을 함유하는 용액 중에 분산될 수 있거나, 지질과 혼합될 수 있거나, 지질과 조합될 수 있거나, 지질 중 현탁액으로서 함유될 수 있거나, 미셀에 함유되거나 그와 복합체화될 수 있거나, 또는 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 회합된 조성물은 용액 중 임의의 특정한 구조에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 중에 산재되어, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 자연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질에서 자연적으로 발생하는 지방 액적, 뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 그의 유도체, 예컨대 지방산, 알콜, 아민, 아미노 알콜 및 알데히드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는데 사용된 방법과 관계없이, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은, 예를 들어 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 속하는 작용제를 확인하기 위한 본원에 기재된 검정에 의해 특정한 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표면 상에 본원에 기재된 항-LAB 구축물을 제시하는 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)가 제공된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)는 그의 표면 상에 본원에 기재된 항-LAB CAR 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 본원에 기재된 항-LAB CAR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 핵산으로부터 발현된 항-LAB CAR 폴리펩티드 또는 그의 부분은 이펙터 세포의 표면 상에 국재화된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)는 그의 표면 상에 본원에 기재된 항-LAB TCR 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 본원에 기재된 항-LAB TCR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 핵산으로부터 발현된 항-LAB TCR 폴리펩티드 또는 그의 부분은 이펙터 세포의 표면 상에 국재화된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)는 그의 표면 상에 본원에 기재된 다중-특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 본원에 기재된 다중-특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 핵산으로부터 발현된 다중-특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체, 폴리펩티드 또는 그의 부분은 이펙터 세포의 표면 상에 국재화된다.
본 발명에 유용한 예시적인 이펙터 세포는 수지상 세포 (미성숙 수지상 세포 및 성숙 수지상 세포 포함), T 림프구 (예컨대 나이브 T 세포, 이펙터 T 세포, 기억 T 세포, 세포독성 T 림프구, T 헬퍼 세포, 자연 킬러 T 세포, Treg 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL) 및 리포카인-활성화 킬러 (LAK) 세포), B 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 대식세포, 호중구, 과립구 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이펙터 세포의 하위집단은 관련 기술분야에 공지된 1종 이상의 세포 표면 마커 (예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD11c, CD123, CD56, CD34, CD14, CD33 등)의 존재 또는 부재에 의해 정의될 수 있다.
일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 조작된 이펙터 세포, 예컨대 조작된 포유동물 이펙터 세포이다. 제약 조성물이 복수의 조작된 포유동물 이펙터 세포를 포함하는 경우에, 조작된 포유동물 이펙터 세포는 이펙터 세포 유형의 특이적 하위집단, 이펙터 세포 유형의 하위집단의 조합, 또는 2종 이상의 이펙터 세포 유형의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 균질한 세포 집단에 존재한다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 이펙터 세포가 증진되어 있는 불균질한 세포 집단에 존재한다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 림프구가 아니다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 입양 면역요법에 적합하다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 PBMC이다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 PBMC로부터 유래된 이펙터 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 B 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 포유동물 세포는 NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 킬러 T 세포 및 억제자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 키메라 수용체 폴리펩티드가 유래된 내인성 TCR 서브유닛 중 하나 또는 둘 다의 발현을 차단 또는 감소시키도록 변형된다. 유전자 발현을 파괴하기 위한 세포의 변형은, 예를 들어 RNA 간섭 (예를 들어, siRNA, shRNA, miRNA), 유전자 편집 (예를 들어, CRISPR- 또는 TALEN-기반 유전자 녹아웃) 등을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 이러한 기술을 포함한다.
항-LAB 항체 모이어티 및 그의 구축물의 제조 방법
본 출원은 한 측면에서 항-LAB 항체 모이어티 및 그의 구축물의 제조 방법을 제공한다.
모노클로날 항체
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티 또는 그의 구축물은 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는, 예를 들어 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256, 1975 및 Sergeeva et al., Blood, 117(16):4262-4272]에 기재된 방법을 사용하거나, 본원 및 하기 실시예에 기재된 파지 디스플레이 방법을 사용하거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조)을 사용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 햄스터, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어 이러한 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 도출한다. 대안적으로, 림프구가 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화제는 관심 단백질의 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 적어도 2종의 분자를 포함하는 복합체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요구되는 경우에 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 또는 비-인간 포유동물 공급원이 요구되는 경우에 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서 림프구는 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다. 예를 들어, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986)]을 참조한다. 불멸화 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여된 경우에, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이며 ("HAT 배지"), 이는 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시양태에서, 불멸화 세포주는 효율적으로 융합되고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 발현을 지지하며, 배지, 예컨대 HAT 배지에 감수성이다. 일부 실시양태에서, 불멸화 세포주는, 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (버지니아주 마나사스)으로부터 입수될 수 있는 뮤린 골수종 세포주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되었다. 문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63].
이어서 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지가, 폴리펩티드에 대해 지시된 모노클로날 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 검정, 예컨대 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 기술 및 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드 분석에 의해 결정될 수 있다.
목적하는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론이 한계 희석 절차에 의해 서브클로닝되고, 표준 방법에 의해 성장될 수 있다. 상기 문헌 [Goding]. 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체내 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
항-LAB 항체 모이어티는 또한 조합 라이브러리를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 이러한 라이브러리를 목적하는 결합 특징을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)]에서 검토되고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마 구축을 요구하지 않으면서 면역원에 대한 고친화도 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브 레퍼토리는 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 임의의 면역화 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하기 위해 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝될 수 있다. 최종적으로, 나이브 라이브러리는 또한 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터 비재배열 V-유전자 절편을 클로닝하는 단계 및 고도로 가변적인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관내 재배열을 달성하는 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하는 단계에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하는 특허 공개는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 및 2009/0002360을 포함한다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편은 라이브러리를 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적인 항체에 대해 스크리닝하기 위해 파지 디스플레이를 사용하여 제조될 수 있다. 라이브러리는 적어도 1 x 109개 (예컨대 적어도 약 1 x 109, 2.5 x 109, 5 x 109, 7.5 x 109, 1 x 1010, 2.5 x 1010, 5 x 1010, 7.5 x 1010 또는 1 x 1011개 중 어느 것)의 특유한 인간 항체 단편의 다양성을 갖는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 모든 인간 중쇄 및 경쇄 서브패밀리를 포괄하는, 건강한 공여자로부터의 인간 PMBC 및 비장으로부터 추출된 DNA로부터 구축된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 다양한 질환을 갖는 환자, 예컨대 자가면역 질환을 갖는 환자, 암 환자 및 감염성 질환을 갖는 환자로부터 단리된 PBMC로부터 추출된 DNA로부터 구축된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 반합성 인간 라이브러리이며, 여기서 중쇄 CDR3은 완전히 무작위화되고, 모든 아미노산 (시스테인 제외)은 동등하게 임의의 주어진 위치에 존재할 가능성이 있다 (예를 들어, 문헌 [Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005] 참조). 일부 실시양태에서, 반합성 인간 라이브러리의 중쇄 CDR3은 약 5 내지 약 24개 (예컨대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 중 어느 것)의 아미노산의 길이를 갖는다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 비-인간 파지 디스플레이 라이브러리이다.
라비린틴 또는 그의 부분에 고친화도로 결합하는 파지 클론은 고체 지지체 (예컨대, 예를 들어 용액 패닝을 위한 비드 또는 세포 패닝을 위한 포유동물 세포)에 결합된 라비린틴에 대한 파지의 반복 결합, 이어서 비-결합된 파지의 제거 및 특이적으로 결합된 파지의 용리에 의해 선택될 수 있다. 용액 패닝의 예에서, 라비린틴은 고체 지지체에의 고정화를 위해 비오티닐화될 수 있다. 비오티닐화된 라비린틴은 파지 라이브러리 및 고체 지지체, 예컨대 스트렙타비딘-접합된 디나비즈 M-280과 혼합된 다음, 라비린틴-파지-비드 복합체가 단리된다. 이어서 결합된 파지 클론은 용리되고, 발현 및 정제를 위해 적절한 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) XL1-블루를 감염시키는데 사용된다. 패닝은 용액 패닝, 세포 패닝 또는 둘 다의 조합으로 다수 (예컨대 약 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 초과 중 어느 것) 라운드 동안 수행되어, 라비린틴에 특이적으로 결합하는 파지 클론이 풍부화될 수 있다. 풍부화된 파지 클론은, 예를 들어 ELISA 및 FACS를 포함한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 라비린틴에의 특이적 결합에 대해 시험될 수 있다.
모노클로날 항체는 또한 재조합 DNA 방법, 예컨대 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 하이브리도마 세포 또는 본 발명의 라비린틴-특이적 파지 클론은 이러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 배치될 수 있고, 이어서 이는 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서의 모노클로날 항체의 합성이 얻어진다. DNA는 또한, 예를 들어 상동 비-인간 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 및/또는 프레임워크 영역에 대한 코딩 서열을 치환시킴으로써 (미국 특허 번호 4,816,567; 상기 문헌 [Morrison et al.]), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 공유 연결시킴으로써 변형될 수 있다. 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인으로 치환될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체의 1개의 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환되어 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 일반적으로 중쇄 가교를 방지하도록 Fc 영역 내의 임의의 위치에서 말단절단된다. 대안적으로, 가교를 방지하도록 관련 시스테인 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실된다.
시험관내 방법이 또한 1가 항체를 제조하는데 적합하다. 단편, 특히 Fab 단편을 생산하기 위한 항체의 소화는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 이뮤노글로불린 불변-도메인 서열에 융합될 수 있다. 융합체는 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)은 융합체 중 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 목적하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 개별 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염된다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]을 참조한다.
인간 및 인간화 항체
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티 또는 그의 구축물은 인간화 항체 또는 인간 항체를 포함한다. 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화 형태는 전형적으로 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄 또는 그의 단편 (예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체에서도 발견되지 않고 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 한 부분, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
일반적으로, 인간화 항체는 비-인간인 공급원으로부터 그에 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기로 지칭되며, 이는 전형적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취해진다. 일부 실시양태에 따르면, 인간화는 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 치환시킴으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 실질적으로 무손상이 아닌 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 치환된 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이체 마우스에서의 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자의 동형접합 결실이 내인성 항체 생산의 완전한 억제를 유발하는 것으로 기재되었다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이체 마우스 내로 전달하는 것은 항원 챌린지시 인간 항체의 생산을 유발할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)]; 미국 특허 번호 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669; 5,545,807; 및 WO 97/17852를 참조한다. 대안적으로, 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 트랜스제닉 동물, 예를 들어 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 챌린지시, 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 포함한 모든 면에서, 인간에서 관찰되는 것과 밀접하게 유사한 인간 항체 생산이 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016 및 문헌 [Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포 (미국 특허 5,567,610 및 5,229,275 참조)에 의해 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술을 사용함으로써 생성될 수 있다. 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. 또한, 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 문헌 [Cole et al. 및 Boerner et al.]의 기술이 이용가능하다. 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 및 Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)].
다중-특이적 항체
일부 실시양태에서, 항-LAB 항체 모이어티 또는 그의 구축물은 다중-특이적 항체를 포함한다. 다중-특이적 (예를 들어, 이중특이적) 항체를 제조하는 적합한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체의 생산은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현에 기초할 수 있으며, 여기서 2개의 쌍은 각각 상이한 특이성을 갖고, 회합시 이종이량체 항체를 생성한다 (예를 들어, 문헌 [Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]; WO 93/08829 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 편성으로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10종의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이들 중 단지 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 통상적으로 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 유사한 절차가 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄의 조합은 종-제한적 쌍형성을 이용함으로써 지시될 수 있고 (예를 들어, 문헌 [Lindhofer et al., J. Immunol., 155:219-225 (1995)] 참조), 중쇄의 쌍형성은 CH3 도메인의 "노브-인투 홀" 조작의 사용에 의해 지시될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168; 문헌 [Ridgway et al., Protein Eng., 9(7):617-621 (1996)] 참조). 다중-특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기적 스티어링 효과를 조작함으로써 제조될 수 있다 (예를 들어, WO 2009/089004A1 참조). 또 다른 방법에서, 안정한 이중특이적 항체는 제어된 Fab-아암 교환에 의해 생성될 수 있으며, 여기서 별개의 항원 특이성 및 CH3 도메인 내의 매칭되는 점 돌연변이를 갖는 2종의 모 항체는 분리, 재조립 및 재산화를 가능하게 하는 환원 조건 하에 혼합되어 고도로 순수한 이중특이적 항체를 형성한다. 문헌 [Labrigin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 110(13):5145-5150 (2013)]. 중쇄/경쇄 쌍의 혼합물을 포함하는 이러한 항체는 본원에서 "이종다량체 항체"로도 지칭된다.
상이한 특이성을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한 화학적으로 가교되어 다중-특이적 이종접합체 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 각각 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 2개의 F(ab')2 분자는 화학적으로 연결될 수 있다. 문헌 [Pullarkat et al., Trends Biotechnol., 48:9-21 (1999)]. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원치않는 세포에 대해 표적화하고 (미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하는 것으로 제안되었다. WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089. 항체는 가교제를 수반하는 것을 포함한 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드-교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 예를 들어 미국 특허 번호 4,676,980에 개시된 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중-특이적 항체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 2개의 scFv를 융합시켜, 예컨대 이들을 펩티드 링커를 통해 융합시켜, 탠덤 scFv를 생성함으로써 조작될 수 있다. 탠덤 scFv의 한 예는 이중특이적 T 세포 연관체이다. 이중특이적 T 세포 연관체는 항-CD3 scFv를 표적 세포의 표면 항원, 예컨대 종양-연관 항원 (TAA)에 특이적인 scFv에 연결시킴으로써 제조되며, 이는 T 세포의 표적 세포로의 재지시를 유발한다. 문헌 [Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025 (1995); Brischwein et al., Mol. Immunol., 43(8):1129-1143 (2006)]. 2개의 가변 도메인 사이의 펩티드 링커의 길이를 단축시킴으로써, 이들은 자기-조립이 방지되고, 제2 폴리펩티드 상의 도메인과 쌍형성하도록 강제되어, 디아바디 (Db)로 불리는 조밀한 이중특이적 항체를 생성할 수 있다. 문헌 [Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448 (1993)]. Db의 2개의 폴리펩티드는 각각 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 한 폴리펩티드의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 폴리펩티드의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍형성하도록 강제되어, 2개의 항원-결합 부위를 형성한다. 이러한 포맷의 변형에서, 2개의 폴리펩티드는 또 다른 펩티드 링커에 의해 연결되어, 단일 쇄 디아바디 (scDb)를 생성한다. Db 포맷의 또 다른 변형에서, 이중-친화도 재표적화 (DART) 이중특이적 항체는, 목적하는 이종이량체 구조의 조립을 유도하는 C-말단 시스테인 잔기 앞의 도메인을 임의로 포함하는 각각의 폴리펩티드의 C-말단에서의 시스테인 잔기 사이에 디술피드 연결을 도입함으로써 생성될 수 있다. 문헌 [Veri et al., Arthritis Rheum., 62(7):1933-1943 (2010)]. 2개의 모노클로날 항체의 표적-결합 가변 도메인이 자연 발생 링커를 통해 조합되어 4가의 이중특이적 항체를 생성하는 이중-가변-도메인 이뮤노글로불린 (DVD-Ig™)이 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 문헌 [Gu and Ghayur, Methods Enzymol., 502:25-41 (2012)]. 또 다른 포맷에서, 독 앤 락 (DNL) 이중특이적 항체는 인간 cAMP-의존성 단백질 키나제 (PKA)의 조절 서브유닛으로부터 유래된 펩티드 (DDD2)와 인간 A 키나제 앵커 단백질 (AKAP)의 앵커링 도메인으로부터 유래된 펩티드 (AD2)의 이량체화를 이용함으로써 제조된다. 문헌 [Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 103:6841-6846 (2006)].
재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조 및 단리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되었다. 예를 들어, 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체가 생산되었다. 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수 있다.
항-LAB 항체 모이어티 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 모이어티의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 모이어티의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 모이어티의 아미노산 서열 변이체는 항체 모이어티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체 모이어티의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 목적하는 특징, 예를 들어 항원-결합을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 모이어티 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환은 관심 항체 모이어티 내로 도입될 수 있고, 생성물은 목적하는 활성, 예를 들어 보유/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
보존적 치환이 하기 표 4에 제시된다.
표 4: 보존적 치환
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아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 상이한 부류로 군분류될 수 있다:
a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. 산성: Asp, Glu;
d. 염기성: His, Lys, Arg;
e. 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
예시적인 치환 변이체는, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체 모이어티이다. 간략하게, 1개 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체 모이어티가 파지 상에 디스플레이되며, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변경 (예를 들어, 치환)은, 예를 들어 항체 모이어티 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 코딩된 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 특이성 결정 잔기 (SDR)에서 이루어질 수 있으며, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되었다.
친화도 성숙의 일부 실시양태에서, 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자 내로 다양성이 도입된다. 이어서 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서 라이브러리는 목적하는 친화도를 갖는 임의의 항체 모이어티 변이체를 확인하기 위해 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-지정 접근법을 수반하며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 수반되는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일부 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은, 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체 모이어티의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 1개 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부에서 이루어질 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 일부 실시양태에서, 각각의 HVR은 비변경되거나 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체 모이어티의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체하여 항체 모이어티와 항원의 상호작용이 영향을 받는지 여부를 결정한다. 추가의 치환이 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항원-항체 모이어티 복합체의 결정 구조를 결정하여 항체 모이어티와 항원 사이의 접촉점을 확인할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 목적하는 특성을 함유하는지 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 모이어티를 포함한다. 항체 모이어티의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어 ADEPT의 경우) 또는 항체 모이어티의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체 모이어티의 N- 또는 C-말단에의 융합체를 포함한다.
Fc 영역 변이체
일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 전장 항-LAB 항체 모이어티의 Fc 영역 내로 도입되어, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 변이체는 종종 Fc 수용체 (FcR)에 대한 결합과 관련된 증진된 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 이펙터 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 변이체는 감소된 ADCC 이펙터 기능을 갖는다. 이펙터 기능을 변경시킬 수 있는 Fc 서열에 대한 변화 또는 돌연변이의 많은 예가 존재한다. 예를 들어, WO 00/42072 및 문헌 [Shields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]은 FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 항체 변이체를 기재한다. 상기 공개문헌의 내용은 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.
항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)은 종양 세포에 대한 치료 항체의 작용 메카니즘이다. ADCC는 면역계의 이펙터 세포가, 막-표면 항원이 특이적 항체 (예를 들어, 항-LAB 항체)에 의해 결합된 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)를 활발하게 용해시키는 세포-매개 면역 방어이다. 전형적인 ADCC는 항체에 의한 NK 세포의 활성화를 수반한다. NK 세포는 Fc 수용체인 CD16을 발현한다. 이러한 수용체는 표적 세포의 표면에 결합된 항체의 Fc 부분을 인식하고 이에 결합한다. NK 세포의 표면 상의 가장 흔한 Fc 수용체는 CD16 또는 FcγRIII로 불린다. 항체의 Fc 영역에 대한 Fc 수용체의 결합은 NK 세포 활성화, 세포용해 과립의 방출 및 그 결과 표적 세포 아폽토시스를 유발한다. 종양 세포 사멸에 대한 ADCC의 기여는 고친화도 FcR로 형질감염된 NK-92 세포를 사용하는 특이적 시험으로 측정될 수 있다. 결과는 FcR을 발현하지 않는 야생형 NK-92 세포와 비교된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 생체내 항-LAB 구축물의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 CDC 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 적용분야에 바람직한 후보가 되도록 하는, 모두는 아니지만 일부 이펙터 기능을 보유하는 FC 영역을 포함하는 항-LAB 구축물 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체가 FcγR 결합이 결여되어 있지만 (따라서 ADCC 활성이 결여되어 있을 가능성이 있음), FcRn 결합 능력은 보유한다는 것을 확실히 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)] 참조); 미국 특허 번호 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 시토톡스(CytoTox) 96™ 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여되어 있다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정이 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 1개 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체, 예컨대 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
일부 실시양태에서, ADCC를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-LAB 구축물 (예를 들어, 전장 항-LAB 항체) 변이체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 ADCC를 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 치환은 변이체 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 존재한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물 (예를 들어, 전장 항-LAB 항체) 변이체는 그의 변이체 Fc 영역에 하기 아미노산 치환을 포함한다: S298A, E333A 및 K334A.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642 및 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 유발하는 변경이 Fc 영역에서 이루어진다.
일부 실시양태에서, 반감기를 증가시키고/거나 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합을 개선시키는 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-LAB 구축물 (예를 들어, 전장 항-LAB 항체) 변이체가 제공된다. 증가된 반감기 및 FcRn에 대한 개선된 결합을 갖는 항체는 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 1개 이상의 치환을 내부에 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 1개 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
본원에 기재된 임의의 Fc 변이체 또는 그의 조합을 포함하는 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체)이 고려된다.
글리코실화 변이체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-LAB 구축물은 항-LAB 구축물이 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항-LAB 구축물에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 항-LAB 구축물 또는 그의 폴리펩티드 부분의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항-LAB 구축물이 Fc 영역을 포함하는 경우, 그에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 일반적으로 부착된 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-LAB 구축물 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항-LAB 구축물 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조가 감소된 푸코스를 갖거나 푸코스가 결여되어 있는 것인, 이러한 Fc 영역을 포함하는 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체) 변이체가 제공되며, 이는 ADCC 기능을 개선시킬 수 있다. 구체적으로, 야생형 CHO 세포에서 생산된 동일한 항-LAB 구축물 상의 푸코스의 양에 비해 감소된 푸코스를 갖는 항-LAB 구축물이 본원에서 고려된다. 즉, 이들은 천연 CHO 세포 (예를 들어, 천연 글리코실화 패턴을 생성하는 CHO 세포, 예컨대 천연 FUT8 유전자를 함유하는 CHO 세포)에 의해 생산되는 경우에, 그렇지 않을 경우 이들이 가질 푸코스의 양보다 더 적은 양의 푸코스를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 그 상의 N-연결된 글리칸의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만이 푸코스를 포함하는 것이다. 예를 들어, 이러한 항-LAB 구축물 내의 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 그 상의 N-연결된 글리칸 중 어느 것도 푸코스를 포함하지 않는 것이며, 즉 항-LAB 구축물은 푸코스가 완전히 없거나 또는 푸코스를 갖지 않거나 또는 비-푸코실화된다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정시 Asn297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합계에 비해 Asn297에서의 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체 내의 부차적 서열 변이로 인해 위치 297의 약 ±3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개문헌의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.), 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체) 변이체가 추가로 제공되며, 예를 들어 여기서 항-LAB 구축물의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드는 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체) 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); US 2005/0123546 (Umana et al.) 및 문헌 [Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006)]에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체) 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항-LAB 구축물 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, Fc 영역을 포함하는 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체) 변이체는 FcγRIII에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역을 포함하는 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체) 변이체는 인간 이펙터 세포의 존재 하에 ADCC 활성을 갖거나 또는 인간 야생형 IgG1 Fc 영역을 포함하나 그 외에 다른 것은 동일한 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체)과 비교하여 인간 이펙터 세포의 존재 하에 증가된 ADCC 활성을 갖는다.
시스테인 조작된 변이체
일부 실시양태에서, 1개 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체)을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치환된 잔기는 항-LAB 구축물의 접근가능한 부위에서 발생한다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 상기 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 항-LAB 구축물의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 이를 사용하여 항-LAB 구축물을 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜, 항-LAB 면역접합체를 생성할 수 있다. 시스테인 조작된 항-LAB 구축물 (예컨대 전장 항-LAB 항체)은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
유도체
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항-LAB 구축물은 관련 기술분야에 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항-LAB 구축물의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜 및 그의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 그의 안정성으로 인해 제조에서 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항-LAB 구축물에 부착된 중합체의 수는 달라질 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우에, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항-LAB 구축물의 특정한 특성 또는 기능, 항-LAB 구축물 유도체가 정의된 조건 하의 요법에 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기초로 하여 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물 및 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상의 세포에는 해를 끼치지 않지만 항-LAB 구축물-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항-LAB CAR, 항-LAB TCR 및 항-LAB 이중특이적 T 세포 연관체
본 출원은 한 측면에서, 예를 들어 항-LAB CAR, 항-LAB TCR 또는 항-LAB 이중특이적 T 세포 연관체인 항-LAB 구축물을 제공한다. 이러한 항-LAB 구축물의 제조 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 상기 섹션에 기재되어 있다.
이펙터 세포 제조
본 발명은 한 측면에서, 예를 들어 항-LAB CAR을 발현하는 이펙터 세포 (예컨대 림프구, 예를 들어 T 세포)를 제공한다. 항-LAB CAR을 발현하는 이펙터 세포 (예컨대 T 세포) (항-LAB CAR 이펙터 세포, 예컨대 항-LAB CAR T 세포)의 예시적인 제조 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항-LAB CAR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)는 이펙터 세포 (예컨대 T 세포) 내로 항-LAB CAR (예를 들어 항-LAB 항체 모이어티 및 CD28 및 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 포함하는 CAR)을 포함하는 벡터 (예를 들어 렌티바이러스 벡터 포함)를 도입함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항-LAB CAR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)는 생체내에서 복제될 수 있으며, 이는 장기간 지속성을 유발하여 라비린틴-양성 질환 (예컨대 암, 예를 들어 선암종)의 지속적인 제어로 이어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 라비린틴-양성 질환을 갖거나 또는 라비린틴-양성 질환을 가질 위험이 있는 환자의 치료를 위해 림프구 주입을 사용하여 항-LAB CAR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포를 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 자가 림프구 주입이 치료에 사용된다. 자가 PBMC는 치료를 필요로 하는 환자로부터 수집되고, T 세포는 본원에 기재되고 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 활성화 및 확장된 다음, 환자 내로 다시 주입된다.
일부 실시양태에서, 항-LAB CAR T 세포는 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 항-LAB CAR (본원에서 "항-LAB CAR T 세포"로도 지칭됨)을 발현한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB CAR T 세포는 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 CD3ζ 및 CD28의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 항-LAB CAR을 발현한다. 본 발명의 항-LAB CAR T 세포는 강건한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 혈액 및 골수에서 연장된 양의 시간 동안 높은 수준으로 지속되는 라비린틴-특이적 기억 세포를 확립할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자 내로 주입된 본 발명의 항-LAB CAR T 세포는 라비린틴-양성 질환을 갖는 환자에서 생체내 라비린틴-제시 세포, 예컨대 라비린틴-제시 암 세포를 제거할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자 내로 주입된 본 발명의 항-LAB CAR T 세포는 적어도 1종의 통상적인 치료에 불응성인 라비린틴-양성 질환을 갖는 환자에서 생체내 라비린틴-제시 세포, 예컨대 라비린틴-제시 암 세포를 제거할 수 있다.
T 세포의 확장 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원이 대상체로부터 수득된다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양을 포함한 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, T 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 수의 기술, 예컨대 피콜(Ficoll)™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 단위 혈액으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 림프구, 예컨대 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 일부 실시양태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여, 혈장 분획을 제거하고, 후속 처리 단계를 위해 세포를 적절한 완충제 또는 배지에 배치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 세척된다. 일부 실시양태에서, 세척 용액은 칼슘이 결여되어 있고, 마그네슘이 결여되어 있을 수 있거나, 또는 모두는 아니지만 많은 2가 양이온이 결여되어 있을 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 인지할 바와 같이, 세척 단계는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해, 예컨대 반-자동화 "관통형" 원심분리기 (예를 들어, 코브(Cobe) 2991 세포 처리기, 백스터 시토메이트(Baxter CytoMate), 또는 헤모네틱스 셀 세이버(Haemonetics Cell Saver) 5)를 제조업체의 지침서에 따라 사용함으로써 달성될 수 있다. 세척 후에, 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예컨대 Ca2+-무함유, Mg2+-무함유 PBS, 플라스마라이트 A, 또는 완충제의 존재 또는 부재 하의 다른 염수 용액 중에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분이 제거될 수 있고, 세포가 배양 배지 중에 직접 재현탁될 수 있다.
일부 실시양태에서, T 세포는 적혈구를 용해시키고, 예를 들어 퍼콜(PERCOLL)™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심 분리에 의해 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포는 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선택을 위해 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28 (즉, 3x28)-접합된 비드, 예컨대 디나비즈(DYNABEADS)® M-450 CD3/CD28 T와의 인큐베이션에 의해 단리된다. 일부 실시양태에서, 기간은 약 30분이다. 일부 실시양태에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 초과 및 그 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 일부 실시양태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 일부 실시양태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시양태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 백혈병을 갖는 환자로부터의 T 세포의 단리를 위해, 더 긴 인큐베이션 시간, 예컨대 24시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 다른 세포 유형과 비교하여 T 세포가 거의 없는 임의의 상황에서, 예컨대 종양 조직 또는 면역-손상 개체로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 단리하는데 있어서, T 세포를 단리하는데 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 추가로, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하게 되는 시간을 단순히 단축 또는 연장시킴으로써 및/또는 비드 대 T 세포의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시시에 또는 공정 동안의 다른 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시시에 또는 다른 목적하는 시점에 우선적으로 선택될 수 있다. 통상의 기술자는 다수 라운드의 선택이 또한 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일부 실시양태에서, 활성화 및 확장 과정에서 선택 절차를 수행하고 "비선택" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "비선택" 세포는 또한 추가 라운드의 선택에 적용될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 특유한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 방법은 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역부착 또는 유동 세포측정법을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 풍부화하거나 또는 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의한 목적하는 세포 집단의 단리를 위해, 세포 및 표면 (예를 들어, 입자, 예컨대 비드)의 농도는 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위해 세포와 비드가 함께 혼합되는 부피를 유의하게 감소시키는 (즉, 세포의 농도를 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 약 20억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시양태에서, 약 10억개 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시양태에서, 약 1억개 초과의 세포/ml가 사용된다. 일부 실시양태에서, 약 1천만, 1천5백만, 2천만, 2천5백만, 3천만, 3천5백만, 4천만, 4천5백만 또는 5천만개 세포/ml 중 어느 것의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시양태에서, 약 7천5백만, 8천만, 8천5백만, 9천만, 9천5백만 또는 1억개 세포/ml 중 어느 것의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시양태에서, 약 1억2천5백만 또는 약 1억5천만개 세포/ml의 농도가 사용된다. 고농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 확장을 유발할 수 있다. 추가로, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 예컨대 CD28-음성 T 세포의 보다 효율적인 포획, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플 (즉, 백혈병성 혈액, 종양 조직 등)로부터의 보다 효율적인 포획을 가능하게 한다. 이러한 세포 집단은 치료 가치를 가질 수 있고, 수득하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하는 것은 정상적으로 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, T 세포는 치료 직후에 환자로부터 수득된다. 이와 관련하여, 특정 암 치료, 특히 면역계를 손상시키는 약물로의 치료 후에, 치료 직후 환자가 치료로부터 정상적으로 회복될 기간 동안 수득된 T 세포의 품질이 그의 생체외 확장 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본원에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 증진된 생착 및 생체내 확장을 위한 바람직한 상태일 수 있다. 따라서, 이러한 회복기 동안 T 세포, 수지상 세포 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함한 혈액 세포를 수집하는 것이 본 발명의 문맥 내에서 고려된다. 추가로, 일부 실시양태에서, 동원 (예를 들어, GM-CSF를 사용한 동원) 및 조건화 요법은 대상체에서, 특히 요법 후 한정된 시간 범위 동안 특정한 세포 유형의 재증식, 재순환, 재생 및/또는 확장이 선호되는 조건을 생성하는데 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
바람직한 항-LAB CAR을 발현하기 위한 T 세포의 유전자 변형 전이든지 또는 그 후이든지, T 세포는 일반적으로, 예를 들어 미국 특허 번호 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; 및 미국 특허 출원 공개 번호 20060121005에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상의 공동-자극 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장된다. 특히, T 세포 집단은, 예컨대 표면 상에 고정화된 항-CD3 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항-CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어와 함께 단백질 키나제 C 활성화제 (예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예는 9.3, B-T3, XR-CD28 (디아클론(Diaclone), 프랑스 브장송)을 포함하며, 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다 (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
면역접합체 제조
항-LAB 면역접합체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, WO 2009/067800, WO 2011/133886 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014322129 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
항-LAB 면역접합체의 항-LAB 항체 모이어티는 항-LAB 항체 모이어티가 이펙터 분자와 회합되거나 또는 그에 연결될 수 있는 임의의 수단에 의해 이펙터 분자에 "부착"될 수 있다. 예를 들어, 항-LAB 면역접합체의 항-LAB 항체 모이어티는 화학적 또는 재조합 수단에 의해 이펙터 분자에 부착될 수 있다. 융합체 또는 접합체를 제조하기 위한 화학적 수단은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 항-LAB 면역접합체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 항-LAB 항체 모이어티 및 이펙터 분자를 접합시키기 위해 사용되는 방법은 표적 세포 상의 항원에 결합하는 결합 단백질의 능력을 방해하지 않으면서 결합 단백질을 이펙터 분자와 연결시킬 수 있어야 한다.
항-LAB 면역접합체의 항-LAB 항체 모이어티는 이펙터 분자에 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 항-LAB 면역접합체의 항-LAB 항체 모이어티는 여러 유형 중 하나의 이펙터 분자를 함유하는 리포솜에 직접 연결될 수 있다. 이펙터 분자(들) 및/또는 항-LAB 항체 모이어티는 또한 고체 표면에 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 면역접합체의 항-LAB 항체 모이어티 및 이펙터 분자는 둘 다 단백질이고, 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 접합될 수 있다. 2개의 단백질을 접합시킬 수 있는 이용가능한 수백개의 가교제가 있다. (예를 들어, 문헌 ["Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking" 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor] 참조). 가교제는 일반적으로 항-LAB 항체 모이어티 및/또는 이펙터 분자 상에 이용가능하거나 삽입된 반응성 관능기에 기초하여 선택된다. 추가로, 반응성 기가 없는 경우, 광활성화가능한 가교제가 사용될 수 있다. 특정 경우에, 항-LAB 항체 모이어티와 이펙터 분자 사이에 스페이서를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 가교제는 동종이관능성 작용제: 글루타르알데히드, 디메틸아디프이미데이트 및 비스(디아조벤지딘) 및 이종이관능성 작용제: m 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 및 술포-m 말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 면역접합체의 항-LAB 항체 모이어티는 이펙터 분자의 화학적 부착을 위한 특이적 잔기로 조작될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 분자의 화학적 부착에 사용되는 구체적 잔기는 리신 및 시스테인을 포함한다. 가교제는 항-LAB 항체 모이어티 상에 삽입되고 이펙터 분자 상에 이용가능한 반응성 관능기에 기초하여 선택된다.
항-LAB 면역접합체는 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 경우에, 항-LAB 항체 모이어티를 코딩하는 DNA 서열은 이펙터 분자를 코딩하는 DNA 서열에 융합되어, 키메라 DNA 분자를 생성한다. 키메라 DNA 서열은 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포 내로 형질감염된다. 융합 단백질은 세포 배양물로부터 회수되고, 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
표지인 이펙터 분자를 결합 단백질에 부착시키는 것의 예는 문헌 [Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974); Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982); Wensel and Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983); 및 Colcher et al., "Use Of Monoclonal Antibodies As Radiopharmaceuticals For The Localization Of Human Carcinoma Xenografts In Athymic Mice", Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986)]에 기재된 방법을 포함한다.
방사성- 또는 다른 표지는 공지된 방식으로 면역접합체에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 또는 예를 들어 수소 대신에 플루오린-19를 수반하는 적합한 아미노산 전구체를 사용한 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 표지, 예컨대 99Tc 또는 123I, 186Re, 188Re 및 111In은 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 아이오도겐(IODOGEN) 방법 (Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978))은 아이오딘-123을 혼입시키는데 사용될 수 있다. 문헌 ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]에는 다른 방법이 상세하게 기재되어 있다.
항체 모이어티 및 세포독성제의 면역접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트나민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 예를 들어, WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본 발명의 항-LAB 면역접합체는 (예를 들어, 미국 일리노이주 록포드 소재 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.)로부터) 상업적으로 입수가능한 가교제 시약: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 사용하여 제조된 ADC를 명백하게 고려하지만 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]을 참조한다.
제약 조성물
항-LAB 구축물을 포함하는 조성물 (예컨대 제약 조성물, 본원에서 제제로도 지칭됨)이 또한 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 항-LAB 구축물과 회합된 세포 (예컨대 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 항-LAB 구축물과 회합된 세포 (예컨대 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포)를 추가로 포함한다.
항-LAB 구축물의 적합한 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항-LAB 구축물을 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 수득된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 다른 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 예시적인 제제는 WO98/56418 (명백하게 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 피하 투여에 적합화된 동결건조 제제는 WO97/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조 제제는 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제는 본원에서 치료될 개체에게 피하로 투여될 수 있다. 리포펙틴 또는 리포솜이 본 발명의 항-LAB 구축물을 세포 내로 전달하는데 사용될 수 있다.
본원의 제제는 또한 치료될 특정한 적응증을 위해 필요에 따라 항-LAB 구축물 이외에 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항-LAB 구축물에 추가로 항신생물제, 성장 억제제, 세포독성제 또는 화학요법제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제에 존재하는 항-LAB 구축물의 양, 질환 또는 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
항-LAB 구축물은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 지속-방출 제제가 제조될 수 있다.
항-LAB 구축물의 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체 (또는 그의 단편)를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 초과 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 히드로 겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장기간 동안 신체에 남아있는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에의 노출 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 가능한 변화를 유발할 수 있다. 수반되는 메카니즘에 따라 항-LAB 구축물의 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견된 경우에, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특이적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 시트레이트, NaCl, 아세테이트, 숙시네이트, 글리신, 폴리소르베이트 80 (트윈 80) 또는 상기의 임의의 조합을 포함하는 완충제 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 약 100 mM 내지 약 150 mM 글리신을 포함하는 완충제 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 약 50 mM 내지 약 100 mM NaCl을 포함하는 완충제 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 약 10 mM 내지 약 50 mM 아세테이트를 포함하는 완충제 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 약 10 mM 내지 약 50 mM 숙시네이트를 포함하는 완충제 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 약 0.005% 내지 약 0.02% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 pH가 약 5.1 내지 5.6인 완충제 중에서 제제화된다. 일부 실시양태에서, 항-LAB 구축물은 10 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충제 중에서 제제화되며, 여기서 제제는 pH 5.5이다. 생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
항-LAB 구축물의 사용 방법
본 출원의 항-LAB 구축물 및/또는 조성물은, 예를 들어 암 (예컨대, 선암종)을 포함한 질환 및/또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위해 개체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 라비린틴-양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 선암종, 예컨대 라비린틴-양성 선암종이다. 따라서, 본 출원은 일부 실시양태에서 개체에게 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 항-LAB 구축물, 예컨대 본원에 기재된 항-LAB 구축물 중 어느 하나를 포함하는 조성물 (예컨대 제약 조성물)의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 라비린틴-양성 질환 (예컨대 암)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 항-LAB 구축물 (예컨대 CAR)을 발현하는 세포 (예컨대 이펙터 세포)를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 개체에게 라비린틴에 특이적으로 결합하는 항-LAB 항체 모이어티를 포함하는 항-LAB 구축물을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 라비린틴-양성 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 개체에게 항-LAB 구축물 (예를 들어, 본원에 기재된 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR)을 발현하는 이펙터 세포 (예컨대 면역 세포, 예를 들어 T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 라비린틴-양성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 개체는 개체로부터의 암 샘플이, 예컨대 면역조직화학 (IHC) 기술을 사용하여 결정시 샘플 내 암성 세포의 약 10% 이상, 예컨대 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 어느 것이 라비린틴에 대해 양성인 것으로 나타나는 경우에, 치료를 위해 선택된다. 일부 실시양태에서, 개체는 개체로부터의 암 샘플이, 예컨대 면역조직화학 (IHC) 기술을 사용하여 결정시 샘플 내 암성 세포, 예컨대 종양의 말초에서의 세포의 하위집단의 약 10% 이상, 예컨대 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 중 어느 것이 라비린틴에 대해 양성인 것으로 나타나는 경우에, 치료를 위해 선택된다.
일부 실시양태에서, 개체는 인간이다.
개체 (예컨대 인간)에게 투여되는 항-LAB 구축물 조성물의 용량은 특정한 조성물, 투여 방식 및 치료될 질환의 유형에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물의 양은 객관적 반응 (예컨대 부분 반응 또는 완전 반응)을 유발하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 조성물 중 항-LAB 구축물 (예를 들어, 전장 항-LAB 항체, 다중-특이적 항-LAB 분자 또는 항-LAB 면역접합체)의 양은, 예를 들어 약 0.001 μg 내지 약 1000 μg의 범위 내에 포함된다. 임의의 상기 측면의 일부 실시양태에서, 조성물 중 항-LAB 구축물 (예를 들어, 전장 항-LAB 항체, 다중-특이적 항-LAB 분자 또는 항-LAB 면역접합체)의 유효량은 약 0.1μg/kg 내지 약 100 mg/kg 총 체중의 범위이다.
항-LAB 구축물 조성물은, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복강내, 폐내, 경구, 흡입, 방광내, 근육내, 기관내, 피하, 피내, 안내, 척수강내, 경점막 및 경피를 포함한 다양한 경로를 통해 개체 (예컨대 인간)에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물의 지속 연속 방출 제제가 사용될 수 있다.
본 출원은 또한 이펙터 세포 (예컨대 면역 세포, 예를 들어 T 세포)의 특이성을 라비린틴을 발현하는 세포로 재지시하기 위해 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR을 사용하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 출원은 또한 포유동물에게 항-LAB CAR 및 항-LAB TCR을 발현하는 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)를 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 라비린틴을 발현하는 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 이펙터 세포-매개 반응 (예컨대 T 세포-매개 면역 반응)을 자극하는 방법을 제공한다.
항-LAB CAR, 또는 항-LAB CAR을 발현하는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)는 그를 필요로 하는 수용자에게 주입될 수 있다. 주입된 세포는 수용자에서 라비린틴-발현 세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 요법과 달리, 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)는 생체내에서 복제될 수 있으며, 이는 장기간 지속성을 유발하여 지속적인 종양 제어로 이어질 수 있다.
생체외 절차는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 하기에서 보다 충분히 논의된다. 간략하게, 세포는 포유동물 (바람직하게는 인간)로부터 단리되고, 본원에 개시된 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR을 발현하는 벡터로 유전자 변형된다 (즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염됨). 항-LAB CART 또는 항-LAB TCRT 세포는 치료 이익을 제공하기 위해 포유동물 수용자에게 투여될 수 있다. 포유동물 수용자는 인간일 수 있고, 항-LAB CART 또는 항-LAB TCRT 세포는 수용자에 대해 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수용자에 대해 동종, 동계 또는 이종일 수 있다.
생체외 면역화의 관점에서 세포-기반 백신을 사용하는 것에 추가로, 본 출원은 또한 환자에서 항원에 대해 지시된 면역 반응을 도출하는 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
투여될 본 출원의 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포) 조성물의 정확한 양은 환자 (대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도 및 상태에서의 개별 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)를 포함하는 제약 조성물은 약 104 내지 약 109개 세포/kg 체중의 투여량으로 투여된다. 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포) 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에 통상적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다. 특정한 환자에 대한 최적 투여량 및 치료 요법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 이식(implantation) 또는 이식(transplantation)에 의한 것을 포함한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 피하로, 피내로, 종양내로, 결절내로, 수질내로, 근육내로, 정맥내 (i.v.) 주사에 의해 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포) 조성물은 환자에게 피내 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 출원의 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포) 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. 항-LAB CAR 또는 항-LAB TCR 이펙터 세포 (예컨대 T 세포)의 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위 내로 직접 주사될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 개체에게 복수회 용량의 본원에 기재된 항-LAB 구축물 및/또는 조성물을 일정 기간에 걸쳐 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-LAB 구축물 및/또는 조성물의 투여 빈도 및/또는 투여량은 투여하는 의사의 판단에 기초하여 치료 과정에 걸쳐 조정된다.
본원에 개시된 치료 및/또는 예방 방법은 개체에서 증식성 질환, 예컨대 암을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 암은 라비린틴-발현 암, 예컨대 라비린틴-양성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 선암종이다. 일부 실시양태에서, 암은 초기 암, 비-전이성 암, 원발성 암, 진행성 암, 국부 진행성 암, 전이성 암, 완화 상태의 암, 재발성 암, 저항성 암 또는 불응성 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 국부 절제가능한 암 (예를 들어, 완전한 외과적 제거가 가능한 기관의 부분에 국한된 종양), 국부 절제불가능한 암 (예를 들어, 중요한 혈관 구조 때문에 절제불가능한 국부 종양), 또는 절제불가능한 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 TNM 분류에 따라 I기 종양, II기 종양, III기 종양, IV기 종양, N1 종양 또는 M1 종양이다.
본원에 개시된 방법은 개체에서 암, 예컨대 라비린틴-발현 암을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 일부 실시양태에서, 개체는 하기 특징 중 1가지 이상을 갖는다: (i) 사전 동의서를 이해할 수 있고 서명할 의향이 있음; (ii) 조직학적으로 확인된 선암종 및/또는 라비린틴-발현 암을 갖는 적어도 18세의 연령; (iii) 이전에 적어도 1종의 선행 전신 요법 (화학요법 및/또는 생물학적 요법)으로 치료되었고, 치료 동안 어떠한 반응도 갖지 않았거나/진행되었거나 또는 전신 요법의 완료 후 진행되었거나 또는 모든 다른 치료를 거부함; (iv) 종양(들)이, 파라핀-포매된 보관 시편의 스크리닝 면역조직화학적 평가에 의해 결정시 > 10%의 악성 세포 염색을 나타내는 정도로 및 단일 참조 병리학자에 의한 점수화에 따라 적어도 2x 배경의 강도로, 라비린틴 항원을 과다발현해야 함; (v) 임의의 수의 선행 화학치료 요법; (vi) 제1 백신 주사 전 통상의 회상 항원에 대한 지연형 과민성 (DTH) 반응의 기록; (vii) 카르노프스키(Karnofsky) 척도에서 수행 상태 ≥ 60%; (viii) 치료 시점에 기대 수명 ≥ 6개월; (ix) 측정가능한 또는 평가가능한 질환; (x) 제1 백신 주사 전 4주 내에 수득된 치료전 절대 과립구 수 (AGC) ≥ 1,000개 및 치료전 혈소판 수 ≥ 75,000개; (xi) 치료전 혈청 크레아티닌 ≤ 1.5 mg/dl이 요구됨; 및 (xii) 혈청 빌리루빈 ≤ 1.5 및 AST ≤ 2.5 x 임상시험용 정상 상한치 (간 전이가 있는 경우 ≤ 5X).
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 출원의 개시내용의 범주 및 취지 내에서 여러 실시양태가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 범주 또는 취지에 있어서 본 개시내용을 본원에 기재된 구체적 절차로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 항-라비린틴 항체 (MCA 44-3A6)로부터 유래된 기능적 단일-쇄 가변 단편 (scFv) 및 항원-결합 단편 (Fab)의 개발 및 시험을 입증한다.
MCA 44-3A6의 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VH) cDNA를 cDNA 합성 및 PCR 방법에 유용한 올리고 프라이머로 클로닝하였다. 클로닝은 이뮤노글로불린의 데이터베이스에 공개된 서열에 기초하였다. 간략하게, 약 5x108개 하이브리도마 세포로부터 제조된 RNA를 상업적으로 입수가능한 시약에 의해 cDNA의 제조에 사용하였다. VH 및 VL의 증폭된 cDNA를 제한 효소로 소화시켰으며, 그의 부위는 PCR 증폭 동안 설치되었다. 이어서 유전자를 파지 디스플레이 벡터 내로 서브클로닝하여 라이브러리 선택의 목적을 위한 scFv를 구축하였다.
이어서 scFv의 라이브러리를 서브클로닝하였다. 각각의 scFV에 대해, 후속 발현시 생성물이 C-말단 myc 태그를 갖도록 서열을 융합시켰다. 파지 라이브러리 선택을 위해, 단백질 항원 (히스티딘-태그부착된 라비린틴)을 96-웰 플레이트 상에 밤새 고정화시켰다. 라이브러리 파지의 분취물을 배정된 웰에 넣었다. 결합된 파지를 용리시키고, 감염을 위해 TG1 배양물에 첨가한 다음, KO7 헬퍼 파지에 의해 구제하였다. 감염된 TG1 세포를 성장시키고 (30℃ 밤새), 박테리아 배양 상청액을 수거하고, 침전시키고, 다음 라운드의 선택 또는 파지 ELISA를 위해 PBS 중에 재현탁시켰다.
항원 제조를 위해, 라비린틴의 세포외 도메인을 클로닝하고, pGEX-2T를 사용하여 GST 융합 단백질로서 발현시켰다. 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 조 제제를 용이하게 제조하고, 친화성 크로마토그래피에 의해 순수한 제제를 제조하였다. 단백질의 일부 부분에서의 음으로 하전된 잔기 및 산성 잔기로 인해, 라비린틴은 점진적 정제 하에 강하게 응집되는 것으로 관찰되었다. 따라서, 히스티딘-태그부착된 변형된 라비린틴 단백질 (매우 소수성인 처음 22개 미만의 아미노산: 리더 유사 서열)을 생산하고, 상기 항원-항체 스크리닝 절차 (파지 디스플레이)에 사용하였다. 히스티딘이 라비린틴 2차 구조에 대해 주요 효과를 생성할 것으로 예상되지는 않지만, 이 단백질의 정제를 둘러싼 문제를 고려하여, MCA 44-3A6의 공지된 결합 부위를 함유하는 아미노산 #109-130에 상응하는 대안적 KLH-접합된 펩티드를 또한 합성하였다. 따라서, 변형된 His-라비린틴을 파지 디스플레이 항체 선택에 사용하였지만, 최적 항체 후보 선택을 보장하기 위해 합성 펩티드를 또한 비아코어 결합 측정에 포함시켰다.
파지 ELISA를 위해, His-라비린틴을 ELISA 플레이트 상에 코팅하였다 (4℃ 밤새). 시험할 각각의 파지의 분취물을 각각의 웰에 첨가한 다음 (37℃에서 30-90분 동안 인큐베이션함), PBS로 광범위하게 세척하였다. 파지 결합된-항원을 HRP-접합된 항-M13 항체와의 인큐베이션에 의해 검출하였다.
후속적으로, 정제된 단백질 라비린틴 항원 (His-라비린틴 및 합성 펩티드)을 비아코어 측정을 위해 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 다양한 농도의 정제된 항체 주요 변이체 (파지 라이브러리로부터 선택됨)를 시스템 내로 주입하여 항체-항원 상호작용의 회합 및 해리를 평가하였다. 비아코어 1000 기기 상에서 제조업체의 프로토콜 (비아코어, 인크., 뉴저지주 피스카타웨이)에 따라 항체 친화도 측정을 수행하였다. 측정된 친화도가 상이한 클론에 대해 서로 얼마나 가까운지에 따라, 최종 스크리닝 및 성장을 위한 상위 3개의 후보를 저장하고, 최고 친화도 후보를 시험관내 스크리닝을 사용하여 추가로 평가하였다.
도 1a 및 도 1b에 제시된 바와 같이, His-태그부착된 라비린틴을 사용하여 클로닝 및 발현된 단백질 (클론 X373 scFv; 도 1b) 및 모 MCA 44-3A6 항체 (도 1a)의 초기 결합 검정을 수행하였다. X373 scFV는 모 MCA 44-3A6 항체보다 약 4배 더 낮은 해리 상수 (Kd)를 갖는 것으로 측정되었다. 구체적으로, X373 scFv의 Kd는 4.8 x 10-7 M인 것으로 측정되었고, MCA 44-3A6의 Kd는 1.17 x 10-7 M인 것으로 측정되었다.
상기 기재된 개발 전략을 변형시켜, Fab 포맷을 위한 추가의 라이브러리를 생산하였다. Fab인 X509Fab를 스크리닝을 통해 확인하고, 후속적으로 상기 상술된 비아코어 방법을 사용하여 His-라비린틴 및 KLH-접합된 라비린틴-유래 펩티드에 대한 친화도에 대해 평가하였다. X509Fab의 친화도 측정치가 표 5에 보고된다.
표 5. X509Fab의 친화도 측정치.
Figure pct00006
후속적으로 X509Fab를 선암종 세포에서의 천연 라비린틴 인식 능력에 대해 시험하였다. A549 이종이식 종양 절편의 연속 절편 (~6 μm 두께)을 사용하여 거의 동일한 환경 내에서 X509Fab를 모 MCA 44-3A6 항체와 비교하였다. 후속적으로 10 μg/ml의 항체 (또는 1차 항체 부재)에 노출된 조직 절편을 표준 ABC 방법 (벡터 래보러토리(Vector Laboratory), 캘리포니아주 벌링게임)을 사용하여 적절한 2차 항체 (HRP-접합된 염소 항-마우스 또는 항-인간 IgG) 및 DAB로 발색시켰다. 결과 (제시되지는 않음)는, X509Fab가 천연 라비린틴에 결합하였고, 암 세포 상의 에피토프 (라비린틴)를 인식하는 능력에 있어서 모 항체와 적어도 동등하다는 것을 입증하였다.
X509Fab의 양성 세포 결합 결과가 라비린틴의 특이적 인식을 나타내는지 여부를 결정하기 위해, WI39 정상 인간 섬유모세포 (음성 대조군) 및 A549 폐 선암종 세포 (양성 대조군) 용해물을 사용하여 표준 웨스턴 이뮤노블롯팅을 수행하였다. 라비린틴에 대한 예상 크기 (~40 kD)에서 명확한 밴드가 관찰된 반면, 음성 대조군에서는 어떠한 신호도 수득되지 않았다 (도 2). MCA 44-3A6을 사용한 이전 결과에서와 같이, 희미한 보다 하부의 밴드 (분해 생성물) 및 보다 상부의 밴드 (~80 kD)가 존재하였으며, 이는 라비린틴이 자기-응집된다는 것을 확인시켜 준다 (도 2).
His-라비린틴 및 KLH-접합된 라비린틴-유래 펩티드에 대한 항-라비린틴 항체 (MCA 44-3A6)로부터 유래된 scFv 및 Fab의 친화도 측정치의 요약이 표 6에 제시된다.
표 6. X373 scFv 및 X509Fab의 친화도 측정치.
Figure pct00007
SEQUENCE LISTING <110> LABYRX IMMUNOLOGIC THERAPEUTICS (USA) LIMITED <120> CONSTRUCTS TARGETING LABYRINTHIN OR A PORTION THEREOF AND USES THEREOF <130> 18572-20002.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/789,871 <151> 2019-01-08 <160> 38 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Ile Ala Leu Leu Gly Val Trp Thr Ser Val Ala Val Val Trp 1 5 10 15 Phe Asp Leu Val Asp Tyr Glu Glu Val Leu Gly Lys Leu Gly Ile Tyr 20 25 30 Asp Ala Asp Gly Asp Gly Asp Phe Asp Val Asp Asp Ala Lys Val Leu 35 40 45 Leu Gly Leu Lys Glu Arg Ser Thr Ser Glu Pro Ala Val Pro Pro Glu 50 55 60 Glu Ala Glu Pro His Thr Glu Pro Glu Glu Gln Val Pro Val Glu Ala 65 70 75 80 Glu Pro Gln Asn Ile Glu Asp Glu Ala Lys Glu Gln Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Leu His Glu Met Val His Ala Glu His Val Glu Gly Glu Asp Leu Gln 100 105 110 Gln Glu Asp Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gln Gln Glu Asp Asp Glu Phe 115 120 125 Leu Met Ala Thr Asp Val Asp Asp Arg Phe Glu Thr Leu Glu Pro Glu 130 135 140 Val Ser His Glu Glu Thr Glu His Ser Tyr His Val Glu Glu Thr Val 145 150 155 160 Ser Gln Asp Cys Asn Gln Asp Met Glu Glu Met Met Ser Glu Gln Glu 165 170 175 Asn Pro Asp Ser Ser Glu Pro Val Val Glu Asp Glu Arg Leu His His 180 185 190 Asp Thr Asp Asp Val Thr Tyr Gln Val Tyr Glu Glu Gln Ala Val Tyr 195 200 205 Glu Pro Leu Glu Asn Glu Gly Ile Glu Ile Thr Glu Val Thr Ala Pro 210 215 220 Pro Glu Asp Asn Pro Val Glu Asp Ser Gln Val Ile Val Glu Glu Val 225 230 235 240 Ser Ile Phe Pro Val Glu Glu Gln Gln Glu Val Pro Pro Asp Thr 245 250 255 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Pro Ala 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Val Pro Pro Glu 1 <210> 4 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Glu Pro His 1 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 5 Glu Pro Glu 1 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Val Pro Val 1 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 7 Glu Pro Gln 1 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 8 Gly Pro Thr 1 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Asn Pro Asp 1 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Glu Pro Val 1 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 11 Glu Pro Leu 1 <210> 12 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Ala Pro Pro Glu 1 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Asn Pro Val 1 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 14 Phe Pro Val 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Val Pro Pro Asp 1 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Glu Pro Ala Val Pro Pro Glu 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Val Pro Pro Glu Glu Ala Glu Pro His 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Glu Pro His Thr Glu Pro Glu 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Glu Pro Glu Glu Gln Val Pro Val 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Val Pro Val Glu Ala Glu Pro Gln 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gln 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Asn Pro Asp Ser Ser Glu Pro Val 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Ala Pro Pro Glu Asp Asn Pro Val 1 5 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Phe Pro Val Glu Glu Gln Gln Glu Val Pro Pro Asp 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Asp Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gln Gln Glu 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 26 Glu Gln Glu Asn Pro Asp Ser Ser Glu Pro Val 1 5 10 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 27 Ala Pro Pro Glu Asp Asn Pro Val Glu Asp 1 5 10 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Glu Glu Gln Gln Glu Val Pro Pro Asp 1 5 <210> 29 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 29 Gly Glu Asp Leu Gln Gln Glu Asp Gly Pro Thr Gly Glu Pro Gln Gln 1 5 10 15 Glu Asp Asp Glu Phe Leu 20 <210> 30 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Asp Met Glu Glu Met Met Ser Glu Gln Glu Asn Pro Asp Ser Ser Glu 1 5 10 15 Pro Val Val Glu Asp Glu 20 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 31 Asn Glu Gly Ile Glu Ile Thr Glu Val Thr Ala Pro Pro Glu Asp Asn 1 5 10 15 Pro Val Glu Asp Ser Gln 20 <210> 32 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Asp Ser Gln Val Ile Val Glu Glu Val Ser Ile Phe Pro Val Glu Glu 1 5 10 15 Gln Gln Glu Val Pro Pro Asp 20 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 33 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 34 Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 35 Leu Gln Gly Ser His Phe Pro Arg Thr 1 5 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 36 Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Thr Met Ser 1 5 10 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 37 Tyr Ile Ser Asn Gly Gly Arg Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 38 Ala Met Asp Asn 1

Claims (32)

  1. 라비린틴 또는 그의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티 및 이펙터 도메인을 포함하는 단리된 항-라비린틴 구축물.
  2. 제1항에 있어서, 항체 모이어티가 이펙터 도메인에 접합된 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  3. 제2항에 있어서, 이펙터 도메인이 이펙터 분자를 포함하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  4. 제3항에 있어서, 이펙터 분자가 치료제를 포함하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  5. 제4항에 있어서, 치료제가 약물, 독소, 방사성동위원소, 단백질, 펩티드 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 약물 접합체 (ADC)인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  7. 제3항에 있어서, 이펙터 도메인이 진단제를 포함하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  8. 제7항에 있어서, 진단제가 표지인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  9. 제1항에 있어서, 항체 모이어티가 이펙터 도메인에 융합된 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  10. 제9항에 있어서, 단리된 항-라비린틴 구축물이 이펙터 도메인에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)이며, 여기서 이펙터 도메인은 막횡단 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  11. 제9항에 있어서, 항-CD3 항체 또는 그의 단편에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 이중특이적 T-세포 연관체 (BiTE)인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 도메인에 융합된 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 T-세포 수용체 (TCR)이며, 여기서 이펙터 도메인은 TCR 서브유닛의 막횡단 도메인 및/또는 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 모이어티가 전장 항체, Fab, Fab', (Fab')2, Fv 또는 단일 쇄 Fv (scFv)인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 모이어티가 라비린틴 또는 그의 부분에 약 0.1 pM 내지 약 500 nM의 Kd로 결합하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 모이어티가 서열식별번호: 2-32로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 라비린틴-유래 펩티드에 특이적으로 결합하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  16. 제15항에 있어서, 라비린틴-유래 펩티드가 B-세포 에피토프를 포함하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 라비린틴-유래 펩티드가 T-세포 에피토프를 포함하는 것인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 모이어티가 다중특이적인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  19. 제18항에 있어서, 다중특이적 항체 모이어티가 탠덤 scFv, 디아바디 (Db), 단일 쇄 디아바디 (scDb), 이중-친화도 재표적화 (DART) 항체, 이중 가변 도메인 (DVD) 항체, 노브-인투-홀 (KiH) 항체, 독 앤 락 (DNL) 항체, 화학적으로 가교된 항체, 이종다량체 항체 또는 이종접합체 항체인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  20. 제19항에 있어서, 다중특이적 항체 모이어티가 임의적인 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv인 단리된 항-라비린틴 구축물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 항-라비린틴 구축물을 포함하는 제약 조성물.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 항-라비린틴 구축물을 발현하는 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 항-라비린틴 구축물의 폴리펩티드 성분을 코딩하는 핵산.
  24. 제23항의 핵산을 포함하는 이펙터 세포.
  25. 제24항에 있어서, T 세포인 이펙터 세포.
  26. (a) 표면 상에 라비린틴 또는 그의 부분을 제시하는 세포를 제8항의 단리된 항-라비린틴 구축물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 세포 상의 표지의 존재를 검출하는 단계
    를 포함하는, 표면 상에 라비린틴 또는 그의 부분을 제시하는 세포를 검출하는 방법.
  27. 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체에게
    (a) 유효량의 제21항의 제약 조성물; 또는
    (b) 유효량의 제24항 또는 제25항의 이펙터 세포
    를 투여하는 단계를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 라비린틴 상태가 치료를 위한 개체를 선택하기 위한 기준으로서 사용되는 것인 방법.
  29. (a) 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체에게 유효량의 제8항의 단리된 항-라비린틴 구축물을 투여하는 단계; 및
    (b) 개체에서 표지의 수준을 결정하는 단계이며, 여기서 한계 수준을 초과하는 표지의 수준은 개체가 라비린틴-양성 질환을 갖는다는 것을 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 방법.
  30. (a) 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체로부터 유래된 샘플을 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 단리된 항-라비린틴 구축물과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 샘플에서 단리된 항-라비린틴 구축물과 결합된 1개 이상의 세포를 확인하고, 이에 의해 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 단계
    를 포함하는, 라비린틴-양성 질환을 갖는 개체를 진단하는 방법.
  31. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 라비린틴-양성 질환이 라비린틴-양성 암인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 라비린틴-양성 암이 선암종인 방법.
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